EA023069B1 - Изолированные рекомбинантные кишечные симбиотические бактерии и их применение - Google Patents

Изолированные рекомбинантные кишечные симбиотические бактерии и их применение Download PDF

Info

Publication number
EA023069B1
EA023069B1 EA201071175A EA201071175A EA023069B1 EA 023069 B1 EA023069 B1 EA 023069B1 EA 201071175 A EA201071175 A EA 201071175A EA 201071175 A EA201071175 A EA 201071175A EA 023069 B1 EA023069 B1 EA 023069B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
peptide
bacterium
protein
cells
recombinant
Prior art date
Application number
EA201071175A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201071175A1 (ru
Inventor
Джон С. Марч
Фейпинг Дуан
Original Assignee
Корнелл Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Корнелл Юниверсити filed Critical Корнелл Юниверсити
Publication of EA201071175A1 publication Critical patent/EA201071175A1/ru
Publication of EA023069B1 publication Critical patent/EA023069B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K10/00—Animal feeding-stuffs
    • A23K10/10—Animal feeding-stuffs obtained by microbiological or biochemical processes
    • A23K10/16—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions
    • A23K10/18—Addition of microorganisms or extracts thereof, e.g. single-cell proteins, to feeding-stuff compositions of live microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23K—FODDER
    • A23K30/00—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs
    • A23K30/10—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder
    • A23K30/15—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging
    • A23K30/18—Processes specially adapted for preservation of materials in order to produce animal feeding-stuffs of green fodder using chemicals or microorganisms for ensilaging using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/26—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/605—Glucagons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C07H21/04—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids with deoxyribosyl as saccharide radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Animal Husbandry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Обеспечиваются созданные методами генной инженерии клетки и микроорганизмы для предотвращения или облегчения течения заболеваний посредством передачи сигналов генетически модифицированной совокупностью бактерий. Также обеспечены способы терапии с применением указанных клеток и микроорганизмов для предотвращения или облегчения течения заболеваний. Указанные клетки или микроорганизмы можно модифицировать с применением генной инженерии с тем, чтобы они экспрессировали белок или пептид и их можно было применять для прерывания связанной с передачей сигналов вирулентности инвазивного патогена. Указанные клетки или микроорганизмы можно применять для обеспечения сигнал-зависимой экспрессии желаемого гена для того, чтобы прервать, предотвратить и/или облегчить течение заболевания у млекопитающего, например заболевания, вызванного паразитами, инфекционного заболевания, аутоиммунного заболевания и генетического нарушения.

