JP2016034987A - 多発性嚢胞腎を処置するためのレセプタータイプキナーゼの調節因子の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の進行において活性なキナーゼの特有の群をダウンレギュレートするキナーゼインヒビター化合物の使用、およびＰＫＤを処置するための方法を提供すること。
【解決手段】本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトもしくはネコ科の動物（例えば、ペルシャ猫））における多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）を処置するための医薬を調製するための、下記の式（Ｉ）の化合物の治療上有効な量の使用を包含する。また、ＰＫＤを処置するための上記化合物および上記化合物を含む組成物が提供される。
【選択図】なし

Description

（関連出願への相互参照）
本出願は、２０１０年８月２６日に出願された米国仮出願第６１／３７７，２１１号の優先権の利益を主張し、上記米国仮出願の内容は、その全容が参考として本明細書に援用される。

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、細胞活動（例えば、増殖、分化およびプログラムされた細胞死）に影響を及ぼすための複数のプロテインキナーゼ酵素の活性を調節するための化合物に関する。具体的には、本発明は、上記で言及されるとおりの細胞活動における変化に関連するキナーゼ酵素のセットおよびレセプターシグナル伝達経路を阻害、調整および／もしくは調節するキナゾリン、これら化合物を含む組成物、ならびにこれら化合物を使用して、キナーゼ依存性疾患および状態を処置するための方法に関する。さらにより具体的には、本発明は、多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）の進行において活性なキナーゼの特有の群をダウンレギュレートするキナーゼインヒビター化合物の使用、およびＰＫＤを処置するための方法に関する。

（関連技術の要約）
標的化治療の開発は、初期には、がんにおける細胞増殖に必須の選択されたキナーゼ酵素を特異的に標的とし得る薬物の検索に焦点を当てていた。選択性についての検索をする目的は、毒性を試験して制限することであった。このアプローチは、一般に、失敗に終わった。なぜなら、既知の５４０ものキナーゼの活性キナーゼドメインの「重なり」および相同性に起因して、単一のキナーゼ標的阻害を達成することが困難であったからである。第２に、集中した標的化は、経路における任意の単一の点での阻害を回避し得る細胞の選択を生じることが、次第に明らかになってきた。現在の考え方は、単一もしくは複数の経路において複数の部位を標的とすることに傾いている。この見解は、腫瘍学における経験から学んだものであり、他の疾患にも適用され得る（以下に概説されるとおり）。

プロテインキナーゼは、タンパク質（特に、タンパク質のチロシン、セリンおよびスレオニン残基のヒドロキシ基）のリン酸化を触媒する酵素である。この表面上単純な活性の結果は、細胞分化および増殖の時間をずらし、影響を及ぼすことである。様々な形で、細胞生命の実質的に全ての局面は、プロテインキナーゼ活性に依存している。さらに、異常なプロテインキナーゼ活性は、比較的生命を脅かすものではない疾患（例えば、乾癬）から極めて悪性の疾患（例えば、神経膠芽腫（脳のがん））までの範囲に及ぶ多くの障害に関連していた。

プロテインキナーゼは、レセプタータイプもしくは非レセプタータイプとして分類され得る。レセプタータイプのチロシンキナーゼは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを有する一方で、非レセプタータイプのチロシンキナーゼは、全体として細胞内にある。

レセプタータイプのチロシンキナーゼは、多様な生物学的活性を有する多くの膜貫通レセプターから構成される。実際に、レセプタータイプのチロシンキナーゼの約２０個の異なるサブファミリーが、既に同定されている。１つのチロシンキナーゼサブファミリーは、ＨＥＲサブファミリーと称され、ＥＧＦＲ（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、およびＨＥＲ４から構成される。これまで同定されたレセプターのこのサブファミリーのリガンドは、上皮増殖因子、ＴＧＦ−α、アンフィレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ベータセルリンおよびヘレグリンを含む。これらレセプタータイプのチロシンキナーゼの別のサブファミリーは、インスリンサブファミリーであり、これは、ＩＮＳ−Ｒ、ＩＧＦ−ＩＲ、およびＩＲ−Ｒを含む。ＰＤＧＦサブファミリーは、ＰＤＧＦ−αレセプターおよびβレセプター、ＣＳＦＩＲ、ｃ−ｋｉｔならびにＦＬＫ−ＩＩを含む。さらには、ＦＬＫファミリーがあり、これは、キナーゼ挿入ドメインレセプター（ＫＤＲ）、ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｋｉｎａｓｅ−１（ＦＬＫ−１）、ｆｅｔａｌ ｌｉｖｅｒ ｋｉｎａｓｅ−４（ＦＬＫ−４）およびｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１（ｆｌｔ−１）から構成される。上記ＰＤＧＦおよびＦＬＫファミリーは、通常、上記２つの群の類似性に起因して、一緒に考えられる。上記レセプタータイプのチロシンキナーゼの詳細な考察については、非特許文献１（これは、全ての目的のために本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

チロシンキナーゼの上記非レセプタータイプも、多くのサブファミリーから構成され、上記サブファミリーとしては、Ｓｒｃ、Ｆｒｋ、Ｂｔｋ、Ｃｓｋ、Ａｂｌ、Ｚａｐ７０、Ｆｅｓ／Ｆｐｓ、Ｆａｋ、Ｊａｋ、Ａｃｋ、およびＬＩＭＫが挙げられる。これらサブファミリーの各々は、種々のレセプターへとさらに細分化される。例えば、上記Ｓｒｃサブファミリーは、最も大きなもののうちの１つであり、Ｓｒｃ、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｂｌｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、およびＹｒｋを含む。酵素の上記Ｓｒｃサブファミリーは、腫瘍形成に関連していた。チロシンキナーゼの上記非レセプタータイプのより詳細な考察については、非特許文献２（これは、全ての目的のために本明細書に参考として援用される）を参照のこと。

プロテインキナーゼ酵素活性の誤調整（ｄｅｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）は、変化した細胞特性（例えば、がんと関連する、制御されない細胞増殖）をもたらし得る。腫瘍学的徴候に加えて、変化したキナーゼシグナル伝達は、多くの他の病的疾患に関連する。これらとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：免疫学的障害、心血管疾患、炎症性疾患、および変性性疾患。従って、レセプターおよび非レセプターのプロテインキナーゼはともに、低分子創薬の魅力的な標的である。

キナーゼ調節の治療的使用に関する１つの特に魅力的なゴールは、腫瘍学的徴候に関する。例えば、がんの処置のためのプロテインキナーゼ活性の調節は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および消化管間質がん（ＧＩＳＴ）の処置についてのグリベック（登録商標）（イマチニブメシレート）（Ｅａｓｔ Ｈａｎｏｖｅｒ，ＮＪのＮｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって製造）のＦＤＡ承認をもって首尾良く実証された。グリベックは、ｃ−ＫｉｔおよびＡｂｌキナーゼインヒビターである。

細胞増殖および脈管形成（腫瘍増殖および生存に必要とされる２つの重要な細胞プロセス（非特許文献３））の調節（特に、阻害）は、低分子薬物の開発にとって魅力的なゴールである。抗脈管形成治療は、調節不全の血管新生と関連した固形腫瘍および他の疾患（虚血性冠動脈疾患、糖尿病性網膜症、乾癬および関節リウマチが挙げられる）の処置のための潜在的に重要なアプローチを代表する。また、抗細胞増殖剤は、腫瘍の増殖を遅らせるかもしくは停止させるために望ましい。

ＥＧＦ、ＶＥＧＦおよびエフリンシグナル伝達の阻害は、細胞増殖および脈管形成（腫瘍増殖および生存に必要とされる２つの重要な細胞プロセスである）を妨げる（非特許文献３）。ＶＥＧＦレセプターは、低分子阻害の標的であると以前に記載されている。

上記Ｅｐｈレセプターは、レセプターチロシンキナーゼの最も大きなファミリーを構成し、それらの配列相同性に基づいて、２つの群ＥｐｈＡおよびＥｐｈＢに分けられている。上記Ｅｐｈレセプターのリガンドは、エフリンであり、これは、膜に固定されている。エフリンＡリガンドは、ＥｐｈＡレセプターに優先的に結合する一方で、エフリンＢリガンドは、ＥｐｈＢレセプターに結合する。Ｅｐｈレセプターへのエフリンの結合は、レセプター自己リン酸化を引き起こし、代表的には、細胞間相互作用を必要とする。なぜなら、レセプターおよびリガンドはともに、膜に結合されているからである。

Ｅｐｈレセプターの過剰発現は、種々の腫瘍における増大した細胞増殖と関連した（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。Ｅｐｈレセプターチロシンキナーゼのファミリーおよびそれらのエフリンリガンドは、胚発生中の種々のプロセスにおいて、ならびに病的な脈管形成および潜在的には転移においても重要な役割を果たす。従って、Ｅｐｈレセプターキナーゼ活性の調節は、異常な細胞増殖（例えば、上記に記載されるもの）と関連する疾患状態を処置もしくは予防するための手段を提供するはずである。

上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ｅｒｂＢ１）は、細胞の成長、増殖、およびアポトーシスを制御する原形質膜レセプターチロシンキナーゼのファミリーの一部である。ＥＧＦＲのリガンドは、上皮増殖因子であり、上記ＥＧＦＲシグナル伝達経路の誤調整は、腫瘍形成およびがん進行に影響を及ぼし、従って、これを新規な抗がん処置の臨床的に関連する標的にする（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９）。

ＥＧＦＲは、種々のヒトがんにおいて、特に、非小細胞肺がんおよび神経膠芽腫において過剰発現される。これらがんにおいて、ＥＧＦＲ過剰発現は、一般に、進行した疾患および不良な予後に関連する（非特許文献１０）。

「多発性嚢胞腎」（ＰＫＤ）とは、両側性腎嚢胞の発生を生じ、最終的に腎不全をもたらす単一遺伝子による障害の群に言及する。ＰＫＤは、全ての生命を脅かす遺伝子疾患の中で最も一般的であり、全世界で１２〜１５００万人の人々が罹患している。ＰＫＤには２つの主要な形態がある：常染色体劣性（ＡＲＰＫＤ）および常染色体優性（ＡＤＰＫＤ）。ＡＲＰＫＤは、しばしば、１ヶ月齢での顕著な死亡数を引き起こす、上記疾患の頻度の低い遺伝形態である。ＡＲＰＫＤは、ＰＫＨＤ１遺伝子における変異によって引き起こされる一方で、ＡＤＰＫＤは、ＰＫＤ１遺伝子もしくはＰＫＤ２遺伝子いずれかにおける変異によって引き起こされる（よって、これら形態は、１型もしくは２型のＡＤＰＫＤといわれる）。これら単一変異は、尿細管細胞がそれらの二次元極性（器官内の位置）を維持し、それらの増殖を制御する能力において劇的な変化を生じる。ＡＤＰＫＤは、最も一般的な遺伝性の遺伝子疾患である。各個体は、彼らの非キャリアの親から受け継いだ１つの正常な対立遺伝子を有するので、その優性の変異遺伝子は、上記正常な対立遺伝子が失われるかもしくは不活性化されるまで、その効果を発現させない。従って、いくらかの患者は、子供の頃に症状を発症させるが、大部分は、上記正常な対立遺伝子がいつ失われるかに依存して、４０歳までに症候性になる。ＰＫＤと関連する臨床的知見に関連する生化学的機構は、カルシウムイオンチャネルにおける異常に関連すると考えられている。

上記のように、ＰＫＤは、腎臓構造体の変化、変形したネフロンおよび腎不全をもたらす、多嚢胞の両側性の形成および増殖によって特徴付けられる。ＡＤＰＫＤにおいて、嚢胞は、尿細管細胞の増殖が、正常の管の流動の閉塞をもたらす場合に形成される。上記嚢胞の内側の裏張りを形成する尿細管細胞は、それらの正常の分泌機能を保持し、上記嚢胞を多くのレセプターリガンド（シグナル伝達タンパク質）（例えば、ＴＧＦ−αおよびＥＧＦ）を含む流体で満たす（Ｗｉｌｓｏｎ ＳＪ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｊｕｌ；１７６２（７）：６４７−５５）。上記嚢胞が拡大するにつれて、上記腎臓は、後期ステージ疾患において２０〜３０ポンド程度へと拡大する。

ＡＤＰＫＤ患者におけるヒトの臨床症状としては、腹痛および側腹部痛（上記嚢胞が拡大するにつれて）、高血圧症、肝嚢胞、血尿、感染および最終的には腎不全が挙げられる。ＰＫＤの進行を妨げるための具体的処置は、利用可能ではない（Ｇｒａｎｔｈａｍ ＪＪ ２００８ ＮＥＪＭ ３５９：１４７７−１４８５）。

同様に、ＰＫＤは、全世界でペルシャ猫のうちの約３８％が罹患しており、このことから、最も顕著なネコ科の動物の遺伝性疾患になっている（Ｙｏｕｎｇ ＡＥ ｅｔ ａｌ
２００５ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １６：５９−６５）。これはヒト疾患によく似ており、ＰＫＤ１遺伝子における変異の後に続くものである。

Ｐｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．， ＤＮ＆Ｐ １９９４ ７（６）：３３４−３３９ Ｂｏｌｅｎ， Ｏｎｃｏｇｅｎｅ， （１９９３） ８：２０２５−２０３１ Ｍａｔｔｅｒ Ａ．， Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃ Ｔｅｃｈｎｏｌ ２００１ ６：１００５−１０２４ Ｚｈｏｕ Ｒ， Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ． １９９８ ７７：１５１−１８１ Ｋｉｙｏｋａｗａ Ｅ， Ｔａｋａｉ Ｓ， Ｔａｎａｋａ Ｍ ｅｔ ａｌ， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９９４ ５４：３６４５−３６５０ Ｔａｋａｉ Ｎ Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｔ， Ｆｕｊｉｓａｗａ Ｋ， Ｎａｓｕ Ｋ および Ｍｉｙａｋａｗａ．， Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ ２００１ ８：５６７−５７３ Ｄｒｅｖｓ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｃｕｒｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ ２００３ ４， １１３−１２１ Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ Ｆ および Ｔｏｒｔｏｒａ Ｇ．， Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００１ ７：２９５８−２９７０ Ｔｈｏｍａｓ Ｍ．， Ｓｅｍｉｎ Ｏｎｃ． Ｎｕｒｓ． ２００２ １８：２０−２７ Ｂａｓｅｌｇａ Ｊ ｅｔ ａｌ， Ｓｅｍｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． １９９９ ２６：７８−８３

