EA023475B1

EA023475B1 - РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFK4, ОБЕСПЕЧИВАЮЩАЯ СИНТЕЗ РЕКОМБИНАНТНОГО ПЕПТИДА RL4, ЯВЛЯЮЩЕГОСЯ АНАЛОГОМ ФРАГМЕНТА КАППА-КАЗЕИНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI XL1-BLUE/pFK4 И РЕКОМБИНАНТНЫЙ ПЕПТИД RL4 - АНАЛОГ ФРАГМЕНТА КАППА-КАЗЕИНА ЧЕЛОВЕКА, ОБЛАДАЮЩИЙ АПОПТОТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАКОВЫМ КЛЕТКАМ

Info

Publication number: EA023475B1
Application number: EA201201337A
Authority: EA
Inventors: Мирослава Олеговна Потапенко; Анна Валентиновна Савельева; Александр Сергеевич Фомин; Галина Павловна Трошкова; Ольга Александровна Коваль; Елена Владимировна Кулигина; Дмитрий Владимирович Семенов; Владимир Александрович Рихтер
Priority date: 2012-10-08
Filing date: 2012-10-08
Publication date: 2016-06-30
Also published as: EA201201337A1

Abstract

Изобретение относится к рекомбинантной плазмидной ДНК, обеспечивающей увеличенный выход рекомбинантного пептида RL4, содержащего фрагмент каппа-казеина человека, рекомбинантному штамму Escherichia coli (депонированному в КЭМТК ИХБФМ СО РАН под номером ЭМТК 1347), который продуцирует с увеличенным выходом рекомбинантный пептид RL4 - аналог каппа-казенина человека, и рекомбинантному пептиду RL4, обладающему увеличенной апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам, который состоит из трех компонентов: N-концевой полигистидиновой последовательности MRGSHHHHHHGS, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности, и фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 а.о. Изобретение может быть использовано в биотехнологии.

Description

Изобретение относится к рекомбинантной плазмидной ДНК с фрагментами каппа-казеина человека, обеспечивающей синтез рекомбинантного пептида - аналога каппа-казеина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам, рекомбинантному штамму ЕксйейсЫа сой - продуценту пептида - аналога каппа-казенина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам и рекомбинантному пептиду - аналогу каппа-казенина человека, обладающему апоптотической активностью по отношению к опухолевым клеткам, и может быть использовано в биотехнологии, в частности в генетической и белковой инженерии.

Одним из возможных перспективных подходов для эффективного лечения опухолей могут стать препараты, способные избирательно вызывать апоптоз в раковых клетках, не повреждая здоровые клетки организма.

Известно, что молоко человека содержит белки и пептиды, вызывающие апоптотическую гибель клеток аденокарциномы молочной железы МСР-7 [1]. Один из таких проапоптотических пептидов был выделен из молока, имеет молекулярную массу 8.6 кДа, содержит установленную последовательность из 74 аминокислотных остатков, в которую входит протеолитический фрагмент каппа-казеина с 63 по 123 аминокислотный остаток, и получил название лактаптин (патент КИ 2317304 С1. 2008) [2]. Данный пептид (лактаптин) индуцирует гибель клеток МСР-7 при минимальной концентрации 10 мкг/мл. При этом прекращается пролиферация клеточной культуры и в течение 12 ч погибает около 10% клеток. Повышение концентрации пептида в среде до 100 мкг/мл приводит к гибели 50-70% клеток аденокарциномы молочной железы МСР-7 в течение 12 ч.

Однако, доступность природного пептида является низкой, а стоимость получения очень высокой.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является рекомбинантный аналог (лактаптин КР2) природного пептида, сконструированный и рассчитанный на основании результатов ΜΑΡΌΙ-ΤΟΡ массспектрометрии, касающихся наиболее вероятной первичной структуры природного пептида (патент КИ 2401307 С1. 2010) [3].