Description

Настоящее изобретение относится к микроорганизмам, полученным методами генетической инженерии (например, бактериям), с модифицированной способностью к передаче сигнала, и к применению таких модифицированных методами инженерии микроорганизмов, (или рекомбинантных клеток, полученных из них) для стимулирования или обеспечения экспрессии целевых генов в организме хозяина. Настоящее изобретение также относится к симбиотическим бактериям, модифицированным методами инженерии с тем, чтобы они экспрессировали сигнальные молекулы, делающие возможной коммуникацию или с клетками хозяина, или с другими бактериями, которые присутствуют в указанном хозяине или внедряются в указанного хозяина.
Уровень техники
Патогены, передающиеся через воду, по оценкам убивают 1,7 млн человек ежегодно и создают серьезную угрозу национальной безопасности США и развитию международной экономики (ЛШЬоН N1. 2004. М1стоЫа1 соШатшайои оГ бтшкшд \\а1ег аиб бйса^с ои1соше8 ίη беуе1оршд гедюи8. Тох1со1оду 198(13):229-38; Ьес1егс Н, 8сНиаг1/Ьгоб Ь, Эе1-Са8 Е. 2002. М1стоЫа1 адей8 а88ос1а1еб \\ЬЬ \уа1егЬогпе бйеакек Стй Кеу М1стоЫо1 28(4):371-409). Такое заболевание кишечника, как холера затрагивает развивающиеся страны во всем мире, особенно страны с теплым климатом, например Бангладеш (Оиетгаи! КБ., СагпейоРййо В А, ЭШтдЬат КА. 2003. Сйо1ета, б1атгйеа, аиб ога1 теЬубгайои 1йетару: йтишрЬ аиб шбЮтей. С1ш 1и£ес1 Όίδ 37(3):398-405). Заболевание, вызываемое морской бактерией УФпо сйо1егае, характеризуется диареей и тяжелым обезвоживанием. По общим оценкам, ежегодно от холеры умирает не менее 120,000200,000 человек (ЗаисНе/ 1.. Но1тдгеи 1. 2005. У1ги1еисе Гас1от8, ра1Ьодеие818 аиб уассше рго1есйои ш сЬо1ега аиб ЕТЕС б1атгйеа. Ситтей Орином ш 1ттиио1оду 17(4): 388-398). Большой масштаб, относительная бедность регионов вспышек заболеваний и недостаток специфичности вариантов лечения препятствует эффективному предотвращению указанных и других кишечных заболеваний, в частности, если для борьбы с инфекцией V. сйо1егае используют антимикробные средства широкого спектра действия, это делает возможным заселение желудочно-кишечного тракта оппортунистическими патогенами, например, С1о8йтбшт бЬПсПе.
ЖКТ является местом обитания по меньшей мере для 395 филотипов бактерий (ЕскЬитд РВ, В1к ЕМ, Вет81еЙ1 ΟΝ., Ригбот Е, Пе1Ь1еГ8еи Ь., Загдей М., Ой1 ЗК, №1кои КЕ., Ке1таи ΌΑ. 2005. 01уег8Йу оГ 1йе Нитаи 41^801^)1 т1стоЫа1 йога. Заеисе 308(5728): 1635-8). Эти симбиотические бактерии (пробиотики) эволюционировали вместе с хозяином для снабжения его питательными веществами, защиты от патогенов и помощи в развитии кишечника (Но1/арГе1 ^Н, НаЬегег Р., Зие1 1., ЗсЫШидет и., Нш8 ш'1 Vе1б 1Н. 1998. Оуету1е№ оГ дй йота аиб ртоЫойс8. 1й 1 Рооб М1стоЫо1 41(2):85-101). Как известно, и патогенные и непатогенные бактерии в желудке используют зависимую от плотности передачу сигналов (сигналлинг) от клетки к клетке, (восприятие кворума) для координации роста и вирулентности (Карег 1В, Зретаибю V. 2005. Вас1епа1 се11-1о-се11 81диа1шд ш 1йе да81то1йе8Йиа1 1тас1. 1йес1 1ттии 73(6):3197-209). Соответственно, восприятие кворума, дает огромные возможности для контроля роста патогенов в кишечнике и других местах. Несмотря на то, что использование восприятия кворума для борьбы с патогенными бактериями имело некоторый успех (МагсН 1С, Веийеу ^Е. 2004. Оногнт 8еи8шд аиб Ьас1епа1 сго88-1а1к ш Ь^οΐесЬηο1οду. Сигг Орш В^οΐесЬпο1 15(5):495-502; Хау1ег КВ., Ва881ег ВЬ. 2005. 1и1егГегеисе №ЙЬ А1-2-теб1а1еб Ьас1епа1 се11-се11 соттийсайои. №-11иге 437(7059):750-3), использованию полного потенциала этого метода препятствует недостаток знаний о функции восприятия кворума и о способах применения тех знаний, которые существуют. Также были предприняты успешные попытки применения симбиотических бактерий для предотвращения заболевания холерой посредством механизмов, отличных от связанных с восприятием кворума (Росатей А., Ра1ои Ю, Могоиа К., Соок К Ра1ои Α\ν. 2006. А гесотЬтай ртоЫойс Гог 1теа1шей аиб ргеуеийои оГ сНо1ега. Оа81тоейето1оду 130(6): 1688-95). Однако еще никому не удалось показать успешное применение сигналлинга от клетки к клетке для того, чтобы помешать внедрившемуся патогену проявить вирулентность.
V. сйо1егае использует восприятие кворума для согласования инфекции ЖКТ человека (МШет МВ, Зкотцр8к1 К, кеи/ ЭН, Тау1ог КК, Ва881ег ВЬ. 2002. Рага11е1 сцюгит 8еи8шд 8у81ет8 соиуетде 1о теди1а1е у1гц1еисе ш V^Ь^^ο сйо1егае. Се11 110(3): 303-14). При низкой плотности V. сйо1егае экспрессирует факторы вирулентности: токсин-корегулируемые пили адгезии (ТСР) и холерный токсин (СТ). ТСР позволяют проникающей V. сйо1егае прикрепиться к внутренней поверхности ЖКТ (Тау1ог КК., Мй1ет УЕ, Риг1оид ЭВ., Мека1аио8 Л. 1987. И8е оГ рНоА деие Ги8^οη8 1о 1беййу а рйи8 со1оЙ7айои Гайот сοο^б^паΐе1у теди1а1еб №ЙЬ сНо1ега 1охш. Ргос Ν;·ιΐ1 Асаб За иЗА 84(9):2833-7), СТ вызывает диарею и обезвоживание посредством стимуляции аденилатциклазы (Мо88 1, VаидЬаи М. 1979. Асйуайои оГ абеиу1а!е сус1а8е Ьу сйо1егадеи. Аиии Кеу ВюсЬет 48:581-600) (РЮ.1В). При высокой плотности клеток экспрессия ТСР и СТ снижается, и начинают экспрессироваться протеазы, которые разрушают матрикс прикрепления, через пути, которые регулируют восприятие кворума (Ζΐη.ι 1., МШет МВ., Vаηсе КЕ., Οζίοίπ·^ М., Ва881ег ВЬ., Мека1аио8
- 1 023069
Η. 2002. Оиогит-кепк1пд теди1а1огк сойто1 У1ги1епсе депе ехргеккюп ίη УФпо с1ю1сгас. Ргос Ναΐΐ Асаб 8с1 И8А 99(5): 3129-34).
Несмотря на то, что значение этого механизма полностью не известно, предположили, что такая синхронизация вирулентности способствует откреплению или перемещению внутри или выходу из хозяина, если популяция достигла высокой плотности (Ζΐιιι 1, МШет МВ, Уапсе КЕ, Э/1е)тап М, Вакк1ег ВЬ, Мека1апок Л. 2002. Оиогит-кепкшд гедиШотк соп!то1 уии1епсе депе ехргеккюп ш УФпо с1ю1егае. Ргос Ν;·ιΐ1 Асаб 8а и 8 А 99(5): 3129-34) (ЕЮ. 1А).
Фиг. 1 демонстрирует схему инфекционного цикла У. с1ю1егае'к и цикл событий, связанных с восприятием кворума. При низкой плотности в кишечнике (фиг. 1А), У. с1ю1егае (УС, эллипсы) экспрессирует факторы вирулентности холерный токсин (СТ, пятигранник) и токсин-корегулируемые пили адгезии (ТСР, цепи), которые инфицируют эпителиальные клетки хозяина (эпителий, прямоугольники) и позволяют УС прикрепляться к эпителию, соответственно. При высокой плотности в кишечнике УС перестает экспрессировать гены вирулентности и поэтому может открепляться и покидать хозяина с током жидкости.
С контролем восприятия кворума у У. с1ю1егае обнаружили связь двух молекул автоиндукторов: холерного_автоиндуктора 1(САТ-1) и автоиндуктора 2 (АТ-2). На фиг. 1В показана схема восприятия кворума У. с1ю1егае: С’срА дает сигнал автоиндуктора СА1-1 и Ьих8 дает сигнал автоиндуктора А1-2. Эти системы пересекаются с 8ук1ет 3 через Ьих О для обеспечения отрицательной обратной связи регуляции экспрессии генов вирулентности при высокой плотности. Высокая плотность клеток приводит к накоплению СА1-1 и А1-2 и переключает сигнальный каскад с киназной на фосфатазную активность, подавляя транскрипцию малых РНК, которые отвечают за развитие вирулентности. (ОМ=наружная мембрана, 1М=внутренняя мембрана).
Существует третий компонент регуляции пути восприятия кворума у У. с1ю1егае (8ук1ет 3), но показано, что он действует внутри клетки без внешнего сигнала (МШет МВ, 8котиркк1 К, Ьеп/ ΌΗ, Тау1ог КК, Вакк1ег ВЬ. 2002. Рага11е1 сщогит кепкшд кук1етк сопуегде 1о геди1а1е У1ти1епсе ш УФпо с1ю1егае (Се11 110(3):303-14)). СА1-1 кодируется геном ссрА у У. с1ю1егае. А1-2 кодируется геном 1их8.
Серотипы У. с1ю1егае Е1 Тог являются причиной вспышек холеры в развивающихся странах. У некоторых штаммов У. с1ю1егае инфекционный цикл согласуется, по меньшей мере, частично, с восприятием кворума. Это означает, что экспрессия генов вирулентности зависит от концентрации автоиндукторов У. с1ю1егае холерного_автоиндуктора 1 (САТ-1) и автоиндуктора 2 (АТ-2). Недавно было показано, что высокие концентрации СА1-1 и А1-2 подавляют экспрессию генов вирулентности.
Поэтому в данной области существует потребность в разработке способов применения межклеточного сигналлинга для предотвращения проявления вирулентности инвазивного патогена. Также в данной области существует потребность в создании рекомбинантных микроорганизмов, которые модифицированы с применением генной инженерии с тем, чтобы они экспрессировали сигнальные молекулы, которые способствуют коммуникации либо с клетками хозяина, либо с другими бактериями, присутствующими в хозяине или внедрившимися в него.
Цитирование или указание любой ссылки в разделе 2 или другом разделе данной заявки не следует рассматривать в качестве признания того, что такая ссылка рассматривается в качестве прототипа настоящего изобретения.
Краткое описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает измененные методами инженерии симбиотические бактерии, полученные из них изолированные рекомбинантные клетки, которые экспрессируют сигнальные молекулы, которые способствуют коммуникации с клетками хозяина или с другими бактериями, присутствующими в хозяине или проникающими в него.
Согласно одному варианту реализации настоящее изобретение обеспечивает изолированную рекомбинантную кишечную симбиотическую бактерию, стимулирующую продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего-хозяина и содержащую рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок или пептид , включающий пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, выбранный из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептид а 1 (СЬР-1), желудочного ингибиторного пептид а (СТР) и панкреатического и дуоденального гомеобоксного пептид а (РОХ-1), причем указанный указанный белок или пептид может экспрессироваться указанной кишечной симбиотической бактерией и стимулировать продукцию инсулина в ответ на глюкозу клетками кишечного эпителия в организме млекопитающего-хозяина.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид секретируется клеткой, и секреция клеткой находится под контролем стимула из окружающей среды. Согласно другому варианту реализации нестоящего изобретения указанный белок или пептид стимулирует или ингибирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно другому варианту реализации указанный стимул из окружающей среды секретируется патогеном или наличие стимула из окружающей среды указывает на присутствие патогена.
Согласно другому варианту реализации указанный патоген представляет собой инвазивный патоген и указанный белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность указанного
- 2 023069 инвазивного патогена.
Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота контролирует патогенез или вирулентность указанного патогена. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор вирулентности инвазивного патогена.
Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота экспрессируется млекопитающим. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор млекопитающего. Фактор млекопитающего может, например, обеспечивать нормальное функционирование физиологического процесса у указанного млекопитающего, или эффективно предотвращает начало, развитие или распространение неинфекционного заболевания у млекопитающего.
Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует причинный фактор, связанный с началом неинфекционного заболевания у млекопитающего.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный микроорганизм представляет собой бактерию. Бактерия может представлять собой, например, кишечную бактерию или симбиотическую бактерию. Согласно одному варианту реализации симбиотическая бактерия представляет собой штамм бактерии ЕксЬепсЫа сой. Согласно частному варианту реализации штамм ЕксЬепсЫа сой представляет собой штамм №§81е 1917Е8сЬепсЫа сой.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид предотвращает, распознаёт, облегчает или лечит заболевание или нарушение у человека или животного. Животное, в качестве примера, может представлять собой Хордовое, например, млекопитающее или человека, или насекомое.
Согласно другому варианту реализации белок или пептид стимулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает кворумный белок или пептид .
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный инвазивный патоген представляет собой простейшее, патогенную бактерию, гриб или вирус. Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный инвазивный патоген представляет собой УФгю сЬо1егае.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид содержит антимикробный пептид или молекулу.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид конститутивно экспрессируется клеткой.
Согласно другому варианту реализации экспрессия рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок или пептид , находится под контролем индуцибельного промотора.
Согласно другому варианту реализации рекомбинантная клетка дополнительно содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, отличающуюся тем, что указанная рекомбинантная молекула ответа распознает молекулу, представленную в хозяине.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения заболевание представляет собой диабет. Согласно этому варианту реализации указанный белок или пептид может включать С1р-1, ΡΌΧ-1 или ΟΙΡ. Стимул из окружающей среды может представлять собой глюкозу или сахар, который стимулирует выделение инсулина у здорового человека.
Согласно отдельному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает кворумный белок или пептид холерного автоиндуктора 1 УФгю сЬо1егае (СА1-1), рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный сигнал, содержит ген сд§А УФгю сЬо1егае, кодирующий СА1-1, целевая нуклеиновая кислота представляет собой холерный токсин УФгю сЬо1ега (СТ), и экспрессия СА1-1 ингибирует экспрессию СТ УФгю сЬо1егае.
Согласно другому отдельному варианту реализации указанный белок или пептид включает кворумный белок или пептид холерного автоиндуктора 2 УФгю сЬо1егае (ΑΙ-2), рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая указанный сигнал, содержит ген 1их8 УФгю сЬо1егае, кодирующий ΑΙ-2, целевая нуклеиновая кислота представляет собой корегулируемые токсином пили адгезии (ТСР) УФгю сЬо1егае, и экспрессия ΑΙ-2 ингибирует экспрессию ТСР УФгю сЬо1егае.
Согласно другому отдельному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего, указанный белок или пептид регулирует экспрессию инсулина инсулин-секретирующими клетками млекопитающего, и экспрессия указанного сигнала в клетке стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента, например, человека. Согласно этому варианту реализации настоящего изобретения указанная рекомбинантная клетка также содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, отличающуюся тем, что рекомбинантная молекула ответа распознаёт молекулу, представленную в организме млекопитающего. Пептид млекопитающего, который стимулирует секрецию инсулина, может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР-1) или панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (ΡΌΧ-1). Инсулин-секретирующие клетки млекопитающего могут представлять собой клетки кишечного эпителия.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ регуляции экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в организме хозяина. Указанный способ включает получение изолированной рекомбинантной
- 3 023069 клетки согласно настоящему изобретению (или микроорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению) и введение указанной клетки (или микроорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из такой клетки) в организм хозяина при условиях, которые делают возможной экспрессию указанного сигнала в организме хозяина, благодаря чему регулируется сигнал-зависимая экспрессия целевой нуклеиновой кислоты в организме хозяина.
Согласно одному варианту реализации указанный белок или пептид предотвращает, выявляет, облегчает или лечит заболевание или нарушение у человека или животного или в полученных из них клетках. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид стимулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Согласно особому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает кворумный сигнальный белок или пептид. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид содержит антимикробный пептид или молекулу.
Целевая нуклеиновая кислота может кодировать фактор вирулентности инвазивного патогена. Инвазивный патоген может представлять собой, например, простейшее, патогенную бактерию, гриб или вирус. Согласно другому отдельному варианту реализации указанный инвазивный патоген представляет собой Υίόπο с1ю1сгас.
Согласно отдельному варианту реализации способа согласно настоящему изобретению указанный белок или пептид включает кворумный сигнальный белок или пептид холерного автоиндуктора 1 (СА11) νίόπο с1ю1сгас. рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая сигнал, содержит ген сцхА νίόπο с1ю1сгас. кодирующий СА1-1, целевая нуклеиновая кислота представляет собой холерный токсин (СТ) νίόΓίο с1ю1сгас, и экспрессия СА1-1 ингибирует экспрессию СТ νίόπο с1ю1сгас.
Согласно другому отдельному варианту реализации белок или пептид включает кворумный сигнальный белок или пептид холерного автоиндуктора 2 (А1-2) νίόπο с1ю1сгас, рекомбинантная нуклеиновая кислота, кодирующая сигнал, содержит ген 1их8 νίόπο с1ю1сгас, кодирующий А1-2, целевая нуклеиновая кислота представляет собой токсин-корегулируемые пили адгезии (ТСР), νίόπο с1ю1сгас, и экспрессия А1-2 ингибирует экспрессию ТСР УШтю с1ю1сгас.
Согласно другому отдельному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, указанный белок или пептид регулирует экспрессию инсулина в инсулин-секретирующих клетках млекопитающего, и экспрессия сигнала клеткой стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего хозяина.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения рекомбинантная клетка содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, причём указанная рекомбинантная молекула ответа распознаёт молекулу, присутствующую в организме млекопитающего хозяина, например человека. Согласно одному варианту реализации инсулин-секретирующие клетки млекопитающего представляют собой клетки кишечного эпителия.
Согласно одному варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР-1), который стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего.
Согласно другому варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего представляет собой панкреатический и дуоденальный гомеобоксный ген 1 (ΡΌΧ-1), который стимулирует конститутивную продукцию инсулина в организме млекопитающего.
Согласно другому варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего представляет собой С1Р пептид , который стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ предотвращения или облегчения симптоматики инфекционного или неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ включает обеспечение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или микроорганизма, включающего указанную клетку или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению), и введение указанной клетки (или микроорганизма, включающего такую клетку или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению) млекопитающему пациенту в условиях, которые эффективны для стимуляции экспрессии фактора, предотвращающего заболевание, или подавления экспрессии фактора, который является причиной заболевания, благодаря чему предотвращается развитие или облегчается указанное заболевание.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения неинфекционное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, например диабет 1 типа.
Согласно другому отдельному варианту реализации указанный белок или пептид включает ΡΌΧ-1, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин, и ΡΌΧ-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает С1р-1, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и С1р-1 стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации указанный белок или пептид включает СТР, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представ- 4 023069 ляет собой инсулин, и ΟΙΡ стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента.
Согласно другому варианту реализации изобретение обеспечивает применение действующего вещества, выбранного из группы, состоящей из сигнала, его фрагмента, производного, комплекса или аналога указанного сигнала, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество или его фрагмент или производное, где указанный белок или пептид регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты; и непатогенного микроорганизма, содержащего нуклеиновую кислоту и способного экспрессировать указанный сигнал, для лечения заболевания или расстройства человека или животного.
Согласно одному варианту реализации указанный белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность инвазивного патогена. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид предотвращает, выявляет, облегчает или лечит заболевание или расстройство человека или животного.
Согласно другому варианту реализации указанное заболевание представляет собой инфекционное или неинфекционное заболевание.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения лечение осуществляют посредством введения изолированного и очищенного действующего вещества в составе фармацевтической композиции.
Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят в дозе, достаточной для лечения болезненного состояния или его предотвращения, для остановки прогрессирования заболевания или облегчения его симптоматики.
Согласно другому варианту реализации настоящего указанное действующее вещество вводят пациенту орально, ректально, парентерально, в виде инъекций, инфузии, спрея или ингалятора.
Согласно другому варианту реализации непатогенный микроорганизм способен продуцировать указанное действующее вещество до, во время или после введения человеку или животному, и выделять выработанное действующее вещество после введения в клетки или ткани пациента.
Согласно другому варианту реализации непатогенный микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию или гриб человека или животного.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм принадлежит к естественной кишечной флоре человека или животного.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамотрицательную бактерию кишечной флоры.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная грамотрицательная бактерия принадлежит роду ЕзсЬепсЫа, Рзеийотоиаз, Вас1его1йез, Ьас1оЪас111из, Ьас1ососсиз, ВасШиз или Рго1еиз.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанная грамотрицательная бактерия представляет собой ЕзсНепсЫа сой (№зз1е 1917).
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамположительную или грамотрицательную бактерию кишечной флоры.
Согласно другому варианту реализации указанная грамположительная бактерия принадлежит роду ВШйоЪас1егшт, §1гер1ососсиз, 81арйу1ососсиз или СогуиеЪас1егшт.
Согласно другому варианту реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок или пептид или его фрагмент или производное, вставляют в вектор.
Согласно другому варианту реализации указанный вектор представляет собой плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус.
Согласно другому варианту реализации указанная нуклеиновая кислота, встроенная в вектор, находится под функциональным контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента, который обеспечивает транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты в транслируемую РНК или трансляцию РНК в белок до, во время или после введения. Согласно другому варианту реализации указанный по меньшей мере один регуляторный элемент представляет собой промотор, сайт связывания рибосомы, сигнальную последовательность или З'-терминатор транскрипции.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный промотор представляет собой индуцибельный промотор. Согласно особому варианту реализации, указанный индуцибельный промотор индуцируется сигнальным каскадом, включающим по меньшей мере один элемент, в ответ на стимул или стимулы из окружающей среды.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения сигнальная последовательность представляет собой сигнальную последовательность гриба или бактерии, которая обеспечивает секрецию белка из цитоплазмы микроорганизма в периплазматическое пространство или в окружающую микроорганизм среду.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм включают в фармацевтическую или пищевую композицию.
Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят орально, ректаль- 5 023069 но, парентерально, в виде инъекции, инфузии, спрея или ингалятора пациенту.
Обеспечивается фармацевтическая или пищевая композиция. Композиция может содержать по меньшей мере одну клетку непатогенного микроорганизма, способного продуцировать действующее вещество, и содержащего экспрессируемую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид или его фрагмент или производное. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную, грамотрицательную или грамположительную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию человека или животного.