（発明の要旨）
多くのストラテジーが、ＰＫＤを処置することについて提唱されてきたが、ほとんど適用されていない。本発明者らは、本明細書において、少なくとも４種のキナーゼ（３種のレセプターチロシンキナーゼ（ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＶＥＧＦＲ）および１種の細胞質チロシンキナーゼ（ＳＲＣ））を阻害することに基づく処置モダリティーを提唱する。本発明者らの提唱は、ＰＫＤの進行の有効な阻害を達成するために、４種全てのキナーゼを標的とする必要性を強調する。

従って、一局面において、本発明は、ＰＫＤを本明細書に開示される化合物および組成物で処置するための方法に関する。

別の局面において、本発明は、ＰＫＤを処置するための医薬の製造のための本明細書に開示される化合物もしくは組成物の使用を包含する。

別の局面において、本発明は、ＰＫＤの処置における使用のための化合物および組成物を包含する。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
哺乳動物におけるＰＫＤを処置する方法であって、該方法は、治療上有効な量の以下の式：

の化合物もしくはその薬学的に受容可能な塩を投与する工程を包含する、方法。
（項目２）
前記哺乳動物はヒトである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記哺乳動物はネコ科の動物である、項目１に記載の方法。
（項目４）
前記ネコ科の動物は、ペルシャ猫である、項目３に記載の方法。
（項目５）
前記化合物は、該化合物もしくはその塩、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、および／もしくは希釈剤を含む薬学的組成物の形態において送達される、項目１〜４のいずれか１項に記載の方法。
（項目６）
哺乳動物におけるＰＫＤを処置するための医薬の製造のための、以下の式：

の化合物もしくはその薬学的に受容可能な塩の使用。
（項目７）
前記哺乳動物はヒトである、項目６に記載の使用。
（項目８）
前記哺乳動物はネコ科の動物である、項目６に記載の使用。
（項目９）
前記ネコ科の動物はペルシャ猫である、項目８に記載の使用。
（項目１０）
哺乳動物におけるＰＫＤを処置することにおいて使用するための化合物、もしくは化合物を含む組成物であって、ここで該化合物は、以下の式：

である、化合物もしくは組成物。
（項目１１）
前記哺乳動物はヒトである、項目１０に記載の化合物もしくは組成物。
（項目１２）
前記哺乳動物はネコ科の動物である、項目１０に記載の化合物もしくは組成物。
（項目１３）
前記ネコ科の動物はペルシャ猫である、項目１２に記載の化合物もしくは組成物。

本発明のこれらおよび他の特徴および利点は、以下でより詳細に記載される。

（発明の詳細な説明）
本発明者らは、ＸＬ−６４７（ＰＲＩＭ−００１およびＫＤ０１９としても公知）および関連化合物（これらは、米国特許第７，５７６，０７４号（その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される）は、以下で記載されるように、ＰＫＤに影響を及ぼすＥＧＦＲシグナル伝達カスケードの重要なエレメント、およびＶＥＧＦ−Ｒを標的とすることにおいて特有であると認識した。従って、本発明者らは、このような化合物は、単一の化合物においてＰＫＤの処置のために必要な阻害全てを提供すると認識した。各標的に対するＸＬ−６４７活性の有効性は、例えば、腫瘍学臨床研究において使用されるものより低い用量を予測することによる。ＸＬ−６４７は、上記単一の標的化薬剤単独の各々より毒性が低く、組み合わせにおいて使用されるそれら薬剤より明らかに毒性が低い。従って、ＰＫＤにおけるＸＬ−６４７の使用は、重要な標的に対して広い範囲の活性を提供し、腎臓における低下したＶＥＧＦ−Ｒ活性および潜在的に改善された安全性プロフィールの利益を付加する。

ＰＫＤにおける上皮増殖因子レセプター（ＥＧＦＲ）の役割の以前の記載は、Ｄｕ および Ｗｉｌｓｏｎによって示され（Ｇｒａｎｔｈａｍ ＪＪ ２００８ ＮＥＪＭ ３５９：１４７７−１４８５； Ｗｉｌｓｏｎ ＰＤ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｅｕｒ Ｊ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｊｕｎ；６１（１）：１３１−８； Ｄｕ Ｊ および Ｗｉｌｓｏｎ ＰＤ １９９５ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６９： Ｃ４８７−Ｃ４９５）、ＳｗｅｅｎｅｙおよびＡｖｎｅｒによって拡げられた（Ｓｗｅｅｎｅｙ ＷＥ および Ａｖｎｅｒ ＥＤ １９９８ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ
２７５：３８７−３９４）。細胞株を、ｂｐｋマウス（ＡＲＰＫＤのマウスモデル）およびＩｍｍｏｒｔｏマウスの交雑繁殖によって得た（Ｓｗｅｅｎｅｙ ＷＥ ｅｔ ａｌ
２００１ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２８１：１６９５−１７０５）。これら動物は、拡大した嚢胞腎および胆管拡張を発症し、腎不全および肝臓異常を生じた。嚢胞細胞株は、インビトロで樹立され、それら頂端面へのＥＧＦＲの誤った局在化を示した。これはインビトロで確認され、Ｗｉｌｓｏｎ および Ｄｕによって実証された（Ｗｉｌｓｏｎ ＰＤ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｅｕｒ Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｊｕｎ；６１（１）：１３１−８； Ｄｕ Ｊ および Ｗｉｌｓｏｎ ＰＤ
１９９５ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６９： Ｃ４８７−Ｃ４９５）。彼らはまた、ＰＫＤの尿細管細胞増殖におけるＴＧＦ−αおよびＥＧＦの役割を示した。さらに、ヒト嚢胞液は、ＥＧＦおよびＴＧＦ−αを含むことが示された（Ｗｉｌｓｏｎ ＳＪ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｊｕｌ；１７６２（７）：６４７−５５； Ｋｌｉｎｇｅｒ Ｒ ｅｔ ａｌ １９９２ Ａｍ Ｊ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓ １９（１）：２２−３０）。ＥＧＦＲのこの誤った局在化は、さらなるマウスモデル、ならびにＡＲＰＫＤおよびＡＤＰＫＤにおけるヒト組織の両方で確認された（Ｗｉｌｓｏｎ ＰＤ ｅｔ ａｌ １９９３ Ｅｕｒ Ｊ
Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ Ｊｕｎ；６１（１）：１３１−８； Ｄｕ Ｊ および Ｗｉｌｓｏｎ ＰＤ １９９５ Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ ２６９： Ｃ４８７−Ｃ４９５； Ａｖｎｅｒ ＥＤ および Ｓｗｅｅｎｅｙ ＷＥ １９９５ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ ３７：３５９Ａ； Ｏｒｅｌｌａｎａ ＳＡ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４７：４９０−４９９； Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＷＧ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０１：９３５−９３９）。Ｐｕｇｈ ｅｔ ａｌ （Ｐｕｇｈ ＪＬ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４７：７７４−７８１）は、ＰＫＤにおいて上昇したＥＧＦＲチロシンキナーゼ活性をさらに示した。最後に、ハイポモルフＥＧＦＲ対立遺伝子（ｗａｖｅｄ−２）を、ｏｒｐｋ（Ｏａｋ Ｒｉｄｇｅ Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ）マウス変異を有する嚢胞マウスに交雑したところ、ＥＧＦＲ活性および嚢胞形成が顕著に低下した（Ｒｉｃｈａｒｄｓ ＷＧ ｅｔ ａｌ １９９８ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １０１：９３５−９３９）。その後の研究から、細胞発生性疾患（ｃｙｔｏｇｅｎｉｃ ｄｉｓｅａｓｅ）を促進することにおけるＥＧＦＲリガンドの潜在的役割が示された。ＥＧＦおよびＴＧＦ−αはともに、インビトロで嚢胞生成性（ｃｙｓｔｏｇｅｎｉｃ）である（Ｐｕｇｈ ＪＬ ｅｔ ａｌ １９９５ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４７：７７４−７８１； Ａｖｎｅｒ ＥＤ および Ｓｗｅｅｎｅｙ ＷＥ １９９０ Ｐｅｄｉａｔｒ Ｎｅｐｈｒｏｌ ４：３７２−３７７； Ｎｅｕｆｉｅｌｄ ＴＫ ｅｔ ａｌ １９９２ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ４１：１２２２−１２３６）。嚢胞腎は、増大したＥＧＦ−α ＲＮＡ発現を有し、ＰＫＤマウスおよびラットモデルからの腎嚢胞液は、有糸分裂濃度における複数のＥＧＦペプチドを含んだ（Ｌｏｗｄｅｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ １９９４ Ｊ Ｌａｂ
Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ １２４， ３８６−３９４）。

変異ＰＫＤ遺伝子がＥＧＦＲ異常を生じる正確な機構が、十分に特徴付けられていない間、ＰＫＤの齧歯類モデルにおける嚢胞発生に対するＥＧＦＲ阻害の効果を評価することは、必然であった。Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ． ａｌ．（Ｓｗｅｅｎｅｙ ＷＥ ｅｔ ａｌ ２０００ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５７：３３−４０）は、上記ＥＧＦＲキナーゼインヒビター（ＥＫＩ−７８５）でのｂｐｋマウスの処置がＰＫＤの進行を妨げることにおいて有効であることを示した。ＥＫＩ−７８５において維持された動物は、長期間生存したが、上記薬物を除去した場合には進行した（Ｓｗｅｅｎｅｙ ｅｔ ａｌ ２０００ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ５７：３３−４０）。この知見は、２種の異なるＥＧＦＲインヒビターを使用して確認された。

ＰＫＤにおけるＥＧＦＲの役割の証拠は、ＥＧＦＲリガンド放出の阻害がまた、ＰＫＤを改善し得るという証明によってさらに裏付けられた。ＴＡＣＥ（ＴＮＦ−α変換酵素）インヒビターでのｂｐｋマウスの処置は、腎臓の大きさにおける劇的な縮小および動物の生存の増大を生じた（Ｄｅｌｌ ＫＭ ｅｔ ａｌ ２００１ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ６０：１２４０−１２４８）。ＴＡＣＥは、メタロプロテイナーゼ酵素ファミリーのメンバーであり、その機能は、プレプロペプチドをプロセシングして、上記活性ペプチドの切断を可能にする。ＰＫＤにおいて、上記ＴＡＣＥ酵素であるＡＤＡＭ−１７の阻害は、ＴＧＦ−αの放出を低下させ、ＥＧＦＲ活性化の低下を生じた。

Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．によるその後の分析（Ｗｉｌｓｏｎ ＳＪ ｅｔ ａｌ
２００６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｊｕｌ；１７６２（７）：６４７−５５）は、ＥＧＦＲ複合体の誤った局在化の一部としてＨＥＲ−２の役割をさらに示した。いくつかの動物モデルにおいて、ＨＥＲ−２は、尿細管細胞増殖を誘導する優性ＥＧＦＲであるようである。上記ＰＣＫラットは、特定のＨＥＲ−２インヒビター（２つが試験された）が、ＰＫＤの発症を予防することにおいて有効であるようなモデルである。あるものは、ヘテロダイマーならびにＨＥＲ−１およびＨＥＲ−２が、疾患進行における主要な要因であると主張する（Ｗｉｌｓｏｎ ＳＪ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｊｕｌ；１７６２（７）：６４７−５５）。従って、二機能性ＨＥＲ−１／ＨＥＲ−２キナーゼインヒビターは、処置において有効である可能性が高い。

ＥＧＦＲ活性化は、ＤＮＡ転写因子およびタンパク質生成に最終的に影響を及ぼす事象のカスケードを生じる。ＥＧＦＲからのシグナル伝達事象における重要なエレメントのうちの１つは、上記細胞質酵素ＳＲＣによって媒介される。上記ＥＧＦＲキナーゼドメインの阻害が、疾患進行を阻害する場合、上記シグナル伝達経路のメンバー（例えば、ＳＲＣ）を阻害することによって、同じ結果が起こり得るということは、論理にかなっている。ＳＲＣは、少なくとも２つのシグナル伝達経路（ＭＥＲ／ＥＲＫおよびＰＫＡ／ｂＲＡＦ）における複数の工程に影響を及ぼすことによって作用するので、標的として選択された。さらに、ＳＲＣは、ＥＧＦＲ活性を促進し、下流の標的のＥＧＦＲリン酸化を増強することが公知である（Ｂｒｏｗｍａｎ ＰＡ ｅｔ ａｌ ２００４ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２３：７９５７−６８； Ｒｏｓｋｏｓｋｉ Ｒ ２００５ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３１：１−１４）。ＳＲＣはまた、細胞膜におけるＭＭＰの活性化を刺激し、リガンド放出を増強する。上記ＳＲＣインヒビターであるＳＫＩ−６０６でのｂｐｋマウスもしくはＰＣＫラットの処置は、上記ＨＥＲ−１依存性およびＨＥＲ−２依存性両方の齧歯類モデルにおいて腎嚢胞形成および胆管異常を改善した（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ Ｒ ２００５ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ ３３１：１−１４）。ＳＲＣ阻害はまた、上昇したｃＡＭＰの低下と相関する（Ｒｏｓｋｏｓｋｉ Ｒ ２００５ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ
３３１：１−１４）。

ＶＥＧＦは、創傷治癒および腫瘍形成の間に脈管形成において主要な役割を果たす。ＶＥＧＦリガンドは、低酸素症、およびＨＩＦ１−αの生成に応じて生じる。ＶＥＧＦは、ＰＫＤ嚢胞液に存在し、機構的破壊によって生じた低酸素症および嚢胞によって引き起こされた血管制限（ｖａｓｃｕｌａｒ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）に対する応答であると考えられる。ＶＥＧＲ−１およびＶＥＧＲ−２は、腎臓内皮細胞に存在し、ＶＥＧＦ経路の活性化が、腫瘍に関して提唱されたものに類似の様式において新血管形成を促進することによって嚢胞増殖を促進すると仮定される。従って、ＶＥＧＦＲの阻害は、脈管増殖を妨げ、腎嚢胞拡大を低下させる。

ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２もしくはＳＲＣに対して活性な個々のキナーゼインヒビター（Ｗｉｌｓｏｎ ＳＪ ｅｔ ａｌ ２００６ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ Ｊｕｌ；１７６２（７）：６４７−５５； Ｌｏｗｄｅｎ ＤＡ ｅｔ ａｌ １９９４ Ｊ． Ｌａｂ． Ｃｌｉｎ． Ｍｅｄ． １２４， ３８６−３９４； Ｓｗｅｎｎｅｙ ＷＥ ｅｔ ａｌ ２００８ Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９： １３３１−１３４１）は、ＰＫＤの齧歯類モデルにおいて活性であることが示された。本発明は、薬剤の組み合わせが、臨床的により有効であり、より低用量であるという見解に基づく。組み合わせ治療の使用は、腫瘍学における先例を有し、ここでは単一の薬剤はほとんど使用されない。実際に、この原理は、ＰＫＤモデルにおける実験（ここで本発明者らは、ＥＧＦＲインヒビター（ＥＫＢ−５６９）およびＴＡＣＥインヒビターの組み合わせで動物を処置した）によって立証された。上記ＥＧＦＲインヒビターは、嚢胞形成を低下させ、かつ正常な腎機能を維持することにおいて有効であった一方；ＴＡＣＥインヒビターの添加は、より高用量でのＥＫＢ−５６９単独でのものと等しい効果を達成しながら、ＥＫＢ−５６９用量の６７％の低下を可能にした（Ｓｗｅｅｎｅｙ ＷＥ ｅｔ ａｌ ２００３ Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ ６４：１３１０−１３１９）。

