EA020979B1 - ПЭГИЛИРОВАННЫЕ Fab-ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДУ Aβ - Google Patents
ПЭГИЛИРОВАННЫЕ Fab-ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДУ Aβ Download PDFInfo
- Publication number
- EA020979B1 EA020979B1 EA200970694A EA200970694A EA020979B1 EA 020979 B1 EA020979 B1 EA 020979B1 EA 200970694 A EA200970694 A EA 200970694A EA 200970694 A EA200970694 A EA 200970694A EA 020979 B1 EA020979 B1 EA 020979B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- antibody
- molecule
- peptide
- peg
- pab
- Prior art date
Links
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 title abstract description 81
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 title abstract description 81
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 111
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 101
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 88
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 43
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 16
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims description 11
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 9
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 208000005145 Cerebral amyloid angiopathy Diseases 0.000 claims description 8
- 208000010877 cognitive disease Diseases 0.000 claims description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 7
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 claims description 6
- 208000028698 Cognitive impairment Diseases 0.000 claims description 5
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 5
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 claims description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 208000008574 Intracranial Hemorrhages Diseases 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 26
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 41
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 36
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 28
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 26
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 26
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 24
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 18
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 18
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 14
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 13
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 9
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 9
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 9
- DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N amyloid-beta polypeptide 42 Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1N=CNC=1)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C(C)C)C(C)C)C1=CC=CC=C1 DZHSAHHDTRWUTF-SIQRNXPUSA-N 0.000 description 8
- 101710137189 Amyloid-beta A4 protein Proteins 0.000 description 7
- 101710151993 Amyloid-beta precursor protein Proteins 0.000 description 7
- 102100022704 Amyloid-beta precursor protein Human genes 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 6
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 6
- 230000004044 response Effects 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 5
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 4
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 4
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 4
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 4
- 206010059245 Angiopathy Diseases 0.000 description 3
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- XLOPXKAWULMNPP-WQLSENKSSA-N [(Z)-N-(diaminomethylideneamino)-C-(4-methylphenyl)carbonimidoyl]phosphonous acid Chemical compound Cc1ccc(cc1)C(=N\N=C(N)N)\P(O)O XLOPXKAWULMNPP-WQLSENKSSA-N 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 2
- 101100370002 Mus musculus Tnfsf14 gene Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 208000037765 diseases and disorders Diseases 0.000 description 2
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 2
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 208000027061 mild cognitive impairment Diseases 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001182632 Akko Species 0.000 description 1
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 description 1
- 102000013455 Amyloid beta-Peptides Human genes 0.000 description 1
- 108010090849 Amyloid beta-Peptides Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 101100533231 Drosophila melanogaster Jon99Ciii gene Proteins 0.000 description 1
- 241000402754 Erythranthe moschata Species 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 101001033280 Homo sapiens Cytokine receptor common subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000958041 Homo sapiens Musculin Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 229920001734 PEG propionaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100030232 Protein SON Human genes 0.000 description 1
- 101150052146 SER2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150060303 SOK2 gene Proteins 0.000 description 1
- GTMJHPZRGBKJFX-UHFFFAOYSA-N SSSSSSSS Chemical compound SSSSSSSS GTMJHPZRGBKJFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100355601 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RAD53 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 201000004810 Vascular dementia Diseases 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- -1 cysteine amino acid Chemical class 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 208000018459 dissociative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012239 gene modification Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960001269 glycine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 102000055647 human CSF2RB Human genes 0.000 description 1
- 102000046949 human MSC Human genes 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000003923 mental ability Effects 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 231100000189 neurotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002887 neurotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940124606 potential therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150087667 spk1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O thiamine pyrophosphate Chemical compound CC1=C(CCOP(O)(=O)OP(O)(O)=O)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N AYEKOFBPNLCAJY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
- A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
- A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6891—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells
- A61K47/6893—Pre-targeting systems involving an antibody for targeting specific cells clearing therapy or enhanced clearance, i.e. using an antibody clearing agents in addition to T-A and D-M
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B82—NANOTECHNOLOGY
- B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
- B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6093—Synthetic polymers, e.g. polyethyleneglycol [PEG], Polymers or copolymers of (D) glutamate and (D) lysine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
- C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/866—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof involving immunoglobulin or antibody fragment, e.g. fab', fab, fv, fc, heavy chain or light chain
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nanotechnology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medical Informatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
В изобретении описаны способы профилактики и лечения состояния, связанного с активностью пептида Aβ. В способе используют фрагменты гуманизированного антитела, которые специфично связывают пептид Aβ человека между положениями аминокислот 13 и 28, причем фрагменты антитела ковалентно связаны с молекулой полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Description
Настоящее изобретение относится к фрагменту антитела, который связывает β-амилоидный пептид (Αβ) и ковалентно соединен с одной или более молекулами полиэтиленгликоля (ПЭГ).
Пептид Αβ в циркулирующей форме состоит из 39-43 аминокислот (преимущественно 40 или 42 аминокислоты) и образуется после расщепления белка-предшественника амилоида (АРР). Оказалось, что превращение Αβ из растворимой в нерастворимую форму с высоким содержанием β-листов и ее отложение в виде нейритических и цереброваскулярных бляшек в мозге связано с рядом состояний и заболеваний, включая болезнь Альцгеймера, синдром Дауна и церебральную амилоидную ангиопатию (ЦАА). Предотвращение и/или обращение отложения Αβ может лечить состояния, связанные с пептидом Αβ.
Терапевтические агенты, которые влияют на отложение, включают антитела к пептиду Αβ, например гуманизированные антитела и фрагменты, описанные в А0 2001/62801, АО 2004/071408 и Татига, Υ., е! а1., №игоЫю1. оГ ϋΐδ. (2005) 20:541-545.
В то время как многие антитела и их производные можно применять в диагностике и терапии, фармакокинетики антител, идеальной для конкретного приложения, часто не удается достичь. Терапевтические антитела, созданные для противодействия различным состояниям и заболеваниям, связанным с пептидом Αβ, обычно представляют собой иммуноглобулины с целыми участками Ре. Участок Ре отвечает за продление периода полураспада антитела в плазме. Это продление может, однако, стать недостатком, поскольку защищает антитело, которое связано с целевым пептидом, от эффективного выведения, что приводит к циркуляции комплекса антиген-антитело в плазме в течение более длительного времени. Последующее введение антитела увеличивает дальнейшее накопление нежелательного комплекса в плазме. Участок Рс антитела может иметь некоторые нежелательные эффекторные функции и может нуждаться в модификации для устранения таких функций. Кроме того, участок Рс добавляет значительную массу к общему размеру терапевтической молекулы, что часто создает проблемы, связанные со способом введения, устройством доставки и масштабированием процессов производства.
Фрагменты антител без части Рс, включая РаЫ, исследовали ίη νίνο, чтобы определить, могут ли такие фрагменты быть потенциальными терапевтическими агентами. Однако исследования показывают, что эффективность терапии с использованием фрагментов, таких как РаЫ, ограничена высокой скоростью выведения и коротким периодом полураспада. Соответственно существует потребность в активных молекулах терапевтических антител к пептиду Αβ, обладающих фармакокинетикой и фармакодинамикой, позволяющими улучшить режим дозирования и одновременно избежать возможных побочных эффектов, которые могут возникнуть как результат образования комплексов в плазме и потенциальных эффекторных функций.
Настоящее изобретение позволяет преодолеть ряд проблем, связанных с терапевтическими антителами или фрагментами антител, которые можно нацеливать на пептид Αβ. Соединения согласно настоящему изобретению охватывают фрагменты антител, которые связывают Αβ и ковалентно связаны с одной или более молекулами полиэтиленгликоля (ПЭГ). Такие соединения можно получать в системах бактериальных или дрожжевых клеток, что устраняет различные проблемы, связанные с получением антител в линиях клеток млекопитающих, такие как проблемы стабильности, очистки и загрязнения эндогенно продуцируемыми антигенами. Кроме того, соединения согласно настоящему изобретению можно вводить подкожно, и они обладают идеальными профилями фармакокинетики (ФК) и фармакодинамики (ФД), но в то же время сохраняют аффинность и избирательность фрагмента антитела к Αβ. Заявители неожиданно и к своему удивлению обнаружили также, что ковалентное присоединение молекул ПЭГ к гипервариабельному участку (СОК, ГВУ) фрагмента антитела не изменяло активность, аффинность или избирательность фрагмента антитела к Αβ.
Настоящее изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела, который специфично связывает пептид Αβ человека между аминокислотными положениями 13 и 28, причем фрагмент антитела ковалентно связан с молекулой ПЭГ. Предпочтительно фрагмент антитела является РаЫфрагментом.
В одном варианте реализации изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела, который содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи включает гипервариабельные участки со следующими последовательностями аминокислот: СПКЬ1: δδδΟδΙ.ΙΥδΐκ..ι\ΑΥΙ.Ι I (δΕΟ ΙΌ N0: 6), СПКЬ2: ΚνδΝΚΤδ (δΕΟ ΙΌ N0: 7) и СПКЬЗ: ТО8ТН8РАТ (δΕΟ ΙΌ N0: 8), и при этом вариабельная область тяжелой цепи включает гипервариабельные участки со следующими последовательностями аминокислот: СЭКН1: СΥТРδКΥδΜδ (δΕΟ ΙΌ N0: 9), С1Ж112: ^INIКССNТΥΥР^ТVΚС (δΕΟ ΙΌ N0: 10) или ΟΙΝΙΗΟΝΝΤΥΥР^ТVΚС (δΕΟ ΙΌ N0: 11) и С’ЭКНЗ: СЭР (δΕΟ ΙΌ N0: 12). Предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи фрагмента антитела. Более предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с гипервариабельным участком. Еще более предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с остатком цистеина в пределах гипервариабельного участка. Наиболее предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с СЭКН2: ^INIКССNТΥΥР^ТVΚС (δΕΟ ΙΌ N0: 10) вариабельной области тяжелой
- 1 020979 цепи фрагмента антитела.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела, который содержит вариабельную область легкой цепи 8ЕО ГО N0: 1 и вариабельную область тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2. Предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи фрагмента антитела. Более предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с гипервариабельным участком вариабельной области тяжелой цепи фрагмента антитела. Еще более предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с остатком цистеина в пределах гипервариабельного участка вариабельной области тяжелой цепи фрагмента антитела. Наиболее предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с цистеином в аминокислотном положении 56 вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает молекулу, включающую РаЬ-фрагмент или δοΡν-фрагмент, причем РаЬ-фрагмент или §сРу-фрагмент ковалентно связан с молекулой ПЭГ и содержит вариабельную область легкой цепи 8Е0 ГО N0: 1 и вариабельную область тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2. Предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с цистеином в аминокислотном положении 56 вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2. Также предпочтительно в такой молекуле молекулярная масса ПЭГ составляет примерно от 0,5 кДа до 30 кДа, более предпочтительно 20 кДа.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела с вариабельной областью легкой цепи 8Е0 ГО N0: 1 и вариабельной областью тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2, причем указанный фрагмент антитела ковалентно связан с молекулой ПЭГ 20 кДа в положении 56 вариабельной области тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 2. Предпочтительно в такой молекуле молекула ПЭГ ковалентно присоединена малеимидной связью.
В другом варианте реализации изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела, специфически связывающий пептид Αβ человека между аминокислотными положениями 13 и 28, причем фрагмент антитела ковалентно связан с молекулой ПЭГ и содержит вариабельную область легкой цепи 8Е0 ГО N0: 1 и вариабельную область тяжелой цепи 8Е0 ГО N0: 3. Предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с шарнирной областью фрагмента антитела. Более предпочтительно ПЭГ присоединен к шарнирной области малеимидной связью.
Изобретение также включает молекулу, содержащую фрагменты антитела, предпочтительно гуманизированные фрагменты антитела, причем с фрагментом антитела ковалентно связана молекула ПЭГ, что дает активную терапевтическую молекулу с фармакокинетикой и фармакодинамикой, обеспечивающими возможность еженедельного введения при снижении потенциальных побочных эффектов, которые могут возникнуть вследствие образования в плазме комплексов и сохранении или улучшении активности, аффинности и избирательности фрагмента антитела к Αβ.
Изобретение также включает способы лечения, предотвращения или обращения состояний или заболеваний, связанных с пептидом Αβ, включая клиническую и доклиническую болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, клиническую и доклиническую амилоидную ангиопатию (ЦАА), когнитивное расстройство, инсульт, кровоизлияние в мозг и общее снижение интеллектуальных способностей. Эти способы включают введение субъекту эффективного количества молекулы, описанной и заявленной в настоящем изобретении.
Настоящее изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела, который специфично связывает пептид Αβ человека между аминокислотными положениями 13 и 28, в которой фрагмент антитела ковалентно связан с молекулой ПЭГ. Авторы обнаружили, что ковалентное связывание молекулы ПЭГ и фрагмента антитела, связывающего Αβ, не приводит к негативным изменениям активности, аффинности или селективности фрагмента антитела в отношении Αβ. Также неожиданно было обнаружено, что ковалентное присоединение молекулы ПЭГ, имеющей молекулярную массу вплоть до 20 кДа, к гипервариабельному участку фрагмента антитела, связывающего Αβ, также не приводит к негативным изменениям активности, аффинности или избирательности фрагмента антитела в отношении Αβ. Указанные фрагменты антитела можно вводить подкожно, и они имеют улучшенный профиль ФК/ФД для терапевтического использования, допускающий гибкий режим дозирования. Кроме того, указанные фрагменты антитела можно получать в системах бактериальных или дрожжевых клеток, что устраняет различные сложности, связанные с получением полноразмерных антител в клетках млекопитающих. ПЭГилированные фрагменты антитела согласно настоящему изобретению обеспечивают возможность предотвращения и лечения как профилактического, так и терапевтического, связанных с Αβ пептидом состояний человека.
Полноразмерное антитело в том виде, в котором оно существует в природе, является молекулой иммуноглобулина, состоящей из четырех пептидных цепей: двух тяжелых цепей (Н) (полный размер примерно 50-70 кДа) и двух легких цепей (Ь) (полный размер примерно 25 кДа), связанных дисульфидными связями. Аминоконцевая часть каждой цепи содержит вариабельную область примерно из 100-110 или более аминокислот, отвечающую в основном за распознавание антигена. Карбоксиконцевая часть
- 2 020979 каждой цепи определяет константную область, отвечающую в основном за эффекторную функцию.