Согласно другому варианту реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид или его фрагмент или производное, вставляют в вектор экспрессии, и при этом экспрессия указанной нуклеиновой кислоты находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента, таким образом, что указанное действующее вещество экспрессируется до, во время или после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции и высвобождается в клетки или ткани человека или животного хозяина после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции.
Обеспечивается способ производства фармацевтической или пищевой композиции. Указанный пособ включает:
(а) выделение или синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей действующее вещество, причём указанное действующее вещество выбирают из группы, состоящей из белка или пептид а, его фрагмента, комплекса, производного и аналога, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество или его фрагмент или производное;
(б) клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок или пептид , в микробный вектор экспрессии;
(в) трансформацию указанного рекомбинатного вектора экспрессии, полученного на стадии (б), в клетку микроорганизма хозяина, причём указанная клетка микроорганизма хозяина представляет собой симбиотическую бактерию человека или животного хозяина;
(г) размножение трансформированных клеток микроорганизма хозяина;
(д) получение иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии трансформированных клеток микроорганизма-хозяина и (е) смешивание иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии трансформированных клеток микроорганизма хозяина, полученных на стадии (е) с физиологически приемлемыми наполнителями, стабилизаторами, загустителями, разделителями, любрикантами, эмульгирующими агентами и т.п. материалами для получения фармацевтической или пищевой композиции.
Краткое описание фигур
Настоящее изобретение описывается со ссылкой на сопутствующие фигуры, на которых одинаковые обозначения относятся к одинаковым элементам на нескольких изображениях. Следует понимать, что в некоторых случаях различные аспекты настоящего изобретения могут быть подчеркнуты или расширены для облегчения понимания изобретения.
Фиг. 1 содержит изображение инфекционного цикла V. с1ю1сгас и схему восприятия кворума (для дополнительной информации, см. раздел 6.1).
Фиг. 2 иллюстрирует экспрессию автоиндукторов симбиотической бактерией, полученной с помощью генной инженерии (для дополнительной информации см. раздел 6.1).
Фиг. 3 иллюстрирует вирулентность V. с1ю1сгас в культуральной среде (для дополнительной информации см. раздел 6.1).
Фиг. 4 иллюстрирует прекращение вирулентности V. с1ю1сгас в совместных культурах (для дополнительной информации см. раздел 6.1).
Фиг. 5 иллюстрирует плазмиды, сконструированные для исследования, описанного в разделе 6.2. Для исследования промоторов Р0/Р1 из Е. сой ЭН5а сконструировали две плазмиды (ρΕΏ1 и ρΡΌ2). ρΡΌΙ кодировала полный участок Р0/Р1 для запуска экспрессии ускоренного зеленого флуоресцентного белка (БОЕР). ρΡΌ2 кодировала только участок Р0 промотора апстрим ЕОРР. Для тестирования эффективности секреции инсулинотропного белка из рекомбинантной бактерии для стимуляции секреции инсулина в клетках Сасо-2, создали плазмиды ρΕΌ-ΡΌΧ, ρΕΌ-ОЬР и ρΕΌ-20, как описано в разделе 6.2.
Фиг. 6 иллюстрирует ответ Р0 и Р0/Р1 на глюкозу. Для измерения ответа промоторов Р0 и/или Р1 в зависимости от различных условий среды использовали экспрессию ЕОЕР. Р0=Р0 только; Р0+Р1=Р0 и фланкирующий участок Р1; ОН5а=контроль 1ас оперона (для дополнительной информации см. раздел 6.2.)
Фиг. 7 иллюстрирует секрецию рекомбинантного инсулинотропного белка Е. сой Νίδδίο 1917 (для дополнительной информации см. раздел 6.2).
Фиг. 8 иллюстрирует стимуляцию секреции инсулина в эпителиальных клетках (для дополнительной информации см. раздел 6.2).
Подробное описание изобретения
Обеспечиваются измененные клетки и микроорганизмы, для предотвращения или облегчения (например, лечения) заболеваний посредством измененного сигналлинга. Также обеспечиваются терапевти- 6 023069 ческие способы применения указанных клеток и микроорганизмов для предотвращения или облегчения заболеваний. Указанные клетки (или микроорганизмы), полученные методами генетической инженерии, можно сконструировать таким образом, что они экспрессируют важный белок или пептид для инвазивных патогенов, других симбиотических микроорганизмов или хозяина. Во всех случаях полученный с помощью генной инженерии симбиотический микроорганизм изменён таким образом, что он испускает и/или воспринимает сигналы вместо хозяина.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный генетически измененный микроорганизм можно использовать для обеспечения кворум-зависимой экспрессии желательного гена для предотвращения, прекращения и/или облегчения заболевания млекопитающего, включая, но не ограничиваясь, человека. Согласно частному варианту реализации соответствующие заболевания, которые можно прекращать, предотвращать и/или облегчать с помощью рекомбинантных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению, могут включать, но не ограничиваться, паразитарными заболеваниями, инфекционными заболеваниями, аутоиммунными заболеваниями и генетическими нарушениями.
В настоящем описании под термином инфекционное заболевание понимают заболевания, которые вызываются патогенами млекопитающих, включая, без ограничения, такие патогены, как бактерии, вирусы, грибы и простейшие. Частный пример бактериального заболевания человека, которое можно прерывать, предотвратить и/или облегчить с помощью измененных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению, включает, но не ограничивается, холеру (вызываемую бактерией νίότίο сЬо1егае). В частности, рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению может быть изменена таким образом, что это регулирует или влияет на кворум-зависимую экспрессию факторов вирулентности νίότίο сЬо1егае. Соответствующие примеры факторов вирулентности νίότίο сЬо1егае, которые можно ингибировать или нарушать их работу с помощью рекомбинантных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению, могут включать, но не ограничиваются, холерный токсин (СТ) и токсин-корегулируемые пили адгезии (ТСР). Соответствующие примеры генов, которые можно вставлять в рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению (например, симбиотическую бактерию ЕксЬепсЫа сой №§81е 1917) для подавления или нарушения экспрессии СТ или ТСР, могут включать, но не ограничиваются, автоиндукторы УШгю сЬо1егае, известные как холерный автоиндуктор 1 (СА1-1) (кодируемый геном сс|5Л) и/или автоиндуктор 2 (ΑΙ-2) (кодируемый геном 1их8).
Частный пример аутоиммунного заболевания человека, которое можно прекратить, предотвратить и/или облегчить с помощью генетически измененной клетки или микроорганизма согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается, диабет 1 типа. Более конкретно, в отношении диабета 1 типа, указанные рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению (например, симбиотическую бактерию №8§1е 1917 ЕксЬепсЫа сой) можно изменить таким образом, чтобы это стимулировало продукцию инсулина и/или транскриптов инсулина у человека.
Примеры продуктов генов, которые могут стимулировать выработку инсулина, включают, но не ограничиваются, ΡΌΧ-1, ΟΙΡ и О1р-1 млекопитающих. Показано, что ΡΌΧ-1 стимулирует конститутивную выработку инсулина в эпителии. Показано, что О1р-1 стимулирует выработку инсулина эпителием в ответ на глюкозу. Показано, что ΟΙΡ стимулирует конститутивную выработку инсулина в β-клетках поджелудочной железы. Поэтому согласно одному варианту реализации настоящего изобретения симбиотическую бактерию, например, ЕксЬепсЫа сой №§81е 1917, можно изменить для обеспечения ею синтеза пептид ов ΡΌΧ-1, ΟΙΡ и/или О1р-1: любого из этих трех пептидов или одного из трех пептидов в сочетании со всеми другими пептидами.
Настоящее изобретение предлагает создание и применение микроорганизмов, например, клеточных линий симбиотических бактерий, которые согласно одному варианту реализации могут воспринимать условия организма хозяина (например, млекопитающего, человека) и отвечать соответствующим образом или оказывать терапевтический эффект, или выделять специфическую сигнальную молекулу вместо хозяина. Согласно другим вариантам реализации настоящего изобретения указанные микроорганизмы могут не воспринимать условия в организме хозяина, но могут коснтитутивно обеспечивать желаемый терапевтический ответ. Частные примеры клеточных линий симбиотических бактерий и их применение приведены ниже в целях иллюстрации, но не ограничения области охвата настоящего изобретения.
В целях ясности, но не ограничения, подробное описание изобретения разделено на подразделы, представленные ниже.
Рекомбинантные клетки
Настоящее изобретение обеспечивает изолированные рекомбинантные клетки, содержащие рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид, причем указанная клетка получена из первого организма, который представляет собой микроорганизм, указанный белок или пептид может экспрессироваться в клетке и указанный белок или пептид регулирует сигнал-зависимую экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно одному варианту реализации указанная нуклеиновая кислота представляет собой реком- 7 023069 бинантную нуклеиновую кислоту восприятия кворума.
Согласно другому варианту реализации указанная рекомбинантная клетка дополнительно содержит рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, причем указанная рекомбинантная молекула ответа распознаёт молекулу, присутствующую в хозяине.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид секретеруется клеткой и секреция клеткой находится под контролем стимула из внешней среды. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид стимулирует или ингибирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Стимул из внешней среды может секретироваться патогеном или наличие внешнего стимула может указывать на присутствие патогена.
Согласно частному варианту реализации, согласно которому рекомбинантную клетку используют для лечения диабета, указанный белок или пептид может включать С1р-1, ΡΌΧ-1 или ΟΙΡ, и внешний стимул может представлять собой глюкозу или сахар, который стимулирует выделение инсулина у здорового человека.
Согласно другому варианту реализации указанный патоген представляет собой инвазивный патоген, и белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность указанного инвазивного патогена
Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота контролирует патогенез или вирулентность патогена. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор вирулентности инвазивного патогена.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота экспрессируется млекопитающим. Согласно другому варианту реализации целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор млекопитающего. Фактор млекопитающего может, например, обеспечивать нормальное функционирование физиологического процесса в организме млекопитающего или быть эффективным для предотвращения начала, формирования или распространения неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента.
Согласно другому варианту реализации указанная целевая нуклеиновая кислота кодирует причинный фактор, ассоциированный с началом неинфекционного заболевания млекопитающего.
Настоящее изобретение также обеспечивает рекомбинантный микроорганизм (одноклеточный или многоклеточный), который включает одну или более рекомбинантную клетку, которая содержит рекомбинантную кворумную нуклеиновую кислоту. Согласно частному варианту реализации указанную рекомбинантную кворумную нуклеиновую кислоту получают из второго организма, который экспрессирует кворумный сигнальный белок или пептид (также известный как сигнал восприятия кворума). Указанный кворумный сигнал регулирует кворум-зависимую экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. При объединении с организмом хозяина (например, симбиотическим хозяином) указанная рекомбинантная клетка (или микроорганизм, содержащий такую клетку) регулирует кворум-зависимую экспрессию представляющего интерес генов организма хозяина или экзогенного (например, патогенного) организма.
Рекомбинантный микроорганизм (или полученная из него рекомбинантная клетка) может представлять собой бактерию, вирус, архею, дрожжи, гриб или клетку млекопитающего.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный рекомбинантный микроорганизм представляет собой непатогенный микроорганизм, например, микроорганизм, который принадлежит к природной кишечной флоре человека или животного.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамотрицательную бактерию кишечной флоры.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения грамотрицательная бактерия принадлежит роду ЕзсЬепсЫа, Рзеийотоиаз, ВайегоШез, Ьас1оЪасй1из, Ьас1ососсиз, ВасШиз или Рго(еиз.
Согласно другому варианту реализации указанная грамотрицательная бактерия представляет собой ЕзсЬепсЫа сой (№зз1е 1917).
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамположительную или грамотрицательную бактерию кишечной флоры.
Согласно другому варианту реализации грамположительная бактерия принадлежит роду ВШйоЪас(егшш, §1гер(ососсиз, 81арЬу1ососсиз или СогуиеЪайегшт.
Согласно частным вариантам реализации указанная бактерия представляет собой кишечную бактерию (например, ЕзсЬепсЫа сой, Ьас1оЪасййз), симбиотическую бактерию (например, штамм ЕзсЬепсЫа сой). Согласно другому частному варианту реализации бактерия представляет собой ЕзсЬепсЫа сой №зз1е 1917.
Штаммы бактерий можно легко получить с помощью стандартных способов, известных в данной области. Например, симбиотическую бактерию такую, как №зз1е 1917 ЕзсЬепсЫа сой, можно получить из коммерческого препарата пробиотика МйаДог™. Бактерии можно культивировать с помощью стандартных способов, известных в данной области.
Согласно другому частному варианту реализации, согласно которому заболевание, которое необходимо предотвратить или облегчить, представляет собой диабет 1 типа, обеспечивается изолированная
- 8 023069 рекомбинантная клетка, содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина. Указанную рекомбинантную клетку можно получить из микроорганизма, например, кишечной бактерии или симбиотической бактерии кишечника.
Согласно этому варианту реализации стимулирующий секрецию инсулина пептид млекопитающего регулирует экспрессию инсулина в инсулин-секретирующих клетках-мишенях млекопитающего. Экспрессия пептида млекопитающего, стимулирующего секрецию инсулина, указанной рекомбинантной клеткой стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего. Пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР-1), желудочный ингибиторный пептид (С1Р) или панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (РОХ-1).
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения инсулин-секретирующие клетки мишени млекопитающего представляют собой клетки кишечного эпителия. Рекомбинантную симбиотическую бактерию согласно настоящему изобретению можно изменить способами генной инженерии, чтобы она для придания стимулировала секрецию инсулина клетками кишечного эпителия в ответ на глюкозу. Согласно одному варианту реализации способами инженерии можно получить бактерию, которая секретирует инсулинотропный СЬР-1, С1Р и/или РОХ-1.
Патогены
Согласно одному варианту реализации целевая нуклеиновая кислота может экспрессироваться инфекционным или инвазивным патогеном, включая, но, не ограничиваясь, инфекционную бактерию, простейшее, гриб или вирус.
Рекомбинантную симбиотическую бактерию согласно настоящему изобретению можно изменить таким образом, что она воспринимает молекулу мишень, которая может представлять собой, но не ограничиваться им, кворумный сигнал, и отвечает на указанную молекулу посредством секреции антипатогенного пептид а (например, антимикробного, противогрибного и т.д.). Антипатогенный пептид может иметь широкий спектр действия (например, действует на несколько видов бактерий) или иметь высокую специфичность к одному виду патогена.
В данной области известно множество инфекционных патогенов. Инфекционная бактерия может представлять собой, например, Е. сой, Ркеийошоиак ог §1арйу1ососси8. Гриб может представлять собой, например, Стур1ососси8 пеоГоттапк. Вирус может представлять собой, например, вирус гриппа птиц (Η5Ν1).
Согласно частному варианту реализации указанный инвазивный патоген представляет собой УФтю сйо1етае.
Целевые нуклеиновые кислоты
Согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота (которая также в данном описании обозначается термином экзогенная целевая нуклеиновая кислота) может кодировать фактор инфекционного патогена, например фактор вирулентности. Согласно частным вариантам реализации указанный фактор инфекционного патогена представляет собой молекулу токсина.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения целевая нуклеиновая кислота кодирует фактор млекопитающего. Фактор млекопитающего может способствовать, например, нормальному функционированию физиологического процесса у млекопитающего пациента, или он может быть эффективным для предотвращения начала, формирования или распространения неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Согласно частным вариантам реализации указанный фактор млекопитающего представляет собой РОХ-1. СЬР-1 или С1Р.
Согласно другому варианту реализации указанный сигнал восприятия кворума регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты. Например, указанный кворумный сигнал может стимулировать или подавлять экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ регуляции экспрессии целевой нуклеиновой кислоты. Указанный способ включает обеспечение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или микроорганизма, который содержит или состоит из клетки согласно настоящему изобретению) и введение указанной клетки (или микроорганизма, содержащего или состоящего из клетки согласно настоящему изобретению) пациенту хозяину при условиях, при которых может осуществляться экспрессия указанного сигнала в пациенте хозяине, что регулирует сигнал-зависимую экспрессию целевой нуклеиновой кислоты в указанном хозяине.
Сигналы и нуклеиновые кислоты, которые их кодируют
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения белок или пептид предотвращает, распознаёт, облегчает или лечит заболевание или нарушение человека или животного или клетки, полученной из них.
Указанный белок или пептид может секретироваться, испускаться, выделяться или продуцироваться рекомбинантной клеткой или микроорганизмом согласно настоящему изобретению. Такая секреция, испускание, выделение или продукция клеткой может контролироваться стимулом из внешней среды.
Согласно одному варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид может
- 9 023069 контролировать, например стимулировать или подавлять экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает антимикробный пептид или молекулу. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает антимикробный пептид или молекулу.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает антимикробный пептид или молекулу.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид экспрессируется клеткой конститутивным образом.
Согласно другому варианту реализации экспрессия рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный сигнал, находится под контролем индуцибельного промотора.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанный белок или пептид включает стимулирующий секрецию инсулина млекопитающего, указанный белок или пептид регулирует экспрессию инсулина в инсулин-секретирующих клетках млекопитающего, и экспрессия указанного сигнала клеткой стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего, например человека. Согласно этому варианту реализации изобретения рекомбинантная клетка также может содержать рекомбинантную нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантную молекулу ответа, причём указанная рекомбинантная молекула ответа распознаёт молекулу, присутствующую в млекопитающем хозяине. Пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, может представлять собой, например, глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР-1) или панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген1 (ΡΌΧ-1). Инсулин-секретирующие клетки млекопитающего могут представлять собой клетки кишечного эпителия.
Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид включает кворумный сигнал. Квормуные сигналы (также известные как сигналы восприятия кворума) используются микроорганизмом для межклеточного сигналлинга в зависимости от плотности клеток (восприятие кворума) для координации их роста и вирулентности. Такие сигналы хорошо известны в данной области. Например, известно, что как патогенные, так и непатогенные бактерии кишечника используют сигналы восприятия кворума (Карег ΙΒ, 8рсгапФо V. 2005. Вас1спа1 ес11-Ю-ес11 кщпаПпд ίη 1Пс βακίΓοίηΙοκΙίηαΙ 1гас1. 1пГсе1 1ттип 73(6):3197-209).
Согласно частному варианту реализации, согласно которому инфекционный патоген представляет собой νίόπο сНо1сгас, сигнал восприятия кворума представляет собой холерный автоиндуктор 1(СА1-1) νίότίο сНо1сгас или автоиндуктор 2 (А1-2). Кворумная нуклеиновая кислота может включать гены νίότίο сНо1сгас сцкА и/или 1их8, кодирующие СА1-1 и А1-2 соответственно. Согласно этому варианту реализации целевые нуклеиновые кислоты (нуклеиновые кислоты-мишени) кодируют холерный токсин (СТ) и токсин-корегулируемые пили адгезии (ТСР) νίότίο сйо1сгас и экспрессия СА1-1 и А1-2 рекомбинантными клетками будет подавлять экспрессию СТ и ТСР νίΠτΟ сНо1сгас.
Рекомбинантную клетку или микроорганизм согласно настоящему изобретению можно генетически изменить с применением способов, известных в данной области техники таким образом, чтобы она экспрессировала сигнал восприятия кворума под контролем промотора (например, индуцибельного или конститутивного промотора). Клетку или микроорганизм можно трансформировать, например, плазмидой, несущей кворумный ген для того, чтобы обеспечить экспрессию сигнала кворума на высоком уровне.
Гены, кодирующие кворумные сигналы, можно получить стандартными способами амплификации нуклеиновых кислот, известными в данной области техники, например высокоточная ПЦР с праймерами, подходящими для желаемой амплификации. Амплифицированную последовательность можно стандартными способами вставить в соответствующий вектор. Такие векторы хорошо известны в данной области и коммерчески доступны (например, вектор рИС19 (Ысте Еп§1ап6 Вю1аЪк)). Вектор может быть трансформирован в клетку или микроорганизм любыми способами, известными в данной области техники, например электропорацией. Клонирование можно проводить стандартными способами, известными в данной области техники (См., например, 8атЪгоок ί. КикксИ ЭА. 2001. Мо1сси1аг с1отпд: а 1аЪога1огу тапиа1. Со1б 8ргтд НагЪог Ν.Υ.: Со1б 8ргшд НагЪог ЬаЪогаЮгу Ргскк. 3 ν. р).
Согласно частному варианту реализации методами генетической инженерии можно получить симбиотическую бактерию Е. сой N^5кIс 1917 (№5к1с), которая экспрессирует СА1-1 под контролем ГНС или другого конститутивного промотора.
Демонстрация терапевтической полезности
Рекомбинантные клетки или микроорганизмы согласно настоящему изобретению предпочтительно проверяют 1п ν^ι^ο. а затем ш νί\Ό на наличие желаемой терапевтической или профилактической активности перед применением на людях.
Например, анализы ш νίΙΐΌ можно применять для определения того, показано ли введение специфической рекомбинантной клетки или микроорганизма. Такие анализы могут представлять собой, например, анализ клеточных культур ш ν^ι^ο. в котором образец ткани пациента выращивают в культуре и его подвергают действию или вводят в него рекомбинантную клетку или микроорганизм, и наблюдают за действием, которое оказывает такая рекомбинантная клетка или микроорганизм на указанный образец
- 10 023069 ткани. Высокий уровень желательного действия или низкий уровень нежелательного действия указывают на то, что рекомбинантная клетка или микроорганизм являются эффективными для лечения заболевания пациента.
В качестве альтернативы вместо культивирования клеток пациента можно проанализировать рекомбинантную клетку или микроорганизм с помощью клеточной линии злокачественной опухоли. Для определения уровней желательного или нежелательного воздействия можно применять множество стандартных способов, известных в данной области техники.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения можно определять активность рекомбинантной клетки или микроорганизма, чтобы модулировать (например, способствовать, ингибировать или оказывать антагонистическое воздействие) уровень и/или активность нуклеиновых кислотмишеней. Уровни белков и мРНК, кодируемых целевой целевой нуклеиновой кислотой, и активность целевой нуклеиновой кислоты можно определять любыми известными в данной области техники способами.