理論上は、組み合わせ治療は、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２、ＳＲＣおよびＶＥＧＦ−Ｒを個々に標的とする薬物を単純に合わせることによって使用され得るが、これは、実施上の複雑さおよび商業的制約に起因して、実際には起こる可能性は低い。さらに、キナーゼ活性の範囲は極めて広く、増大した毒性リスクを生じる。例えば、ラパチニブ（Ｌａｐａｔａｎｉｂ）とスニチニブとの組み合わせは、ＥＲＢ−１、ＥＲＢ−２およびＶＥＧＦ−Ｒに影響を及ぼすのみならず、ＥＲＫ−１、ＥＲＫ−２、ＡＫＴ、Ｃｙｃｌｉｎ−Ｄ、ＰＤＧＦＲ、ｃＫＩＴおよびＦＬＴ−３をも標的とする（しかしＳＲＣに影響を及ぼすことはない）。この組み合わせにダサチニブ（Ｄａｓｔｉｎｉｂ）を加えると、ＳＲＣだけでなく、ＡＢＬにも影響を及ぼし、ｃＫＩＴおよびＰＤＧＦＲの過度な阻害によって潜在的に毒性を増大させる。さらに、これら組み合わせ研究の臨床試験は、過度に複雑であり、いかなる合理的期間においても達成可能ではなかったようである。例えば、各薬物は、異なるＰＫ／ＰＤ特徴を有し、毒性が重なり得るので、投与スケジュールを複雑にし得る。最後に、異なる製造業者の３種もしくは４種の薬剤を組み合わせるコストは、ひどく高くなり得る。

本発明者らは、ＸＬ−６４７および関連化合物が、ＨＥＲ−１、ＨＥＲ−２、ＳＲＣおよびＶＥＧＦ−Ｒを標的とし得、従って、組み合わせ治療の必要性を回避し得、組み合わせ治療と関連した複雑さを克服し得ることを発見した。

従って、一局面において、本発明は、ＰＫＤを、ＸＬ−６４７もしくは関連化合物およびその薬学的に受容可能な組成物で処置するための方法に関する。このような薬学的に受容可能な組成物は、ＸＬ−６４７もしくは関連化合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、および／もしくは賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、上記キャリアは、水である。他の実施形態において、上記キャリアは、水以外である。

本発明の方法は、治療上有効な量のＸＬ−６４７もしくは関連化合物（もしくはその薬学的に受容可能な塩）を、ＰＫＤを有する哺乳動物に投与する工程を包含する。一実施形態において、ＸＬ−６４７もしくは関連化合物は、薬学的に受容可能な組成物の形態にある。いくつかの実施形態において、上記哺乳動物は、ヒトである。他の実施形態において、上記哺乳動物は、ネコ科の動物（例えば、ペルシャ猫）である。

別の局面において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトもしくはネコ科の動物（特に、ペルシャ猫））におけるＰＫＤを処置するための医薬の製造のための、本明細書に開示される化合物もしくは組成物の使用を包含する。

別の局面において、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトもしくはネコ科の動物（特に、ペルシャ猫））におけるＰＫＤを処置することにおける使用のための化合物および組成物を包含する。

ＸＬ−６４７は、Ｎ−（３，４−ジクロロ−２−フルオロフェニル）−７−（｛［（３ａＲ，５ｒ，６ａＳ）−２−メチルオクタヒドロシクロペンタ［ｃ］ピロール−５−イル］メチル｝オキシ）−６−（メチルオキシ）キナゾリン−４−アミン：

である。上記ＸＬ−６４７は、米国特許第７，５７６，０７４号（実施例１４を参照のこと）に記載される方法に従って合成され得る。

上記に示されかつ本明細書で使用される場合、関連化合物は、式Ｉの米国特許第７，５７６，０７４号におけるもの：

またはその薬学的に受容可能な塩、水和物、もしくはプロドラッグであり、ここで
Ｒ^１は、１〜３個のＲ^５０置換基で必要に応じて置換されたＣ_１−Ｃ_３アルキルであり；Ｒ^２は、−Ｈ、ハロゲン、トリハロメチル、−ＣＮ、−ＮＨ_２、−ＮＯ_２、−ＯＲ^３、−Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−Ｓ（Ｏ）_０−２Ｒ^４、−ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−ＣＯ_２Ｒ^３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−Ｎ（Ｒ^３）ＳＯ_２Ｒ^４、−Ｎ（Ｒ^３）Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^３、−Ｎ（Ｒ^３）ＣＯ_２Ｒ^４、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^３、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、および必要に応じて置換された低級アルキニルから選択され；
Ｒ^３は、−ＨもしくはＲ^４であり；
Ｒ^４は、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換された低級アリールアルキル、必要に応じて置換されたヘテロシクリル、および必要に応じて置換された低級ヘテロシクリルアルキルから選択されるか；または
Ｒ^３およびＲ^４は、これらが結合される共通する窒素と一緒になった場合、必要に応じて置換された５〜７員のヘテロシクリルを形成し、上記必要に応じて置換された５〜７員のヘテロシクリルは、必要に応じて、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される少なくとも１個のさらなるヘテロ原子を含み；
ｑは、０〜５であり；
Ｚは、−ＯＣＨ_２−、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_０−２−、−Ｎ（Ｒ^５）ＣＨ_２−、および−ＮＲ^５−から選択され；
Ｒ^５は、−Ｈもしくは必要に応じて置換された低級アルキルであり；
Ｍ^１は、−Ｈ、Ｒ^５０によって必要に応じて置換されたＣ_１−Ｃ_８アルキル−Ｌ^２−Ｌ^１−、Ｇ（ＣＨ_２）_０−３−、またはＲ^５３（Ｒ^５４）Ｎ（ＣＨ_２）_０−３−であり；ここでＧは、１個もしくは２個の環構成ヘテロ原子を含み、かつ１〜３個のＲ^５０置換基で必要に応じて置換された、飽和５〜７員のヘテロシクリルであり；Ｌ^１は、−Ｃ＝Ｏ−もしくは−ＳＯ_２−であり；Ｌ^２は、直接結合、−Ｏ−、もしくは−ＮＨ−であり；そしてＲ^５３およびＲ^５４は、独立して、１〜３個のＲ^５０置換基で必要に応じて置換されたＣ_１−Ｃ_３アルキルであり；
Ｍ^２は、環１個あたり１個、２個もしくは３個の環構成ヘテロ原子を必要に応じて含み、かつ０〜４個のＲ^５０置換基で必要に応じて置換された、飽和または一不飽和もしくは多不飽和のＣ_３−Ｃ_１４単環式もしくは縮合した多環式ヒドロカルビルであり；そして
Ｍ^３は、−ＮＲ^９−、−Ｏ−であるか、もしくは存在せず；
Ｍ^４は、−ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２−、−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−であるか、もしくは存在せず；
Ｒ^９は、−Ｈもしくは必要に応じて置換された低級アルキルであり；
Ｒ^５０は、−Ｈ、ハロ、トリハロメチル、−ＯＲ^３、−Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−Ｓ（Ｏ）_０−２Ｒ^４、−ＳＯ_２Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−ＣＯ_２Ｒ^３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−Ｃ（＝ＮＲ^２５）Ｎ（Ｒ^３）Ｒ^４、−Ｃ（＝ＮＲ^２５）Ｒ^４、−Ｎ（Ｒ^３）ＳＯ_２Ｒ^４、−Ｎ（Ｒ^３）Ｃ（Ｏ）Ｒ^３、−ＮＣＯ_２Ｒ^３、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^３、必要に応じて置換されたアルコキシ、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換されたアリール、必要に応じて置換された低級アリールアルキル、必要に応じて置換されたヘテロシクリル、および必要に応じて置換された低級ヘテロシクリルアルキルであり；あるいは
Ｒ^５０のうちの２個は、同じ炭素原子上で一緒になった場合、オキソであり；あるいは
Ｒ^５０のうちの２個は、これらが結合される共通する炭素と一緒になった場合、必要に応じて置換された３〜７員のスピロシクリルを形成し、上記必要に応じて置換された３〜７員のスピロシクリルは、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰから選択される少なくとも１個のさらなるヘテロ原子を必要に応じて含み；そして
Ｒ^２５は、−Ｈ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＯＲ^３、−Ｓ（Ｏ）_０−２Ｒ^４、−ＣＯ_２Ｒ^３、必要に応じて置換された低級アルキル、必要に応じて置換された低級アルケニル、および必要に応じて置換された低級アルキニルから選択され、
そして米国特許第７，５７６，０７４号に開示される亜属および種を含む。

ＸＬ−６４７は、重要なマウスモデル（ＡＲＰＫＤのＢＰＫモデル）において有効な治療剤である。上記ＡＲＰＫＤのＢＰＫモデルは、マウスおよびヒトのＡＤＰＫＤにおいて認められるＥＧＦＲの同じ位置の変化を保持する。このモデルは、従って、ＰＫＤ（ＡＲＰＫＤおよびＡＤＰＫＤの両方）におけるＥＧＦＲ異常性に影響を及ぼすための一般的手段として広く受け入れられている。上記ＢＰＫモデルは、ＢＡＬＢ／ｃマウスの近親交配コロニーにおいて自然発生的変異として生じた。ホモ接合性ｂｐｋマウスは、かなり拡大した腎臓を生じ、平均して生後２４日齢（ＰＮ−２４）において腎不全で死亡する。無処置の罹患動物の平均死亡齢は、２５日であり、２１〜２９日の範囲である。さらなる腎臓での発現としては、胆管増殖および管拡張が挙げられる。上記疾患の劣性の性質が原因で、野生型＋／＋およびヘテロ接合型ｂｐｋ／＋マウスは、表現型として正常である。これら研究において使用される主な測定量は、腎臓重量 対 体重比（ＫＷ／ＢＷ）の比較である。この比は、ＰＫＤ治療の効力の正確な評価であることを一貫して示した。さらなる測定量としては、腎機能（ＢＵＮ、クレアチニンおよびＭＵＣＡ）の評価ならびに腎臓サイズおよび集合管−嚢胞指数（ＣＴ−ＣＩ）の組織学的評価が挙げられる。

以下に記載されるｂｐｋマウスモデルにおいて、ＸＬ−６４７処置は、無処置動物と比較して、上記腎臓重量 対 体重比を、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｏ．ｄ．については２１．５％、１５．０ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｏ．ｄ．については３６．７％、および１５．０ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄについては４１．１９％低下させた。これらの比は、単一の薬剤での実験において認められたものに匹敵するかもしくはより優れている（「Ｓｒｃ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ Ｋｉｄｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ」， Ｊ Ａｍ Ｓｏｃ Ｎｅｐｈｒｏｌ １９： ２００８， ｐｐ． １３３１−１３４１； 「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ＰＫＤ ｗｉｔｈ ａ ｎｏｖｅｌ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ」， Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ， Ｖｏｌ． ５７， ２０００， ｐｐ． ３３−４０）。ＸＬ−６４７処置は、腎臓重量を７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で２１．８％、および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄで４０．３％低下させた。さらに、ＢＵＮは、４２％および６０．５％低下し、クレアチニンは、８．３％および２５％低下し、そしてＭＵＣＡは、２０．１％および６６．２％改善した（それぞれ、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．に関して）。上記ＣＴ−ＣＩ指数は、それぞれ、２５％および４５．８％低下した。これら知見は、ＸＬ−６４７が、ＰＫＤの進行を妨げるための有効な手段であることを示す。

同様に、ＸＬ−６４７は、齧歯類モデル（ＰＣＫラットモデル）において有効な治療である。ＸＬ−６４７での処置は、腎臓重量を、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で１３．４％、および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で２６．０％低下させた。このことは、上記処置したＰＣＫ（疾患）ラットにおけるＫＷ／ＢＷ比の用量依存性低下と対応した。ＣＴ−ＣＩは、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．についてそれぞれ、１９．６％および３５．７％低下した。上記ＢＵＮレベルは、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で１９．２％、および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で２８．８％低下した。

純粋形態もしくは適切な薬学的組成物での、ＸＬ−６４７もしくは関連化合物、もしくはそれらの薬学的に受容可能な塩の投与は、受け入れられた投与様式もしくは類似の有用性を供するための作用因子のうちのいずれかを介して行われ得る。従って、投与は、固体、半固体、凍結乾燥粉末、もしくは液体投与形態の形態（例えば、錠剤、坐剤、丸剤、軟質弾性および硬質のゼラチンカプセル剤、散剤、液剤、懸濁物、もしくはエアロゾルなど）において、好ましくは、正確な投与量の単純な投与に適した単位投与形態において、例えば、経口、鼻に、非経口（静脈内、筋肉内、もしくは皮下）、局所に、経皮、膣内に、嚢内に、大槽内に、もしくは直腸に、であり得る。

上記組成物は、従来の薬学的キャリアもしくは賦形剤、および活性薬剤として本発明の化合物を含み、さらに、他の医療用薬剤、薬学的薬剤、キャリア、補助物質などを含む。本発明の組成物は、がんに関して処置されている患者に一般に投与される抗がん剤もしくは他の薬剤との組み合わせにおいて使用され得る。補助物質としては、保存剤、湿潤剤、懸濁剤、甘味剤、矯味矯臭剤、香料、乳化剤、および分散剤が挙げられる。微生物活動の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）によって確実にされ得る。等張剤（例えば、糖、塩化ナトリウムなど）を含むこともまた、望ましいことであり得る。注射用の薬学的形態の長期間吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）の使用によってもたらされ得る。

所望されれば、本発明の薬学的組成物はまた、少量の補助物質（例えば、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝化剤、抗酸化剤など（例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、ブチル化ヒドロキシトルエンなど））を含み得る。

非経口的注射に適した組成物は、生理学的に受容可能な滅菌水性溶液もしくは非水性溶液、分散物、懸濁物もしくはエマルジョン、および滅菌注射用溶液もしくは分散物への再構成のための滅菌散剤を含み得る。適切な水性および非水性のキャリア、希釈剤、溶媒もしくはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロールなど）、これらの適切な混合物、植物性油（例えば、オリーブ油）および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。適切な流動性が、例えば、コーティング（例えば、レシチン）の使用によって、分散物の場合には必要とされる粒度の維持によって、および界面活性剤の使用によって、維持され得る。