Наиболее близкими аналогами (прототипами) являются также рекомбинантная плазмидная ДНК рРК2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппаказеина человека, в клетках ЕксйейсЫа сой, с молекулярной массой 2,1 МДа и размером 3164 п.о., содержащая плазмидный вектор ρΟδΌΙ, гидролизованный по 8ай и В§1й сайтам и содержащий сайт инициации репликации плазмиды рВК322, промотор фага Т7 и уникальные сайты рестрикции ЕсоК I (1595), Β§1 II (1613), 8а1 I (1985), Ρκΐ I (1995), Ηίηά III (2000), С1а I (2053); В§1 й-8а1 I фрагмент размером 372 п.о., включающий стартовый кодон, сегмент, кодирующий фрагмент каппа-казеина человека с 24 по 134 аминокислотный остаток и олигопептид с последовательностью ΟΟδΗΗΗΗΗΗ, и стоп-кодон; генетические маркеры: АМРг - ген ампициллин резистентности (ген бетта-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации ЕксйейсЫа сой, а также рекомбинантный штамм ЕксйейсЫа сой ХЬ1В1ие/рРК2 - продуцент рекомбинантного пептида, аналога фрагмента каппа-казеина человека (лактаптин КР2) [3]. Первичная структура КР2 соответствует структуре фрагмента каппа-казеина человека (с 23 по 134 аминокислотный остаток) с шестью дополнительными остатками гистидина на С-конце. Рекомбинантный аналог лактаптина КЬ2 также индуцирует апоптоз клеток МСР-7. КР2 индуцирует диссипацию трансмембранного потенциала митохондрий клеток МСР-7 и приводит к активации инициаторных каспаз 8, 9 и эффекторной каспазы 7 [4]. Активация каскада каспаз в конечном итоге приводит к протеолитическому расщепления различных клеточных белков и вызывает широкий спектр морфологических изменений, характерных для клеток, подвергающихся апоптозу. Выход белка после его очистки аффинной хроматографией на Νί-ΝΤΑ агарозе составляет 150 мкг из 500 мл культуры клеток ЕксйейсЫа сой.

Недостатком прототипов является невысокий уровень синтеза рекомбинантного аналога (лактаптина КР2) природного пептида и его недостаточная апоптическая активность в отношении раковых клеток. Одностадийная хроматографическая очистка приводит к снижению качества пептида и ограничивает возможность его использования для промышленного производства субстанции медицинского назначения. Техническим результатом заявляемого изобретения является создание плазмиды, обеспечивающей увеличение синтеза рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, и создание более продуктивного (с более высоким выходом целевого пептида) бактериального штамма-продуцента, позволяющего получать рекомбинантный пептид - аналог каппа-казеина человека, обладающего более высокой апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.

Указанный технический результат достигается получением рекомбинантной плазмидной ДНК рРК4, обеспечивающей синтез рекомбинантного пептида КР4, являющегося аналогом фрагмента каппаказеина человека, с молекулярной массой 2,41 МДа и размером 3653 п.о., содержащая в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:

Ват ΗΡΗίηά III - фрагмент плазмидной ДНК рРК4 размером 264 п.о., имеющий нуклеотидную последовательность и кодируемую ею аминокислотную последовательность, представленные на фиг. 1 а, и состоящий из трех компонентов, кодирующих последовательность: пептида с аминокислотной последовательностью ΜКΟδΗΗΗΗΗΗΟδ, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности и фрагмента каппа-казеина с 49 по 122 аминокислотный остаток;

- 1 023475 фрагмент плазмидного вектора рЦЕ30, обеспечивающий эффективную экспрессию фрагмента каппа-казеина человека и содержащий:

а) сайт инициации репликации плазмиды рВР322;

б) промотор бактериофага Т5;

в) генетические маркеры: АМРг - ген ампициллин резистентности (ген β-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации ЕзсйепсЫа сой;

г) уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Ауа I (2), Есо Р (89), Ват ΗΙ (146), Ηίηά III (380), Ысо I (1053), Ара Ы (1585), Ара Ы (2083), Ара и (3329).

Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного штамма бактерий ЕзсйепсЫа сой ХЬ1-В1ие/рРК4, содержащего рекомбинантную плазмидную ДНК рРК4 по п.1 формулы и депонированного в Межинститутском Центре коллективного пользования СО РАН Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур (КЭМТК) ИХБФМ СО РАН под номером № ЭМТК 1347 (справка о депонировании прилагается), - продуцента пептида РЬ4 - аналога фрагмента каппа-казеина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.

Указанный технический результат достигается также получением рекомбинантного пептида РЬ4 аналога фрагмента каппа-казеина человека, включающего аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: I, представленную на фиг. 16, состоящего из остатка метионина, фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 аминокислотный остаток и Νконцевой гистидиновой последовательности, имеющего молекулярную массу 10,2 кДа и обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.

Трансформация полученной плазмидой клеток ЕзсйепсЫа сой обеспечивает синтез рекомбинантного пептида, аналога фрагмента каппа-казеина человека, обладающего апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам, с выходом белка не менее 6,8 мг на 1 л культуры клеток ЕзсйепсЫа сой (не менее 20% от суммарного содержания белка клеток).

Сведения, поясняющие сущность изобретения

Генно-инженерными методами получают плазмиду рРК4, несущую ген, кодирующий рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, созданный на основе последовательности ДНК, кодирующей фрагмент каппа-казеина человека с 49 по 122 (РЬ4) аминокислотный остаток и гистидиновый олигопептид.