Например, уровни белка можно количественно определять известными способами иммунной диагностики, например иммунопреципитацией с вестерн-блоттингом с применением любого антитела против этого белка (например, коммерчески доступных антител). мРНК можно количественно определять способами, известными в данной области техники, например нозерн-блоттингом, анализом защиты от РНКаз, ПЦР с обратной транскрипцией и т.д. Активность целевой нуклеиновой кислоты можно также определить любым способом, известным в данной области техники.
Вещества, предназначенные для применения в терапии, можно тестировать на соответствующих животных моделях перед тестированием на человеке, включая, но не ограничиваясь, крыс, мышей, цыплят, коров, обезьян, кроликов и т.д.
Для проверки влияния экспрессии сигнала восприятия кворума на вирулентность представляющего интерес патогена можно создать совместные культуры эпителия человека, генетически измененных симбиотических бактерий и патогенных бактерий. В таких совместных культурах указанные генетически модифицированные симбиотические бактерии сначала культивируют с клетками эпителия человека, или сначала культивируют указанные генетически модифицированные симбиотические бактерии, а затем продукты их секреции (бесклеточная среда, СРМ) культивируют совместно с эпителием человека. После того, как указанные генетически модифицированные симбиотические бактерии некоторым образом культивировали совместно с эпителием (добавляя их к эпителию или добавляя их СРМ к эпителию), указанный эпителий можно проконтактировать с патогеном для оценки реакции эпителия на патоген.
Можно провести анализ для определения активности сигнала восприятия кворума в рекомбинантной клетке или организме методами иммунного окрашивания (например, ИФА), биологическими способами анализа (например, люминесценция) или другими химическими методами в жидких средах (например, жидкостная аффинная хроматография высокого разрешения (ИРЬС)). В одном примере можно использовать биологические способы анализа для исследования СА1-1 и ΑΙ-2 УФтю с1ю1сгас. В этом тесте методами генетической инженерии получают мутантный по тестируемому соединению штамм УФгю, который люминесцирует в присутствии тестируемого соединения (ΑΙ-2 или СА1-1). Интенсивность люминесценции тестируемого штамма указывает на количество целевого соединения, продуцируемого тестируемым штаммом УФтю с1ю1сгас.
Способы регуляции сигнал-зависимой экспрессии целевой нуклеиновой кислоты
Настоящее изобретение обеспечивает способ регуляции сигнал-зависимой экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в организме. Согласно одному варианту реализации указанный способ включает обеспечение рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению и введение указанной клетки в организм при условиях, эффективных для обеспечения экспрессии указанно сигнала в организме, посредством чего регулируется сигнал-зависимая экспрессия целевой нуклеиновой кислоты в указанном организме.
Согласно одному варианту реализации указанный организм представляет собой млекопитающее. Согласно другому варианту реализации указанное млекопитающее представляет собой человека.
Согласно другому варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой бактерию, например кишечную бактерию или симбиотическую бактерию.
Согласно частному варианту реализации указанная нуклеиновая кислота кодирует пептид ΡΌΧ-1, который эффективно стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего. Согласно другому варианту реализации указанная нуклеиновая кислота кодирует пептид С1р-1, который эффективно стимулирует продукцию инсулина у млекопитающего в ответ на глюкозу.
Способы предотвращения или облегчения заболеваний или нарушений
Настоящее изобретение обеспечивает способы предотвращения, облегчения, лечения и/или профилактики посредством введения пациенту эффективного количества рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно изобретению.
Согласно одному варианту реализации обеспечивается способ предотвращения или облегчения инфекционного или неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ включает обеспечение изолированной рекомбинантной клетки согласно настоящему изобретению (или мик- 11 023069 роорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из такой клетки согласно настоящему изобретению), и введение указанной клетки (или микроорганизма, содержащего указанную клетку или состоящего из такой клетки) млекопитающему пациенту при условиях, эффективных для стимулирования экспрессии фактора, предотвращающего развитие заболевания, или подавления экспрессии фактора, который является причиной заболевания, в результате чего предотвращается или облегчается заболевание.
Согласно одному варианту реализации указанное неинфекционное заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, например диабет 1 типа.
Согласно частному варианту реализации указанный белок или пептид включает ΡΌΧ-1, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и ΡΌΧ-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего пациента. Согласно другому особенному варианту реализации указанный белок или пептид включает С1р-1, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и С1р-1 стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента. Согласно другому частному варианту реализации указанный белок или пептид включает ΟΙΡ, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин и ΟΙΡ стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента.
Согласно другому варианту реализации обеспечивается способ облегчения или предотвращения инфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ может включать обеспечение рекомбинантной клетки или микроорганизма, содержащего рекомбинантную клетку согласно настоящему изобретению (или рекомбинантного одноклеточного организма, содержащего указанную клетку), причем указанный белок или пептид ингибирует экспрессию фактора вирулентности инфекционного патогена. Рекомбинантную клетку (или рекомбинантный микроорганизм, содержащий клетку, или рекомбинантный одноклеточный микроорганизм) можно вводить млекопитающему пациенту при условиях, при которых эффективно ингибируется экспрессия фактора вирулентности у млекопитающего пациента.
Согласно другому варианту реализации указанное инфекционное заболевание связано с фактором вирулентности инфекционного патогена. Поэтому введение рекомбинантной клетки или микроорганизма может предотвратить или облегчить указанное инфекционное заболевание, связанное с фактором вирулентности инфекционного патогена.
Согласно частному варианту реализации указанный инфекционный патоген представляет собой VIЪпо с1ю1сгас. и указанное инфекционное заболевание представляет собой холеру. Сигналы могут представлять собой холерный автоиндуктор 1 (СА1-1) и/или автоиндуктор 2 (ΑΙ-2) ν&ήο с1ю1сгас. Указанная нуклеиновая кислота может сдержать ген сс|5А ν&ήο сйо1егае, кодирующий СА1-1 и/или ген 1их8, кодирующий ΑΙ-2. Нуклеиновые кислоты-мишени могут представлять собой холерный токсин (СТ) и/или токсин-корегулируемые пили адгезии(ТСР) ν&ήο с1о1егае и экспрессия СА1-1 и/или ΑΙ-2 ингибирует экспрессию СТ и/или ТСТ инфекционного патогена.
Настоящее изобретение также обеспечивает способ предотвращения или облегчения инфекционного или неинфекционного заболевания у млекопитающего пациента. Указанный способ включает обеспечение генетически модифицированного микроорганизма, содержащего рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует сигнальный белок или пептид, причём указанный сигнальный белок или пептид стимулирует экспрессию фактора, предотвращающего развитие заболевания, или ингибирует экспрессию фактора, который является причиной заболевания; и введение указанного микроорганизма млекопитающему пациенту при условиях, эффективных для предотвращения или облегчения заболевания млекопитающего пациента. Экспрессию указанного сигнального белка может вызывать сигнал, который присутствует в среде, в которую помещают указанный полученный методами инженерии микроорганизм.
Неинфекционное заболевание может представлять собой, например, аутоиммунное заболевание, например, диабет 1 типа или другое неинфекционное заболевание, наличие которого отражается на биохимическом составе среды, в которую можно поместить полученную методами инженерии бактерию.
Согласно частному варианту реализации указанный сигнальный пептид содержит ΡΌΧ-1, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин, и ΡΌΧ-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина у млекопитающего пациента. Здесь запускающим сигналом является глюкоза, которая стимулирует экспрессию и секрецию ΡΌΧ-1 из полученного методами инженерии микроорганизма. ΡΌΧ-1 стимулирует секрецию инсулина у млекопитающего пациента.
Согласно другому особенному варианту реализации указанный сигнальный пептид представляет собой С1р-1, фактор, предотвращающий развитие заболевания, представляет собой инсулин, и С1р-1 стимулирует продукцию инсулина в ответ на глюкозу у млекопитающего пациента.
Согласно другому особенному варианту реализации пусковым сигналом является оксид азота, который указывает на наличие множественного склероза у пациента человека. Согласно этому варианту реализации генетически модифицированный микроорганизм воспринимает высокие уровни оксида азота и отвечает флуоресценцией или люминесценцией. Это обеспечивает определение повышенного уровня оксида азота и служит способом ранней диагностики рассеянного склероза. Можно определять флуоресценцию или люминесценцию генетически модифицированного микроорганизма в образце стула или кро- 12 023069 ви человека хозяина в зависимости от молекулы, секретируемой указанным модифицированным микроорганизмом, и/или от того, где указанный организм был индуцирован в организме человека (например, кровь, желудок и т.д.).
Настоящее изобретение также обеспечивает применение действующего вещества, выбранного из группы, состоящей из сигнала, его фрагмента, комплекса, производного и аналога указанного сигнала, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество, или его фрагмен,т или производное, причём указанный белок или пептид регулирует экспрессию целевой нуклеиновой кислоты; и непатогенного микроорганизма, содержащего указанную нуклеиновую кислоту, и способного экспрессировать указанный сигнал, для лечения заболевания или нарушения у человека или животного.
Согласно одному варианту реализации указанный белок или пептид ингибирует или нарушает патогенность или вирулентность инвазивного патогена. Согласно другому варианту реализации указанный белок или пептид предотвращает, выявляет, облегчает или лечит заболевание или нарушение у человека или животного пациента.
Согласно другому варианту реализации указанное заболевание представляет собой инфекционное или неинфекционное заболевание.
Согласно другому варианту реализации лечение осуществляют посредством введения изолированного и очищенного действующего вещества в составе фармацевтической композиции.
Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят в дозе, достаточной для лечения или предотвращения болезненного состояния, остановки развития заболевания или облегчения его симптоматики.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения указанное действующее вещество вводят пациенту орально, ректально, парентерально, в виде инъекции, инфузии, спрея или ингалятора.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм может продуцировать указанное действующее вещество до, во время или после введения человеку или животному пациенту и выделять указанное продуцированное действующее вещество после введения в клетки или ткани пациента.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию или гриб человека или животного.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм принадлежит естественной кишечной флоре человека или животного.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамотрицательную бактерию кишечной флоры.
Согласно другому варианту реализации указанная грамотрицательная бактерия принадлежит роду ЕксйепсЫа, Ркеийотопак, ВаСегоШек, ЬасЮЬасШик, ЬасЮсоссик, ВасШик или Рго1еик.
Согласно другому варианту реализации указанная грамотрицательная бактерия представляет собой ЕксйепсЫа сой (№кк1е 1917).
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм представляет собой аэробную или анаэробную грамположительную или грамотрицательную бактерию кишечной флоры.
Согласно другому варианту реализации указанная грамположительная бактерия принадлежит роду ВШйоЬас1егшт, §1гер1ососсик, 81арйу1ососсик или СогупеЬас1егшт.
Согласно другому варианту реализации настоящего изобретения нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнал, его фрагмент или производное, вставляют в вектор.
Согласно другому варианту реализации указанный вектор представляет собой плазмиду, космиду, бактериофаг или вирус.
Согласно другому варианту реализации нуклеиновая кислота, встроенная в вектор, находится под функциональным контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента, который обеспечивает транскрипцию указанной нуклеиновой кислоты в транслируемую РЕК или трансляцию РНК в белок до, во время или после введения. Согласно другому варианту реализации указанный по меньшей мере один регуляторный элемент представляет собой промотор, сайт связывания с рибосомой, сигнальную последовательность или З'-терминатор транскрипции.
Согласно другому варианту реализации указанный промотор представляет собой индуцибельный промотор. Согласно частному варианту реализации настоящего изобретения указанный индуцибельный промотор индуцируется сигнальным каскадом, включающим по меньшей мере один элемент в ответ на стимул или стимулы из окружающей среды.
Согласно другому варианту реализации сигнальная последовательность представляет собой последовательность бактерии или гриба, которая способствует секреции указанного белка из цитоплазмы микроорганизма в периплазматическое пространство или в среду, внешнюю для указанного микроорганизма.
Согласно другому варианту реализации указанный непатогенный микроорганизм содержится в фармацевтической или пищевой композиции.
Согласно другому варианту реализации указанное действующее вещество вводят пациенту орально,
- 1З 023069 ректально, парентерально, в виде инъекции, инфузии или ингалятора.
Терапевтическое/профилактическое введение и композиции
Настоящее изобретение обеспечивает способы облегчения, предотвращения, лечения и/или профилактики посредством введения пациенту эффективного количества рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно изобретению. Согласно предпочтительному аспекту изобретения рекомбинантная клетка или микроорганизм согласно настоящему изобретению являются, по существу, очищенными. Предпочтительно пациент представляет собой животное без ограничения, включая коров, свиней, лошадей, цыплят, собак, кошек и т.д., и предпочтительно представляет собой млекопитающее, наиболее предпочтительно человека. Согласно частному варианту реализации указанный пациент представляет собой отличающееся от человека млекопитающее.
Известны различные системы доставки для введения рекомбинантных клеток или микроорганизмов согласно настоящему изобретению (например, жидкие суспензии, суспензии в пище, лиофилизированные порошки, таблетки, капсулы, инкапсулированные в липосомах, микрочастицы, микрокапсулы). Способы введения включают внутрикожный, внутримышечный, интраперитонеальный, внутривенный, подкожный, интраназальный, эпидуральный и оральный. Указанные рекомбинантные клетки или микроорганизмы можно вводить любым удобным способом, например проглатыванием, и можно вводить вместе с другими биологически активными агентами. Введение может быть системным или локальным.
Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтические композиции. Такие композиции могут содержать терапевтически эффективное количество рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель. Согласно частному варианту реализации термин фармацевтически приемлемый означает одобренный регулирующим ведомством федерального правительства и правительства штата или внесенный в список Фармакопеи США или другой признанной фармакопеи для применения на животных и, в частности, на человеке. Термин носитель относится к растворителю, наполнителю, носителю, адъюванту, с которым вводят рекомбинантную клетку или микроорганизм. Указанная композиция также может содержать незначительные количества увлажняющих или эмульгирующих агентов или буферных агентов. Эти композиции могут иметь форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, лекарственных форм с постоянным высвобождением и т.д. Примеры соответствующих фармацевтических носителей описаны Е.Ш. Матйи в КештдЮи'к РЬагтасеийса1 Баенсек. Такие композиции будут содержать терапевтически эффективно количество рекомбинантной клетки или микроорганизма, предпочтительно в очищенном виде, совместно с соответствующим количеством носителя для обеспечения формы для надлежащего введения пациенту. Лекарственная форма должна соответствовать способу введения.
Согласно предпочтительному варианту реализации настоящего изобретения композицию составляют согласно рутинным процедурам, поскольку фармацевтическую композицию адаптируют для орального введения человеку.
Количество рекомбинантной клетки или микроорганизма согласно изобретению, которое будет эффективным для лечения конкретного нарушения, будет зависеть от природы нарушения или состояния, и его можно определить стандартными клиническими методами. Дополнительно можно использовать анализы ίη νίίτο для определения оптимальных границ дозы. Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых зависимости от доз, полученных из тестовых систем ίη νίίτο или животных моделей.
Обычно суппозитории содержат активный ингредиент в количестве от 0,5 до 10% по весу, оральные лекарственные формы предпочтительно содержат от 10 до 95% активного ингредиента.
Также настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую упаковку или набор, включающий один или более контейнеров, наполненных одним или более ингредиентом фармацевтических композиций согласно изобретению.
Согласно частному варианту реализации обеспечивается фармацевтическая или пищевая композиция. Композиция может содержать по меньшей мере одну клетку непатогенного микроорганизма, способного продуцировать действующее вещество и содержащего экспрессируемую нуклеиновую кислоту, кодирующую белок или пептид или его фрагмент или производное. Согласно одному варианту реализации указанный микроорганизм представляет собой анаэробную или аэробную, грамотрицательную или грамположительную бактерию кишечной флоры. Согласно другому варианту реализации микроорганизм представляет собой симбиотическую бактерию человека или животного.
Согласно другому варианту реализации нуклеиновую кислоту, кодирующую указанный белок или пептид или его фрагмент или производное, встраивают в вектор экспрессии, и при этом экспрессия нуклеиновой кислоты находится под контролем по меньшей мере одного регуляторного элемента таким образом, что указанное действующее вещество экспрессируется до, во время или после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции, и высвобождается в клетки или ткани человека или животного хозяина после введения указанной фармацевтической или пищевой композиции.
Обеспечивается способ получения фармацевтической или пищевой композиции. Указанный способ включает:
(а) выделение или синтез нуклеиновой кислоты, кодирующей действующее вещество, где указанное действующее вещество выбрано из группы, состоящей из белка или пептида, его фрагмента, комплекса
- 14 023069 указанного белка или пептида, производного указанного белка или пептида и аналога указанного белка или пептида, экспрессируемой нуклеиновой кислоты, кодирующей указанное действующее вещество или его фрагмент или производное;
(б) клонирование указанной нуклеиновой кислоты, кодирующей указанный белок или пептид, в микробный вектор экспрессии;
(в) трансформацию рекомбинантного вектора экспрессии, полученного на стадии (б) в клетку микроорганизма-хозяина, при этом указанная клетка микроорганизма-хозяина представляет собой симбионта человека или животного;
(г) размножение указанных трансформированных клеток микроорганизма-хозяина;
(д) получение иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии указанных трансформированных клеток микроорганизма-хозяина; и (е) смешивание указанного иммобилизированного, лиофилизированного, жидкого препарата или суспензии трансформированных клеток микроорганизма-хозяина, полученных на стадии (е), с физиологически приемлемыми наполнителями, стабилизаторами, загустителями, разделителями, лубрикантами и подобными материалами для получения фармацевтической или пищевой композиции.
Приведенные ниже примеры представлены исключительно с целью иллюстрации, но не ограничения объема настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1. Прекращение инфекции УЛпо сЬо1егае в клетках эпителия человека с помощью модифицированной передачи сигналов симбиотическими бактериями
Введение.
Серотипы У. сЬо1егае Е1 Тог отвечают за вспышки холеры в развивающихся странах. У некоторых штаммов У. сЬо1егае инфекционный цикл координируется, по меньшей мере, в некоторой степени посредством восприятия кворума. То есть, экспрессия генов вирулентности зависит от концентрации автоиндукторов У. СЬо1егае: автоиндуктора 1 (СА1-1) и автоиндуктора 2 (ΑΙ-2). Недавно показано, что высокие концентрации СА1-1 и А1-2 подавляют экспрессию генов вирулентности. Этот пример показывает, что методами генной инженерии можно получить симбиотическую бактерию Е. сой №зз1е 1917 (№зз1е), которая экспрессирует СА1-1 (в естественных условиях №зз1е экспрессирует А1-2) и эффективно нарушает вирулентность У. СЬо1егае. Методами генетической инженерии получили штамм №зз1е, который экспрессирует СА1-1 под контролем промотора 1ас оперона и этот штамм продемонстрировал подавление экспрессии холерного токсина (СТ) У. сЬо1егае (на что указывало присутствие субъединицы В СТ (СТВ)), и токсин-корегулируемых пилей адгезии - ТСР (на что указывает относительная транскрипция субъединицы А ТСР (ТСРА)) как в монокультурах У. СЬо1егае, так и при совместном культивировании №зз1е и У. сЬо1егае с эпителиальными клетками. На модельной системе клеток эпителия Сасо-2, которые инкубировали с У. сЬо1егае, было показано, что совместное культивирование с бактериями №зз1е, экспрессирующими СА1-1, снижало связывание СТВ с клетками Сасо-2 на 63% по сравнению с совместными культурами со штаммом №зз1е дикого типа. Также в культурах с №зз1е, экспрессирующей СА1-1, была сравнительно низкая транскрипция ТСРА, чем в контролях со штаммом №зз1е дикого типа. Эти результаты представляют собой значительный прогресс в направлении профилактического способа борьбы с кишечными заболеваниями посредством генетически модифицированного сигналлинга восприятия кворума у штамма симбиотической бактерии.
Материалы и методы Плазмиды
Было показано, что СА1-1 У. йагуеу1 стимулирует восприятие кворума у У. сЬо1егае тем же образом, что и СА1-1 У. сЬо1егае (Непке 1М. Вазз1ег ВЬ. 2004. ТЬгее рага11е1 сцюгшп-зегМпд зуз1етз геди1а1е депе ехргеззюп ш УШпо Ьагуеук 1 Вас1епо1 186(20):6902-14). Поэтому получили ген сцзА (который кодирует СА1-1) У. сЬо1ега (УСА 0532) (МШег МВ, §когирзк1 К, йен/ ЭН, Тау1ог КК, Вазз1ег ВЬ. 2002. Рага11е1 цногит зеизшд зуз1етз соиуегде Ю геди1а!е У1ги1еисе ш УШгю сЬо1егае. Се11 110(3):303-14) способом высокоточной ПЦР (§1га1адепе) с праймерами: 5' СТО САС (сайт Рз1 I) АТС ААС ААС ССТ САА СТТ С 3' и 5' ССТАСС (сайт Крп1) ТТА ТТА АСС ААА АТА ААА АТС АСС СТА С 3', и вставили в вектор рИС19 (Яете Епд1апД Вю1аЪз). Е. сой №зз1е 1917 (№зз1е-сцзА) трансформировали в с помощью электропорации новым вектором (рСА1-1). В качестве контроля Е. сой №зз1е 1917 также трансформировали ИС19 отдельно (получив вектор №зз1е). Клонирование проводили стандартным способом, описанным ранее (8атЪгоок 1, Киззе11 Э\У. 2001. Мо1еси1аг с1опшд: а 1айога!огу тапиай Со1Д 8ргшд Нагйог, Ν.Υ.: Со1Д 8ргтд Нагйог йаЪогаЮгу Ргезз. 3 ν. р).
Штаммы бактерий
Штамм №зз1е 1917 Е. сой получили из коммерческого препарата пробиотика Ми1айог™. Штамм №зз1е 1917 выращивали на агаре МакКонки и верифицировали с помощью серий анализов ПЦР (использованные праймеры представляли собой рМи! 5/6, 7/8, 9/10 из В1ит-ОеЫег С, Оз\\а1Д 8, ЕйеЦогде К, 8оппепЪогп и, 5>с1ш1/е 1, Кгшз Наскег 1. 2003. ^еνе1ортеиΐ оГ зйаш-зресШс РСК геасйопз Гог 1Ье Де1есДоп оГ Не ргойюйс ЕзсЬепсЫа сой з1гат №зз1е 1917 πι Геса1 затр1ез. Кез Мюгойю1 154(1): 59-66).
№зз1е 1917 и другие штаммы Е. сой культивировали в ЬВ (среда Лурия-Бертани ) при 37°С при