１つの好ましい投与経路は、処置されるべき疾患状態の重篤度に従って調節され得る、便利な１日投与レジメンを使用する、経口である。

経口投与のための固体投与形態としては、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤が挙げられる。このような固体投与形態において、上記活性化合物は、少なくとも１種の不活性な慣例的賦形剤（もしくはキャリア）、例えば、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウム、または（ａ）充填剤もしくは増量剤（例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、およびケイ酸）、（ｂ）結合剤（例えば、セルロース誘導体、デンプン、アルギネート、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロース、およびアカシアガム）、（ｃ）保湿剤（例えば、グリセロール）、（ｄ）崩壊剤（例えば、寒天、炭酸カルシウム、ポテトもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、クロスカルメロースナトリウム、複合ケイ酸塩（ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｉｌｉｃａｔｅ）、および炭酸ナトリウム）、（ｅ）溶液リターダー（ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｒｅｔａｒｄｅｒ）（例えば、パラフィン）、（ｆ）吸収促進剤（例えば、４級アンモニウム化合物）、（ｇ）湿潤剤（例えば、セチルアルコール、およびグリセロールモノステアレート、ステアリン酸マグネシウムなど）、（ｈ）吸着剤（例えば、カオリンおよびベントナイト）、ならびに（ｉ）潤滑剤（例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、もしくはこれらの混合物）と混合される。カプセル剤、錠剤、および丸剤の場合、上記投与形態はまた、緩衝化剤を含み得る。

上記に記載される固体投与形態は、コーティングおよび外殻（例えば、腸溶性コーティングおよび当該分野で周知の他のもの）とともに調製され得る。それらは、調節剤（ｐａｃｉｆｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）を含み得、また、遅延した様式で腸管の特定の部分において上記活性化合物を放出するような組成物であり得る。使用され得る埋め込まれる組成物の例は、ポリマー物質およびワックスである。上記活性化合物はまた、上記の賦形剤のうちの１種以上で微小被包された形態（適切な場合）にあり得る。

経口投与のための液体投与形態としては、薬学的に受容可能なエマルジョン、液剤、懸濁物、シロップ剤、およびエリキシル剤が挙げられる。このような投与形態は、例えば、本発明の化合物もしくはその薬学的に受容可能な塩、および選択肢的な薬学的補助物質をキャリア（例えば、水、食塩水、デキストロース水性溶液、グリセロール、エタノールなど）；可溶化剤および乳化剤（例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド）；油（特に、綿実油、ラッカセイ油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油および胡麻油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル）；またはこれら物質の混合物などに溶解、分散等させて、それによって、溶液もしくは懸濁物を形成することによって調製される。

懸濁物は、上記活性化合物に加えて、懸濁剤、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカント、もしくはこれら物質の混合物などを含み得る。

直腸投与のための組成物は、例えば、坐剤であり、これは、本発明の化合物と、例えば、適切な非刺激性賦形剤もしくはキャリア、例えば、ココアバター、ポリエチレングリコールもしくは坐剤用ワックス（これらは、通常の温度では固体であるが、体温では液体であるので、適切な体腔においては融解し、その中で上記活性化合物を放出する）とを混合することによって調製され得る。

本発明の化合物の局所投与のための投与形態としては、軟膏剤、散剤、スプレー、および吸入薬が挙げられる。上記活性成分は、滅菌条件下で、生理学的に受容可能なキャリアおよび任意の保存剤、緩衝化剤、もしくは高圧ガス（必要であり得る場合には）と混合される。眼用処方物、眼用軟膏剤、散剤、および液剤はまた、本発明の範囲内にあると企図される。

一般に、意図された投与形態に依存して、上記薬学的に受容可能な組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本発明の化合物、もしくはその薬学的に受容可能な塩、および９９重量％〜１重量％の適切な薬学的賦形剤を含む。一例において、上記組成物は、約５重量％〜約７５重量％の本発明の化合物、もしくはその薬学的に受容可能な塩であり、残りは、適切な薬学的賦形剤である。

このような投与形態を調製するための実際の方法は当業者に公知であるか、または当業者に明らかである；例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， １８ｔｈ Ｅｄ．， （Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐａ．， １９９０）を参照のこと。投与されるべき上記組成物は、いずれにしても、本発明の教示に従って、疾患状態の処置のために、治療上有効な量の本発明の化合物もしくはその薬学的に受容可能な塩を含む。

本発明の化合物、もしくはそれらの薬学的に受容可能な塩は、種々の要因に依存して変動する治療上有効な量において投与される。上記要因としては、使用される特定の化合物の活性、上記化合物の代謝的安定性および作用時間の長さ、年齢、体重、全身的な健康状態、性別、食事、投与様式および投与時間、排出速度、薬物の組み合わせ、特定の疾患の状態の重篤度、ならびに宿主が受けている治療が挙げられる。本発明の化合物は、約０．１〜約１，０００ｍｇ／日の範囲の投与レベルにおいて患者に投与され得る。約７０ｋｇの体重を有する通常の成人については、約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇ 体重／日の範囲の投与量が、一例である。しかし、使用される特定の投与量は、変動し得る。例えば、上記投与量は、上記患者の要件、処置される状態の重篤度、および使用される化合物の薬理学的活性を含む多くの要因に依存し得る。特定の患者のための最適投与量の決定は、当業者に周知である。

例示的なインビトロおよびインビボのプロトコルは、Ｇｅｎｄｒｅａｕ ＳＢ， Ｖｅｎｔｕｒａ Ｒ， Ｋｅａｓｔ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ７９０Ｍ Ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＥＸＥＬ−７６４７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７１３， １３（１２） （２００７）（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）において見いだされ得る。

（化合物調製）
インビトロアッセイに関して、ＸＬ−６４７の１０ｍｍｏｌ／Ｌ ストック溶液を、ＤＭＳＯ中に調製し、最適なアッセイ緩衝液もしくは培養培地で希釈した。最終ＤＭＳＯアッセイ濃度は、０．３％（ｖ／ｖ）を超えないようにした。インビボ研究に関しては、ＸＬ−６４７を、乾燥粉末（ＨＣｌ塩もしくはトシレート塩のいずれか）を滅菌濾過した（０．４５μｍ；Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）食塩水（０．９％
ＵＳＰ， Ｂａｘｔｅｒ Ｃｏｒｐ．）中もしくは滅菌水（Ｂａｘｔｅｒ）中に溶解することによって、経口投与用に処方した。全ての化合物をボルテックスすることによって混合し、ウォーターバス中で超音波処理して、大きな粒子を壊した。全ての投与溶液／懸濁物を、毎日用事調製した。

（実施例１：ＡＲＰＫＤのＢＰＫモデル）
ＡＲＰＫＤを処置することにおけるＸＬ−６４７の効力を、ＡＲＰＫＤのＢＰＫモデルを使用して試験した。ｂｐｋマウスは、ＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドを有し、マウスおよびヒトのＡＤＰＫＤにおいて認められるＥＧＦＲ遺伝子において同じ変異を含む。これら動物は、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの飼育施設において飼育した。全ての動物実験を、実験動物の管理および使用に関するＮＩＨ指針ならびにＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの動物実験委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の方針に従って行った。

生後７日目（ＰＮ−７）に開始して、ホモ接合性（疾患）およびヘテロ接合性を含む、証明済のｂｐｋヘテロ接合体ブリーダーの同腹仔全体、ならびに野生型の動物に、ＸＬ−６４７を注射し、７．５ｍｇ／ｋｇもしくは１５ｍｇ／ｋｇにおいて隔日で投与したか、または１５ｍｇ／ｋｇで毎日投与した。動物を、ＰＮ−７からＰＮ−２１まで処置し、疾患の程度について評価した。ｂｐｋ＋／＋動物の正体は、非常に拡大した腎臓の存在によって剖検で容易に決定され得る。ＰＮ−２１に、上記研究を終了し、動物を屠殺した。各動物の質量を決定した。各動物から両側の腎臓を摘出し、秤量した。腎臓重量 対 体重比（ＫＷ／ＢＷ）を、以下の式によって決定した：ＫＷ／ＢＷ＝［両側の腎臓質量］／［動物の質量］。

さらに、腎嚢胞指数（ＣＩ）を計算した。近位尿細管（ＰＴ）に特異的なレクチン（ｌｏｔｕｓ ｔｅｔｒａｇｏｎｏｌｏｂｕｓ［ＬＴＡ］）および集合管（ＣＴ）に特異的なレクチン（Ｄｏｌｉｃｈｏｓ ｂｉｆｌｏｒｕｓ ａｇｇｌｕｔｉｎｓ［ＤＢＡ］）を染色し、０〜５のスケールで嚢胞拡張の重篤度を評価するために使用した。腎機能を、心臓穿刺を介してＢＵＮおよびクレアチニンレベルを得ることによって評価した。ＭＵＣＡを、１２時間にわたって動物を水なしで飼育した後に測定した。

表１に示される結果は、ＸＬ−６４７が、処置したｂｐｋマウスにおいて、２１．８％（７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：１．６１±０．２３）および４０．３％（１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：１．２８±０．０９）腎臓重量を有意に低下させたことを実証する。ＫＷ／ＢＷは、処置により２１．５％（７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：１５．３４±１．２６）および３６．７％（１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．）低下した。低下した腎臓サイズはまた、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．において、それぞれ、処置したｂｐｋマウスにおけるＣＴ−ＣＩの２５％および４５．８％低下を反映する。

ＸＬ６４７処置ｂｐｋマウスに対するｂｐｋビヒクル処置マウスのｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。

表２の結果は、ＸＬ−６４７での処置が、腎機能を有意に改善することを示す。ＢＵＮレベルは、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で４２．０％、および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．で６０．５％低下し、そしてクレアチニンレベルは、それぞれ、８．３％および２５％低下した。ＸＬ−６４７で処置したｂｐｋマウスにおけるＭＵＣＡ測定値の改善は、それぞれ、２０．１％および６６．２％であった。ウェスタンブロット分析は、ＸＬ−６４７の有効性を確認するために使用した。

疾患ＸＬ６４７処置マウスに対する疾患ビヒクル処置マウスについてのｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。

（実施例２：ＰＣＫモデル）
ＸＬ−６４７を、ＰＣＫラットモデル（ＡＲＰＫＤのオルソログモデル）において使用して、ＥｒｂＢ２を阻害することにおけるその効力を決定した。上記ＰＣＫラットの表現型は、よりゆっくりとした疾患進行およびよりゆっくりとした腎機能低下を有するという点で、ヒトの表現型とは異なる。上記ＰＣＫラットは、藤田保健衛生大学のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの変異コロニーに由来したものであり、Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎにおいて飼育した。全ての動物実験を、実験動物の管理および使用に関するＮＩＨ指針ならびにＭｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎの動物実験委員会の方針に従って行った。

ＰＮ３０からＰＮ ９０まで、ＰＣＫ（疾患）ラットに、ＸＬ−６４７を胃管栄養法によって７．５ｍｇ／ｋｇ／ｑ．ｄ．および１５ｍｇ／ｋｇ／ｑ．ｄ．において与えた。ＰＮ９０における最後の注射の２時間後に、上記ラットを屠殺し、腎臓および肝臓を取り出して、秤量した。剖検測定は、ＫＷ／ＢＷ比、ならびに皮質、髄質、および腎乳頭からの腎臓切片を使用した嚢胞指数（ＣＩ）を含んだ。次いで、ＣＴ−ＣＩを、ＰＮ０からＰＮ１３５まで１５日間隔で腎臓嚢胞サイズに基づいた嚢胞指数から決定した。腎機能を、心臓穿刺から、ＢＵＮおよびクレアチニンレベルから評価した。

表３は、ＸＬ−６４７で処置したＰＣＫラットが、ＫＷ／ＢＷ比における有意な低下と、１３．４％（７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：５．７７±０．４７）および２６．０％（１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：４．９３±０．４２）の腎臓重量における対応する低下を示したことを示す。腎臓サイズが低下することによって、ＣＴ嚢胞が低下する。表３は、ＸＬ−６４７での処置が、ＣＴ−ＣＩを、７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．および１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．に関して、それぞれ、１９．６％および３５．７％低下させることを示す。

＊ＰＣＫラットに対するＳＤラットのビヒクル処置についてのｐ値：ｐ＜０．００１；＊＊ＰＲＩＭ−００１処置ＰＣＫラットに対するビヒクル処置ＰＣＫラットについてのｐ値：ｐ＜０．０５；＊＊＊ＰＲＩＭ−００１処置ＰＣＫラットに対するビヒクル処置ＰＣＫラットについてのｐ値：ｐ＜０．００１。

表４は、腎機能の測定値を示す。処置を受けたＰＣＫラットは、１９．２％（７．５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：２７．５０±３．７４）および２８．８％（１５ｍｇ／ｋｇ ｑ．ｄ．：２４．２５±４．３）低下したＢＵＮレベルを有した。ウェスタンブロット分析を使用して、ＸＬ−６４７の効力を確認および検証した。

疾患ＸＬ６４７処置マウスに対する疾患ビヒクル処置マウスについてのｐ値：＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．００１。

（実施例３：ＸＬ−６４７の阻害に関するインビトロ生化学アッセイ）
いくつかのキナーゼ（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２／ＨＥＲ２、およびＫＤＲ／ＶＥＧＦＲ２を含む）の活性に対する上記ＸＬ−６４７化合物の効果を、３つアッセイ形式のうちの１つを使用して測定した。用量応答実験を、３８４ウェルマイクロタイタープレート中で１０の異なるインヒビター濃度を使用して行った。各アッセイについて使用したＡＴＰ濃度は、各キナーゼについてのＫ_ｍに等価であった。ＩＣ_５０値を、４変数の方程式を使用して、非線形回帰分析によって計算した：Ｙ＝最小＋（最大−最小）／［１＋（［Ｉ］／ＩＣ_５０）Ｎ］（ここでＹは、観察されたシグナルであり、［Ｉ］は、インヒビター濃度であり、最小は、酵素の非存在下（０％酵素活性）でのバックグラウンドシグナルであり、最大は、インヒビターの非存在下（１００％酵素活性）でのシグナルであり、ＩＣ_５０は、５０％酵素阻害において必要とされるインヒビター濃度であり、Ｎは、協同性の尺度としての経験的なヒルの傾き（ｅｍｐｉｒｉｃａｌ Ｈｉｌｌ ｓｌｏｐｅ）を表す。結果を、表５にまとめる。