Исходным генетическим материалом для конструирования рекомбинантной плазмиды рРК4 являются:

а) плазмидный вектор рЦЕ30 [5], обеспечивающий встройку фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, его экспрессию под контролем раннего промотора Т5 ДНК-полимеразы;

б) фрагмент ДНК, кодирующий фрагмент каппа-казеина с 49 по 122 аминокислотный остаток, который получают в полимеразной цепной реакции с использованием в качестве матрицы рекомбинантной плазмидной ДНК рОГОВЕКА содержащий фрагмент каппа-казеина человека РК2 большей длины, и олигонуклеотидных праймеров, обеспечивающих наличие в амплификационном фрагменте сайтов рестрикции Ват Ш и Ηίηά III

5’ТАТАООАТССАТСТАТТАТСТСССАААТ (серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ват Ш, подчеркиванием выделен кодон, кодирующий метионин, введенный в конструкцию после нуклеотидной последовательности, кодирующей шесть остатков гистидина); и

(серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ηίηά III, подчеркиванием выделен введенный терминирующий кодон).

Клетки Е.сой ВЬ21(НЕ3), несущие ген РНК-полимеразы фага Т5 под индуцибельным 1асИУ5 промотором, трансформируют сконструированной плазмидой рРК4 и выращивают в течение ночи. Ночную культуру (1/100) засевают в свежую среду ΥΤχ2 с ампициллином (100 мкг/мл). Синтез РНК-полимеразы индуцируют добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 0,3 мМ в тот момент, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растят 18 ч при температуре 30°С, после чего собирают центрифугированием при 5000д. Индуцированные клетки Е.сой ВЬ21(НЕ2)/рРК4 используют для очистки рекомбинантного фрагмента каппа-казеина человека с помощью аффинной хроматографии. В результате получают рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, имеющий молекулярную массу около 10 кДа, состоящий из Ν-концевой гистидиновой последовательности, остатка метионина и фрагмента каппа-казеина человека (с 49 по 122 аминокислотный остаток -РЬ4). Полученный пептид, включающий аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеотидной последовательностью 8ЕЦ ГО N0: 2 для фрагмента № 4 (фиг. 1), обладает апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека.

Полученный штамм Е.сой ХР1-В1ие/рРК4 не является зоопатогенным и фитопатогенным, депонирован в Межинститутском Центре коллективного пользования СО РАН Коллекция экстремофильных микроорганизмов и типовых культур (КЭМТК) ИХБФМ СО РАН и характеризуется следующими при- 2 023475 знаками:

Культурально-морфологические признаки: клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Ийко - колонии круглые, гладкие, прижатые, мутные, блестящие, серые, край ровный. При росте на жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или ЬВ бульоне) образуют интенсивную ровную муть. Клетки растут при температуре 37°С при оптимуме рН от 6,8 до 7,5.

Продукт, синтезируемый штаммом: рекомбинантный пептид, являющийся аналогом фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 аминокислотный остаток с Ν-концевой гистидиновой последовательностью и обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.

Активность (продуктивность) штамма: при культивировании в бульоне Лурия при 30°С после индукции 0,3 мМ ИПТГ уровень продукции целевого белка через 18 ч составляет 28 мг из 1 л суспензионной культуры клеток Е.сой ВЬ21(ИЕ3)/рРК4, проведено более 20 пассажей.

Способ определения активности штамма: активность штамма определяется по апоптотической активности очищенного рекомбинантного пептида, аналога фрагмента каппа-казеина человека, по отношению к раковым клеткам, например клеткам аденокарциномы молочной железы человека линии МСР-7.

Способ, условия и состав сред для длительного хранения штамма: лиофилизация, низкотемпературное замораживание в бульоне Лурия, содержащем 25% глицерина.

Способ, условия и состав сред для размножения: культивировать при 37°С на агаре Лурия с ампициллином (100 мкг/мл) или в бульоне Лурия с ампициллином (100 мкг/мл).

Условия и состав среды для ферментации: бульон Лурия с ампициллином (100 мкг/мл), индукция ИПТГ (0,3 мМ).

Генетические особенности штамма: клетки проявляют устойчивость к ампициллину (100 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды.

Рекомендуемые условия хранения: при 4°С на минимальном агаре с ампициллином (100 мкг/мл).