Легкие цепи классифицируют как каппа или лямбда, и они характеризуются конкретной константной областью. Каждая легкая цепь состоит из Ν-концевой вариабельной области легкой цепи (далее ЬСУК) и константной области легкой цепи, состоящей из одного домена СЬ. Тяжелые цепи классифицируют как гамма, мю, альфа, дельта или эпсилон, они определяют изотип антитела: Ι§0, Ι§Μ, Ι§Ά, Ι§Ό и 1дЕ соответственно, причем некоторые из них подразделяются далее на подклассы (изотипы), например 1дС]. Ι§02, 1§Сз, Ι§04, Ι§Α! и 1дА2. Каждый тип тяжелой цепи характеризуется конкретной константной областью. Каждая тяжелая цепь включает Ν-концевую вариабельную область тяжелой цепи (далее НСУК) и константную область тяжелой цепи. Константная область тяжелой цепи включает три домена (СН1, СН2, и СНЗ) для Ι§0, Ι§Ό и 1§А и 4 домена (СН1, СН2, СНЗ и СН4) для 1дМ и 1дЕ.
Области НСУК и ЬСУК далее можно подразделить на гипервариабельные участки, называемые также участками, определяющими комплементарность (СИК), которые перемежаются с более консервативными областями, характеризующими каркасные участки (РК). Каждая НСУК и ЬСУК образована тремя СИК и четырьмя РК, расположенными от амино- до карбоксиконца в следующем порядке: РК1, СГОКЕ РК2, СОК2, РКЗ, СОК.З, РК4. Три СОН тяжелой цепи называются ('ОКНЕ СОКН2 и СОКН.З, три СИК легкой цепи называются СИКЛ, СОКЕ-2 и СНКЬЗ.
Гипервариабельные участки содержат большинство остатков, которые обеспечивают специфичное взаимодействие с антигеном. Нумерация и расположение аминокислотных остатков СГОК в пределах областей НСУК и ЬСУК приведено в соответствии с хорошо известной принятой системой нумерации по КаЪаЕ
Вариабельная область каждой пары легкой и тяжелой цепей образует антигенсвязывающий сайт антитела. В настоящем изобретении термины антигенсвязывающая часть, или антигенсвязывающая область, или антигенсвязывающий домен, или антигенсвязывающий сайт равнозначны и обозначают те части молекулы антитела, которые содержат остатки аминокислот, взаимодействующие с антигеном и обеспечивающие специфичность и аффинность антитела к антигену. Такая часть антитела включает каркасные остатки аминокислот, необходимые для поддержания соответствующей конформации антигенсвязывающих остатков. Предпочтительно каркасная область антител согласно настоящему изобретению является каркасной областью человеческого происхождения или по существу человеческого происхождения (по меньшей мере 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% человеческого происхождения) и соответствует нумерации по КаЪаЕ Кроме того, антигенсвязывающая область может быть получена из последовательности человека.
В настоящем изобретении термин фрагмент антитела относится к одному или более фрагментам антитела, сохранившим способность специфично связываться с антигеном (например, Αβ). Примеры охватываемых термином фрагмент антитела молекул антител включают (ί) РаЪ-фрагмент - одновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) Р(аЪ')2-фрагмент - двухвалентный фрагмент, включающий два фрагмента РаЪ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) Рй-фрагмент, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) Ρν-фрагмент, состоящий из доменов УЪ и УН одноплечевого антитела; и (ν) йАЪ-фрагмент (\Сагй, с1 а1., (1989) ЫаШге З41:544-546), который состоит из домена УН. Кроме того, хотя два домена УЬ и УН Ρν-фрагмента кодируют отдельные гены, их можно соединить с использованием рекомбинантных методов посредством синтетического линкера, который позволяет получить из них единую белковую цепь, в которой домены УЪ и УН образуют одновалентную молекулу (называемую одноцепочечным Ρν (5сРу); см., например, Впй с1 а1. (1988) §с1еиее, 242:42З-426 и Ни81ои е1 а1. (1988) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сЕ И8А, 85:5879-588З). Подразумевается, что такие одноцепочечные антитела также охватывает термин фрагмент антитела. Другие формы одноцепочечных антител, таких как димерные антитела, также входят в определение фрагмент антитела. Димерные антитела являются двухвалентными, биспецифическими связывающими белками, в которых домены УН и УЪ экспрессируются в виде единой полипептидной цепи, но используется линкер, который слишком короток, чтобы позволить спаривание между двумя доменами в одной и той же цепи, в результате чего домены спариваются с комплементарными доменами другой цепи с образованием двух антигенсвязывающих сайтов (см., например, НоШдег, Р., е1 а1. (199З) Ргос. ЫаЙ. Асай. 8сЕ И8А, 90:6444-6448; РоЦак, К.Т, е1 а1. (1994) 5>1гис1иге, 2:1121-112З).
Далее, антитело или фрагмент антитела может быть частью крупной иммуноадгезивной молекулы, образованной в результате ковалентного или нековалентного связывания антитела или фрагмента антитела с одним или более другими белками или пептидами. Примеры таких молекул иммуноадгезии включают использование коровой области стрептавидина для получения молекулы тетрамерного 5сРу (Κίρτίуаηоν, 8.М., е1 а1. (1995) Нитап АийЪой1е8 апй НуЪпйоит, 6: 9З-101) и использование остатка цистеина, маркерного пептида и С-концевой полигистидиновой метки для получения двухвалентных и биотинилированных молекул 5сРу (Карпуапоу, 8.М., е1 а1. (1994) Мо1. Iттиηо1., З1: 1047-1058). Фрагменты антител, такие как фрагменты РаЪ и Р(аЪ')2, могут быть получены из целых антител с использованием стандартных способов, таких как расщепление цельных антител пепсином или папаином соответственно. Кроме того, антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии можно получать с использованием стандартных технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных в области техники. Антитела, фрагменты антител и молекулы иммуноадгезии могут быть гликозилированными или негликозилированными, причем в обоих случаях они включены в объем изобретения. Предпочтительно фрагментом антитела является РаЬ-фрагмент.
Термин гуманизированное антитело относится к антителу, которое частично или полностью образовано последовательностью аминокислот, полученной из зародышевой линии антител человека, или перестроенной (геаггапдеб) последовательностью, полученной путем изменения последовательности антитела, имеющего гипервариабельные участки не человека. Каркасные области вариабельных областей могут быть заменены на соответствующие каркасные области человека. Каркасные области человека включают геномные каркасные области, а также области, содержащие одну или более замен аминокислот. В частности, такие замены включают мутации, при которых аминокислота в конкретном положении в каркасной области человека заменена на аминокислоту из соответствующего положения природного каркаса гипервариабельного участка не человека. Например, содержащее гипервариабельные участки мыши гуманизированное антитело может содержать одну или более замен, при которых определенная аминокислота каркаса человека заменена на соответствующую аминокислоту каркаса мыши. Источники, более подробно описывающие способы гуманизации антител мыши, которые можно использовать, включают, например, Оиееп е! а1., Ргос. Иаб. Асаб. 8с1. И8А, 88:2869, 1991; патент США № 5693761; патент США № 4816397; патент США № 5225539; компьютерные программы АВМОИ и ΕΝΤΆΩ. описанные в Ьеу111, М., 1. Мо1. Вю1., 168:595-620, 1983; гуманизацию можно осуществить, по существу, в соответствии со способом, описанным \Уш1ег е! а1. (1опе8 е! а1., №!иге, 321:522-525, 1986; ШесЪтапп е! а1., №!иге, 332:323-327, 1988; УегЬоеуеп е! а1., 8с1епсе, 239:1534-1536, 1988).
Предпочтительно антитело согласно настоящему изобретению является фрагментом гуманизированного антитела. Более предпочтительно антитело согласно изобретению является РаЬ-фрагментом гуманизированного антитела.
Настоящее изобретение также включает фрагменты антител, ковалентно связанные с одной или более молекулами ПЭГ. Подразумевается, что термины полиэтиленгликоль и ПЭГ используются равнозначно и относятся к полиэтиленгликолю или его производным, известным в данной области техники (см., например, патенты США № 5445090, 5900461, 5932462, 6436386, 6448369, 6437025, 6448369, 6495659, 6515100 и 6514491). Предпочтительно ПЭГ ковалентно связан с одним или более остатков лизина или цистеина фрагмента антитела. Более предпочтительно ПЭГ ковалентно связан с одним или более остатков лизина или цистеина вариабельной области тяжелой цепи фрагмента антитела. Еще более предпочтительно ПЭГ ковалентно связан с одним или более остатков лизина или цистеина в пределах гипервариабельного участка фрагмента антитела. Наиболее предпочтительно ПЭГ связан с остатком цистеина в аминокислотном положении 56 вариабельной области тяжелой цепи указанной 8ΕΟ ГО ΝΟ: 2. Кроме того, молекулы ПЭГ могут быть связаны с фрагментом антитела через молекулу линкера или спейсера в шарнирной области фрагмента антитела. Введение молекул линкеров и спейсеров в шарнирную область хорошо известно в данной области техники. Кроме того, ПЭГ можно ковалентно присоединить к модифицированным неприродным аминокислотам фрагмента антитела с помощью хорошо известных в данной области способов.
В типичной форме ПЭГ является линейным полимером с концевыми гидроксильными группами и имеет формулу НО-СН2СН2-(СН2СН2О)п-СН2СН2-ОН, где п равно от примерно 8 до примерно 4000. Концевой водород может быть замещен защитной группой, такой как алкил или алканол (М-ПЭГ). Предпочтительно ПЭГ содержит по меньшей мере одну гидроксильную группу, более предпочтительно гидроксильную группу, расположенную на конце. Именно эту гидроксильную группу предпочтительно активируют для взаимодействия с пептидом. Для получения активного производного ПЭГ, содержащего подходящую для связывания с данной целевой молекулой функциональную группу, такую как активный карбонат, активный сложный эфир, альдегид, трезилат или ПЭГ-пропиональдегид, используют ряд химических модификаций. Затем осуществляют ковалентное связывание активированного производного ПЭГ с реакционноспособной группой лекарственного полипептида. Существует множество форм ПЭГ, которые можно применять в настоящем изобретении. В данной области техники существует множество производных ПЭГ, подходящих для использования в настоящем изобретении. Предполагается, что ковалентно связанная с фрагментом антитела согласно настоящему изобретению молекула ПЭГ не ограничена конкретным типом или размером. Молекулярная масса ПЭГ составляет предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 100 кДа, более предпочтительно от примерно 5 до примерно 30 кДа и наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 20 кДа. ПЭГ может быть линейным или разветвленным, и фрагмент антитела к пептиду Αβ согласно настоящему изобретению может иметь 1, 2, 3, 4, 5 или 6 молекул ПЭГ, связанных с пептидом. Наиболее предпочтительным является одна молекула ПЭГ на фрагмент антитела; однако, если присутствует более одной молекулы ПЭГ на молекулу пептида, предпочтительно, чтобы их было не более шести. Далее предполагается, что оба конца молекулы ПЭГ могут служить для перекрестного связывания вместе двух или более молекул фрагментов антител к Αβ-пептиду. Способы присоединения молекул ПЭГ к белкам, антителам и их фрагментам хорошо известны в данной области.
Термин Кс в настоящем изобретении относится к константе диссоциации конкретного взаимо- 4 020979 действия антитело-антиген. Ее рассчитывают по формуле:
Кп=ко££/коп (измеряется в М).
Термин коп в настоящем изобретении относится к константе скорости ассоциации или удельной скорости реакции, прямой реакции или образования комплекса, измеряемой в единицах М-1с-1. Термин ко££ в настоящем изобретении относится к константе скорости диссоциации или удельной скорости реакции диссоциации антитела из комплекса антитело/антиген, измеряемой в единицах с-1.
Термин специфично связывает в настоящем изобретении относится к ситуации, в которой один член специфичной связывающейся пары не связывается в значительной степени с молекулами, отличными от своего партнера (партнеров) по специфичному связыванию. Данный термин применим, например, в случае, когда антигенсвязывающий домен антитела согласно настоящему изобретению специфичен в отношении конкретного эпитопа, который несет множество антигенов, в этом случае специфичное антитело, несущее антигенсвязывающий домен, будет способно связываться с различными антигенами, несущими данный эпитоп. Соответственно молекула согласно настоящему изобретению специфично связывает пептид Αβ и вместе с тем не связывает специфично АРР. Кроме того, молекула согласно настоящему изобретению специфично связывает линейный, нелинейный или конформационный эпитоп Αβ, включающий аминокислоты ΗΗφΚΡνΡΈΑΕΌνΟδΝΚ (13-28) (8ЕЦ ΙΌ N0: 4).
Термин активность в отношении молекул согласно настоящему изобретению включает, но не ограничивается, аффинность к эпитопу/антигену и специфичность способности нейтрализовать или противодействовать активности пептида ίη νίνο или ίη νίΐτο Αβ, 1С50, стабильность антитела ίη νίνο и иммуногенные свойства антитела. Другие идентифицируемые биологические свойства или характеристики антитела, признанные в данной области, включают, например, перекрестную реактивность (то есть в общем случае связывание с гомологами целевого пептида, не являющегося пептидом человека, или с другими белками или тканями) и способность сохранять высокие уровни экспрессии белка в клетках млекопитающих. Указанные свойства или характеристики можно наблюдать, измерять или оценивать с использованием принятых в данной области техники методов, включая, но не ограничиваясь, твердофазный ИФА, конкурентный твердофазный ИФА, анализы поверхностного плазмонного резонанса В1асоге или ΚίηΕχΑ, тесты нейтрализации ίη νίΐτο или ίη νίνο без ограничений, связывание рецептора, продукцию и/или секрецию цитокинов или факторов роста, внутриклеточную передачу сигнала и иммуногистохимиический анализ срезов тканей из различных источников, включая человека, примата или любой другой источник.
Термины индивидуум, субъект и пациент равнозначно используются в настоящем изобретении в отношении млекопитающего, предпочтительно человека. В одной реализации настоящего изобретения субъект дополнительно характеризуется заболеванием, расстройством или состоянием, при котором будет полезно уменьшение активности пептида Αβ.