- 15 023069 встряхивании при 225 об/мин. Во всех экспериментах по вирулентности и инфекционности использовали стрептомицин-устойчивый штамм V. сйо1егае Е1 Тог С6706 (любезно предоставленный Копа1й Тау1ог, ПайтоиЛ МеЙ1са1 8сЬоо1). V. с1ю1егае культивировали при 30°С без встряхивания либо в среде ЬВ, либо в среде ΛΚΕΌ (15г/л пептона, 4 г/л экстракта дрожжей, 10 г/л хлорида натрия, рН 7.4). V. Ьагуеу1 зйатз ВВ120 (дикого типа) и ВВ170 (Д1ихБ) использовали в качестве положительного контроля и штамма сравнения в анализах ΑΙ-2 соответственно. Оба штамма выращивали в среде АВ (0.3М ЫаС1, 0.05М М§БО4, 0.2% казаминовых кислот без витаминов (01Гсо), доведенной до рН 7.5 без Κ0Η). Среду стерилизовали и затем добавляли 10 мл 1М фосфата калия (рН 7.0), 10 мл 0,1М Ь-аргинина, 20 мл глицерола, 1 мл 10 мкл мл-1 рибофлавина и 1 мл 1 мг мл-1 тиамина из расчета на литр (ОгеепЪегд ЕР, Назйпдз ЛУ, иНШиг δ. 1979. 1пйисйоп оГ ЕисГегазе 8уйЬез1з ίη Вепескеа-Нагуеу1 Ъу ОТОег Маппе-Вас1епа. АгсЫуез оГ МкгоЪюШду 120(2):87-91) при 30°С при встряхивании при 225 об/мин. V. с1ю1егае ММ920 (V. с1ю1егае Е1 Тог С6706 з1г АсцзА А1ихО рВВ1 (1ихСЭАВЕ от V. Ьагуеу1)) использовали в качестве штамма сравнения для СА1-1 и культивировали в среде ЬВ при 37°С при встряхивании при 225 об/мин .
Эпителий
Клетки эпителия Сасо-2 (АТСС# СКЕ-2102) культивировали в модифицированной по способу Дальбекко среде Игла (ИМЕМ, Се11дго) с добавлением 10% ЕВБ (Се11дго) при 37°С в инкубаторе с 5% СО2- Сасо-2 клетки также культивировали в среде ΑΚΕΌ с добавлением 10% ЕВБ при 37°С в инкубаторе с 5% СО2 в течение до 7 дней для определения жизнеспособности в этой среде. Все эксперименты по совместному культивированию проводили в среде ΑΚΕΌ с добавлением 10% ЕВБ с клетками Сасо-2 15 и 22 пассажа.
Условия совместного культивирования
Конфлюэнтные культуры клеток Сасо-2 (15-22 пассажа) в 96-луночных планшетах, обработанных коллагеном, промывали свежей ΑΚΕΌ с 10% ЕВБ и инкубировали в течение ночи при 37°С в инкубаторе при 5% СС2. Для определения влияния экспрессии СΑI-1 от №зз1е на вирулентность V. сйо1егае, проводили совместное культивирование клеток Сасо-2 и V. с1ю1егае либо в бесклеточной среде (СЕМ) от штаммов №зз1е или со штаммами №зз1е как показано ниже.
СЕМ из вектора №зз1е и N^зз1е-с^зΑ получали способом, описанным ниже (приготовление СЕМ). Конфлюэнтный монослой клеток Сасо-2 в 96-луночных планшетах промывали один раз ΑΚΕΌ и добавляли 200 мкл 30% СЕМ в ΑΚΕΌ с 10% ЕВБ. Культуры V. с1ю1егае (ОИ600=1) разводили 1:1,000 в лунках 96-луночных планшетов, содержащих Сасо-2 и СЕМ, которые инкубировали при 37°С, 5% СО2 в течение 3 ч. Из 96-луночных планшетов удаляли жидкость, измеряли ОИ600 и центрифугировали (12,000 х д, в течение 10 мин). В супернатант добавляли Лейпептин (10 нг/мл) и непродолжительное время выдерживали при 4°С перед анализом субъединицы В холерного токсина (СТВ). Измерения нормализовали по ОИ600 жидкости, которую отбирали из лунок.
В случае совместного культивирования штаммов №зз1е, V. с1ю1егае и клеток Сасо-2, клетки Сасо-2 в 96-луночных планшетах промывали один раз ΑΚΕΌ перед добавлением приблизительно 200 мкл ΑΚΡΌ с 10% ЕВБ в каждую лунку. №зз1е, №зз1е-вектор и N^зз1е-с^зΑ разводили 1:1,000 (начиная с ОИ600=1) перед совместной инкубацией с клетками Сасо-2 в течение 3 ч. 1 мМ ΙΡΤΟ добавляли в среду с №зз1евектором и N^зз1е-с^зΑ. Через 3 ч в каждую лунку добавляли разведения V. с1ю1егае 1:1,000 (начиная с ОИ600=1) перед инкубацией в течение еще 3 ч. После этого из лунок удаляли жидкость и центрифугировали (12,000 х д, в течение 10 мин). После центрифугирования супернатант нормализовали по ОЭ600 и в него добавляли Лейпептин (10 нг/мл ) (для подавления протеаз) и непродолжительное время выдерживали при 4°С перед анализом СТВ, как описано в разделе Измерения липосомной СТВ. Один раз СТВ анализировали, как описано в разделе Измерения на клетках.
Получение бесклеточной среды (СЕМ)
ΌΗ5α, №зз1е, №зз1е-вектор, N^зз1е-с^зΑ культивировали в ΑΚΡΌ с 50 нг/мл ампициллина при 37°С и встряхивании при 225 об/мин в течение 8 ч. V. с1ю1егае культивировали в ΑΚΡΌ с 10 мкг/мл стрептомицина при 30°С при встряхивании при 225 об/мин, и V. Ьагуеу1 ВВ120 (АТСС Αссезз^оη Ыо. ВΑΑ-1116) культивировали в среде АВ при встряхивании при 225 об/мин и 30°С, обе культуры культивировали в течение 8 ч. Через 8 ч все бактерии откручивали на центрифуге и трижды промывали соответствующей питательной средой. Все культуры приводили к одной ОЭ600 и инокулировали равный объем питательной среды. После инокуляции ΌΗ5α, №зз1е, №зз1е-вектор, N^зз1е-с^зΑ выращивали в течение ночи в ΑΚΤΌ при 37°С и встряхивании при 200 об/мин. 1 мМ ΙΡΤΟ добавляли в питательную среду №зз1евектора и N^зз1е-с^зΑ. После инокуляции V. сйо1егае культивировали в течение ночи при 30°С и встряхивании при 200 об/мин в ΑΚΤΌ, и V. Нагуеу! ВВ120 культивировали при 30°С при встряхивании при 200 об/мин в среде АВ.
После культивирования в течение 14-16 ч культуры центрифугировали при 4,000 х д в течение 30 мин при 4°С. Супернатант пропускали через фильтр (0.2 мм, ΡΑΣΕ ЬГе заепсез). Бесклеточную среду (СЕМ) разводили до плотности ОЭ600=1 ΑΚΓΌ и добавляли 10 нг/мл лейпептина для подавления протеаз перед хранением при 4°С.
Анализ активности ΑΙ-2
- 16 023069
V. Нагусу! ВВ170 (АТСС № доступа ВАА-1117) культивировали в течение ночи в среде АВ и разводили в отношении 1:3,000 средой АВ. Ночные культуры штаммов, которые необходимо было протестировать на активность ΑΙ-2, центрифугировали (4,000 х д) и 10 мкл полученных супернатантов добавляли к 90 мкл разведенной V. Нагусуа ВВ170 в стерильном 96-луночном планшете и инкубировали при 30°С при встряхивании при 225 об/мин. Люминисценцию репортерного штамма измеряли на считывающем устройстве (ридере) для микротитровальных планшетов (ЕЬХ800, В1О-ТЕК йШгитспК 1пс., ΧνίηοοίΕί. УГ) каждые полчаса, пока увеличивалась люминисценция в контроле. В качестве контроля тестировали штамм Е. сой ΌΗ5α (мутантный штамм ΑΙ-2 (Битейе МО, МШет МВ, Ва881ег ВЬ. 1999. Циотит 8еп8шд ίη ЕксйейсЫа сой, Ба1топе11а ίуρй^ти^^ит, апй V^Ь^^ο йагуеуг а пе\у ГатНу оГ депе8 п^ог^Ые Гог аШотЙисет ρ^οάисйοη. Ргос Ν;·ιΐ1 Асай δα И8А 96(4): 1639-44), у которого нет активности СА1-1) и V. Нагуеут ВВ120 (у которого есть активность СА1-1 и ΑΙ-2).
Анализ активности СА1-1
V. сНо1ега ММ920 культивировали до высокой плотности в течение ночи и разводили 1:10 средой ЬВ с 5 мкг/мл тетрациклина. Ночные культуры штаммов, которые необходимо было протестировать на активность СА1-1, центрифугировали (4,000 х д ) и 30 мкл бесклеточного супернатанта добавляли к 70 мкл разведенного репортерного штамма V. сНо1ега ММ920 (разведенного в ЬВ) в стерильном 96луночном планшете и инкубировали при 30°С при встряхивании при 225 об/мин. Люминисценцию измеряли на ридере для микротитровальных планшетов (ЕЬХ800, В1О-ТЕК Пъйитепй, 1пс., V^ηοο8к^, ΥΓ) каждые полчаса до тех пор, пока снижалась люминисценция. В качестве контроля тестировали штаммы Е. сой ΌΗ5α (мутантный штамм ΑΙ-2 у которого нет активности СА1-1) и V. йатуеу1 ВВ120 ((у которого есть активность СА1-1 и А1-2).
ПЦР-РВ для экспрессии ТСРА
Бесклеточную среду (СЕМ) от №881е, №881е-вектора, №881е-сц8А и V. сНо1егае получали, как описано выше (Получение бесклеточной среды). V. СНо1егае С6706 8ΐτ2 (стрептомицин-устойчивый) культивировали в течение ночи на АК1 со стрептомицином при 30°С в присутствии СЕМ либо от №881е, №881евектора, №881е-сц8А, V. сНо1егае С6707 8ίτ2 или только в среде ЬВ (без СЕМ). Ночные культуры разводили в отношении 1:10,000 от ΟΌ600=1 в среде 5хАКЕО, содержащей соответствующую СЕМ, со стрептомицином и культивировали в течение 3-5 ч до тех пор, пока ΟΌ600 достигает 0,2-0,25. Культуры центрифугировали (4,000 х д ) и выделяли общую РНК с помощью РНКциеои8™ (АтЫоп, Нон81оп, ТХ) согласно инструкции изготовителя, которая включает обработку ДНКазой для удаления любой контаминирующей ДНК. Ген ΚρΛ представляет собой ген, который кодирует субъединицу А ТСР, и использовали уровень транскрипта ^А в качестве относительного показателя количества экспрессированного белка ТСРА. Для определения относительного количества мРНК ^А для каждого образца проводили ПЦР-РВ с 100 нг общей РНК и обратной транскриптазы δиρе^8С^^ρΐ™ III (Ыуйгодеп, Саткйай, СА) для синтеза первой цепи согласно инструкции производителя. Последующие реакции ПЦР проводили с использованием набора Ма81егпи.\™ (Рготеда, МаЙ18оп, VI) и следующих праймеров: ^А прямой: 5'ООТТТООТСАОССТТООТАА-3'9 [БЕЦ ΙΟ ΝΟ:1], обратный: 5'-ТОТОААТООАОСАОТТССТО-3' [БЕЦ ГО ΝΟ:2]; 168 РНК прямой: 5'-САОССАСАСТООААСТОАОА-3' [БЕЦ ГО ΝΟ:3], обратный: 5'ОТТАОССООТОСТТСТТСТО-3'[БЕЦ ГО ΝΟ:4].
Измерение липосомной СТВ
Липосомы, встраивающие ганглиозид ОМ1 в липидный бислой и инкапсулирующие сульфородамин В (БКВ) (липосомы), применяли для обнаружения и количественного определения субъединицы Б холерного токсина (СТВ, в качестве индикатора СТ) как в супернатантах культур, так и на поверхности эпителиальных клеток Сасо-2.
Измерения СРМ
СЕМ получали, как описано выше (Получение СЕМ). Определение СТВ в СЕМ проводили, как описано ранее (Ей\\агЙ8 КА, МагсН 1С. 2007. ОМ(1)-ГипсйопаП/ей Йρο8οте8 ш а тютоЫет ρΕιΚ а88ау Гог холерный токсин ш Х^по сНо1егае сийите 8атρ1е8. Апа1 Вюсйет 368(1):39-48). Кратко: СТВ определяли с помощью микротитровального сэндвич-анализа. Микротитровальные планшеты со связанным нейтравидином Кеасй-Ыпй® (Р1етсе В|о1есНпо1оду, Ыс., КоскГотй, ГО) промывали 3х200 мкл промывочного буфера (состоящего из 0.05% (ν/ν) Т\уееп-20, 0.01% сывороточного бычьего альбумина (ВБА)). Добавляли 100 мкл биотинилированного антитела против СТВ (10 мкг/мл в промывочном буфере, Ипйей Б1а1е8 Вю1од1са1, Б\γатρ8сοи. МА) и инкубировали в течение 2 ч при 23°С. Несвязавшиеся иммобилизованные антитела удаляли, лунки осушали и тщательно промывали 3\200 мкл промывочного буфера. Стандарты, состоящие из очищенного СТВ (ЕМО Вю8аепсе) в АКЕО, ЬВ, или супернатанта культур V. сНо1егае, которые выращивали в АКРО или ЬВ, разводили в отношении 1:1 промывочным буфером и инкубировали (100 мкл на образец на лунку) в планшетах, конъюгированных с анти-СТВ, при комнатной температуре в темноте без встряхивания в течение 2 ч. Планшеты дважды промывали 200 мкл промывочного буфера и один раз 200 мкл 1хΗеρе8 с сахарозой на физиологическом растворе (НББ: 10 мМ НЕРЕБ, 150 мМ натрия хлорида, 200 мМ сахарозы, рН 7.5) перед нанесением 100 мкл липосом, разведенных в НББ до концентрации 0.2 мМ фосфолипидов, и инкубацией при комнатной температуре в темноте без встряхивания в
- 17 023069 течение часа. Затем планшеты встряхивали в течение 10 мин при 18 Гц в флуоресцентном планшетном ридере (ЕЬХ800, ΒΙΟ-ΤΕΚ НМгитепК 1пс., ΧνίηοοδΚί, УТ). Несвязавшиеся липосомы удаляли из планшетов с помощью 3x200 мкл Ηδδ. Интактные связавшиеся липосомы лизировали 50 мкл 30 мМ п-октил-βΌ-глюкопиранозида (ОС) на лунку и измеряли флуоресценцию в каждой лунке (^озбуждения=540 нм, ^испускания=590 нм). Данные соотносили с 4-параметровой логистической моделью (формула 1):
Формула!: а-Ь где х представляет собой концентрацию СТВ (масса1), а представляет собой ответ при нулевой концентрации (КЕИ),
Ъ представляет собой ответ при максимальной концентрации (КЕИ), с представляет собой концентрацию, при которой получается 50% ответ (масса-1), и й представляет собой угловой коэффициент (бесконечно малая величина) (Όοθ5Ηκ·ι11< РС, Эипп 1К. 2005. Т1е Пус-рагатс1сг кд18Йс: а сНа^асΐе^^ζаί^οη апй сοтра^^8οп \νίΐ1ι 11с Нэиг-рататекг кд18Йс. Апа1 Βίοс1ет 343(1):54-65).
Измерения на клетках
СТВ, связавшийся с монослоем клеток Сасо-2, визуализировали и количественно определяли, как описано в других источниках (Ей\\агЙ5 апй Магс1, Апа1 ВюсНет. 2008 §ер 1;380(1):59-67.). Кратко: получали стандартные кривые посредством инкубации клеток Сасо-2 с различными разведениями СТВ в ЛКЕЭ с 10% ЕВ§ в течение 30 мин при 37°С с 5% СО2 без встряхивания. Затем клетки дважды промывали ледяной АКЕЭ с 10% ЕВ§ и однократно промывали ледяным Ηδδ с 10% ЕВ§ перед добавлением липосом и инкубацией (при 4°С без СО2) в течение часа. Лишние липосомы удаляли из клеток, промывая их трижды Ηδδ с 10% ЕВ§. Отмытые клетки исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа (Ьека, Ва8а1, 5>\\й/ег1апй) и фотографировали или лизировали 30 мМ ОС и определяли оптическую плотность на флуоресцентном ридере микротитровальных планшетов (ЕЬх800, Вю1ек НМгитепй). Для определения СТВ, связавшейся с монослоем Сасо-2 в совместных культурах, после инкубации бактерии дважды промывали от клеток Сасо-2 ледяной АКЕЭ с 10% ЕВ§ и ледяным Ηδδ с 10% ЕВ§ перед определением количества связанного СТВ с липосомами по сравнению со стандартной кривой чистой СТВ, как описано выше.
Микроскопия
Монослои клеток Сасо-2 визуализировали при увеличении 40 с помощью стандартного флуоресцентного светового микроскопа (Ьека, Ва8е1, 5>\\й/ег1апй). Изображения были получены с помощью монохромной камеры (Кейда 4000К, Цтадшд, 1пс., 8штеу, ВС, Сапайа).
Результаты и обсуждение Трансформация Е. соН Νΐδδΐβ 1917 геном сцхА №§81е трансформировали плазмидой, несущей кворумный ген ν. с1ю1егае сцхА (получая штамм Νίδхк-сцхА) для обеспечения высокого уровня экспрессии сигнала кворума ν. с1ю1егае, СА1-1. Для определения проявляет ли №881е активность СА1-1 и А1-2 проводили биологический анализ.
На фиг. 2 показана экспрессия автоиндуктора у генетически модифицированной симбиотической бактерии. Штамм №881е 1917 Е. той (№881е) трансформировали пустым вектором (№881е-вектором) или вектором, несущим ген сцхА (№881е-сд8А). Клетки проверяли на способность экспрессировать (А) А1-2 или (В) СА1-1. ΌΗ5α Е. тоН (ΌΗ5α), ν. с1ю1егае (УС) и У. Иагуеуз (ВВ120) использовали в качестве контроля. ΌΗ5α представляет собой мутанта по активности А1-2. Величина ошибки показывает одно стандартное отклонение для трех повторений эксперимента. Результаты показывают, что №881е обладает такой же активностью А1-2, как и У. с1ю1егае (Е1С. 2А), и при трансформации рИС19-сд8А проявлял активность СА1-1 того же порядка, что и У. с1ю1егае после стимуляции 1РТС (фиг. 2В).
Прерывание вирулентности V. сЬо1егае в монокультурах с СЕМ
Для определения способности трансформированного №881е подавлять вирулентность У. с1ю1егае, У. сМетае инкубировали с СЕМ от №881е, №881е-вектора, №881е-сд8А и исключительно средой ЬВ. Из культур выделяли общую РНК через 3-5 ч и определяли транскрипт гена 1срА с помощью ПЦР-РВ и 100 нг общей РНК на образец (фиг. 3А).
Фиг. 3 иллюстрирует нарушение вирулентности У. сйскте в питательной среде. Е. тоН №881е 1917 (№881е) трансформировали пустым вектором (№881е-вектором) или вектором, несущим ген сцхА (№881есцхА). У. с1ю1егае культивировали в бесклеточной среде (СЕМ) от каждого из штаммов или в СЕМ от У. сИскше (УС) или в стерильной среде (только среда). После инкубации с различными СЕМ, транскрипты 1срА У. с1ю1егае анализировали с помощью ПЦР-РВ (фиг. 3А). Транскрипты 1срА использовали в качестве показателя относительного количества экспрессированного белка ТСРА. Результаты нормировали по количеству транскриптов 168 рРИК. Экспрессию СТВ наблюдали после инкубации У. с1ю1егае с СЕМ от указанных штаммов (фиг. 3В). В качестве положительного контроля в экспериментах ТСРА и СТВ У. сМетае инкубировали в свежей среде без СЕМ. Величина ошибки показывает одно стандартное откло- 18 023069 нение для трех повторений эксперимента. Величину р определяли с помощью Т-критерия Стьюдента.
Гели сканировали и анализировали с использованием программного обеспечения 1таде I (Ыайоиа1 1п5Ши1е5 оГ Неайй ВеЙ1е8Йа, МО) для определения относительного количества присутствующих в них транскриптов. 168 ρΡΗΚ использовали для нормирования результатов. Наблюдали, что СРМ от №881есс|5Л оказывала то же действие на экспрессию ТСРА, что СРМ от V. сЬо1егае. Такие результаты ожидались, поскольку уже установлено, что экспрессия ТСРА зависит от восприятия кворума.
Для определения может ли СРМ от №881е-сс.]8Л подавлять экспрессию СТ V. сЬо1егае в культуре, анализировали экспрессию субъединицы В СТ (СТВ) с применением СМ1 ганглиозидфункционализированных липосом, как описано ранее (Ей^агй8 КА, МагсЬ БС. 2007. СМ(1)-ГипсОопаП/ей Нрокотек ίη а тБсгоШег р1а1е а88ау Гог сЬо1ега Ю.хт ίη V^Ь^^ο сЬо1егае сийиге 8атр1е8. Апа1 ВюсЬет 368(1):39-48). Результаты (Фигура ЗВ) показали, что уровень СТ можно существенно снизить в монокультурах V. сЬо1егае, которые культивируют в СРМ от №881е, №881е-вектора и №881е-сс.]8Л. Результат оказался неожиданным, принимая во внимание результаты анализа ТСРА, в котором снижение, совпадающее с СРМ V. сЬо1егае, наблюдали только в случае с СРМ от №881е-сд8Л. Это наблюдали на протяжении нескольких повторяющихся экспериментов (данные не показаны). Несмотря на то, что уровень СТ в среднем был ниже, что у №881е-сс|8Л, не ожидали, что уровень экспрессии СТ будет ниже в случае инкубации СРМ с №881е и №881е-вектором, чем в СРМ от V. сЬо1егае. Этот результат можно объяснить активностью Л1-2 в СРМ от №881е и остаточным уровнем СТ в СРМ от V. сЬо1егае.
Нарушение вирулентности V. сйо1егае в совместных культурах с клетками эпителия
Для определения, сможет ли №881е-сс|8Л предотвратить инфекцию эпителия V. сЬо1егае, разработали простую модель культуры, которая состояла из эпителиальных клеток Сасо-2, V. сЬо1егае и или штаммов №881е, или СРМ №881е. Поскольку V. сЬо1егае не продуцирует СТ в существенном количестве в ЭМЕМ (Ей^агй8 КЛ, МагсЬ БС. 2007. СМ(1)-Гипс1юпаП/ей Нрокотек ίη а тБсгоШег р1а1е аккау Гог сЬо1егае 1охш ίη V^Ь^^ο сЬо1егае сийиге 8атр1е8. Лпа1 ВюсЬет 368(1):39-48), определили, что клетки Сасо-2 могут продолжать расти, по меньшей мере, в течение недели в ЛКРО с 10% РВ8 (данные не показаны). Поэтому все эксперименты по совместному культивированию проводили в ЛКРО с 10% РВ8.
Результаты экспериментов по культивированию клеток Сасо-2 в СРМ от №881е-вектора или №881есс|5Л и затем совместным культивированием с V. сЬо1егае обобщены на фиг. 4.
Фиг. 4 демонстрирует прекращение вирулентности V. сЬо1егае в совместных культурах. Клетки Νΐδ81е 1917 Е. сой (№кк1е) трансформировали либо пустым вектором (№881е-вектор) либо вектором, несущим ген сс|8Л (№881е-сд8Л). Эпителиальные клетки Сасо-2 инкубировали либо с СРМ из различных штаммов №881е (фиг. 4А) или непосредственно со штаммами №881е (фиг. 4Β-4Ό) и с V. сЬо1егае перед анализом на СТВ либо в супернатанте (фиг. 4А) или (фиг. 4В), либо прикрепленного к клеткам Сасо-2 (фиг. 4С) и (фиг. 4Ό). Количество СТВ определяли из контролен известного количества СТВ, нанесенного на клетки Сасо-2. Величина ошибки показывает одно стандартное отклонение для трех повторений эксперимента. Величину ρ определяли на основе Т-критерия Стьюдента. Панельные фотографии на фиг. 4Ό сделаны на обычном флуоресцентном микроскопе. Флуоресценция показывает СТВ, связавшийся с клетками Сасо-2.
После инкубации V. сЬо1егае с клетками Сасо-2 в течение 3 ч определяли количество СТ в питательной среде (фиг. 4А). Количество СТ в супернатанте культуры определенно уменьшалось в присутствии №881е-сс|8Л по сравнению с контролем. Затем проверяли, приводит ли совместное культивирование штаммов №881е с клетками Сасо-2 к такому же результату. Штаммы №881е-вектор и №881е-сс|8Л культивировали с клетками Сасо-2 в течение 3 ч перед культивированием с V. сЬо1егае в течение 3 ч. Снова измеряли СТ в питательной среде (фиг. 4В) и СТ, прикрепленный к клеткам Сасо-2 (фиг. 4С). Клетки Сасо2 исследовали с помощью флуоресцентного микроскопа для визуализации связывания СТ (фиг. 4Ό). По результатам этих экспериментов сделал вывод, что уровень экспрессии СТ и связывание с клетками Сасо-2 значительно различалось между клетками, обработанными №881е-сс|8Л и обработанными №881евектором, несущим пустой вектор. Присутствие №881е-сс|8Л снижало экспрессию СТ в штамме V. сЬо1егае и приводило к меньшему связыванию СТ с клетками Сасо-2.
Выводы
На основе представленных выше результатов ίη уйго можно ожидать, что профилактическое применение №881е-сс|8Л может ограничить колонизацию ЖКТ человека V. сЬо1егае. Принимая во внимание использованное количество бактерий (соотношение симбиотических бактерий и V. сЬо1егае приблизительно 1:1), затраченное время (3 ч для заселения симбиотическими бактериями эпителиального слоя), результаты указывают на то, что если принимать симбиотические бактерии, описанные в данном примере, в качестве профилактики, количество симбиотических бактерий, заселивших ЖКТ (~10ПКОЕ г-1 содержимого кишечника, (8с1шЙ/ М., \Уа1/1 8., Ое18сй1аедег ТА., РаБЬ НС., Сой1 С., йеНм Ν., 8сЬо1тегБсЬ ί., Ьшйе Ηί. 2005. Сгеем Пиоге8сеШ ргсйет Гог йе1есОог1 оГ Не ргоЫойс тБсгоогдаш8т Е8сЬегБсЫа сой 81гаш №881е 1917 (ΞοΝ) ίη уБуо. ί МБсгойю1 Ме1ЬоЙ8 61(3):389-98), существенно превысит количество V. сЬо1егае в контаминированном образце воды (~104-108 КОЕ мл-1, (Ва8е18ЙБ У8., Мейта РЛ., Ρа^ке^ СО. 1978. 8игуБуа1 апй тиШр^а!^ оГ V^Ь^^ο сЬо1егае ίη 1Ье иррег Ьо\\е1 оГ БиГаШ тБсе. 1иГес1 Iттиη 22(2):435-40).
- 19 023069
Поэтому ожидается, что вирулентность V. с1ю1егае ослабится до такой же степени, что и в случае чистых ночных культур (фиг. 3). Такое подавление похоже на то, которое можно ожидать, когда V. с1ю1егае достигает высокой плотности в хозяине и прекращает проявлять вирулентность.
Этот пример показывает, что можно сконструировать штамм симбиотической бактерии (Е. сой №зз1е 1917), который будет служить профилактическим средством для холеры. Полученные методами генетической инженерии симбиотические бактерии имеют огромный потенциал для применения в качестве средств доставки лекарственного препаратов, особенно в развивающихся странах, где барьеры для получения лекарственных препаратов потенциально выше, чем барьеры при получении помощи в виде продуктов питания. Этот пример показывает, что методами генетической инженерии можно получить коммерчески доступные штаммы симбиотических бактерий человека для имитации сигналлинга инвазивного патогена таким образом, чтобы нарушать вирулентность. Это является ключевым отличием от других работ в относительно новой области создания методами генетической инженерии симбиотических бактерий. С помощью приведенного выше способа методами генетической инженерии можно получить штаммы симбионтов, которые служат важными сигнальными переключателями, экспрессирующими патоген-специфичный бактериальный кворумный сигнал таким образом, чтобы предотвратить экспрессию факторов вирулентности внутри организма хозяина.
С помощью этого подхода методами генетической инженерии можно получить симбиотические штаммы для коммуникации с другими инвазивными видами или даже с видами, которые уже заселяют ЖКТ. Аспекты метаболизма могут быть изменены в ответ на специфические изменения биохимии ЖКТ.
Хотя применение рекомбинантных организмов в этом отношении (то есть, в человеке) может вызвать вопросы, симбиотические штаммы (которые обычно признаются безопасными Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (ΡΌΆ)) можно безопасно применять для экспрессии экзогенных генов. Мало того, что вероятность горизонтального переноса генов ниже для симбиотических штаммов по сравнению с аденовирусами так, как аденовирусы облегчают ядерную инкапсуляцию гетерологичных генов, но в случае симбиотических бактерий можно также применять антибиотики для полного их удаления из ЖКТ. Поэтому эта технология считается безопасной или более безопасной, чем способы, уже одобренные для применения на людях.
Пример 2. Секреция инсулинотропных белков симбиотическими бактериями: переключение кишечника для лечения диабета
Краткое описание
Пример 1 (выше) показал, что методами генетической инженерии можно получить штамм Е. сой №зз1е 1917 (продаваемый без рецепта пробиотический штамм №зз1е), который экспрессирует сигнал восприятия кворума МШИо сйо1егае, создавая потенциальное профилактическое средство против холеры (Эиап, Р., апй 1. С. Магсй. 2008. йИеггирРпд V^Ь^^о сйо1егае шГесйоп оГ йитап ерййейа1 се11з \\ЙН егщпеегей соттепза1 Ъаскейа1 кщпайпд. Вю1ес1то1 Вюегщ 101(1):128-134, ΌΘΙ: 10.1002/ЙЙ.21897).
Настоящий пример показывает, что симбиотические бактерии могут стимулировать секрецию инсулина клетками кишечного эпителия в ответ на глюкозу. Методами генетической инженерии получили симбиотический штамм №зз1е 1917 Е. сой, который секретирует инсулинотропные белки СЬР-1 и РОХ-1. Эпителиальные клетки, стимулированные полученными методами инженерии штаммами, секретировали до 1 нг мл-1 инсулина без значительной фоновой секреции.
Введение
Недавно было показано, что два белка: глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР-1) и панкреатический или дуоденальный гомеобоксный ген 1 (РОХ-1), стимулируют синтез инсулина клетками кишечного эпителия в ответ на глюкозу (διιζιιΐά Α., Η. №-1каис1н апй Н. ТапщисЫ. 2003. СЬР-1 (1-37) сопуеРз шкезйпа1 ерййейа1 се11з шко шзи1ш-ргойист§ се11з. Ргос Νη11 Асай 8с1 υδΑ 100:5034-9) и независимо от уровня глюкозы (Уоз1ййа δ., Υ. Картою, Т. Уакийа, Η. \Уа1айа, Υ. Риркат, Η. Козака, Т. Сокощ Т. М1уакзика, Υ. Итауайата, Υ. Уатазакк апй М. Иогк 2002. РОХ-1 шйисез ййГсгепРаРоп оГ ^икезк^иа1 ерййейоШ 1ЕС-6 шко тзи1т-ргойист§ се11з. О1аЪекез 51:2505-2513), соответственно. СЬР-1 секретируется клетками кишечного эпителия дистального отдела тонкой кишки в ответ на глюкозу и другие питательные вещества (Ваддю, Ь. Ь., апй О. 1. Отискет. 2007. Вю1о§у оГ шсгекшз: СЬР-1 апй С1Р. СазктоепкегоШду 132:2131-57). Он имеет очень короткий период полураспада, и его разрушение дипептидилпептидазой IV (ОРР-ГУ) происходит в кровеносных сосудах, дренирующих слизистую кишечника (Иапзеп Ь., С. Р. Оеасоп С. Огзкоу апй 1. 1. Ио151. 1999. С1исадоп-йке рерййе-1-(7-36)атМе 18 кгапзГогтей ко д1исадоп-йке рерййе-1-(9-36)ат1йе Ъу Фрерййу1 рерййазе IV ш кйе сарШапез зирр1ушд кйе Ь се11з оГ кйе рогсше шкезкше. Епйосгто1о§у 140:535663). СЬР-1 активирует синтез инсулина в р-клетках поджелудочной железы, связываясь с мембранным рецептором, СЕР-1К, в связи с этим предложили применять СЬР-1 в качестве лекарственного средства для лечения диабета 1 типа (διιζιι1<ί, Α., Η. №-1каис1и апй Η. Ташдисйк 2003. СЬР-1 (1-37) сопуеткз нИезРпа1 ерййейа1 се11з шко тзийп-ргойистд се11з. Ргос №И1 Асай δα υδΑ 100:5034-9) и 2 типа (Ваддю, Ь. Ь., апй О. 1. Отискет. 2007. Вю1о§у оГ шстейпз: СЬР-1 апй СГР. Сазктоепкего1о§у 132:2131-57).