Изобретение иллюстрируется следующими графическими материалами:

На фиг. 1а приведена нуклеотидная последовательность, а на фиг. 1б - кодируемая ею аминокислотная последовательность Ват ΗΙ/Ηίηά ΙΙΙ-фрагмента плазмиды рРК4, кодирующая фрагмент каппаказеина человека с 49 по 122 аминокислотный остаток с Ν-концевой гистидиновой последовательностью. На фиг. 2 представлена физическая и генетическая карта плазмиды рРК4. РК4 ген, кодирующий рекомбинантный аналог каппа-казеина человека, КВ8 - сайт посадки рибосом, Т5 - промотор фага Т5, АМРгген устойчивости к ампициллину; указаны некоторые сайты рестрикции. На фиг. 3 приведена электрофореграмма в 12% 8И8-ПААГ белков фракций, полученных последовательным выделением аналога лактаптина КЬ4 аффинной хроматографией на Νί-ΝΤΑ сефарозе и ионообменной хроматографией на 8Рсефарозе и МасгоРгер ИЕАЕ.

Дорожки: 1 - белковые-маркеры, молекулярная масса в кДа приведена слева, 2 - рекомбинантный аналог лактаптина КТ2 (17 кДа), 3 -белки супернатанта лизата клеток-продуцентов Е.сой, трансформированных плазмидой рРК4 и культивированных с индукцией ИПТГ, 4 - белки, не взаимодействующие с Νί-ΝΤΑ сефарозой, 5 - белки, элюируемые 50 мМ имидазола, 6 - белки, элюируемые 200 мМ имидазола, 7 - белки, элюируемые 6М гуанидин-НС1 с 0.1М ЭДТА, 8 - белки, не взаимодействующие с 8Р-сефарозой (дорожка 7), 9 - белки фракции, содержащей КЬ4, элюируемые с 8Р-сефарозы в градиенте мочевины и №С1, 10 - белки фракции, содержащей КЬ4 (дорожка 9), элюируемые при нанесении на сорбент МасгоРгер ИЕАЕ, 11 - белки, элюируемые в градиенте мочевины и №С1 с МасгоРгер ИЕАЕ. Ниже приведены конкретные примеры выполнения изобретения.

Пример 1. Технология конструирования плазмиды рРК4.

На основе результатов секвенирования Ν-конца лактаптина, выделенного из женского молока, была выбрана аминокислотная последовательность каппа-казеина, которая с наибольшей вероятностью соответствует последовательности природного лактаптина

ΥΥνΡΧίίνΊ'νΥΟΤΝΓΥΟΗΚΡΑΙΑΙΝΝΡννΡΠ-η,ΎΛΧΡΛνΛΚΡΗ.ΛΟΙΡΟ ΚΟΥΓΡΝ3ΙΙΡΡΤΥνΚΚΡΝ1.ΗΡ8ΓΙ А1РР (фрагмент № 4).

В качестве источника гена, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, использовали плазмидную ДНК рРК2, использованную для получения рекомбинантного аналога КТ2 и содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующие фрагменты ДНК каппа-казеина № 4. Амплификацию гена, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, проводили методом ПЦР с использованием Тас| ДНКполимеразы (ЗАО Биосан, ИХБФМ СО РАН), которая позволяет синтезировать продукты с частотой мутаций около 1х10^-4 ошибок/нуклеотид. Для синтеза фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент каппаказеина человека, в реакционную смесь добавляли праймеры

(серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ват ΗΙ, подчеркиванием выделен кодон, кодирующий метионин, введенный в конструкцию после нуклеотидной последовательности, кодирующей шесть остатков гистидина) и

- 3 023475 (серым цветом выделен сайт эндонуклеазы рестрикции Ηίηά III, курсивом выделен введенный терминирующий кодон), соответствующих 5'- и 3'-концу ДНК, кодирующей фрагмент каппа-казеина с 49 по 122 аминокислотный остаток, и обеспечивающих в амплификационном фрагменте наличие сайтов рестрикции Ват ΗΙ и Ηίηά III.

Реакцию проводили с использованием технологии горячего старта в амплификаторе Ма81егсуе1ег βίτιάίοηΐ (ЕррегкогГ. США). Условия проведения ПЦР: предварительная денатурация - 5 мин при 95°С; 30 циклов - 15 с при 95°С, 30 с при 58°С, 20 с при 72°С; заключительная стадия - 5 мин при 72°С.

Продукты амплификации, кодирующие фрагмент каппа-казеина человека, расщепляли рестриктазами Ват Ш и Ηίηά III в реакционной смеси, содержащей рестрикционный буфер ТапдоТМ, 10 ед. активности Ват Ш и 20 ед. активности Ηίηά III. Аналогично проводили обработку рестриктазами ДНК векторной плазмиды рЦЕ30. Реакцию вели 3 ч при 37°С. После этого ПЦР-фрагмент и линеаризованный вектор очищали электрофорезом в 1,5%-ном агарозном геле с последующим выделением ДНК с помощью набора СеηЕ1иΐе Се1 ΕχΙπ-ιαΙίοη Κίΐ (§1§та, США) в соответствии с рекомендациями производителя.

Лигирование фрагмента ДНК, кодирующего фрагмент каппа-казеина человека, и векторной ДНК проводили в стандартных условиях [6].

Пример 2. Получение штамма-продуцента фрагментов каппа-казеина человека - продуктов плазмиды рРК4.

Клетки Е.соП ХЬ1-В1ие трансформировали сконструированной плазмидой рРК4, имеющей фаговый промотор Т5 под контролем двух последовательностей 1ас оператора, который узнается РНК полимеразой Е.сой. Трансформированные клетки Е.соП выращивали в течение ночи. Ночную культуру (1/100) засевали в свежую среду ΥΤχ2 с ампициллином (100 мкг/мл). Экспрессию целевого белка индуцировали добавлением изопропилтиогалактазида до концентрации 0,3 мМ в тот момент, когда культура достигает среднелогарифмической фазы роста. Индуцированные клетки растили 18 ч при температуре 30°С, после чего собирали центрифугированием при 5000д и анализировали методом электрофореза по Лэммли [7] в 12%-ном 8И8-полиакриламидном геле (ПААГ).

Результаты этого анализа (электрофорез и иммуноблот в 12% 8И8-ПААГ лизатов клеток Е.соП ХЕ1-В1ие, трансформированных плазмидой рРК4 в присутствие индуктора ИПТГ и без него), показали наличие в индуцированной культуре клеток Е.сой ХЕ1-В1ие/рРК4 дополнительного белка с молекулярной массой около 10 кДа, который отсутствовал в контрольных лизатах клеток Е.сой ХЬ1-В1ие/рРК4.

Пример 3. Технология очистки рекомбинантного пептида КЕ4 - аналога фрагмента каппа-казеина человека из клеток Е.сой ХЬ1-В1ие/рРК4.

Индуцированные клетки Е.сой ХЬ1-В1ие/рРК4 использовали для очистки рекомбинантных фрагментов каппа-казеина человека с помощью аффинной хроматографии на Νί-ΝΤΑ сефарозе (Вю^-к США), согласно инструкции производителя.

Для этого клетки Е.сой осаждали из культуральной среды центрифугированием при 5000д 30 мин при температуре 4°С. Биомассу суспендировали в 5 объемах лизирующего буфера (50 мМ ^-фосфатный буфер рΗ 9.0, 300 мМ №С1, 10 мМ имидазол, 1 мМ фенилметилсульфонил фторид, 10 мМ 2меркаптоэтанол, 4М мочевина). Клетки лизировали ультразвуком с использованием дезинтегратора УЗДН-1 У4.2, с генератором 22 кГц (5 подходов по 30 с, 200-300 А, с охлаждением во льду в перерывах между подходами). Лизат центрифугировали 30 мин при 10000д при 4°С.

Супернатант наносили на хроматографическую колонку, упакованную 10 мл Νί-ΝΤΑ сефарозы (Ргойш1у [МАС Вю^-к США) и уравновешенную лизирующим буфером, со скоростью 1 мл/мин. Не связавшиеся с сорбентом белки элюировали лизирующим буфером. Для удаления неспецифически сорбирующихся белков Е.сой проводили предварительную элюцию лизирующим буфером, содержащим 50 мМ имидазола. Аналог лактаптина элюировали лизирующим буфером, содержащим 200 мМ имидазола, а затем проводили дополнительную элюцию в денатурирующих условиях буфером, содержащим 6М гуанидина гидрохлорида и 0,1М ЭДТА. Полученные белковые фракции диализовали против воды (две смены по 18 ч при 5°С) и анализировали 8И8 электрофорезом в ПААГ по Лэммли [7] в восстанавливающих условиях. Пример такой очистки приведен на фиг. 4. Фракции, содержащие рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, концентрировали ионообменной хроматографией на 8Рсефарозе.

Определение концентрации белка в препарате рекомбинантного аналога лактаптина проводили по методу Брэдфорд [8, 9]. Для построения калибровочной кривой использовали бычий сывороточный альбумин (8егуа, США).

Определение концентрации белка показывает, что общий выход составляет 10,3 мг рекомбинантного аналога КЬ4 из 1,5 л культуры клеток ЕксйейсЫа сой.

Пример 4. Исследование апоптотической активности рекомбинантного пептида КЕ4 - аналога фрагмента каппа-казеина человека по отношению к раковым клеткам.