Выражения клетка-хозяин, линия клеток-хозяев и культура клеток хозяев равнозначно используются в настоящем изобретении и включают индивидуальные клетки или культуру клеток, которые являются реципиентами любого выделенного (изолированного) полинуклеотида согласно настоящему изобретению или любого рекомбинантного вектора (векторов), включающего последовательности, кодирующие Ηί','νΒ. ЬСУК или моноклональное антитело согласно настоящему изобретению. Клетки-хозяева включают потомков единственной клетки-хозяина. Потомки могут быть не полностью идентичны исходной родительской клетке по морфологии или общему содержанию ДНК из-за естественных, случайных или преднамеренных мутаций и/или изменений. Клетки-хозяева включают трансформированные клетки, трансдуцированные или инфицированные рекомбинантным вектором или полинуклеотидом, экспрессирующие фрагмент антитела согласно настоящему изобретению или легкую или тяжелую цепи такого антитела. Клетку-хозяина, которая содержит рекомбинантный вектор согласно настоящему изобретению, стабильно включенный в хромосому или нет, также можно назвать рекомбинантной клеткойхозяином. Предпочтительными клетками для получения клеток-хозяев согласно настоящему изобретению являются клетки СНО (например, АТСС СРЬ-9096), клетки N80, клетки 8Р2/0, клетки С08 (например, АТСС СРЬ-1650, СРЬ-1651) и НеЬа (АТСС ССЬ-2). Дополнительные клетки-хозяева для использования в настоящем изобретении включают клетки растений, дрожжей, других млекопитающих и прокариотические клетки. Более предпочтительно клетками для использования в настоящем изобретении являются клетки дрожжей или прокариотов.
Предполагается, что термин состояние или заболевание, ассоциируемое с пептидом Αβ или заболевание, связанное с активностью Αβ включает все состояния, расстройства и заболевания, которые связаны с 1) развитием бляшек β-амилоида в мозге, 2) синтезом аномальных форм Αβ, 3) образованием особенно токсичных форм Αβ или 4) аномальной скоростью синтеза, разложения или выведения Αβ. По объективным данным и предположениям с Αβ связаны такие состояния и заболевания, как болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, церебральная амилоидная ангиопатия, некоторые сосудистые деменции и умеренное когнитивное расстройство.
Настоящее изобретение обеспечивает молекулу, включающую фрагмент антитела, который специфично связывает пептид Αβ между аминокислотными положениями 13 и 28, причем указанный фрагмент
- 5 020979 антитела ковалентно связан с молекулой ПЭГ. Фрагмент антитела является предпочтительно гуманизированным фрагментом антитела, таким как РаЬ-фрагмент и/или зсРу-фрагмент. Наиболее предпочтительно фрагмент антитела является РаЬ-фрагментом. Специфичное связывание молекул согласно настоящему изобретению и пептида Αβ позволяет использовать указанные молекулы для терапии связанных с пептидом Αβ заболеваний и расстройств, то есть состояний, заболеваний и расстройств, при которых полезно ингибирование биологической активности пептида Αβ.
В одном варианте реализации изобретения фрагмент антитела содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, причем вариабельная область легкой цепи включает гипервариабельные участки со следующими последовательностями аминокислот: СЭКВ1: δδδρδυΥδΌΟΝΑΥΡΗ (δΙΟ ΙΌ N0: 6), С1Ж1.2: ΚνδΝΕΡδ (δΙΟ ΙΌ N0: 7) и С1Ж1Э: ΤΟδΤΙ ΙδΙΛΥΤ (δΙΥ) ΙΌ N0: 8), и/или вариабельная область тяжелой цепи включает гипервариабельные участки со следующими последовательностями аминокислот: СЭКН1: ΟΥΤΡδΕΥδΜδ (δΙΥ) ΙΌ N0: 9), С1Ж112: ΟΙΝΙΗΟίΑΤΥΥΡΌΤνΚΟ (δΙΥ) ΙΌ N0: 10) или ^INIКСNNΤΥΥΡ^ΤVΚС (δΙΥ) ΙΌ N0: 11) и СЭКН3: СЭР (δΙΥ) ΙΌ N0: 12). Предпочтительно шесть гипервариабельных участков фрагмента антитела согласно настоящему изобретению существуют вместе. Сочетание, включающее гипервариабельные участки согласно настоящему изобретению, обычно представляет собой последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или ее существенную часть, в которых гипервариабельные участки расположены в положении, соответствующем нумерации по КаЬак Каркасная область содержит три гипервариабельных участка для каждого цепи, тяжелой и легкой, в виде непрерывной последовательности, представленной следующей формулой: РК1-СОК1-РК2-СОК2-РК3-СОК3-РК4. Участки тяжелой или легкой цепи РК1, РК2, РК3 и РК4 вместе образуют полную каркасную область фрагмента антитела, если они размещены в виде непрерывной последовательности с гипервариабельными участками в установленном порядке. Предпочтительно каркасные области антитела согласно настоящему изобретению получены или имеют человеческое происхождение (т.е. получены/происходят из каркасной области человека) или, по существу, человеческое происхождение (т.е. более чем примерно на 80, 82, 85, 87, 90, 92, 95, 97%).
Предпочтительно фрагмент антитела согласно настоящему изобретению включает ЬСУК, включающую пептид следующей последовательности:
РТУМТОТРЬЗЪЗУТРСОРАЗГЗСЗЗЗСЗЫУЗРСМАУШНУЬОКРСОЗР 02ЫУК72НРГ2СУР2РГЗЗЗС-ЗСТ27,ТЪК12Р.УЕ?.ЕЭУС УУУСТрЗТНЗРИТГЗСОТКУЕГК (ЗЕО Ю N0; 1);
и НСУК, включающую пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из следующих последовательностей:
ЕУОЬУЕЗСССЪУКРСеЗЪКЪЗСААЗСУТГЗЕУЗМЗИУКОАРС К6ЬЕИУС01М1Р6СЫТУУРРТУКСКЕТ13КРРЗКЦТЬУЬ0МНЗ ЬКТЕРТАУУУСТТСРЕИСОСТЬУТУЗЗ (ЗЕО ΙΡ N0: 2);
ЕУОЬУЕЗССеЬУКРССЗЬКЬЗСААЗСУТЕЗКУЗМЗИУКОАРС КС1ЕИУС01М1КСИЫТУУРРТУКСКГТIЗКРЭЗКНТЬУ Ы2МЫ 3 ЬКТЕРТАУУУСТТСОЕИСОСТЬУТУЗЗ (ЗЕО Ю N0: 3).
Кроме того, фрагмент антитела включает область ЬСУК, включающую пептид с последовательностью, состоящей из δΙΟ ΙΌ N0: 1, и НСУК, включающую пептид с последовательностью, выбранной из группы, состоящей из δΙΟ ΙΌ N0: 2 или δΙΟ ΙΌ N0: 3, при этом НСУК и ЬСУК сосуществует вместе в одном фрагменте антитела. Специалисту в данной области техники понятно, что фрагменты антитела согласно настоящему изобретению не ограничиваются конкретными последовательностями НСУК и ЬСУК, но также включают варианты этих последовательностей, присутствие которых в молекуле согласно настоящему изобретению не ухудшает или улучшает способность к связыванию антигена и по меньшей мере одно другое функциональное свойство родительского антитела, такое как специфичность к эпитопу, способность конкурировать с родительским антителом за связывание с Αβ пептидом, значения Κ.'50 и/или К или ко££ для связывания пептида Αβ.
В другом варианте реализации согласно настоящему изобретению вся вариабельная область или часть вариабельной области ограничивается конкретной последовательностью ЬСУК, которая показана в δΙΟ ΙΌ N0: 1, и последовательностью НСУК, которая показана в δΙΟ ΙΌ N0: 2 или δΙΟ ΙΌ N0: 3, и дополнительно характеризуется тем, что оказывает антагонистическое действие или нейтрализует по меньшей мере один вид активности пептида Αβ ίη νίνο или ίη νΐίτο. Антитело согласно настоящему изобретению, в котором вся вариабельная область или ее часть ограничивается конкретной последовательностью, показанной в ЬСУК δΙΟ ΙΌ N0: 1 и НСУК δΙΟ ΙΌ N0: 2 или δΙΟ ΙΌ N0: 3 настоящего изобретения, дополнительно характеризуется способностью к специфичному связыванию пептида Αβ человека и отсутствием связывания ΑΡΡ человека.
В одном аспекте настоящего изобретения ПЭГ (или его производные) ковалентно связан с одним или более остатков лизина, цистеина или неприродной модифицированной аминокислоты фрагмента
- 6 020979 антитела. Предпочтительно молекула ПЭГ ковалентно связана с вариабельной областью тяжелой цепи или вариабельной областью легкой цепи фрагмента антитела. Более предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с СГОВ вариабельной области тяжелой цепи фрагмента антитела. Наиболее предпочтительно такая молекула содержит молекулу ПЭГ, которая ковалентно связана с аминокислотой цистеином в аминокислотном положении 56 вариабельной области тяжелой цепи δΕΟ ГО N0: 2. Кроме того, молекулы ПЭГ могут быть связаны с РаЬ-фрагментом антитела к пептиду Αβ при помощи молекулы линкера или спейсера в шарнирной области фрагмента антитела.
В другом аспекте настоящего изобретения молекула ПЭГ ковалентно связана с одним или более модифицированными остатками лизина, цистеина или неприродной модифицированной аминокислоты антитела согласно настоящему изобретению и замещает существующий в молекулах антитела фрагмент гликозилирования без значительного влияния на аффинность и избирательность фрагмента антитела к Αβ. Предпочтительно молекула ПЭГ заменяет сигнал гликозилирования в вариабельной области тяжелой цепи или вариабельной области легкой цепи фрагмента антитела. Более предпочтительно молекула ПЭГ заменяет сигнал гликозилирования в гипервариабельном участке вариабельной области тяжелой цепи фрагмента антитела. Наиболее предпочтительно молекула ПЭГ заменяет сигнал гликозилирования в положении 56 вариабельной области тяжелой цепи δΕΟ ГО N0: 2.
Подразумевается, что ковалентно связанная с антителом молекула ПЭГ в настоящем изобретении не ограничена конкретным типом или размером. Молекулярная масса ПЭГ предпочтительно составляет от примерно 0,5 до примерно 100 кДа, более предпочтительно от примерно 0,5 до примерно 30 кДа и наиболее предпочтительно от примерно 1 до примерно 20 кДа. Кроме того, молекулярную массу ПЭГ можно выбрать из группы, состоящей из примерно 0,5, примерно 1, примерно 5, примерно 10 и примерно 20 кДа. ПЭГ может быть линейным или разветвленным и к ПЭГилированному антителу к пептиду Αβ согласно настоящему изобретению может быть присоединено более одной молекулы ПЭГ. Предпочтительно к ПЭГилированному антителу к пептиду Αβ присоединена одна молекула ПЭГ.
Наиболее предпочтительно молекула антитела по данному изобретению включает фрагмент антитела с вариабельной областью легкой цепи δΕΟ ГО N0: 1 и вариабельной областью тяжелой цепи δΕΟ ГО N0: 2, причем указанный фрагмент антитела ковалентно связан с молекулой ПЭГ массой 20 кДа в положении 56 вариабельной области тяжелой цепи δΕΟ ГО N0: 2.
Антигенный эпитоп пептида Αβ, с которым связываются антитела согласно настоящему изобретению, может быть линейным, нелинейным или конформационным эпитопом, который включает аминокислоты НН01<ЕУЕЕАЕЭУС5>М< (δΕΟ ГО N0: 4). Антитела, которые связывают указанный эпитоп, связывают пептид Αβ специфично и преимущественно по сравнению с тем, как они связывают ΑΡΡ. Моноклональные антитела согласно настоящему изобретению связывают пептид Αβ по меньшей мере в 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз лучше (например, с большей аффинностью или большей специфичностью), чем они связывают ΑΡΡ человека; более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз лучше, чем они связывают ΑΡΡ, еще более предпочтительно они не связывают ΑΡΡ на уровне большем, чем уровень фона, определенный, например, путем твердофазного ИФА, конкурентного твердофазного ИФА или по значению Кс в тестах В1асоге или ΚίηΕχΑ.
Фрагменты антител согласно настоящему изобретению связывают эпитоп между аминокислотами Η^Κ^VЕЕΑΕ^VΟδNΚ (δΙΤ) ГО N0: 5) по меньшей мере в 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 раз лучше (например, с большей аффинностью или большей специфичностью), чем эпитоп, не включающий аминокислоты НОКЕУЕЕЛЕОУС8М< (δΕΟ ГО N0: 5). Более предпочтительно по меньшей мере в 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550 или 600 раз лучше, чем эпитоп, не включающий аминокислоты Η^<^УЕЕЛΕ^УСδN< (8ЕО ГО N0: 5), еще более предпочтительно они вообще не связывают эпитоп, не включающий аминокислоты Η^<^УЕЕЛΕ^УСδN< (δΕΟ ΙΌ N0: 5), на уровне большем, чем уровень фона, определенный, например, путем твердофазного ИФА, конкурентного твердофазного ИФА или по значениям К в тестах В1асоге или ΚίηΕχΑ.
В предпочтительном варианте реализации изобретение обеспечивает фрагмент антитела, который обладает высокой аффинностью связывания с пептидом Αβ, то есть связывает пептид Αβ или его часть, включающую последовательность Η^<^УЕЕЛΕ^УСδN< (δΕΟ ΙΌ N0: 5) [то есть антитело входит в контакт с полипептидом Η^Κ^УЕЕЛΕ^УСδNΚ| с аффинностью связывания (Кс) для пептида Αβ человека менее примерно 200, 100, 50, 40 или 30 пМ, предпочтительно менее примерно 20 пМ, измеренной методом ΚίηΕχΑ. Кроме того, аффинность связывания (Кс) для пептида Αβ человека составляет от 0,1 до 200 пМ. Аффинность антитела можно определять так, как описано в примерах ниже или другими способами, доступными в данной области техники.
Вводить антитело согласно настоящему изобретению можно следующими путями: пероральным, парентеральным, ингаляционным или местно. Предпочтительно антитела согласно настоящему изобретению могут быть включены в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Термин парентеральный в настоящем изобретении включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Предпочтительной является системная периферическая доставка путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Бо- 7 020979 лее предпочтительный способ введения антитела согласно настоящему изобретению представляет собой подкожную инъекцию. Подходящие инструменты для подобных инъекций хорошо известны в данной области техники.
Период полураспада фрагмента антитела согласно настоящему изобретению в плазме меньше, чем у соответствующего полноразмерного антитела к пептиду Αβ, и он выводится из плазмы быстрее, чем соответствующее полноразмерное антитело к пептиду Αβ. Кроме того, период полураспада антитела согласно настоящему изобретению в плазме больше, чем период полураспада соответствующего РаЬфрагмента антитела к пептиду Αβ, который не связан ковалентной связью с молекулой ПЭГ, и оно выводится из плазмы менее быстро, чем соответствующий РаЬ-фрагмент к пептиду Αβ, не связанный ковалентно с молекулой ПЭГ (примеры 1, 2 и 3). Термин соответствующий по отношению к антителу в настоящем изобретении относится к антителу с такими же областями ЬСУК и НСУК. Например, соответствующее полноразмерное антитело в отношении РаЬ-фрагмента антитела, имеющего области ЬСУК и НСУК, состоящие из 5>ЕО ГО N0: 1 и 8Е0 ГО N0: 2, должно иметь такие же ЬСУК и НСУК, состоящие из 5>Е0 ГО N0: 1 и 8Е0 ГО N0: 2 вместе с целым Рс-доменом.