ラジオメトリック^３３Ｐ−ホスホリル転移キナーゼアッセイを、ＥｐｈＢ４、インスリン様増殖因子−Ｉレセプター（ＩＧＦＲ−１）、およびインスリンレセプター（ＩＲＫ）活性を測定するために使用した。反応を、３８４ウェルの白色透明底の高結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において行った。プレートを、５０μＬ容積において２μｇ／ウェル ペプチド基質でコーティングした。コーティング緩衝液は、４０μｇ／ｍＬ ＥｐｈＢ４およびＩＲＫ基質ポリ（Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ）もしくはＩＧＦＲ−１基質ポリ（Ｇｌｕ−Ｔｙｒ）６：２：５：１（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、２２．５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｎａ_２ＣＯ_３、２７．５ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＨＣＯ_３、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、および３ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＮ_３を含んだ。上記コーティングプレートを、室温において一晩インキュベートした後、５０μＬ アッセイ緩衝液で一度洗浄した。試験化合物と、５ｎｍｏｌ／Ｌ ＥｐｈＢ４（バキュロウイルス発現系において発現され、金属キレートクロマトグラフィーを使用して精製された、６ヒスチジンＮＨ_２末端タグを含むヒトＥｐｈＢ４の残基Ｅ６０５−Ｅ８９０）、４ｎｍｏｌ／Ｌ インスリン様増殖因子−Ｉレセプター（ヒトインスリン様増殖因子−Ｉレセプターの残基Ｍ９５４−Ｃ１３６７（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ ＧｍｂＨ））、もしくは１５ｎｍｏｌ／Ｌ インスリンレセプター１（ヒトインスリンレセプター１の残基Ｐ９４８−Ｓ１３４３（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ））のいずれかとを、全容積２０μＬにおいて、［^３３Ｐ］ｇ−ＡＴＰ（５μｍｏｌ／Ｌ，３．３μＣｉ／ｎｍｏｌ）と組み合わせた。上記反応混合物を、室温において１．５〜２．５時間にわたってインキュベートし、吸引によって終了させた。その後、上記マイクロタイタープレートを、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳ緩衝液で６回洗浄した。シンチレーション液（５０μＬ／ウェル）を添加し、組み込まれた^３３Ｐを、ＭｉｃｒｏＢｅｔａシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、液体シンチレーション分光光度法によって測定した。

ルシフェラーゼ結合化学発光アッセイを使用して、ＥＧＦＲおよびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ２）活性を測定した。キナーゼ活性を、ルシフェラーゼ−ルシフェリン結合化学発光を使用して、キナーゼ反応後に消費したＡＴＰのパーセンテージとして測定した。反応を、３８４ウェル白色中程度結合マイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において行った。キナーゼ反応を、２０ｍＬ容積において、ＸＬ−６４７、３μｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、１．６μｍｏｌ／Ｌ 基質（ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１；Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）と、ＥＧＦＲ（７ｎｍｏｌ／Ｌ，ヒトＥＧＦＲの残基Ｈ６７２−Ａ１２１０（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ））もしくはＫＤＲ（５ｎｍｏｌ／Ｌ，ヒトＫＤＲの残基Ｄ８０７−Ｖ１３５６（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ））のいずれかとを合わせることによって開始した。上記反応混合物を、室温において４時間にわたってインキュベートした。上記キナーゼ反応の後、Ｋｉｎａｓｅ Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の２０μＬアリコートを添加し、ルミネッセンスシグナルを、Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。全ＡＴＰ消費を５０％に制限した。

ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎチロシンキナーゼアッセイを使用して、ＥｒｂＢ２およびＦｌｔ−４活性を測定した。ストレプトアビジンでコーティングしたドナービーズ、およびＰＹ１００抗ホスホチロシン抗体でコーティングしたアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用した。ビオチン化ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１を、基質として使用した。基質リン酸化を、ドナー−アクセプタービーズ添加、続いて、複合体形成後のルミネッセンスによって測定した。試験化合物、３μｍｏｌ／Ｌ ＡＴＰ、３ｎｍｏｌ／Ｌ ビオチン化ポリ（Ｇｌｕ，Ｔｙｒ）４：１、および１ｎｍｏｌ／Ｌ ＥｒｂＢ２（ヒトＥｒｂＢ２の残基Ｑ６７９−Ｖ１２５５（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ））もしくはＦｌｔ−４（ヒトＦｌｔ−４の残基Ｄ７２５−Ｒ１２９８（Ｐｒｏｑｉｎａｓｅ））を、３８４ウェル白色中程度結合のマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において、容積２０μＬのアッセイ緩衝液（２０ｍＭ ＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＭｇＣｌ_２、３ｍＭ ＭｎＣｌ_２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．０１％ Ｔｒｉｔｏｎ）中に合わせた。反応混合物を、１時間にわたって室温においてインキュベートした。反応を、１０μＬの１５〜３０μｇ／ｍＬ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎビーズ懸濁物（７５ｍｍｏｌ／Ｌ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、３００ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１２０ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、０．３％ ウシ血清アルブミン、および０．０３％ Ｔｗｅｅｎ ２０を含む）を添加することによってクエンチした。室温において２〜１６時間インキュベートした後、プレートを、ＡｌｐｈａＱｕｅｓｔリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して読み取った。

結果を、少なくとも３回の独立した測定の平均±ＳＤとして現す。

ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＫＤＲ、およびＥｐｈＢ４の作用機構の研究から、ＸＬ−６４７が、可逆的かつＡＴＰ競合性のインヒビターであることが確認された。高濃度の酵素およびＸＬ−６４７（＞＞Ｋｉ）を合わせ、氷上で２時間にわたってインキュベートした。以下の濃度の酵素およびＸＬ−６４７を使用した：２００ｎＭ ＥｐｈＢ４、４００ｎＭ
ＸＬ−６４７；０．５ｎＭ ＥＧＦＲ、５ｎＭ ＸＬ−６４７；３ｎＭ ＫＤＲ、１０００ｎＭ ＸＬ−６４７。酵素活性を、酵素−インヒビター複合体の希釈後に標準的方法によって測定した。活性を、同一条件下でのＤＭＳＯコントロール処理と比較した。

（実施例３：ＸＬ−６４７の特異性に対するインビトロ生化学スクリーニング）
ＸＬ−６４７の特異性を、薬理学的標的のパネル（レセプター、トランスポーター、および酵素を含む）に対して評価した（ＮｏｖａＳｃｒｅｅｎ，Ｈａｎｏｖｅｒ，ＭＤ）。１０μＭの単一のインビトロ濃度において、ＸＬ−６４７は、上記薬理学的標的のうちのわずかと相互作用することを示した（表７）。ヒトセロトニントランスポーターのみが、ＩＣ_５０＜１μＭ（ＩＣ_５０＝１８８ｎＭ）で阻害された。ムスカリン性レセプター、α２−アドレナリン作動性レセプターおよびドパミントランスポーターにおいても効果が観察され、これらは、１〜２．７μＭのＩＣ_５０値を示した。

ＸＬ−６４７は、１０個のチロシンキナーゼ（インスリンおよびインスリン様増殖因子−１レセプターを含む）および５５個のセリン−スレオニンキナーゼ（サイクリン依存性キナーゼ、ストレス活性化プロテインキナーゼ、およびプロテインキナーゼＣアイソフォームを含む）のパネルに対して不活性であった。

さらなるスクリーニングを、実施例２の生化学アッセイ法を使用して行った。成分および濃度のさらなる説明を、以下の表８、表９、および表１０にまとめる。スクリーニングの結果は、表１１に見いだされる。

１μＭを超えるＩＣ_５０値を有する酵素としては、以下が挙げられる：ＡＭＰＫ、ｃ−Ｒａｆ、ＣａｍＫＩＩ、ＣａｍＫＩＶ、ＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＫ２、ＧＳＫ３β、ＩＫＫα、ＩＫＫβ、ＪＮＫ１α、ＪＮＫ２α、ＪＮＫ３α、ＭＡＰＫ１、ＭＡＰＫ２、ＰＲＡＫ ＭＥＫ１、ＭＫＫ４、ＭＫＫ６、ＭＫＫ７β、ＭＡＰ４Ｋ３、ＭＡＰ４Ｋ５、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＰＡＫ２、Ｐｌｋ１、ＣＫ１ＰＲＡＫ２、ＲＯＣＫ ＩＩ、Ｒｓｋ１、Ｒｓｋ２、Ｒｓｋ３、ＳＡＰＫ３、ＳＡＰＫ４、Ｓｙｋ。１０μＭを超えるＩＣ_５０値を有する酵素としては、以下が挙げられる：Ｃｈｋ１、Ｃｈｋ２、Ｃｌｋ１、Ｃｌｋ２、ＥＭＫ、ＭＡＰＫＡＰ２、ＰＫＢα、ＰＫＢβ、ＰＫＣα、ＰＫＣ−γ、ＰＫＣ−ε、ＰＫＣ−ζ、ＰＫＡ、ｐ７０Ｓ６Ｋ、ＳＧＫ。

（実施例４：インビボ細胞ベースの活性アッセイ）
ＸＬ−６４７によるＥＧＦＲの阻害を、Ａ４３１ヒト類表皮がん（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト腺がん（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）、Ｈ１９７５ ＮＳＣＬＣ腺がん（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、およびＬｘ−１扁平上皮がん（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ， Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）の細胞を使用して、インビボで確認した。Ａ４３１は、過剰発現されるｗｔヒトＥＧＦＲを含む。Ｈ１９７５は、ＥＧＦＲにおける活性化変異（Ｌ８５８Ｒ）、ならびにゲフェチニブおよびエルロチニブに対する抵抗性を付与する第２の部位の変異（Ｔ７９０Ｍ）の両方を含む。Ｌｘ−１細胞は、内因性ＥＧＦＲを発現せず、外因性ＥＧＦＲ構築物を発現させるために使用した。他の細胞株を、表１２にまとめる。

Ａ４３１細胞株およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株を、１０％ 熱不活化ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１００単位／ｍＬ ペニシリンＧ、１００μｇ／ｍＬ ストレプトマイシン（１％ ペニシリン／ストレプトマイシン，Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、および１％ 非必須アミノ酸（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）を補充した、Ｌ−グルタミンを含むＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）中で、３７℃において、加湿５％ ＣＯ_２インキュベーターの中で単層培養物として維持し、増殖させた。Ｈ１９７５細胞株、およびＬｘ−１細胞株を、完全ＲＰＭＩ １６４０（３０−２，００１；Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ；１０％ 熱不活化ウシ胎仔血清、１％ ペニシリン／ストレプトマイシン、および１％ 非必須アミノ酸を補充し、Ｌ−グルタミンを含む）中、３７℃において、加湿５％ ＣＯ_２インキュベーターの中で維持した。他の細胞株を、標準培地中で同様の方法によって維持し、増殖させた。

ｗｔ ＥＧＦＲに対するＸＬ−６４７の効果を、Ａ４３１細胞における細胞ベースのＥＧＦＲ自己リン酸化アッセイによってインビボで測定した。Ａ４３１細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート（３９０４ Ｃｏｓｔａｒ，ＶＷＲ）中、５×１０^４／ウェルにおいて播種し、完全に補充したＤＭＥＭ中で、１６時間にわたってインキュベートした。その後、増殖培地を無血清ＤＭＥＭと置換し、上記細胞を、さらに２４時間にわたってインキュベートした。無血清培地中のＸＬ−６４７の連続希釈物（三連で）を静止した細胞（ｑｕｉｅｓｃｅｎｔ ｃｅｌｌ）に添加し、１時間にわたってインキュベートし、その後、１００ｎｇ／ｍＬ 組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）で１０分間刺激した。陰性コントロールウェルは、ＥＧＦを受容しなかった。処理後、細胞単層を冷ＰＢＳで洗浄し、直ぐに冷溶解緩衝液（５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ、１０％ グリセロール、１％ ＮＰ４０、０．１％ ＳＤＳ、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ピロリン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ オルトバナジン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｇ／ｍＬ アプロチニン、５μｇ／ｍＬ ロイペプチン、５μｇ／ｍＬ ペプスタチン）で溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、ビオチン結合体化マウスモノクローナル抗ヒトＥＧＦＲ（２μｇ／ｍＬ；Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含む９６ウェルストレプトアビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に移し、２時間にわたってインキュベートした。プレートを、ＴＢＳＴ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ（ｐＨ７．２）、０．１％ ウシ血清アルブミン、および０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０）で３回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合体化抗ホスホチロシン抗体（１：１０，０００；Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）とともにインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を、ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ基質（Ｐｉｅｒｃｅ）の添加後に、Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーの中で上記プレートを読み取ることによって決定した。ＩＣ_５０値を、ＸＬ−６４７処理での全ＥＧＦＲチロシンリン酸化 対 増殖因子処理単独での全ＥＧＦＲチロシンリン酸化に基づいて決定し、レセプターレベルに対して正規化した。

ｗｔおよび変異型ＥＧＦＲに対するＸＬ−６４７の効果を、一過性にトランスフェクトしたＬｘ−１細胞を使用して、インビボで測定した。Ｌｘ−１細胞を使用したのは、それらが、バックグラウンドＥＧＦＲ活性を欠いているからである。最も長いＥＧＦＲアイソフォームに対応するクローン（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号 ＮＭ＿００５２２８．３／ＮＰ＿００５２１９．２ ♯２１−１７６，Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を、テンプレートとして使用して、部位特異的変異誘発によって２個の変異型ＥＧＦＲ遺伝子（Ｌ８５８ＲおよびＬ８６１Ｑをコードする）を生成した。ＷＴおよび上記２個の配列を確認した変異型を、ＣＯＯＨ末端Ｆｌａｇタグ化レトロウイルス性サイトメガロウイルスプロモーター駆動哺乳動物発現ベクターに移した。２個のＴｅｔ−Ｏｎ発現ベクター、ＥＧＦＲ ＷＴ（Ｔｅｔ−Ｏｎ）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ（Ｔｅｔ−Ｏｎ）（これらは、ＣＯＯＨ末端Ｆｌａｇタグ化されている）は、Ａｂｈｉｊｉｔ Ｇｕｈａ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）が惜しみなく提供してくれた。

