EA020527B1

EA020527B1 - Комбинации ингибиторов вируса гепатита с

Info

Publication number: EA020527B1
Application number: EA201270555A
Authority: EA
Inventors: Джулии А. Лемм; Стейси А. Восс; Мин Гао; Сьюзан Е. Чаниевски; Эмми К. Шиффер; Фиона Макфи
Original assignee: Бристол-Майерс Сквибб Кампани
Priority date: 2009-10-12
Filing date: 2010-10-08
Publication date: 2014-11-28
Also published as: AU2010307144A1; IL219123A; AU2010307144B2; EP2488192B1; EP2488192A1; MX351910B; BR112012008533A8; JP5992828B2; US20130259832A1; CN105343868A; EA201270555A1; NZ599284A; PE20160800A1; CO6430507A2; BR112012008533A2; IL219123A0; US8415374B2; KR20120088743A; CL2012000919A1; US20110250176A1

Abstract

Изобретение, по существу, относится к антивирусным соединениям и, более конкретно, к комбинациям соединений, которые могут ингибировать вирус гепатита С (ВГС), композициям, содержащим такие соединения, и способам лечения гепатита С с использованием таких комбинаций.

Description

Настоящее изобретение по существу относится к противовирусным соединениям, конкретнее к комбинациям соединений, которые могут ингибировать вирус гепатита С (ВГС), композициям, содержащим такие соединения, и способам для лечения гепатита С, используя такие комбинации.

ВГС является главным патогенном человека, которым предположительно инфицировано около 170 млн людей по всему миру - приблизительно в пять раз больше, чем инфицированных вирусом иммунодефицита человека типа 1. Основная часть таких индивидуумов, инфицированных ВГС, развивают серьезные прогрессирующие заболевания печени, включая цирроз и гепатоклеточную карциному.

ВГС является РНК положительным вирусом. На основании сравнения предполагаемой аминокислотной последовательности и пространственного сходства 5'-нетранслируемой области ВГС был классифицирован как отдельный вид семейства Ηανίνίπύαο. Все члены семейства Ηανίνίπύαο имеют вирионы, покрытые оболочкой и содержащие РНК положительный геном, кодирующий все известные вирусспецифические белки через трансляцию одиночной непрерывной открытой рамки считывания.

Существенная гетерогенность была обнаружена в нуклеотидной и кодируемой аминокислотной последовательности ВГС генома, соответствующая большой доле ошибки кодирующей РНК, которая зависит от РНК полимеразы, лишенной способности исправления ошибок. Были охарактеризованы по меньшей мере шесть главных генотипов и более чем 50 подтипов, распространенных по всему миру. Клиническое значение генетической гетерогенности ВГС состоит в оценке предрасположенности к мутациям, происходящим в течение монотерапевтического лечения. Таким образом, желательно использовать дополнительные варианты лечения.

Одиночная цепь РНК ВГС генома составляет примерно 9500 нуклеотидов в длину и имеет одну открытую рамку считывания (ОКБ), кодирующую один большой полипротеин из примерно 3000 аминокислот. В инфицированных клетках этот полипротеин расщепляется в многочисленных сайтах клеточными и вирусными протеазами с получением структурных и неструктурных (N8) протеинов. В случае ВГС образование зрелых неструктурных протеинов (N82, N83, Ν84Α, Ν84Β, Ν85Α и Ν85Β) опосредовано двумя вирусными протеазами. Первая из них предположительно является металлопротеазой и расщепляет соединение Ν82-Ν83; вторая является сериновой протеазой, содержащая Ν-терминальный регион N83 (также называемый здесь как Ν83 протеаза), и опосредует все нижеследующие расщепления Ν83, оба в С18, в Ν83-Ν84Α сайте расщепления, и в 1гап5, для оставшихся Ν84Α-Ν84Β, Ν84Β-Ν85Α, Ν85ΑΝ85Β сайтов. Ν84Α белок проявляет многочисленные функции, действуя как кофактор Ν83 протеазы и содействуя локализации в мембране Ν83 и других вирусных репликазных компонентов. Образование Ν83-Ν84Α комплексов необходимо для специфической протеазной активности в усиленной протеолитической эффективности расщепления. Ν83 белок также проявляет нуклеозид трифосфатазную и РНК хеликазную активности. Ν84Β является интегрированным в мембрану белком, участвующим в образовании мембранной сети, в которой собираются ВГС комплексы репликации. Ν85Β (также называемый здесь как ВГС полимераза) представляет собой РНК-зависимую РНК полимеразу, которая вовлечена в репликацию ВГС с другими ВГС белками, включая Ν85Α, в репликазном комплексе.

Действующий стандарт лечения большинства пациентов с хронической ВГС инфекцией представляет собой режим введения пэгилированного интерферона альфа и рибавирина. Однако у большей части пациентов не наблюдается ответа на такую терапию, а лечение вызывает различные побочные эффекты. Таким образом, существует огромная необходимость в развитии безопасных и более эффективных методов терапии. Хотя в настоящее время в клинической практике применяется множество малых молекул ВГС ингибиторов, на основании клинических данных от различных исследований доказано, что комбинации таких ингибиторов могут быть необходимы для продолжительного противовирусного эффекта у ВГС инфицированных пациентов. Появление резистентности у пациентов в течение лечения и после лечения возникает при применении протеазных ингибиторов, также как и нуклеозидных, и ненуклеозидных ВГС ингибиторов. Для достижения максимальной эффективности и для возможности уничтожения вируса необходимо использовать комбинированную терапию, в особенности нацеленную на различные ВГС вирусные мишени. Ιη νίίτο комбинированные исследования репликона показали, что эффекты от аддитивных до синергетических достигаются различными комбинациями ВГС ингибиторов.

В большинстве случаев имеющаяся заявка на патент \УО 2008/021927 раскрывает соединения, которые ингибируют функции Ν85Α белка, кодируемого ВГС. Патент США № 6995174 раскрывает соединения, которые ингибируют функции Ν83 протеазы, кодируемой ВГС. Настоящее изобретение относится к комбинациям специфического ВГС Ν85Α ингибитора и ингибитора ВГС Ν83 протеазы, которые полезны для лечения ВГС.

В первом аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество соединения формулы (Ι)

- 1 020527

или его фармацевтически приемлемой соли, терапевтически эффективное количество соединения формулы (II)

или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель. В первом воплощении первого аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от приблизительно 1:3 до приблизительно 3:1. Во втором воплощении первого аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от приблизительно 1:2,5 до приблизительно 2,5:1. В третьем воплощении первого аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет приблизительно 1:1. В четвертом воплощении первого аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет приблизительно 1:2,5. В пятом воплощении первого аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет приблизительно 2,5:1.

В шестом воплощении первого аспекта настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество соединения формулы (I)

(И), или его фармацевтически приемлемой соли, одно или два дополнительных соединения, имеющих

- 2 020527 анти-ВГС активность, и фармацевтически приемлемый носитель. В седьмом воплощении по меньшей мере одно из дополнительных соединений представляет собой интерферон или рибавирин. В восьмом воплощении интерферон выбран из группы интерферон альфа 2В, пегилированный интерферон альфа, интерферон лямбда, пегилированный интерферон лямбда, консенсусный интерферон, интерферон альфа 2А и лимфобластоидный интерферон тау.

Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ лечения ВГС инфекции у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей терапевтически эффективное количество соединения формулы (I)

или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель. В первом воплощении второго аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от приблизительно 1:3 до приблизительно 3:1. Во втором воплощении второго аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от приблизительно 1:2,5 до приблизительно 2,5:1. В третьем воплощении второго аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет приблизительно 1:1. В четвертом воплощении второго аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет приблизительно 1:2,5. В пятом воплощении второго аспекта отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли 2,5:1.