В другом аспекте настоящее изобретение относится к рекомбинантным полинуклеотидам, кодирующим антитела, которые при экспрессии содержат последовательности ЬСУК 8Е0 ГО N0: 1 и НСУК, состоящую из 8Е0 ГО N0: 2. По причине вырожденности кодонов эти последовательности могут быть заменены другими последовательностями полинуклеотидов. В частности, предпочтительные полинуклеотиды согласно настоящему изобретению, кодирующие антитела, в случае экспрессии содержат последовательности легкой цепи СПК 8Е0 ГО N0: 6-8 и тяжелой цепи СОК 8Е0 ГО N0: 9, 10 или 11 и 12 или любую из вариабельных областей 8Е0 ГО N0: 1-8Е0 ГО N0: 3. Примеры последовательностей полинуклеотидов, которые кодируют ЬСУК 8Е0 ГО N0: 1 и НСУК 8Е0 ГО N0: 2, представлены в 8Е0 ГО N0: 13 (ЬСУК) и δΙΤ) ΙΌ N0: 14 (НСУК) соответственно.
Полинуклеотиды обычно включают дополнительно последовательность полинуклеотида, позволяющую контролировать экспрессию, функционально связанную с последовательностью, кодирующей гуманизированный иммуноглобулин, включая природные связанные или гетерологичные промоторные области.
Предпочтительно последовательности контроля экспрессии являются системами эукариотических промоторов в векторах, подходящих для трансформации или трансфекции эукариотических клеток, однако также можно использовать регуляторные последовательности прокариотических клеток. После внедрения вектора в подходящую линию клеток-хозяев, клетки-хозяева размножают в условиях, пригодных для экспрессии последовательностей нуклеотидов, при желании затем можно отбирать и очищать легкие цепи, тяжелые цепи, димеры легкой/тяжелой цепей или целые антитела, связывающие фрагменты или другие формы иммуноглобулинов.
Последовательности нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению, подходящие для непрерывной экспрессии желаемого антитела или фрагмента антитела, можно получать из ряда других полинуклеотидов (геномных или кДНК, РНК, синтетических олигонуклеотидов и т.п.) и компонентов (например, областей У, 1, Ό и С) с использованием любого из ряда известных способов. Соединение подходящих геномных и синтетических последовательностей является общеизвестным способом производства, но также можно использовать последовательности кДНК.
Последовательности ДНК константной области человека могут быть выделены в соответствии с хорошо известными процедурами из разнообразных клеток человека, но предпочтительно из иммортализованных В-клеток. Подходящие для последовательностей полинуклеотидов источники клеток и клеткихозяева для экспрессии и секреции иммуноглобулинов можно получать из множества источников, известных в данной области техники.
В дополнение к гуманизированным антителам или фрагментам антител, подробно описанным в настоящем изобретении, могут быть легко разработаны другие по существу, гомологичные модифицированные антитела, которые можно получать с использованием различных технологий рекомбинантных ДНК, хорошо известных специалистам в данной области. Например, каркасная область может отличаться от исходных последовательностей на уровне первичной структуры заменой нескольких аминокислот, концевыми и промежуточными вставками и делециями и т.п. Кроме того, в качестве основы для гуманизированных антител согласно настоящему изобретению можно использовать ряд других областей каркаса человека, отдельно или в сочетании. В общих чертах, модификации генов легко можно выполнить с помощью ряда известных методов, таких как сайт-направленный мутагенез.
Как было сказано ранее, экспрессия полинуклеотидов в хозяевах происходит после функционального связывания с последовательностью, регулирующей экспрессию (то есть после того, как полинуклеотид и контрольную последовательность объединяют для обеспечения функционирования). Эти векторы экспрессии обычно можно реплицировать в клетках-хозяевах или эписомах или в качестве составляющей ДНК хромосом хозяина. Обычно векторы экспрессии будут содержать маркеры селекции, например гены устойчивости к тетрациклину или неомицину, для обнаружения клеток-хозяев, трансформированных желаемыми последовательностями ДНК. Векторы экспрессии для этих клеток могут включать регули- 8 020979 рующие экспрессию последовательности, например ориджин репликации, промотор, энхансер и необходимые для процессинга сайты, например сайты связывания рибосом, сайты сплайсинга РНК, сайты полиаденилирования и последовательности терминации транскрипции. Предпочтительные регулирующие экспрессию последовательности представляют собой промоторы, полученные из генов иммуноглобулинов, 8У40, аденовируса, вируса папилломы коров, цитомегаловируса и т.п.
Векторы, содержащие целевые последовательности полинуклеотидов (например, последовательности, кодирующие тяжелую и легкую цепи и регулирующие экспрессию последовательности), можно переносить в клетку-хозяина с помощью хорошо известных методов, которые будут варьировать в зависимости от типа клетки. Для экспрессии антител согласно настоящему изобретению можно применять множество клеток-хозяев с использованием хорошо известных в данной области техники методов. Предпочтительные линии клеток включают СО8, СНО, 8Р2/0, N80 (доступны в публичных хранилищах, например АТСС - Американской коллекции типовых культур, Мапаккак, УА) и линии клеток дрожжей. Предпочтительно клетка-хозяин согласно настоящему изобретению включает один или более вектор или конструкт, включающие молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения. Клетка-хозяин согласно настоящему изобретению является клеткой, в которую введен вектор согласно настоящему изобретению, причем указанный вектор включает полинуклеотид, кодирующий ЬСУК согласно настоящему изобретению, и/или полинуклеотид, кодирующий НСУК согласно настоящему изобретению. Изобретение также обеспечивает клетку-хозяина, в которую введены два вектора согласно настоящему изобретению: один вектор содержит полинуклеотид, кодирующий область ЬСУК антитела согласно настоящему изобретению, а другой содержит полинуклеотид, кодирующий область НСУК антитела согласно настоящему изобретению, при этом каждый полинуклеотид функционально связан с последовательностью промотора. Типы клеток включают клетки млекопитающих, бактерий, растений и дрожжей. Предпочтительно клетка является клеткой линий СНО, СО8, 8Р2/0 или N80. дрожжевой клеткой или производной либо потомком любой клетки предпочтительного типа.
После экспрессии целые антитела, их димеры, отдельные легкие и тяжелые цепи или другие формы иммуноглобулинов согласно настоящему изобретению можно очищать в соответствии со стандартными принятыми в данной области техники процедурами, включая осаждение сульфатом аммония, ионообменную, аффинную, обратнофазовую и гидрофобную хроматографии на колонках, гель-электрофорез и т.п. Для фармацевтического использования предпочтительны, по существу, чистые иммуноглобулины, гомогенность которых составляет по меньшей мере примерно 90, 92, 94 или 96%, наиболее предпочтительно от 98 до 99% или более. После частичной очистки или очистки до гомогенного состояния, по желанию, пептиды затем можно использовать в целях терапии или профилактики, как описано в настоящем изобретении.
Ряд симптомов, приводящих к когнитивным расстройствам, инсульту, кровоизлиянию в мозг и общему снижению умственных способностей, по всей видимости, связаны с содержащими пептид Αβ нейритными и цереброваскулярными бляшками в мозге. Среди этих состояний - как клиническая, так и доклиническая болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, клиническая или доклиническая амилоидная ангиопатия (ЦАА). Амилоидные бляшки состоят их пептида Αβ. Этот пептид циркулирует в крови и спинномозговой жидкости (ликворе) обычно в форме комплекса с липопротеинами. Циркулирующая форма пептида Αβ состоит из 39-43 аминокислот (в основном из 40 или 42 аминокислот) и образуется при расщеплении общего белка-предшественника, белка предшественника амилоида, часто называемого АРР. Некоторые формы растворимого АРР сами являются нейротоксичными и, возможно, определяют остроту нейродегенерации и/или когнитивного расстройства (МеЬеап, С.А., е! а1., Апп. ΝοΙυΓοΙ., (1999) 46:860866; ЬатЬеП, М.Р., е! а1., (1998) 95:6448-6453; №к1ипй, 1., 1. Ат. Мей. Аккос., (2000) 283:1571).
Соответственно фармацевтическую композицию, включающую молекулу по настоящему изобретению, можно применять для лечения или предотвращения состояний, при которых присутствие пептида Ав вызывает нежелательные патологические эффекты или вносит вклад в их развитие, или снижение активности пептида Ав оказывает терапевтическое полезное действие на млекопитающих, предпочтительно людей, при состояниях, которые включают, без ограничения, клиническую или доклиническую болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, клиническую или доклиническую амилоидную ангиопатию (ЦАА), продромальную болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение (УКН) и когнитивное расстройство, инсульт, кровоизлияние в мозг и общее снижение интеллектуальных способностей, которые, как оказалось, связаны с нейритными и цереброваскулярными бляшками, содержащими пептид Ав, в мозге. В изобретении предусмотрено использование молекул согласно настоящему изобретению для лечения или предотвращения по меньшей мере одного из указанных расстройств, при котором активность пептида Ав является нежелательной или при котором полезно уменьшение уровня биоактивного пептида Ав. Кроме того, предусмотрено использование молекул согласно настоящему изобретению в производстве лекарственных средств для лечения по меньшей мере одного из указанных расстройств.
Термины лечение и подобные термины в настоящем изобретении относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Эффектом может быть частичное или полное излечение заболевания и/или нежелательного эффекта, связанного с прогрессированием заболевания.
- 9 020979
Лечение в настоящем изобретении включает введение соединения, в частности, человеку и включает (а) подавление заболевания, то есть прекращение его прогрессирования; или (Ь) снижение выраженности заболевания, то есть обращение заболевания или расстройства или снижение выраженности симптомов или их осложнений. Режимы дозирования (введения) можно скорректировать для обеспечения оптимального желаемого ответа (например, терапевтического или профилактического ответа). Например, можно однократно вводить болюс, введение нескольких доз можно разделить во времени или можно пропорционально уменьшить или увеличить дозу, если это показано неотложными случаями при терапевтической ситуации.
Молекулу согласно настоящему изобретению можно включать в фармацевтические композиции, пригодные для введения субъектам. Молекулы согласно настоящему изобретению можно вводить отдельно или в сочетании с фармацевтически приемлемым носителем, растворителем и/или наполнителем, в виде однократной или многократной доз. Фармацевтические композиции для введения приводят в соответствие с выбранным режимом введения; используют подходящие фармацевтически приемлемые растворитель, носитель и/или наполнители, такие как эмульгаторы, буферы, поверхностно-активные вещества, консерванты, солюбилизаторы, изотонические вещества, стабилизаторы и т.п. (см., например, пример 14 ниже). Указанные композиции разработаны в соответствии со стандартными методами, такими как описаны в руководстве Рспипфоп. Тйе 8шепсе апб Ргасйсе о£ Рйагшаеу, 19* Εάίΐίοη, Оеииаго, Εά., Маск РиЬЙ8Й1п§ Со., Еа81оп, РА 1995, которое представляет собой руководство по приготовлению форм, известных обычному специалисту в данной области.
Фармацевтическую композицию, включающую молекулу согласно настоящему изобретению, можно вводить субъекту при риске возникновения или после выявления вышеописанной патологии, используя стандартные способы введения, включая пероральное, внутривенное, внутрибрюшинное, подкожное, легочное, трансдермальное, внутримышечное, интраназальное, защечное или подъязычное введение, или введение с использованием суппозиториев. Предпочтительно молекулу согласно настоящему изобретению можно вводить субъекту при риске возникновения или после выявления патологии, как описано в настоящем изобретении, путем подкожного введения.
Фармацевтическая композиция по изобретению предпочтительно содержит терапевтически эффективное количество или профилактически эффективное количество молекулы по изобретению. Терапевтически эффективное количество означает эффективное количество, дозировки и период времени, необходимые для достижения желаемого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество молекулы можно изменять в соответствии с такими факторами, как состояние болезни, возраст, пол и вес индивидуума и способность молекулы приводить к желаемому ответу у индивидуума. Терапевтически эффективным количеством является также такое количество, при котором любые терапевтически благоприятные эффекты перевешивают токсический или нежелательный эффект молекулы. Профилактически эффективное количество означает эффективное количество, дозировки и период времени, необходимые для достижения желаемого профилактического результата. Обычно, поскольку профилактическая доза используется у субъекта до начала или на более раннем этапе заболевания, профилактически эффективное количество будет меньшим, чем терапевтически эффективное количество.
Терапевтически эффективное или профилактически эффективное количество является, по меньшей мере, минимальной дозой, меньшей, чем токсичная доза активного агента, которую необходимо ввести субъекту для достижения благоприятного терапевтического действия. В соответствии с другим определением терапевтически эффективное количество молекул согласно настоящему изобретению - это количество, которое снижает активность пептида Αβ у млекопитающих, предпочтительно у людей, например, путем связывания пептида Αβ в случаях, когда присутствие пептида Αβ вызывает или способствует нежелательным патологическим эффектам или уменьшает количество самого пептида Αβ, оказывая на млекопитающее, предпочтительно человека, благоприятное терапевтическое действие.
Способ введения молекул согласно настоящему изобретению может быть пероральным, парентеральным, ингаляционным или местным. Предпочтительно антитела по изобретению можно вводить в фармацевтическую композицию, подходящую для парентерального введения. Термин парентеральный в настоящем изобретении включает внутривенное, внутримышечное, подкожное, ректальное, вагинальное или внутрибрюшинное введение. Предпочтительной является периферическая системная доставка путем внутривенной или внутрибрюшинной или подкожной инъекции. Подкожная инъекция является наиболее предпочтительной. Подходящие инструменты для таких инъекций широко известны в данной области техники.