Ｌｘ−１細胞の一過性トランスフェクションを、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って行った。上記ＷＴ、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑ構築物のトランスフェクションについては、１μｇ プラスミドＤＮＡを、各トランスフェクションに使用した（１２ウェルプレートの各ウェル）。Ｔｅｔ制御ＥＧＦＲ ＷＴおよび改変型ＩＩＩ構築物のトランスフェクションについては、０．５μｇのいずれかの構築物を、各トランスフェクションについて０．５μｇのｐＴｅｔ−Ｏｎプラスミド（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）と合わせた。細胞を、トランスフェクションの２４時間後に採取し、化合物処理のために９６ウェルプレート（４×１０^４細胞／ウェル）、もしくはイムノブロットアッセイのために１２ウェルプレート（２×１０^５細胞）のいずれかに再度プレーティングした。上記ＥＧＦＲｖＩＩＩ導入遺伝子の発現を、１μｇ／ｍＬ ドキシサイクリンを上記培地に添加することによって、トランスフェクション２４時間後、誘導した。これら細胞を、実験の残りのために、ドキシサイクリンの存在下で維持した。１２時間のインキュベーション後、上記細胞を血清欠乏にし（ウシ胎仔血清なしの培地中）、直ぐに、上記示された化合物で三連で２４時間にわたって処理し、続いて、組換えヒトＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）で１０分間処理した。全細胞溶解物を、ＥＧＦＲリン酸化ＥＬＩＳＡもしくはイムノブロットいずれかのために、各ウェルに、５０ｍｍｏｌ／Ｌ ＮａＦ、１ｍｍｏｌ／Ｌ ピロリン酸ナトリウム、１ｍｍｏｌ／Ｌ オルトバナジン酸ナトリウム、２ｍｍｏｌ／Ｌ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｇ／ｍＬ アプロチニン、および５μｇ／ｍＬ ロイペプチンに加えて、プロテアーゼインヒビター（Ｐｒｏｔｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｃｏｃｋｔａｉｌ Ｔａｂｌｅｔｓ，Ｒｏｃｈｅ）を含む放射性免疫沈降アッセイ緩衝液（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）を１２５μＬ添加することによって作製した。

上記ＥＧＦＲリン酸化ＥＬＩＳＡに関しては、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄストレプトアビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）を、２μｇ／ｍＬ ビオチン結合体化抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）でコーティングした。次いで、全細胞溶解物（１０μｇ）を、最終容積１００μＬにおいて、２時間にわたって室温で上記抗Ｆｌａｇコーティングウェルに添加し、次いで、ＴＢＳＴで３回洗浄した。抗ホスホチロシン西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体（１：１０，０００；Ｚｙｍｅｄ）を使用して、リン酸化されたＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；室温において１時間、続いて、ＴＢＳＴで３回洗浄）を検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼ活性を、ＥＬＩＳＡ Ｆｅｍｔｏ基質を添加した後に、Ｖｉｃｔｏｒ２プレートリーダーの中で上記プレートを読み取ることによって決定した。

上記ＥｐｈＢ４自己リン酸化ＥＬＩＳＡは、ＥｐｈＢ４／Ｈｅｐ３Ｂ細胞を利用した。細胞を、２×１０^４細胞／ウェルにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）に、１０％ ＦＢＳ（熱不活化，Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）および４５０μｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＭＥＭＥ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で播種した。次いで、上記細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２において２４時間にわたってインキュベートした。増殖培地を無血清ＭＥＭＥで置き換え、細胞を、さらに１６時間にわたってインキュベートした。新たな無血清培地中でのＸＬ−６４７の連続希釈物を、静止した細胞に添加し、１時間にわたってインキュベートし、その後、組換えマウスＥｐｈｒｉｎ Ｂ２／Ｆｃキメラタンパク質（２μｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヤギ抗ヒトＩｇＧ／Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）の混合物で３０分間刺激した。陰性コントロールウェルは、増殖因子で処理しなかった。処理後、培地を除去し、上記細胞単層を、冷ＰＢＳで洗浄し、直ぐに、冷溶解緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０、２００ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％ ＮＰ−４０、０．２％ デオキシコール酸ナトリウム、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ ピロリン酸ナトリウム、１ｍＭ オルトバナジン酸ナトリウム、２ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオリド、１０μｇ／ｍｌ アプロチニン、５μｇ／ｍｌ ロイペプチンおよび５μｇ／ｍｌ ペプスタチンＡ）で溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、抗マウスＥｐｈＢ４（２．５μｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングしたブロックされた（１％ ＢＳＡ）高結合９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９２５）中でインキュベートした。次いで、プレートを、ＨＲＰ結合体化抗ホスホチロシンカクテル（１：１０，０００，Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）とともにインキュベートし、続いて、ルミノールベースの基質溶液を添加した。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ分光光度計（Ｗａｌｌａｃ）を使用して読み取った。ＩＣ_５０値を、ＸＬ−６４７処理での全ＥｐｈＢ４レセプターチロシンリン酸化 対 増殖因子処理単独での全ＥｐｈＢ４レセプターチロシンリン酸化に基づいて決定した。

上記ＥｐｈＡ２自己リン酸化ＥＬＩＳＡは、ＰＣ−３（ＡＴＣＣ）細胞を利用した。細胞を、２．５×１０^４細胞／ウェルにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）に、１０％ ＦＢＳ（熱不活化，Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、および１％ ＮＥＡＡ溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で播種した。次いで、上記細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２において１６時間にわたってインキュベートした。増殖培地を無血清ＤＭＥＭで置き換え、細胞を、さらに２４時間にわたってインキュベートした。新たな無血清培地中でのＸＬ−６４７の連続希釈物を、静止した細胞に添加し、１時間にわたってインキュベートし、その後、組換えマウスＥｐｈｒｉｎ Ａ１／Ｆｃキメラタンパク質（１μｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）およびヤギ抗ヒトＩｇＧ／Ｆｃ（１０μｇ／ｍｌ，Ｐｉｅｒｃｅ）の混合物で２０分間刺激した。陰性コントロールウェルは、増殖因子で処理しなかった。処理後、培地を除去し、上記細胞単層を冷ＰＢＳで洗浄し、直ぐに、冷溶解緩衝液で溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、ビオチン結合体化マウス抗ホスホチロシンＰＹ２０（２μｇ／ｍｌ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）でコーティングした、９６ウェルストレプトアビジンコーティングプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）の中でインキュベートした。プレートを、ウサギポリクローナル抗ＥｐｈＡ２，Ｃ−２０（１：５００，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）、続いて、２次抗体（Ｃｅｌｌ ＳｉｇｎａｌｉｎｇのＨＲＰ結合体化ヤギ抗ウサギＩｇＧ，１：１０００）とともにインキュベートし、さらにルミノールベースの基質溶液を添加した。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ分光光度計（Ｗａｌｌａｃ）で読み取った。ＩＣ_５０値を、ＸＬ−６４７処理での全ＥｐｈＡ２レセプターチロシンリン酸化 対 増殖因子処理単独での全ＥｐｈＡ２レセプターチロシンリン酸化に基づいて決定した。

上記ｃ−Ｋｉｔ自己リン酸化ＥＬＩＳＡは、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ）細胞を利用した。細胞を、６×１０^５細胞／ウェルにおいて、１００ｍｍディッシュに播種した。２４時間後、ＨｅＬａ細胞を、Ｃ末端にＦｌａｇエピトープタグを有するヒトｃ−ｋｉｔのオープンリーディングフレームに作動可能に連結したＣＭＶプロモーターを含む哺乳動物発現プラスミドでトランスフェクトした。２４時間後、ｃ−ＫｉｔトランスフェクトＨｅＬａ細胞をトリプシン処理し、６×１０^３細胞／ウェルにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）へと、１０％ ＦＢＳ（熱不活化，Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、および１％ ＮＥＡＡ溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含むＤＭＥＭ（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で再度播種した。次いで、上記細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２において２４時間にわたってインキュベートした。新たな無血清培地中でのＸＬ−６４７の連続希釈物を、上記細胞に添加し、１時間にわたってインキュベートし、その後、１０分間組換えヒトＳＣＦで刺激（１００ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）した。陰性コントロールウェルは、刺激しないままであった。刺激の後、培地を除去し、上記細胞単層を冷ＰＢＳで洗浄し、直ぐに、冷溶解緩衝液で溶解した。溶解物を、ビオチン結合体化ヤギ抗ヒトｃ−Ｋｉｔ（１μｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングした、９６ウェルストレプトアビジンコーティング（Ｐｉｅｒｃｅ）中でインキュベートした。プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＨＲＰ結合体化抗ホスホチロシン（１：１０，０００，Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）もしくはＨＲＰ結合体化抗Ｆｌａｇ（Ｍ２）（１：２，０００，Ｓｉｇｍａ）のいずれかとともにインキュベートした。プレートを、上記のように再度洗浄し、続いて、ルミノールベースの基質溶液を添加し、Ｖｉｃｔｏｒ分光光度計（Ｗａｌｌａｃ）で読み取った。ＩＣ５０値を、ＸＬ−６４７処理でのｃ−Ｋｉｔチロシンリン酸化 対 ＳＣＦ処理単独でのｃ−Ｋｉｔチロシンリン酸化（正規化後）に基づいて決定した。

上記Ｆｌｔ−４自己リン酸化ＥＬＩＳＡは、ＣＯＳ細胞を利用した。細胞を、６ウェルプレート中、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）中で２００，０００細胞／ウェルにおいて播種し、５％ ＣＯ_２および３７℃において増殖させた。２４時間の増殖の後、細胞を、１μｇ／ウェル Ｆｌｔ−４ ｃＤＮＡで、３μｌ ＦｕＧＥＮＥ−６（Ｒｏｃｈｅ）を使用してトランスフェクトした。細胞を、トランスフェクション２４時間後、１時間にわたって新たな無血清ＤＭＥＭ中のＸＬ−６４７で処理し、次いで、３００ｎｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ−Ｃで１０分間にわたって刺激した。上記細胞単層を、冷ＰＢＳで２回洗浄し、１５０μｌ 氷冷溶解緩衝液へと掻き取ることによって採取した。細胞溶解物を、１３，０００ｇにおいて１５分間にわたって遠心分離にかけ、氷冷ＰＢＳで１：１０に希釈し、抗ヒトＶＥＧＦ−Ｃ（Ｆｌｔ−４）ビオチン化ヤギＩｇＧ（２μｇ／ウェル，Ｒ＆Ｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でコーティングした、透明なストレプトアビジンプレート（Ｐｉｅｒｃｅ）に移した。洗浄後、抗Ｆｌａｇ Ｍ２マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ １：１０，０００希釈）もしくは抗ホスホチロシンウサギＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｚｙｍｅｄ，６１−５８２０，１：１０，０００）を使用して、全Ｆｌｔ−４およびリン酸化Ｆｌｔ−４を検出した。サンプルを正規化し、ＩＣ_５０値を、ＸＬ−６４７処理でのＦｌｔ−４チロシンリン酸化とＶＥＧＦ−Ｃ処理単独でのＦｌｔ−４チロシンリン酸化とを比較することによって決定した。

上記ＥｒｂＢ２自己リン酸化ＥＬＩＳＡは、ＢＴ４７４（ＡＴＣＣ）細胞を利用した。細胞を、３×１０^４細胞／ウェルにおいて、９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９０４）へと、１０％ ＦＢＳ（熱不活化，Ｈｙｃｌｏｎｅ）、１％ ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、１％ ＮＥＡＡ溶液（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、および２％ Ｌ−グルタミン（Ｃｅｌｌｇｒｏ）を含む１：１（ＤＭＥＭ：Ｆ１２Ｋ）（Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で播種した。次いで、上記細胞を、３７℃、５％ ＣＯ_２において４０時間にわたってインキュベートした。細胞を、新たな無血清培地中でのＸＬ−６４７の連続希釈物で処理し、１時間にわたってインキュベートした。処理後、培地を除去し、上記細胞単層を冷ＰＢＳで洗浄し、直ぐに、冷溶解緩衝液で溶解した。溶解物を遠心分離にかけ、ウサギポリクローナル抗ＥｒｂＢ２（１．３μｇ／ｍｌ，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でコーティングした、ブロックした（１％ ＢＳＡ）９６ウェル高結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ ３９２５）に移した。次いで、プレートを、ＨＲＰ結合体化抗ホスホチロシンカクテル（１：１０，０００，Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ， Ｉｎｃ）とともにインキュベートし、続いて、ルミノールベースの基質溶液を添加した。プレートを、Ｖｉｃｔｏｒ分光光度計（Ｗａｌｌａｃ）で読み取った。ＩＣ_５０値を、化合物処理での全ＥｒｂＢ２チロシンリン酸化 対 化合物処理なしでの全ＥｒｂＢ２チロシンリン酸化に基づいて決定した。

（実施例５：イムノブロット分析）
ＸＬ−６４７で処理したＨ１９７５細胞の溶解物を、イムノブロットによって分析した。Ｈ１９７５イムノブロット研究のために、３×１０^５細胞を、各ウェル（１２ウェルプレート）にプレーティングし、１６時間にわたって完全ＲＰＭＩ １６４０中でインキュベートし、ウシ胎仔血清を含まないＲＰＭＩ １６４０ですすぎ、ウシ胎仔血清を含まない培地中での試験化合物の連続希釈物と２時間にわたってインキュベートし、続いて、１００ｎｇ／ｍＬ ヒト組換えＥＧＦで１０分間にわたって刺激した。全細胞タンパク質溶解物を、上記のように調製し、１０分間にわたって１３，０００×ｇにおいて４℃で遠心分離にかけて、いかなる不溶性物質をも除去した。全タンパク質を、ビシンコニン酸試薬を使用して決定し、等量のタンパク質を、ＬＤＳローディング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と、製造業者の説明書に従って合わせた。タンパク質を、４％〜１５％ ポリアクリルアミドゲルでのゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に転写し、イムノブロッティングによって検出した。抗体：抗原複合体を、化学発光を使用して検出した。Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製の以下の抗体を、１：１，０００希釈において使用した： 抗ＥＧＦＲ、抗ｐＥＧＦＲ^{Ｔｙｒ１０６８}、抗ＡＫＴ、抗ｐＡＫＴ^{Ｓｅｒ４７３}、抗ＥＲＫ、および抗ｐＥＲＫ^{Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４}。抗β−アクチン１次抗体（Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、１：１０，０００において使用し、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合２次抗体を、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入し、１：５，０００において使用した。

イムノブロッティングから、ＸＬ−６４７は、３０μｍｏｌ／Ｌおよび１０μｍｏｌ／ＬにおいてＥＧＦＲのリン酸化を阻害し、ＡＫＴおよびＥＲＫのリン酸化（これは、ＥＧＦＲリン酸化の下流にある）をも阻害することが示された。イムノブロットの一例は、Ｇｅｎｄｒｅａｕ ＳＢ， Ｖｅｎｔｕｒａ Ｒ， Ｋｅａｓｔ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ７９０Ｍ Ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＥＸＥＬ−７６４７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７１３， １３（１２） （２００７）（これらは、本明細書に参考として援用される）に見いだされ得る。