В шестом воплощении первого аспекта настоящее изобретение обеспечивает способ лечения ВГС инфекции у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей терапевтически эффективное количество соединения формулы (I)

- 3 020527

или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель, дополнительно содержащей одно или два дополнительных соединения, имеющих анти-ВГС активность до, после или совместно с указанной композицией. В седьмом воплощении по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой интерферон или рибавирин. В восьмом воплощении интерферон выбран из интерферона альфа 2В, пегилированного интерферона альфа, интерферона лямбда, пегилированного интерферона лямбда, консенсусного интерферона, интерферона альфа 2А и лимфобластоидного интерферона тау.

В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию, содержащую терапевтически эффективное количество соединения формулы (I)

или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель, где отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет примерно 1:10.

Другие аспекты настоящего изобретения могут включать подходящие комбинации воплощений, раскрытых здесь.

Еще другие аспекты и воплощения могут быть найдены в описании, приведенном здесь.

Все патенты, заявки на патенты и литературные ссылки, цитированные в соответствии с описанием, включены сюда посредством ссылки в полном объеме. В случае противоречий настоящее изобретение, включая определения, будет превалировать.

Как используется в настоящем описании, следующие термины имеют следующие значения.

При использовании здесь формы единственного числа включают формы множественного числа, если из контекста явно не следует иное.

Некоторые соединения по настоящему изобретению могут существовать в различных стабильных конформационных формах, которые могут быть разделены. Торсионная асимметрия из-за ограниченного вращения вокруг асимметричной одинарной связи, например, из-за стерических препятствий или кольца

- 4 020527 напряжения, может позволить разделение различных конформеров. Настоящее изобретение включает в себя каждый конформационный изомер этих соединений и их смеси.

Соединения по настоящему изобретению могут существовать как фармацевтически приемлемые соли. Термин фармацевтически приемлемая соль, как используется здесь, представляет соли или цвиттерионные формы соединений по настоящему изобретению, которые являются водно- или маслянорастворимыми или дисперсивными, которые в рамках тщательных медицинских исследований являются подходящими для использования в контакте с тканями пациента без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других проблем или осложнений, соизмеримых с приемлемым соотношением польза/риск, и являются эффективными для их использования по назначению. Соли могут быть приготовлены в течение финального выделения и очистки соединений или отдельно путем взаимодействия подходящего атома азота с подходящей кислотой. Типичные соли, полученные путем добавления кислоты, включают ацетат, адипат, альгинат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, камфорат, камфорсульфонат; диглюконат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, формат, фумарат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, мезитиленсульфонат, метансульфонат, нафталинсульфонат, никотинат, 2-нафталинсульфонат, оксалат, пальмоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, трихлорацетат, трифлуороацетат, фосфат, глутамат, бикарбонат, паратолуенсульфонат и ундеканоат. Примеры кислот, которые могут быть использованы для формирования фармацевтически приемлемых солей, включают неорганические соли, такие как соляная, бромисто-водородная, серная и фосфорная, и органические кислоты, такие как щавелевая, малеиновая, янтарная и лимонная.

Основные соли могут быть получены в течение финального выделения и очистки соединений посредством взаимодействия протона кислоты с подходящим основанием, таким как гидроксид, карбонат или бикарбонат катиона металла или с аммонием или органическим первичным, вторичным или третичным амином. Катионы фармацевтически приемлемых солей включают литий, натрий, калий, кальций, магний и алюминий, также как и нетоксичные катионы четвертичного амина, такие как аммоний, тетраметиламмоний, тетраэтиламмоний, метиламин, диметиламин, триметиламин, триэтиламин, диэтиламин, этиламин, трибутиламин, пиридин, Ν,Ν-диметилаланин, Ν-метилпиперидин, Ν-метилморфолин, дициклогексамин, прокаин, дибензиламин, Ν,Ν-дибензилфенэтиламин и Ν,Ν'-дибензилэтилендиамин. Другие типичные органические амины, пригодные для формирования основных солей, включают этилендиамин, этаноламин, диэтаноламин, пиперидин и пиперазин.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтические композиции, которые включают терапевтически эффективные количества соединений формулы (I) и (II) или их фармацевтически приемлемые соли, и один или более фармацевтически приемлемых носителя, разбавителя или наполнителя. Термин терапевтически эффективное количество, как используется здесь, относится к общему количеству каждого активного компонента, которое пригодно для появления заметного эффекта у пациента, например продолжительного сокращения вирусной нагрузки. При применении индивидуального активного ингредиента, вводимого отдельно, этот термин относится к одному ингредиенту. Когда применяется комбинация, указанный термин относится к комбинированному количеству активных ингредиентов, которые вызывают терапевтический эффект, вводимые в комбинации, последовательно или одновременно. Соединения формул (I) и (II) и их фармацевтически приемлемые соли описаны выше. Носитель(и), разбавитель(и) или наполнитель(и) должны быть приемлемы в сочетании с другими ингредиентами препарата и неопасными для реципиента. В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения здесь также обеспечен процесс приготовления фармацевтического состава, включающего смешанные соединения формул (I) и (II) или их фармацевтически пригодные соли с одним или более фармацевтически пригодными носителями, разбавителями или наполнителями. Термин фармацевтически пригодный при использовании здесь относится к таким соединениям, материалам, композициям и/или формам дозирования, которые в рамках медицинского заключения являются пригодными для использования в контакте с тканями пациента без чрезмерной токсичности, раздражения, аллергического ответа или других проблем или соизмеримой сложности с соотношением разумная польза/риск и являются эффективными для продолжительного использования.

Фармацевтические композиции могут быть представлены в форме однократной дозы, содержащей предопределенное количество активных ингредиентов на единицу дозы. Как правило, фармацевтические композиции по настоящему изобретению могут быть введены от приблизительно 1 до приблизительно 5 раз в день или альтернативно путем продолжительной инфузии. Такие введения могут быть использованы в качестве продолжительной или экстренной терапии. Количество активного ингредиента, которое может быть скомбинировано с носителем для получения единичной дозы, может быть различным в зависимости от условий лечения, тяжести состояния, времени введения, способа введения, уровня выведения применяемого соединения, продолжительность лечения, а также возраста, пола, веса и состояния пациента. Предпочтительные единицы дозы композиций представляют собой дневную дозу или субдозу активного ингредиента, как было процитировано выше, или ее подходящую часть. Обычно лечение начинается с малых доз, значительно меньших, чем оптимальная доза соединения. После этого доза увеличивается небольшими порциями до оптимального эффекта в данных условиях. В общем наиболее жела- 5 020527 тельно введение соединения в концентрации, которая будет приводить к антивирусным эффективным результатам без каких-либо вредных или опасных побочных эффектов.

Также как все композиции по этому изобретению содержат комбинации двух соединений, имеющих анти-ВГС активность, оба соединения могут быть представлены в дозе, меньшей или равной обычной дозе, вводимой в режиме монотерапии. Уровни дозы от примерно 0,01 до примерно 250 мг/кг веса тела в день, предпочтительно от примерно 0,05 до примерно 100 мг/кг веса тела в день каждого соединения по настоящему изобретению типичны в режиме монотерапии для предупреждения и лечения ВГС опосредованных заболеваний. Композиции по настоящему изобретению могут быть приготовлены совместно с одним или более дополнительных терапевтических или профилактических агентов, например, в форме монолитных и/или би/мультислойных таблеток или могут быть введены раздельно от терапевтического(их) или профилактического(их) агента(ов).