Фармацевтическая композиция обычно должна быть стерильной и стабильной при условиях производства и хранения в предусмотренном контейнере, включая, например, запечатанный флакон или шприц. Следовательно, после получения формы фармацевтические композиции, возможно, подвергают стерильной фильтрации или делают приемлемыми с точки зрения микробиологии или иным способом. Типичная композиция для внутривенного вливания может иметь в составе до 250-1000 мл жидкости, такой как стерильный раствор Рингера, физиологический раствор, раствор декстрозы и раствор Хэнка, и терапевтически эффективную дозу терапевтического агента (например, от 1 до 100 мг/мл или более) для
- 10 020979 доставки указанных ниже типичных доз. Доза может изменяться в зависимости от типа и тяжести заболевания. Как хорошо известно в медицине, дозировка для любого субъекта зависит от многих факторов, включая размер пациента, площадь поверхности тела, возраст, конкретное вводимое соединение, пол, время и способ введения, общее состояние здоровья и другие применяемые параллельно лекарства. Типичная дозировка может быть, например, в диапазоне от 0,001 до 1000 мкг; тем не менее, предусмотрены дозировки ниже или выше этого примерного диапазона, особенно с учетом вышеупомянутых факторов. При режиме ежедневного парентерального введения дозировка может составлять от примерно 0,1 мкг/кг до примерно 100 мг/кг общей массы тела, предпочтительно от примерно 0,3 мкг/кг до примерно 10 мг/кг и более предпочтительно от примерно 1 мкг/кг до 1 мг/кг, еще более предпочтительно от примерно 0,5 до 10 мг/кг массы тела в день. Прогресс можно отслеживать путем периодической оценки. Для регулярного введения в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, введение повторяют, пока не произойдет желаемое подавление симптомов болезни. Тем не менее, настоящее изобретение не исключает других режимов дозирования, которые можно применять. Желаемую дозу можно доставлять путем однократного болюсного введения, многократного болюсного введения или путем непрерывной инфузии молекулы в зависимости от профиля фармакокинетики разложения, которую врач хочет получить.
Предложенные количества молекул согласно настоящему изобретению можно варьировать в зависимости от терапевтической необходимости. Ключевым фактором при выборе подходящей дозы и планировании является полученный результат. Факторы для рассмотрения в этом контексте включают конкретное расстройство, которое лечат, конкретное млекопитающее, подвергающееся лечению, клиническое состояние конкретного пациента, причину расстройства, место доставки антитела, конкретный тип антитела, способ введения, расписание введения и другие факторы, известные в медицинской практике.
Терапевтические агенты согласно изобретению для хранения можно замораживать или лиофилизировать и восстанавливать перед использованием в пригодном стерильном носителе. Лиофилизация и восстановление могут привести к варьирующей потере активности антитела. Соответственно возможна корректировка дозировок.
Следующие примеры приведены с целью иллюстрации, но не ограничения настоящего изобретения. В приведенных ниже примерах используются, среди прочих, моноклональное антитело мыши, названное 266 (т266), которое первоначально получили в результате иммунизации мыши пептидом, образованным остатками 13-28 пептида Αβ человека, и РаЬ-фрагмент моноклонального антитела мыши 266 (т266РаЬ). Подтверждено, что антитело обладает иммунореактивностью в отношении данного пептида. Получение т266 было описано ранее. Для ковалентного присоединения молекулы ПЭГ к т266-РаЬ РаЬ можно модифицировать с введением остатка цистеина в СЭР2 (N566.') вариабельной области тяжелой цепи и ПЭГилирования показанным ниже способом (пример 4). Поскольку примеры описывают эксперименты, проведенные на системах с использованием мышей, необходимо использование моноклональных антител мыши. Тем не менее, в способах лечения по настоящему изобретению, предназначенных для использования у человека, предпочтительны гуманизированные формы антител согласно настоящему изобретению или их фрагменты. В примерах, ниже, 1А1-РаЬ относится к гуманизированному фрагменту антитела РаЬ, который включает ЬСУК §ЕЦ ГО N0: 1 и НСУК §ЕЦ ГО N0: 2.
Пример 1. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики т266-РаЬ ПЭГ при подкожном введении мышам ΡΌΑΕΡ.
Для исследования фармакокинетики/фармакодинамики в плазме антитела и комплекса антитело/пептид Αβ использовали молодых (3-месячных) трансгенных мышей ΡΌΑΡΡ. Исследованные антитела включали 266 РаЬ (т266-РаЬ) мыши, т266-РаЬ+5 кДа ПЭГ, т266-РаЬ+10 кДа ПЭГ, т266-РаЬ+20 кДа ПЭГ и полноразмерное антитело т266 1§С. Мышам ΡΌΑΡΡ+/- подкожно вводили 1 мг/кг антитела и затем в следующие моменты времени отбирали плазму крови: 1, 4, 8, 24, 48, 96, 168 и 240 ч спустя после введения. Животных, получавших антитело т266-РаЬ, анализировали в дополнительных ранних временных точках отбора плазмы из-за быстрого разложения этой молекулы. Точки отбора для т266-РаЬ были спустя 1, 4, 8, 12, 16, 24 и 48 ч после введения. В общей сложности на антитело в один момент времени анализировали по пять животных. Цельную кровь получали путем прокола сердца иглами 23 размера, надетыми на 1СС шприцы, предварительно промытые 0,5 М ЭДТА. Образцы крови во время процедуры выделения держали на ледяной бане и затем центрифугировали при 14000 об/мин в охлаждающей центрифуге при 4°С в течение 15 мин. Полученные образцы плазмы аликвотировали и хранили при -80°С.
А. Методология анализа фармакокинетики РаЬ.
Концентрацию РаЬ в плазме определяли методом захвата антигена в твердофазном ИФА. Вкратце, планшеты в течение ночи при 4°С или 1 ч при 37°С покрывали конъюгатом Αβ-БСА, затем блокировали с помощью казеинового буфера Пирке. В планшеты вносили стандарты, контрольные и анализируемые образцы и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Для обнаружения использовали конъюгированные с ΗΚΡ Αβ козы к иммуноглобулинам мыши, а колориметрический ответ получен с субстратом 0ΡΌ. Планшеты сканировали при оптической плотности А493 относительно А700. Концентрацию иммунореактивных молекул в образцах плазмы определяли по стандартным кривым, полученным с известно- 11 020979 го количества т266 РаЬ в плазме крови мыши, используя 4/5-параметрический алгоритм. Анализируемый диапазон составлял для т266 РаЬ от 0,05 до 0,5 мкг/мл. Диапазон для ПЭГилированных РаЬ составлял от 0,075 до 0,8 мкг/мл.
Концентрацию иммунореактивных молекул в образцах плазмы определяли по стандартным кривым, полученным с известного количества т266 РаЬ в плазме крови мыши, используя 4/5параметрический алгоритм. Анализируемый диапазон составлял для т266 РаЬ от 0,05 до 0,5 мкг/мл. Диапазон для ПЭГилированных РаЬ составлял от 0,075 до 0,8 мкг/мл. Результаты ясно демонстрировали, что добавление молекулы ПЭГ и увеличение размера молекулы ПЭГ увеличивает удерживание ПЭГилированных РаЬ в плазме (2545 нг/мл спустя 8 ч для 20 кДа ПЭГилированного т266-РаЬ) по сравнению с не-ПЭГилированным т266-РаЬ (350 нг/мл спустя 8 ч).
В. Твердофазный ИФА-тест на т266 к Αβ.
Для измерения количества пептида Αβ в плазме в отсутствие или в присутствии терапевтического антитела (полноразмерного или РаЬ-фрагмента) разработали и использовали твердофазные ИФА-тесты. Измеряемые в этих тестах пептиды Αβ представляли собой полноразмерный Αβ1-40 или Αβ1-42. 96луночные планшеты для твердофазного ИФА 1тти1оп 4НВХ (ТЬегтоЬаЬ8у81ет8) в течение ночи покрывали при 4°С захваченным за С-конец антителом (т2С3 для планшета Αβ40 или т21Р12 для планшета Αβ42) в 10 мкг/мл в фосфатно-солевом буфере (ФСБ, 100 мкл на 1 лунку). Тестовый планшет закрывали для предохранения испарения во время инкубации в течение ночи. На следующий день из лунок удаляли раствор и лунки 3 раза промывали ФСБ (400 мкл на 1 лунку) с помощью промывочного устройства для 96-луночных планшетов ЬаЬ8у81ет8. Добавляли блокирующий буфер (360 мкл 1% молочно-ФСБ) и инкубировали планшеты при 37°С в течение 1 ч. Образцы подготавливали путем растворения плазмы в растворителях, получая следующее: 20% плазма, 0,5 М гуанидин, 5 мМ Тп5 рН 8,0, 0,5Х коктейль ингибиторов протеаз, 25 мкг/мл т266 и ФСБ. Объем использованной в тесте плазмы в определенный момент может нуждаться в уменьшении из-за высоких уровней присутствующего пептида Αβ, и в этих случаях остаточный объем плазмы корректировали плазмой крысы (конечный объем поддерживали на уровне 20%). Стандарты пептида Αβ с концентрацией, варьирующей от 250 до 3,9 пг/мл, получали в стандартном растворителе (20% плазмы крысы, 0,5 М гуанидин, 5 мМ ТгЕ рН 8,0 и 0,5Х полностью свободный от ЭДТА коктейль-ингибитор протеаз (КосЬе П1адпо811С8), 25 мкг/мл т266 и ФСБ). Добавление 25 мкг/мл интактного т266 в образцы и стандартные растворители требуется для того, чтобы нейтрализовать любое негативное влияние, которое могут оказывать в тесте уровни вариабельности центральных доменов антител. После блокировки планшеты 4 раза промывали ФСБ. Образцы и стандарты в трех повторах загружали на планшеты (100 мкл на 1 лунку), планшеты закрывали и сутки инкубировали при 4°С. На следующее утро планшеты 4 раза промывали ФСБ-Т (ФСБ+0,05% Тгееп-20) и в лунки на 2 ч при комнатной температуре добавляли биотинилированное вторичное антитело ιη3Ό6 (100 мкл на 1 лунку, разбавляли 0,5% БСА/ФСБ-Т). Затем планшеты 4 раза промывали ФСБ-Т, инкубировали с конъюгатом стрептавидин-поли-НКР (1:5000 в 0,5% БСА/ФСБ-Т) в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Планшеты 4 раза промывали ФСБ-Т и добавляли в лунки по 100 мкл субстрата ТМВ (§1§та). Развитие окрашивания отслеживали при 650 нм спустя 15, 30 и 60 мин.
Таблица 1
Результаты фармакодинамики: средняя концентрация в плазме Αβ 40 (пг/мл)
| Время (ч) | тп2 66 ГаЬ | т266 ГаЬ+5 кДа ПЭГ | т266 ГаЬ+10 кДа ПЭГ | т266 ЕаЬ+20 кДа ПЭГ | Исходное т26б |
| 1 | 246, 7 | 253, 5 | 178, 4 | 196, 3 | 223,7 |
| 4 | 498,8 | 693,2 | 898, 1 | 816, 6 | 1110 |
| 8 | 576, 7 | 997, 8 | 1011 | 1259 | 1852 |
| 12 | 530, 9 | ||||
| 18 | 344,1 | ||||
| 24 | 181,2 | 914,7 | 1728 | 2966 | 6919 |
| 48 | 200, 1 | 789, 6 | 2642 | 8557 | |
| 96 | 79, 1 | 104, 8 | 329,3 | 10792 | |
| 168 | 62, 64 | 76, 49 | 143,3 | 9923 | |
| 240 | 50, 14 | 98, 24 | 101,2 | 6114 |
В дополнение к более гибкому режиму дозирования, который можно менять в зависимости от размера ПЭГ, результаты демонстрируют, что комплекс антигена с ПЭГилированным РаЬ не накапливается в плазме на протяжении продолжительного времени подобно интактному антителу (интактному т266). Интактное антитело продлевает период полураспада антитела в плазме и приводит к циркуляции комплекса антиген/антитело в плазме на протяжении продолжительного времени (>240 ч). Исходный РаЬ (т266 РаЬ), с другой стороны, имеет быструю скорость выведения и короткий период полураспада (<24 ч), который ограничивает их применение в терапии. Наоборот, как показано в табл. 1, ПЭГилированные РаЬ дают молекулу антитела с фармакокинетикой и фармакодинамикой, которая позволяет улучшить режим дозировки.
- 12 020979
Пример 2. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики 1А1-РаЬ ПЭГ на мышах ΡΌΆΡΡ.
Для исследования фармакокинетики/фармакодинамики в плазме антитела и комплекса антителопептид Αβ использовали молодых (3-месячных) трансгенных мышей ΡΌΑΡΡ. Исследованные антитела включали гуманизированные 1А1-РаЬ, 1А1-РаЬ+5 кДа ПЭГ, 1А1-РаЬ+10 кДа ПЭГ и 1А1-РаЬ+20 кДа ПЭГ. Мышам ΡΌΑΡΡ+/- подкожно вводили 1 мг/кг антитела и затем в определенные моменты времени отбирали плазму крови в зависимости от типа введенного антитела. Для различных антител использовали следующие моменты времени:
1А1-РаЬ - кровь брали спустя 1, 4, 8, 12, 18, 24 и 48 ч после введения;
1А1-РаЬ+5 кДа ПЭГ - кровь брали спустя 1, 4, 8, 24, 48, 96 и 168 ч после введения;
1А1-РаЬ+10 кДа ПЭГ - кровь брали спустя 1, 4, 8, 24, 48, 96 и 168 ч после введения;
1А1-РаЬ+20 кДа ПЭГ - кровь брали спустя 1, 8, 24, 48, 96, 168 и 240 ч после введения.
В общей сложности на антитело в один момент времени анализировали по пять животных. Полученные образцы плазмы аликвотировали и хранили при -80°С.
A. Методология анализа фармакокинетики РаЬ.
Концентрацию 1А1 РаЬ в плазме определяли с использованием твердофазного сэндвич-ИФА. Планшеты покрывали антителами козы к κ-цепи 1§О человека; в планшеты вносили стандарты, контрольные и анализируемые образцы и затем инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Для обнаружения использовали антитела козы к 1§О человека, добавляя ΟΡΌ для колориметрического ответа. Планшеты сканировали при оптической плотности А493 по отношению к А700.
Концентрацию в образцах плазмы определяли по стандартным кривым, полученным с известного количества 1А1 РаЬ в плазме крови мыши, используя 4/5-параметрический алгоритм; анализируемый диапазон для РаЬ и РаЬ-ПЭГ 5 кДа составлял от 0,003 до 0,3 мкг/мл; для РаЬ-ПЭГ 10 кДа составлял от 0,006 до 0,2 мкг/мл и от 0,04 до 0,4 мкг/мл; для РаЬ-ПЭГ 20 кДа составлял от 0,02 до 0,4 мкг/мл и от 0,04 до 0,4 мкг/мл. Результаты ясно демонстрировали, что добавление молекулы ПЭГ и увеличение размера молекулы ПЭГ увеличивает удерживание ПЭГилированных РаЬ в плазме (77 нг/мл спустя 96 ч для 20 кДа ПЭГилированного 1А1 РаЬ) по сравнению с не-ПЭГилированным 1А1 РаЬ (не обнаруживается спустя 24 ч).