Для оценки апоптотической активности рекомбинантного пептида -аналога фрагмента каппаказеина человека использовали клетки аденокарциномы молочной железы человека линии МСР-7 (Российская коллекция клеточных культур позвоночных, ИНЦ РАН, Санкт-Петербург). Клетки МСР-7 куль- 4 023475 тивировали в среде ΙΜΌΜ с 10 мМ Ь-глутамина и 40 мкг/мл гентамицина в присутствии 10%-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота при 37°С в атмосфере 5% СО₂ в культуральных флаконах с площадью поверхности дна 25 см². Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева по стандартной методике [10]. Для анализа влияния аналогов лактаптина на жизнеспособность клеток 2,5х10³ клеток МСР-7 в 100 мкл среды ΚΡΜΙ-1640, содержащей 5% эмбриональной сыворотки теленка и 20 мМ буфера Нерек, культивировали в лунках 96 луночного плоскодонного планшета в стандартных условиях (37°С, 5% СО₂, 95% влажности) в течение 24 ч (экспоненциальная фаза роста, 50% монослой). К культуральной среде добавляли рекомбинантные аналоги лактаптина в 100 мкл среды с сывороткой и инкубировали 72 ч, после чего оценивали морфологические изменения с помощью световой микроскопии и анализировали жизнеспособность клеток с помощью МТТ-теста [11]. Для этого содержащую препарат среду удаляли, в лунки добавляли по 100 мкл среды ΚΡΜΙ-1640 без сыворотки, содержащей МТТ в концентрации 0,5 мг/мл. Клетки ΜСР-7 инкубировали в присутствии МТТ в течение 4 ч при температуре 37°С, затем среду с МТТ удаляли. Формазан растворяли в ДМСО и определяли оптическую плотность раствора при длине волны 570 нм на планшетном сканере ΜτιΙΐίκΚαη КС, ТЬеттоТаЬ® (США).

Результаты эксперимента представлены в таблице и показывают, что инкубация ΜСΡ-7 в присутствии фрагмента № 4 наиболее эффективно снижала жизнеспособность клеток (на 42,7 % при концентрации 0,07 мг/мл, 48 ч инкубации). Снижение жизнеспособности под действием аналога лактаптина сопровождалось морфологическими изменениями, характерными для апоптоза клеток в культуре: откреплением от пластиковой подложки, конденсацией цитоплазмы и ядер и появлением вторичных некротических клеток, окрашиваемых трипановым синим.

Из данных таблицы видно, что подавление жизнеспособности клеток ΜСΡ-7 под действием аналогов лактаптина снижается с уменьшением концентрации аналогов в среде. Концентрация, при которой происходит снижение жизнеспособности клеток на 50% (ИК₅₀), составляет 0,08 мг/мл для КБ4 аналога, в то время как для КБ2 эта концентрация 0,45 мг/мл. Для белка КБ4 с расчетной массой 10,2 кДа это составляет ~7,8 мкМ.

Таким образом достигнут заявленный технический результат, а именно создана плазмида, обеспечивающая увеличение синтеза рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппаказеина человека, и создан более продуктивный (с более высоким выходом целевого пептида) бактериальный штамм-продуцент, позволяющий получать рекомбинантный пептид - аналог каппа-казеина человека, обладающего более высокой апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.

Таблица

Данные о жизнеспособности клеток ΜСΡ-7, инкубированных 48 ч в полной культуральной среде в присутствии различных концентраций рекомбинантных аналогов лактаптина КБ2 и КБ4

	ИК₅„	ИКдо
Концентрация аналога КЬ4 в культуральной среде, мг/мл	0,028	0,042	0,07	0,08	0,13
Жизнеспособность клеток МСР-7, %	92,9	84,4	57,4
Концентрация аналога КЬ2 в культуральной среде, мг/мл	о,1	0,2	0,3	0,4	0,5	0,6	0,45	0,73
Жизнеспособность клеток МСР-7, %	108,5	67,0	63,3	48,9	41,3	37,6

Примечание. За 100% принята жизнеспособность клеток ΜСΡ-7, инкубированных в отсутствии аналога лактаптина

Источники научно-технической и патентной информации

1. Некипелая В.В., Семенов Д.В., Потапенко М.О., Кулигина Е.В., Кит Ю.Я., Романова И.В., Рихтер В.А. Лактаптин - белок человеческого молока, индуцирующий апоптоз клеток аденокарциномы ΜСΡ7//Докл. Академии Наук, 2008, т. 419, № 2, с. 268-271.

2. Власов В.В., Рихтер В.А., Семенов Д.В., Некипелая В.В., Кулигина Е.В., Потапенко М.О. Пептид, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам человека//патент КЛ № 2317304, 2008, бюл. № 5.

3. Тикунова Н.В., Семенов Д.В., Бабкина И.Н., Кулигина Е.В., Коваль О.А., Фомин А.С, Матвеева В.А., Матвеев А.Л., Матвеев Л.Э., Рихтер В.А. Рекомбинантная плазмидная ДНК рРК2, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина, способ получения рекомбинантного пептида и рекомбинантный пептид, аналог фрагмента каппа-казеина человека, обла- 5 023475 дающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам//патент РФ № 2401307 С1, 2010, бюл. № 28.

4. §ешеиоу Ό.ν., Ротш Ά.8., КиЬдша Е.У., Коуа1 О.А., МаАееуа У.А., ВаЪкша Ι.Ν., Пкииоуа Ν.ν., КюШег ν.Α. РесотЪшай апа1одие8 о! иоуе1 тйк рго-арорЮйс рерйбе 1ас1арЬп апб (Ьеи еГГес! оп сиЬигеб Ьитап се118.//ТЬе Рго1еш 1оита1, 2010, ν. 29 (3), р. 174-180.

5. ТЬе О1Ае.\рге88юш81. А ЬапбЪоок Гог ЫдЬ 1е\'е1 ехрге88юп апб рипйсаЬоп оГ 6хШ8-1аддеб рго1еш8. РГЙЬ ебйюп. 06/2003.

6. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.

7. ЬаеттЪ и.К. С1еаνаде оГ 8йис1ига1 рго1ет8 бийид (Ье а88етЪ1у оГ (Ье Ьеаб оГ Ъас1егюрЬаде Т4//№Пиге. 1970, ν. 227 (5259), р. 680-685.

8. Государственная фармакопея Российской Федерации, XII издание, часть 1, 2007. Определение белка (ОФС 42-0053-07).

9. ВгабГогб М.М. (1976) Апа1. ВюсЬет. 72: 248-254.

10. И8е оГ Ьтрап Ъ1ие 8(аш апб 1Ье Ьетосу1оте1ег (о бе(епшпа(е (о(а1 се11 соип(8 апб \ааЬ1е се11 питЪег. Зфта. 1996, р. 1702.

11. Методические указания по изучению противоопухолевой активности фармакологических веществ / Е.М. Трещалина, О.С. Жукова, Г.К. Герасимова, Н.В. Андронова, А.М. Гарин//Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; под общ. ред. Р.У. Хабриева. - 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2005. с. 637-651.

Список последовательностей <110> Федеральное государственное бюджетное учреждение науки

Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук (ИХБФМ СО РАН) <120> Рекомбинантная плазмидная ДНК рРК4, обеспечивающая синтез рекомбинантного пептида КЬ4, являющегося аналогом фрагмента каппа-казеина человека, рекомбинантный штамм бактерий ЕзскеггсЫа соИ ХИ-В1ие/рРК4 и рекомбинантный пептид К£4 аналог фрагмента каппа-казеина человека, обладающий апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам <160> 2 <210> 2 <211> 264 <212> ΌΝΑ <213> Ното заргепз <400> 1

аСд

ада

дда

Ссд

саС

сас

саС

сас

дда

Ссс

аСд

Сас

СаС

45

Мес

Агд

С1у

Зег

Н13

Ηίδ

ΗΪ5

НЪз

ΗΪ3

Ηί$

С1у

Зег

МеС

Туг

1

5

10

15

дед

сса

аас

аде

СаС

ссС

сас

дда

асе

аас

ССд

Сас

саа

сдс

90

Уа1

Рго

Азп

Зег

Туг

Рго

Туг

С1у

ТЬг

Азп

Ъеи

Туг

С1п

Агд

20

25

30

ада

сса

дсС

аСа

дса

асе

аас

ааС

сса

сас

дед

ссс

сдс

аса

сас

135

Агд

Рго

А1а

Не

А1а

Не

Азп

Рго

Туг

Уа1

Рго

Агд

ТЬг

Туг

35

40

45

СаС

дса

аас

сса

дсс

дса

дсс

адд

сса

саС

дсс

саа

асе

ссС

сад

180

Туг

А1а

Азп

Рго

А1а

Уа1

Агд

Рго

ΗΪ5

А1а

С1п

Не

Рго

С1п

50

55

60

сдд

саа

Сас

сСд

сса

ааС

аде

сас

сса

ссс

асе

дСд

дса

сдс

225

Агд

С1п

Туг

Ъеи

Рго

Азп

Зег

Ηίδ

Рго

ТЬг

Уа1

Агд

70 75

сса аас Рго Азп	ссд саС сса Сса ССС аСС дсс асе ссс сса Саа	264
Ъеи НЪз	Рго Зег РЬе Не А1а Не Рго Рго *
80	85
<210>		2
<211>		88
<212>		РЕТ
<213>		Ното	заръепз
<400>		2