（実施例６：Ａ４３１異種移植片モデル）
雌性重症複合型免疫不全マウスおよび雌性無胸腺ヌードマウス（ＮＣｒ）（５〜８週齢および体重約２０〜２５ｇ）を、それぞれ、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ ＬａｂｏｒａｔｏｒｙおよびＴａｃｏｎｉｃから購入した。上記動物を、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ動物実験委員会によって概説される指針に従って、Ｅｘｅｌｉｘｉｓ飼育施設において飼育した。全ての研究の間、動物の飼料および水は不断給餌とし、７０^°Ｆ〜７５^°Ｆおよび６０％ 相対湿度に調整した部屋において飼育した。

処置前に、Ｈ１９７５細胞、Ａ４３１細胞、もしくはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、指数関数的に増殖している培養物から採取し、短時間のトリプシン処理によって剥離し、冷ＨＢＳＳ中で２回洗浄し、氷冷ＨＢＳＳ中に再懸濁し、ｓ．ｃ．（Ｈ１９７５，３×１０^６細胞／マウス）もしくはｉ．ｄ．（Ａ４３１，１×１０^６細胞／マウス）のいずれかで背側側腹部、またはｓ．ｃ．で乳腺脂肪パッド（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，１×１０^６細胞／マウス）へと移植した。触診できる腫瘍を、平均腫瘍重量が、約８０〜１２０ｍｇの範囲になるまでカリパスで１週間に２回測定した。腫瘍重量を、垂直方向の直径をカリパスで測定し、２次元の直径の測定値を乗算することによって決定した：腫瘍体積（ｍｍ^３）／２＝長さ（ｍｍ）×幅^２（ｍｍ^２）／２。腫瘍重量（ｍｇ）を、換算率１と仮定することによって、腫瘍体積（ｍｍ^３）から外挿した。移植後の適切な日に、群平均腫瘍重量が、約１００±１５ｍｇになるように、マウスを群分けした（１０マウス／群）。それぞれのコントロール群および処置群の各動物における上記平均腫瘍重量を、投与期間の間、１週間に２回測定した。腫瘍異種移植片を、雌性マウスにおいて確立し、処置前に約１００ｍｇに達するようにした。一例が、Ｇｅｎｄｒｅａｕ ＳＢ， Ｖｅｎｔｕｒａ Ｒ， Ｋｅａｓｔ Ｐ， ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｔ７９０Ｍ
Ｇａｔｅｋｅｅｐｅｒ Ｍｕｔａｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ＥＸＥＬ−７６４７， Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７１３， １３（１２） （２００７）（これは、本明細書に参考として援用される）に記載される。

処置に対する腫瘍の応答を、処置群の平均腫瘍重量と、適切なコントロール群とを比較することによって決定した。腫瘍増殖のパーセンテージ阻害を、以下の式で決定した：パーセンテージ阻害＝１００×［１−（Ｘ_ｆ−Ｘ_０）／（Ｙ_ｆ−Ｙ_０）］（ここでＸ_ｆおよびＹ_ｆは、それぞれ、上記処置群およびコントロール群のｆ日目の平均腫瘍重量であり、Ｘ_０およびＹ_０は、それぞれ、処置群およびコントロール群の０日目の平均腫瘍重量（群分け後の設定された腫瘍重量）である。

ＸＬ−６４７の経口投与後の血漿中の化合物レベルの決定のために、全血を、氷上のヘパリン化エッペンドルフチューブに入れ、２０，０００×ｇで４分間にわたって遠心分離した。その血漿上清（５０μＬ）を、１００μＬ 内部標準溶液（アセトニトリル中２５０ｎｇ／ｍＬ 内部標準）に添加し、ボルテックスして混合し、遠心分離にかけた。サンプル抽出物（２０μＬ）を、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によってＸＬ−６４７についてアッセイした。血漿レベルを、信頼できる標準曲線を使用して計算した。定量限界は、ＸＬ−６４７については０．００４μｍｏｌ／Ｌ（２ｎｇ／ｍＬ）であった。平均値およびＳＤを、各時点について計算し、用量濃度を評価した。

Ｈ１９７５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１および他の異種移植片の免疫組織化学分析については、安楽死の後に腫瘍を摘出し、パラフィンブロックの中へと加工処理する前に、亜鉛固定液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で４８時間にわたって固定した。５μｍ単位での連続切片を、各腫瘍について、可能な最大表面の面積から得、標準法に従って染色した。以下の抗体を使用した：Ｋｉ６７（ＳＰ６；Ｌａｂｖｉｓｉｏｎ）、ＣＤ３１（ＭＥＣＡ．３２；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ｐＥＲＫ^{Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４}（ホスホ−ｐ４４／４２マイトジェン活性化プロテインキナーゼ；Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｐＡＫＴ^{Ｓｅｒ４７３}（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびｐＥＧＦＲ^{Ｔｙｒ１０６８}（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。免疫蛍光染色のために、切片を、次いで、Ａｌｅｘａ
５９４結合体化ヤギ抗ウサギ２次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにインキュベートし、核対比染色として、４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）を含むＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｍｏｕｎｔｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＡＫＯ）中にマウントした。蛍光染色を、Ｚｅｉｓｓ ＡｘｉｏＩｍａｇｅｒを使用して可視化し、ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ画像分析ソフトウェアに結合したＺｅｉｓｓ高分解能カメラを使用して、デジタルで取り込んだ。３つの重複しない代表的視野のうちの２つを、組織学的読み取りに依存して、×２００もしくは×４００の倍率で取り込み、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈソフトウェア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．）における統合形態計測解析機能を用いて定量した。アポトーシス細胞を、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識インサイチュ細胞死検出キットを使用して、製造業者の説明書（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）に従って検出した。

ＡＣＩＳ自動細胞画像化システム（Ｃｌａｒｉｅｎｔ， Ｉｎｃ．）における統合形態計測解析機能を用いて、各腫瘍切片における、ＣＤ３１陽性腫瘍脈管、Ｋｉ６７陽性増殖細胞、およびｐＥＲＫ染色を同定および定量し、盲検の観察者によって検討させた。ＣＤ３１陽性脈管の数を、目に見える腫瘍組織において、×１００倍率において等しいサイズの５〜１０個の無作為に選択した視野にわたって同定し、各腫瘍に関して、脈管数／ｍｍ^２として計算し、各処置群で平均し、ビヒクル処置コントロールと比較した。パーセンテージＫｉ６７陽性細胞を、目に見える腫瘍組織において、等しいサイズの５〜１０個の無作為に選択された視野にわたって同定した全細胞数で除算したＫｉ６７陽性細胞の比として計算した。各腫瘍および処置群の結果を平均し、ビヒクル処置コントロールと比較した。ｐＥＲＫ染色のレベルを、上記のように決定し、同定された全細胞数で除算した抗体染色の比として計算し、各処置群で平均し、ビヒクル処置コントロールと比較した。

結果を、各グラフもしくは表について示されるように、平均±ＳＤもしくはＳＥとして表す。Ａ４３１細胞生存性実験におけるＩＣ_５０比較に関しては、２サンプルスチューデントｔ検定を適用して、用量応答曲線の周囲の反復物の無作為変動が、上記ｔ検定の「サンプルサイズ」として使用した個々の反復物（三連で行った９点の用量応答）で対数正規分布していると仮定して、各ＩＣ_５０対のＰ値を決定した。インビボ研究からの免疫組織化学結果の統計分析のために、両側スチューデントｔ検定分析およびボンフェローニの補正を行って、ビヒクルコントロール群（単一ビヒクルコントロール群の複数使用）と比較して有意差を同定した（Ｐ＜０．０５の累積最小要件を伴う）。上記Ｈ１９７５効力研究の終わりの最終腫瘍重量測定値、ならびにＨ１９７５異種移植片における、パーセンテージｐＥＧＦＲ、ｐＡＫＴ、Ｋｉ６７指数、ＣＤ３１、および末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介性ｄＵＴＰニック末端標識を、ＸＬ−６４７とエルロチニブとの間の統計的差異の決定のための、一元配置ＡＮＯＶＡ、続いて、ポストホックＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌ分析で分析した。

Ａ４３１異種移植片マウスにおいて、１４日間にわたるＸＬ−６４７（１０ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、および１００ｍｇ／ｋｇ／日）の１日１回の経口投与は、用量依存様式において腫瘍増殖を有意に阻害した。１０ｍｇ／ｋｇ／日において、６５％の腫瘍増殖阻害と、上記研究の終わりに向かって腫瘍増殖の停止の証拠が認められた。１００ｍｇ／ｋｇ／日の用量は、顕著な腫瘍退縮（出発重量：１０９±２０ｍｇ；最終重量：３６±１５ｍｇ）を生じた。

免疫組織化学分析から、１００ｍｇ／ｋｇ ｑｄ×１４によるＸＬ−６４７での雌性無胸腺ヌードマウスにおける皮下で増殖したＡ４３１腫瘍の処置は、ビヒクル処置腫瘍と比較して２．９倍、全腫瘍壊死のパーセンテージを有意に増大させることが示された（表１４）。生きている腫瘍組織におけるＣＤ３１陽性脈管のパーセンテージは、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、および１００ｍｇ／ｋｇのＸＬ−６４７での処置によって有意に低下した。腫瘍脈管形成のこの阻害は、用量依存性を示した。上記Ａ４３１腫瘍におけるＫｉ６７発現細胞のパーセンテージは、全ての用量レベルにおいて有意に低下した。このことは、上記研究の終わりに腫瘍中の増殖している細胞の数が低下していることを示す。

ＭＶＣ，平均脈管数；ＮＡ，適用不能
値は、平均±ＳＤである。

投与の１４日目に、全血を、終末心臓穿刺によって集め、ＸＬ−６４７の血漿濃度プロフィールを、液体クロマトグラフィーと質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）によって決定した。ＸＬ−６４７は、長期の血漿薬物曝露のＰＫプロフィールを示した。マイクロモル濃度の血漿濃度が、上記３０ｍｇ／ｋｇおよび１００ｍｇ／ｋｇの用量において上記研究の最終用量の投与後、最大２４時間まで観察された。

（実施例７：さらなる異種移植片腫瘍学モデル）
いくつかのさらなるのモデルを使用して、腫瘍増殖阻害およびインビボでの腫瘍退縮に関して、ＸＬ−６４７の効力および有効性を調査した。使用した腫瘍細胞株は、固形腫瘍の代表であり、表１５に列挙される。これら研究の標準実験設計では、上記で詳細に記載されるように、確立された固形腫瘍が指定された大きさ（大部分の異種移植片モデルについて約１００ｍｇ）に達したときに始めて、ＸＬ−６４７の１日１回の経口投与を含んだ。投与期間全体を通じて、腫瘍サイズを１週間に２回測定し（適切な場合）、体重を毎日測定した。ＸＬ−６４７は、これら研究において強力な抗腫瘍活性を示し、実質的な退縮が固形腫瘍に関して観察された。腫瘍を、いくつかの研究の終了時に摘出し、微小脈管密度（ＣＤ３１染色）、増殖している細胞（Ｋｉ６７染色）、および壊死（ヘマトキシリン／エオシン染色）に関して組織学的に試験した。腫瘍増殖の阻害は、一般に、増大した腫瘍壊死、低下した腫瘍血管新生、および低下した腫瘍細胞増殖指数と十分に相関した。このことは、抗脈管形成活性が、ＸＬ−６４７の強力な抗腫瘍効力に寄与したことを示唆する。

耐性を、体重を毎日測定することによってこれらの研究においてモニターした。ＸＬ−６４７は、一般に、１００ｍｇ／ｋｇ／日の１４日間にわたる投与において実質的な体重減少なしに、マウスにおいて十分に耐性であるようであった。

試験した株のうち、Ａ４３１およびＨＮ５は、最も感受性が高く、効果的なＸＬ−６４７用量は、上記Ａ４３１モデルに関して１４日間もしくは２８日間の投与後に、それぞれ、５．９ｍｇ／ｋｇ／日および３．８ｍｇ／ｋｇ／日において、および上記ＨＮ５モデルに関して１４日間の投与後に、３ｍｇ／ｋｇ／日未満において、推定される５０％腫瘍増殖阻害（ＥＤ_５０）を生じた（表１５にまとめる）。

Ａ４３１，類表皮がん；ＢＴ４７４，乳がん；Ｃａｌｕ−６，ＮＳＣＬＣ；Ｈ１９７５，ゲフィチニブおよびエルロチニブに抵抗性を付与するＥＧＦＲにおける活性化変異（Ｌ８５８Ｒ）および第２の部位の変異（Ｔ７９０Ｍ）の両方を含むＮＳＣＬＣ（Ｐａｏ ｅｔ
ａｌ．，２００５）；ＨＮ５，頭頸部がん；ＨＴ−２９，結腸がん；ＭＤＡ−ＭＤ−２３１，乳がん；ＮＤ，行わなかった；ＰＣ−３，前立腺がん；ｑｄ，１日に１回。
^ａ ＥＤ_５０＝５０％腫瘍阻害に必要な用量。腫瘍を有する無胸腺マウスを、１４日間または２８日間、ＸＬ６４７で処置した。

ＭＶＣ，平均脈管数；ＮＡ，適用不能；ＴＵＮＥＬ，末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼビオチン−ｄＵＴＰニック末端標識
値は、平均±ＳＤである
^ａ Ｐ＜０．０００１
^ｂ Ｐ＜０．００５。

ＮＡ，適用しない
値は、平均±ＳＤである
^ａ Ｐ＜０．０００１。

標的レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ）の活性に対するＸＬ−６４７のインビボ効果は、ＸＬ−６４７の経口（ＰＯ）投与後に（表１８）、以前記載されたものに類似の方法を使用して、腫瘍異種移植片（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２）もしくはマウス肺（ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ）においてレセプターリン酸化レベルを測定することによって評価した。

これら薬力学的実験のデータは、インビボで、ＸＬ−６４７が、腫瘍増殖および脈管形成の促進、ならびにＰＫＤ（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＶＥＧＦＲ２／ＫＤＲ）にも関与する重要なＲＴＫを阻害することを示す。このことは、複数の異種移植片に対するＸＬ−６４７の効力が、腫瘍細胞分裂および宿主内皮細胞応答の阻害から生じるという仮説の裏付けを提供する。一般に、試験した用量において、血漿薬物濃度の増大とレセプターのリン酸化の阻害の増大との間には良好な相関があった。１００ｍｇ／ｋｇのＸＬ−６４７の単一用量は、レセプターのリン酸化の長期の阻害を生じた（＞７２時間）。

血漿曝露およびＥＧＦＲの阻害についての薬力学の比較は、用量依存性を示した。血漿濃度４μＭは、Ａ４３１異種移植片においてＥＧＦＲリン酸化の８９％阻害を生じた（表１９）。血漿濃度／リン酸化ＥＧＦＲの阻害の関係性に基づいて、ＥＧＦＲリン酸化の５０％阻害は、血漿濃度０．７２μＭにおいて起こると推定される。

ＥＧＦＲ，表皮増殖因子レセプター；ＩＣ_５０，５０％阻害に必要とされる濃度；ＳＤ，標準偏差。
ＸＬ６４７を、ＥＧＦ投与の３．５時間前に投与した。ｐ−Ｙ−ＥＧＦＲレベルを、ＥＧＦ投与の３０分後に測定した。

ＸＬ−６４７が腫瘍増殖および血管新生に影響を及ぼす動態を、３日間、５日間、もしくは７日間にわたってＸＬ−６４７で毎日処置したマウスから採取した、切片化したＭＤＡ−ＭＢ−２３１異種移植片腫瘍に対する定量的免疫組織化学および組織学を使用して決定した。腫瘍増殖を、Ｓ期細胞を選択的に同定するＫｉ６７の染色によって測定した。腫瘍血管新生の程度を、内皮細胞マーカーＣＤ３１での染色によって測定した（表２０）。

^ａ ビヒクルに対して。

１００ｍｇ／ｋｇのＸＬ−６４７は、血管分布における迅速な低下を引き起こした。３日間での７６％阻害が明らかになり、上記腫瘍中のほぼ完全な内皮細胞の喪失が７日間で明らかになった。増殖している細胞の数の低下は、上記実験の期間にわたって徐々に起こった。５０％低下が７日目で認められた。

これら腫瘍からの微小血管喪失の迅速な開始および程度は、ＸＬ−６４７が、継続中の脈管形成のみを阻害するのではなく、新脈管構造における内皮細胞の生存に影響を及ぼすことを強く示唆する。

（実施例８：前臨床実施例−非臨床薬物動態）
ＸＬ−６４７の非臨床薬物動態（ＰＫ）を、マウス、ラット、イヌ、およびサルにおいて研究した。動物に、以下の表２１および表２２に記載されるように、１回もしくは数日間にわたって１日１回のいずれかで投与した。結果のまとめはまた、以下の表２１および表２２に見いだされ得る。ＸＬ−６４７を、１００％の生理食塩水との液体処方物として、または１０ｍｇ／ｋｇもしくは３０ｍｇ／ｋｇのゼラチンカプセル剤における固体として、投与した。全身薬物曝露（すなわち、ＡＵＣ）は、ラット（１０〜１００ｍｇ／ｋｇ）、サル（２〜２０ｍｇ／ｋｇ）、およびイヌ（３〜３０ｍｇ／ｋｇ）においては、低用量範囲にわたって、ほぼ用量に比例して増大するようであったが、単一用量研究においては、高用量範囲（ラットにおいては２００〜２０００ｍｇ／ｋｇ、サルにおいては５〜３００ｍｇ／ｋｇ、およびイヌにおいては１００〜１０００ｍｇ／ｋｇ）にわたって、用量比例値未満（ｌｅｓｓ ｔｈａｎ ｄｏｓｅ ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎａｌｌｙ）の増大であった。血漿中のＸＬ−６４７の最小（＜２倍）蓄積が、反復される１日１回の投与で認められた。平均ｔ_ｍａｘ値は、ほぼ４〜８時間であり、血漿終末半減期は、９．４１〜２０．９時間の範囲に及んだ。ＸＬ−６４７ ＰＫにおける明らかな性別関連差異は、観察されなかった。大きな分布容積（すなわち、ＩＶ投与後に＞１８Ｌ／ｋｇ）は、全ての種において認められた。ＸＬ−６４７は、マウス、ラットおよびイヌにおいて経口的に生体利用可能であった。最高の生体利用可能性を、イヌにおいて測定し（６３％〜７４％）、これは、錠剤および液体処方物に関して類似していた。

ＸＬ−６４７は、標準法を使用して限外濾過によって決定される場合、ラット、マウスおよびヒトの血漿中の血漿タンパク質に対して、中程度に高いタンパク質結合（９１〜９６％）を示した。平衡透析から、ＸＬ−６４７が、ヒト血漿において９３〜９７．５％のタンパク質と結合することを示した。

ＡＵＣ_０−ｔ，０時間〜最後のサンプリング時点までの血漿濃度 対 時間曲線下の面積；Ｃ_ｍａｘ，最大血漿濃度；Ｆ，雌性；ＧＩ，胃腸；ＧＬＰ，優良試験所基準；ＨＣＴ，ヘマトクリット；ＨＧＢ，ヘモグロビン；ＬＯＡＥＬ，観察可能な最低有害影響レベル；Ｍ，雄性；ＭＴＤ，最大耐量；ＮＡ，適用しない；ＮＯＡＥＬ，観察可能な有害影響レベルなし；ｐｏ，経口；ＲＢＣ，赤血球；ｔ_１／２，終末半減期。

Ａ／Ｇ比，アルブミン 対 グロブリン比；ＡＬＴ，アラニンアミノトランスフェラーゼ；ＡＳＴ，アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ；ＡＵＣ０−２４，０〜２４時間までの血漿薬物濃度時間曲線下の面積；ＢＵＮ，血中尿素窒素；Ｃｍａｘ，最大血漿濃度；Ｆ，雌性；ＧＩ，胃腸；ＧＬＰ，優良試験所基準；ＨＧＢ，ヘモグロビン；ＨＣＴ，ヘマトクリット；Ｍ，雄性；ＮＡ，利用可能でない；ＮＧ，経鼻胃；ＮＯＡＥＬ，観察可能な有害影響レベルなし；ｐｏ，経口；ｑｄ，１日１回；ｔ１／２，終末半減期
ａ 最後の用量の後に決定し、平均として報告した。別段示されなければ、雄性および雌性の組み合わせに適用可能。
ｂ トキシコキネティクス値は、７日目のものである。
ｃ 値は、７日目の０〜４８時間のサンプリングに基づく。

（実施例９：ヒト臨床試験のまとめ）
ＸＬ−６４７を、５０ｍｇの白色から灰白色の錠剤として提供した。これら錠剤を、２つの構成において提供する：１）白色から灰白色の楕円形錠剤（一方で分割でき、他方は平ら）。３３．３３％ 薬物濃度処方物において５０ｍｇのＸＬ−６４７を含む、および２）白色から灰白色の円い錠剤。５０％ 薬物濃度処方物において５０ｍｇのＸＬ−６４７を含む。

両方の即時放出のラクトースベース処方物についての組成は、以下の表２３および表２４に提供される。上記２種のＸＬ−６４７処方物の比較溶解研究を、インビボ生体利用可能性に関連する条件下で評価し、両方の処方物の適合性を確認した。全ての研究医薬を、室温において貯蔵し、適用可能な州および連邦の規則に従って目録に記入した。研究薬物を再パッケージングした場合、それを、高密度ポリエチレン（ＨＤＰＥ）バイアルの中に分注した。

個々の研究を、以下のように行った：
研究ＸＬ−６４７−００１：進行した固形腫瘍を有する被験体（ｎ＝４１）に、１４日サイクルの間欠性投与スケジュール（「間欠性５＆９スケジュール」）で投与した。１〜５日目に、被験体に、ＸＬ−６４７を与え、続く９日間（６〜１４日目）は処置しなかった。ＸＬ−６４７を、上記間欠性５＆９スケジュールにおいて、０．０６〜７．００ｍｇ／ｋｇの範囲の用量レベルで、種々の固体腫瘍を有する４１名の被験体に投与した。登録は完全であり、全ての被験体が、２００７年５月３１日に研究を終えた。被験体には、最初に、ボトル中の粉末（ＰＩＢ）の処方物を、質量ベースの投与を使用して与えた。上記ＭＴＤを、４．６８ｍｇ／ｋｇであると決定し、これを、固定した用量３５０ｍｇに変換した。最終のコホートには、錠剤処方物中３５０ｍｇの固定した用量を与えた。

研究ＸＬ−６４７−００２：進行した固形腫瘍を有する被験体を、単一経口用量において毎日ＸＬ−６４７を受容するように、一連のコホートに登録した。合計３１名の被験体を、７５〜３５０ｍｇの範囲に及ぶ５種の用量レベルにわたって処置した。上記ＭＴＤを、３００ｍｇであると決定し、１８名の被験体を、この用量レベルにおいて処置した。

研究ＸＬ−６４７−００４：健康なボランティア（ｎ＝２４）に、摂食状態もしくは絶食状態のいずれかにおいて、ＸＬ−６４７の単一の３００ｍｇ用量を与え、次いで、２２日後に、逆のアームへと交換した。生体利用可能性に対する食品の効果を分析した。

研究ＸＬ−６４７−００５：健康なボランティア（ｎ＝８）に、標識したＸＬ−６４７（^１４Ｃ−ＸＬ−６４７）の単一の経口用量３００ｍｇを与え、薬物代謝および排除を評価した。吸収、代謝、排出、およびマスバランスを分析した。

研究ＸＬ−６４７−２０１：腺腫内がん（ａｄｅｎｏｍａｃａｒｃｉｎｏｍａ）組織の非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（ステージＩＩＩＢ（悪性胸水を伴う）もしくはステージＩＶ（転移性疾患について以前処置しなかった））を有する被験体（ｎ＝５２）を登録した。被験体を、ＥＧＦＲインヒビターへの応答を予測する臨床的特徴（アジア人、女性、および／もしくは最小限の過去の喫煙歴）について選択した。ＸＬ−６４７を、上記間欠性５＆９スケジュールで３５０ｍｇ（ｎ＝４１）、もしくは１日１回スケジュールで３００ｍｇ（ｎ＝１３）のいずれかとして投与した。

研究ＸＬ−６４７−２０３：回帰もしくは再発性ＮＳＣＬＣ（ステージＩＩＩＢもしくはステージＩＶ）を有する被験体（ｎ＝４１）（エルロチニブもしくはゲフィチニブでの単一薬剤処置からの利益の後に進行性疾患が記録されたか、または公知のＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異を有する）を、登録した。被験体には、３００ｍｇのＸＬ−６４７を経口で１日に１回与えた。

２００８年８月１日現在で、臨床安全性データは、ＸＬ−６４７で処置したがんを有する１５９名の被験体について利用可能である。単一薬剤ＸＬ−６４７を受けている被験体が経験した最も一般的な有害事象（ＡＥ）（頻度≧１０％，頻度が低下する順に）は、下痢、発疹、疲労、悪心、乾燥肌、咳、呼吸困難、食欲不振、心電図のＱＴ延長（機械読み取り）、嘔吐、便秘、味覚異常、上気道感染、腹痛、背部痛、発熱、目眩、およびドライマウスであった。これらＡＥの大部分は、グレード１もしくはグレード２であり、研究薬物中止を生じなかった。研究薬物が原因となった死亡はなかった。

抗腫瘍活性を、上記間欠性５＆９スケジュールおよび毎日投与スケジュールの両方においてＸＬ−６４７を受けている被験体において観察した。間欠性スケジュールを使用する第１相研究において、ＮＳＣＬＣを有する１名の被験体は、未確認の部分応答（ＰＲ）を得た場合に、２２８日目まで安定した疾患を有し、１４名の他の被験体（ＮＳＣＬＣを有する３名の被験体を含む）は、３ヶ月間より長く継続する長期の安定した疾患（ＳＤ）を有した。第２の第１相研究であるＸＬ−６４７−００２において、１６名の被験体（ＮＳＣＬＣを有する３名の被験体を含む）は、３ヶ月間より長く継続するＳＤを達成した。上記５＆９スケジュールにおける第２相研究ＸＬ−６４７−２０１に登録した上記３８名の評価可能な被験体（第一線，ＥＧＦＲ変異について濃縮するように臨床的特徴について選択された被験体において）のうち、１０名の被験体はＰＲを有し、１７名の被験体は、７１％という臨床利益率（ＰＲ＋ＳＤ）に関して３ヶ月以上持続するＳＤを経験した。臨床利益を達成したこれらの被験体のうち、腫瘍がＥＧＦＲエキソン１９欠失を含んでいた６名の被験体およびＬ８５８Ｒ変異を有する１名の被験体は、ＰＲを経験し、Ｌ８５８Ｒ点変異を有する２名は、ＳＤを有した。回帰もしくは再発性ＮＳＣＬＣを有する被験体（ステージＩＩＩＢもしくはステージＩＶ，ｎ＝４１）（エルロチニブもしくはゲフィチニブでの単一薬剤からの利益の後に進行性疾患が記録されたか、または公知のＥＧＦＲ Ｔ７９０Ｍ変異を有する）における第２の第２相研究において、１名の被験体は、ＰＲを達成し、１９名の被験体は、それらの最良の応答としてＳＤを達成した。

上記間欠性５＆９スケジュールにおいてＸＬ−６４７の経口用量を受けている被験体の臨床薬物動態（ＰＫ）データの予備分析において、濃度時間曲線下の面積（ＡＵＣ）および最大血漿薬物濃度（Ｃｍａｘ）は、一般に、研究した全用量範囲（すなわち、３．４〜５８６ｍｇの全用量）にわたって、用量と比例して増大した。５連続用量後のメジアン終末半減期は、約６０時間であり、一般に、用量とは無関係であるようであった。ＸＬ−６４７は、経口投与後に迅速に吸収され、メジアンｔ_ｍａｘは約４時間であった。３００ｍｇ／日（ＭＴＤ）での１日１回の経口投与後に、ＸＬ−６４７は血漿中に約４倍蓄積し、定常状態は、約１５日目までに達成された。３００ｍｇ ＸＬ−６４７の１日１回の投与は、３５０ｍｇの間欠性５＆９投与に対して、２８日の期間にわたる平均曝露において約２倍の増大を生じた。

非臨床的およびインビトロ代謝プロファイリング研究から、ＸＬ−６４７は、ヒト肝臓ミクロソームにおけるＣＹＰ３Ａ４媒介性代謝の基質であることが示唆される。ＸＬ−６４７は、インビトロでアイソザイムＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｃ８のインヒビターであったが、ヒト肝臓ミクロソーム中のＣＹＰ３Ａ４のインヒビターではなかった。ＸＬ−６４７は、複数の種において経口で生体利用可能であり、ヒト血漿において非常にタンパク質に結合する（９３〜９９％）。

健康な被験体における臨床的食品効果研究（ＸＬ−６４７−００４）において、ＡＵＣは、食品の存在下で約１８％増大したのに対して、Ｃ_ｍａｘは、約５％だけ増大するに過ぎなかった。従って、食品を伴ったＸＬ−６４７の投与、またはＣＹＰ３Ａ４の活性を阻害する薬物もしくは物質と組み合わせた場合は、上昇したＸＬ−６４７曝露を生じ得る。

マスバランス研究からの予備データから、ＸＬ−６４７は、顕著に代謝され、主に糞便中に排出されることが示唆された。

Claims (1)

1. 本明細書に記載の発明。