B. Твердофазный ИФА тест на 1А1 Ав.
Твердофазный ИФА был, по существу, таким же, как и описанный выше для т266. Образцы подготовили путем растворения плазмы в растворителях, получая следующее: 20% плазма, 0,5 М гуанидин, 5 мМ ТгЬ рН 8,0, 0,5Х коктейль ингибиторов протеаз, 20 мкг/мл 1А1 и ФСБ. Измеряемые в этих тестах пептиды Ав представляли собой полноразмерный Ав 1-40 или Ав 1-42. Развитие окрашивания отслеживали при 650 нм спустя 15, 30 и 60 мин. Результаты представлены в табл. 2 ниже.
Таблица 2
Результаты фармакодинамики: средняя концентрация в плазме Ав 40 (пг/мл)
| Время Ν) | 1А1 ГаЬ | 1А1 ЕаЬ+5 рД& ПЭГ | 1А1 ГаЬ+10 кДа ПЭГ | 1А1 ЕаЪ+20 кДа пэг |
| 1 | 136, 8 | 117, 1 | 116, 3 | 111,2 |
| 4 | 153, 6 | 208,2 | 281, 6 | |
| 8 | 96,65 | 198,4 | 406, 3 | 529, 2 |
| 12 | 131, 9 | |||
| 18 | 105, 9 | |||
| 24 | 114,7 | 133, 6 | 585,1 | 1243 |
| 48 | 106, 8 | 95,12 | 170, 7 | 642 |
| 96 | 88,48 | 113, 7 | 177,9 | |
| 168 | 93, 96 | 110, 8 | 125, 4 | |
| 240 | 200 |
Аналогично случаю т266 РаЬ в примере 1 данные из табл. 2 демонстрируют, что гуманизированные РаЬ с ковалентно присоединенной молекулой ПЭГ также обеспечивают идеальный профиль ФК/ФД, учитывающий гибкий режим дозировки для предотвращения накопления комплекса антитело-антиген в кровотоке в течение длительного времени.
Пример 3. Очистка антитела мыши 266 и гуманизированных аналогов 1А1 РаЬ.
Супернатанты из культуры клеток, трансфицированных генами 266 РаЬ мыши или гуманизированного 1А1 РаЬ и аналогов, очищали с использованием двухэтапной хроматографии, состоящей из катионобменной хроматографии и эксцизионной хроматографии на смоле 8ирегйех 75 (ОЕ НеаПЪеаге). По окончании очистки культуральный супернатант концентрировали с использованием ТРР и диализировали против 20-кратного избыточного объема 10 мМ ацетата натрия рН 5 в течение ночи при 4°С. Осадок удаляли центрифугированием и супернатант проводили через слой 8Ρ сефарозы (ОЕ НеаПЪеаге), заряженный 10 мМ ацетатом натрия рН 5. Колонки промывали 10 мМ ацетатом натрия рН 5, содержащим последовательно возрастающее количество ЫаС1 до тех пор, пока элюировался РаЬ-фрагмент, приблизи- 13 020979 тельно от 90 до 110 мМ ЫаС1. Содержащие активный РаЬ-фракции определяли и собирали вместе. Уменьшали объем и заменяли буфер (ФСБ) при помощи центрифужного концентрирующего устройства (МбРроте). Конечный объем доводили до 13 мл и загружали на разделяющие по размеру колонки §иретбех 75. Содержащие РаЬ-фрагмент фракции элюировали примерно при 50 кДа, определяли и собирали вместе для дальнейшего исследования и ПЭГ илирования.
Пример 4. ПЭГилирование и исследование ίη νίίτο.
Цистеин Ы56С в очищенном из культуры клеток фрагменте 1А1-РаЬ блокировали для ПЭГилирования. Для избирательного восстановления цистеина N560.’ использовали бусины Иетее'к КебисеЛММ™. Восстанавливающие бусины извлекали из колонки, поставляемой производителем, и использовали в периодическом режиме. Бусины (~4 мл) сначала активировали 8 мл 10 мМ ΌΤΤ в буфере Кебисе-1ММ ЕсциНЬгайоп #1 (фосфат натрия + ЭДТА, рН 8,0) в течение 30 мин. Бусины затем 3 раза промывали ФСБ. К бусинам добавляли 18 мл 1А1 N560 РаЬ в ФСБ рН 7,4 (1,7 мг/мл) и к смеси добавляли 10 мМ ЭДТА. Смесь перемешивали вращением и оставляли при комнатной температуре на 4-5 ч. От бусин отделяли РаЬ, используя разделитель смолы Напбее™, бусины промывали ФСБ. Фракции смыва и РаЬ объединяли и обрабатывали 5-кратным мольным избытком ПЭГ-малеимида (20 кДа ПЭГ от NΟР; 10 кДа ПЭГ от 8ипЬю; 5 кДа ПЭГ от №Пат) в течение 1 ч. Реакционную смесь диализовали против 4 л буфера 10 мМ ацетата натрия рН 5,0 так, чтобы РаЬ и РаЬ-ПЭГ можно было удержать на колонке с 8Р сефарозой, которую уравновешивали 10 мМ буфером ацетата натрия рН 5,0. Непрореагировавшие РаЬ и РаЬ-ПЭГ элюировали в градиенте соли. Их элюировали при концентрации №С1 от 50 до 70 мМ. Белок далее очищали путем эксцизионной хроматографии (колонки §иретбех75, ОБ НеаИйсате) с ФСБ в качестве подвижной фазы. Масштабировали в сторону увеличения или уменьшения объема. Аналогичные способы можно использовать для получения ПЭГилированного антитела мыши 266 РаЬ N560
Для подтверждения присоединения к РаЬ молекулы ПЭГ образцы исследовали путем эксцизионной хроматографии. Эксцизионную хроматографию проводили на колонках ΤδΚ О3000Р\У ХЬ (ΤοκοΡ ВюксЕ епсе). Колонки прогоняли со скоростью 0,5 мл/мин ФСБ и 0,35 М №С1 (рН 7,4), используя серию аналитической ВЭЖХ ЛдПеШ НР1100, работающую при 214 нм. Кроме того, образцы проанализировали путем δΌδ-ПААГ. На 4-12% ШРаде® гель с Βίκ-Ττίκ загружали 10 мкг очищенного материала и окрашивали с помощью 81шр1уВ1ие™ 5>аГе5>1аит
Пример 5. Измерение кинетических констант методом В1асоте.
Для измерения кинетики связывания также использовали прибор В1асоте® 2000. В1асоте® использует оптические свойства поверхностного плазмонного резонанса для обнаружения изменения концентрации взаимодействующих молекул белка в пределах декстрановой биосенсорной матрицы. Кроме отмеченных, все реагенты и материалы приобретались в В1асоте® АВ (Ирка1а, Елтебеп). Все измерения проводили при 25°С. Образцы растворяли в буфере НВ8-ЕР вещества (150 мМ хлорид натрия, 3 мМ ЭДТА, 0,005% (мас./об.) поверхностно-активного вещества Р-20 и 10 мМ НЕРЕ8, рН 7,4). Антитела козы к κ-цепи человека иммобилизировались на клетках от 1 до 4 на сенсорном чипе СМ5 на уровне 8000 единиц ответа (ЕО) с использованием связывающего амины набора.
Связывание оценивали с использованием множественных циклов анализа. Каждый цикл проводили при скорости течения 50 мкл/мин, и он состоял из следующих этапов: инъекция ~20 мкл связывающей антитело композиции при 10 мкг/мл, приводящая к захвату 400-500 ЕО, инъекция 250 мкл пептида Αβ человека (1-40) (начиная с 200 нМ и используя двукратные последовательные разбавления для каждого цикла), затем 20 мин для диссоциации и регенерация с использованием ~30 мкл 10 мМ гидрохлорида глицина рН 1,5. Скорости ассоциации и диссоциации для каждого цикла оценивали с использованием модели 1:1 (Лэнгмюровского) связывания с помощью программного обеспечения ΒIΑеνа1иаί^οη. Результаты показывают, что ПЭГилирование в сайте №6С имеет небольшое влияние на аффинность РаЬ к Αβ пептиду человека.
Пример 6. Измерение константы равновесия методом ΚίηΕχΑ.
Анализ ΚίηΕχΑ использовали как независимый подход к измерению аффинности связывания путем равновесного анализа из-за медленной скорости разложения комплекса антигена и РаЬ. Для измерения кинетики связывания использовали прибор ΚίηΕχΑ 3000 (8ар1бупе Ιηκί 1пс.). Вкратце, антиген ковалентно связывали с бусинами из сефарозы, на приборе обнаруживали связывание свободных РаЬ/РаЬ-ПЭГ с бусинами. Для измерения ΚΒ отдельные пробирки, содержащие РаЬ/РаЬ-ПЭГ (20 или 500 пМ для 1Α1РаЬ-20 кПЭГ, 5 или 50 пМ для 1А1 РаЬ) с серийно разбавленным антигеном - растворимым пептидом Αβ человека (1-40) (0-10 нМ) инкубировали в течение 30-50 ч при 37°С в содержащем 1 мг/мл БСА ФСБ для гарантированного достижения равновесия. После инкубации в каждом равновесном образце на ΚίηΕχΑ 3000 определяли величину свободного РаЬ/РаЬ-ПЭГ в соответствии с инструкциям изготовителя. Величины ΙΟ, определяли путем п-Сигте анализа кривых с использованием программного обеспечения ΚίηΕχΑ 3000. Результаты показали, что 1А1 РаЬ хорошо связывается с пептидом Αβ человека (19 пМ) с аффинностью ~10-кратно выше по сравнению с 266 РаЬ мыши (240 пМ). Кроме того, ковалентное присоединение 20Κ ПЭГ в сайте №6С не имеет влияния на аффинность 1А1-РаЬ (12 пМ).
- 14 020979
Пример 7. Тест на связывание белка-предшественника амилоида (ΑΡΡ) с помощью твердофазного клеточного ИФА.
Для оценки перекрестной реактивности 266 ΡаЬ/тΑЬ с белком-предшественником ΑΡΡ использовали стабильно экспрессирующие ΑΡΡ клетки НЕК 293 (аминокислоты 1-751). Эти клетки получили путем клонирования гена ΑΡΡ (1-751) в плазмиду, содержащую маркер устойчивости к неомицину. Рекомбинантной плазмидой трансфицировали клетки НЕК 293 и отбирали трансфектантов при 200 мкг/мл 0418 для получения стабильно экспрессирующей клеточной линии. Для теста на связывание в каждую лунку покрытого ΡΌΕ 96-луночного планшета помещали 75000 клеток ΑΡΡ 751. После инкубации в течение 2 дней в ростовой среде (ΌΜΕΜ Р12, 5% РВ8, 10 мМ Нерек рН 7,5, 200 мкг/мл 0418) жидкость удаляли и добавляли 20 мкг/мл РаЬ или тΑЬ в ФСБ (с Са/Мд), содержащем 10 мг/мл БСА. Связывание продолжалось 2 ч при 4°С, клетки трехкратно промывали 10 мг/мл БСА. В ФСБ/БСА (^иФет Вю1есй) добавляли вторичное антитело (антитело к к легкой цепи, конъюгированное с пероксидазой хрена (Ьгр)), специфичное к легким цепям человека или мыши. Для антител к легкой цепи человека использовали разбавление 1:5000 в ФСБ/БСА и 1:2000 для легкой цепи мыши. После 1 ч инкубации при 4°С клетки пятикратно промывали ФСБ/БСА. После добавления субстрата ТМВ в течение 10 мин измеряли активность Нгр как функцию от связывания ΡаЬ/тΑЬ и ΑΡΡ. Реакционную смесь переносили на чистый 96-луночный планшет и измеряли оптическую плотность при 650 нм. Данные показали, что ПЭГилированные (5, 10 и 20 кДа) 1Α1-Ρ^ и ш266-РаЬ проявляют избирательность к Αβ-пептиду по отношению к ΑΡΡ.
- 15 020979
Перечень последовательностей <ιιο> эли лилли энд компани
БЕЙЛЗ, Келли Р.
Бьюмол, Томас Ф.
Чоу, Чи-Кин Дематтос, Рональд В.