МеС Агд 1

<31у

Зег ΗΪ3 5

НЪз

ΗΪ8

Ηίβ ΗΪ3 Ηίβ 10

О1у

Зег

МеС

Туг

Туг 15

Уа1

Рго

Азп

Зег

Туг

Рго

Туг

<31у

ТЬг

Азп

Ъеи

туг

О1п

Агд

20

25

30

Агд

Рго

А1а

Не

А1а

Не

Азп

Рго

Туг

Уа1

Рго

Агд

ТЬг

Туг

35

40

45

Туг

А1а

Азп

Рго

А1а

Уа1

Агд

Рго

ΗΪ8

А1а

Θΐη

Не

Рго

С1п

50

55

60

Агд

(31п

Туг

Ъеи

Рго

Азп

Зег

ΗΪ3

Рго

ТН.г

Уа1

Агд

65

70

75

Рго

Азп

Ъеи

Ηί3

РГО

Бег

РЬе

Не

А1а

11е

Рго

*

80

85

- 6 023475

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1) фрагмент Ват I П/Ι Ιίικί III размером 264 п.о., имеющий нуклеотидную последовательность 8Ер Ιϋ ΝΟ: 1, которая кодирует указанный пептид РР4 с аминокислотной последовательностью 8Ер Ιϋ ΝΟ: 2;

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕК4, обеспечивающая увеличенный выход рекомбинантного пептида ЙБ4 с аминокислотной последовательностью 8Ер Ιϋ ΝΟ: 2, который является аналогом фрагмента каппа-казеина человека и состоит из трех компонентов: Ν-концевой полигистидиновой последовательности МКО8НННННИО8, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности, и фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 а.о., и который обладает увеличенной апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам, причем указанная ДНК характеризуется молекулярной массой 2,41 МДа и размером 3653 п.о. и содержит в соответствии с физической и генетической картой, представленной на фиг. 2, следующие элементы:

2. Рекомбинантный штамм бактерии ЕзсйепсЫа сой ХБ1-В1ие/рЕК4, продуцирующий с увеличенным выходом рекомбинантный пептид РР4 с аминокислотной последовательностью 8Рр ГО ΝΟ: 2, причем штамм содержит рекомбинантную плазмидную ДНК рЕК4 по п.1 и депонирован в КЭМТК ИХБФМ СО РАН под номером ЭМТК 1347.

2) фрагмент плазмидного вектора ррЕ30, обеспечивающий эффективную экспрессию фрагмента каппа-казеина человека и содержащий:

а) сайт инициации репликации плазмиды рВЙ322;

б) промотор бактериофага Т5;

в) генетический маркер АМРг - ген резистентности к ампициллину (ген β-лактамазы), определяющий устойчивость к ампициллину при трансформации ЕзсйепсЫа сой;

г) уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, имеющими следующие координаты: Ανα I (2), Есо ΡΙ (89), Ват Н1 (146), НМ III (380), Νο I (1053), Ара Ы (1585), Ара Ы (2083), Ара Ы (3329).

3. Рекомбинантный пептид РР4 с аминокислотной последовательностью 8Рр ГО ΝΟ: 2, который является аналогом фрагмента каппа-казеина человека, имеет молекулярную массу 10,2 кДа, состоит из трех компонентов: Ν-концевой полигистидиновой последовательности МКО8ННННННО8, остатка метионина, введенного в конструкцию для возможности отщепления полигистидиновой последовательности, и фрагмента каппа-казеина человека с 49 по 122 а.о. и обладает увеличенной апоптотической активностью по отношению к раковым клеткам.

акд ада дда кед сак сас сак сас сак сас дда ксс акд как как 45 Мек Агд СЬу Зег НЬз НЬз НЬз НЬз НЬз НЬз СЬу Зег Мек Туг Туг 1 5 10 15 дкд сса аак аде как сск как как дда асе аак ккд кас саа сдк 90 Уа1 Рго Азп Зег Туг Рго Туг Туг СЬу ТЬг Азп Ьеи Туг С1п Агд 20 25 30 ада сса дек аса дса акк аак аак сса как дьд сск сдс аса как 135 Агд Рго А1а Не А1а Не Азп Азп Рго Туг Уа1 Рго Агд ТЬг Туг 35 40 45 как дса аас сса дек дка дкк адд сса сак дсс саа акк сск сад 180 Туг А1а Азп Рго АЬа Уа1 УаЬ Агд Рго НЬз А1а С1п 11е Рго С1п 50 55 60 сдд саа кас скд сса аак аде сас сса ссс аск дкд дка сдк сдс 225 Агд С1п Туг Ьеи Рго Азп Зег НЬз Рго Рго ТЬг Уа1 Уа1 Агд Агд 65 70 75 сса аас скд сак сса кса ккк акк дсс акс ссс сса каа 264 Рго Азп Ьеи НЬз Рго Зег РЬе 11е АЬа Не Рго Рго * 80 85