δι.ιζτιΚί с коллегами показали, что клетки кишечного эпителия у новорожденных и взрослых крыс, которым интраперитонеально вводили СЬР-1, превращаются в инсулин-секретирующие клетки, отвечающие на глюкозу (Бигий Α., Η. №-1каис1и апй Η. ТатдисЫ. 2003. СЬР-1 (1-37) сопуеткз шкезйпа1 ер1кйе- 20 023069
На1 се11х ίηΐο 1П8и1ш-ргобисш§ се11х. Ргос Ναΐ1 Асаб 8с1 и 8 А 100:5034-9). Дополнительно они обнаружили, что хирургическая имплантация мышам эпителиальных клеток, стимулированных ίη νίίτο СЬР-1, приводила к обращению сахарного диабета у мышей, получивших имплантаты.
Показано, что активатор транскрипции РОХ-1 стимулирует секрецию инсулина как β-клетками, так и клетками кишечного эпителия (Κοίζιιιηί М., К. Όοί, К. РиртоЮ, Ό. Ιίο, Е. Тоуоба, Т. Мой, К. Кат1, Υ. КатеадисЫ, С. К. СШех, апб М. 1татига. 2005. Рапсгеайс ерйНеПа1 се11х сап Ье сошейеб ίηΐο иъиПпргобисшд се11х Ьу СЬР-1 ίη сощипсйоп \νί11ι νίπ^-η^ία^ депе йапйег οί рбх-1. 8игдегу 138:125-133; Κοίζηοιί, М., К. №да1, А. К1ба, К. Кат1, Ό. Ιίο, К. РиртоЮ, Υ. КатеадисЫ, аиб К. Όοί. 2006. Рогсеб ехрюкк^ οί РОХ-1 тбисех ίη5ΐι1ίη рго6исйоп ίη 1^086^1 ерШсеПа. 8игдегу 140:273-280). 1<οίζιιιηί с коллегами показал, что если клетки эпителия поджелудочной железы трансфецировать с помощью вирусов геном рбх-1 и при этом стимулировать экзогенным СЬР-1, они становятся инсулин-секретирующими клетками (Ко1ζιπηί, М., К. Όοί, К. РиртоЮ, Ό. Ιίο, Е. Тοуοба, Т. Мой, К. Кат1, Υ. КатеадисЫ, С. К. СШех амб М. 1татига. 2005. Раг1сгеаРс ерйНе11а1 се118 саη Ье сошейеб ίηΐο ^η8и1^η-р^οбис^ηд се11х Ьу СЬР-1 ίη соищпсйоп тейН ν^^и8-теб^аίеб дегсе ί^аη8ίе^ οί рбх-1. 8игдегу 138:125-133). Та же группа показала, что клетки кишечного эпителия (петли подвздошной кишки мыши) экспрессируют инсулин, если их трансфицировать геном рбх-1, хотя в этой работе не были представлены данные относительно добавления СЬР-1 к этим клеткам (Κο^ζит^, М., К. №-1дак А. К1ба, К. Кат1, О. Ιίο, К. РиртоЮ, Υ. КатеадисЫ, агсб К. Όοί. 2006. Рогсеб еxр^е88^οη οί РОХ-1 тбисех шхиНп рто6ис(1оп ίη тех^а! ерйНеОа. 8игдегу 140:273-280).
Вспомогательные бактерии кишечника широко доступны в качестве пробиотиков и обычно считаются безопасными (СКА8) Управлением по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (АНтеб, Р. Е. 2003. Се^НсиНу тобШеб ртоЬюйсх ίη Гообх. Тгеибх ίη В^οίесНηο1οду 21:491-497). Возможные преимущества применения симбиотических штаммов для экспрессии рекомбинантных генов ίη νίνο включают их совместимость с хозяином (в частности с иммунной системой хозяина), их контролируемую персистенцию в кишечники и возможность их орального введения. Сообщали об экспрессии симбиотическими бактериями различных рекомбинантных цитокинов и антигенов на мышиной модели (ОаЫе1, С, А. Кера, С. Убб, А. Ρο11ак, В. Ροί, Н. В^е^ίеηебе^, и. Мебегтагт аиб А. Мегсешег. 2006. МобиΗιΙίοη οί а11егдк ппиите гохропхох Ьу тисο8а! арр^аНот οί гесотЬтаШ 1ас11с ааб Ьас1епа ргобистд (Не та^г ЬЫсН рο11еη а11егдег1 Ве1 ν 1. А11егду 61:812-819; Раггаг, М. Ό., Т. К. УННеНеаб, ί. Ьа^ Р. Обдет, К. ТНогре, К. Т. НоНаМ, аг!б 8. К. Сагбтд. 2005. Еηд^ηее^^ηд οί (Не ди( сοттеη8а1 Ьас1егтт ВасЮгспбех ονα1и5 ίο ргобисе агсб хесгеЮ Ью1одЮа11у асРхе тигте т1ег1еикт-2 ίη гохропхо ίο хукт. ЮиРНК1 οί АррНеб МЮгоЬЮЮду 98:1191-1197; Найтат, М., А. Уех^кой, ί. Виег, агсб Р. Сиюег. 2004. Е-соП №881е 1917 а8 а νеЫс1е ίοτ тЮхишЬ еxр^е88^οη οί ЮегареЫкс тο1еси1е8: СопхйисРоп οί аη Е-соП а НетоЦхш Ьахеб ехргех8ΐοη νесίο^. IηίеΡНΚί^οηа! ЮиРНК1 οί Мебка1 МЮгоЬЮЮду 294:198-198; НагеЬгоиск, 8., Ь. ΡοίНе1иηе, У. Αζеνебο, С. СоРЫег, ί.-М.УаР Р. Ьа^еЮ 2007. ЕГйтеЫ рго6исйоп аг!б хесгеРог! οί Ьохте р-1асЮд1оЬи1ш Ьу ЬасЮЬасШих сахек М1сгоЬ Се11 Раск 2007; 6: 12. бок 10.1186/1475-2859-6-12).
Материалы и методы Создание плазмид
Всё клонирование проводили способами, описанными ранее (8атЬгоок ί. & Ки88е11 О.У. Мо1еси1аг с1оп1п§: а 1аЬогаЮгу таша! Е6п. 3гб., Со1б 8ргтд НагЬог ЕаЬогаЮгу Рге88, Со1б 8ргтд НагЬог, Ν.Υ.; 2001). Фигура 5 иллюстрирует схематическую плазмиду, использованную в данном исследовании. Для анализа промоторов Р0/Р1 из Е. соН ОН5а создали две плазмиды (рРО1 и рРО2). рРО1 кодировала целый участок Р0/Р1 для запуска экспрессии зеленого флуоресцентного белка с усиленной флуоресценцией (ЕСРР). рРО2 кодировала только участок Р0 промотора апстрим ЕСРР. Для исследования эффективности секреции инсулинотропного белка рекомбинатными бактериями для стимуляции секреции инсулина клетками Сасо-2 сконструировали плазмиды рРО-РОХ, рРО-СЬР и рРО-20, как описано в настоящем изобретении.
Фиг. 6 иллюстрирует ответ на глюкозу Р0 и Р0/Р1. Использовали экспрессию ЕСРР для определения ответа промотора Р0 и/или Р1 на различные условия среды. Р0=Р0 только; Р0+Р1=Р0 и фланкирующий участок Р1; ОН5а=контроль 1ас оперона.
Для исследования эффективности продуцирования рекомбинантных белков в ответ на глюкозу промоторной системой, отвечающей на глюкозу, два отрезка промоторного участка, отвечающего на глюкозу, Е. соН ОН5а клонировали методом ТА клонирования в рС1оте- СРР апстрим и в рамке считывания с СРР (результаты представлены на фиг. 6). Две конструкции состояли из промоторам Р0 или участка, перекрывавшего промоторы Р0 и Р1 (Куи, 8. & Сагдех, 8. Ргото1ег 8теПсН ίη 1Не ЕхсНейсЫа-СоН Р(8 Орегст. ЮиРНК1 οί Вю1од1са1 СНепихйу 269, 4767-4772 (1994)) в рамке считывания и апстрим старта СРР. Кратко, участок Р0 клонировали из геномной ДНК Е. соН ОН5а в рСЬОУ-СРР ДшИтодей СатЫЬаб, СА) для получения (рРО2). Участок Р0/Р1 клонировали в рСЬОУ-СРР для получения рРО1.
Для экспрессии гена РОХ-1 млекопитающего в Мххк сконструировали плазмиду рРО-РОХ, как описано ниже. Получили кассету 6ΧН^8-Χр^е88-ЕΚ-Ρ^Χ-1-СΡΡ с помощью двух циклов ПЦР с высокой точностью (8ϋ0^οηο, Ьа боПа, СА). Полноразмерный РЫС получили от ОН5а ПЦР с высокой точностью. Эти два фрагмента клонировали в рВЫехспрРК^ для получения 6ΧН^8-Χр^е88-ЕΚ-Ρ^Χ-7-СΡΡРЫС. Фрагмент ТНе 6ΧН^8-Χр^е88-ЕΚ-Ρ^Χ-1-СΡΡ-Р^IС затем клонировали в рСЬОУ-РО-СРР для полу- 21 023069 чения вектора (ρΡΌ-ΡΌΧ), который использует Р0 промотор Е. сой для запуска экспрессии 6ХН18-Хрге88ΕΚ-ΡΙλ\-1-('ΡΡΤΤΙ('.
Для конститутивной экспрессии белка ΟΕΡ-1 в №§81е сконструировали плазмиду ρΡΌ-ΟΌΡ, как указано ниже. Синтетическим путем (ГОТ. СогаМ11е, ΙΑ) получили последовательность 6ХН18-Хрге88-ЕКΟΌΡ-1(1-37). Этот фрагмент вставляли с помощью ПЦР с высокой точностью в рВ1ие8Спр1-К8 для получения ρΒ1ιΚ8αίρΙ-ΟΕΡ. Для клонирования последовательности 5'иТК-РЬ1С20 из ρΚδ104 в рВ1ие8СГ1р1ΟΕΡ для получения ρΒ1ιΚ8αρΙ-20-ΟΕΡ использовали ПЦР с высокой точностью. Полученный вектор содержал последовательность: 5'υΤΚ-ΡΕ^20-6ΧΗί8-ΧρΐΌ88-ΕΚ-ΟΕΡ-1(1-37). Эту последовательность клонировали в ρΚδ121 (содержащей 3'иТК РЬ1С) для получения конструкции: 5'υΤΚ-ΡΕ^20-6ΧΗί8-ΧρΐΌ88ΕΚ-ΟΕΡ-1(1-37)-3'υΤΚ с помощью ПЦР с высокой точностью.
Для получения ρΡΌ-20 использовали ПЦР с высокой точностью для клонирования последовательности 5'υΤΒ-ΡΕΙί.’20-6ΧΗί8-ΧρΐΌ88-ΕΙ< из ρΡΌ-ΟΕΡ. ПЦР-фрагмент клонировали в ρΚδ121 для получения конструкции: 5'υΤΒ-ΡΕΚ'.’20-6ΧΗί8-ΧρΐΌ88-ΕΙ<. Получили ρΚδ104 и ρΚδ121 из Университета Хельсинки, Финляндия, лаборатория Веийа Ае81ег1ипб-А|к81гот).
Штаммы бактерий
Е. сой №881е 1917 получали из коммерческого препарата пробиотиков МШаЯог™, как описано ранее (Эиап. Ρ., апб ί. С. Магсй. 2008. ΙηίΌΠΗρίίη^ УФпо сйо1егае 1и£есйоп оГ Ьитап еρЬЬеЬа1 се118 \\ЬЬ епщпеегеб соттеп8а1 Ьас1епа1 8щпа1тд. Вю1есЬпо1 Вюепд. 101(1):128-134, ΌΟΙ: 10.1002/ЬЬ.21897). №881е 1917 и все другие штаммы Е. сой культивировали в среде ЬВ при 37°С при встряхивании при 225 об/мин. В экспериментах по совместному культивированию №881е 1917 культивировали в Ρ-12Κ (Се11дго, Мапа88а8, УА), дополненной 0,4% глицеролом или 0,4% глюкозой при 37°С при встряхивании при 225 об/мин или без встряхивания.
Условия культивирования клеток
Клетки эпителия Сасо-2 (АТСС# СКЬ-2102, Мапа88а8, УА) культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (ИМЕМ, Се11дго, Нетбоп,УА), с 10% ΡΒδ (эмбриональная бычья сыворотка) (Се11дго) при 37°С в инкубаторе при 5% СО2. Клетки Сасо-2 также культивировали в Ρ-12Κ с 10% ΡΒδ при 37°С в инкубаторе при 5% СО2. Все эксперименты по совместному культивированию проводили в Ρ12Κ с 10% ΡΒδ с клетками Сасо-2 15-22 пассажа.
Условия культивирования СЕМ
Получали СΡМ от №881е, несущей ρΡΌ-20 (№881е-вектор), ρΡΌ-ΡΌΧ (Νΐ88Φ-ΡΌΧ-1) и ρΡΌ-ΟΕΡ (Νΐ88Φ-ΟΕΡ-1), как описано ниже (Получение СЕМ). Для совместного культивирования монослои клеток Сасо-2 приблизительно 80% конфлюэтности в 12-луночных планшетах промывали свежей Ρ-12Κ с 10% ΡΒδ и покрывали 1 мл 50% СЕМ в Ρ-12Κ с 10% ΡΒδ и инкубировали при 37°С при 5% СО2. Добавляли 200 нМ ΟΌΡ-1 (1-37) (НасЬет Κίπ§ оГ Ρ^и88^а, ΡΑ) в лунки положительного контроля. Через 16 ч инкубации клеткам добавляли еще 1 мл 50% СΡМ в Ρ-12Κ с 10% ΡΒδ или 1 мл Ρ-12Κ с 10% ΡΒδ и 200 нМ ΟΌΡ-1(1-37), дополненной 0,4% глюкозой или 0,4% глицеролом перед инкубацией в течение еще 2 ч. Отбирали среду с клеток, добавляли в нее лейпептин (10 нг/мл), 0,2 мМ ΡМδΡ и апротинин (10 нг/мл), центрифугировали (12,000 х об/мин ) (ЕГГепбогГ 5804К, Ае81Ъигу, ΝΥ) и непродолжительное время выдерживали при 4°С перед анализом экспрессии инсулина с помощью ИФА (см. раздел Иммуноблоттинг и ИФА. Непосредственно после удаления среды проводили ПЦР-РВ для определения экспрессии инсулина, как указано ниже (см. раздел ПЦР-РВ для определения экспрессии инсулина).
Получение СЕМ №881е-вектор и Νί88Κ-ΟΕΡ-1 культивировали в Ρ-12Κ с 0,4% глицерола и Νί88Κ-ΡΌΧ-1 культивировали в Ρ-12Κ с 0,4% глюкозы при 37°С при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 ч. Через 24 ч все бактерии разводили Ρ-12Κ до ΘΌ600 = 1, центрифугировали и утилизировали. Супернатант пропускали через фильтр (0,2 мкм, ΡΑΡΤ ЫГе δс^еηсе8,Со^И№а11,υΚ). В бесклеточную среду (СЕМ) добавляли 10 нг/мл лейпептина 200 мкМ ΡМδΡ и 5 нг/мл апротинина для подавления протеаз перед хранением при 4°С.
ПЦР-РВ
Из клеток Сасо2 выделяли общую ДНК в конце каждого эксперимента с использованием КЫАдиеои8™ (АтЪюи, Нои8Юи, ΤΧ) согласно инструкциям производителя, которые включали обработку ДНКазой для удаления любой контаминирующей ДНК. Для определения относительного количества мРНК инсулина, проводили ПЦР-РВ для каждого образца с 500 нг общей РНК и обратной транскриптазой δυρе^8С^^ρΐ™ Ш Дпуйгодеп, СагНЪаб, СА) для синтеза первой цепочки согласно инструкциям производителя. Последующие реакции ПЦР проводили с использованием Цшск Ьоаб Тад 2Χ Ма81ег М1х (ΝΕΒ) и со следующими праймерами: для инсулина человека прямой: 5'-АОСАСАТСАСТОТССТТСТОССАТ-3' [δΕΡ ΙΌ ΝΟ: 5], обратный: 5'-ТТС.ТТССАСААТС.ССАСС.СТТСТО-3'^1Т) ΙΌ ΝΟ: 6]; для β-актина человека прямой: 5'-АТСТООСАССАСАССТТСТАСААТОАОСТОСО-3'ЦРО ΙΌ ΝΟ: 7], обратный: 5'СОТСАТАСТССТОСТТОСТОАТССАСАТСТО-3'ΙδΕΟ ΙΌ ΝΟ: 8].
- 22 023069
Осаждение секретируемых белков и приготовление лизатов клеток №881е-вектор и №881е-ОЬР-7 культивировали в Р-12К с 0,4% глицеролом, №881е-РЭХ-1 культивировали в Р-12К с 0,4% глюкозой или 0,4% глицеролом при 37°С при встряхивании при 225 об/мин в течение 24 ч. Через 24 ч бактерии центрифугировали. Супернатант пропускали через фильтр (0,2 мкм, РЛЬЬ ЫГе 8с1епсе8). Бесклеточную среду (СРМ) разводили Р-12К до такой же оптической плотности ΘΌ600 и добавляли 10 нг/мл лейпептина, РМБР и 5 нг/мл апротинина для подавления протеаз. Очищенный супернатант (14 мл) осаждали 10% трихлоруксусной кислотой (ТСА, УШК) в течение 30 мин на льду и дважды промывали осадок ледяной смесью этанол/эфира (1:1). Супернатант осадка высушивали под вакуумом, растворяли в 50 мкл буфера для образца (2% δΌδ, 50мМ Тпк. рН 6,8, 20% глицерол, 10% меркаптоэтанол, бромфеноловый синий) и кипятили в течение 5 мин при 95°С. Осадок с клетками ресуспендировали (из 14 мл культуры) при комнатной температуре в ВидВи81ег Ма81ег Μίχ при мягком вортексировании с использованием 500 мкл ВидВи81ег Ма81ег М1х с ингибиторами протеаз (10 нг/мл лейпептина, 200мкМ РМ8Р и 5 нг/мл апротинина). Суспензию клеток инкубировали на вращающейся платформе (УШК, Вг181о1, СТ) в медленном перемешивании в течение 10-20 мин при комнатной температуре. В каждый образец добавляли 125 мкл 5Х буфера образца перед кипячением в течение 10 мин при 95°С.
Иммуноблоттинг и ИФА
Для определения экспрессии и секреции СЬР-1 и РОХ-1 использовали стандартный метод вестернблоттинга (8атЬгоок 1. & Ки88е11 Э.Ш. Мо1еси1аг с1отпд: а 1аЬогаЮгу тапиа1, Ебп. 3гб. Со1б δριϊη§ НагЬог ЬаЪогаЮгу Рге88, Со1б δρήη§ НагЬог, Ν.Υ.; 2001). Кратко: на полиакриламидный гель наносили по 50мкл образцов и переносили их на гибридизационную мембрану 1ттоЫ1оп-РБ0. МетЬгапе8 \уеге ргоЬеб \\ЪЪ 1:1,000 Гог тои8е апб-Ы8 (СЕ ЪеаЬЬ, Р18са1а\уау, N1). Мембраны инкубировали с НКР-конъюгированными анти-мышиными 1дС (Атег8Ъат Вю8с1епсе8, РЬ18Ьиг§Ь, РА), проявляли посредством повышенной хемилюнимисценции (Р1егсе, КоскГогб, 1Ь) и переносили на рентгеновскую пленку (РЪоетх, Сапб1ег, ΝΟ). Пленки сканировали и анализировали плотность пикселей блот на изображениях с помощью программного обеспечения 1таде 1 8оП\уаге (ΝΤΈΙ).
Для определения количества секретированного инсулина клетками Сасо-2 анализировали бесклеточные супернатанты (полученные, как описано в Условия культур СРМ) с помощью стандартных методов ИФА (БатЬгоок 1. & Ки88е11 Э.Ш. Мо1еси1аг с1отпд: а 1аЬогаЮгу тапиа1, Ебп. 3гб., Со1б δριϊπβ НагЬог ЬаЬогаЮгу Рге88, Со1б δριϊπβ НагЬог, Ν.Υ.; 2001) с захватывающими антителами (Е86802М 5мкг/мл ) и биотинилированными распознающими антителами (Е86306В 1 мкг/мл ) В1обе81дп ^асо, МЕ) в планшетах Шпс 1ттоЫПхег Атто™ (КосЪе81ег, ΝΥ). Для определения после обработки биотинилированными определяющими антителами обрабатывали образцы пероксидазой хрена, конъюгированной со стрептавидином (1:5,000). Субстрат представлял собой реагент Атр1ех ИНга-Кеб™ (1пуЬгодеп, Саг18Ьаб, СА), который использовали согласно инструкции изготовителя. Флуоресценцию измеряли с помощью планшетного ридера РЬХ-800 Вю1ек, ВигЬпдЮп, УТ) при λ=540 нм (возбуждение) и λ=590 нм (испускание). Стандарты человеческого инсулина (δί^πη, δΐ. Ьош8, МО) от 0 до 2 нг мл-1 готовили в пяти репликатах для каждого планшета для обеспечения точности. Для обеспечения аналитической точности каждый образец определяли в пяти отдельных лунках.
Вычисления для масштабирования инсулинового ответа целого организма
Для экстраполяции ответа модели культуры клеток на то, что возможно в теле, предположили, что будет стимулироваться секреция инсулина только в тонкой кишке. Работа Као и сотрудников продемонстрировала, что выживаемость №881е в кишечнике мышей составляла 10 КОЕ/г ткани через 3 дня (Као δ. е1 а1. 2005. То\\агб а буе ткгоЫа1 писгоЫабе Гог Н1У: Соттеп8а1 Ьас1епа 8есгебпд ап Н1У Ги8юп шЫЬЬог рерббе. Ргосеебшд8 оГ 1Ье №Фопа1 Асабету оГ Бс1спсс8 оГ 1Ъе ИпЬеб δΐ8ΐ£8 оГ Атепса 102, 11993-11998). Несмотря на это, Шс81епбогГ и сотрудники обнаружили, что в фекалиях мышей концентрация рекомбинантных №881е на три порядка больше, чем в работе Као, что указывает на то, что вероятно есть вариация в выживаемости в зависимости от секретируемых белков (Шс81епбогГ А.М. е1 а1. 2005. 1п1с8Ипа1 1ттипЬу оГ Е8сЪег1сЫа соЬ ΝΙδδΕ-Е 1917: а 8аГе сатег Гог 1ЪегареиЬс то1еси1е8. Рет8 1ттипо1оду апб МебЕ са1 М1сгоЫо1оду 43, 373-384). Шс81епбогГ не приводил величины выживаемости №881е в тонком кишечнике. Предполагая, что выживаемость в системе органов человека (откуда выделяли №881е) или откудалибо составляет от 10 до 10 КОЕ мл (10 КОЕ мл -1 соответствует ΘΌ600 = 1 в наших экспериментах), количество инсулина, которые можно поступать в кровоток, если наши бактерии колонизировали тонкий кишечник, представлено ниже. Количество секретированного инсулина в этих экспериментах (~1 нг/мл х 1 мл/лунка х 1 лунка/491 мм2 составляет 0.002 нг/мм2) умножали на площадь поверхности слизистой тонкого кишечника (~2 м2, Шб8оп ТР. 1967 БигЕнсс Агеа оГ δта11 1п1е8Ипе ш Мап. Си! 8, 618) для получения величины разброса концентрации инсулина в крови (объем которой составляет 4.7 л) 164 фмоль л-1 164 пмоль л-1 при выживаемость №881е от 10 до 10 КОЕ мл-1 соответственно. Концентрации инсулина в сыворотке после приема пищи могут достигать 400 пмоль л-1 у взрослых, не страдающих диабетом (Ва8и, К. е! а1. 2006. ЕГГесЕ оГ аде апб 8ех оп ро81ргапб1а1 д1исо8е те1аЬоЬ8ш: б1ГГегепсе8 ш д1исо8е (нгпоуег, 1п8и1т 8есгеПоп, Ш8и1ш асбоп, апб Ъерабс 1п8иЬп ех1гасбоп. И1аЬе1е8 55, 2001-2014).
- 23 023069
Результаты и обсуждения
Методами генетической инженерии получили №кк1е, секретирующую СЬР-1 (аминокислоты от 1 до 37), или полноценный РОХ-1, с помощью метки секреции ШС (Ма)апйег, К., Ь. Лп1оп, 1. АпОкатеп, Н. Ьапд, М. Вгиттег, Т. К. Когйопеп, апй В. \Уек(ег1ипй-\У1кк1гот. 2005. Ех1тасе11и1ат кестейоп ой ро1урерййек икшд а тойШей ЕксйепсЫа сой йадейат кестейоп арратаШк. №Риге Вю!есйпо1оду 23:475-481).
РОХ-1 секретировался в виде рекомбинантных конструкций с пенетрирующим в клетки пептид ом (СРР) (Шапд 1. Р. апй V. С. Уапд. 2005. 1и8ийп-се11 репейайпд рерййе йуЬййк \\Ый ипргоуей ш!екйпа1 аЬкогрОоп ейййепсу. Вюсйепчса1 апй Вюрйукюа1 Кекеатсй СотпштсаОопк 335:734-738) для ускорения быстрого проникновения в эпителий после секреции. Результаты вестерн-блоттинга секретированных в супернатант №кк1е (который обозначен в виде фракции М) и в осадок №кк1е (который обозначен как фракция С) СЬР-1 и ΡΌΧ-1-СРР показаны на фиг. 7. Фиг. 7 демонстрирует секрецию рекомбинантных инсулинотропных белков Е. сой №кк1е 1917.
Методами генетической инженерии получили №кк1е, который секретирует СЬР-1 под контролем промотора ШС или Р0Х-1-СРР под контролем элемента, отвечающего на глюкозу. Показаны результаты вестерн-блоттинга секретированных белков СЬР-1 (верхний блот) и РОХ-1-СРР (нижний блот). Клетки культивировали в течение 6-8 ч, нормализовали относительно ΘΌ600=1 и центрифугировали. Осадки лизировали и определяли количество каждого белка (фракция С). Сохраняли супернатант и анализировали аналогичным образом (фракция М). В случае клеток, экспрессирующих РОХ-1-СРР, сравнивали клетки, растущие на среде, содержащей глюкозу (0,4%) или глицерол (0,4%). В качестве отрицательного контроля использовали клетки, экспрессирующие пустую плазмиду (обозначенную 20).
Представленные данные показали, что секретировались оба белка. РОХ-1 секретировался под контролем промоторного элемента, отвечающего на глюкозу, для которого не характерна растекающаяся экспрессия (фиг. 7).
Для проверки, способны ли полученные методами генетической инженерии штаммы №кк1е вызывать секрецию инсулина клетками эпителия у человека, клетки Сасо-2 культивировали в бесклеточной среде (СРМ) ночных культур штаммов №кк1е, экспрессирующих РОХ-1-СРР, СЬР-1 или метку из 20 аминокислот (образцы, обозначенные 20) в качестве отрицательного контроля. Ночные культуры выращивали в среде Р-12К (Мей1а!есй, Мапаккак, νΑ) без глюкозы (кроме штаммов РОХ-1, которым необходима глюкоза для продукции РОХ-1). Культивирование клеток Сасо-2 в смеси 1:1 свежей среды Р-12К без глюкозы и СРМ ночных культур №кк1е, секретировавших РОХ-1-СРР, СЬР-1, 20, или смесь из половины РОХ-1-СРР СРМ и половины СЬР-1 СРМ, проводили в течение 16 ч перед удалением среды и культивированием клеток Сасо-2 в среде либо с глюкозой (0,4%) либо глицеролом (0,4%) в течение 2 ч. После введения глюкозы в каждом образце определяли секрецию инсулина и транскрипт инсулина. В качестве положительного контроля клетки Сасо-2 инкубировали в свежей среде Р-12К (без глюкозы) и приобретенном СЬР-1 (аминокислоты 1-37, образцы обозначали 37) в течение тех же 16 ч перед культивированием с глюкозой (0,4%) или глицеролом (0,4%) в течение 2 ч.
Для секреции пептидов Е. сой применяли конструкцию ШС (Ма)апйег К., Ь. АпЮп, 1. Апйкашеп, Н. Ьапд, М. Вгиттег, Т. К. Когйопеп, апй В. \Уек(ег1ипй-\У1кк1гот. 2005. Ех1тасе11и1ат кестейоп ой ро1урерййек икшд а тойШей ЕксйейсЫа сой йадейат кестейоп арратаШк. №Риге Вю1есйпо1оду 23:475-481).
Данные транскрипции и ИФА показали, что инкубация эпителии человека с СРМ от СЬР-1 и РОХ1-СРР вместе или по отдельности стимулирует продукцию клетками инсулина (фиг. 8).
Фиг. 8 иллюстрирует стимуляцию секреции инсулина клетками эпителия. Клетки эпителия Сасо-2 инкубировали с бесклеточной средой (СРМ) ночных культур Е. сой №кк1е 1917, экспрессировавших СЬР-1 (С), РОХ-1-СРР (Р), оба СЬР-1 и РОХ-1-СРР (СР) или контрольную плазмиду (20) или синтезированный СЬР-1 (аминокислоты 1-37, 37) в течение 6 ч перед добавлением глюкозы или глицерола.
а) ПЦР-РВ клеток Сасо-2, инкубированных с СРМ указанной клеточной линии или с белком, и последующая стимуляция глюкозой (обозначено д) или глицеролом.
б) ИФА секреции инсулина стимулированными клетками Сасо-2. Величина ошибки показывает одно стандартное отклонение для трех повторений эксперимента. Значение ρ определяют по Т-критерию Стьюдента (п=3).
Наибольшую продукцию инсулина постоянно наблюдали при инкубации с СЬР-1 СРМ или 37. РОХ-1-СРР СРМ стимулировали секрецию инсулина в ответ на глюкозу как при добавлении только веществ, так и при добавлении с СЬР-1. Секреция инсулина, опосредованная СЬР-1- и РОХ-1, происходила в ответ на глюкозу. Отрицательный контроль эпителия, культивированный с СРМ ночных культур с меткой последовательности 20 аминокислот, не проявлял продукции инсулина в ответ на глюкозу (фиг. 8).
Оказалось неожиданным, что обработка РОХ-1-СРР приводила к секреции инсулина в ответ на глюкозу клетками Сасо-2 (фиг. 8). УокЫйа с сотрудниками сообщил, что РОХ-1 стимулирует конститутивную продукцию инсулина клетками эпителия крыс 1ЕС-6, но только, если эти клетки также обрабатывали бетацеллюлином (УокЫйа δ., У. Картою, Т. Уакийа, Н. \Уа(айа, У. Рир1аЫ, Н. Кокака, Т. Со(о\у, Т. М|уа1кпка, У. Итауайата, У. Уатакакк апй М. Ной. 2002. РОХ-1 шйисек йййетепйайоп ой ш!екйпа1 ерК (йейоЫ 1ЕС-6 1п1о шкийп-ргойистд се11к. 01аЬе(ек 51:2505-2513). Более новая работа КШ/шт, в которой показано, что мыши, трансфицированные РОХ-1, ш У1уо экспрессировали инсулин в тонкой кишке, но
- 24 023069 авторы не определили, какие конкретно клетки отвечают за секрецию и не определили их способность отвечать на глюкозу (Κοίζιιιηί МЬ, К. Ναβαί, Α. К|ба, К. Кат1, И. Йо, К. РиртоЮ, Υ. КазгадисЫ апб К. Όοί. 2006. Рогсеб ехргеззюп оГ ΡΌΧ-1 шбисез шзийп ргобисйоп ίη т1езРпа1 ерйНеПа. Зигдегу 140:273-280). Представленные результаты наводят на мысль, что существует определенное различие между клетками эпителия человека и крысы в отношении ответа на ΡΌΧ-1.
Определили (вычисления приведены выше), что концентрация инсулина в крови составит 164 фмоль л-1-164 фмоль л-1 при выживаемости №зз1е от 106 до 109 КОЕ мл -1 соответственно. Принимая во внимание, что концентрация инсулина в сыворотке после приема пищи может достигать 400 фмоль л-1 у взрослых, не страдающих диабетом (Вази К., С. Эа11а Мап, М. СатрюЫ, А. Вази, О. К1ее, О. То£Го1о, С СоЪеШ апб К. А. К^ζζа. 2006. ЕГГес1з оГ аде апб зех оп роз!ргапб1а1 д1исозе теЫЪойзт: бГГегепсез т д1исозе Ытоуег, шзийп зесгеРоп, шзийп асРоп, апб НераПс шзийп ехйасбоп. Э|аЪе1ез 55:2001-14), то неоптимизированные, полученные методами инженерии бактерии могут стимулировать выделение инсулина, по меньшей мере, того же порядка, который необходим для нормального обмена веществ, кажется очень воодушевляющим.
Эти результаты показывают, что можно разработать очень перспективный и осуществимый способ лечения диабета 1 типа на основе представленных выше способов. С учетом простого орального введения, отсутствия заметной фоновой экспрессии и наличия чувствительности к глюкозе применение рекомбинантных штаммов симбионтов может заметно снизить или даже устранить необходимость инъекций инсулина и поможет снизить долгосрочные осложнения, которые наблюдаются у диабетиков, с помощью замены синтеза инсулина хозяина.
Настоящее изобретение не ограничивается рамками приведенных вариантов реализации. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем, описанные в данной заявке, станут очевидным для специалиста в данной области из предыдущего описания. Такие модификации должны находиться в пределах приложенной формулы изобретения.
Все ссылки, приведенные в настоящем описании, включены в полном объеме и во всех отношениях в той же степени, как если бы было указано, что каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент включены посредством ссылки в полном объеме во всех отношениях.
Цитирование любой публикации приведено для ее раскрытия до даты подачи и не должно быть истолковано, как признание того, что настоящее изобретение не дает право учитывать задним числом такую публикацию после приоритета настоящего изобретения.