Хансен, Райан Кучибхолта, Ума Лу, Жиронг МахДоннел, Питер <120> ПЭГИЛИРОВАННЫЕ ГАВ-ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДУ А&
<130> Х17087 <150> иБ 60/885439 <151> 2007-01-18 <160> 14 <170> Патентная версия 3*4 <2Ю> 1 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>
<223> синтетическая конструкция <400> 1
Азр Не Уа1 Нес ТЬг С1п ТЬг Рго Ьеи Зег Ьеи Бег Уа1 ТЬг Рго С1у 15 10 15
С1п Рго А1а Зег Пе Бег Суз Зег Бег Зег С1п Бег Ьеи Не Туг Зег 20 25 30
Азр С1у Азп А1а Туг Ьеи Н1з Тгр Туг Ьеи С1п Ьуз Рго С31у С1п Зег <40
- 16 020979
| Рго | О1п 50 | Ьеи | Ьеи | 11е | Туг | Ьуз Уа1 55 | Зег | Азп | Агд | РЬе 60 | 5ег | С1у | Уа1 | Рго | |
| Азр | Агд | РЬе | Зег | 31у | Зег | С1у | Зег | О1у | ТЬг | Азр | РЬе | ТЬг | Ьеи | Ьуз | 11е |
| 65 | 70 | 75 | 80 | ||||||||||||
| Зег | Агд | Уй1 | С1и | А1а | О1и | Азр | ν&ι | 01у | Уа1 | Туг | Туг | Суз | ТЬг | С1п | Зег |
| 65 | 90 | 95 | |||||||||||||
| ТЬг | ΗΪ5 | Зег | Рго | Тгр | ТЬг | РЬе | С1у | С1у | С1у | ТЬг | Ьуз | Уа1 | С1и | Пе | Ьуз |
100 105 110 <210> 2 <211> 112 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>
| <223> | синтетическая конструкция |
| <400> | 2 |
| С1и Уэ1 1 | С1п Ьеи Уа1 С1и Зег О1у Е1у С1у Ьеи Уа1 Ьуз Рго С1у С1у 5 10 15 |
| Зег Ьеи | Агд Ьеи Зег Суз А1а А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе Зег Агд Туг 20 25 30 |
| Зег Ме£ | Зег Тгр Уа1 Агд СЬп АЬа Рго С1у Ьуз С1у Ьеи СЬи Тгр Уа1 35 40 45 |
| С1у 01п 50 | Ые Азп 11е Агд С1у Суз Азп ТЬг Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа1 55 60 |
- 17 020979
| Ьуз С1у 65 | Агд | РНе | ТЬг | Не 70 | Зег | Агд | Азр | Азр | Зег 75 | Ьуз | Азп | ТЬг | Ьеи | Туг 80 |
| Ьеи С1п | МеЬ | Азп | 5ег | Ьеи | Ьуз | ТЬг | СЬи | Азр | ТЬг | А1а | Уа1 | Туг | Туг | Суз |
| 85 | 90 | 95 | ||||||||||||
| ТЬг ТЬг | С1у | Азр | РЬе | Тгр | С1у | С1п | С1у | ТЬг | Ьеи | Уа1 | ТЬг | Уа1 | Зег | Зег |
| 100 | 105 | 110 | ||||||||||||
| <210> | 3 | |||||||||||||
| <211> | 112 | |||||||||||||
| <212> | БЕЛОК | |||||||||||||
| <213> | искусственная | |||||||||||||
| <220> | ||||||||||||||
| <223> | синтетическая конструкция | |||||||||||||
| <4 00> | 3 | |||||||||||||
| СЬи Уа1 | С1п | Ьеи | Уа1 | С1и | Зег | О1у | С1у | С1у | Ьеи | 7а1 | Ьуз | Рго | С1у | С1у |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||||||
| Зег Ьеи | Агд | Ьеи | Зег | Суз | А1а | А1а | Зег | С1у | Туг | ТЬг | РЬе | Зег | Агд | Туг |
| 20 | 25 | 30 | ||||||||||||
| Зег МеЬ | Зег | Тгр | Уа1 | Агд | С1п | А1а | Рго | С1у | Ьуз | 01у | Ьеи | С1и | Тгр | Уа1 |
| 35 | 40 | 45 | ||||||||||||
| С1у С1п | Не | Азп | 11е | Агд | С1у | Азп | АЗП | ТЬГ | Туг | Туг | Рго | Азр | ТЫ | Уа1 |
| 50 | 55 | 60 | ||||||||||||
| Ьуз С1у | Агд | РЬе | ТЬг | 11е | Зег | Агд | Азр | Азр | Зег | Ьув | Азп | ТЬг | Ьеи | Туг |
| 65 | 70 | 75 | 80 |
| Ьеи С1п МеЬ Азп Зег | Ьеи | Ьуг ТЬг С1и | Азр 90 | ТЬг | АЬа | УаЬ | Туг | Туг 95 | Суз | |
| 85 | ||||||||||
| ТЬг ТЬг | СЬу Авр РЬе | Тгр | СЬу СЬп СЬу | ТЬг | Ьеи | УаЬ | ТЬг | УаЬ | Зег | Зег |
| 100 | 105 | ЫО | ||||||||
| <210> | 4 | |||||||||
| <211> | 16 | |||||||||
| <212> | БЕЛОК | |||||||||
| <213> | Ьото заргепэ | |||||||||
| <400> | 4 | |||||||||
| Н13 Н15 | ; СЬп Ьуз Ьеи | УаЬ | РЬе РЬе АЬа | СЬи | Азр | УаЬ | СЬу | Зег | Азп | Ьуз |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
| <210> | 5 | |||||||||
| <211> | 15 | |||||||||
| <212> | БЕЛОК | |||||||||
| <213> | Ьото зар1епз | |||||||||
| <4ОО> | 5 | |||||||||
| Ηΐ5 С1г | ι Ьуз Ьеи УаЬ | РЬе | РЬе АЬа СЬи | Азр | УаЬ | СЬу | Зег | Азп | Ьуз | |
| 1 | 5 | 10 | 15 | |||||||
| <210> | 6 | |||||||||
| <2 11> | 16 | |||||||||
| <212> | БЕЛОК | |||||||||
| <21 3> | искусственная | |||||||||
| <220> | ||||||||||
| <223> | синтетическая конструкция | |||||||||
| <400> | 6 | |||||||||
| Зег Зег Зег СЬп Зег | Ьеи | Не Туг Зег | Азр | СЬу | Азп | АЬа | Туг | Ьеи | Нгз | |
| 1 | 5 | 10 | 15 |
- 19 020979
| <210> | 7 |
| <211> | 7 |
| <212> | БЕЛОК |
| <213> | искусственная |
| <220> | |
| <223> | синтетическая конструкция |
| <400> | 7 |
Ъуз Уа1 Зег Азп Агд РЬе Зег
| 1 | 5 |
| <210> | 8 |
| <211> | 9 |
| <212> | БЕЛОК |
| <213> | искусственная |
| <220> | |
| <223> | синтетическая конструкция |
| <4 00> | 8 |
ТЬг С1п Зег ТЬг Нхз Зег Рго Тгр ТЬг 1 5
| <210> | 9 |
| <211 > | 10 |
| <212> | БЕЛОК |
| <213> | искусственная |
| <220> | |
| <223> | синтетическая конструкция |
| <400> | 9 |
С1у Туг ТЬг РЬе Зег Агд Туг Зег МеЪ Зег 15 10
- 20 020979 <210> 10 <211> 16 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>
<223> синтетическая конструкция <400> 10
С1п Пе Азп Не Агд С1у Суэ Аэп ТНг Туг Туг Рсо Азр ТЬг \/а1 Ьуз 15 10 15 <210> 11 <211> 17 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>
<223> синтетическая конструкция <400> 11
С1п 11е Азп 11е Агд С1у Азп Азп ТЬг Туг Туг Рго Азр ТЬг Уа! Ьуз 15 10 15
С1у <210> 12 <211> 3 <212> БЕЛОК <213> искусственная <220>
<223> синтетическая конструкция <400> 12
С1у Азр РЬе
- 21 020979 <210> 13 <2И> 65?
<212> ДНК <213> искусственная <220>
<223> синтетическая конструкция
| <400> 13 дасаСсдССа | СдасСсадас | СссаССдСсс | ссдсес диа | сСссаддСса | ассадсССсС | 60 |
| аСССссСдСС | ссСссСссса | аНсЪССдаСс | СасСссдасд | дсаасдссса | сССдсасСдд | 120 |
| СассСдсаэа | адссСддСса | аСссссасаа | ССдссдассо | асааддЬССс | саасадассс | 180 |
| сссддсдссс | сСдасадасс | ссссддсссс | ддССссддСа | сСдасССсас | ССсдаадагс | 240 |
СссададССд аадсСдадда СдССддСдСС СасСасСдСа сСсадСссас СсаССсссса 300 сддасссссд дсддсддсас сааддссдад ассаададаа сСдссдсхдс сссасссдсс 360
| сссаеьсссс | сассаСссда | сдаасааССд | аадСсСддСа | сСдсССссдС | СдСССдСССд | 420 |
| ССдаасаасС | СсСасссаад | ададдсСаад | дЬСсадСдда | аддССдасаа | сдсСССдсаа | 480 |
| СссддСаасС | сссаадаагс | сдсрасСдад | саадасСсса | аддасСссас | ССассссссд | 540 |
| сссСссастС | СдасСССдЪс | сааддсСдаС | Сасдадаадс | асааддСССа | сдсССдСдад | 600 |
| дРСасасаСс | адддССС.дСс | сСссссадСС | асСаадСссС | Ссаасададд | ададСсс | 657 |
| <210> | 14 |
| <211> | 657 |
| <212> | ДНК |
| <213> | искусственная |
<220>
<223> синтетическая конструкция
- 22 020979
| <400> 14 даддггсадг | Едд^ГдазЪс | ЪддЬддЬдда | гЪддггаадс | сгддЬддССс | гггдадаггд | 60 |
| гссЬдЬдсгд | сггссддгга | сасгггсгсс | адаЬасгсса | гдгссгдддг | гадасаадсг | 120 |
| ссаддааадд | даггддадгд | ддггддгсаа | аЬсаасагса | даддггд^аа | сасггасгас | 180 |
| ссадасасгд | г^аадддаад | аЫсасгагс | ЬссададаБд | аегесаадаа | сасЬЫдгас | 240 |
| ыдсада1:да | асссссгдаа | аасСдаддас | аседегдггг. | ассассдгас | гасгддгдас | 300 |
| гъгьддддас | адддаасггг | ддССасгдгг | гссСссдсгг | сгасЬааддд | ассагссдгг | 360 |
| гггссаггдд | сгссаСссгс | гаадгсгасг | гссддЬддга | сгдегдеггг | дддаСдгггд | 420 |
| дггааддасг | асггсссада | дссадггасг | дгСЕсССдда | асгссддЕдс | гггдасггсг | 480 |
| ддгдггсаса | сЬССсссадс | Ьдггггдсаа | гсССссддгг | гдсасСссгг | дгссСссдгг | 540 |
| дггасгдгге | сасссгсг ее | сегдддгасг | садасггаса | геедгэаедг | гаэссасаад | 600 |
| ссагссааса | сЬааддггда | саадааддгг | даассааадг | ссЬсгдасаа | дасгсас | 657 |
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Claims (8)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Молекула, включающая РаЬ-фрагмент антитела, которая специфически связывает пептид Ав человека между аминокислотными положениями 13 и 28, где указанный РаЬ-фрагмент антитела содержит вариабельную область легкой цепи §ЕЦ ГО N0: 1 и вариабельную область тяжелой цепи §ЕЦ ГО N0: 2, где указанный РаЬ-фрагмент антитела ковалентно присоединен к молекуле полиэтиленгликоля (ПЭГ) в положении 56 §ЕЦ ГО N0: 2.
- 2. Молекула по п.1, где молекула ПЭГ имеет молекулярную массу от примерно 0,5 до примерно 30 кДа.
- 3. Молекула по п.1, где молекула ПЭГ имеет молекулярную массу примерно 20 кДа.
- 4. Фармацевтическая композиция для лечения или предотвращения состояний, при которых присутствие пептида Ав вызывает нежелательные патологические эффекты либо вносит вклад в их развитие или снижение активности пептида Ав оказывает терапевтическое полезное действие, включающая эффективное количество молекулы по любому из пп.1-3 и фармацевтически приемлемые растворитель, носитель и/или эксципиенты.
- 5. Применение молекулы по любому из пп.1-3 в получении лекарственного средства для лечения или предотвращения состояния, связанного с активностью пептида Ав.
- 6. Применение молекулы по любому из пп.1-3 в получении лекарственного средства для лечения или предотвращения состояния, выбранного из группы, состоящей из болезни Альцгеймера, синдрома Дауна, церебральной амилоидной ангиопатии (ЦАА), когнитивного расстройства, инсульта, кровоизлияния в мозг и общего снижения интеллектуальных способностей.
- 7. Применение по п.6, где болезнь Альцгеймера является доклинической болезнью Альцгеймера.
- 8. Применение по п.6, где болезнь Альцгеймера является клинической болезнью Альцгеймера.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US88543907P | 2007-01-18 | 2007-01-18 | |
| PCT/US2008/050554 WO2008088983A1 (en) | 2007-01-18 | 2008-01-09 | PEGYLATED Aβ FAB |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200970694A1 EA200970694A1 (ru) | 2010-02-26 |
| EA020979B1 true EA020979B1 (ru) | 2015-03-31 |
Family
ID=39332186
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200970694A EA020979B1 (ru) | 2007-01-18 | 2008-01-09 | ПЭГИЛИРОВАННЫЕ Fab-ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДУ Aβ |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8066999B2 (ru) |
| EP (2) | EP2842967B1 (ru) |
| JP (2) | JP5307030B2 (ru) |
| KR (2) | KR101414847B1 (ru) |
| CN (2) | CN101981053B (ru) |
| AR (1) | AR064944A1 (ru) |
| AU (1) | AU2008206555B2 (ru) |
| BR (1) | BRPI0806715A2 (ru) |
| CA (1) | CA2675847C (ru) |
| CL (1) | CL2008000121A1 (ru) |
| CY (2) | CY1116157T1 (ru) |
| DK (1) | DK2121754T3 (ru) |
| EA (1) | EA020979B1 (ru) |
| ES (2) | ES2535641T3 (ru) |
| HK (1) | HK1190623A1 (ru) |
| HR (2) | HRP20150237T1 (ru) |
| IL (2) | IL199838A (ru) |
| LT (1) | LT2842967T (ru) |
| MX (1) | MX2009007691A (ru) |
| PE (1) | PE20081634A1 (ru) |
| PL (1) | PL2121754T3 (ru) |
| PT (2) | PT2842967T (ru) |
| RS (1) | RS53948B1 (ru) |
| SI (2) | SI2121754T1 (ru) |
| TW (1) | TW200836763A (ru) |
| UA (1) | UA95996C2 (ru) |
| WO (1) | WO2008088983A1 (ru) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2009259901B2 (en) | 2008-06-20 | 2016-02-04 | Massachusetts Institute Of Technology | Immunoglobulins with reduced aggregation |
| ES2417781T3 (es) | 2008-06-20 | 2013-08-09 | Novartis Ag | Procedimientos para identificar regiones de unión a macromolécula y propensas a la agregación en proteínas y usos de los mismos |
| PT2437785E (pt) | 2009-06-04 | 2015-04-20 | Novartis Ag | Método de identificação de sítios para conjugação de igg |
| EA201201227A1 (ru) | 2010-03-03 | 2013-04-30 | Бёрингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Бипаратопные а-бета-связывающие полипептиды |
| JP6231263B2 (ja) * | 2012-07-17 | 2017-11-15 | 株式会社島津製作所 | アフィニティ支持体及びそれを用いた物質の捕捉方法 |
| US10431325B2 (en) | 2012-08-03 | 2019-10-01 | Novartis Ag | Methods to identify amino acid residues involved in macromolecular binding and uses therefor |
| WO2015036553A1 (en) * | 2013-09-16 | 2015-03-19 | Novo Nordisk Health Care Ag | Thiol functionalized polymers |
| KR20150133576A (ko) | 2014-05-20 | 2015-11-30 | 삼성전자주식회사 | 화학적 개질된 표적화 단백질 및 그의 이용 |
| WO2017079831A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | The University Of British Columbia | N-terminal epitopes in amyloid beta and conformationally-selective antibodies thereto |
| KR20180085736A (ko) | 2015-11-09 | 2018-07-27 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 아밀로이드 베타 중간-영역 내 에피토프 및 이에 대해 구조적으로 선택성인 항체 |
| CA3004498A1 (en) | 2015-11-09 | 2017-05-18 | Neil R. Cashman | Amyloid beta epitopes and antibodies thereto |
| TWI735600B (zh) | 2016-07-01 | 2021-08-11 | 美商美國禮來大藥廠 | 抗－N3pGlu類澱粉β肽抗體及其用途 |
| JP2019533426A (ja) | 2016-07-18 | 2019-11-21 | ザ・ユニバーシティ・オブ・ブリティッシュ・コロンビア | アミロイドベータに対する抗体 |
| JP6949102B2 (ja) | 2016-08-09 | 2021-10-13 | イーライ リリー アンド カンパニー | 併用療法 |
| US20180125920A1 (en) | 2016-11-09 | 2018-05-10 | The University Of British Columbia | Methods for preventing and treating A-beta oligomer-associated and/or -induced diseases and conditions |
| CA3070085A1 (en) | 2017-07-18 | 2019-01-24 | Promis Neurosciences Inc. | Antibodies to amyloid beta |
| US20210140980A1 (en) * | 2018-01-04 | 2021-05-13 | Septa Therapeutics, Inc. | Septapeptides associated with neurodegeneracy |
| TW202300518A (zh) | 2021-03-12 | 2023-01-01 | 美商美國禮來大藥廠 | 抗N3pGlu類澱粉β抗體及其用途 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004071408A2 (en) * | 2003-02-10 | 2004-08-26 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Aβ BINDING MOLECULES |