Фармацевтические композиции могут быть приготовлены для введения любым подходящим способом, например орально (включая подщечно или подъязычно), ректально, назально, местно (включая подщечно, подъязычно или трансдермально), вагинально или парентерально (в том числе подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутрисуставно, внутригрудинно, интратекально, в повреждение, внутривенные или внутрикожные инъекции или инфузии). Такие композиции могут быть приготовлены любым методом, известным в области фармацевтики, например путем ассоциации активного ингредиента с носителем(ями) или наполнителем(ями).

Фармацевтические композиции, подготовленные для введения орально, могут быть представлены в качестве отдельных единиц, таких как капсулы или таблетки, порошки или гранулы, растворы или суспензии водных или неводных жидкостей, съедобные пены или пластины, либо жидкие эмульсии масло в воде или вода в масле.

В действительности для орального введения в форме таблеток или капсул активный ингредиент лекарственного препарата может быть скомбинирован с нетоксичным фармацевтически пригодным инертным носителем для орального введения, таким как этанол, глицерин, вода и т.п. Порошки приготавливаются путем измельчения вещества до подходящего размера частиц и смешиванием с измельченным таким же образом фармацевтического носителя, такого как съедобный карбогидрат, например, с крахмалом или маннитолом. Ароматизаторы, консерванты, диспергирующие добавки и красители также могут присутствовать.

Капсулы производятся путем смешивания порошков, как описано выше, и наполнения сформированных желатиновых оболочек. Вещества, способствующие проскальзыванию, и смазывающие соединения, такие как коллоидный кварц, тальк, стеарат магния, стеарат кальция или твердый полиэтиленгликоль, могут быть добавлены к порошковой смеси до заправки капсулы. Дезинтегрирующий или растворяющий агент, такой как агар-агар, карбонат кальция или карбонат натрия, также может быть добавлен для улучшения доступности лекарственного средства при введении капсулы.

Кроме того, при желании или необходимости, также могут быть включены в смесь подходящие связующие вещества, смазки, разрыхлители и красители. Подходящие связующие вещества включают крахмал, желатин, природные сахара, такие как глюкоза или бета-лактоза, кукурузный подсластители, природные и синтетические смолы, такие как смолы акации, трагакант или альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза, полиэтиленгликоль и т.п. Смазочные соединения, используемые в этих лекарственных формах, включают олеат натрия, хлорид натрия и т.п. Дезинтегрирующие вещества включают, без ограничения, крахмал, метилцеллюлозу, агар, бентонит, ксантановую смолу и т.п. Таблетки формируются, например, путем приготовления порошковой смеси, гранулированием или измельчением, добавлением масла и разрыхлителей и прессованием в виде таблеток. Порошковая смесь готовится путем смешивания соединений, измельченных до подходящего размера, разбавителей или основ, как описано выше, и дополнительно со связующими веществами, такими как карбоксиметилцеллюлоза, альгинат, желирующими веществами, или поливинилпирролидоном, растворимым ингибитором, такими как парафин, ускорителем резорбции, таким как четвертичные соли, и/или адсорбирующим агентом, таким как бентонит, каолин или дикальцийфосфат. Порошковая смесь может быть гранулирована путем смачивания связующим раствором, таким как сироп, крахмальные пасты, растительная слизь АсаФа, либо раствором целлюлозных или полимерных материалов, и формированием гранул. В качестве альтернативы гранулирования, порошковая смесь может быть пропущена через машину формирования таблеток, в результате чего формируются бруски в виде гранул. Гранулы могут быть смазаны для предупреждения прилипания с помощью таких добавок, как стеариновая кислота, стеарат соль, тальк, или минеральным маслом. Смеси со смазывающими веществами прессуют в таблетки. Соединения по настоящему изобретению также могут быть объединены с сыпучим инертным носителем и спрессованы в таблетки непосредственно, минуя стадии гранулирования или измельчения. Прозрачный или непрозрачный защитный слой состоит из уплотненного слоя шеллака, покрытия из сахара или полимерного материала, а также глянцевого покрытия воском. Такие покрытия также могут содержать красители в различных дозах.

Жидкости для орального введения, такие как растворы, сиропы и эликсиры, могут быть приготовлены в формах единиц дозирования, обеспечивая предопределенное количество соединения. Сиропы могут быть приготовлены путем растворения вещества в подходящем ароматизированном жидком рас- 6 020527 творе, в то время как эликсиры приготавливаются с помощью нетоксичных средств. Также могут быть добавлены растворители и эмульгирующие вещества, такие как этоксилированные изостеариловые спирты и эфиры полиоксиэтиленсорбита, консерванты, вкусовые добавки, такие как мятное масло или натуральные подсластители, сахарин или искусственные заменители сахара и т.п. В случае необходимости, единицами дозирования препарата для приема орально могут быть микрокапсулы. Препарат может быть приготовлен для длительного или поддерживающего высвобождения, как, например, с покрытием или внедрением частиц препарата в полимеры, воск и т.п.

Соединения формул (I) и (II) и их фармацевтически приемлемые соли также могут быть введены в форме систем доставки в виде липосом, таких как малые униламелярные везикулы, большие униламелярные везикулы и мультиламелярные везикулы. Липосомы могут быть сформированы из различных фосфолипидов, таких как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолин.

Соединения формулы (I) и их фармацевтически приемлемые соли могут быть введены с использованием моноклональных антител как индивидуальных переносчиков, связывающих молекулы соединения. Соединения могут быть также связаны с растворимыми полимерами в качестве направленных переносчиков лекарственных средств. Такие полимеры могут включать поливинилпироллидон, сополимеры пирана, полигидроксипропиласпертамидефенол, полигидроксиэтиленаспертамидефенол или полиэтиленеоксидеполилизин, замещенный остатками палитоила. Дополнительно соединения могут быть связаны с различными биодергадабельными полимерами, пригодными для контролируемого высвобождения лекарственного препарата, например полимолочная кислота, полиэпсилон капролактон, полигидрокси масляная кислота, полиортоэфиры, полиацетали, полидигидропираны, полицианоакрилаты и дигидропираны, и кросс-присоединенные или амфипатические блок-сополимеры гидрогелей.

Фармацевтические композиции, пригодные для трансдермального введения, могут быть представлены для отдельных участков и направлены на тесный контакт с эпидермисом реципиента в течение длительного периода времени. Например, активный ингредиент может быть введен в участок путем ионофореза, как описано в общем виде в РЬагшасеийса1 КекеагсЬ, 3(6), 318 (1986).

Фармацевтические композиции, пригодные для местного введения, могут быть приготовлены как мази, кремы, суспензии, лосьоны, пудры, растворы, пасты, гели, спреи, аэрозоли или масла.

Для лечения глаз или других внешних тканей, например рта или кожи, композиции предпочтительно применяются как местная мазь или крем. Когда приготавливается мазь, активные ингредиент может применяться с парафиновой или водорастворимой основой мази. Альтернативно, активный ингредиент может быть приготовлен в креме с водно-масляной основой крема типа масло в воде или вода в масле.

Фармацевтические композиции, подготовленные для местного введения в глаза, включают глазные капли, где активный ингредиент растворен или суспендирован в подходящем носителе, в частности водном растворителе.

Фармацевтические композиции, пригодные для местного введения в рот, включают таблетки, пастилки и лосьоны для рта.

Фармацевтические композиции, подготовленные для ректального введения, могут быть представлены как свечи или как клизмы.

Фармацевтические композиции, подготовленные для назального введения, где носитель является твердым, включают порошки грубого помола, которые вводятся тем же способом, что и нюхательный табак, т.е. резким вдыханием через назальное отверстие из контейнера с порошком, расположенным вблизи носа. Подходящие композиции, где носитель жидкий, для введения как назальный спрей или назальные капли включают жидкие или масляные растворы активного ингредиента.

Фармацевтические композиции, подготовленные для введения путем ингаляции, включают мелкие частицы пыли или аэрозоля, которые могут быть приготовлены средствами различных типов дозирования, дозированными аэрозолями под давлением, распылителями или инсуффляторами.

Фармацевтические композиции, подготовленные для вагинального введения, могут быть представлены в виде пессариев, тампонов, кремов, гелей, паст, пенок или спреев.

Фармацевтические композиции, подготовленные для патентерального введения, включают водные и неводные стерильные растворы для инъекций, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатики и загустители, которые обеспечивают образование раствора, изотонического в отношении крови реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие агенты и загустители. Препараты могут быть представлены в виде контейнеров с однократной или многократной дозой, например в виде запаянных ампул и флаконов, и могут быть сохранены в лиофилизированном состоянии, требующим только добавления стерильного жидкого носителя, например, воды для инъекций непосредственно перед использованием. Непредусмотренные для инъекций растворы и суспензии могут быть приготовлены в виде стерильных порошков, гранул и таблеток.

Следует понимать, что в дополнение к ингредиентам, в частности отмеченным выше, композиции могут включать другие агенты, общепринятые в данной области с учетом типа препарата вопроса, например препараты, пригодные для перорального введения, могут включать ароматизаторы.

Термин пациент включает как человека, так и других млекопитающих.

- 7 020527

Термин лечение относится к (ί) предупреждению заболевания, расстройства или состояния у пациента, который мог быть предрасположенным к заболеванию, расстройству и/или состоянию, но еще не диагностированный как имеющий такое заболевание, расстройство или состояние; (ίί) ингибированию заболевания, расстройства или состояния, т.е. задержке их развития; и (ίίί) облегчению заболевания, расстройства или состояния, т.е. вызывая регрессию заболевания, расстройства и/или состояния.

В табл. 1, приведенной ниже, перечислены некоторые пояснительные примеры соединений, которые могут быть введены с композициями по настоящему изобретению. Композиции по настоящему изобретению могут быть введены вместе с другими соединениями с анти-ВГС активностью в качестве комбинированной терапии, совместно или раздельно, либо путем комбинирования соединению в одной композиции.

Таблица 1

Торговое наименование	Физиологический класс	Тип ингибитора или назначение	Поставщик
ΝΙΜ811 ОеЬю-025 5СУ-635		ингибиторы циклофилина	Νθν3Γΐ15 ОеЬюрЬагт 8супех13
Задаксин		иммуномодулято Р	8<яс1опе
Сувус		Метиленовый синий	Βίοεηνίβίοη
Актилон (СРО 10101)		ТЬК.9 агонист	Со1еу
Батабулин (Т67)	противораковый	ингибитор β- тубулина	Ти1апк 1пс., 8ои(Ь 8ап Ргапс15со, СА
АЙСИС 14803	противовирусный	антисмысловой	1818 РЬагтасеи1юа1з 1пс, СагЬЬаЗ, СА / Е1ап РНагтасеиПса1з 1пс., Νβνν Уогк, ΝΥ
Сумметрел	противовирусный	противовирусны й	Εηάο РЬагтасеийсаВ Но1сЬп§з 1пс., СЬасШ РогсЬ РА
08-9132 (АСН-806)	противовирусный	ВГС ингибитор	АсЬЛЬоп / ОПеаб
Соединения пиразолопиримидина и его соли, описанные в ΨΟ2Ο05/Ο47288, 26 мая 2005	противовирусный	ВГС ингибитор	Αϊτόν.' ТЬегареиЬсз ЬЫ.
Левовирин	противовирусный	ΙΜΡϋΗ ингибитор	КлЪаркагт 1пс., Соа(а Меза, СА

- 8 020527

Меримеподиб (УХ-497)	противовирусный	1МРЭН ингибитор	УеПех РЬагтасеийсак 1пс,, СашЬпбзе, МА
ХТЬ-6865 (ХТЬ-002)	противовирусный	моноклональное антитело	хть ВюрЬагтасеиЬса! в ЬьЬ, \|{с1ю\о(. Израиль
Телапревир (УХ-950, ЬУ-570310)	противовирусный	ингибитор N83 сериновой протеазы	Уейех РЬагтасеийсаЬ 1пс., СатЬпбае, МА ί Ε1Ϊ Ы11у апб Со. 1пс., ЬкЬапароПк, ΙΝ
НСУ-796	противовирусный	ингибитор Ν85Β репликазы	ХУуеЛ / УпорЬагта
ΝΜ-283	противовирусный	ингибитор Ν85Β репликазы	Ыешх / Νονειτ03
ОЬ-59728	противовирусный	ингибитор Ν85Β репликазы	Оепе ЬаЬв / ΝονπτίίΒ
ОЬ-60667	противовирусный	ингибитор Ν55Β репликазы	Сгепе ЬаЬз / Хй'.апЬ
2'С МеА	противовирусный	ингибитор Ν85Β репликазы	ОПеаб
Ρ8Ι6130	противовирусный	ингибитор Ν85Β репликазы	КосЬе
К1626	противовирусный	ингибитор Ν85Β репликазы	КосЬе
2'С метил аденозин	противовирусный	ингибитор Ν55Β репликазы	Мегск

- 9 020527

ДТК-003	противовирусный	ингибитор ΚάΚ,ρ	1арап ТоЬассо 1пс., Токуо, 1арап
Левовирин	противовирусный	рибавирин	ΙΓΝ РЬагтасеийсак, Соз{а Меза, СА
Рибавирин	противовирусный	рибавирин	8сЬегт2-Р1ои@Ь Согрогайоп, КетЬсопН, N5
Вирамидин	противовирусный	рибавирин пролекарство	КлЪарНагт 1пс., СоЫа Меза, СА
Гептазим	противовирусный	рибозим	ГЬЪогуте РЬагтасеиГкаи 1пс., ВоиМег, СО
ΒΙΓ.Ν-206Ι	противовирусный	ингибитор сериновой протеазы	Вос1т п§ег ΙηββΙΙιείιη РЬагта КО, ]пуе1Ье1т, Оегтапу
8СН-900518 - нарлепревир	противовирусный	ингибитор сериновой протеазы	8сЬепп§ Р1ои§Ь
Залазим	иммуномодулятор	иммуномодулято Р	8с1С1опе РНагтасеи11са1з 1пс., 8ап Ма(ео, СА
Цеплен	иммуномодулятор	иммуномодулято Р	Махш РЬагтасеийса1$ 1пс., Зап Οίβ£θ, СА
ЦелЦепт	иммуносупрессор	ВГС !§О иммуносупрессо Р	Г. НоГблапп-Ьа КосЬе ЬТЭ, Вазе1, 3№11гсг1апд

- 10 020527

Цивацир	иммуносупрессор	ВГС ЦО иммуносупрессо Р	ΝαΒί ВюрНаппасеиПса! з 1пс., Воса Ка1оп, ГЬ
Албуферон - а	интерферон	альбумин ΙΡΝ- а2Ъ	Нитап Оепоте Заепсез 1пс., К.оск\’Ше, Μϋ
Инферген А	интерферон	ΙΡΝ а1£асоп-1	1п1егМипе РЬагтасеийсаИ 1пс., ВпзЬапе, СА
Омега 1ΡΝ	интерферон	ΙΡΝ-ω	1п(агс1а ТЬегареийсз
ΙΡΝ-β апб ΕΜΖ701	интерферон	ΙΡΝ-β апб ΕΜΖ701	ГгапзИюп ТЬегареийсз 1пс., Оп1апо, Сапаба
Ребиф	интерферон	ΙΡΝ-β 1а	Зегопо, Оепеха, 8\У11гег1апб
Роферон А	интерферон	1РМ-«2а	Р. Нойтапп-Ьа ВосЬе ЬТО, Вазе1, 8чб1гег1апб
Интрон А	интерферон	ΙΡΝ-α2Β	8сЬепп§-Р1ои§Ь Согрогайоп, ΚεηίΙννοιΤΒ, Ν.Τ
Интрон А и Задаксин	интерферон	ΙΡΝ-α2Β/α1- ТИМОЗИН	Ве^епеВх ВюрЬагта. 1пс., ВеЙтезба, Μϋ / ЗсЮопе РЬагтасеийсаИ 1пс, Зап МаТео, СА

- 11 020527

Ребетрон	интерферон	ΙΡΝ-α2Η / рибавирин	8сЬепп8-Р1ои§Ь Согрогайоп, КетЫопЬ, N1
Актиммун	интерферон	ΙΝΡ-γ	1п(егМипе 1пс., ВпвЬапе, СА
Интерферон-β	интерферон	Интерферон- β-1 а	Зегопо
Мультиферон	интерферон	Удлиненный ΙΡΝ	У1га§еп! Уа1еп1в
Велферон	интерферон	Лимфобласта иди ый ΙΡΝ-αηΙ	(НахоЗтйНКНпс р1с, ихЪпсЦе, ик
Омниферон	интерферон	Природный ΙΡΝ- α	Упареп 1пс., Р1ап1а1юп, РЬ
Пегасис	интерферон	ПЭГ илированны й ΙΓΝ-<χ2α	Р. Но££тагт-Еа КосЬе ЬТЭ, Вазе!, Зтойгепапб
Пегасис и Цеплен	интерферон	ПЭГ илированны й 1РГ4-а2а / иммуномодулято Р	Мах1т РЬагтасеийсай 1пс., 8ап Οίο^ο, СА
Пегасис и Рибавирин	интерферон	ПЭГ илированны й 1РК-«2а / рибавирин	Р. Нойтапп-Еа КосЬе Ьт, Ва$е1, ЗиАгейапб
РЕО-Интрон	интерферон	ПЭГ илированны й ΙΡΝ-α2Η	ЗсЪегтд-РкищЬ Согрогайоп, КетМопЬ, N1
РЕО-Интрон / рибавирин	интерферон	ПЭГ илированны й ΙΡΝ-α2Η / рибавирин	ЗсЬепп8-Р1ои§Ь Согрогайоп, КетЕтойЬ, Ш

- 12 020527

ΙΡ-501	защита печени	АпйЯЪгойс	1пбеуи5 РЬагтасеиЯсаР 1пс., Ьехт§(оп, МА
ΙϋΝ-6556	защита печени	Ингибитор каспазы	Иип РНагтасеиЯсак 1пс., Зап ϋϊβ^ο, СА
ΙΤΜΝ-191 (Κ-7227)	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	ЬиегМипе РЪагтасеииеаЬ 1пс., ВпзЬапе, СА
ОБ-59728	противовирусный	Ингибитор репликазы Ν85Β	Оепе1аЬ8
ΑΝΑ-971	противовирусный	ТЬК-7 агонист	Ападу.ч
Боцепревир	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	ЗсНеНпд Р1ои§Ь
ТМС-435	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	Т\|Ьокс ΒΥΒΑ, МесЬе1еп, Вефшт
ΒΙ-201335	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	ВоеЬппрег 1п§е1Ье1т РЬагта КО, 1пуе1Не1т. Оегтапу
ΜΚ-7009	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	Мегск
ΜΚ-5172	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	Мегск

- 13 020527

ГОХ-316	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	Ыетх
АСЫ-1625	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	АсЫИюп
АСН-2684	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	АсЫШоп
АУЬ-181	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	ΑνίΙίΐ
АВТ-450	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	АЬЬоП/Епап1а
03-9256	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	ОПеай
ΙΤΜΝ-8187	противовирусный	Ингибитор сериновой протеазы	1п1егтипе
РГ-00868554 (филибувир)	противовирусный	Ингибитор репликазы	Рйгег
ΑΝΑ598	противовирусный	Ингибитор ненуклеозидной полимеразы Ν55Β	Апайуз РЪагтасеийсаЦ 1пс., Зал О1еео. са, изд
ГОХ375	противовирусный	Ингибитор ненуклеозидной репликазы	Иешх РЬагтасеийсаН, СатЬпс1ее, МА, изд

- 14 020527

ΒΙίΒ 1941	противовирусный	Ингибитор полимеразы Ν85Β	ВоеЬпп§ег 1пде1Непп Сапаба П4 К.&И, Т.агаГ <?С. СапаОа
Ρ3Ι-7851	противовирусный	Ингибитор нуклеозидной полимеразы	РЬаггпабкец РппсеГоп, М, изА
Ρ8Ι-352938	противовирусный	Ингибитор нуклеозидной полимеразы	РЬагтаззеЦ РппсеЮп, N3, изА
ΡδΙ-7977	противовирусный	Ингибитор нуклеозидной полимеразы	РЬагтагзеГ РппсеЮп, N1, ИЗА
ТМС-647055	противовирусный	Ингибитор нуклеозидной полимеразы	ТйхЯес/Мебтг
ΙΝΧ-189	противовирусный	Ингибитор нуклеозидной полимеразы	1пЫЬКех
УСН-759	противовирусный	Ингибитор полимеразы Ν85Β	ХТгоСЬет РЬагта
УСН-916	противовирусный	Ингибитор полимеразы Ν85Β	УиоСЬет РЬагта
08-9190	противовирусный	Ингибитор полимеразы Ν85Β	ОПеаО
ΡΡΙ-461	противовирусный	Ингибитор Ν35Α	РгеАсЬо

ΡΡΙ-1310	противовирусный	Ингибитор N85 А	Ргез1<Ио
08-5885	противовирусный	Ингибитор Ν35Α	ООеаб
ΕϋΡ-239	противовирусный	Ингибитор N85 А	Епап1а
АСН-2928	противовирусный	Ингибитор Ν35Α	АсЫШоп
ΙΤΧ-5061	Ингибитор входного рецептора клетки- хозяина	Ингибитор- антагонист ВГС входа в клеку 8К.-В1	ЬЬегХ
Пег-интерферон лямда	противовирусный	Интерферон	/утоСепеПсз / Вп8(о1-Муегк ЗцшЪЪ

Композиции по настоящему изобретению также могут быть использованы в качестве лабораторных реагентов. Соединения могут быть инструментом в обеспечиваемых исследовательских средствах для дизайна анализа вирусной репликации, для проверки на животных моделях и исследований в области структурной биологии для дальнейшего изучения механизмов ВГС заболеваний. Дополнительно соединения по настоящему изобретению могут быть полезны для создания или определения связывающих сайтов других противовирусных соединений, например, при конкурентном ингибировании.

Соединения по настоящему изобретению могут быть использованы для лечения или предупрежде- 15 020527 ния вирусного заражения материалов, следовательно, уменьшая риск вирусной инфекции лабораторного и медицинского персонала или пациентов, которые контактируют с такими материалами, например с кровью, тканями, хирургическими инструментами и одеждой, а также аппаратами и материалами для сбора и переливания крови.

Настоящее изобретение в настоящее время описано в связи с некоторыми воплощениями, не ограничивая объем притязаний, напротив, настоящее изобретение охватывает все альтернативы, модификации и эквиваленты, которые могут быть включены в объем притязаний. Таким образом, следующие примеры, которые включают в себя конкретные варианты, призваны проиллюстрировать одну из форм настоящего изобретения, при том понимании, что примеры предназначены для иллюстрации некоторых вариантов и представлены для представления наиболее полезных и легких в понимании процедур и концептуальных аспектов.

Исходные материалы могут быть получены из коммерческих источников или подготовлены широко применяемыми и описанными в литературе способами, известными специалистам в этой области.

Примеры

Соединения.

Ингибитор ВГС Ν85Α (соединение формулы (I)) может быть приготовлено в соответствии с процедурой, описанной в общем виде в заявках на патенты \УО 2008/021927 или \УО 2009/020825. Ингибитор ВГС N83 (соединение формулы (II)) может быть приготовлен в соответствии с процедурами, описанными в общем виде в патенте США № 6995174 и в заявке на патент США 12/547158. Рекомбинантный 1Ь29 (г1Ь-29 или τΙΡΝλ1) экспрессирован в Е.соП, как модифицированная метилированная с Ν-конца форма человеческого 1Ь-29. Рекомбинантный ΙΡ-28Α (τΙΡΝλ2) и τΙΡ28Β (τΙΡΝλ3) также экспрессирован в Е.соП. Пэгилированный τΙΡΝλ1 (ρο§ΙΕΝλ1) представляет собой ковалентно конъюгированный τΙΡΝλ1 (молекулярной массы 19,6 кДа) и 20 кДа линейной цепи полиэтилен гликоля (ПЭГ). Оба τΙΕΝλ1 и ροβΙΕΝλΕ синтезированные фирмой 2утодспс11С5, были в значительной степени охарактеризованы с помощью многочисленных методов, включая аминокислотный анализ, Ν-концевая последовательность, 81/с Ехс1и51Оп\СНгота1одгарНу-Ми111-Лпд1с ЫдЫ 8сайсгтд (8ЕС-МЛЬ8), анализ пептидной карты и общий масс анализ. Комбинированные анализы τΙΕΝλ1 подтверждают, что очищенный белок, прежде всего в форме 1, с двумя дисульфидными в ожидаемой конформации. Кроме того, анализы подтверждают, что последовательность, как и ожидалось, основана на кДНК и экспрессии в Е.соП, при этом белок имеет дополнительный Ν-терминальный метионин и негликозилирован. Комбинированный анализ ροβΙΕΝλ подтверждает, что белковая часть молекулы по-прежнему в ожидаемом виде и в ожидаемой конформации. Кроме того, анализ показал, что молекулы, в основном, ПЭГ на Ν-конце, как и ожидалось. Анализ 8ЕСΜΑΡ8 и все масс-спектрометрии подтверждают, что молекулярная масса составляет около 39,6 кДа, как и ожидалось от соединения с τΙΕΝλ1 с 20 кДа ПЭГ.

Клеточные линии.

Клеточная линия НиП-7, использованная в этих исследованиях, была получена от Эг. Ка1Г БаПсп8сП1адег (ишусгШу оГ НсИсШсгд, НсМсФсгд, Оегтапу) и размножена в ЭМЕМ, содержащем 10% ΕΒ8, 10 ед./мл пенициллина и 10 мкг/мл стрептомицина. Репликоны ВГС, использованные в этих исследованиях, были произведены ЕпМоЕМусге 8с.]шЬЬ с использованием процедур, описанных в \УО 2004/014852. Кодирующая последовательность известного генотипа 1Ь ВГС репликона (ЬоПтапп, V., Ε. Котсг, Т-О. КосП, и. Нспап, Ь. ТПсПтапп, апП К. Βа^ίсη5сП1адс^ 1999, 8сюпсс 285:110-113) была синтезирована Орсгоп ТсПпо1од1с8, Шс. (Л1атсάа, СΑ), используя набор последовательностей ΞΜΒΕ № доступа Α1242652, нуклеотиды от 1801 до 7758. Функциональный репликон был затем собран в плазмиду рСст9/Г(+) (Рготсда, МаФкоп, νΙ) с использованием стандартных методик молекулярной биологии. Для создания репликона, кодирующего люциферазный переносчик, ген, кодирующий гуманизированный КспШа ЬисГсгакс белок, был введен выше неомицин фосфотрансферазного гена. Полученный репликон содержит (ί) ВГС 5' иТК, соединенный с 12 аминокислотами капсидного белка, (и) ген ренила люциферазы, (ίίί) ген неомицин фосфотрансферазы (псо), (ΐν) ΙΒΞ8 из вируса энцефаломиокардита (ЕМСУ), (ν) ВГС N83 до Ν85Β гены и ВГС 3' ИТК.

Репликон 1а был получен с использованием клона, описанного выше путем замещения 1Ь ВГС последовательности последовательностью генотипа 1а из рСV-Н77с (УападЕ М., К. Ригсс11, 8. Етсгкоп, 1. ΒιιΕΙι 1997, ΡΝΑ8, 94:8738-8743; 1сп8 ΒιιΕΠ №Щопа1 ПъПцНс оГ НсаПП, ΒсίПс8άа, МЭ 20892) с использованием стандартных методик молекулярного клонирования. Для получения более эффективного репликона 1а были введены адаптивные мутации Р1496Ь (N83) и 82204Ι (Ν85Α), используя Цшск СПапдс ХЬ набор для сайт-направленного мутагенеза в соответствии с инструкциями производителя (81га1адспс СогрогаПоп, Ьа 1о11а, СΑ).

ВГС репликон был выделен из колонии, как описано ЬоПтап и др. (ЬоПтапп, V., Ε. Котсг, Р-О.

КосП, и. Нспап, Ь. ТПсПтапп и К. Βа^ίсη5сП1адс^ 1999, 8сюпсс 285:110-113), и использован во всех экспериментах. Вкратце, клоны репликона были линеаризированы 8саI и РНК транскрипты синтезированы ш νίϋΌ с использованием Т7 Мсда8спр1 транскрипционного набора (АтЬю!!, Α^Π^ ТХ) в соответствии с инструкциями производителя. 10 в 20 мкг ш νίΙΐΌ транскрибированной РНК реплика были введены в 4- 16 020527

5х10⁶ Ниб-7 клетки путем трансфекции с помощью ΌΜΡΙΕ-С реагента ОпуЦгодеп Сотротабоп, СатПЪаб, СА) в соответствии с протоколом производителя. После 24 ч была добавлена селективная среда, содержащая 0,5 мг/мл генетицина (0418, ОЛсо-ВКЕ, КоскуШе, ΜΌ), которая менялась каждые 3-5 дней. После примерно 4 недель клетки были готовы для дальнейшего анализа. Клетки сохранялись при 37°С в ΌΜΕΜ (ОШсо-ВКЕ, КоскуШе, ΜΌ) с 10% телячьей сыворотки, инактивированной нагреванием (§1§ша), пенициллин/стрептомицин и 0,5 мг/мл О418.

Оценка цитотоксичности и люциферазной активности клеточной культуры.

Для определения эффективности соединения клетки с ВГС репликонами высевались с плотностью 10⁴ на лунку в 96-луночные планшеты в ΌΜΕΜ среду, содержащую 10% РВ§. После ночной инкубации соединения, разведенные в ΌΜδΟ стерильно, или только ΌΜδΟ были добавлены в каждую лунку до конечной концентрации ΌΜδΟ 0,5%. Планшеты клеток затем инкубировались при 37°С в течение 3 дней до анализа цитотоксичности и ингибирования ВГС. Жизнеспособность клеток оценивалась с использованием набора А1атаг Ъ1ие, а значения СС₅₀ рассчитывались с использованием уравнения среднего эффективного.

Планшеты затем отмывались дважды с помощью ΡΒδ и оценивалась активность ренилла люциферазы с помощью Оиа1-О1о Ьисбегаке системы анализа (Рготеда Сотротабои, Μаб^5оη, XVI) в соответствии с инструкциями производителя. Планшеты анализировали на ТорСошИ ΝΧΤ микропланшетном счетчике сцинциляции и люминисценции (Раскагб 1п51гитеп1 Сотрапу). 50% эффективная концентрация (ЕС₅₀) рассчитывалась с помощью Ехсе1 Ρίΐ (Уегеюп 2.0, Вш1б 30). Известные х (концентрация соединений) и у (% относительно контрольных лунок с только ΌΜδΟ) значения были использованы для расчета ЕС₅₀ с помощью Ехсе1 Ρίΐ уравнения 205, представленного как у=А+((В-А)/(1+((С/х)^ЛО))), где А и В соответствуют нижнему и верхнему плато кривой соответственно, С равно среднему значению х на кривой, а Ό соответствует наклону кривой.

Исследование комбинации.

Для четырех исследований комбинации ингибиторов ΙΡΝ-α и ингибиторов ВГС Νδ5Α и Νδ3 протеазы были протестированы каждый при одиннадцати концентрациях. Основной раствор, 200 раз желаемой конечной концентрации для анализа, был приготовлен 3-кратным разведением ΌΜδΟ до добавления к клеткам/среде. Соединения тестировались в качестве монотерапии и в комбинации с соединением формулы (I) в различных соотношениях концентраций. Клетки обрабатывались соединениями в течение 3 дней, а затем степень ВГС ингибирования оценивалась с помощью анализа люциферазной активности, как описано выше. Потенциальная цитотоксичность комбинированных агентов также параллельно анализировалась с помощью красителя А1атаг Ъ1ие. Степень антагонизма, аддитивности или синергизма определялись в отношении диапазона концентраций лекарственного препарата, были построены кривые ответа на комбинации для оценки противовирусного эффекта лечения комбинациями лекарственных средств. Эффект комбинации лекарственных препаратов был проанализирован с помощью метода Сбои Сбои Т. Тбеотебса1 Ва515, Ехрептеп1а1 Ое5щп. апй СотрШеп/еб δ^υ^ΐ^ оГ δуηе^д^5т апб Атадогщт ίη Эгид СотЫпабоп δΐиб^е5, Рбагтасо1одюа1 Ре\ае\У5. 2006; 58(3):621-81.

Все значения рассчитывались с помощью программ биостатистики δΑδ Ргос ΝΌΙΝ, и четырехпараметрической логистики. Все индексы комбинации были рассчитаны для оценки отклонения от аддитивности с использованием изоболограммных методов. Асимптотические доверительные интервалы также были подсчитаны для каждого индекса комбинации. Эти интервалы использованы для оценки отклонения от аддитивности путем сравнения граничных значений - нижняя граница интервала больше 1 показывает антагонизм, верхняя граница меньше 1 показывает синергизм, а значение 1 в интервале соответствует аддитивности.

Результаты.

Устойчивость к антивирусной терапии стала главной проблемой в руководстве пациентов с хроническими вирусными инфекциями. Для достижения устойчивого противовирусного ответа необходимо использовать комбинированную терапию, в особенности направленные на отдельные ВГС вирусные мишени. В этой работе мы используем ВГС репликон для оценки степени антагонизма, аддитивности или синергизма при комбинировании ингибитора ВГС Νδ-ЗА формулы (I) с ингибитором протеазы Νδ3 формулы (II), а также для сравнения эффекта при комбинировании ΙΡΝ-α, редШЫХ или τΙΡΝλ1 с обоими соединениями.

Для экспериментов, показанных в табл. 2-6, ингибитор Νδ-ЗА формулы (I) и ингибитор протеазы Νδ3 формулы были протестированы либо одиночно, либо с различными интерферонами, применяемыми для ВГС системы репликации, и представлены оцененные ЕС₅₀ значения для каждого, также как и индексы комбинации (С^. Потенциальная цитотоксичность этих комбинированных агентов также была проанализирована как на параллельные, так и на недостигаемые СС50 значения.

Комбинации ингибитора Νδ-ЗА формулы (I) с ингибитором протеазы Νδ3 формулы (II) оценивались на клетках двух генотипов репликона 1а и 1Ъ. Как показано в табл. 2, в целом результаты от двух экспериментов на генотипе 1а показывают аддитивность с синергетическими эффектами, которые наблюдались в одном эксперименте при 75 и 95% эффективных дозах в соотношении 2,5:1 ингибитора Νδ-ЗА к

- 17 020527 ингибитору протеазы N83.

Таблица 2

Комбинации ингибитора ВГС Ν85Α формулы (I) с ингибитором протеазы N83 формулы (II) на генотипе 1а

Эксп,	Ингибито ρΝ85Α ЕС}(/, пМ	Ингибит ор протеаз ы№3 ЕС_М пМ	Соотногиени е, ингибитор N83 и ингибитору Ν85Α	Индексы комбинации (доверительный интервал)	Обобщенный результат
50% эффекти в-ности	75% эффекти в-ности	90% эффекти в-ности
1	0,045	8,5	1:1	0,98 (0,89; 1,07)	0,91 (0,79; 1,03)	0,86 (0,69; 1,03)	аддитивность
1:2,5	0,96 (0,86; 1,05)	0,95 (0,82; 1,09)	0,97 (0,75; 1,18)	аддитивность
2,5:1	0,96 (0,88; 1,03)	0,84 (0,75; 0,94)	0,76 (0,60; 0,91)	аддитивность/ синергизм
2	0,037	7,8	1:1	0,97 (0,89; 1,05)	0,96 (0,85; 1,07)	0,97 (0,80; 1,14)	аддитивность
1:2,5	0,99 (0,91; 1,07)	0,98 (0,87; 1,09)	0,98 (0,81; 1,15)	аддитивность
2,5:1	0,93 (0,85; 1,00)	0,98 (0,88; 1,09)	1,05 (0,87; 1,23)	аддитивность

Эффекты соединения Ν85Α формулы (I) в комбинации с ингибитором протеазы N83 формулы (II) на генотип 1Ь приведены в табл. 3. В целом, результаты всех трех экспериментов показывают смешанную аддитивность/синергизм.

- 18 020527

Таблица 3

Комбинация ингибитора Ν85Α формулы (I) с ингибитором протеазы N83 формулы (II) на генотипе 1Ь

Экс п.	Ингибит ор N85 А ЕСуд, пМ	Ингибито Р протеазы N83 ЕС;О, пМ	Соотношен ие, ингибитор N53 к ингибитору Ν55Α	Индексы комбинации (доверительный интервал)	Обобщенный результат
50% эффекты в-ности	75% эффектив -носит	50% эффекты в-ности
1	0,005	0,5	1:1	0,65 (0,57; 0,73)	0,72 (0,60; 0,84)	0,82 (0,60; 1,04)	синергизм / аддитивность
2,5:1	0,77 (0,69; 0,86)	0,77 0,65; 0,89)	0,80 (0,60; 0,99)	синергизм
1:2,5	0,57 (0,51; 0,63)	0,61 (0,52; 0,70)	0,68 (0,52; 0,84)	синергизм
2	0,003	0,5	1:1	0,90 (0,79; 1,01)	0,97 (0,80; 1,13)	1,07 (0,79; 1,36)	аддитивность
2,5:1	0,76 (0,67; 0,85)	0,82 (0,69; 0,95)	0,91 (0,68; 1,14)	синергизм / аддитивность
1:2,5	0,68 (0,61; 0,76)	0,78 (0,66; 0,90)	0,92 (0,70; 1,14)	синергизм / аддитивность
3	0,003	0,6	1:1	0,79 (0,72; 0,86)	0,74 (0,65; 0,82)	0,69 (0,56; 0,81)	синергизм
2,5:1	1,03 (0,93; 1,12)	0,96 (0,84; 1,07)	0,89 (0,72; 1,06)	аддитивность
1:2,5	0,91 (0,83; 0,98)	0,88 (0,78; 0,97)	0,85 (0,70; 0,99)	синергизм

Ингибитор Ν85Α формулы (I) также был протестирован в экспериментах с комбинациями трех лекарственных препаратов ΓΡΝ-α и ингибитором N83 формулы (II), используя клетки с репликонами генотипа 1Ь. Результаты четырех экспериментов показывают аддитивность/синергизм 50% и синергизм 75 и 90% эффективных значений (табл. 4).

- 19 020527

Таблица 4

Тройная комбинация с использованием ингибитора Ν85Α формулы (I) с ΓΡΝ-α и ингибитора N83 формулы (II)

Экс п.	Ингибито ρ Ν55Α, ЕСм пМ	Ингибит ор протеазы N53, ЕС}о. пМ	ΙΡΝ-α ЕСы единицы на мл	Индексы комбинации (доверительный интервал)	Обобщенный результат
50% эффектив -ности	75% эффектив -ности	50% эффекта в-ности
1	0,005	1,5	6,4	0,99 (0,89; 1,08)	0,87 (0,76; 0,98)	0,79 (0,64; 0,95)	аддитивность / синергизм
2	0,005	1,3	6,9	0,93 (0,85; 1,02)	0,81 (0,71; 0,91)	0,72 (0,58; 0,85)	аддитивность /синергизм
3	0,006	2,2	5,9	0,88 (0,77; 0,99)	0,81 (0,69; 0,94)	0,79 (0,61; 0,97)	синергизм
4	0,005	1,9	2,3	0,98 (0,86; 1,10)	0,83 (0,68; 0,97)	0,75 (0,55; 0,96)	аддитивность /синергизм

Тройные комбинации редШШ. с ингибитором протеазы Ν83 формулы (II) и ингибитором Ν85Α формулы (I) были протестированы на аддитивность. Данные от этих экспериментов подытожены в табл.

5. Аддитивность наблюдалась во всех трех экспериментах на эффективном уровне 50%. При эффективных уровнях 75 и 90% аддитивность наблюдалась в экспериментах 1 и 3, а синергизм в эксперименте 2. В целом, эти результаты показывают смешанную аддитивность и синергизм для комбинации ρβ^ΓΡΝλ с ингибиторами протеазы Ν83 и Ν85Α. Эти результаты согласуются с результатами для ιΊΡΝλΙ в комбинации с ингибитором протеазы Ν83 формулы (II) и ингибитором Ν85Α формулы (I) (табл. 6).

- 20 020527

Таблица 5

Исследование тройной комбинации с использованием редГРЫХ с ингибитором Ν85Α формулы (I) и ингибитором протеазы N83 формулы (II) ίΚξΙΡΝλ

Ингибитор

Индексы комбинации

Ингибитор (доверительный интервал)³ Обобщенный

Эксп.	ЕСы	N83, ЕС₁₀, пМ	Ν85Α,	50%,	75%	50%	результат
	нг/мл	ЕС}о, пМ	эффект	эффекти	эффекту
				ив-ности в-ности	в-ности
				1,04	1,03	1,06
1	1,8	1,1	0,004	(0,95;	(0,91;	(0,86;	аддитивность
				1,14)	1,15)	1,25)
				1,05	0,86	0,77	аддитивность при 50%
2	0,778	0,630	0,003	(0,95; 1Д5)	(0,75; 0,98)	(0,61; 0,94)
синергизм при
					75% и 90%
				1,02	0,95	1,00
3	0,867	0,947	0,003	(0,94;	(0,85;	(0,82;	аддитивность
				1,10)	1,06)	1,17)

“Соединения протестированы при соотношении 250/171 000

Таблица 6

Использование тройной комбинации с использованием ιΊΡΝλΙ с ингибитором Ν85Α формулы (I) и ингибитором N83 формулы (II) κΙΡΝλΙ

Ингибитор

Индексы комбинации

Ингибито (доверительный интервал)³ Обобщенный

Эксп. ЕС}/),		ρΝ85Α,	50%	75%	50%	результат
	N83,	ЕС;о,
нг/мл	пМ	ЕСзо, пМ	эффекти	эффекти	эффекти
			в-ности	в-ности	в-ности
			0,98	0,96	0,96
1 0,52	1,4	0,008	(0,90;	(0,85;	(0,79;	аддитивность
			1,06)	1,06)	1,13)

синергизм при 50%,

0,27

1,2

0,009

0,85	0,88	0,97	аддитивность
(0,76;	(0,75;	(0,74;	при 75% и
0,94)	1,02)	1,20)	90%

эффективных уровнях

0,53

2,3

0,005 синергизм при 50%

0,79	0,80	0,90	75%,
(0,72;	(0,70;	(0,72;	аддитивность
0,86)	0,90)	1,07)	при	90%

эффективных уровнях “Соединения протестированы при соотношении 250/1/1000

Эти результаты демонстрируют, что комбинированное лечение клеток с репликонами вируса с помощью ингибитора Ν85Α формулы (I) и ингибитора N83 протеазы формулы (II), с или без интрона Α,

ΗΡΝλ 1 или редЮШ. приводит к аддитивным и синергетическим противовирусным эффектам. Важно, что

- 21 020527 ни антагонистические эффекты, ни улучшение цитотоксичности не наблюдалось ни с одной из этих комбинаций. Следовательно, эти комбинации являются прекрасными кандидатами для комбинированных режимов лечения пациентов, инфицированных ВГС.

Специалистам в данной области будет понятно, что настоящее изобретение не ограничивается вышеупомянутыми иллюстрирующими примерами и что оно может быть воплощено в других частных формах, не отходя от основных замыслов настоящего изобретения. Таким образом, желательно, чтобы примеры, основанные на всех замыслах настоящего изобретения, оценивались как иллюстрирующие и неограничивающие, со ссылкой на приложенную формулу изобретения, а не на приведенные примеры, а все модификации, эквивалентные по смыслу формуле изобретения, включались в объем притязаний настоящего изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Композиция для лечения вируса гепатита С (ВГС) инфекции у пациента, содержащая терапевтически эффективное количество соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, терапевтически эффективное количество соединения формулы (II) <П), или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель.
2. Композиция по п.1, где отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 1:3 до примерно 3:1.
3. Композиция по п.2, где отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет от примерно 1:2,5 до примерно 2,5:1.
4. Композиция по п.3, где отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет примерно 1:1.
5. Композиция по п.3, где отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет примерно 1:2,5.
6. Композиция по п.3, где отношение соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли к соединению формулы (II) или его фармацевтически приемлемой соли составляет примерно 2,5:1.
7. Композиция по п.1, дополнительно содержащая один или два дополнительных соединения, имеющих анти-ВГС активность.
8. Композиция по п.7, где по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой интерферон или рибавирин.
9. Композиция по п.8, где интерферон выбран из интерферона альфа 2В, пэгилированного интерферона альфа, консенсусного интерферона, интерферона альфа 2А, интерферона лямбда, пэгилированного интерферона лямбда и лимфобластоидного интерферона тау.
10. Способ лечения ВГС-инфекции у пациента, включающий введение пациенту терапевтически эффективного количества композиции по п.1.

- 22 020527
11. Способ по п.10, дополнительно включающий введение пациенту одного или двух дополнительных соединений, имеющих анти-ВГС-активность, до, после или одновременно с композицией по п.1.
12. Способ по п.11, где по меньшей мере одно дополнительное соединение представляет собой интерферон или рибавирин.
13. Способ по п.12, где интерферон выбран из интерферона альфа 2В, пэгилированного интерферона альфа, консенсусного интерферона, интерферона альфа 2А, интерферона лямбда, пэгилированного интерферона лямбда и лимфобластоидного интерферона тау.