Claims (11)

1. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия, стимулирующая продукцию инсулина в ответ на глюкозу в организме млекопитающего-хозяина и содержащая рекомбинантную нуклеиновую кислоту, которая кодирует белок или пептид, включающий пептид млекопитающего, стимулирующий секрецию инсулина, выбранный из группы, состоящей из глюкагоноподобного пептида 1 (ΟΕΡ1), желудочного ингибиторного пептида (ΟΙΡ) и панкреатического и дуоденального гомеобоксного пептида (ΡΌΧ-1), при этом указанный белок или пептид может экспрессироваться указанной кишечной симбиотической бактерией и стимулировать продукцию инсулина в ответ на глюкозу клетками кишечного эпителия в организме млекопитающего-хозяина.
2. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.1, отличающаяся тем, что экспрессия указанной рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок или пептид, находится под контролем индуцибельного промотора.
3. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.1, дополнительно содержащая нуклеиновую кислоту, кодирующую сигнальную последовательность, которая обеспечивает секрецию указанного белка или пептида из цитоплазмы рекомбинантной кишечной симбиотической бактерии.
4. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по любому из пп.1-3, принадлежащая к роду, выбранному из группы, состоящей из ЕзсйегюЫа, Ρзеибοтοηаз, Вас1егсйбез, БасЮЪасб1из, БасЮсосснз, Васб1из, Ρ^οΐеиз, ВШбоЪаЫегшт, ЗцерЮсоссиз, §1арйу1ососсиз и СогупеЪаЫегшт.
5. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.4, представляющая собой штамм бактерии ЕзсйегюЫа сой.
6. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по п.5, представляющая собой штамм №зз1е 1917 ЕзсйегюЫа сой.
7. Изолированная рекомбинантная кишечная симбиотическая бактерия по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что указанный белок или пептид представляет собой глюкагоноподобный пептид 1 (ΟΕΡ-1).
8. Применение рекомбинантной кишечной симбиотической бактерии по п.1 для предотвращения или облегчения диабета у млекопитающего-хозяина.
9. Применение рекомбинантной кишечной симбиотической бактерии по п.8 для лечения диабета.
10. Применение по любому из пп.8-9, отличающееся тем, что указанный микроорганизм принадле- 25 023069 жит к роду, выбранному из группы, состоящей из ЕксйепсЫа, Ркеиботопак, Вас1его1бек, Ьас1оЬасШик, Ьас1ососсик, ВасШик, Рго1еик, В1ЙбоЬас1ег1ит, 81гер1ососсик, 81ар1у1ососсик и СогупеЬас1егшт.
11. Применение по любому из пп.8-10, отличающееся тем, что указанный белок или пептид представляет собой глюкагоноподобный пептид 1 (СЬР-1).
EA201071175A 2008-04-09 2009-04-08 Изолированные рекомбинантные кишечные симбиотические бактерии и их применение EA023069B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US4342608P 2008-04-09 2008-04-09
PCT/US2009/039923 WO2009126719A2 (en) 2008-04-09 2009-04-08 Commensal bacteria as signal mediators within a mammalian host