| WO2006040153A2 (en) * | 2004-10-13 | 2006-04-20 | Ablynx N.V. | Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease |
| US20060257396A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-11-16 | Jacobsen Jack S | Abeta antibodies for use in improving cognition |
Family Cites Families (52)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8308235D0 (en) | 1983-03-25 | 1983-05-05 | Celltech Ltd | Polypeptides |
| US5225539A (en) | 1986-03-27 | 1993-07-06 | Medical Research Council | Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies |
| US5278049A (en) * | 1986-06-03 | 1994-01-11 | Incyte Pharmaceuticals, Inc. | Recombinant molecule encoding human protease nexin |
| US5004697A (en) | 1987-08-17 | 1991-04-02 | Univ. Of Ca | Cationized antibodies for delivery through the blood-brain barrier |
| US5530101A (en) | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| US5753624A (en) * | 1990-04-27 | 1998-05-19 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Materials and methods for treatment of plaquing disease |
| US5445090A (en) | 1991-07-25 | 1995-08-29 | Mim Industries, Inc. | Interchangeable clamp for use in a sewing machine |
| US5766846A (en) * | 1992-07-10 | 1998-06-16 | Athena Neurosciences | Methods of screening for compounds which inhibit soluble β-amyloid peptide production |
| US5837672A (en) * | 1992-07-10 | 1998-11-17 | Athena Neurosciences, Inc. | Methods and compositions for the detection of soluble β-amyloid peptide |
| CA2115900A1 (en) | 1993-02-22 | 1994-08-23 | Gerald W. Becker | Pharmaceutical screens and antibodies |
| US5446090A (en) | 1993-11-12 | 1995-08-29 | Shearwater Polymers, Inc. | Isolatable, water soluble, and hydrolytically stable active sulfones of poly(ethylene glycol) and related polymers for modification of surfaces and molecules |
| JPH09511492A (ja) * | 1994-02-03 | 1997-11-18 | ザ ピコワー インスティテュート フォア メディカル リサーチ | アミロイドーシスの前進性グリコシル化終末産物仲介モジュレーション用組成物及び方法 |
| US5668651A (en) * | 1994-03-18 | 1997-09-16 | Sharp Kabushiki Kaisha | Polymer-wall LCD having liquid crystal molecules having a plane-symmetrical bend orientation |
| US6114133A (en) * | 1994-11-14 | 2000-09-05 | Elan Pharmaceuticals, Inc. | Methods for aiding in the diagnosis of Alzheimer's disease by measuring amyloid-β peptide (x-≧41) |
| US5688651A (en) | 1994-12-16 | 1997-11-18 | Ramot University Authority For Applied Research And Development Ltd. | Prevention of protein aggregation |
| US5932462A (en) | 1995-01-10 | 1999-08-03 | Shearwater Polymers, Inc. | Multiarmed, monofunctional, polymer for coupling to molecules and surfaces |
| US5786180A (en) | 1995-02-14 | 1998-07-28 | Bayer Corporation | Monoclonal antibody 369.2B specific for β A4 peptide |
| US6214966B1 (en) | 1996-09-26 | 2001-04-10 | Shearwater Corporation | Soluble, degradable poly(ethylene glycol) derivatives for controllable release of bound molecules into solution |
| US20040121415A1 (en) * | 1996-12-10 | 2004-06-24 | King David John | Monovalent antibody fragments |
| US6218506B1 (en) | 1997-02-05 | 2001-04-17 | Northwestern University | Amyloid β protein (globular assembly and uses thereof) |
| US6413940B1 (en) | 1997-02-07 | 2002-07-02 | Nymox Corporation | Pharmaceutically active agents that impede the formation of amyloid by impeding the genesis of DMS |
| US20020086847A1 (en) * | 1997-04-09 | 2002-07-04 | Mindset Biopharmaceuticals (Usa) | Recombinant antibodies specific for beta-amyloid ends, DNA encoding and methods of use thereof |
| DK0994728T3 (da) | 1997-04-09 | 2008-12-01 | Intellect Neurosciences Inc | Rekombinante antistoffer, som er specifikke for beta-amyloide ender, DNA, der koder derfor, samt fremgangsmåder til anvendelse heraf |
| US6787319B2 (en) * | 1997-04-16 | 2004-09-07 | American Home Products Corp. | β-amyloid peptide-binding proteins and polynucleotides encoding the same |
| US6227999B1 (en) | 1997-07-09 | 2001-05-08 | Transmisiones Tsp, S.A. De C.V. | Method and apparatus for operating a clutch in an automated mechanical transmission |
| IT1293511B1 (it) | 1997-07-30 | 1999-03-01 | Gentili Ist Spa | Anticorpi monoclonali catalitici ad attivita' proteasica per la lisi selettiva della componente proteica di placche e aggregati correlati |
| US6114113A (en) * | 1997-08-11 | 2000-09-05 | Chiron Corporation | High efficiency genetic modification method |
| US6448369B1 (en) | 1997-11-06 | 2002-09-10 | Shearwater Corporation | Heterobifunctional poly(ethylene glycol) derivatives and methods for their preparation |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| TWI239847B (en) * | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| ES2222689T3 (es) | 1998-03-12 | 2005-02-01 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Derivados del polietilenglicol con grupos reactivos proximales. |
| PT1078005E (pt) | 1998-05-21 | 2010-08-30 | Univ Tennessee Res Foundation | Processo de eleminação de amilóide usando anticorpos antiamilóide |
| DK1409654T3 (da) * | 1999-06-16 | 2008-12-08 | Boston Biomedical Res Inst | Immunologisk styring af beta-amyloid-niveauer in vivo |
| ATE283285T1 (de) | 1999-08-04 | 2004-12-15 | Univ Southern California | Globularer aufbau vom amyloid-beta- protein und deren verwendungen |
| ES2344189T3 (es) | 1999-09-03 | 2010-08-20 | RAMOT UNIVERSITY AUTHORITY FOR APPLIED RESEARCH & INDUSTRIAL DEVELOPMENT LTD. | Agentes, composiciones y metodos que los utilizan utiles en el tratamiento o la prevencion de la enfermedad de alzheimer. |
| US6294171B2 (en) | 1999-09-14 | 2001-09-25 | Milkhaus Laboratory, Inc. | Methods for treating disease states comprising administration of low levels of antibodies |
| ATE317868T1 (de) | 1999-12-22 | 2006-03-15 | Nektar Therapeutics Al Corp | Sterisch gehinderte derivate von wasserlöslichen polymeren |
| US6413507B1 (en) | 1999-12-23 | 2002-07-02 | Shearwater Corporation | Hydrolytically degradable carbamate derivatives of poly (ethylene glycol) |
| WO2001062801A2 (en) * | 2000-02-24 | 2001-08-30 | Washington University | Humanized antibodies that sequester amyloid beta peptide |
| US20020009445A1 (en) * | 2000-07-12 | 2002-01-24 | Yansheng Du | Human beta-amyloid antibody and use thereof for treatment of alzheimer's disease |
| ATE441663T1 (de) | 2000-09-06 | 2009-09-15 | Aventis Pharma Sa | Verfahren und zusammensetzungen für amyloidosis- verbundene krankheiten |
| US6436386B1 (en) | 2000-11-14 | 2002-08-20 | Shearwater Corporation | Hydroxyapatite-targeting poly (ethylene glycol) and related polymers |
| TWI255272B (en) | 2000-12-06 | 2006-05-21 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| ATE381346T1 (de) | 2001-08-17 | 2008-01-15 | Univ Washington | Assayverfahren für alzheimer-krankheit |
| AU2002329775C1 (en) * | 2001-08-17 | 2011-04-07 | Eli Lilly And Company | Assay method for alzheimer's disease |
| WO2003015691A2 (en) | 2001-08-17 | 2003-02-27 | Eli Lilly And Company | RAPID IMPROVEMENT OF COGNITION IN CONDITIONS RELATED TO A$g(b) |
| US20040241164A1 (en) * | 2001-08-17 | 2004-12-02 | Bales Kelly Renee | Use of antibodies having high affinity for soluble ab to treat conditions and diseases related to ass |
| US20040192898A1 (en) | 2001-08-17 | 2004-09-30 | Jia Audrey Yunhua | Anti-abeta antibodies |
| US7166478B2 (en) * | 2002-03-12 | 2007-01-23 | Enzo Life Sciences, Inc., C/O Enzo Biochem, Inc. | Labeling reagents and labeled targets, target labeling processes and other processes for using same in nucleic acid determinations and analyses |
| DE60325717D1 (de) | 2002-04-25 | 2009-02-26 | Lilly Co Eli | Verfahren zur behandlung von angststörungen bei älteren personen |
| WO2004060965A2 (en) * | 2002-12-31 | 2004-07-22 | Nektar Therapeutics Al, Corporation | Hydrolytically stable maleimide-terminated polymers |
| SI1639011T1 (sl) * | 2003-06-30 | 2009-04-30 | Domantis Ltd | Pegilirana protitelesa z enojno domeno (dAb) |
-
2008
- 2008-01-09 US US12/521,309 patent/US8066999B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-09 CN CN2008800026216A patent/CN101981053B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-09 ES ES08713652.9T patent/ES2535641T3/es active Active
- 2008-01-09 KR KR1020127003094A patent/KR101414847B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2008-01-09 KR KR1020097015076A patent/KR101160385B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2008-01-09 MX MX2009007691A patent/MX2009007691A/es not_active Application Discontinuation
- 2008-01-09 CN CN201310412048.9A patent/CN103479998B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-09 DK DK08713652.9T patent/DK2121754T3/en active
- 2008-01-09 PT PT141901629T patent/PT2842967T/pt unknown
- 2008-01-09 AU AU2008206555A patent/AU2008206555B2/en not_active Ceased
- 2008-01-09 SI SI200831378T patent/SI2121754T1/sl unknown
- 2008-01-09 WO PCT/US2008/050554 patent/WO2008088983A1/en active Application Filing
- 2008-01-09 SI SI200831733A patent/SI2842967T1/sl unknown
- 2008-01-09 PT PT87136529T patent/PT2121754E/pt unknown
- 2008-01-09 ES ES14190162.9T patent/ES2615454T3/es active Active
- 2008-01-09 EP EP14190162.9A patent/EP2842967B1/en active Active
- 2008-01-09 CA CA2675847A patent/CA2675847C/en not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-09 EP EP08713652.9A patent/EP2121754B1/en active Active
- 2008-01-09 EA EA200970694A patent/EA020979B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2008-01-09 RS RS20150252A patent/RS53948B1/en unknown
- 2008-01-09 PL PL08713652T patent/PL2121754T3/pl unknown
- 2008-01-09 BR BRPI0806715-5A patent/BRPI0806715A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2008-01-09 UA UAA200907146A patent/UA95996C2/ru unknown
- 2008-01-09 JP JP2009546461A patent/JP5307030B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2008-01-09 LT LTEP14190162.9T patent/LT2842967T/lt unknown
- 2008-01-11 TW TW097101232A patent/TW200836763A/zh unknown
- 2008-01-16 CL CL200800121A patent/CL2008000121A1/es unknown
- 2008-01-17 PE PE2008000153A patent/PE20081634A1/es not_active Application Discontinuation
- 2008-01-17 AR ARP080100214A patent/AR064944A1/es unknown
-
2009
- 2009-07-13 IL IL199838A patent/IL199838A/en not_active IP Right Cessation
-
2013
- 2013-06-26 JP JP2013133551A patent/JP5782479B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2014
- 2014-02-06 IL IL230876A patent/IL230876A/en not_active IP Right Cessation
- 2014-04-22 HK HK14103815.1A patent/HK1190623A1/zh not_active IP Right Cessation
-
2015
- 2015-03-02 HR HRP20150237AT patent/HRP20150237T1/hr unknown
- 2015-03-31 CY CY20151100312T patent/CY1116157T1/el unknown
-
2016
- 2016-12-08 HR HRP20161677TT patent/HRP20161677T1/hr unknown
-
2017
- 2017-01-24 CY CY20171100108T patent/CY1118554T1/el unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004071408A2 (en) * | 2003-02-10 | 2004-08-26 | Applied Molecular Evolution, Inc. | Aβ BINDING MOLECULES |
| WO2006040153A2 (en) * | 2004-10-13 | 2006-04-20 | Ablynx N.V. | Single domain camelide anti -amyloid beta antibodies and polypeptides comprising the same for the treatment and diagnosis of degenarative neural diseases such as alzheimer's disease |
| US20060257396A1 (en) * | 2004-12-15 | 2006-11-16 | Jacobsen Jack S | Abeta antibodies for use in improving cognition |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| CHAPMAN ANDREW P.: "PEGylated antibodies and antibody fragments for improved therapy: A review", 20020617, vol. 54, no. 4, 17 June 2002 (2002-06-17), pages 531-545, XP001199533, page 532, right-hand column, paragraph 1 - page 534, right-hand column, paragraph 1 page 537, right-hand column, paragraph 3 - page 539, right-hand column, paragraph 1, page 542, left-hand column, paragraph 2 - right-hand column, paragraph 1, page 543, right-hand column, paragraph 2 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA020979B1 (ru) | ПЭГИЛИРОВАННЫЕ Fab-ФРАГМЕНТЫ АНТИТЕЛ К ПЕПТИДУ Aβ | |
| US20230103401A1 (en) | Pharmaceutical composition comprising bispecific antibody constructs | |
| US7150872B2 (en) | Polyalkylene oxide-modified single chain polypeptides | |
| JP5878757B2 (ja) | Ｆｇｆ２１変異体およびその使用 | |
| CN110740754A (zh) | 一种抗间皮素抗体及其抗体药物缀合物 | |
| KR20210074284A (ko) | 표지부-항인간 항체 Fab 프래그먼트 복합체를 포함하는 의약 조성물 | |
| JP5352761B2 (ja) | 抗体ジスルフィド異性体、その使用及びその分析法 | |
| CA3203332A1 (en) | Pegylated t cell engager with dual specificities to cd3 and cd19 | |
| JP2006505497A5 (ru) | ||
| AU2013231065B2 (en) | Pegylated Aß Fab |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AZ BY KG MD TJ TM |
|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM KZ RU |