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201071175A1 EA201071175A1 (ru) 2011-06-30
EA023069B1 true EA023069B1 (ru) 2016-04-29

Family

ID=41162574

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201071175A EA023069B1 (ru) 2008-04-09 2009-04-08 Изолированные рекомбинантные кишечные симбиотические бактерии и их применение

Country Status (8)

Country Link
US (2) US8771668B2 (ru)
EP (1) EP2274416B1 (ru)
CN (2) CN105754918A (ru)
AU (1) AU2009233739B2 (ru)
CA (1) CA2758023A1 (ru)
EA (1) EA023069B1 (ru)
TR (1) TR201100184T1 (ru)
WO (1) WO2009126719A2 (ru)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009126719A2 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Cornell University Commensal bacteria as signal mediators within a mammalian host
JP6007103B2 (ja) 2009-10-30 2016-10-12 ストライク バイオ インク．Ｓｔｒｉｋｅ Ｂｉｏ，Ｉｎｃ． Ｐｄｘ−１発現神経内分泌腫瘍中のｐｄｘ−１オンコジーンを標的とする新規な治療的ｒｎａ干渉技術
EP2627770B1 (en) * 2010-10-15 2017-06-28 Cornell University Compositions and methods for treating endocrine, gastrointestinal or autoimmune disorders
CA2893265A1 (en) * 2012-11-30 2014-06-05 Universite D'auvergne Clermont 1 Use of microorganisms for reducing the level of trimethylamine in a human body cavity in particular for the treatment of trimethylaminuria or of bacterial vaginosis and the prevention of cardiovascular diseases
WO2015095796A1 (en) 2013-12-20 2015-06-25 President And Fellows Of Harvard College An engineered genetic enteric sensor bacteria and uses thereof
WO2016096507A1 (de) 2014-12-18 2016-06-23 Continental Teves Ag & Co. Ohg Triggerbasierte übersetzung von car2x nachricht unterschiedlicher standards
CN109180786B (zh) * 2015-11-20 2021-06-18 深圳市南山区人民医院 用于预防和治疗肠致病大肠杆菌感染的肽段
GB2545395A (en) * 2015-11-27 2017-06-21 The Inst Of Food Res Engineered lactococcus lactis producing biologically active GLP-1
US20180030403A1 (en) * 2016-07-28 2018-02-01 Bobban Subhadra Devices, systems and methods for the production of humanized gut commensal microbiota
WO2020041673A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-27 President And Fellows Of Harvard College Compositions and methods related to cholic acid-7-sulfate as a treatment for diabetes

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040106547A1 (en) * 1999-07-12 2004-06-03 Zealand Pharma A/S Novel peptide agonists of GLP-1 activity
US20050090465A1 (en) * 1999-06-01 2005-04-28 Sarah Ferber Methods of inducing regulated pancreatic hormone production in non-pancreatic islet tissues
US20060057607A1 (en) * 2004-04-12 2006-03-16 Lenz Derrick H Small RNAs and bacterial strains involved in quorum sensing
US20060073115A1 (en) * 2002-05-10 2006-04-06 Rivero Iraldo B Chimeric antagonist anth1

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6019733B2 (ja) * 1977-06-10 1985-05-17 科研製薬株式会社 蛋白質性活性物質
CA2243718A1 (en) * 1996-02-06 1997-08-14 Eli Lilly And Company Diabetes therapy
CN100480374C (zh) * 2001-09-28 2009-04-22 中国科学院上海生命科学研究院 制备重组人类胰高血糖素肽－1氨基酸7－37肽段的方法
US7374930B2 (en) 2002-05-21 2008-05-20 Expression Genetics, Inc. GLP-1 gene delivery for the treatment of type 2 diabetes
EP1853627A2 (en) * 2005-02-11 2007-11-14 Amylin Pharmaceuticals, Inc. Gip analog and hybrid polypeptides with selectable properties
EP3255149A3 (en) 2006-05-02 2018-04-18 Intrexon Actobiotics NV Microbial intestinal delivery of obesity related peptides
WO2009126719A2 (en) * 2008-04-09 2009-10-15 Cornell University Commensal bacteria as signal mediators within a mammalian host
EP2627770B1 (en) * 2010-10-15 2017-06-28 Cornell University Compositions and methods for treating endocrine, gastrointestinal or autoimmune disorders

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20050090465A1 (en) * 1999-06-01 2005-04-28 Sarah Ferber Methods of inducing regulated pancreatic hormone production in non-pancreatic islet tissues
US20040106547A1 (en) * 1999-07-12 2004-06-03 Zealand Pharma A/S Novel peptide agonists of GLP-1 activity
US20060073115A1 (en) * 2002-05-10 2006-04-06 Rivero Iraldo B Chimeric antagonist anth1
US20060057607A1 (en) * 2004-04-12 2006-03-16 Lenz Derrick H Small RNAs and bacterial strains involved in quorum sensing

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAPING DUAN, JOHN C MARCH Interruption Vibrio cholerae Infection of Human Epithelial Cells With Engineered Commensal Bacterial Signaling in Biotechnology and Bioenginee ping, vol. 101, No 1, pp. 128-134 (Online published on 19 March 2008) (See the whole document ) *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2009233739A1 (en) 2009-10-15
US9334503B2 (en) 2016-05-10
EP2274416A2 (en) 2011-01-19
AU2009233739B2 (en) 2015-09-17
WO2009126719A2 (en) 2009-10-15
US8771668B2 (en) 2014-07-08
WO2009126719A3 (en) 2010-02-18
US20140234256A1 (en) 2014-08-21
CN101998987A (zh) 2011-03-30
EP2274416A4 (en) 2011-06-15
EP2274416B1 (en) 2017-01-18
EA201071175A1 (ru) 2011-06-30
TR201100184T1 (tr) 2011-04-21
US20110280835A1 (en) 2011-11-17
CA2758023A1 (en) 2009-10-15
CN105754918A (zh) 2016-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA023069B1 (ru) Изолированные рекомбинантные кишечные симбиотические бактерии и их применение
US11883447B2 (en) Methods and probiotic compositions for the treatment of metabolic diseases and disorders
Yan et al. Colon-specific delivery of a probiotic-derived soluble protein ameliorates intestinal inflammation in mice through an EGFR-dependent mechanism
BE1023915A9 (fr) Nouveaux procedes pour induire une reponse immunitaire
AU2020273293A1 (en) Compositions and methods for induction of Th17 cells
Lazado et al. Atlantic cod in the dynamic probiotics research in aquaculture
JP6949184B2 (ja) 治療的な使用のための、核酸送達のための治療用ファージおよび方法
CN108779482B (zh) 工程化肠道共生细菌在其外膜囊泡(omv)中表达异源蛋白质以递送至胃肠道
CN105039372A (zh) 一种核苷酸疫苗
CN109069605A (zh) 新免疫原性CD1d结合肽
Lawenius et al. Pasteurized Akkermansia muciniphila protects from fat mass gain but not from bone loss
RU2653757C2 (ru) Модифицированные грамположительные бактерии и их применение
US20200009239A1 (en) Compositions, methods and therapies for administering antigen peptide
US20100303863A1 (en) Recombinant edwardsiella bacterium
JP2007131610A (ja) 免疫機能が強化された死菌化乳酸菌製剤及びその製造方法
TW201026852A (en) Process for production of vaccines
US20210386819A1 (en) Bioengineered lactobacillus probiotics and the uses thereof
Bailey et al. In vivo adaptation of attenuated Salmonella typhimurium results in increased growth upon exposure to norepinephrine
Mackie et al. Bacterial cancer therapy in autochthonous colorectal cancer affects tumor growth and metabolic landscape
Stamm et al. Epithelial and mesenchymal cells in the bovine colonic mucosa differ in their responsiveness to Escherichia coli Shiga toxin 1
CN107073106A (zh) 用于治疗泌尿生殖系统癌症的减毒或失活病原性大肠杆菌
KR101456160B1 (ko) 고스트 살모넬라 및 이를 함유하는 세균성 소화기 질환 예방용 백신
TWI283268B (en) Novel microorganism strain GM-020 of Lactobacillus rhamnosus and its use for treating obesity
KR20230064561A (ko) 이중 분비 시스템을 탑재한 항암 균주
JP2023511282A (ja) シュウ酸塩が有害となる障害を治療するための遺伝子改変細菌

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU