EA020130B1 - Специфичное к антигену са6 антитело, содержащий его цитотоксический конъюгат и способы применения конъюгата - Google Patents

Специфичное к антигену са6 антитело, содержащий его цитотоксический конъюгат и способы применения конъюгата Download PDF

Info

Publication number
EA020130B1
EA020130B1 EA200800642A EA200800642A EA020130B1 EA 020130 B1 EA020130 B1 EA 020130B1 EA 200800642 A EA200800642 A EA 200800642A EA 200800642 A EA200800642 A EA 200800642A EA 020130 B1 EA020130 B1 EA 020130B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
antibody
mean
zeg
carbon atoms
amino acid
Prior art date
Application number
EA200800642A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200800642A1 (ru
EA020130B9 (ru
Inventor
Джиллиан Пайн
Филип Чан
Дэниэл Таварес
Original Assignee
Иммьюноджен, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Иммьюноджен, Инк. filed Critical Иммьюноджен, Инк.
Publication of EA200800642A1 publication Critical patent/EA200800642A1/ru
Publication of EA020130B1 publication Critical patent/EA020130B1/ru
Publication of EA020130B9 publication Critical patent/EA020130B9/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
    • A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
    • A61K47/68033—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a maytansine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6877—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the antibody being an immunoglobulin containing regions, domains or residues from different species
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
    • C07K16/461—Igs containing Ig-regions, -domains or -residues form different species
    • C07K16/464—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another
    • C07K16/465—Igs containing CDR-residues from one specie grafted between FR-residues from another with additional modified FR-residues
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Изобретение направлено на моноклональное антитело и его эпитопсвязывающие фрагменты, которые распознают и связываются с гликотопом СА6, в частности на гуманизованные или поверхностно-перестроенные варианты моноклонального антитела DS6 мыши против СА6 и его эпитопсвязывающие фрагменты. Изобретение также относится к цитотоксическому конъюгату, содержащему указанные антитела, и к композициям, содержащим конъюгат, которые могут использоваться при ингибировании роста клеток и лечении раковых заболеваний.

Description

Настоящее изобретение направлено на мышиное моноклональное антитело против гликотопа СА6 и его гуманизованные или поверхностно-перестроенные варианты. Настоящее изобретение также направлено на эпитоп-связывающие фрагменты моноклонального антитела против гликотопа СА6, а также на эпитоп-связывающие фрагменты гуманизованных или поверхностно-перестроенных вариантов моноклонального антитела против гликотопа СА6.
Настоящее изобретение также направлено на цитотоксические конъюгаты, включающие агент, связывающий клетку, и цитотоксический агент, терапевтические композиции, включающие конъюгат, способы применения этих конъюгатов при ингибировании роста клеток и лечении заболеваний, а также набор, включающий цитотоксический конъюгат. В частности, агентом, связывающим клетку, является моноклональное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, который распознает и связывается с гликотопом СА6 или его гуманизованным или поверхностно-перестроенным вариантом.
Уровень техники
Предпринимались многочисленные попытки разработать противораковые терапевтические средства, специфически разрушающие заданные раковые клетки, но не повреждающие окружающие нераковые клетки и ткани. Такие терапевтические средства способны сильно улучшить лечение рака у пациентов.
Один из перспективных подходов состоит в том, чтобы соединить агент, связывающий клетку, типа моноклонального антитела с цитотоксическим препаратом (8е1а с1 а1, ίη 1тпшпосопщда1с5 189-236 (С. Уоде1, еб. 1987); Скоке е1 а1., ίη Татде1:еб Итидк 1-22 (Е. Со1бЬегд, еб. 1983); О|спсг е1 а1., ίη АйтЬобу теб1а1еб бекуегу кук1етк 1-23 (1. Воб^е11, еб. 1988); Р|е1ег8/ е1 а1., ίη АпкЬобу теб1а1еб бекуегу кук1етк 25-53 (1. Воб^е11, еб. 1988); Вито1 е1 а1., ίη АикЬобу теб1а1еб бекуегу кук1етк 55-79 (1. Воб^е11, еб. 1988)). В зависимости от агента, связывающего клетку, можно разработать такие цитотоксические конъюгаты, которые будут распознаваться и связываться только со специфическими типами раковых клеток, исходя из профиля экспрессии молекул, экспрессируемых на поверхности таких клеток.
В таких цитотоксических конъюгатах использовались цитотоксические препараты, такие как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мелфалан, митомицин С и хлорамбуцил, присоединенные к целому ряду мышиных моноклональных антител. В некоторых случаях молекулы лекарств соединяли с молекулами антител через промежуточную молекулу-носитель типа сывороточного альбумина (Сатей е1 а1., 46 Саисет Век. 2407-2412 (1986); Оккама е1 а1., 23 Саисет Iттиηо1. Iттиηо1кег. 81-86 (1986); Еп6о е1 а1., 47 Самсет Век. 1076-1080 (1980), декстрана (ΗιιηνίΙζ е1 а1., 2 Арр1. Вюскет. 25-35 (1980); МатЫ е1 а1., 34 Вюскет. Ркагтасо1. 289-291 (1985); Οί11ιη;·ιη е1 а1., 46 Сагсег Век. 4886-4891 (1986); 8коуа1 е1 а1., 85 Ргос. №111. Асаб. 8ск 8276-8280 (1988) или полиглутаминовой кислоты (Ткикаба е1 а1., 73 1. ЫаИ. Са11с. 1пк£ 721-729 (1984); КаЮ е1 а1., 27 1. Меб. Скет. 1602-1607 (1984); Ткикаба е1 а1., 52 Вг. 1. Са11сег 111-116 (1985)).
В качестве примера одного специфического конъюгата, подающего некоторые надежды, приводится конъюгат из антитела С242, направленного против антигена СашАд, экспрессированного на колоректальных и панкреатических опухолях, и производного майтансина ΌΜ1 (Ьш е1 а1., Ргос. Ыаб. Асаб. 8ск И8А, 93: 8618-8623 (1996)). Изучение этого конъюгата ίη уйто показало, что он обладает высоким сродством связывания с СаηАд, экспрессированным на клеточной поверхности, при этом значение кажущейся Кб составляет 3х10-11 М, и обладает высокой цитотоксической активностью на СаηАд-положительные клетки, при этом значение 1С50 составляет 6х10-11 М. Цитотоксичность была зависимой от антигена, так как она блокировалась избытком неконъюгированных антител, а антиген-отрицательные клетки были в 100 с лишним раз менее чувствительными к конъюгату. Другие примеры конъюгатов типа антитело-ОМ1 с высоким сродством к соответствующим клеткам-мишеням и высокой антиген-селективной цитотоксичностью включают конъюгаты с 1ιι.ιΝ901. гуманизованным вариантом антитела к СИ56 человека; киМу9-6, гуманизованным вариантом антитела к СИ33 человека; киС242, гуманизованным вариантом антитела против эпитопа Мис1 СаηАд; ки1591, деиммунизованным антителом к Р8МА; трастузумаб, гуманизованным антителом к НсгЗ/псп; и биватузумаб, гуманизованным антителом к СЭ44у6.
Разработка дополнительных цитотоксических конъюгатов, специфически распознающих определенные типы раковых клеток, имеет важное значение для постоянного усовершенствования способов лечения больных раком.
С этой целью настоящее изобретение направлено на разработку антител, распознающих и связывающихся с молекулами/рецепторами, экспрессированными на поверхности раковых клеток, и на разработку новых цитотоксических конъюгатов, включающих агенты, связывающие клетку, типа антител и цитотоксические агенты, специфически нацеленные на молекулы/рецепторы, экспрессированные на поверхности раковых клеток.
В частности, настоящее изобретение направлено на изучение характеристик нового сиалогликотопа СА6 на рецепторах муцина Мис1, экспрессируемых раковыми клетками, и на получение антител, предпочтительно гуманизованных антител, распознающих новый сиалогликотоп СА6 муцина Мис1, которые можно было бы использовать для ингибирования роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6, в качестве цитотоксического агента.
- 1 020130
Раскрытие изобретения
Настоящее изобретение охватывает антитела, специфически распознающие и связывающиеся с новым сиалогликотопом СА6 рецепторов муцина Мис1, или их эпитоп-связывающие фрагменты. В другом воплощении настоящее изобретение охватывает гуманизованные антитела или их эпитопосвязывающие фрагменты, распознающие новый сиалогликотоп СА6 (гликотоп СА6 ) рецепторов муцина Мис1.
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение включает мышиное моноклональное антитело Ό86 к СА6 (антитело Ό86), а также поверхностно-перестроенные или гуманизованные варианты антитела Ό86, у которых выходящие на поверхность остатки антитела или его эпитопосвязывающих фрагментов на легких и тяжелых цепях заменены так, чтобы они были больше похожи на поверхности известных антител человека. Гуманизованные антитела и их эпитопосвязывающие фрагменты по настоящему изобретению обладают улучшенными свойствами в том, что они значительно менее иммуногенны (либо полностью не иммуногенны) в организме человека, которому они введены, чем их полностью мышиные варианты. Таким образом, гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты по настоящему изобретению специфически распознают новый сиалогликотоп на рецепторах муцина Мис1, т.е. гликотоп СА6, и в то же время не иммуногенны для человека. Эти гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты могут быть конъюгированы с лекарственным веществом типа майтансиноида с образованием пролекарства, обладающего специфической цитотоксичностью к антиген-экспрессирующим клеткам, направляя лекарство на сиалогликотоп СА6 Мис1. При этом цитотоксические конъюгаты, содержащие такие антитела и небольшие, сильно токсичные препараты (напр., майтансиноиды, таксаны, аналоги СС-1065), могут применяться в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых опухолей типа опухолей молочной железы и яичников.
Гуманизованные варианты антител Ό86 по настоящему изобретению полностью в нем охарактеризованы в отношении соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, последовательностей ДНК генов вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, идентификации участков СЭЯ, идентификации их поверхностных аминокислот и изложения способа их экспрессии в рекомбинантном виде.
В одном воплощении представлены гуманизованные антитела Ό86 или их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь, включающую участки СЭЯ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЭ ГО N0: 1-3:
ΥΝΜΗ (8ΕφΠ)ΝΟ: 1),
ΥΙΥΡΟΝΟΑΤΝΥΝ0ΚΓΚ6 (8Е<3 ГО N0: 2),
ΟΟδνΡΡΑΥ (8Е<Э ГО N0: 3), и содержащие легкую цепь, содержащую участки СЭЯ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЭ ΙΌ N0: 4-6:
8АН88У8РМН (8Ε0ΙϋΝΟ:4),
Т 8 5 Ь А 8 (8Е0 ГО N0: 5), (2рЯ88ЕРЬТ (8ЕЦ №N0: 6).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЭ ГО N0: 7 или 8ЕЭ ГО N0: 8:
ф1УЕТф8РА1М8А8РОЕКУТ1ТС8АН88У8РМН9/РффКРОТ8РКЕ\У1¥8Т88ЕА8О νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ8ΚΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥ€φρΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Еф ГО N0:7)
ΕΐνΤΤφ8ΡΑΤΜ8Α8ΡΟΕΚνΤΙΤ08ΑΗ88ν8ΡΜΗΨΡφφΚΡΟΤ8ΡΚΕΨ1Υ8Τ88ΕΑ8Ο νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕϋΑΑΤΥΥ€φφΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Еф ГО N0: 8).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЭ ГО N0: 9, 8ЕЕ) ГО N0: 10 или 8ЕЕ) ГО N0: 11:
φΑΥΕφφ8ΟΑΕΕνΚ8ΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗ\ννΚφΤΡΟφΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝρΚΡΚΟΚΑΤΕΤΑΟΡ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Εϋ8ΑνΥΡΟΑΚ.Οϋ8νΡΡΑΥ\νθφΟΤ ЕУТУ8А (8Еф ГО N0: 9) φΑφΕνφδΟΑΕννΚΡΟΑδνΚΜδΟΚΑδΟΥΤΓΤδΥΝΜΗΨνΚφΤΡαφΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡ
ΟΝΟΑΤΝΥΝφΚΡφΟΚΑΤΕΤΑϋΤ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΕΟΑΚΟΟδνΡΓΑΥΨΟφσΤ
- 2 020130
БУТУЗА (8ΕΟΙΩΝΟ: 10) 0Α0Ενφ8ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΜ8ΟΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗΨνΚ0ΤΡΟ0ΟΕΕΨΙΟΥΙΥΡ
ΟΝ0ΑΤΝΥΝφΚΡ0ΟΚΑΤΕΤΑΕ)Ρ383ΤΑΥΜ0Ι88ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΓ0ΑΚ.ΟΌ8νΡΕΑΥΐνθ0ΟΤ БУТУЗА (δΕφΠΟΝΟ: 11).
В другом воплощении представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно-перестроенную вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕО ΙΌ N0: 8:
Е1УЕТ08РАТМ8А8РОЕВУТ1ТС8АН88У8РМНЗ¥Рр0КРОТ8РКБЗ¥1У8Т88БА8О νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥΟ00Κ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΚ (8Е() ГО ΝΟ: 8).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно-перестроенную вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8Е0 ΙΌ N0: 10 или 8Е0 ΙΌ N0: 11, соот ветственно:
9АфЕУ08ОАЕУУКРОА8УКМ8СКА8О¥ТРТ8УММНХ^УКфТРСфОЬЕ\¥1ОУ1УР ΟΝΟΑΤΝΥΝφΚΡφΟΚΑΤΕΤΑΟΤ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΡΕΑΚΟϋ8νΡΡΑΥτνθφΟΤ БУТУЗА (8Еф ГО N0:10)
0Α(2Εν08ΟΑΕννΚΡΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗλννΚ.0ΤΡΟ0ΟΕΕλΜΙΟΥΙΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝΟΚΡΟΟΚΑΤΕΤΑϋΡ888ΤΑΥΜρΐ88ΕΤ8ΕΟδΑνΥΡΟΑΚΟΏ8νΡΡΑΥΨΟΟΟΤ БУТУ8А (8Е<) Ιϋ ΝΟ: И).
Гуманизованные антитела Ό86 и их эпитопосвязывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут включать замены аминокислотных остатков в легкой и/или тяжелой цепи по одному или нескольким положениям, представленным звездочками в табл. 1, которые представляют собой остатки на поверхности мышиного каркаса, находящиеся в пределах 5А от СБК, требующие замены на остаток человека. Например, первый аминокислотный остаток О в мышиной последовательности (8Е0 ΙΌ N0: 7) был заменен на Е (8Е0 ΙΌ N0: 8) при гуманизации антитела. Однако, вследствие близости этого участка к СБК, для сохранения аффинности антител может потребоваться обратная мутация на мышиный остаток о.
Таблица 1
Остатки каркаса тиО86, находящиеся вблизи от СОК (нумерация по Кабату)
Легкая цепь Тяжелая цепь
01* 01
УЗ К.64*
Т5 Р73*
Р40 874
057
А60
867
Е81
Это также показано в табл. 2, где представлено сопоставление поверхностных остатков вариабельной области с поверхностными остатками трех наиболее гомологичных вариабельных областей человека. Аминокислотные остатки в табл. 1 соответствуют подчеркнутым аминокислотным остаткам в табл. 2.
Таблица 2
Три наиболее гомологичные поверхности антител человека
Антитело Легкая цепь 8Еф ΙΏ N0
тиОЗб 0 V Т А IР К Р 0 О А 8 К. Е К Е V Т А Т Р К Р 0 0 А 8 8 Е К ЕУТОТРК.РООО8К.ЕК Е V Т 0 Т Р К.Р 0 0 Ώ 8 К.Е К 8Еф ГО N0 12
28Е4 8Еф ГО N0 13
ΗΑΖοΡΒ ЗЕфГОИО 14
88аРВ 8Еф ГО N0 15
Антитело Тяжелая цепь 8Еф ГО N0
тиО86 0 Υ 0 А Б К 8 К К Р О 0 </1 К К (Ζί Р 8 8 8 Е 0 8 0фУАУКРККРО00КфОТ888Е08 - 0УАУКРККРОффКфОЕ888Е08 -0УАУКРККР600К0СЕ888Е08 8Еф ГО N0 16
28Е4 8Еф ГО N0 17
ΗΑΖοΡΒ 8Е0 ГО ΝΟ 18
ЗЗаРВ 8Ер ГО N0 19
Настоящее изобретение также предусматривает цитотоксические конъюгаты, включающие: (1) агента, связывающего клетку, распознающего и связывающегося с гликотопом СА6, и (2) цитотоксического агента. В цитотоксических конъюгатах агент, связывающий клетку, обладает высоким сродством к
- 3 020130 гликотопу СА6, а цитотоксический агент обладает высокой степенью цитотоксичности для клеток, экспрессирующих гликотоп СА6, при этом цитотоксические конъюгаты настоящего изобретения образуют эффективные поражающие средства.
В предпочтительном воплощении агентом, связывающим клетку, является антитело к СА6 или его эпитоп-связывающий фрагмент, более предпочтительно гуманизованное антитело к СА6 или его эпитопсвязывающий фрагмент, причем цитотоксический агент ковалентно присоединен, непосредственно или через расщепляемый или нерасщепляемый линкер, к антителу или его эпитоп-связывающему фрагменту. В более предпочтительных воплощениях агентом, связывающим клетку, является гуманизованное антитело Ό86 или его эпитоп-связывающий фрагмент, а цитотоксическим агентом является таксол, майтансиноид, СС-1065 или аналог СС-1065.
В предпочтительных воплощениях изобретения агентом, связывающим клетку, является гуманизованное антитело к СА6, а цитотоксическим агентом является цитотоксический препарат, к примеру, майтансиноид или таксан.
Более предпочтительно агентом, связывающим клетку, является гуманизованное антитело Ό86 к СА6, а цитотоксическим агентом является соединение майтансина типа ΌΜ1 или ΌΜ4.
Настоящее изобретение также включает способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6. В предпочтительных воплощениях способ ингибирования роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6, осуществляется ίη νίνο и приводит к гибели клеток, хотя включено и его применение ίη νίΐτο и ех νίνο.
Настоящее изобретение также предусматривает терапевтическую композицию, включающую цитотоксический конъюгат и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
Настоящее изобретение также включает способ лечения больных, страдающих раком, с помощью терапевтической композиции. В предпочтительных воплощениях цитотоксический конъюгат включает антитело к СА6 и цитотоксического агента. В более предпочтительных воплощениях цитотоксический конъюгат включает конъюгат гуманизованного антитела Ό86 с ΌΜ1, гуманизованного антитела Ό86 с ΌΜ4 или гуманизованного антитела Ό86 с таксаном, причем конъюгат вводится вместе с фармацевтически приемлемым носителем или наполнителем.
Настоящее изобретение также включает набор, включающий конъюгат антитела к СА6 с цитотоксическим агентом и инструкции по применению. В предпочтительных воплощениях антитело к СА6 представляет собой гуманизованное антитело Ό86, цитотоксическим агентом является соединение майтансина типа ΌΜ1 или ΌΜ4 либо таксан, а инструкции по применению предназначены для применения конъюгата при лечении больных, страдающих раком. Набор также может включать и компоненты, необходимые для приготовления фармацевтически приемлемой лекарственной формы, к примеру, разбавитель, если конъюгат находится в лиофилизованном состоянии или в концентрированном виде, а также для применения лекарственной формы.
Настоящее изобретение также включает производные антител, которые специфически связываются с и распознают гликотоп СА6. В предпочтительных воплощениях производные антител получают путем перестройки поверхности или гуманизации антител, связывающихся с гликотопом СА6, при этом производные обладают пониженной иммуногенностью в отношении хозяина.
Настоящее изобретение также предусматривает гуманизованные антитела или их фрагменты, которые дополнительно помечены для применения в исследованиях или в диагностике. В предпочтительных воплощениях метка представляет собой радиометку, флуорофор, хромофор, контрастирующее вещество или ион металла.
Также предусматривается способ диагностики, в котором данные меченные гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты вводятся пациенту, у которого есть подозрение на рак, и измеряется или отслеживается распределение метки в организме пациента.
Настоящее изобретение также предусматривает способы лечения больных, страдающих раком, путем введения конъюгата гуманизованного антитела по настоящему изобретению, одного или в сочетании с другими цитотоксическими или терапевтическими веществами. Рак может представлять собой, к примеру, рак молочной железы, рак толстой кишки, рак яичников, рак эндометрия, остеосаркому, рак шейки матки, рак простаты, рак легких, синовиальную карциному, рак поджелудочной железы, саркому или карциному, при которой экспрессируется СА6, или другой вид рака, еще не известный, при котором преимущественно экспрессируется гликотоп СА6.
Если только не указано иначе, все ссылки и патенты, цитируемые в настоящем изобретении, включены путем отсылки.
Краткое описание фигур
На фиг. 1 представлены результаты исследований, проведенных для определения способности антитела Ό86 к связыванию с поверхностью выбранных линий раковых клеток. Измеряли флуоресценцию клеток, инкубированных с первичным антителом Ό86 и с вторичными антителами против 1дС (Н+Ь) мыши, конъюгированными с Б1ТС, методом проточной цитометрии. Антитело Ό86 связывалось с клетками Саоу-3 (фиг. 1А) и Τ-47Ό (фиг. 1В) с кажущимся значением Ка, равным 1,848 и 2,586 нМ, соответственно. Клетки отрицательных по антигену линий 8Κ-ΟΥ-3 (фиг. 1С) и Со1о205 (фиг. 1Ό) не проявляли
- 4 020130 специфичного к антигену связывания.
На фиг. 2 представлены результаты анализа экспрессии эпитопа методом дот-гибридизации. Лизаты клеток Саоу-3 (фиг. 2А и 2В), 8КМЕБ28 (фиг. 2С) и Со1о205 (фиг. 2И) индивидуально наносили на нитроцеллюлозные мембраны, а затем индивидуально инкубировали с проназой, протеиназой К, нейраминидазой или йодной кислотой. После этого мембраны подвергали иммуноблоттингу с антителом И86 (фиг. 2А), антителом СМ1 (фиг. 2В), антителом К.24 (фиг. 2С) или антителом С242 (фиг. 2И).
На фиг. 3 представлены результаты анализа экспрессии антигена И86 методом дот-гибридизации. Лизаты клеток Саоу-3 индивидуально наносили на мембраны РУЭЕ. а затем инкубировали в присутствии трифторметансульфоновой кислоты (ТРМ8А). После этого мембраны подвергали иммуноблоттингу с антителом СМ1 (1 и 2) или антителом И86 (3 и 4).
На фиг. 4 представлены результаты анализа гликотопов антигена И86. Лизаты клеток Саоу-3, предварительно обработанные Ν-гликаназой (Ы-д1у), О-гликаназой (О-д1у) и/или сиалидазой (8), наносили на нитроцеллюлозные мембраны, а затем подвергали иммуноблоттингу с антителом И86 или антителом СМ1 (νΝΤΚ Мис-1).
На фиг. 5 представлены результаты анализа антигена И86 методом вестерн-гибридизации. Лизаты клеток подвергали иммунопреципитации (1Р) и иммуноблоттингу с антителом И86. Антиген соответствует полосе белка >250 кДа, наблюдаемой у антиген-положительных клеток Саоу-3 (фиг. 5А и 5В) и Т47И (фиг. 5С). Отрицательные по антигену клетки линий 8К-ОУ-3 (фиг. 5И) и Со1о205 (фиг. 5Е) не проявляли этой полосы. После иммунопреципитации шарики с белком С из лизатов клеток Саоу-3 инкубировали с нейраминидазой (Ν) (фиг. 5А) или йодной кислотой (РА) (фиг. 5В). На том же геле разгоняли и контроли: антитело (α), проточные фракции лизатов до 1Р (Бук) и после 1Р (ЕТ). Иммунопреципитаты Саоу-3 также инкубировали с Ν-гликаназой (№д1у), О-гликаназой (О-д1у) и/или сиалидазой (8) (см. фиг. 5Е, на которой блот-мембраны альтернативно подвергались гибридизации с биотинилированным И86 и стрептавидин-НКР).
На фиг. 6 представлены результаты иммунопреципитации и/или иммуноблоттинга лизатов клеток Саоу-3 (фиг. 6А) и НеЬа (фиг. 6В) с помощью антитела И86 или антитела СМ1. Перекрывание сигналов от СМ1 и И86 на вестерн-блотах означает, что антиген И86 находится на белке Мис1. У лизатов НеЬа раздвоение полосы Мис1 возникает из-за того, что экспрессия Мис1 управляется разными аллелями, которые отличаются по числу тандемных повторов.
На фиг. 7 представлена схема определения антител И86 методом сэндвич-ЕЬ18А (фиг. 7А) и стандартная кривая (фиг. 7В). Стандартная кривая была получена при известных концентрациях коммерчески доступных стандартов СА15-3 (при этом 1 ед. СА15-3 = 1 ед. И86).
На фиг. 8 представлены стандартные кривые для количественного метода ЕБ18А. Стандартные кривые по сигналам детектирующего антитела (стрептавидин-НКР/биотин-И86) (фиг. 8С) определяли при известных концентрациях биотин-И86, захваченного нанесенным на планшет козьим антителом против 1дС мыши (фиг. 8А), либо нанесенного непосредственно на планшет для ЕБ18А (фиг. 8В).
На фиг. 9 представлены последовательности кДНК и аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой цепи (фиг. 9А) и тяжелой цепи (фиг. 9В) мышиного антитела И86. В каждой последовательности подчеркнуты три участка СИК (согласно определению Кабата).
На фиг. 10 представлены участки СИК легкой (фиг. 10А) и тяжелой цепи (фиг. 10В) мышиного антитела И86, определенные по правилам Кабата. Моделирование с помощью программы АЬМ дает несколько другую картину для участков СИК тяжелой цепи (фиг. 10С).
На фиг. 11 представлены аминокислотные последовательности легкой цепи (тиО86ЬС) (остатки 1-95 в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 7) и тяжелой цепи (тиО86НС) (остатки 1-98 в 8ЕЦ ГО ΝΟ: 9) мышиного антитела И86, сопоставленные с эмбриональными последовательностями генов 1дУк ар4 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 23) и 1дУЪ 1558.41 (8ЕЦ ГО ΝΟ: 24). Серым цветом обозначено расхождение последовательностей.
На фиг. 12 представлены десять последовательностей легких цепей и тяжелых цепей, наиболее гомологичных последовательностям легкой цепи (тиО86ЬС) и тяжелой цепи (тиО86НС) мышиного антитела И86, по которым имеются файлы разрешенных структур в базе данных Вгоокйауеи. Последовательности расположены в порядке от наибольшей до наименьшей гомологии.
На фиг. 13 представлены данные и расчеты по поверхностной доступности для прогнозирования тех остатков вариабельных областей легкой цепи мышиного антитела И86, которые доступны с поверхности. Положения, имеющие среднюю поверхностную доступность в 25-35% и отмеченные как ??, подвергали второму циклу анализа. Вариабельные области легкой цепи (фиг. 13А) и вариабельные области тяжелой цепи (фиг. 13В) антитела И86.
На фиг. 14 представлена карта экспрессионной плазмиды для млекопитающих ртИ86 ν1-0. Эту плазмиду использовали для создания и экспрессии рекомбинантных химерных и гуманизованных антител И86.
На фиг. 15 представлены аминокислотные последовательности вариабельных доменов легкой цепи (фиг. 15А) и тяжелой цепи (фиг. 15В) мышиного (тиО86) и гуманизованного (йиО86) (1.01 и 1.21) антитела И86.
- 5 020130
На фиг. 16 представлена последовательность кДНК и аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи гуманизованного антитела Ό86 (киО86)(1.01 и1 .21).
На фиг. 17 представлена последовательность кДНК и аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи варианта 1.01 (фиг. 17А) и 1.21 (фиг. 17В) гуманизованного антитела Ό86 (ЬиБ86).
На фиг. 18 представлены полученные методом проточной цитометрии кривые связывания мышиного Ό86 (шиОЗб), химерного Ό86 (сЮ86), варианта 1.01 (1шЭ86 ν1.01) и варианта 1.21 (1шЭ86 ν1.21) гуманизованного Ό86 из опыта, проведенного на клетках КВ. Авидности мышиных, химерных и гуманизованных (ν1.01 и ν1.21) антител Ό86 (тиО86 = 0,82 нМ, сЮ86 = 0,69 нМ, 1πΌ86ν1.01 = 0,82 нМ и 1шЭ86у1.21 = 0,85 нМ) сравнимы, свидетельствуя о том, что перестройка поверхности не привела к уменьшению авидности.
На фиг. 19 представлены результаты анализа конкуренции за связывание антител тиО86, сЮ86. 1шЭ86у1.01 и 1шЭ86у1.21 с биотинилированным тиЭ86. Различные концентрации голых тиО86, сЮ86, 1шО86у1.01 и НиЭ86у1.21 комбинировали с 2 нМ биотин-тиО86 и стрептавидин-ΌΤΛΕ (вторичным антителом). Значения 1С50 (тиО86 = 1,9 нМ, сНЭ86 = 1,7 нМ, 1πΌ86ν1.01 = 3,0 нМ и 1πΌ86ν1.21 =
1.9 нМ) у всех антител были близкими, свидетельствуя о том, что гуманизация не привела к уменьшению авидности.
На фиг. 20 представлены результаты определения аффинности связывания неконъюгированного антитела Ό86 по сравнению с конъюгатом антитело Ό86-ΌΜ1. Результаты показали, что конъюгирование с ΌΜ1 не оказывает отрицательного эффекта на аффинность связывания антитела. Кажущееся значение К, у конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 (3,902 нМ) (Ό86-ΌΜ1) было слегка выше, чем у голого антитела (2,020 нМ) (Ό86).
На фиг. 21 представлены результаты косвенного определения жизнеспособности клеток с помощью антитела Ό86 в присутствии и в отсутствие конъюгата антител против 1§С (Н+Ь) мыши с ΌΜ1 (2°АЬΌΜ1). Антиген-положительные клетки Саον-3 погибали зависящим от антитела Ό86 образом (1С50 =
424.9 пМ) только в присутствии вторичного конъюгата (Ό86 + 2°Α^ΌΜ1).
На фиг. 22 представлены результаты анализа комплемент-зависимой цитотоксичности (СЭС) антитела тиО86. Результаты показывают отсутствие эффекта типа СЭС у антитела Ό86 на клетки НРАС (фиг. 22А) и ΖΚ-75-1 (фиг. 2В).
На фиг. 23 представлены результаты анализа цитотоксичности ίη νίΐτο конъюгата антитело Ό86ΌΜ1 по сравнению со свободным майтансином. Клоногенным методом тестировали на цитотоксичность положительные по антигену Ό86 клетки раковых линий яичников (фиг. 23А), молочной железы (фиг. 23В), шейки матки (фиг. 23С) и поджелудочной железы (фиг. 23Ό) при непрерывном воздействии конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 (слева). Клетки этих линий таким же образом тестировали на чувствительность к майтансину при воздействии свободного майтансина в течение 72 ч (справа). При тестировании использовали следующие линии раковых клеток: из яичников - ОУСАК5, ТОУ-21О, Саον-4 и Саον-3; молочной железы - Τ47Ό, ВТ-20 и ВТ-483; шейки матки - КВ, НеЬа и \У18Н; поджелудочной железы НРАС, Н8766Т и НРАР-1Б.
На фиг. 24 представлены результаты анализа цитотоксичности ίη νίΐτο конъюгата антитело Ό86ΌΜ1. При определении жизнеспособности клеток методом МТТ раковые клетки яичников (фиг. 24А, 24В и 24С), молочной железы (фиг. 24Ό и 24Е), шейки матки (фиг. 24Р и 240) и поджелудочной железы (фиг. 24Н и фиг 241) человека погибали зависящим от конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 образом. Голые Ό86 не оказывали отрицательного эффекта на рост этих клеток, свидетельствуя, что для цитотоксичности необходимо конъюгирование с ΌΜ1.
На фиг. 25А представлены результаты исследования противоопухолевого действия ίη νίνο конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 на привитые подкожно опухоли ксенотрансплантатов КВ. Раковые клетки инокулировали в день 0, а первую обработку проводили в день 6. Обработку иммуноконъюгатом продолжали ежедневно до введения всех 5 доз. Контрольным животным, получавшим РВ8, делали эвтаназию после того, как объем опухоли превышал 1500 мм3. Конъюгат вводили в дозе 150 или 225 мкг/кг ΌΜ1, что соответствует концентрации антител 5,7 и 8,5 мг/кг, соответственно. Во время исследования регистрировали вес тела мышей (фиг. 25В).
На фиг. 26 представлены результаты исследования противоопухолевого действия конъюгата антитело Ό86-ΌΜ1 на привитые подкожно ксенотрансплантаты опухолей. Клетки ОУСАК5 (фиг. 26А и 26В), ТОУ-21О (фиг. 26С и 26Ό), НРАС (фиг. 26С и 26Р) и НеБа (фиг. 260 и 26Н) инокулировали в день 0, а обработку иммуноконъюгатом проводили в день 6 и 13. Контрольным животным, получавшим РВ8, делали эвтаназию после того, как объем опухоли превышал 1000 мм3. Конъюгат вводили в дозе 600 мкг/кг ΌΜ1, что соответствует концентрации антител 27,7 мг/кг. Во время исследования регистрировали объем опухолей (фиг. 26А, 26С, 26Е и 260) и вес тела (фиг. 26В, 26Ό, 26Р и 26Н) мышей.
На фиг. 27 представлены результаты исследования действия конъюгата антитело ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 на внутрибрюшинные опухоли ОУСАК5. Раковые клетки вводили внутрибрюшинно в день 0, а обработку иммуноконъюгатом проводили в день 6 и 13. Животным делали эвтаназию после того, как потеря веса тела превышала 20%.
- 6 020130
На фиг. 28 представлена полученная методом проточной цитометрии кривая связывания из исследования аффинности связывания голых и конъюгированных с таксаном антител Ό86 на клетках НеЬа. Конъюгирование с таксаном (ММ1-202) не оказывает отрицательного эффекта на аффинность связывания антител. Кажущееся значение Κ,ι у конъюгата Ό86-ΜΜ1-202 (1,24 нМ) было слегка выше, чем у голого антитела Ό86 (620 пМ).
На фиг. 29 представлено связывание ίη νίίτο и активность конъюгата гуманизованного варианта 1.01 антитела Ό86. Конъюгирование 1ιιιΌ86ν1.01 с ΌΜ4 оказывает незначительное влияние на авидность 1ιι.ιΌ86ν1.01 к клеткам КВ (фиг. 29А). Конъюгат 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 проявляет сильную цитотоксичность ίη νίίτο на экспрессирующие Ό86 клетки \У18Н. при этом значение 1С50 составляет 0,44 нМ (фиг. 29В).
На фиг. 30 представлены результаты исследования действия ίη νίνο конъюгата 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 на модели рака поджелудочной железы НРАС. Конъюгат 1ιιιΌ86ν1.01-ΌΜ4 проявляет сильную противоопухолевую активность, тогда как контрольный конъюгат В4-ЭМ4, мишень которого не экспрессируется на модели НРАС, практически не обладает активностью (фиг. 30А). Вводимая доза 200 мкг/кг не была токсичной для животных, о чем свидетельствует отсутствие потери веса (фиг. 30В).
Осуществление изобретения
Настоящее изобретение предусматривает, среди прочих особенностей, моноклональные антитела к СА6, гуманизованные антитела к СА6 и фрагменты антител к СА6. Каждое из антител и фрагментов антител настоящего изобретения предназначено для распознавания и связывания с гликотопом СА6 на поверхности клетки. Известно, что СА6 экспрессируется во многих типах опухолей человека: 95% серозных карцином яичников, 50% эндометриозных карцином яичников, 50% новообразований шейки матки, 69% новообразований эндометрия, 80% новообразований вульвы, 60% карцином молочной железы, 67% опухолей поджелудочной железы и 48% опухолей уротелиальных опухолей, но редко экспрессируется в нормальных тканях человека.
В работе Кеагке еί а1., Ιηί. ί. Сапсег 88(6): 866-872 (2000) белок, на котором находится эпитоп СА6, был ошибочно идентифицирован, как белок в 80 кДа, содержащий Ν-связанный углевод, который содержит эпитоп СА6, когда они использовали супернатант гибридомы для его изучения. Используя очищенный Ό86, мы после этого показали, что эпитоп СА6 находится на О-связанном углеводе гликопротеида более 250 кДа, не связанного дисульфидными связями. Более того, гликопротеид был идентифицирован как муцин Мис1. Поскольку разные аллели Мис1 имеют различное число тандемных повторов в домене вариабельного числа тандемных повторов (νΝΤΚ), то клетки зачастую экспрессируют два разных белка Мис1 различного размера (Тау1ог-Рараб1шйпои, Вюсйеш. Вюрйук. Айа 1455(2-3): 301-13 (1999). Вследствие отличий по числу повторов в домене νΝΤΚ, а также отличий по гликозилированию, молекулярный вес Мис1 различается в зависимости от клеточной линии.
Чувствительность иммунореактивности СА6 к йодной кислоте означает, что эпитоп СА6 является углеводным гликотопом. Кроме того, чувствительность иммунореактивности СА6 к обработке нейраминидазой из νίόπο с1ю1ега означает, что эпитоп СА6 является гликотопом, зависящим от сиаловой кислоты, то есть сиалогликотопом.
Подробные характеристики СА6 можно найти в примере 2 (см. ниже). Дополнительные подробности о СА6 можно найти в \УО 02/16401; νοηηοΛοτ^ еί а1., Ат. 1. Ра^Е 143(4): 1050-1054 (1993); 8ιηί11ι еί а1., Нитаη Аηί^Ьοά^е8 9: 61-65 (1999); Кеагке еί а1., Ιηί. 1. Саг1сег 88(6): 866-872 (2000); 8ιηί11ι еί а1., Ιηί. 1. буге^Е Ра^Б 20(3): 260-6 (2001) и 8ιηί11ι еί а1., Арр1. IттиηοЫ8ίοсйет. Μο1. [Ποροίοΐ. 10(2): 152-8 (2002).
Настоящее изобретение также включает цитотоксические конъюгаты, содержащие два первичных компонента. Первым компонентом является агент, связывающий клетку, который распознает и связывается с гликотопом СА6. Агент, связывающий клетку, должен распознавать сиалогликотоп СА6 на Мис1 с высокой степенью специфичности с тем, чтобы цитотоксические конъюгаты распознавали и связывались только с теми клетками, для которых они предназначены. Высокая степень специфичности позволяет конъюгатам действовать направленным образом с незначительными побочными эффектами, возникающими из-за неспецифического связывания.
В следующем воплощении агент, связывающий клетку, по настоящему изобретению также распознает гликотоп СА6 с высокой степенью аффинности с тем, чтобы конъюгаты находились в контакте с клетками-мишенями в течение достаточного времени, позволяющего цитотоксической лекарственной части конъюгата действовать на клетку, и/или дающего конъюгатам достаточно времени, за которое они будут интернализованы клеткой.
В предпочтительном воплощении цитотоксические конъюгаты включают в качестве агента, связывающего клетку, антитело к СА6, более предпочтительно мышиное моноклональное антитело Ό86 к СА6. В более предпочтительном воплощении цитотоксические конъюгаты включают гуманизованное антитело Ό86 или его эпитоп-связывающий фрагмент. Антитело Ό86 способно распознавать СА6 с высокой степенью специфичности и направляет цитотоксический агент к аномальной клетке или ткани типа раковых клеток целенаправленным образом.
Вторым компонентом цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения является цитотоксический агент. В предпочтительном воплощении цитотоксическим агентом является таксол, майтансиноид
- 7 020130 типа ΌΜ1 или ΌΜ4, СС-1065 или аналог СС-1065. В предпочтительных воплощениях агенты, связывающие клетки, по настоящему изобретению ковалентно соединяются, непосредственно либо через расщепляемый или нерасщепляемый линкер, с цитотоксическим агентом.
Агенты, связывающие клетки, цитотоксические агенты и линкеры рассмотрены более подробно ниже.
Агенты, связывающие клетки
Эффективность соединений настоящего изобретения в качестве терапевтических средств зависит от тщательного выбора соответствующего агента, связывающего клетку. Агенты, связывающие клетку, могут быть любого типа, известного в настоящее время или ставшего известным, причем не только пептиды. Агентом, связывающим клетку, может быть любое соединение, которое может связаться с клеткой как специфическим, так и неспецифическим образом. В общем, ими могут быть антитела (особенно моноклональные антитела), лимфокины, гормоны, факторы роста, витамины, молекулы переносчиков питательных веществ (к примеру, трансферрина) или любые другие молекулы либо вещества, связывающиеся с клетками.
Более конкретные примеры агентов, связывающих клетку, которые можно использовать, включают:
(a) поликлональные антитела;
(b) моноклональные антитела;
(c) фрагменты антител типа БаЬ, БаЬ' и Р(аЬ')2, Ρν (Рагйат., 1. 1ттипо1. 131: 2895-2902 (1983); 8рппд е! а1., 1. 1ттипо1. 113: 470-478 (1974); ΝίκοηοίΡ е! а1., Агсй. Вюсйет. Вюрйуз. 89: 230-244 (1960);
(б) интерфероны (напр., α-, β-, γ-интерферон);
(е) лимфокины типа 1Ь-2, 1Ь-3, 1Ь-4, 1Ь-6;
(ί) гормоны, такие как инсулин, ТКН (тиреотропин-высвобождающий гормон), М8Н (меланоцитстимулирующий гормон), стероидные гормоны типа андрогенов и эстрогенов;
(д) факторы роста и колониестимулирующие факторы, такие как ЕСР, α-ТСР, РСР, УЕСР, С-С8Р, М-С8Р и СМ-С8Р (Витдезз, 1ттипо1оду Тобау 5: 155-158 (1984);
(й) трансферрин (О'КееГе е! а1., 1. Вю1. Сйет. 260: 932-937 (1985) и (ί) витамины, такие как фолат.
Антитела
Выбор надлежащего агента, связывающего клетку, является важным делом, которое зависит от того, какая популяция клеток должна стать мишенью, но в общем случае предпочтительны антитела, если имеется или может быть получено надлежащее антитело, более предпочтительно моноклональное антитело.
Методы моноклональных антител позволяют получить чрезвычайно специфические агенты, связывающие клетку, в виде специфических моноклональных антител. В данной области особенно хорошо известны методы получения моноклональных антител путем иммунизации мышей, крыс, хомяков или любых других млекопитающих соответствующим антигеном, к примеру, интактными клетками мишени, выделенными из клеток мишени антигенами, целыми вирусами, ослабленными целыми вирусами и такими вирусными белками, как белки оболочки вируса. Также можно использовать сенсибилизированные клетки человека. Другим методом получения моноклональных антител является использование фаговых библиотек 8сΡν (одноцепочечных вариабельных участков, в частности 8сΡν человека (напр., см. СтйТййз е! а1., И8 Ра!еп! №к. 5,885,793 и 5,969,108; МсСайейу е! а1., АО 92/01047; Ыттд е! а1., АО 99/06587).
Типичное антитело состоит из двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей, которые соединяются дисульфидными связями. Вариабельная область представляет собой часть тяжелой цепи или легкой цепи антитела, которая отличается по последовательности от других антител и кооперативно участвует в связывании и специфичности каждого конкретного антитела к антигену. Обычно вариабельность не распределяется равномерно по вариабельным участкам антител. Как правило, она сосредоточена в трех сегментах вариабельной области, именуемых участками, определяющими комплементарность (СЭК), или гипервариабельными участками, как в легкой цепи, так и в тяжелой цепи. Очень консервативные части вариабельных областей называют каркасными участками. Вариабельные области тяжелых и легких цепей содержат по четыре каркасных участка, которые в основном принимают конфигурацию β-листа, при этом каждый каркасный участок соединяется тремя участками СЭК, которые образуют петли, соединяющие структуры типа β-листа, а в некоторых случаях сами входят в эти структуры типа β-листа. Участки СЭК в каждой цепи удерживаются близко друг к другу каркасными участками, при этом участки СЭК из другой цепи вносят вклад в образование антигенсвязывающего сайта антител (Е.А. КаЬа! е! а1. 8ес.|иепсе8 оГ Рто!е1пз оГ 1ттипо1од1са1 1п!егез!, Р1П11 Ебйюп, 1991, ΝΙΗ).
Константная область входит в состав тяжелой цепи. Хотя она и не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но она выполняет различные эффекторные функции, такие как участие антитела в клеточной токсичности антител.
Подходящим моноклональным антителом для применения в настоящем изобретении является мышиное моноклональное антитело Ό86 (И.8. Ра!еп! №. 6,596,503; депонировано в АТСС под номером РТА-4449).
- 8 020130
Гуманизованные или поверхностно-перестроенные антитела Б86
Предпочтительно в качестве агента, связывающего клетку, по настоящему изобретению используется гуманизованное антитело к СА6. Предпочтительным воплощением такого гуманизованного антитела является гуманизованное антитело Ό86 или его эпитоп-связывающий фрагмент.
Целью гуманизации является уменьшение иммуногенности чужеродного антитела типа мышиного антитела для введения его человеку, при сохранении полной аффинности связывания анигена и специфичности антитела.
Гуманизованные антитела могут быть получены при помощи нескольких технологий, таких как перестройка поверхности и пересадка участков СГОВ. В настоящем изобретении в технологии перестройки поверхности применяется сочетание молекулярного моделирования, статистического анализа и мутагенеза для изменения не входящих в СОВ поверхностей вариабельной области антител с тем, чтобы они были похожи на поверхности известных антител организма-хозяина.
Подходы и методы перестройки поверхности антител, как и другие способы уменьшения иммуногенности антител в другом организме, изложены в И8 Ра1еи1 5639641 (Ребегаеи е! а1.), который включен в настоящее изобретение во всей полноте путем отсылки. Вкратце, в предпочтительном способе: (1) проводится сопоставление положений вариабельных областей тяжелой и легкой цепи ряда антител, чтобы получить такой набор выходящих на поверхность положений каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, в котором совмещенные положения всех вариабельных областей будут идентичными по меньшей мере на 98%; (2) определяется набор выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи для антитела (или его фрагмента) грызуна; (3) устанавливается набор выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, который более всего идентичен набору выходящих на поверхность аминокислотных остатков грызуна; (4) набор выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, определенный на стадии 2, заменяется набором выходящих на поверхность аминокислотных остатков каркаса вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, установленным на стадии 3, за исключением тех аминокислотных остатков, которые находятся в пределах 5А от любого атома любого остатка участков СОВ антитела грызуна; и (5) вырабатывается гуманизованное антитело грызуна, которое обладает специфичностью связывания. Антитела могут быть гуманизированы при помощи ряда других методов, в том числе пересадки СОВ (ЕР 0239400; \УО 91/09967; Ц.8. Ра!. N08. 5530101 и 5585089), гиперхимеризации или перестройки поверхности (ЕР 0592106; ЕР 0519596; Раб1аи Е.А., 1991, Мо1еси1аг 1штипо1о§у 28(4/5): 489-498; 81ибшека 6.М. е! а1., 1994, Рто!еш Еидшеепид 7(6): 805-814; Во§и8ка М.А. е! а1., 1994, РNА8 91: 969-973) и перетасовки цепей (И8 Рак Νο. 5565332). Антитела человека могут быть получены рядом методов, известных в данной области, включая методы фагового дисплея. См. также И8 Ра!. N08. 4444887, 4716111, 5545806 и 5814318; и публикации международных патентных заявок \УО 98/46645, \УО 98/50433, \УО 98/24893, \УО 98/16654, \УО 96/34096, \УО 96/33735 и \УО 91/10741 (данные ссылки включены путем отсылки во всей полноте).
В предпочтительном воплощении настоящее изобретение предусматривает гуманизованные антитела или их фрагменты, которые распознают новый сиалогликотоп (гликотоп СА6) на муцине Мис1. В другом воплощении гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты обладают дополнительной способностью к ингибированию роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6.
В более предпочтительных воплощениях представлены поверхностно-перестроенные или гуманизованные варианты антитела Ό86, у которых выходящие на поверхность остатки антитела или его фрагментов подвергаются замене на легких и тяжелых цепях с тем, чтобы они стали более похожими на поверхности известных антител человека. Гуманизованные антитела Ό86 или их эпитоп-связывающие фрагменты специфически распознают новый сиалогликотоп (гликотоп СА6) на муцине Мис1. Более предпочтительно гуманизованные антитела Ό86 или их эпитопосвязывающие фрагменты обладают дополнительной способностью к ингибированию роста клеток, экспрессирующих гликотоп СА6. Гуманизованное антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент может быть конъюгировано с лекарственным препаратом типа майтансиноида с образованием пролекарства, обладающего специфической цитотоксичностью к экспрессирующим антиген клеткам, направляя лекарство на сиалогликотоп СА6 Мис1. Цитотоксические конъюгаты, включающие такие антитела и небольшие, сильно токсичные препараты (например, майтансиноиды, таксаны, аналоги СС-1065), могут применяться в качестве терапевтических препаратов для лечения раковых опухолей типа опухолей молочной железы и яичников.
Гуманизованные варианты антитела Ό86 по настоящему изобретению полностью в нем охарактеризованы в отношении соответствующих аминокислотных последовательностей вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, последовательностей ДНК генов вариабельных областей их легких и тяжелых цепей, идентификации участков СОВ, идентификации их поверхностных аминокислот и изложения способа их экспрессии в рекомбинантном виде.
В одном воплощении представлены гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие тяжелую цепь, включающую участки СОВ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕЦ ГО NО: 1-3:
- 9 020130
При определении участков СЭВ тяжелой цепи с помощью моделирующей программы ЛЬМ они представлены 8ЕЦ ГО N0: 20-22:
В том же воплощении гуманизованные антитела или их эпитоп-связывающие фрагменты содержат легкую цепь, содержащую участки СЭВ, имеющие аминокислотные последовательности, представленные 8ЕС) ГО N0: 4-6:
Также представлены гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 7 или 8ЕО ГО N0: 8:
01УЕТф5РА1М8А8РОЕКУТ1ТС8АН88У8РМЮИГО0КРОТ8РКЕУаУ8Т88ЕА8(л
УРАКГСг0808СТ8У8ЕТ18КМЕАЕОААТУУСфрК88РРЬТЕОАОТКЬЕЕКВ (8ЕЭ ΙΟΝΟ: 7)
ΕΐνΕΤφ8ΡΑΤΜ8Α8ΡΟΕΚνΤΙΤΓ8ΑΗ88ν8ΓΜΗΨΡς0ΚΡΟΤ8ΡΚΕ\νΐΥ8Τ88ΕΑ8Ο νΡΑΚΡΟΟ8Ο8ΟΤ8Υ8ΕΤΙ88ΜΕΑΕΟΑΑΤΥΥ00ΡΚ88ΡΡΕΤΡΟΑΟΤΚΕΕΕΚΒ (8ВД ГО N0: 8).
Также представлены гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична аминокислотной последовательности, представленной 8ЕЦ ГО N0: 9, 8ЕЦ ГО N0: 10 или 8ЕО ГО N0: 11:
ρΑΥΕςςδ0ΑΕΕνΒ8ΟΑ8νΚΜ80ΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗΨνκρΤΡθρθΕΕνΐ0ΥΙΥΡ
С1ШдАГЕА\фКЕКСтКАТ1ТА1)Р888ТАУМО1881гТ8Е1)8АУ\'ЕСАК(ГО8УРЕАУ’'Л'гС0СТ
ЬУТУ8А (8ЕЦ ГО N0: 9)
0Λ0Τ,νρ8ΟΛΕννΚΡθΛ8νΚ_\Ί80ΚΑ8Γ7ΥΤΕΤ8λΤΙΜΗΨνΚ0ΤΡΓι0ίίΕΕ\\'Ί6ϊΊΥΡ ΟΝΟΑΤΝΥΝςΚΡφΟΚΑΤΕΤΑϋΤ888ΤΑΥΜςΐ88ΕΤ8Εϋ8ΑνΎΕαΑΒσθ8νΡΡΑΥΨΟ0ΟΤ БУТУЗА (ЗЕфШИО: 10)
0ΑφΕνφ8ΟΑΕννΚΡ6Α8νΚΜ8εΚΑ8ΟΥΤΡΤ8ΥΝΜΗ3ννΚφΤΡΟφσΕΕλνΐΟΥΙΥΡ 6Ν0ΑΤΝΥΝφΚΡφ0ΚΑΤΕΤΑ0Ρ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8ΕΌ8ΑνΥΡ€ΑΚ008νΡΡΑΥ\ν0φ6Τ БУТУЗА (ЗЕфГОЬЮ: 11).
В другом воплощении представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно-перестроенную вариабельную область легкой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0: 8:
Е1УЕТОЗРАТМ8А8РОЕВУТ1ТС8АН88УЗРМН\УРф9КРОТ8РКЕ\У1У8Т88ЕАЗС νΡΛΚΕ6Π8680Τ8Υ8ΕΤ138ΜΕΑΕΟΛΑΤΥΥΟφφΚ88ΡΡΕΊΤΟΑΟΤΚΕΕΤ.ΚΚ.
(ЗЕф ГО N0: 8).
Также представлены гуманизованные антитела Ό86 и их эпитоп-связывающие фрагменты, содержащие гуманизованную или поверхностно перестроенную вариабельную область тяжелой цепи, имеющую аминокислотную последовательность, соответствующую 8ЕЦ ГО N0: 10 или 8ЕЦ ГО N0: 11, соответственно:
- 10 020130 фАфЕУф8САЕУУКРСА8УКМ8СКА86УТЕТ8¥ПМН\УУКфТР63ОЬЕ!УЮТ1УР αΝ6ΛΤΝΎ'Ν0ΚΡϊχ}ΚΑΊ1.'[·ΑϋΤ888ΤΑΥΜφΙ55ΕΤ8ΕΟ8ΑνΥΓύ'ΛΡΟΟ8νΡ[ΑΥνίΌφΟΤ ЕУТУ8А (8Εφ Ю N0: 10) рЛфЕУфЗбЛЕУУЮ’ОАЗУКМЗСКАЗОУТГТЙ^Э/МНи-ТКфТРСфСЬЕМ'ЮУП’Р ΟΝ6ΑΤΝΥΝρΚΓφΟΚΑΤΕΤΑΟΡ888ΤΑΥΜφΙ88ΕΤ8Ε08ΑνΥΡ€ΑΒσΒ8νΡΕΑΥ\¥ΟφΟΤ БУТУЗА (8Ε01ΟΝΟ: 11).
Гуманизованные антитела и их эпитоп-связывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут включать такие варианты вариабельных областей легкой и/или тяжелой цепи, у которых поверхностные аминокислотные остатки человека вблизи от СЭВ заменены соответствующими поверхностными остатками тнЭ8б по одному или нескольким положениям, представленным звездочками в табл. 1 (нумерация по Кабату), чтобы сохранить аффинность связывания и специфичность тиЭБб.
Таблица 1
В настоящем изобретении раскрыты первичные аминокислотные последовательности и последовательности ДНК легких и тяжелых цепей антитела Ό86 и их гуманизованных вариантов. Однако рамки настоящего изобретения не ограничиваются антителами и фрагментами, содержащими эти последовательности. Наоборот, в настоящее изобретение включены все антитела и фрагменты, которые специфически связываются с САб как с уникальным опухолеспецифичным гликотопом на рецепторе Мис1.
Предпочтительно антитела и фрагменты, которые специфически связываются с САб, также являются антагонистами биологической активности этого рецептора. Более предпочтительно такие антитела также практически лишены активности агониста. Таким образом антитела и фрагменты антител настоящего изобретения могут отличаться от антитела Ό86 и его гуманизованных производных по аминокислотной последовательности каркаса, участков СОВ и/или легкой цепи и тяжелой цепи, и тем не менее попадать в рамки настоящего изобретения.
Участки СОВ антитела Ό86 были идентифицированы путем моделирования и были предсказаны их молекулярные структуры. Опять же, хотя участки СОВ и важны для распознавания эпитопа, но они не являются основными для антител и фрагментов по изобретению. Соответственно, предусмотрены антитела и фрагменты, обладающие улучшенными свойствами, которые получают, к примеру, при созревании аффинности антител настоящего изобретения.
Эмбриональный ген легкой цепи мыши 1дУк ар4 и эмбриональный ген тяжелой цепи мыши 1дУЪ 1558.41, из которых вероятно происходит Ό86, представлены на фиг. 11 в сопоставлении с последовательностью антитела Ό86. При сравнении идентифицированы вероятные соматические мутации в антителе Ό86, в том числе несколько в участках СЭВ.
Последовательности вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи антитела Ό86, а также последовательности участков СЭВ антитела Ό86 ранее не были известны и приводятся на фиг. 9А и 9В. Такая информация может использоваться для получения гуманизованных вариантов антитела Ό86.
Фрагменты антител
Антитела настоящего изобретения включают как целые антитела, рассмотренные выше, так и эпитопосвязывающие фрагменты. В настоящем изобретении фрагменты антител охватывают любые части антитела, сохраняющие способность к связыванию с эпитопом, распознаваемым целым антителом, которые обычно именуются эпитопосвязывающими фрагментами. Примеры фрагментов антител включают, не ограничиваясь этим, фрагменты ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2, Εν, одноцепочечные Εν (ксЕу), одноцепочечные антитела, связанные дисульфидными связями Εν (άδΕν) и фрагменты, содержащие область V ИЛИ νΗ. Эпитопосвязывающие фрагменты, в том числе одноцепочечные антитела, могут включать одни только вариабельные области или в сочетании с полным участком или частью следующего шарнирного участка доменов Сн1, СН2 и Сн3.
Такие фрагменты могут содержать один или оба фрагмента ЕаЬ либо фрагмент Е(аЬ')2. Предпочтительно фрагменты антител содержат все шесть участков СЭВ полного антитела, хотя функциональными являются и фрагменты, содержащие не все такие участки, скажем, три, четыре или пять СЭВ. Кроме то
- 11 020130 го, фрагменты могут принадлежать к любому или составлять комбинацию из представителей любого из следующих классов иммуноглобулинов: 1§С. 1дМ, 1дЛ, 1дО или 1дЕ, а также их подклассов.
Фрагменты ЕаЬ и Е(аЬ')2 могут быть получены путем протеолитического расщепления с помощью таких ферментов, как папаин (фрагменты ЕаЬ) или пепсин (фрагменты Е(аЬ')2).
Одноцепочечные фрагменты Εν ЦеЕу) представляют собой эпитопосвязывающие фрагменты, содержащие по меньшей мере один фрагмент вариабельной области тяжелой (Ун) антитела, соединенный по меньшей мере с одним фрагментом вариабельной области легкой цепи (Уь) антитела. Линкером может быть короткий, гибкий пептид, выбранный таким образом, чтобы обеспечить правильную трехмерную укладку областей Уъ И Ун после их соединения с тем, чтобы сохранилась специфичность связывания с молекулой мишени того целого антитела, из которого получен одноцепочечный фрагмент антитела. Через линкер карбоксильный конец последовательности Уъ или Ун может ковалентно соединяться с аминокислотным концом комплементарной последовательности Уъ или Ун.
Одноцепочечные фрагменты антител настоящего изобретения содержат аминокислотные последовательности, содержащие по меньшей мере одну из вариабельных областей или участков комплементарности (СЭК.) целых антител, описанных в настоящем описании, но не содержат некоторых или всех константных доменов этих антител. Эти константные домены не нужны для связывания антигена, но они составляют большую часть структуры целых антител. Поэтому одноцепочечные фрагменты антител могут преодолеть некоторые проблемы, связанные с использованием антител, содержащих часть или весь константный домен. Например, одноцепочечные фрагменты антител обычно свободны от нежелательных взаимодействий между биологическими молекулами и константной областью тяжелой цепи или иной нежелательной биологической активности. Кроме того, одноцепочечные фрагменты антител являются значительно меньшими, чем целые антитела, поэтому они могут обладать большей капиллярной проницаемостью, чем целые антитела, что позволяет им более эффективно располагаться на и связываться с антигенсвязывающими сайтами мишени. К тому же фрагменты антител могут быть получены в сравнительно большом количестве в прокариотических клетках, что облегчает их получение. Более того, сравнительно небольшой размер одноцепочечных фрагментов антител делает менее вероятным индукцию иммунного ответа у реципиента, чем целые антитела.
Одноцепочечные фрагменты антител могут быть созданы методами молекулярного клонирования, библиотеки фагового дисплея антител или сходными методами, хорошо известными специалистам. Эти белки можно продуцировать, к примеру, в эукариотических или прокариотических клетках, включая бактерии. Эпитоп-связывающие фрагменты по настоящему изобретению также могут быть созданы различными методами фагового дисплея, известными в данной области. В методах фагового дисплея функциональные домены антител выставляются на поверхности частиц фага, несущих кодирующие их полинуклеотидные последовательности. В частности, такой фаг может быть использован для дисплея эпитопосвязывающих доменов, экспрессируемых из репертуара или комбинаторной библиотеки антител (напр., человека или мыши). Фаг, экспрессирующий эпитоп-связывающий домен, который связывается с нужным антигеном, может быть выбран или идентифицирован с помощью антигена, например, с помощью меченого антигена, связанного или фиксированного на твердой поверхности или шариках. Как правило, в этих методах используются нитчатые фаги, включая Гб и М13, при этом происходит экспрессия связывающих доменов из фага вместе с ЕаЬ, Εν или стабилизированными дисульфидными связями доменами Εν антител, слитыми рекомбинантным путем с белком гена III или гена УШ самого фага.
Примеры методов фагового дисплея, которые могут быть использованы для получения эпитопосвязывающих фрагментов по настоящему изобретению, включают методы, изложенные в Вппктап е! а1., 1995, ί. 1ттипо1. Ме!йоб§ 182: 41-50; Лшек е! а1., 1995, ί. 1ттипо1. Ме!йоб§ 184: 177-186; КеШеЬогоидф е! а1., 1994, Еиг. ί. 1ттипо1. 24: 952-958; Регыс е! а1., 1997, Оепе 187: 9-18; Вийоп е! а1., Абхапсе ίη 1ттипо1оду 57: 191-280; заявке РСТ Ыо. РСТ/ОВ91/01134; публикациях РСТ АО 90/02809, АО 91/10737, АО 92/01047, АО 92/18619, АО 93/11236, АО 95/15982, АО 95/20401 и И8 Ра!. Хох 5698426, 5223409, 5403484, 5580717, 5427908, 5750753, 5821047, 5571698, 5427908, 5516637, 5780225, 5658727, 5733743 и 5969108; которые все включены в настоящее изобретение путем отсылки во всей полноте.
После селекции фага можно выделить участки фага, кодирующие фрагменты, и использовать их для создания эпитоп-связывающих фрагментов посредством экспрессии в выбранном организме хозяина, включая клетки млекопитающих, клетки насекомых, клетки растений, дрожжей и бактерий, используя методы рекомбинантной ДНК, например, как описано подробно ниже. Например, для получения фрагментов ЕаЬ, ЕаЬ' и Е(аЬ')2 можно использовать методы, известные в данной области типа тех, что изложены в публикации РСТ АО 92/22324; МиШпах е! а1., 1992, ВюТееНшсщех 12(6): 864-869; 8а^а1 е! а1., 1995, АЖ1 34: 26-34 и Ве!!ег е! а1., 1988, 8е1епее 240: 1041-1043; которые включены путем отсылки во всей полноте. Примеры методов, которые могут быть использованы для получения одноцепочечных Εν и антител, включают методы, описанные в И8. Ра!. Ыок. 4946778 и 5258498; Ин51оп е! а1., 1991, Ме!йоб§ ш Еп/уто1оду 203: 46-88; 81ш е! а1., 1993, РЫА8 90: 7995-7999; 8кетга е! а1., 1988, 8е1епее 240: 1038-1040.
Функциональные эквиваленты
В рамки изобретения также входят функциональные эквиваленты антитела к СА6 и гуманизованного антитела к СА6. Термин функциональные эквиваленты охватывает антитела с гомологическими по
- 12 020130 следовательностями, химерные антитела, искусственные антитела и модифицированные антитела, к примеру, при этом каждый функциональный эквивалент определяется по способности к связыванию с СА6. Специалисты должны понимать, что группа молекул, называемых фрагментами антител, перекрывается с группой, именуемой функциональными эквивалентами. Способы получения функциональных эквивалентов изложены, к примеру, в заявке РСТ νθ 93/21319; европейской патентной заявке Νο. 239400; заявке РСТ νθ 89/09622; европейской патентной заявке Νο. 338745 и европейской патентной заявке ЕР 332,424; которые все включены во всей полноте путем отсылки.
Антитела с гомологическими последовательностями представляют собой такие антитела, у которых аминокислотные последовательности гомологичны аминокислотной последовательности антитела к СА6 и гуманизованного антитела к СА6 по настоящему изобретению. Предпочтительно гомологичность относится к аминокислотной последовательности вариабельных областей антитела к СА6 и гуманизованного антитела к СА6 по настоящему изобретению. Гомологичность последовательности в применении к аминокислотной последовательности в настоящем изобретении определяется как то, что последовательность по меньшей мере на 90, 91, 92, 93 или 94%, более предпочтительно на 95, 96, 97, 98 или 99% гомологична другой аминокислотной последовательности при определении, к примеру, методом поиска РА8ТА согласно Реагкоп аиб Ыршаи, Ргос. Ναΐί. Асаб. 8οί. И8А 85, 2444-2448 (1988).
В настоящем изобретении химерное антитело означает такое антитело, у которого различные части происходят из разных видов животных. Например, антитело, содержащее вариабельную область из мышиного моноклонального антитела вместе с константной областью иммуноглобулина человека. Способы получения химерных антител известны в данной области. Например, см. Моткой, 1985, 8с1еисе 229: 1202; Θί е! а1., 1986, ВюТес11пк.|иек 4: 214; О1Шек е! а1., 1989, 1. 1ттипо1. МеШобк 125: 191-202; И8 Ра!. Νοκ. 5807715, 4816567 и 4816397; которые включены в настоящее изобретение путем отсылки во всей полноте.
Гуманизованные формы химерных антител получают путем замены участков комплементарности (СЭВ), к примеру, из антитела мыши в каркасный домен человека, например, см. РСТ РиЬ. №. νθ 92/22653. Гуманизованные химерные антитела предпочтительно содержат константные области и вариабельные области, у которых участки комплементарности (СОВ) не происходят практически или исключительно из соответствующих участков антител человека, а происходят практически или исключительно из других млекопитающих.
Искусственные антитела охватывают фрагменты ксРу. диантитела (б1аЬобу), триантитела (1г1аЬобу). тетрантитела (!е!гаЬобу) и тги (см. обзоры V^ηΐе^ О. апб МбКет С, 1991, №1иге 349: 293-299; Нибкоп Р.Е, 1999, Сиггеп! Ор1шоп ίη 1ттипо1оду 11: 548-557), которые все обладают способностью к связыванию антигена. У одноцепочечных фрагментов Εν (ксЕу) домены УН и Уь антитела соединяются гибким пептидом. Как правило, такой пептид-линкер состоит примерно из 15 аминокислот. Если линкер намного меньше, к примеру, из 5 аминокислот, то образуются диантитела, которые представляют собой двухвалентные димеры ксЕ\'. Если же линкер уменьшить до менее трех аминокислотных остатков, то образуются тримерные и тетрамерные структуры, называемые триантителами и тетрантителами. Наименьшей связывающей единицей антитела является участок СЭВ, как правило, это СЭВ2 тяжелой цепи, который обладает достаточно специфичным распознаванием и связыванием, так что его можно использовать отдельно. Такой фрагмент называют молекулярной единицей распознавания, или тги. Несколько таких тги можно соединить короткими пептидами-линкерами, при этом образуется искусственный связывающий белок с более высокой авидностью, чем у одиночного звена тги.
Функциональные эквиваленты по настоящей заявке также включают модифицированные антитела, напр., антитела, модифицированные ковалентным присоединением какой-нибудь молекулы к антителу. Так, модифицированные антитела охватывают такие антитела, которые подверглись модификации, напр., гликозилированию, ацетилированию, ПЭГилированию, фосфорилированию, амидированию, образованию известных защитных/блокирующих групп, протеолитическому расщеплению, присоединению к клеточному лиганду или другому белку и т.п. Ковалентное присоединение не мешает выработке антиидиотипического ответа антитела. Такие модификации могут осуществляться известными методами, включая, но не ограничиваясь этим, специфическое химическое расщепление, ацетилирование, формилирование, метаболический синтез туникамицина и др. Кроме того, модифицированные антитела могут содержать одну или несколько необычных аминокислот.
Функциональные эквиваленты могут быть получены путем замены различных участков СЭВ на разных цепях в различных каркасах. Так, например, для данного набора СЭВ возможны разные классы антител при замене различных тяжелых цепей, при этом, к примеру, можно получить антитела типа 1дС1-4, 1дМ, 1дА1-2, Ι§Ό, 1дЕ и их изотипов. Также в рамках настоящего изобретения искусственные антитела могут быть получены встраиванием данного набора СЭВ в полностью синтетический каркас.
Функциональные эквиваленты можно легко получить при помощи мутации, делении и/или вставки в пределах вариабельной и/или константной области последовательности, обрамляющей определенный набор СЭВ, используя широкий спектр методов, известных в данной области.
Фрагменты антител и функциональные эквиваленты по настоящему изобретению охватывают такие молекулы, которые обладают заметной степенью связывания с СА6 по сравнению с антителом Ό86. За
- 13 020130 метная степень связывания включает все значения в интервале как минимум 10-100%, предпочтительно по меньшей мере 50, 60 или 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75, 80, 85, 90, 95 или 99% от связывающей способности мышиного антитела Ό86 к СА6.
Усовершенствованные антитела
Участки СЭК имеют первостепенное значение для распознавания эпитопа и связывания антитела. Тем не менее, можно произвести изменения в остатках, входящих в состав СОК, без ухудшения способности антитела к распознаванию и связыванию со своим эпитопом. Например, можно произвести изменения, не влияющие на распознавание эпитопа, но повышающие сродство антитела к эпитопу.
Так, в рамки настоящего изобретения также включены и усовершенствованные варианты мышиных и гуманизованных антител, которые тоже специфически распознают и связываются с СА6, предпочтительно с повышенной аффинностью.
В нескольких исследованиях изучались эффекты введения одной или нескольких замен аминокислот в различных положениях последовательности антитела, исходя из первичной последовательности антитела, на такие его свойства, как связывание и уровень экспрессии (Уапд ^.Р. е! а1., 1995, 1. Μοί. В1ο1., 254, 392-403; Набег С е! а1., 1998, Ргос. Ыаб. Асаб. 8οΐ. И8А, 95, 8910-8915; УаидЬап Т.1. е! а1., 1998, Ма1иге Вю!есЬпо1оду, 16, 535-539).
В этих исследованиях создавались эквиваленты первичного антитела путем изменения последовательностей генов тяжелой и легкой цепи в районе СЭК1. СЭК2. СЭК3 или каркасной области, используя такие методы, как направленный мутагенез с помощью олигонуклеотидов, кассетный мутагенез, подверженная ошибкам реакция ПЦР, перетасовка ДНК или штаммы-мутаторы Е. сой (УаидЬап Т.1. е! а1., 1998, Ыа1иге Вю!есЬпо1оду, 16, 535-539; Абеу Ν.Β. е! а1., 1996, СЬар!ег 16, рр. 277-291, ίη РЬаде Э1кр1ау οί Рерйбек апб Рго!е1пк, Ебк. Кау В.К. е! а1., Асабешю Ргекк). Эти методы изменения последовательности первичного антитела привели к улучшению аффинности вторичных антител (Стат Н. е! а1., 1992, Ргос. №!1. Асаб. 8οΐ. И8А, 89, 3576-3580; Вобег Е.Т. е! а1., 2000, Ргос. №б. Асаб. 8сг И8А, 97, 10701-10705; Эау1ек 1. апб КтесЬтапп Ь., 1996, 1ттипо!есЬпо1оду, 2, 169-179; ТЬотркоп 1. е! а1., 1996, 1. Мо1. Вю1., 256, 77-88; 8Ьой М.К. е! а1., 2002, 1. Вю1. СЬет., 277, 16365-16370; Еигиката К. е! а1., 2001, 1. Вю1. СЬет., 276, 27622-27628).
При аналогичной стратегии направленного изменения одного или нескольких аминокислотных остатков антитела можно использовать описанные в настоящем изобретении последовательности антител для разработки антител к СА6 с улучшенными функциями, включая увеличение аффинности к СА6.
К усовершенствованным антителам также относятся антитела, обладающие улучшенными характеристиками, которые получены стандартными методами иммунизации животных, получения гибридомы и отбора антител с определенными характеристиками.
Цитотоксические агенты
Цитотоксическим агентом в цитотоксическом конъюгате настоящего изобретения может быть любое соединение, вызывающее гибель клетки или клеточную смерть либо тем или иным образом снижающее жизнеспособность клетки. Предпочтительными цитотоксическими агентами являются, к примеру, майтансиноиды и аналоги майтансиноидов, таксоиды, СС-1065 и аналоги СС-1065, доластатин и аналоги доластатина, определенные ниже. Эти цитотоксические агенты подвергаются конъюгированию с антителами, фрагментами антител, функциональными эквивалентами, усовершенствованными антителами и их аналогами, как изложено в настоящем изобретении.
Цитотоксические конъюгаты могут быть получены методами ш νίΙΐΌ. Для того чтобы соединить лекарственный препарат или пролекарство с антителом, используется соединительная группа. Подходящие соединительные группы хорошо известны в данной области и включают дисульфидные группы, тиоэфирные группы, кислотолабильные группы, фотолабильные группы, подверженные пептидазам группы и подверженные эстеразам группы. Предпочтительными соединительными группами являются дисульфидные группы и тиоэфирные группы. Например, можно конструировать конъюгаты при помощи реакции обмена дисульфидов или образования тиоэфирной связи между антителом и препаратом или пролекарством.
Майтансиноиды
В число цитотоксических агентов, которые можно использовать в настоящем изобретении для образования цитотоксических конъюгатов, входят майтансиноиды и аналоги майтансиноидов. Примеры подходящих майтансиноидов включают майтансинол и аналоги майтансинола. Майтансиноиды представляют собой вещества, ингибирующие образование микротрубочек, которые сильно токсичны для клеток млекопитающих.
Примеры подходящих аналогов майтансинола включают аналоги с модифицированным ароматическим кольцом и аналоги с модификациями по другим положениям. Такие подходящие майтансиноиды раскрыты в И8 Ра!еп! Ν(Κ. 4424219, 4256746, 4294757, 4307016, 4313946, 4315929, 4331598, 4361650, 4362663,4364866,4450254,4322348,4371533,6333410,5475092,5585499 и 5846545.
Конкретные примеры подходящих аналогов майтансинола с модифицированным ароматическим кольцом включают:
(1) С-19-дехлоро (И8 Ра!. №. 4256746) (получают восстановлением ансамитоцина Р2 с помощью
- 14 020130
БАН);
(2) С-20-гидрокси (или С-20-деметил) +/- С-19-дехлоро (И8 Ра1. Νοβ. 4361650 и 4307016) (получают деметилированием с помощью 81гер1отусев или АеОпотуесв либо дехлорированием с помощью ЬАН) и (3) С-20-деметокси, С-20-ацилокси (-ОСОЯ), +/- С-19-дехлоро (И8 Ра1. Νο. 4294757) (получают ацилированием с помощью хлорангидридов).
Конкретные примеры подходящих аналогов майтансинола с модификациями по другим положениям включают:
(1) С-9-8Н (И8. Ра1. Νο. 4424219) (получают при реакции майтансинола с Н28 или Р285);
(2) С-14-алкоксиметил (деметокси/СН2ОЯ) (И.8. Ра1. Νο. 4331598);
(3) С-14-гидроксиметил или ацилоксиметил (СН2ОН или СН2ОАс) (И8 Ра1. Νο. 4450254) (получают из №сагб1а);
(4) С-15-гидрокси/ацилокси (И8. Ра1. Νο. 4,364,866) (получают при превращении майтансинола с помощью ЕНгерЮтусев);
(5) С-15-метокси (И8 Ра1. Νοβ. 4313946 и 4315929) (выделяют из Тге\\!а ηιιάίΠοη);
(6) С-18-Ы-деметил (И8 Ра1. Νοβ. 4362663 и 4322348) (получают деметилированием майтансинола с помощью ЕНгерЮтусев); и (7) 4,5-дезокси (И8. Ра1. Νο. 4371533) (получают восстановлением майтансинола с помощью трихлорида титана/ЬАН).
В предпочтительном воплощении в качестве цитотоксического агента цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения используют тиол-содержащий майтансиноид ΌΜ1, формально именуемый Ν2деацетил-Н2-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансином. ΌΜ1 представлен следующей структурной формулой I:
В другом предпочтительном воплощении в качестве цитотоксического агента цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения используют тиол-содержащий майтансиноид Ν2-деацетил-Ν2-(4метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансин. ΌΜ4 представлен следующей структурной формулой II:
В следующих воплощениях изобретения могут использоваться другие майтансины, в том числе тиол- и дисульфид-содержащие майтансиноиды, несущие моно- или диалкильное замещение на атоме углерода, несущем атом серы. К ним относятся майтансиноиды, содержащие в положении С-3, С-14гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь ацилированной аминокислоты с ацильной группой, несущей блокированную сульфгидрильную группу, причем атом углерода ацильной группы, несущей функциональную группу тиола, содержит один или два заместителя, которыми являются СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом одним из заместителей может быть Н, а ацильная группа имеет линейную цепь длиной по меньшей мере в три атома углерода между функциональной группой карбонила и атомом серы.
К таким дополнительным майтансинам относятся соединения, представленные формулой III
- 15 020130
где Υ' означает (С1П№-(С1СС1Б)Х С ЛоЦЗии...1).(СН СН-2НС С).В.(СН;1С)..СН· №8/. где
К! и Κ2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероцикический радикал, при этом Κ2 может означать Н;
А, В, Ό означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7, Κ8, Κ9, Κ10, 1ц и К.|2 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
1, т, η, о, р, с.|, г, 8, ΐ и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно; и
Ζ означает Н, 8Κ или -СОК, где К означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал.
Предпочтительные воплощения формулы III включают соединения формулы III, у которых
Κι означает метил, К2 означает Н, а Ζ означает Н;
Κι и К2 означают метил, а Ζ означает Н;
Κι означает метил, К2 означает Н, а Ζ означает -8СН3;
Κι и К2 означают метил, а Ζ означает -8СН3.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой БУ-Ь, IVΌ или БУ-Ό, Б:
(ΐν-Ь) (ΐν-ϋ) (ΐν-οχ) где Υ означает (ΟΚ7Κ8)1(ΟΚ5Κ6^(ΟΚ3Κ4)ηΟΚ1Κ28Ζ, где
К! и Κ2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом Κ2 может означать Н;
Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0;
Ζ означает Н, 8Κ или -СОЕ, где Κ означает линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал; и
Μау означает майтансиноид, несущий в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь.
Предпочтительные воплощения формул ЕУ-Ь, ЕУ-Э и ^-Э, Ь включают соединения формул ЕУ-Ь, ЕУ-Э и у которых
Κι означает метил, Κ2 означает Н, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;
Κ1 и Κ2 означают метил, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;
Κ1 означает метил, Κ2 означает Н, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ
- 16 020130 означает -8СН3;
Κι и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает 8СН3.
Предпочтительно цитотоксический агент представлен формулой 1У-Ь.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой V
где Υ означает ^ΚγΚ^/Ο^ΚΟ^ΟΚβΚ^ΟΚιΚ^Ζ, где
Κι и К2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом К2 может означать Н;
К3, К4, К5, К6, К7 и К8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0; и
Ζ означает Н, 8К или -СОК, где К означает линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал.
Предпочтительные воплощения формулы V включают соединения формулы V, у которых
К| означает метил, К2 означает Н, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;
В1 и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает Н;
К1 означает метил, К2 означает Н, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает -8СН3;
К1 и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η = 0, а Ζ означает 8СН3.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой VIБ, ^-0 или ^-0^:
(У1-Б) (νΐ-ϋ) (νΐ-ϋ, Б) где Υ2 означает (СΚ7Κ8)1(СΚ5Κ6)т(СΚ3Κ4)ηСΚ1Κ28Ζ2, где
К1 и К2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом К2 может означать Н;
К3, К4, К5, К6, К7 и К8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0;
Ζ2 означает 8К или -СОК, где К означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический
- 17 020130 радикал; и
Мау означает майтансиноид.
К таким дополнительным майтансинам также относятся соединения, представленные формулой VII
где Υ2' означает (С1ии-(СВ.СкМС С)ЛКЗи<2т|)(СВ СВ-;).(С С).В.(СВ;1С)..СВ-В;8/;.
где
В1 и В2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом В2 может означать Н;
А, В и Ό независимо друг от друга означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклоалкильный радикал;
В3, В4, В5, В6, В7, В8, В9, В10, Вп и В12 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
1, т, и, о, р, с.|. г, 8, ! и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно; и
Ζ2 означает 8В или -СОВ, где В означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал.
Предпочтительные воплощения формулы VII включают соединения формулы VII, у которых В! означает метил, а В2 означает Н.
Вышеприведенные майтансиноиды могут быть конъюгированы с антителом Ό86 к СА6 либо его гомологом или фрагментом, причем антитело соединяется с майтансиноидом с помощью функциональной группы тиола или дисульфида, которая находится на ацильной группе боковой цепи ацилированной аминокислоты, находящейся в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила майтансиноида, причем ацильная группа боковой цепи ацилированной аминокислоты содержит функциональную группу тиола или дисульфида, которая находится на атоме углерода, содержащем один или два заместителя, которыми являются СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом одним из заместителей может быть Н, а ацильная группа имеет линейную цепь длиной, по меньшей мере, в три атома углерода между функциональной группой карбонила и атомом серы.
Предпочтительным конъюгатом настоящего изобретения является конъюгат, включающий антитело Ό86 к СА6 либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с майтансиноидом формулы VIII
- 18 020130
где Υ1· означает (СЯ7Я8)1(СЯ9=Я10)р(С=С),А<)(СЯ5Я6)тОи(СЯ11=СЯ12)г(С=С)8В1(СЯ3Я4)пСЯ1Я28-, где
А, В и Ό независимо друг от друга означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Я10, Яп и Я12 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал; и
1, т, п, о, р, с.|. г, β, ΐ и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно.
Предпочтительно Я! означаетметил, а Я2 означает Н, либо Я! и Я2 означают метил.
Еще более предпочтительным конъюгатом настоящего изобретения является конъюгат, включающий антитело Ό86 к СА6 либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с майтансиноидом формулы ГС-Ь, IX-!) или ΕΧ-ϋ,Ε:
ΙΧ-Ь ΙΧ-ϋ 1Х-Э,Ь где Υ1 означает (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)пСЯ1Я2Е-, где
Я1 и Я2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал, при этом Я2 может означать Н;
Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
1, т и п независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом п может означать 0; и
Мау означает майтансиноид, несущий в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь.
Предпочтительные воплощения формул Ш-Ь, Ш-Э и ГХ-ЭД включают соединения формул ГХ-Ь, ΣΧ-Ό и ГХ-ЭД, у которых:
Я1 означает метил, а Я2 означает Н, либо Я1 и Я2 означают метил;
Я! означает метил, Я2 означает Н, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, т = 0;
Я1 и Я2 означают метил, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п =0.
Предпочтительно цитотоксический агент представлен формулой Ш-Ь.
Еще одним предпочтительным конъюгатом настоящего изобретения является конъюгат, включающий антитело Ό86 к СА6 либо его гомолог или фрагмент, конъюгированный с майтансиноидом формулы X
- 19 020130
где заместители соответствуют определениям для приведенной выше формулы IX. Особенно предпочтительны любые из вышеописанных соединений, у которых К; означает Н, К2 - метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, а п = 0.
Еще более предпочтительны любые из вышеописанных соединений, у которых К; и К2 означают метил, К5, К6, К7 и К8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, а п = 0.
Кроме того, предпочтительны Ь-аминоацильные стереоизомеры.
В цитотоксических конъюгатах настоящего изобретения могут использоваться все майтансиноиды, приведенные в находящейся на рассмотрении патентной заявке США № 10/849,136 от 20 мая 2004 г. Все содержание патентной заявки США № 10/849,136 включено в настоящее изобретение путем отсылки.
Дисульфид-содержащие соединительные группы
Для соединения майтансиноида с агентом, связывающим клетку, типа антитела Ό86 майтансиноид должен включать соединительную часть. Соединительная часть содержит химическую связь, позволяющую высвобождение полностью активных майтансиноидов в определенном месте. Подходящие химические связи хорошо известны в данной области и включают дисульфидные связи, кислотолабильные связи, фотолабильные связи, подверженные пептидазам связи и подверженные эстеразам связи. Предпочтительными являются дисульфидные связи.
Соединительная часть также включает реакционно-способную химическую группу. В предпочтительном воплощении реакционно-способная химическая группа может быть ковалентно связана с майтансиноидом через дисульфидную связь соединительной части.
Особенно предпочтительными реакционно-способными химическими группами являются Νсукцинимидиловые эфиры и Ν-сульфосукцинимидиловые эфиры.
Особенно предпочтительными майтансиноидами, включающими соединительную часть, содержащую реакционно-способную химическую группу, являются С-3-эфиры майтансинола и его аналогов, у которых соединительная часть содержит дисульфидную связь, а химическая реакционно-способная группа включает Ν-сукцинимидиловый эфир или Ν-сульфосукцинимидиловый эфир.
Многие положения на майтансиноидах могут служить для химической связи с соединительной частью. Например, следует ожидать, что будут полезными положение С-3, содержащее гидроксильную группу, положение С-14, модифицированное гидроксиметилом, положение С-15, модифицированное гидроксилом, и положение С-20, содержащее гидроксильную группу. Однако предпочтительным является положение С-3, а особенно предпочтительным является положение С-3 майтансинола.
Несмотря на то, что синтез эфиров майтансинола, содержащих соединительную часть, описан в отношении соединительных частей, содержащих дисульфидную связь, специалисты в этой области должны понимать, что в настоящем изобретении можно использовать соединительные части и с другими химическими связями (как описано выше), а также и другие майтансиноиды. Конкретные примеры других химических связей включают кислотолабильные связи, фотолабильные связи, подверженные пептидазам связи и подверженные эстеразам связи. Содержание патента США № 5208020, включенного в настоящее изобретение, предусматривает получение майтансиноидов, несущих такие связи.
Синтез майтансиноидов и их производных, содержащих дисульфидную часть, несущую реакционно-способную группу, описан в патентах США № 6441163 и 6333410 и заявке США № 10/161651, которые включены в настоящее изобретение путем отсылки.
Майтансиноиды, содержащие реакционно-способные группы, к примеру, ΌΜ1, подвергают реакции с антителом, к примеру, антителом Ό86, получая цитотоксические конъюгаты. Такие конъюгаты могут быть очищены методом НРЬС или гель-фильтрации.
Некоторые отличные схемы получения таких конъюгатов антитело-майтансиноид представлены в патенте США № 6333410 и заявках США № 09/867598, 10/161,651 и 10/024,290, которые включены в настоящее изобретение во всей полноте.
В общем, раствор антитела в водном буфере можно проинкубировать с молярным избытком майтансиноидов, содержащих дисульфидную часть, несущую реакционно-способную группу. Реакционную смесь можно остановить добавлением избытка амина (к примеру, этаноламина, таурина и др.). Затем
- 20 020130 конъюгат майтансиноид-антитело можно очистить методом гель-фильтрации.
Число молекул майтансиноида, связанных с одной молекулой антитела, можно определить по спектрофотометрическому измерению соотношения поглощения при 252 нм и 280 нм. Предпочтительно в среднем 1-10 молекул майтансиноида на молекулу антитела.
Конъюгаты антител с препаратами майтансиноидов можно исследовать на их способность к подавлению пролиферации различных нежелательных линий клеток ίη νίίτο. Например, для оценки цитотоксичности этих соединений можно с легкостью использовать такие клеточные линии, как клетки эпидермоидной карциномы человека А-431, клетки мелкоклеточного рака легких человека 8ν2, клетки опухоли молочной железы человека 8КВК3 и клетки лимфомы Беркитта №ипа1\\а. Клетки для исследования можно подвергнуть воздействию соединений на 24 ч и измерить долю выживших клеток прямо в опыте известными методами. Затем из полученных результатов можно вычислить значения 1С50.
ПЭГ-содержащие соединительные группы
Майтансиноиды также можно соединить с агентами, связывающими клетку, с помощью ПЭГсодержащих соединительных групп, как изложено в заявке США № 10/024,290. Такие содержащие ПЭГ соединительные группы растворимы как в воде, так и в неводных растворителях, и могут быть использованы для соединения одного или нескольких цитотоксических агентов с агентом, связывающим клетку. Примеры ПЭГ-содержащих соединительных групп включают гетеробифункциональные линкеры на основе ПЭГ, которые связываются с цитотоксическими агентами и агентами, связывающими клетку, на противоположных концах линкеров через функциональную сульфгидрильную или дисульфидную группу на одном конце и активный эфир на другом конце.
В качестве общего примера синтеза цитотоксического конъюгата с помощью ПЭГ-содержащей соединительной группы можно опять привести заявку США № 10/024290 в отношении конкретных деталей. Синтез начинается с реакции одного или нескольких цитотоксических агентов, несущих реакционноспособную группировку ПЭГ, с агентом, связывающим клетку, что приводит к вытеснению концевого активного эфира из каждой реакционноспособной молекулы ПЭГ аминокислотным остатком агента, связывающего клетку, с образованием цитотоксического конъюгата, включающего один или несколько цитотоксических агентов, ковалентно связанных с агентом, связывающим клетку, через ПЭГ-содержащую соединительную группу.
Таксаны
Цитотоксическим агентом в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению также может быть таксан или его производное.
Таксаны представляют собой семейство соединений, включающее паклитаксель (таксол), натуральный цитотоксический препарат, и доцетаксель (таксотер), его полусинтетическое производное, то есть два соединения, которые широко применяются при лечении рака. Таксаны являются ядами для митотического веретена, которые ингибируют деполимеризацию тубулина, что ведет к гибели клетки. Хотя доцетаксель и паклитаксель являются полезными средствами при лечении рака, однако их противораковая активность ограничена вследствие неспецифической токсичности в отношении нормальных клеток. Кроме того, соединения типа паклитакселя и доцетакселя сами по себе не являются достаточно сильнодействующими для использования в конъюгатах с агентами, связывающими клетку.
Предпочтительным таксаном для получения цитотоксических конъюгатов является таксан формулы XI
Способы синтеза таксанов, пригодных для цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения, вместе с методами конъюгирования таксанов с агентами, связывающими клетку, типа антител, подробно описаны в патентах США № 5416064, 5475092, 6372738 и 6436931 и заявках США № 10/024290, 10/144042, 10/207814, 10/210112 и 10/369563.
Аналоги СС-1065
Цитотоксическим агентом в цитотоксических конъюгатах по настоящему изобретению также может быть СС-1065 или его производное.
СС-1065 является сильнодействующим противоопухолевым антибиотиком, который выделен из культуральной жидкости 81герЮ1пусе8 хе1ег1818. СС-1065 примерно в 1000 раз более активен ίη νίίτο, чем такие распространенные противораковые препараты, как доксорубицин, метотрексат и винкристин (В.К. Екиуам еί а1., Сагсег Кек.,42, 3532-3537 (1982)). СС-1065 и его аналоги раскрыты в патентах США № 6372738, 6340701, 5846545 и 5585499.
- 21 020130
Цитотоксическая активность СС-1065 коррелирует с его алкилирующим действием и связыванием с ДНК или интеркалированием в ДНК. Эти две активности принадлежат разным частям молекулы. Так, алкилирующее действие присуще циклопропапирролоиндоловой (СР1) субъединице, а связывание с ДНК свойственно двум пирролоиндоловым субъединицам.
Несмотря на то, что СС-1065 как цитотоксический агент обладает некоторыми привлекательными характеристиками, он имеет ограничения при терапевтическом применении. Введение СС-1065 мышам вызывало отсроченную гепатотоксичность и приводило к смертельному исходу на 50-й день после однократной внутривенной дозы в 12,5 мкг/кг (У.Ь. Веую1бк е! а1., 1. АпйЬюйск, XXIX, 319-334 (1986)). Это ускорило попытки разработать аналоги, не вызывающие отсроченной гепатотоксичности, и был описан синтез более простых аналогов наподобие СС-1065 (М.А. \Уагрекокк| е! а1., I. Меб. Скет., 31, 590603(1988)).
У следующей серии аналогов молекулу СР1 заменили молекулой циклопропабензиндола (СВ1) (Ό.Κ Водег е! а1., I. Огд. Скет., 55, 5823-5833 (1990); Э.Ь. Водег е! а1., ВюОгд. Меб. Скет. Ье!!., 1, 115-120 (1991)). Эти соединения сохраняют высокую активность ίη νίΙΐΌ исходного соединения, не вызывая отсроченной токсичности у мышей. Как и СС-1065, эти соединения являются алкилирующими реагентами, которые связываются с малой бороздкой ДНК ковалентным образом, вызывая гибель клетки. Но клиническая оценка наиболее перспективных аналогов, адозелесина и карзелесина, привела к неутешительным результатам (В.Е. Еок!ет е! а1., Iηνек!^даί^оηа1 №\ν Эгидк, 13, 321-326 (1996); I. \Уо1ГГ е! а1., С1т. Сзпссг Век., 2, 1717-1723 (1996)). Эти препараты проявляют слабые терапевтические эффекты вследствие их высокой системной токсичности.
Терапевтическая эффективность аналогов СС-1065 может быть сильно улучшена при изменении распределения ίη νί\Ό посредством направленной доставки на место опухоли, что приведет к уменьшению токсичности для остальных тканей и тем самым к снижению системной токсичности. Для достижения этой цели описаны конъюгаты аналогов и производных СС-1065 с агентами, связывающими клетку, специфически нацеленными на раковые клетки (патенты США № 5475092, 5585499, 5846545). Как правило, эти конъюгаты проявляют высокую, специфичную к мишени цитотоксичность ίη νίΙΐΌ и исключительную противоопухолевую активность на моделях привитых опухолей человека у мышей (В.У.1. Скал е! а1., Самсе!· Век., 55, 4079-4084 (1995)).
Способы синтеза аналогов СС-1065, пригодных для цитотоксических конъюгатов настоящего изобретения, вместе с методами конъюгирования этих аналогов с агентами, связывающими клетку, типа антител, подробно описаны в патентах США № 5,475,092, 5,846,545, 5,585,499, 6,534,660 и 6,586,618 и заявках США № 10/116,053 и 10/265,452.
Другие препараты
Такие препараты, как метотрексат, даунорубицин, доксорубицин, винкристин, винбластин, мельфалан, митомицин С, хлорамбуцил, каличамицин, тубулизин и его аналоги, дуокармицин и его аналоги, доластатин и его аналоги также пригодны для получения конъюгатов настоящего изобретения. Молекулы лекарств также можно соединить с молекулами антител через молекулу промежуточного носителя типа сывороточного альбумина. Соединения доксарубицин и данорубицин, как описано, к примеру, в и.8. 8епа1 №. 09/740991, также могут оказаться полезными цитотоксическими агентами.
Терапевтические композиции
Настоящее изобретение также предусматривает терапевтические композиции, включающие:
(а) эффективное количество одного или нескольких цитотоксических конъюгатов, (б) фармацевтически приемлемый носитель.
Также настоящее изобретение предусматривает способ торможения роста выбранных популяций клеток, включающий контактирование искомых клеток или ткани, содержащей искомые клетки, с эффективным количеством цитотоксического конъюгата или терапевтического средства, включающего цитотоксический конъюгат, одного или в сочетании с другими цитотоксическими или терапевтическими средствами.
Настоящее изобретение также включает способ лечения субъекта, страдающего раком, с помощью терапевтической композиции настоящего изобретения.
Цитотоксические конъюгаты могут быть исследованы в отношении активности и специфичности ίη νίΙΐΌ ранее описанными методами (напр., см. В.У.1. Скап е! а1., Самсег Век., 55, 4079-4084 (1995)). Противоопухолевую активность можно оценить на моделях привитых опухолей человека у мышей также ранее описанными методами (напр., см. Ьш е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ск И8А, 93: 8618-8623 (1996)).
Подходящие фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть установлены рядовым специалистом в данной области в соответствии с клинической ситуацией. В настоящем изобретении носители включают разбавители и наполнители.
Примеры подходящих носителей, разбавителей и/или наполнителей включают: (1) физраствор Дюльбекко с фосфатным буфером, рН 7,4, содержащий или не содержащий от 1 мг/мл до 25 мг/мл сывороточного альбумина человека; (2) 0,9% физраствор (0,9% раствор №С1); и (3) 5% раствор декстрозы; они могут также содержать антиоксидант типа триптамина и стабилизирующее вещество типа Т\уссп 20.
Способ торможения роста выбранных популяций клеток может выполняться ίη νίϋΌ, ίη νί\Ό или ех
- 22 020130 νο. В настоящем изобретении торможение роста означает замедление роста клеток, снижение жизнеспособности клеток, причинение гибели клеток, лизирование клеток и индуцирование клеточной смерти как в течение короткого, так и продолжительного периода времени.
Примеры применения т νίΙΐΌ включают обработку аутологического костного мозга перед трансплантацией его тому же пациенту с тем, чтобы уничтожить больные или злокачественные клетки; обработку костного мозга перед трансплантацией с тем, чтобы уничтожить компетентные Т-клетки и предотвратить отторжение трансплантата; обработку клеточных культур с тем, чтобы уничтожить все клетки за исключением нужных вариантов, не экспрессирующих антиген мишени; либо уничтожить варианты, экспрессирующие ненужный антиген.
Условия неклинического применения ш νίΙΐΌ может легко установить рядовой специалист в данной области.
Примеры клинического применения ех νί\Ό заключаются в удалении раковых клеток или лимфоидных клеток из костного мозга перед аутологической трансплантацией при лечении рака или при лечении аутоиммунных заболеваний; либо удалении Т-клеток и других лимфоидных клеток из аутологического или аллогенного костного мозга или ткани перед трансплантацией с тем, чтобы предотвратить отторжение трансплантата. Обработка может проводиться следующим образом. Костный мозг извлекают из пациента или иного индивидуума, а затем инкубируют в среде, содержащей сыворотку, в которую добавляют цитотоксического агента изобретения. Концентрации составляют от 10 мкМ до 1 пМ, на протяжении от 30 мин до 48 ч при 37°С. Точные условия концентрации и времени инкубации, т.е. дозировку, может легко установить рядовой специалист. После инкубации клетки костного мозга отмывают средой, содержащей сыворотку, и возвращают в организм пациента путем внутривенной инфузии согласно известным методам. В тех случаях, когда пациенту проводят другую обработку, к примеру, курс абляционной химиотерапии либо облучение всего организма между извлечением костного мозга и обратным введением обработанных клеток, обработанные клетки костного мозга хранят замороженными в жидком азоте, используя стандартное медицинское оборудование.
Для клинического применения ш νί\Ό цитотоксический конъюгат изобретения должен храниться в виде раствора, который подвергают тестированию на стерильность и уровень эндотоксина. Примеры подходящих методик применения цитотоксических конъюгатов заключаются в следующем. Конъюгаты вводят внутривенно болюсом раз в неделю на протяжении 4 недель. Болюсные дозы вводятся в 50-100 мл физраствора, в который можно добавить 5-10 мл сывороточного альбумина человека. Дозировка составляет от 10 мкг до 100 мг за один раз внутривенно (от 100 нг до 1 мг/кг в день). Более предпочтительно дозировка составляет от 50 мкг до 30 мг. Наиболее предпочтительно дозировка составляет от 1 мг до 20 мг. После 4-недельного курса пациент может продолжать лечение по еженедельной схеме. Конкретные клинические методики в отношении способа применения, наполнителей, разбавителей, дозировки, времени и т.д. могут быть установлены рядовым специалистом в соответствии с клинической ситуацией.
Примеры медицинских заболеваний, которые можно лечить в соответствии со способом уничтожения выбранных популяций клеток ш νί\Ό или ех νί\Ό, включают злокачественные опухоли любого типа, в том числе, к примеру, рак легких, молочной железы, толстой кишки, простаты, почек, поджелудочной железы, яичников, шейки матки и лимфатических органов, остеосаркому, синовиальную карциному, саркому или карциному, при которой экспрессируется СА6, и другие виды рака, еще неизвестные, при которых преимущественно экспрессируется гликотоп СА6; аутоиммунные заболевания, такие как системная волчанка, ревматоидный артрит и множественный склероз; отторжение трансплантата, к примеру, отторжение почечного трансплантата, отторжение печеночного трансплантата, отторжение легочного трансплантата, отторжение сердечного трансплантата и отторжение трансплантата костного мозга; реакцию трансплантат против хозяина; вирусные инфекции, такие как тУ-инфекция, ВИЧ-инфекция, СПИД и др.; и паразитарные инфекции, такие как жиардиаз, амебиаз, шистосомоз и др., что устанавливается рядовыми специалистами в данной области.
Наборы
Настоящее изобретение также включает наборы, например, включающие описанный цитотоксический конъюгат и инструкции по применению цитотоксического конъюгата для уничтожения определенных типов клеток. Инструкции могут включать указания по применению цитотоксических конъюгатов ш νίΙΐΌ, 1п νί\Ό или ех νί\Ό.
Как правило, набор имеет отсек, содержащий цитотоксический конъюгат. Цитотоксический конъюгат может находиться в лиофилизованном виде, жидком виде или ином виде, в котором его можно включить в набор. Набор также может содержать дополнительные элементы, необходимые для выполнения способа, описанного в инструкции к набору, как-то стерильный раствор для растворения лиофилизованного порошка, дополнительные реагенты, объединяемые с цитотоксическим конъюгатом перед введением его пациенту, и приспособления, помогающие вводить конъюгат пациенту.
Дополнительные воплощения
Настоящее изобретение также предусматривает моноклональные антитела, гуманизованные антитела и их эпитопосвязывающие фрагменты, которые дополнительно помечены для применения в исследованиях или в диагностике. В предпочтительных воплощениях метка представляет собой радиоактив
- 23 020130 ную метку, флуорофор, хромофор, контрастирующее вещество или ион металла.
Также предусматривается способ диагностики, в котором данные меченые антитела или их эпитопосвязывающие фрагменты вводятся субъекту, у которого есть подозрение на рак, и измеряется или отслеживается распределение метки в организме субъекта.
Примеры
Широкие рамки данного изобретения лучше всего раскрываются на следующих примерах, которые не предназначаются для ограничения изобретения конкретными воплощениями.
Пример 1. Идентификация положительных и отрицательных по антигену клеточных линий при анализе связывания методом проточной цитометрии
Использовали анализ методом проточной цитометрии для локализации эпитопа СА6 антитела Ό86 на поверхности клеток. Линии клеток человека получали из Американской коллекции типовых культур (АТСС) за исключением клеток ОУСАК5 (Кеагке е1 а1., ΙηΙ. 1. Сапсег 88(6): 866-872 (2000)), ОУСАК8 и 1СВОУ1 (Μ. 8еЛеп, Μа55асΗи5еΠ5 Сепега1 Но§рйа1). Все клетки культивировали в среде ΚΡΜΙ 1640 с добавлением 4 мМ Ь-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина (СатЬгех Вю8аепсе, КосИапб, ΜΕ) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (АИак ВЫощсаК Рой СоШпк, СО), которая в дальнейшем именуется культуральной средой. Клетки содержали в увлажнительном инкубаторе при 37°С, 5% СО2.
Клетки (1-2х10-5 клеток на лунку) инкубировали на льду в течение 3-4 ч вместе с серийными разведениями антитела Ό86, приготовленными на буфере РАС8 (2% козьей сыворотки, ΚΡΜΙ), в 96-луночных планшетах. Клетки осаждали в настольной центрифуге при 1500 об/мин 5 мин при 4°С. После удаления среды лунки снова заполняли 150 мкл буфера РАС8. Затем повторяли отмывку. РГТС-меченное козье антитело против ЦС мыши (1асккоп Гттипогекеагск) разводили 1:100 буфером РАС8 и инкубировали с клетками в течение 1 ч. на льду. Планшет закрывали фольгой, чтобы предотвратить фотообесцвечивание сигнала. После двух отмывок клетки фиксировали 1% формальдегидом и анализировали на проточном цитометре.
Преимущественно эпитоп СА6 обнаруживался в линиях клеток, происходящих из яичников, молочной железы, шейки матки и поджелудочной железы (табл. 3), как и предполагалось по данным иммуногистохимии опухолей. Однако некоторые линии клеток из других типов опухолей проявляли ограниченную экспрессию СА6. Антитело Ό86 связывается с кажущимся значением К, в 135,6 пМ (на клетках РС-3, табл. 3). Максимальная средняя флуоресценция (табл. 3) на кривых связывания (фиг. 1) в положительных по антигену линиях клеток свидетельствует об относительной плотности антигена.
Таблица 3
Клеточная линия Ткань Антиген ММЕ* Кажущееся значение Ко (М)
НЕ-60 Кровь -
Зигка! Кровь -
Уатакуа Кровь -
и-937 Кровь -
Т98С Мозг 35,94 1— 11775хЮ-|'>
ВТ-20 Мол. железа + 232,20 9,142х10 ш
- 24 020130
ВТ-474 Мол. железа -
ВТ-483 Мол. железа + 1911,00 ’ ” ι,ίββχΐό4* ‘
ВТ-549 Мол. железа + 71,39 1,046x1О'09
САМА-1 Мол. железа + 12,46 2,330* 104'9
МСР-7 Мол. железа + 81,41 2,890х1’(Г°у
ΜϋΑ-ΜΒ-157 Мол. железа 8,635 1,972х10‘1и
МПА-МВ-231 Мол. железа + 31,85 1,460x10419
ΜϋΑ-ΜΒ-468 Мол. железа + 71,58 8,127x10’*°
8К-ВК-3 Мол. железа -
Т-47В Мол. железа + 559,58 ~ 3,424x10“™
ΖΚ-75-1 Мол. железа 4- 811,67 ’ 4,299x10я*9 .....
НеТа Шейка матки + 242,50 ’ 6,938* Ю’10 ~
КВ Шейка матки + 119,56 1,110*10’™
Ψ18Η Шейка матки + 1133,55 2,380x1ο419
Со1о205 Толстая кишка -
ОЫ>1 Толстая кишка -
НСТ-8 Толстая кишка -
НТ-29 Толстая кишка -
СаИ-1 Почки —
А549 Легкие
8Ψ2- Легкие —
Саоу-3 Яичники + 465,20 5,47^10419......
Саоу-4 Яичники + 149,00 ” 4,043x10я*9
Е8-2 Яичники —
ΙΟΚΟ VI Яичники -
Ον-90 Яичники —
ОУСАКЗ Яичники —
ОУСАК5 Яичники + 97,10 1,473*10™
О7СА1<8 Яичники -
РА-1 Яичники -
8К-ОУ-3 Яичники -
89/626 Яичники -
Τθν-112Ό Яичники -
ТОУ-21Сг Яичники + 87,79 3,067х10“го
А8РС-1 Поджелудочная -
ВхРС-3 Поджелудочная + 79,99 5,263 x1ο419
НРАС Поджелудочная + 2228,00 ~ 2,348 х1О’08 ~
НРАР-П Поджел удочная + 266,50 2,81 ΙχΙΟ’™
Нз766Т Поджелудочная + 182,90 2,319*10 ™
М1АРаСа2 Поджелудочная -
МРапс96 Поджелудочная -
8и.86.86 Поджелудочная + 36,86 1,043 x1ο419
8Ψ1990 Поджелудочная + 36,17 3,679x10’10
РС-3 Простата 24,81 1,356*10’***
А375 Кожа -
8КМЕЕ28 Кожа -
КЬЕ Матка -
* среднее значение максимальной относительной флуоресценции
Пример 2. Характеристика эпитопа Ό86
Свойства антигена СА6 антитела Ό86 анализировали методом иммуноблоттинга на дот-блотах лизатов СА6-положительных клеток (Саоу-3), подвергнутых расщеплению путем протеолитической и/или гликолитической обработки. В качестве положительного контроля тестировали другие антитела, распознающие целый ряд эпитопов, на лизатах антиген-положительных линий клеток (Саоу-3 и СМ1; Со1о205 и С242; 8КМЕБ28 и Я24). Антитело СМ1 распознает белковый эпитоп из домена с вариабельным числом тандемных повторов (УКТЯ) Мис-1, и поэтому оно служит контролем на белковый эпитоп. С242 связывается с новым гликотопом на Мис-1 (СапАд), связанным с сиаловой кислотой и специфичным для рака прямой и толстой кишки, который служит контролем на гликотоп на белке. Я24 связывается с ганглиозидом СЭ3. специфичным для меланомы, и поэтому служит контролем на гликотоп на небелковом каркасе.
Клетки Саоу-3, Со1о205 и 8КМЕБ28 высеивали на чашки для тканевой культуры диаметром 15 см.
- 25 020130
Культуральную среду (30 мл на чашку) меняли за день до лизирования. Модифицированный буфер В1РА (50 мМ трис-НС1 рН 7,б, 150 мМ ЫаС1, 5 мМ ЭДТА, 1% ΝΡ40, 0,25% дезоксихолата натрия), ингибиторы протеаз (РМ8Е, пепстатин А, лейпептин и апротинин) и РВ8 предварительно охлаждали на льду. После отсасывания культуральной среды из чашек клетки дважды промывали 10 мл охлажденного РВ8. Все последующие операции выполнялись на льду и/или в холодной комнате при 4°С. После удаления последней порции РВ8 клетки лизировали в 1-2 мл лизирующего буфера (буфера В1РА с добавлением свежих ингибиторов протеаз до конечной концентрации 1 мМ РМ8Е, 1 мкМ пепстатина А, 10 мкг/мл лейпептина и 2 мкг/мл апротинина). Лизаты отделяли от чашек с помощью съемника и суспендировали, пропуская 5-10 раз через пипетку с иглой 18С. Лизаты вращали в течение 10 мин, а затем центрифугировали в микроцентрифуге до максимума (13000 об/мин) в течение 10 мин. Осадки отбрасывали, а в супернатантах определяли белок с помощью набора для метода Брэдфорда (ВюВаф.
Лизаты (2 мкл) наносили пипеткой прямо на сухие нитроцеллюлозные мембраны 0,2 мкм. Их оставляли сохнуть на воздухе примерно на 30 мин. Мембраны нарезали на кусочки, содержащие по одному пятну. Пятна инкубировали в присутствии проназы (1 мг/мл фермента, 50 мМ трис рН 7,5, 5 мМ СаС12), протеиназы К (1 мг/мл фермента, 50 мМ трис рН 7,5, 5 мМ СаС12), нейраминидазы (20 мЕд/мл фермента, 50 мМ ацетата натрия рН 5, 5 мМ СаС12, 100 мкг/мл В8А) или перйодной кислоты (20 мМ, 0,5 М ацетат натрия рН 5) в течение 1 ч при 37°С. Реагенты приобретали у фирмы Воске (ферменты) и ν\νΡ (перйодную кислоту). Мембраны отмывали (5 мин) буфером Т-ТВ8 (0,1% Т\\ееп 20, 1Х ТВ8), блокировали в блокирующем буфере (3% В8А, Т-ТВ8) в течение 2 ч при комнатной температуре и инкубировали в течение ночи с первичным антителом (т.е. ПЗб, СМ1, С242, В24) при 2 мкг/мл в блокирующем буфере при 4°С. Мембраны отмывали три раза по 5 мин буфером Т-ТВ8, а затем инкубировали со вторым, конъюгированным с НВР козьим антителом против 1дС мыши (или человека) (1аск8ои 1ттииоге8еагск); разведение 1:2000 в блокирующем буфере, в течение 1 ч при комнатной температуре. Иммуноблоты отмывали три раза и проявляли с помощью системы ЕСЬ (Атегккат).
Иммуноблоты (фиг. 2) подвергнутых расщеплению контрольных лизатов показали, что сигнал СМ1 разрушается при протеолитической обработке, тогда как сигналы при гликолитической обработке не менялись, как и следовало ожидать от антитела, распознающего белковый эпитоп. Сигнал С242 разрушался как при протеолитической, так и при гликолитической обработке, как и следовало ожидать от антитела, распознающего гликотоп, находящийся на белке. Сигнал В24, на который не влияла протеолитическая обработка, устранялся при обработке нейраминидазой или перйодатом, как и следовало ожидать от антитела, распознающего ганглиозид. Иммуноблоттинг ПЗб на пятнах подвергнутого расщеплению лизата Саоν-3 проявлял потерю сигнала при обработке как протеолитическими, так и гликолитическими соединениями. Таким образом, как и С242, ПЗб связывается с углеводным эпитопом на белковом остове. Кроме того, сигнал при иммуноблоттинге ПЗб оказался чувствительным к обработке нейраминидазой. Следовательно, САб, как и СапАд, является гликотопом, связанным с сиаловой кислотой.
Для подтверждения углеводной природы САб лизат Саоν-3 наносили на мембрану Р^Е и обрабатывали дегликозилирующим реагентом, трифторметансульфоновой кислотой (ТЕМ8А), в атмосфере азота при комнатной температуре в течение 5 мин. Блот промывали буфером Т-ТВ8 и подвергали иммуноблоттингу с СМ1 или с ПЗб (фиг. 3). Сигнал ПЗб разрушался при обработке кислотой, что дополнительно свидетельствует о том, что САб представляет собой гликотоп. Усиление сигнала СМ1 при обработке ТЕМ8А означает, что обработка кислотой не влияет на белок на фильтре и свидетельствует о том, что гликолитическая обработка демаскирует белковый эпитоп, распознаваемый СМ1.
Для дальнейшего выяснения структуры того углевода, на котором располагается САб, дот-блоты подвергали расщеплению Ν-гликаназой, О-гликаназой и/или сиалидазой (фиг. 4). Лизаты клеток Саоν-3 (100 мкг, 30 мкл) инкубировали при 100°С в течение 5 мин с 2,5 мкл денатурирующего буфера (С1уко). содержащего 8Ό8 и β-меркаптоэтанол. Затем денатурированные лизаты подвергали расщеплению с помощью 1 мкл Ν-гликаназы, О-гликаназы и/или сиалидазы А (С1уко) при 37°С в течение 1 ч. После этого подвергнутые расщеплению лизаты наносили (2 мкл) на нитроцеллюлозу и подвергали иммуноблоттингу, как описано выше.
Ν-гликаназа не оказывала заметного влияния на сигналы иммуноблота ПЗб. Однако образцы, обработанные сиалидазой, не давали никакого сигнала. Поскольку О-гликаназа не способна расщеплять сиалилированные О-связанные углеводы без предварительной обработки сиалидазой, сигнал ПЗб в образцах, обработанных одной лишь О-гликаназой, не должен меняться. Напротив, для действия Ν-гликаназы не требуется предварительная обработка какими-либо гликозидазами. То, что обработка Ν-гликаназой не влияет на сигнал ПЗб, свидетельствует о том, что эпитоп САб, скорее всего, находится на сиалилированных цепях О-связанного углевода.
Пример 3. Выявление антигена, на котором находится эпитоп САб
Для идентификации антигена, на котором находится эпитоп САб, иммунопреципитаты ПЗб анализировали методами 8Э8-РАСЕ и вестерн-гибридизации. Супернатанты лизатов клеток (1 мл на образец, 3-5 мг белка) осветляли при помощи шариков с белком С (30 мкл), уравновешенных в 1 мл буфера В1РА в течение 1-2 ч, с вращением, при 4°С. Все последующие операции выполнялись на льду и/или в холодной комнате при 4°С. Шарики быстро (2-3 с) осаждали в микроцентрифуге. Осветленные супернатанты
- 2б 020130 переносили в новые пробирки и инкубировали в течение ночи с 2 мкг Ό86, с вращением. В лизаты добавляли новые уравновешенные шарики с белком С (30 мкл) и инкубировали в течение 1 ч, с вращением. Суспензии шариков в лизатах подвергали кратковременному центрифугированию в микроцентрифуге и необязательно отбирали образцы лизатов после иммунопреципитации. Шарики отмывали 5-10 раз с помощью 1 мл буфера ШРА.
Подвергнутые иммунопреципитации образцы Ό86 затем расщепляли с помощью 30 мкл нейраминидазы (20 мЕд нейраминидазы (Косйе), 50 мМ ацетата натрия рН 5, 5 мМ СаС12, 100 мкг/мл В8А) или 30 мкл перйодной кислоты (20 мМ перйодной кислоты (УАЕ), 0,5 М ацетата натрия рН 5) в течение 1 ч при 37°С. Затем их ресуспендировали в 30 мкл 2-кратного буфера для нанесения образцов (содержащего β-меркаптоэтанол). Шарики кипятили в течение 5 мин и супернатанты в буфере для нанесения образцов наносили на 4-12% или 4-20% гели с трис-глицином (ЗпуЦгодеп). Гели разгоняли в буфере для электрофореза методом Леммли при 125 В в течение 1,5 ч. Образцы гелей подвергали переносу в течение ночи при 20 мА, на нитроцеллюлозные мембраны 0,2 мкм при помощи установки для переноса М1ш Тгап8-Ь1о! (ВюЕаб). Мембраны подвергали иммуноблоттингу с Ό86, как описано выше в примере 2.
В качестве альтернативы подвергнутые иммунопреципитации шарики сначала денатурировали, а затем подвергали энзиматическому расщеплению Ν-гликаназой, О-гликаназой и/или сиалидазой А (С1уко). Шарики ресуспендировали в 27 мкл инкубационного буфера и 2 мкл денатурирующего раствора (С1уко) и инкубировали при 100°С в течение 5 мин. После охлаждения до комнатной температуры добавляли раствор детергента (2 мкл) и инкубировали образцы с 1 мкл Ν-гликаназы, О-гликаназы и/или сиалидазы А при 37°С в течение 4 ч. После добавления 5-кратного буфера для нанесения образцов (7 мкл) образцы кипятили в течение 5 мин. Образцы подвергали 8Э8-РАСЕ и иммуноблоттингу, как описано выше.
Ό86 вызывает иммунопреципитацию полосы белка >250 кДа, которая наблюдается в лизатах антиген-положительных клеток (фиг. 5А, В и С). В некоторых линиях клеток (Т-47Э) наблюдается двойная полоса. Полоса >250 кДа устранялась в иммунопреципитатах, обработанных нейраминидазой или перйодной кислотой (фиг. 5А и В), свидетельствуя о том, что эпитоп СА6 находится в полосе >250 кДа. Также оказалось, что полоса >250 кДа нечувствительна к обработке иммунопреципитатов нейраминидазой, что согласуется с тем, что СА6 располагается на О-связанном углеводе (фиг. 5Е). Дополнительным подтверждением того, что полоса в 250 кДа представляет собой антиген СА6, является то, что Ό86 не вызывает иммунопреципитации такой полосы из отрицательных по антигену Ό86 клеток (фиг. 5Ό и 5Е).
Есть несколько доводов в пользу того, что антигеном СА6 является Мис1. Вследствие большого молекулярного веса и чувствительности к гликолитичсским ферментам, специфичным к О-связанным углеводам, кажется весьма вероятным, что антиген СА6 представляет собой муцин. Суперэкспрессия муцинов в опухолях хорошо изучена, особенно в опухолях молочной железы и яичников, что совпадает с основной реактивностью Ό86 в отношении опухолей. Более того, СА6, как и СапАд (сиалогликотоп на Мис1), не подвержен осаждению перйодной кислотой, свидетельствуя о том, что антиген СА6 сильно Огликозилирован. Тот факт, что в некоторых экспрессирующих Ό86 клеточных линиях Ό86 вызывал иммунопреципитацию двойной полосы >250 кДа, говорит о том, что СА6 представляет собой Мис1. Отличительной особенностью Мис1 у человека является наличие двух разных аллелей Мис1, отличающихся числом тандемных повторов, что приводит к экспрессии двух белков Мис1 различного молекулярного веса.
Для проверки того, что СА6 находится на Мис1, иммунопреципитаты Ό86 из лизата Саоν-3 подвергали 8Э8-РАСЕ и иммуноблоттингу с антителом Ό86 или с антителом СМ1 к УЫТЕ Мис1. Как видно из фиг. 6А, СМ1 дает сильную реакцию с полосой >250 кДа, иммунопреципитацию которой вызывает Ό86. На фиг. 6В иммунопреципитаты Ό86 и СМ1 из лизата клеток неЬа проявляют все ту же двойную полосу >250 кДа при иммуноблоттинге как с Ό86, так и с СМ1. Эти результаты показывают, что эпитоп СА6 действительно локализуется на белке Мис-1. Двойная полоса от Ό86, наблюдавшаяся в клетках неЬа (и Т-47Э), может объясняться тем, что экспрессия Мис-1 управляется разными аллелями, имеющими различное число тандемных повторов.
Несмотря на то что СМ1 и Ό86 связываются с одним и тем же белком Мис-1, они являются разными эпитопами. Химическое дегликозилирование дот-блотов лизата Саоν-3 с помощью трифторметансульфоновой кислоты (ТЕМ8А) устраняло сигнал Ό86 (фиг. 3). Однако та же обработка усиливала сигнал СМ1. Видимо, дегликозилирование выявило скрытые эпитопы для антитела СМ1. Более того, сравнение результатов по связыванию Ό86 и СМ1 методом проточной цитометрии (табл. 4) показывает, что эпитоп СА6 существует не на всех клетках, экспрессирующих Мис1. Интересно то, что эпитоп СА6 не экспрессируется на клетках линии Со1о205 (табл. 3), у которых на высоком уровне экспрессируется сиалогликотоп СапАд Мис1.
- 27 020130
Таблица 4
Клеточная линия ϋ86 СМ1
ммг* Кажущееся КДМ) ммг* Кажущееся КДМ)
О86-иСМ1положит. ВТ549 71,39 1,046x10 09 187,90 6,056x10 119
СаохЗ 465,20 5,478x10” 1031,00 7.479x10”9
НеЬа 242,50 6,938х10ш 334,80 2,907x10”
КВ 119,56 1,110x10”'19 338,00 5,345х 10 99
МСГ7 81,41 2,890x10 1,9 1023,00 8.694x10 99
О£6-иСМ1отрицат. КЬЕ 27,48 - 561,70 8,156x10”
ОУСАКЗ 21,19 - 192,50 5,949 х 10 99
8ΚΟΥ3 17,53 - 49,41 6.246x1 (Г99
* среднее значение максимальной относительной флуоресценции
Пример 4. Количественный анализ сбрасываемого эпитопа СА6
Поскольку эпитоп СА6 располагается на молекуле Мис1, которая сбрасывается в кровоток у многих больных раком, то был предпринят количественный подход с целью определения того, не помешает ли такой уровень терапии с помощью антитела Ό86. Связывание циркулирующего антитела с антигеном обычно ведет к быстрому выведению таких комплексов из крови. Если значительная доля введенной дозы антитела быстро удаляется из кровотока, то уменьшится количество, достигающее опухоли, что приведет к снижению противоопухолевой активности терапевтического антитела. При конъюгировании антитела с сильнодействующим цитотоксическим соединением быстрый клиренс конъюгата способен повысить неспецифическую токсичность. Таким образом, в случае таких конъюгатов антител с небольшими веществами, как Ό86-ΌΜ1, можно ожидать, что высокий уровень сбрасываемого антигена вызовет снижение противоопухолевого эффекта и повышение ограничивающей дозировку токсичности.
Недавние клинические испытания терапевтических антител дали информацию о влиянии концентрации сбрасываемого антигена на фармакокинетику. Например, при клинических испытаниях антитела трастузумаб (НегсерИп), используемого для лечения экспрессирующего Ьег2/пеи метастазирующего рака молочной железы, фармакокинетика трастузумаба не менялась, когда уровень сбрасываемого Ьег2/пеи составлял менее 500 нг/мл (Редгат е! а1., 1. С1т. Опсо1. 16(8): 2659-71 (1998)). При молекулярном весе Ьег2/пеи 110 000 дальтон молярная концентрация сбрасываемого Ьег2/пеи менее 4,5 нМ почти не влияет на фармакокинетику.
В другом примере клинические испытания кантузумаб-мертансина (ЬиС242-ЭМ1) показали отсутствие корреляции между уровнем сбрасываемого СапАд (эпитопа С242) перед обработкой и фармакокинетикой клиренса антител (То1сЬег е! а1., 1. С1т. Опсо1. 21(2): 211-22 (2003)). Эпитоп СапАд, как и эпитоп СА6, распознаваемый Ό86, является уникальным опухолеспецифичным О-связанным сиалогликотопом на Мис1. Однако гетерогенность эпитопа СапАд затрудняет его количественное определение в молях. В генеральной популяции аллели Мис1 имеют разную длину в зависимости от числа тандемных повторов в домене с вариабельным числом тандемных повторов (УКГК). В каждом тандемном повторе имеется несколько сайтов О-гликозилирования. Сложности экспрессии СапАд способствует и колебания уровня собственной гликозилтрансферазной активности от клетки к клетке. Таким образом, даже у одного и того же пациента возможен широкий интервал числа эпитопов СапАд на молекуле Мис1. Более того, число эпитопов СапАд на одной молекуле Мис1 будет разным по всей популяции пациентов. По этой причине уровень сбрасываемого СапАд в образцах сыворотки измеряют методом сэндвич-ЕЬ18А, в котором сброшенный Мис1 с эпитопом СапАд фиксируется на С242 и детектируется при помощи системы биотинилированное антитело С242/стрептавидин-НКР. Сброшенный СапАд количественно выражают в стандартных единицах (ед.), пропорциональных количеству эпитопов на 1 мл сыворотки, а не в виде молярной концентрации Мис1. По аналогии такая же ситуация возникает и при количественном определении сброшенных эпитопов СА6. Напротив, у трастузумаба есть только один эпитоп на одну сбрасываемую молекулу Ьег2/пеи, что сильно упрощает количественное определение сбрасываемого антигена.
Для того, чтобы установить связь между уровнем сбрасываемого эпитопа СА6 и уровнем, выявленным при клинических испытаниях трастузумаба и кантузумаб-мертансина, был разработан метод получения молярных концентраций таких сложных сбрасываемых эпитопов, как сиалогликотопы на Мис1. Во-первых, была составлена простая методика сэндвич-ЕЫ8А на Ό86. Схема метода представлена на фиг. 7А. Для фиксации Мис1 с эпитопом СА6 использовали Ό86. Поскольку каждая молекула Мис1 содержит несколько эпитопов СА6, то еще использовали биотинилированное антитело Ό86 в качестве трейсера. Биотинилированное Ό86, связавшееся с фиксированным СА6, детектировали с помощью стрептавидин-НКР, используя в качестве субстрата АВТ8. Эпитоп СА6 фиксировали из сыворотки больных раком яичников или из стандартов, полученных из коммерчески доступного набора для теста на Мис1 (СА15-3), который применяется для мониторинга сбрасываемого Мис1 у больных раком молочной железы. Содержание Ό86 в единицах на мл было произвольно приравнено к содержанию стандартов СА15-3 в единицах на мл.
На фиг. 7В представлены результаты метода сэндвич-ЕЬ18А на Ό86, для которых использовали
- 28 020130 стандарты СА15-3. Полученная кривая очень близка к кривой, полученной со стандартами СА15-3 при определении СА15-3. Для того, чтобы перевести содержание Ό86 в единицах на мл в молярную концентрацию СА6, необходима стандартная кривая для биотинилированного Ό86, на которой сигнал переводится в пикограммы Ό86. При условии, что стехиометрия между эпитопом СА6 и биотинилированным Ό86 равна 1:1, а молекулярный вес биотинилированного Ό86 равен 160000 Да, можно рассчитать количество молей фиксированного СА6 в одном объеме внесенного образца.
На фиг. 8А и В представлены два альтернативных способа получения стандартной кривой для биотинилированного Ό86. На фиг. 8А для фиксации биотинилированного Ό86 использовали козье поликлональное антитело против 1дС мыши, которое в свою очередь детектировали способом, идентичным тому, который использовался в методе сэндвич-ЕЬ18А на фиг. 7. В методе, представленном на фиг. 8В, биотинилированное Ό86 вносили непосредственно на планшет для ЕЫ8А и детектировали, как на фиг. 8А. Как видно из фиг. 8С, стандартные кривые для биотинилированного Ό86, полученные каждым способом, хорошо совпадают друг с другом.
В табл. 5 представлен анализ образцов сыворотки больных раком яичников на различные сбрасываемые антигены. Метод ЕЫ8А на СА125 обычно применяется для мониторинга лечения больных раком яичников путем измерения сбрасываемого СА125 в единицах на мл. Содержание СА125 было проставлено на образцах сыворотки. Метод ЕБ18А на СА15-3 обычно применяется для мониторинга лечения больных раком молочной железы путем измерения сбрасываемого Мис1 в единицах на мл с помощью фиксирующего и детектирующего антител, распознающих эпитопы, отличные от тех, которые распознает Ό86. В табл. 5 измеряли СА15-3 в образцах сыворотки больных раком яичников.
Таблица 5
№ сыворотки СА1251 (ед./мл) СА15-31 (ед./мл) Ώ862 (едУмл) ϋ36 (пМ) Ώ864 (пМ)
4 72,80 117,72 29,79 52,13 188,94
5 3651,90 98,19 567,02 654,44 >2560,00
6 930,50 87,08 504,15 667,56 2505,00
7 76,00 72,70 135,65 246,94 778,25
8 32,50 18,44 39,96 65,19 239,88
9 351,70 292,39 >975,61 1512,31 >2560,00
10 90,00 42,40 49,48 85,19 305,88
11 200,50 60,58 92,32 152,38 526,75
12 283,00 35,67 83,65 135,81 485,06
13 197,50 20,61 35,92 61,06 216,25
14 100,60 6,13 12,39 23,19 88,06
15 34,60 59,18 199,85 286,63 1228,56
17 196,40 56,75 66,53 130,44 405,88
18 16,90 30,45 34,43 60,81 223,69
19 22,00 263,93 118,98 191,69 728,94
22 110,70 21,44 16,46 29,94 111,38
Определяли с помощью набора для ЕБ18А
Определяли по коммерческим стандартам СА15-3 (1 ед. СА15-3 = 1 ед. Ό86) 3 стандартная кривая, козье антитело к 1дС мыши + биотин-086 4стандартная кривая, биотин-086
Для значений СА15-3, приведенных в табл. 5, использовали коммерчески доступный набор для иммуноферментного анализа СА15-3 от СаиАд О|адио511с5. Для значений 086 в единицах на мл стандартную кривую составляли, используя стандарты СА15-3 (из набора для иммуноферментного анализа СА153 от СаиАд ПхадиокЕск) методом сэндвич-ЕЬ18А. 086 в единицах на мл произвольно приравняли к единицам СА15-3 на мл. В двух последних столбцах рассчитано содержание сбрасываемого СА6 в пикомолях (пМ) по стандартным кривым для биотинилированного 086, приведенным на фиг. 8С.
Для количественного анализа уровня СаиАд использовали данные по уровню СаиАд в сыворотке у пациентов, принимавших участие в клиническом испытании кантузумаб-мертансина перед лечением (То1с11ег е1 а1., I. С1т. Опсо1. 21(2): 211-22 (2003)). Для составления стандартной кривой по стандартам СаиАд использовали методику ЕБ18А, аналогичную той, что описана для 086. Для фиксации стандартов СаиАд использовали С242. Фиксированный СаиАд детектировали с помощью биотинилированного антитела-трейсера С242, а затем проявляли с помощью стрептавидин-НКР, используя в качестве субстрата АВТ8. Стандартную кривую для биотинилированного С242 составляли так же, как и для биотинилированного 086, что дало возможность перевести единицы/мл в молярные концентрации циркулирующих эпитопов СаиАд. В табл. 6 приведены уровни СаиАд у пациентов из клинического испытания кантузумаб-мертансина вместе с соответствующими рассчитанными молярными концентрациями циркулирующего СаиАд.
- 29 020130
Таблица 6
СапАд1 (ед./мл) СапАд2 (пМ) СапАд3 (пМ)
31240 19185,7 34592,8
8687 3535 9619,3
7456 4579 8256,2
3686 2263,7 4081,6
1447 888,7 1602,3
1262 775 1397,4
718 441 795,1
547 335,9 605,7
394 242 436,3
381 234 421,9
329 202,1 364,3
322 197,8 356,6
306 187 338,8
284 174,4 314,5
247 151,7 273,5
242 148,6 268
229 140,6 253,6
227 139,4 251,4
184 ИЗ 203,7
120 73,7 132,9
107 65,7 118,5
100 61,4 110,7
81 49,7 89,7
81 49,7 89,7
67 41,1 74,2
53 32,5 58,7
45 27,6 49,8
43 26,4 47,6
39 24 43,2
36 22,1 39,9
24 14,7 26,6
18 11,1 19,9
17 10,4 18,8
<10 6Д 11,3
<10 6,1 и,з
<10 6,1 11,3
<10 1 6,1 11,3
'уровень циркулирующего СапАд до лечения, измеренный методом сэндвич-ЕЫ8Л Стандартная кривая, козье антитело к βίΐ мыши + биотин-С242 Стандартная кривая, биотин-С242
Сравнение уровня сброшенного СА6 в пМ у больных раком яичников с рассчитанным уровнем СацАд у СаиЛд-положительных больных раком показывает, что в общем уровень сброшенного СА6 близок уровню сброшенного СаηЛд. Более того, только в 2 из 16 образцов сыворотки больных раком яичников уровень СЛ6 может превышать 4,5 нМ (образцы 5 и 9, у которых сигнал выходил за пределы стандартной кривой), то есть тот уровень, при превышении которого наблюдалось изменение фармакокинетики герцептина в клинических испытаниях у 11ег2/пеи-положительных больных раком молочной железы. Уровень СаηЛд свыше 4,5 нМ наблюдался только у 3 из 37 больных из клинического испытания. В этом клиническом испытании отсутствовала корреляция между уровнем сброшенного СаηЛд и более быстрым клиренсом кантузумаб-мертансина. Однако у больного с наиболее высоким уровнем СаηЛд (31240 ед./мл) образец был взят всего лишь через 8 ч после переливания крови. Эти результаты свидетельствуют, что хотя и происходит сброс некоторых эпитопов Μιιο1 типа СА6 и СаηЛд у больных раком, но на таком уровне, который не мешает терапевтическому применению антител.
Пример 6. Клонирование вариабельных областей мышиного антитела Ό86
Такие мышиные моноклональные антитела, как Ό86, имеют ограниченную полезность в клинической обстановке, так как иммунная система человека признает их чужими. У пациентов быстро выраба
- 30 020130 тываются человеческие противомышиные антитела (НАМА), что приводит к быстрому клиренсу мышиных антител. По этой причине вариабельную область мышиного И86 (тиИ86) подвергали поверхностной перестройке, чтобы получить гуманизованные антитела И86 (ЬиИ86).
Вариабельные области мышиного антитела И86 клонировали методом ОТ-ПЦР. Тотальный препарат РНК выделяли из достигшей конфлуэнтности колбы Т175 с клетками гибридомы И86 с помощью набора КЫеаву тЭшргер фирмы О|адеп. Концентрацию РНК определяли методом УФспектрофотометрии, а реакции обратной транскрипции (ОТ) проводили при 4-5 мкг тотальной РНК с помощью набора Еирегвспр! II фирмы СЛот и праймеров в виде рандомизованных гексамеров.
Реакции ПЦР проводили с вырожденными праймерами по типу тех, что описаны в \¥апд Ζ. е1 а1., I. Iттипο1. Ме11тобв, 1ап. 13, 233(1-2): 167-77 (2000). Для вырожденных реакций ПЦР использовали непосредственно реакционную смесь ОТ. Использовали 3'-праймер легкой цепи НтбКЬ:
ТАТАОАОСТСААОСТтеОАТООТОООААОАТООАТАСАОТТОСТСС (8ЕЦ ГО
N0: 25) и З'-праймер тяжелой цепи Ват1§01: СОАООАТССАТАбАСАСАТСССОПТСТСОТ’ТТТОбС (8Е() ГО ΝΟ: 26), а для 5'-концевых реакций ПЦР использовали праймер 8ас1 МК:
ОСОАССТССАУАТТОТСМТЗАСМСАГОУСТМСА (8Еф 10 N0: 27) для легкой цепи и равную смесь праймеров ЕсоЮМШ: СТТССООААТТСЗАКОТЦМАОС!С8АО8АОТС (8Еф ГО N0: 28) и ЕсоК1МН2: СТТССОЦААТТС8АКОТНМАОСТО8АО8АОТСтеО (8ЕЦ ПЭ N0: 29) для тяжелой цепи (смешанные основания: Н = А+Т+С, 8 = О+С, ¥ = С+Т, К = О+Т, М = А+С, К. = Л+6, = А+Т, V = А+С+О, N = А+Т+О+С).
Реакции ПЦР были стандартными за исключением того, что в них добавляли 10% ИМ8О (реакционная смесь на 50 мкл содержала в конечной концентрации: 1Х буфер для ПЦР (ΡοΟκ), по 2 мМ каждого бХТР, по 1 мМ каждого праймера, 2 мкл реакции ОТ, 5 мкл ИМ8О и 0,5 мкл Тас.| (ΡοΟκ). Реакции ПЦР проводили на термоциклере ΜΙ Яевеагсй по программе, адаптированной из \¥апд Ζ. е1 а1., Т Iтти№1. Μ^οάβ, 1ап 13, 233(1-2): 167-77 (2000): 1) 94°С, 3 мин; 2) 94°С, 15 с; 3) 45°С, 1 мин; 4) 72°С, 2 мин; 5) цикл из 29 повторов со стадии 2; 6) заключительная стадия наращивания при 72°С, 10 мин. Продукты ПЦР клонировали в рВ1иевспр1 II ЕК+ (Ейайдепе), используя сайты рестрикционных ферментов, созданные ПЦР-праймерами. Клоны тяжелой и легкой цепи секвенировали при помощи сервиса ЕесрупдЫ.
Для проверки 5'-концевых последовательностей кДНК дополнительно проводили ПЦР и клонирование. Последовательностей кДНК легкой цепи и тяжелой цепи И86, определенные из вырожденных ПЦР-клонов, запускали на вебсайт NСΒI с поисковой программой В1ав1 и сохраняли последовательности мышиных антител с представленной сигнальной последовательностью. По этим сигнальным пептидам составляли праймеры для ПЦР, используя консервативные отрезки между родственными последовательностями ДНК. В праймеры для сигнальной последовательности вводили рестрикционные сайты ΕсοЯI (табл. 7) и использовали их при реакциях ОТ-ПЦР, как описано выше.
Таблица 7. Вырожденные праймеры для сигнальной последовательности И86
Наименование Последовательность
Тяжелая цепь: О86НС1еаб гщаааИсаайасШсаёяГкйсасГ (8Еф Ю ΝΟ: 30)
Легкая цепь: К.Т1ЬС1еас1 1ГЙ8а§с1сса§а1Шса§сПсс1§с1 ( 8ЕС) ПЭ ΝΟ: 31)
Секвенировали несколько индивидуальных клонов легкой и тяжелой цепи, чтобы выявить и устранить возможные ошибки в последовательности, внесенные полимеразой. Была получена только одна последовательность для клонов легкой цепи и тяжелой цепи при ОТ-ПЦР. Этого было достаточно, чтобы составить праймеры, способные амплифицировать последовательности легкой и тяжелой цепи мышиного И86, простирающиеся до сигнальной последовательности. Последующие клоны из этих дополнительных реакций ПЦР подтвердили 5'-концевые последовательности вариабельной области, которые были искажены первоначальными вырожденными праймерами. Совокупные результаты из различных клонов кДНК дали окончательные последовательности легкой и тяжелой цепи мышиного И86, приведенные на фиг. 9. Используя правила Кабата и определения ΑΒΜ, были идентифицированы три участка СИЯ легкой цепи и тяжелой цепи (фиг. 9 и 10). Поиск в базе данных ^Β^βΙ NСВI показал, что вариабельная область легкой цепи антитела тиИ86, скорее всего, происходит из мышиного эмбрионального гена ^Ук ар4, а вариабельная область тяжелой цепи, скорее всего, происходит из мышиного эмбрионального гена ^УЪ 1558.41 (фиг. 11).
Пример 7. Определение поверхностных остатков вариабельных областей антитела И86
Методы перестройки поверхности антител, описанные в Ребегаеп е1 а1. (1994) и ΡοβΗβΚη е1 а1. (1996), начинаются с прогнозирования поверхностных остатков вариабельных областей мышиного антитела. Поверхностный остаток определяется как такая аминокислота, у которой по меньшей мере 30% общей площади поверхности доступно для молекул воды. В отсутствие готовой структуры для поиска поверхностных остатков тиИ86 мы провели сопоставление 10 антител с наиболее гомологичными последовательностями в группе из 127 файлов структур антител (фиг. 12). Для этих совмещенных последователь
- 31 020130 ностей усредняли доступность для растворителя по каждому положению Кабата (фиг. 13А и В).Поверхностные положения со средним значением доступности между 25% и 35% подвергали второму циклу анализа путем сравнения подгруппы антител, содержащих два идентичных остатка с каждой стороны (фиг. 13А и В). После второго цикла анализа число предполагаемых поверхностных остатков тяжелой цепи 1Ш1О86 возросло с 21 до 23, при этом в список остатков, у которых расчетная поверхностная доступность составила более 30%, вошли Туг3 и Ьу823. В большей части наших поверхностноперестроенных антител использовалось определение Кабата для СОВ1 тяжелой цепи, но при расчетах для Ό86 нечаянно было использовано определение АЬМ, поэтому остаток Т28 тяжелой цепи не попал под определение поверхностного остатка каркасного района, как это могло бы быть в ином случае. Число поверхностных остатков легкой цепи уменьшилось из 16 до 15, так как расчетная поверхностная доступность А1а80 снизилась с 30,5 до 27,8% во втором цикле анализа. В целом вариабельные области тяжелой и легкой цепи тиО86 содержат 38 предполагаемых доступных с поверхности каркасных остатков.
Пример 8. Выбор антител человека
Поверхностные положения вариабельной области мышиного Ό86 сравнивали с соответствующими положениями последовательностей антител человека в базе данных Кабата (1оЬи8ои С., \¥и ТТ. М.1с1е1с Ас1б8 Ве8. 1аи. 1, 29(1): 205-6 (2001). С помощью программы 8В (8еаг1е, 1998) для управления базой данных по антителам извлекали и совмещали поверхностные остатки тяжелой и легкой цепи из естественных пар антител человека. Для замены поверхностных остатков вариабельной области мышиного антитела Ό86 была выбрана поверхность вариабельной области антител человека с наиболее идентичными остатками на поверхности, при этом особое внимание уделялось положениям, находящимся в пределах 5А от СОВ.
Пример 9. Экспрессионный вектор для химерных и гуманизованных антител
Парные последовательности легкой и тяжелой цепи клонировали в один и тот же экспрессионный вектор для млекопитающих. С помощью ПЦР-праймеров для вариабельных участков человека создавали рестрикционные сайты, позволяющие вставить сигнальную последовательность человека в клонирующий вектор рВ1ие8спр! II. После этого можно было клонировать вариабельные участки в экспрессионную плазмиду для млекопитающих с помощью ЕсοВI и В81^[ или НтбШ и АраI для легкой цепи и тяжелой цепи, соответственно (фиг. 14). Вариабельные участки легкой цепи клонировали в одной рамке считывания с константной областью каппа ЦС человека, а вариабельные участки тяжелой цепи клонировали в последовательность константной области человека. В окончательных экспрессионных плазмидах экспрессия последовательностей кДНК легкой и тяжелой цепи управляется промоторами СМV человека.
Пример 10. Идентификация остатков, способных отрицательно повлиять на активность Ό86
В большинстве случаев гуманизации вплоть до настоящего времени строили молекулярную модель рассматриваемого антитела, чтобы идентифицировать остатки, находящиеся вблизи от СИВ, как возможные проблемные остатки. При все возрастающем количестве поверхностно-перестроенных антител для работы исторический опыт оказывается не менее эффективным для прогнозирования проблем, чем построение модели, поэтому для Ό86 не создавали никаких молекулярных моделей. Вместо этого поверхностные остатки Ό86 мыши сравнивали с остатками у ранее полученных поверхностноперестроенных антител и идентифицировали остатки, способные с низкой или высокой степенью риска повлиять на связывающую активность антитела. В доступных разрешенных структурах антител и молекулярных моделях от предыдущих случаев гуманизации неоднократно идентифицировались сходные группы остатков, находящиеся в пределах 5А от СИВ. Используя эти данные, в табл. 1 приведены остатки Ό86 мыши, которые могут находиться вблизи от и даже в пределах 5А от СИВ. Многие из этих положений подвергались замене и в предыдущих случаях гуманизации, но только лишь положение 74 в тяжелой цепи вызывало потерю связывающей активности.
Мышиный остаток был оставлен в этой позиции у 1шС242 и 1шВ4 с тем, чтобы сохранить связывающую активность антитела мыши. С другой стороны, то же самое вложение подвергали замене на соответствующий остаток человека у гуманизованного 6.2С5С6 без потери активности (6.2С5С6 является антителом против ЮЕ1-В и часто именуется анти-С6). Хотя любой из остатков в табл. 1 может вызывать проблемы с гуманизованным антителом, но особое внимание следует уделять остатку Р73 из-за предыдущего опыта по этой позиции.
Пример 11. Выбор наиболее гомологичной поверхности антител человека
Кандидатов на перестройку поверхности тиО86 из поверхностей антител человека извлекали из базы данных Кабата по последовательностям антител при помощи программы 8В. Эта программа служит интерфейсом для поиска только определенных положений остатков по всей базе данных антител. Чтобы сохранить естественные пары, поверхностные остатки легких и тяжелых цепей сравнивали вместе. Наиболее гомологичные поверхности антител человека из базы данных Кабата выстраивали по степени идентичности последовательностей. Верхние 3 поверхности при совмещении их программой 8В базы данных Кабата представлены в табл. 2. Затем эти поверхности сравнивали с целью идентификации тех поверхностей человека, которые требуют наименьших замен по остаткам, приведенным в табл. 1. Антитело 28Е4 против ВЦО) (Воисйег е! а1., 1997) требует наименьшего числа замен поверхностных остатков (всего 11), причем только 3 из них входят в список вероятных проблемных остатков. Поскольку антитело
- 32 020130
28Е4 человека обладает наиболее гомологичной поверхностью, оно и является самым лучшим кандидатом для поверхностной перестройки тиЭ86.
Пример 12. Конструирование последовательностей ДНК для гуманизованных антител Ό86
Замены 11 поверхностных остатков у Ό86 осуществляли методом ПЦР-мутагенеза. ПЦР-мутагенез выполняли на клонах кДНК вариабельной области мышиного Ό86 для создания гена поверхностноперестроенного Ό86 человека. Чтобы произвести аминокислотные замены, необходимые для поверхностноперестроенного Ό86, составили набор праймеров для гуманизации, представленный ниже в табл. 8.
Таблица 8
Праймер Последовательность праймера
ОЗбНСара с8а1ёёё.с<-'си8ё1К8а8ёсСВеаёаКаса81Й.ассаЙа 8Еф ГО ΝΟ: 32
Б86ЬСВм ТШсд(ас§тса§с!сса§с觧1 8Е<) ГО ΝΟ: 33
Э86НС5епа са§£181асас!ссса88сНа!с!сса£са81с1 8Еф ГО ΝΟ: 34
ИиСбНСара С£а1§8£сссН££1£ёа88С£§саеа§асае1§асса£а 8Εζ) ΙϋΝΟ: 35
О86ЬС5е( са881ё1асас!сс8а§аК8ис1сассса81с1сса^саасса181с!§са1с1 8Εζ) ГО ΝΟ: 36
О86ЬСг18 §£сас!8са§8На1§8!£ассс1с1сссс188а£а 8ЕО ГО ΝΟ: 37
О86ЕСз77Г саа!са£са§саТ§£а£§с1§аа£а 8Ер ГО ΝΟ: 38
О8бЬСз77г §сс1сса!§с!§с1§а1181§а§а 8ЕфГО>Ю:39
ОЗбНСсскр сае§1д(асас!сссаёёс(саёс1с8£8са£(с(£8££с!да8£1££(£аа8 ссс§8§§сс!са§(: 8Е<2 ГО ΝΟ: 40
О86НС1 ПсдсГцса£асаса1сс(сса8саса 8ЕфГО N0:41
ϋδόΗΟηΐ £1£1с1§са£Хсаа1£к£ссй§ссс1££аасйс1£аС 8ЕО ГО ΝΟ: 42
ЬиОЗбНСара с£а1£8£ссс«§§1:8ёа£8с£8са£а§аса8!8асаапа 8ЕО ГО ΝΟ: 43
Реакции ПЦР были стандартными за исключением того, что в них добавляли 10% ΌΜ8Ο (реакционная смесь на 50 мкл содержала в конечной концентрации: 1Х буфер для ПЦР (Косйе), по 2 мМ каждого бЭТР, по 1 мМ каждого праймера, 100 нг матрицы, 5 мкл ΌΜ8Ο и 0,5 мкл Тад (Косйе). ПЦР проводили на термоциклере Μι Кезеагсй по следующей программе: 1) 94°С, 1 мин; 2) 94°С, 15 с; 3) 55°С, 1 мин; 4) 72°С, 1 мин; 5) цикл из 29 повторов со стадии 2; 6) заключительная стадия наращивания при 72°С, 4 мин. Продукты ПЦР расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами и клонировали в клонирующие векторы рВ1иезсг1р!. Клоны секвенировали для подтверждения аминокислотных замен.
Поскольку замена остатка Р73 тяжелой цепи вызывала проблемы в прошлом, то создавали варианта тяжелой цепи, один с Т73 из 28Е4 человека и другой, сохраняющий Р73 мыши. Остальные 10 поверхностных остатков заменяли из мышиных на остатки из 28Е4 человека у обоих вариантов гуманизованного Ό86 (табл. 2). Придерживаясь обычного способа наименования, наиболее гуманизованным является вариант 1.0, так как он содержит все 11 остатков из поверхности человека. Вариант тяжелой цепи, у которого остается Р73 мыши, получил название вариант 1.2 на тот случай, если потребуются другие варианты, так что вариант 1.1 зарезервирован для варианта, содержащего максимальное число мышиных остатков. Аминокислотные последовательности двух гуманизованных вариантов представлены совмещенными с аминокислотной последовательностью Ό86 мыши на фиг. 15А и В. Последовательности кДНК и аминокислотные последовательности вариабельной области легкой цепи гуманизованных вариантов 1.01 и 1.21 одинаковы и представлены на фиг. 16. Последовательности кДНК и аминокислотные последовательности тяжелой цепи гуманизованных вариантов 1.01 и 1.21 представлены на фиг. 17А и В.
Пример 13. Экспрессия в клетках СНО и выделение йиО86 и измерение аффинности
Для определения того, сохранили ли гуманизованные варианты Ό86 аффинность связывания тнЭ86. необходимо было экспрессировать и очистить антитела. Клетки СНО устойчиво трансфецировали химерным вариантом Ό86 (сйО86), содержащим константную область человека и вариабельную область мыши, либо ΗπΌ86ν1.01 или ΗπΌ86ν1.21.
Клетки СНО ЭС44 (4,32х106 клеток на чашку) высеивали на чашки диаметром 15 см в неселективной среде (α-МЕМ + нуклеотиды (С1Ьсо) с добавлением 4 мМ Ь-глутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина и 10% РВ8) и помещали в увлажнительный инкубатор при 37°С, 5% СО2. На следующий день клетки трансфецировали несущей сйО86 экспрессионной плазмидой по модифицированной версии методики Ро1уГес! ТгапзГесйоп, рекомендованной фирмой 01адеп. Из клеток отсасывали неселективную среду. Чашки промывали 7 мл подогретого (37°С) РВ8 и снова заполняли 20 мл неселективной среды. Плазмидную ДНК (11 мкг) разводили 800 мкл среды НуЬпбота 8ΡΜ (С1Ьсо). Затем в смесь ДНК/8ΡΜ добавляли 70 мкл реагента Ро1уГес! (01адеп). После этого смесь осторожно обрабатывали на вибрационной мешалке и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. В смесь добавляли неселективную среду (2,7 мл). Эту конечную смесь инкубировали с клетками на чашке в течение 24 ч.
Из чашек удаляли трансфекционную смесь/среду, а затем обрабатывали клетки трипсином и просчитывали. Затем клетки высеивали в селективную среду (α-МЕМ + нуклеотиды с добавлением 4 мМ Ьглутамина, 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 10% РВ8, 1,25 мг/мл С418) на 96-луночные планшеты (250 мкл на лунку) при различной плотности (1800, 600, 200 и 67 клеток на лунку). Клетки
- 33 020130 инкубировали в течение 2-3 недель, добавляя среду при необходимости. Лунки подвергали скринингу на уровень продукции антител количественным методом ЕЬ18А. 96-луночный планшет Iтти1οη 2НВ покрывали козьим Е(аЬ)2-антителом против 1дС человека (,Εκ1<κοη Iттиηο^еκеа^сЬ; 1 мкг на лунку в 100 мкл буфера из 50 мМ карбоната натрия рН 9,6) и инкубировали 1,5 ч при комнатной температуре с покачиванием. Все последующие операции выполняли при комнатной температуре. Лунки отмывали два раза буфером Т-ТВ8 (0,1% Ъуеен 20, ТВ8) и блокировали в 200 мкл блокирующего буфера (1% В8А, Т-ТВ8) в течение 1 ч. Лунки отмывали два раза буфером Т-ТВ8. На отдельном планшете делали серийные разведения (1:2 или 1:3) стандарта антител ЕМ164 (100 нг/мл) и супернатантов культур в блокирующем буфере. Эти разведения (100 мкл) переносили на планшет для ЕЬ18А и инкубировали в течение 1 ч. Лунки отмывали 3 раза буфером Τ-ΊΒ8 и инкубировали со 100 мкл козьего Ес-АР против 1дС человека (Εκ1<κοη Iттиηο^еκеа^сЬ), разведенного 1:3000 блокирующим буфером, в течение 45 мин. После 5 отмывок буфером Т-ТВ8 лунки проявляли с помощью 100 мкл проявляющего реагента Р№Р (10 мг/мл; Р№Р = пнитрофенилфосфат, динатриевая соль, Р1егсе; в 0,1 М диэтаноламиновом буфере рН 10,3) в течение 25 мин. Измеряли поглощение при 405 нм на считывающем устройстве планшетов ЕЬ18А. Для определения уровня антител использовали значения поглощения (супернатантов культур) на линейном участке стандартной кривой.
Наиболее продуктивные клоны, идентифицированные методом ЕЬ18А, затем субклонировали, размножали и замораживали клетки порциями для хранения.
Для экспрессирования 1ιι.ιΌ86ν1.01 и 1ιι.ιΌ86ν1.21 клетки СНО ΌΟ44 (Όγ. Ба\\тег1се Скакт, 0ο1ιιιηΝ3 ишуегкПу, ΝΥ) культивировали в среде α-МЕМ с рибонуклеозидами и дезоксирибонуклеозидами (кат. № 12571 фирмы ОФот, Оп-ιηά Шшй, №\ν ΥοιΈ). В среду добавляли 10% эмбриональной бычьей сыворотки (кат. № 8Н30071.03 фирмы НуС^е, Εο^ηη, υΤ), 1% гентамицина (кат. № 30-005-СВ фирмы МеШа1ес11, Нет^щ VА) и 2 мМ Ь-глутамина (К-ц1и() (кат. № 17-605Е фирмы Вю\У1й1акег, \Уа1кегкй11е, МО). Этот состав назвали полной средой СНО.
Клетки СНО ΌΟ44 (5х106) трансфецировали 50 мкг ДНК плазмидны, несущей ЬиЭ86. Перед трансфекцией клетки извлекали из колб с трипсином (кат. № 15090-046 фирмы Ойто, Опий Шагй, ΝΥ) и промывали два раза средой α-МЕМ без добавок и без рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов (кат. № 12561 фирмы ОФто, Опий Шагй, ΝΥ). Ее назвали промывочной средой. Клетки смешивали с плазмидной ДНК в кюветах с расстоянием между электродами 0,4 см (кат. № 1652088 фирмы ВюКаб, Негси1ек, РА). Их ставили на лед на две минуты, а затем подавали разряд в 1000 мкФ и 260 вольт через прибор для электропорации фирмы ВюВай. После электропорации клетки инкубировали на льду две минуты. Затем клетки высеивали на пять 24-луночных планшетов (кат. № 3524 фирмы ΟοκΕπ) в полную среду СНО и держали в инкубаторе при 37°С, 5% СО2. Через 48 ч среду удаляли из лунок. Лунки промывали один раз промывочной средой и заполняли средой α-МЕМ без рибонуклеозидов и дезоксирибонуклеозидов (кат. № 12561 фирмы ОФто, Опий Шагй ΝΥ) с добавлением 1% гентамицина, 2 мМ Б-Дик 10% диализованной эмбриональной бычьей сыворотки (кат. № 26400-044 фирмы ОФто, Опий Ικ1πηά, ΝΥ) и 1,25 мг/мл генетицина (О418) (кат. № 11811 фирмы ОФто, Опий Шагй ΝΥ). Этот полный состав назвали селекционной средой. Клоны инкубировали в селекционной среде приблизительно две недели, после чего их подвергали скринингу на продукцию антител количественным методом ЕЫ8А. Затем наиболее продуктивные клоны субклонировали, размножали и замораживали клетки порциями для хранения.
Чтобы получить достаточное количество антител для очистки, клетки размножали на чашках диаметром 15 см (~1х 106 клеток на чашку) в 30 мл селективной среды с добавлением сыворотки с ультранизким содержанием Ι§Θ (и11га Б-ον Ι§Θ ЕВ8; ОФот) и инкубировали в течение 1 недели. Супернатанты культур собирали в конические пробирки на 250 мл, центрифугировали в настольной центрифуге (2000 об/мин, 5 мин, 4°С), а затем стерилизировали фильтрованием через фильтровальную установку с диаметром пор 0,2 мкм.
Для очистки Ό86 в профильтрованные супернатанты культур добавляли гранулы №1ОН до конечного рН 8,0. Колонку Н1Тгар ^Р^οίе^η А (АтегкЬат) с белком А уравновешивали в 20-50 колоночных объемах связывающего буфера. На колонку наносили супернатант с помощью перистальтического насоса. Затем колонку промывали 50 колоночными объемами связывающего буфера. Связавшиеся антитела элюировали из колонки с помощью элюирующего буфера (100 мМ уксусной кислоты, 50 мМ №С1, рН 3) в пробирки, стоящие в коллекторе фракций. Элюированные антитела нейтрализировали с помощью нейтрализирующего буфера (2 М К2НРО4, рН 10,0) и диализировали всю ночь в РВ8. Диализованные антитела фильтровали через шприц-фильтр с диаметром пор 0,2 мкм. Для определения конечной концентрации белка измеряли поглощение при 280 нм.
Аффинность очищенного ЬйдО сравнивали с тиО86 методом проточной цитометрии. В первой группе экспериментов непосредственно измеряли связывание с клетками экспрессирующей СА6 линии КВ. Как видно из фиг. 18, тиО86, сЮ86, 1πΌ86ν1.01 и Ьи^86ν1.21проявляют очень близкие аффинности с кажущимися значениями К,| 0,82 нМ, 0,69 нМ, 0,82 и 0,85 нМ, соответственно, свидетельствуя о том, что перестройка поверхности не повредила участки СОВ. Для проверки того, что варианты 1ιι.ιΌ86 сохраняют аффинность тиЭ86, проводили опыты по конкурентному связыванию. Преимущество этого
- 34 020130 формата состоит в том, что для антител мыши и антител человека используется одна и та же система детекции, то есть биотин-тиО86/стрептавидин-0ТАР. Результаты сравнения способности тиБ86. еЮ86. 1шБ86у1.01 и ЬиО86у1.21 к конкуренции с биотин-тиО86 методом конкурентного связывания представлены на фиг. 19. Кажущиеся значения ЕС50 равны 1,9 нМ, 1,7 нМ, 3,0 и 1,9 нМ для тиО86, сЮ86, 1шБ86у1.01 и ЬиО86у1.21, соответственно. Эти результаты свидетельствуют о том, что перестройка поверхности тиБ86 для получения гуманизованного Б86 почти не вызывает уменьшения аффинности связывания.
Пример 14. Получение цитотоксического конъюгата тиО86-ОМ1
Антитело тиБ86 (8 мг/мл) подвергали модификации при 8-кратном молярном избытке N сукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)пентаноата (8РР) для введения дитиопиридильных групп. Реакцию проводили в смеси из 95% буфера А (50 мМ КР1, 50 мМ №С1, 2 мМ ЭДТА, рН 6,5) и 5% БМЛ в течение 2 ч при комнатной температуре. Слегка мутную реакционную смесь подвергали гель-фильтрации через колонку с NΑР или 8ерйа4ех 625 (уравновешенную в буфере А). Степень модификации определяли путем измерения поглощения антител при 280 нм и выделения 2-меркаптопиридина (8ру) под действием БТТ при 280 и 343 нм. Затем модифицированные тиБ86 подвергали конъюгированию при 2,5 мг антител/мл и 1,7-кратном молярном избытке ^-деацетил-Н2'-(3-меркапто-1-оксопропил)майтансина (Ь-ОМ1) относительно 8ру. Реакцию проводили в смеси из буфера А (97%) и БМЛ (3%). Реакцию инкубировали при комнатной температуре в течение ночи ~20 ч. Мутную реакционную смесь центрифугировали (1162хд, 10 мин), а супернатант подвергали гель-фильтрации через колонки с NΑР-25 или 8300 (3 колонки для обессоливания подряд, 3x26/10, 625 среднего размера), уравновешенные в буфере В (IX РВ8, рН 6,5). Осадок отбрасывали. Конъюгат стерилизировали фильтрованием через фильтр 0,2 мкм МШех-6У и диализировали в буфере В на установке 8114е-А-Еухег. Число молекул БМ1, соединенных с молекулой 1111.1086, определяли измерением поглощения профильтрованного материала при 252 нм и 280 нм. Соотношение ОМ1/АЬ оказалось равным 4,36, а выход на стадии конъюгирования тиО86 составил 55%. Концентрация конъюгированного антитела составила 1,32 мг/мл. Очищенный конъюгат подвергали биохимическому исследованию методом эксклюзионной хроматографии (8ЕС), при этом оказалось, что он на 92% состоит из мономера. Анализ БМ1 в очищенном конъюгате показал, что 99% его ковалентно связано с антителом. На фиг. 20 анализ связывания конъюгата тиО86-ОМ1 и немодифицированного тиО86 с клетками Саоу-3 методом проточной цитометрии показал, что конъюгирование тиО86 приводит лишь к незначительному снижению аффинности.
Пример 15. Цитотоксичность тиО86-0М1 ίη уйго
В виде голого антитела тиО86 не проявляло ингибирующего действия на пролиферацию или рост клеточных культур (фиг. 21). Однако при инкубации тиО86 с клетками в присутствии конъюгата БМ1 с козьим антителом против тяжелой и легкой цепи Ц6 мыши оно оказалось очень эффективным в наводке этого конъюгата и доставке его к клеткам, что приводило к косвенной цитотоксичности (фиг. 21). Для дальнейшей проверки присущей голому тиО86 активности проводили определение комплемент-зависимой цитотоксичности (СБС) с использованием тиО86. Клетки НРАС и ΖΒ-75-1 (25 000 клеток на лунку) высеивали на 96-луночные планшеты в присутствии 5% сыворотки человека или кролика и различных разведений тиО86 в 200 мкл среды КНВР (КРМЫ640, 0,1% В8А, 20 мМ НЕРЕ8 рН 7,2-7,4, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина). Клетки инкубировали 2 ч при 37°С. Затем в супернатант добавляли реагент А1атаг В1ие (10% от конечной концентрации) (ВЧозоигсе). Клетки инкубировали 5-24 ч, а затем измеряли флуоресценцию. Ό86 мыши не оказывало влияния на определение комплемент-зависимой цитотоксичности (СБС) (фиг. 22). Это свидетельствует о том, что терапевтическое применение тиО86 потребует конъюгирования с токсической эффекторной молекулой.
Цитотоксичность конъюгированного с майтансиноидом антитела тиО86 изучали в 2-х разных форматах на различных 086-положительных линиях клеток. Проводили определение клоногенным методом, в котором клетки (1000-2500 клеток на лунку) высеивали на 6-луночные планшеты в 2 мл конъюгата, разведенного культуральной средой. Клетки подвергались непрерывному воздействию конъюгата при нескольких концентрациях, обычно от 3х10-11 М до 3х10-9 М, при инкубации в увлажнительной камере при 37°С и 6% С02 на протяжении 5-9 дней. Лунки отмывали РВ8 и окрашивали колонии раствором 1% хрустального фиолетового/10% формальдегида/РВ8. Несвязавшийся краситель затем тщательно смывали из лунок дистиллированной водой, а планшеты оставляли сушиться. Колонии просчитывали с помощью анатомического микроскопа ЬеЧса 8ιе^еоΖоот 4.
Эффективность посева (РЕ) определяли как число колоний, деленное на число посеянных клеток. Выживаемость рассчитывали как РЕ обработанных клеток, деленное на РЕ необработанных клеток. Концентрации Ι^0 определяли из графика выживаемости клеток в зависимости от молярной концентрации конъюгата. При определении клоногенным методом (фиг. 23) тиО86-ОМ1 эффективно вызывал гибель клеток Саоу-3 со значением Ι6?50 в 800 пМ. Антиген-отрицательные клетки А375 испытывали лишь незначительное влияние конъюгата при концентрации 3х10-9 М, то есть при самой высокой концентрации тиО86-ОМ1, свидетельствуя о том, что вызывающая гибель клеток активность конъюгата направлена именно на клетки, экспрессирующие антиген. Однако, несмотря на видимую чувствительность к майтан
- 35 020130 сину, многие другие 086-положительные линии клеток оказались не особенно чувствительными к иммуноконъюгату. Все линии клеток шейки матки (НеЬа, КВ и \У18Н) оказались чувствительными к конъюгату, тогда как лишь ограниченное число линий клеток яичников и молочной железы проявляли какиелибо признаки цитотоксичности. Не была задета ни одна из линий клеток поджелудочной железы.
При определении методом МТТ клетки высеивали на 96-луночные планшеты при плотности 10005000 клеток на лунку. Клетки сеяли вместе с серийными разведениями голого тиО86 или иммуноконъюгата ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 в 200 мкл культуральной среды. Образцы составляли в трех повторах. Смеси клеток с антителом/конъюгатом затем инкубировали в течение 2-7 дней, после чего оценивали жизнеспособность клеток с помощью МТТ ([3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромид]). МТТ (50 мкг на лунку) вносили в супернатанты культур и оставляли инкубироваться на 3-4 ч при 37°С. Среду удаляли, а формазан МТТ солюбилизировали в О1Л8О (175 мкл на лунку). Измеряли поглощение при 540-545 нм. При определении жизнеспособности клеток методом МТТ (фиг. 24С) иммуноконъюгат эффективно вызывал гибель клеток Саον-3 со значением 1С50 в 1,61 нМ. Лунки с наиболее высокими концентрациями конъюгата не содержали жизнеспособных клеток в отличие от голого антитела, которое не оказывало никакого эффекта (фиг. 21 и фиг. 24).
Результаты опытов методом МТТ на других линиях клеток слегка различались (фиг. 24А, В и Ό-Ι). Во многих случаях, хотя и наблюдалась некоторая цитотоксичность, однако конъюгат не смог вызвать полную гибель всей популяции клеток (за исключением клеток \У18Н). Особенно устойчивыми оказались клетки ВТ-20, ОУСАК5 и НРАС: в лунках с самой высокой концентрацией конъюгата (32 нМ) свыше 50% клеток все еще были жизнеспособными.
Пример 16. Противоопухолевая активность конъюгата ш νί\Ό
Чтобы продемонстрировать активность конъюгата ти^86-^Μ1 т νί\Ό, мышам 8СГО прививали ксенотрансплантаты опухолей человека. Была разработана подкожная модель клеточной линии КВ карциномы шейки матки человека. Клетки КВ культивировали ш νίΙΐΌ, собирали и вводили 5х106 клеток в 100 мкл лишенной сыворотки среды под правое плечо каждой мыши и оставляли расти в течение 6 дней до среднего объема опухоли в 144 ± 125 мм3, после чего начинали применять препарат. Мышам вводили либо РВ8, либо конъюгат при 150 мкг/кг ΌΜ1 или конъюгат при 225 мкг/кг ΌΜ1 (по 2 мыши на группу) внутривенно каждый день на протяжении 5 дней. Ежедневно отслеживали токсические реакции за время обработки. Отмечали объем опухоли (фиг. 25А) и соответствующий вес тела (фиг. 25В) на всем протяжении исследования.
У контролей, получавших РВ8, опухоли КВ росли быстро со временем удвоения около 4 дней. Напротив, обе группы мышей, получавших конъюгат, проявляли полную регрессию опухолей через 14 дней и 18 дней после начала обработки по группам с дозами в 150 мкг/кг, соответственно. При дозе в 150 мкг/кг отсрочка опухоли составила примерно 70 дней. Обработка при 225 мкг/кг приводила к излечению, поскольку не было признаков рецидива опухолей по завершении исследования на 120-й день. Как видно из фиг. 25В, мыши в группе 150 мкг/кг не проявляли потери веса, что свидетельствует о хорошей переносимости этой дозы. При самой высокой дозе мыши испытывали лишь временное снижение веса тела на 3%. За время 5-дневной обработки мыши не проявляли видимых признаков токсичности. В целом это исследование показывает, что при применении ти^86-^Μ1 возможно излечение мышей от привитых опухолей КВ при нетоксической дозе.
Активность ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 также тестировали на нескольких моделях привитых подкожно ксенотрансплантатов (см. фиг. 26). Раковые линии клеток, использовавшиеся для прививки ксенотрансплантатов, проявляли различную чувствительность к майтансину ш νίΙΐΌ и плотность эпитопа СА6 (приведенная ниже табл. 9). Клетки ОУСАК5 и ТОУ-21С являются клеточными линиями рака яичников, НРАС является клеточной линией рака поджелудочной железы, НеЬа является клеточной линией рака шейки матки. Клетки ОУСАК5 и ТОУ-21С проявляли слабую экспрессию СА6, клетки НеЬа проявляли промежуточный уровень экспрессии СА6, а клетки НРАС проявляли экспрессию СА6 с высокой плотностью на поверхности. Клетки ТОУ-21С и НРАС чувствительны к майтансину, а клетки ОУСАК5 и НеЬа в 2,7 раза менее чувствительны.
- 36 020130
Таблица 9
Клеточная линия ΜΜΕ* Кажущееся КДМ) Клоногенный метод, 1С50 (Μ) майтансина Клоногенный метод, 1С5о (М) конъюгата Метод МТТ, ЕС50 (М) конъюгата
ВТ-20 232,20 9,14* 10-1° 3,50*10'° >3,00*10’°9
ВТ-483 1911,00 1,37*10’°8 1,50*10'° 1,00*10’*° -
С’аоу-3 465,20 5,48*10™у 3,20*10’ 8,00*10'° ι,6ΐ*ϊδ™3“”
Саоу-4 149,00 4,04*10’1 6,00*10’*° >3,00х10’°у -
НеЬа 242,50 6,94*10 10 1,00x10’*° 1,80*10’°° -
НРАС 2228,00 2,35*10 щ 5,50*10 11 1,80x10’°° 1,84*10’°°
НРАГ-П 266,50 .....2,8?хКГ°9 6,00*10-1° >3,00*10™° 1,00*10™“
Нз766Т 182,90 2,32* ΪΟ™9 >3,00*10™° >3,00х10-°у >3,20*10°“
кв 119,56 1,11*10’'° 3,00x10’ 1,40*10°° 3,01*10’°°
ОУСАК5 97,10 1,47*10’°° 3,20*10’’*° >3,00*10°° 8,46* 10™7
Τ-47ϋ 559,58 3,42*10’°° 1,20*10’*'° >3,00*10°° -
ТОУ-21О 87,79 3,07* 104°- 4,80*10’** 2,00* 10™3 6,88*10™°
АТ8Н 1133,55 2,38x1ο-09 9,00*10’11 4,60*10’*° 6,69* 10’*°
ΖΚ-75-1 811,67 4,30*10’°° 1,00x10’*° - 9,45*10’*°
*среднее значение максимальной относительной флуоресценции
Клетки этих 4-х линий культивировали ίη νίΐτο, собирали и вводили 1 х 107 клеток в 100 мкл лишенной сыворотки среды под правое плечо каждой мыши (по 6 мышей на модель) и оставляли расти в течение 6 дней до среднего объема опухоли в 57,6 ± 6,7 и 90,2 ± 13,4 мм3 для опытной и контрольной группы ОУСЛ^, соответственно, 147,1 ± 29,6 и 176,2 ± 18,9 мм3 для опытной и контрольной группы НРЛС, соответственно, 194,3 ± 37,2 и 201,7 ±71,7 мм3 для опытной и контрольной группы НеЬа, соответственно, и 96,6 ± 22,8 и 155,6 ± 13,4 мм3 для опытной и контрольной группы ТОУ-21С, соответственно, после чего начинали применять препарат. По каждой модели трем контрольным мышам вводили две еженедельные дозы РВ8 и трем опытным мышам вводили две еженедельные дозы конъюгата (600 мкг/кг ΌΜ1) внутривенно. Ежедневно отслеживали токсические реакции за время обработки и отмечали объем опухоли и вес тела на всем протяжении исследования. Эффективность конъюгата на различных моделях представлена на графике на фиг. 26А, С, Е и С, а соответствующий вес тела представлен на фиг. 26В, Ό, Р и Н. Клетки линий ОУСАЮ, ТОУ-21С и НРЛС образуют агрессивные опухоли, как видно у контролей РВ8 для каждой модели. На модели НеЬа наблюдался лаг-период около 3 недель перед началом экспоненциального роста. На всех моделях применение конъюгата Ό86-ΌΜ1 приводило к полной регрессии опухолей у всех мышей. На моделях ТОУ-21С, НРЛС и НеЬа мыши оставались свободными от опухолей через 61 день. На модели ОУСЛЕ5 происходил рецидив примерно через 45 дней после прививки опухоли. Таким образом, применение ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 на этой модели приводит к задержке роста опухоли приблизительно на 34 дня. Эта задержка роста существенна, так как клетки ОУСЛЕ5 менее чувствительны к майтансину и проявляют слабую экспрессию эпитопа СА6. На тех моделях, у которых более высокая плотность эпитопа СА6 либо большая чувствительность к майтансину, регрессия опухолей выражена сильнее. Нужно отметить, что вводили только 2 дозы. Ясно, что применявшаяся в этом исследовании схема дозировки не была токсичной для мышей, так как не наблюдалось снижения веса. Вероятно, можно было бы добиться излечения при дополнительных или более высоких дозах конъюгата.
Рак яичников у человека в большой степени является заболеванием брюшины. Клетки ОУСЛЮ растут агрессивно в качестве внутрибрюшинной (ВБ) модели у мышей 8СГО, образуя опухолевые узлы и асциты подобно заболеванию у человека. Чтобы продемонстрировать активность конъюгата на ВБ модели, ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 вводили мышам, несущим ВБ опухоли ОУСЛ^З (фиг. 27). Клетки ОУСЛ^З культивировали ίη νίΐτο, собирали и вводили 1х 107 клеток внутрибрюшинно. Опухоли оставляли расти в течение 6 дней, после чего начинали применять препарат. Мышам вводили раз в неделю на протяжении 2 недель либо РВ8, либо конъюгат Ό86-ΌΜ1 в дозе 600 мкг/кг ΌΜ1 и отмечали снижение веса в результате заболевания брюшины. Через 28 дней мыши в группе РВ8 потеряли более 20% веса тела и их подвергали эвтаназии. Животных в опытной группе забивали через 45 дней, после снижения веса тела более чем на 20%. Это исследование показывает, что ιηι.ιΟ86-ΟΜ1 способен задержать развитие опухолей на агрессивной ВБ модели ОУСЛ^З несмотря на то, что клетки ОУСЛ^З менее чувствительны к майтансину и содержат мало эпитопов СА6 на одну клетку. Поскольку применявшаяся схема дозировки не вызывала видимых признаков токсичности, то весьма вероятно, что при дополнительных и более высоких дозах можно было бы добиться еще большей задержки развития опухолей или излечения.
Пример 17. Синтез и характеристика цитотоксического конъюгата Э86-8РР-таксоид ММ1-202
Антитело пшЭ86 подвергали модификации с линкером из Ы-сульфосукцинимидил-4-нитро-2пиридил-пентаноата (88№Р). К 50 мг тиЭ86 в смеси из 90% буфера А и 10% ЭИЛ добавляли 10 эквивалентов 88№Р в ЭИЛ. Конечная концентрация антител составляла 8 мг/мл. Реакционную смесь пере
- 37 020130 мешивали в течение 4 ч при комнатной температуре, а затем подвергали очистке хроматографией на С25. Степень модификации антител определяли спектрофотометрически по поглощению при 280 нм (антитело) и 325 нм (линкер), и она составила 3,82 линкера на антитело. Выход антител составил 43,3 мг, что равно 87%. Конъюгат тнО86-нитро 8РР подвергали конъюгированию с таксоидом ММ1-202 (1812 Р.16). Конъюгированию подвергали 42 мг в смеси из 90% буфера А и 10% ОМА. Таксоид вносили 4 порциями по 0,43 экв./линкер на протяжении около 20 ч. К этому времени реакционная смесь стала заметно мутной. После очистки на С25 полученный с выходом 64% конъюгат содержал 4,3 таксоида/антитело, и еще оставался примерно 1 эквивалент непрореагировавшего линкера. Чтобы израсходовать оставшийся линкер, к конъюгату добавляли 1 эквивалент цистеина и перемешивали в течение ночи. После добавления цистеина появлялся заметный желтоватый оттенок, означающий выделение тиопиридина. Реакционную смесь затем диализировали в буфере В с 0,01% Т\\ееп 20, после чего дополнительно диализировали в одном лишь буфере В в течение нескольких дней. Конечный конъюгат содержал 2,86 молекул/антитело. Выход антител составил 14,7 мг, что в целом равно 35%. При дальнейшем биохимическом исследовании конъюгата методом эксклюзионной хроматографии оказалось, что он содержит 89% мономера, 10,5% димера и 0,5% высокомолекулярных агрегатов.
Результаты анализа связывания конъюгата тиО86-8РР-таксоид ММ1-202 в сравнении с антителом тиО86 на клетках НеЬа методом проточной цитометрии представлены на фиг. 28. Результаты свидетельствуют о том, что тиО86 сохраняет связывающую активность при конъюгировании с таксаном.
Пример 18. Активность конъюгата гуманизованного Ό86 ш νίΙΐΌ и ш νί\Ό
Конструировали конъюгат 1шО86у1.01-8РОВ-ЭМ4. Этот конъюгат аналогичен описанному в примере 14 конъюгату тиО86-8РР-ОМ1 за исключением того, что у него компонент линкер/майтансин отличается по структуре в районе дисульфидной связи: конъюгат тиО86-8РР-ОМ1 содержит стерическое препятствие в виде одной метильной группы на несущем дисульфид углероде линкера со стороны антитела, тогда как конъюгат 8РЭВ-ЭМ4 содержит стерическое препятствие в виде двух метальных групп на несущем дисульфид углероде линкера со стороны майтансина.
Антитело 1шЭ86у1.01 (8 мг/мл) подвергали модификации при 8-кратном молярном избытке Мсукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноата (8РЭВ) для введения дитиопиридильных групп. Реакцию проводили в смеси из 95% буфера А (50 мМ КР1, 50 мМ №С1, 2 мМ ЭДТА, рН 6,5) и 5% этанола в течение 1,5 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергали гель-фильтрации через колонку с 15 мл 8ерйабех С25 (уравновешенную в буфере А). Степень модификации определяли путем измерения поглощения антител при 280 нм и выделения 2-меркаптопиридина (8ру) под действием ΌΤΤ при 280 и 343 нм. Затем модифицированные тиЭ86 подвергали конъюгированию при 2,5 мг антител/мл и 1,7кратном молярном избытке ^-деацетил-Н2-(4-метил-4-меркапто-1-оксопентил)майтансина (Ь-ЭМ4) относительно 8ру. Реакцию проводили в смеси из буфера А (97%) и ОМА (3%). Реакцию инкубировали при комнатной температуре в течение ночи ~20 ч. В отличие от конъюгирования тиО86, реакционная смесь была прозрачной и ее сразу же подвергали гель-фильтрации через колонку с 15 мл NАР С25, уравновешенную в цитратном буфере (20 мМ цитрат, 135 мМ №С1, рН 5,5). Конъюгат стерилизировали фильтрованием через фильтр 0,22 мкм МШех-СУ. Число молекул ЭМ4, соединенных с молекулой Ό86, определяли измерением поглощения профильтрованного материала при 252 нм и 280 нм. Соотношение ЭМ4/АЬ оказалось равным 3,2, а выход на стадии конъюгирования Ό86 составил 69%. Концентрация конъюгированного антитела составила 1,51 мг/мл. Очищенный конъюгат подвергали биохимическому исследованию методом эксклюзионной хроматографии (8ЕС), при этом оказалось, что он на 92% состоит из мономера. Анализ ЭМ4 в очищенном конъюгате показал, что >99% его ковалентно связано с антителом.
На фиг. 29А анализ связывания конъюгата 1шО86у1.01-ЭМ4 и немодифицированного Ό86 с клетками КВ методом проточной цитометрии показал, что конъюгирование НнЭ86у1.01 практически не вызывает снижения аффинности. Опыты по связыванию проводили в основном, как описано для фиг. 20, за исключением того, что использовали клетки КВ, а не клетки Саον-3. Цитотоксичность 1шО86у1.01-ЭМ4 1п νίΙΐΌ тестировали в основном, как описано для фиг. 24С. Конъюгат 1шЭ86у1.01 вызывал гибель клеток νίδΗ со значением 1С50 в 4,4х10-10 М, тогда как неконъюгированное антитело НнЭ86у1.01 не проявляло цитотоксической активности.
Активность 1шО86у1.01ЭМ4 ш νί\Ό тестировали на поджелудочной модели НРАС. Клетки НРАС инокулировали в день 0, а иммуноконъюгат вводили на 13-й день. Получавших РВ8 контрольных животных подвергали эвтаназии при превышении объема опухоли в 1000 мм3. Конъюгат вводили в дозе 200 мкг/кг или 600 мкг/кг ЭМ4, что соответствует концентрации антител в 15 и 45 мг/кг соответственно. Отмечали объем опухолей (фиг. 30А) и вес тела (фиг. 30В) мышей на протяжении исследования. Конъюгат 1шО86у1.01-ОМ4 проявлял сильную противоопухолевую активность при 200 мкг/кг ЭМ4 на всех мышах, достигая полной регрессии опухолей. Контрольный конъюгат В4-ЭМ4, распознающий антиген, который не экспрессируется на ксенотрансплантатах НРАС, практически не обладал активностью при 200 мкг/кг. Отсутствие потери веса тела (фиг. 30В) у мышей свидетельствует, что доза конъюгата в 200 мкг/кг находится ниже максимальной допустимой дозы. Этот результат показывает, что гуманизованный вариант
- 38 020130
Ό86 способен опосредовать направленную доставку препарата типа майтансиноида, что приводит к сильной противоопухолевой активности.
Перечень последовательностей <110> ИММЬЮНОДЖЕН, инк.
ПАЙН, Джиллиан
ЧАН, Филип
ТАВАРЕС, Дэниэл <120> СПЕЦИФИЧНОЕ К АНТИГЕНУ СА6 АНТИТЕЛО, СОДЕРЖАЩИЙ ЕГО ЦИТОТОКСИЧЕСКИЙ КОНЪЮГАТ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ КОНЪЮГАТА <130> А8621 <150> 60/488,447 <151> 2003-07-21 <160> 63 <170> Ра(еп11п уегзюп 3.3 <210> 1 <211> 5 <212> ПРТ <213> Миз тизсЫиз <400> 1
8ег Туг Азп Ме11Пз
5 <210> 2 <211> 17 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 2
Туг Не Туг Рго С1у Азп О1у А1а ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе Ьуз
10 15
О1у <210> 3 <211> 8 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 3
- 39 020130
61у Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг
5 <210> 4 <211> 10 <212> ПРТ <213> МизтизсиЬз <400> 4
Зег А1а ΗΪ3 8ег 8ег Уа1 8ег РЬе Мег Ηίβ
5 10 <210> 5 <211> 7 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 5
8ег ТЬг 8ег Зег Ьеи А1а 8ег
5 <210> 6 <211> 9 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 6
О1п О1п Агд 8ег 8ег РЬе Рго Беи ТЬг
5 <210> 7 <211> 321 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <220>
<221> экзон <222> (1)..(321) <400> 7 саа ай дй с!с асе сад ιοί сса дса а(с а1д 1с( дса 1с1 сса ддд 48 СИп Пе Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а Не Ме1 Зег А1а Зег Рго О1у 15 10 15
- 40 020130 дад аад дСс асе а!а асе Сде ад! дес сас !са ад! дСа ад! йс а!д 96 СНи Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз 8ег А1а Нез Зег 8ег Уа1 8ег РЬе Ме! 20 2530 сас (дд йс сад сад аад сса ддс ас! Сс! ссс ааа с!с !дд ай !а!144
ΗΪ8 Тгр РЬе С1п С1п Ьуз Рго <Э1у ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045 аде аса !сс аде с!д де! !с! дда д!с ее! де! еде йс дд! ддс ад! 192
8ег ТЬг 8ег 8ег Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе О1у СНу Зег 50 5560 дда !с! ддд асе !с! сас 1сС сГс аса а!с аде еда а!д дад дс! даа 240 СНу 8ег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме! СНи А1а СНи 65 70 7580 да! де! дсс асС !а! Сас !дс сад саа адд адС адС йс сед сСс асд 288 Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз 61 η СИп Агд Зег Зег РЬе Рго Ьеи ТЬг 85 9095 йс ддС дсС ддд асе аад сед дад сед ааа сде321
РЬе 61у А1а СНу ТЬг Ьуз Ьеи СНи Ьеи Ьуз Агд
100105 <210> 8 <211> 321 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> гуманизированная последовательность мышиного антитела <220>
<221> экзон <222> (1)..(321) <400> 8 дад ай дй сСс асе сад Сс! сса дса асе а!д !с! дса СсС сса ддд 48 СНи Не Уа1 Ьеи ТЬг О1п Зег Рго А1а ТЬг МеС Зег А1а Зег Рго О1у 15 1015 дад адд дСс асе аСа асе !дс ад! дсс сас !са ад! дСа ад! Йс аСд 96 О1и Агд Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Н1з Зег Зег Уа1 Зег РЬе МеС
2530 сас Сдд !!с сад сад аад сса ддс ас! !с! ссс ааа с!с !дд ай !а!144
Из Тгр РЬе С1п СИп Ьуз Рго СНу ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045 аде аса Ссс аде сСд дсС Сс! дда дСс сс! дсС сдс йс дд! ддс адС192
- 41 020130
Зег ТЬг Зег Зег Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе О1у О1у Зег 50 5560 ё§а (с( ддд ΐεΐ (ас (с( с(с аса а(с аде аде а(д дад дс( даа 240 О1у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Ме( О1и А1а О1и 65 70 7580 да( дс( дсс ас( (а( (ас (дс сад саа адд ад( ад( Кс ссд с(с асд 288 Акр А1а А1а ТЬг Туг Туг Сук <31п О1п Агд Зег Зег РЬе Рго Ьеи ТЬг 85 9095 пс дд( дс( ддд асе аад с(д дад с(д ааа сд(321
РЬе О1у А1а О1у ТЬг Ьук Ьеи О1и Ьеи Ьук Агд
100105 <210> 9 <211> 351 <212> ПРТ <213> Миктикси1ик <220>
<221> экзон <222> (1)..(351) <400> 9 сад дс( Ха( с(с сад сад (с( ддд дс( дад с(д д(д адд (с( ддд дсс 48 <31п А1а Туг Ьеи О1п СИп Зег О1у А1а (Ли Ьеи Уа1 Агд Зег О1у А1а 15 1015 (са д(д аад а(д (сс (дс аад дс( (с( ддс (ас аса (((асе ад( (ас 96 Зег Уа1 Ьук Ме( Зег Сук Ьук А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530 аа( а(д сас (дд д(а аад сад аса сс( дда сад ддс с(д даа (дд ай 144 Акп Ме( Ηΐκ Тгр Уа1 Ьук О1п ТЬг Рго О1у О1п <31у Ьеи О1и Тгр Пе 35 4045 дда (а( ай (а( сс( дда аа( дд( дс( ас( аас (ас аа( сад аад По 192 С1у Туг Пе Туг Рго <31 у Акп О1у А1а ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе
5560 аад ддс аад дсс аса йд ас( дса дас сса (сс (сс аде аса дсс (ас 240 Ьуз СИу Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Рго Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580 а(д сад а(с аде аде с(д аса (с( даа дас (с( дед д(с (а( Нс (д(288
Ме( 61п Пе Зег Зег Ьеи ТЬг Зег <31и Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095 дса ада дда да( (сд д(с ссд Ш дс( (ас (дд ддс саа ддд ас( ей 336
- 42 020130
А1а Агд СИу Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг Тгр О1у СИп СИу ТЬг Ьеи 100 105 110 д!с ас! βίο !с! дса 351
Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115 <210> 10 <211> 351 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> гуманизированная последовательность мышиного антитела <220>
<221> экзон <222> (1)..(351) <400> 10 сад дс! сад с(с д!д сад Гс1 ддд дс! дад д!д д!д аад ссс ддд дсс 48 О1п А1а СИп Ьеи Уа1 СИп Зег СИу А1а СИи Уа! Уа1 Ьуз Рго СИу А1а 15 1015 (са д(д аад а!д тсс !дс аад дс( (а ддс 1ас аса й! асе ад! (ас 96 Зег Уа1 Ьуз Мег Зег Суз Ьуз А1а Зег СИу Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг
2530 аа( а!д сае !дд д1а аад сад аса сс! дда сад ддс с!д даа !дд ай 144 Азп Ме! Н13 Тгр Уа1 Ьуз О1п ТЬг Рго СИу СИп СИу Ьеи О1и Тгр Не
4045 дда !а! ай !а! ее! дда аа! дд! дс! ас! аас !ас аа! сад аад йс 192
СИу Туг Не Туг Рго СИу Азп О1у А1а ТЬг Азп Туг Азп СИп Ьуз РЬе
5560 сад ддс аад дсс аса йд ас! дса дас аса !сс !сс аде аса дсс !ас 240 СИп О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580 а!д сад а!с аде аде с!д аса 1с1 даа дас Тс! дед д!с (а! йс !д!288
Ме! СИп Не Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз
9095 дса ада дда да! !сд д!с ссд И! дс! !ас (дд ддс саа ддд ас! ей 336 А1а Агд СИу Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг Тгр СИу СИп СИу ТЬг Ьеи 100 105110 д(с ас! д!с Те! дсс3 51
Уа1ТЬгУа1 Зег А1а
- 43 020130
115 <210> 11 <211> 351 <212> ПРТ <213> Искусственная последовательность <220>
<223> гуманизированная последовательность мышиного антитела <220>
<221> экзон <222> (1)-.(351) <400> 11 са§ §с! сад с!с д!д сад (с! ддд де! дад £(ё аад ссс ёёё ё<^
О1п А1а О1п Ьеи Уа1 <Э1п Зег О1у А1а СИи Уа1 Уа1 Ьуз Рго О1у А1а 15 1015 (са д!д аад а!д !сс !дс аад дс! !с! ддс !ас аса й! асс а# !ас 96 Зег Уа1 Ьуз Ме! Зег Суз Ьуз А1а 8ег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг
2530 аа! а!д сас !дд д(а аад сад аса сс! дда сад ддс с!д 8аа !дд ай 144 Азп Ме! Шз Тгр Уа1 Ьуз СИп ТЬг Рго Сг1у О1п О1у Ьеи СИи Тгр Не
4045 ада !а( ай !а! сс! £§а аа! дд! дс! ас! аас (ас аа! сад аад Ес 192
О1у Туг Не Туг Рго СИу Азп С1у А1а ТЬг Азп Туг Азп С1п Ьуз РЬе 50 5560 сад ддс аад дсс аса йд ас! дса дас сса !сс !сс аде аса дсс !ас 240 О1п О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Рго Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580 а!д сад а!с аде аде с!д аса !с! даа дас !с! дед д!с !а! йс !д!288
Ме! О1п Не Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095 дса ада дда да! !сд д!с сед !й дс! 1ас (дд ддс саа ддд ас! ей 336
А1а Агд О1у Азр Зег Уа1 Рго РЬе А1а Туг Тгр О1у СНп О1у ТЬг Ьеи 100 105110 д!с ас! д(с !с! дсс351
Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115 <210> 12 <211> 15
- 44 020130 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <4О0> 12
01п Уа1 ТЬг А1а Не Рго Ьуз Рго О1у С1у А1а Зег Агд О1и Ьуз 15 10 15 <210> 13 <211> 15 <212> ПРТ <213> Нотозар1епз <400> 13
О1и Уа1 ТЬг А1а ТЬг Рго Агд Рго О1у О1у А1а Зег Зег СНи Ьуз 15 10 15 <210> 14 <211> 15 <212> ПРТ <213> Нотозар1епз <400> 14
О1и Уа1 ТЬг СНу ТЬг Рго Агд Рго О1у СНу Азр Зег Агд О1и Ьуз 15 10 15 <210> 15 <211> 15 <212> ПРТ <213> Нотозар1епз <400> 15
СНи Уа1 ТЬг СНу ТЬг Рго Агд Рго СНу О1у Азр Зег Агд О1и Ьуз
10 15 <210 16 <211> 23 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400 16
61п Туг СНп А1а Ьеи Агд Зег Ьуз Ьуз Рго СНу С1п О1п Ьуз Ьуз СНу
10 15
- 45 020130
Рго Зег Зег Зег СИи О1п Зег <210> 17 <211> 23 <212> ПРТ <213> Ното зар^епз <400> 17
О1п СИп Уа1 А1а Уа1 Ьуз Рго Ьуз Ьуз Рго СИу 01η СИп Ьуз О1п О1у
10 15
ТЬг Зег Зег 8ег О1и СИп Зег <210> 18 <211> 22 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 18
О1п Уа1 А1а Уа1 Ьуз Рго Ьуз Ьуз Рго СИу О1п О1п Ьуз СИп О1у О1и 15 10 15
Зег Зег Зег 61и С1п Зег <210> 19 <211> 22 <212> ПРТ <213> Ното зар1епз <400> 19
О1п Уа1 А1а Уа1 Ьуз Рго Ьуз Ьуз Рго О1у СИп О1п Ьуз СЬ СИу СИи 15 10 15
Зег Зег Зег О1и СИп Зег <210> 20 <211> 10
- 46 020130 <212>
<213>
ПРТ
Миз шизси1из <400>
С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг 8ег Туг Азп Ме1 ΗΪ3 I 5 10 <210> 21 <211> 10 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 21
Туг Не Туг Рго СИу Азп С1у А1а ТЬг Азп
5 10 <210> 22 <211> 8 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 22
СИу Азр 8ег Уа1 Рго РЬе А1а Туг
5 <210> 23 <211> 95 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 23
О1п Не Уа1 Ьеи ТЬг О1п 8ег Рго А1а Не Ме18ег А1а Зег Рго О1у
1015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг МеС 20 2530
ΗΪ3 Тгр РЬе СИп О1п Ьуз Рго СИу ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СИу Уа1 Рго А1а Аге РЬе Зег СИу 8ег 50 5560
- 47 020130
01у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме!СИ и А1а О1и 65 70 75 80
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп СИп Агд Зег Зег Туг Рго Рго
90 95 <210> 24 <211> 98 <212> ПРТПРТ <213> Миз тизси1из <400> 24
СНп А1а Туг Ьеи Щп О1п Зег С1у А1а О1и Ьеи Уа1 Агд Зег О1у А1а
1015
Зег Уа1 Ьуз Ме! Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530
Азп Ме! Шз Тгр Уа1 Ьуз С1п ТЬг Рго О1у СНп О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045
О1у Туг Не Туг Рго О1у Азп О1у СИ у ТЬг Азп Туг Азп СИп Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр ТЪг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме! СНп Не Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095
А1а Агд <210> 25 <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер
- 48 020130 <400> 25
1а(ададс1с аадсйдда! дд!дддаа§а 1дда!асад! (дд!дс 46 <210> 26 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 26 ддаддаСсса (адасадаСд дддд(д(сд1 ПСддс 36 <210> 27 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР праймер <400> 27 дддадсСсда уайдСдпйз астсапусйп са 32 <210> 28 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР праймер <220 <221> пнкс ГеаШге <222> (18)..(18) <223> η это а, с, д, или I <400 28 сйссддааС СсвагдСпта дсСдзадаад 1с 32 <210> 29 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 49 020130 <220>
<223> ПЦР праймер <220>
<221> гшзс ЕеаШге <222> (18)..(18) <223> η это а, с, или I <400> 29 сИссддаа! юзагдшта дс^задзад 35 <210> 30 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вырожденный праймер <400> 30
Ш1§ааПс аа1аас(аса §£1£1ссас( 30 <210> 31 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Вырожденный праймер <400> 31
ПП£адс1с садайПса дсПсс1дс1 30 <210> 32 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 32 сда1§§дссс с(§сада§ас а§1дасса§а 40 <210> 33 <211> 28 <212> ДНК
- 50 020130 <213> Искусственная последовательность <220 <223> ПЦР праймер <400 33
ППсдсасд Гйсадс1сс а§сид§1 28 <210> 34 <211> 35 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400 34 садд1д1аса с(сссаадс( (а(с1сса§с а§1с1 35 <210 35 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 > ПЦР праймер <400 35 сда1д§дссс Пддхддадд сддсададас ад1§асса§а 40 <210> 36 <211> 56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 36 са§д>д1аса с(ссдадай дНс1сассс ад(с(ссадс аасса(д1с1 дсаш 56 <210> 37 <211> 36 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер
- 51 020130 <400> 37 §£сас1£са£ £1(а1££12а сссШсссс (§£ада 36 <210> 38 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 38 саа1са§са§ са1й£ае§с1 даада 25 <210> 39 <211> 24 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 39 §сс1сса1ес 1§с1еай§( §аеа 24 <210> 40 <211> 67 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 40 са§е^аса с1ссса§£с1 са2с1с£.1§с а£1с1§££ес 1£а££1££1£ аа§ссс§е§§ 60 ссГсад! 67 <210> 41 <211> 27 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 41
- 52 020130 (Цас1§сас асаса1сссс садсаса 27 <210> 42 <211> 40 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 42 д1д1с1дсад 1саа1д1ддс сйдсссГдд аасйс(да( 40 <210> 43 <211> 40 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР праймер <400> 43 сдагдддссс йдШёадд сддсададас адгдасаада 40 <210> 44 <211> 107 <212> ПРТ <213> Миз тизстйиз <400> 44
СИп Не Уа1 Ьеи ТЬг СИп Зег Рго А1а Не Ме1 Зег А1а РЬе Рго (Иу
1015
СИи Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а ТЬг Зег Зег Уа1 Азп Туг Ме( 20 2530
ΗΪ3 Тгр РЬе СИп О1п Ьуз Рго СИу ТЬг Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045
Зег Зег Зег Азп Ьеи А1а Зег СИу Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег О1у Зег 50 5560
СИу Зег СИу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме1 СИи А1а СИи 65 70 7580
- 53 020130
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз СИп С1п Агд Зег Зег Туг Рго Не ТЬг 85 90 95
РЬе О1у Зег СИу ТЬг Ьуз Ьеи СИи Не Ьуз Агд 100 105 <210> 45 <211> 107 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <220>
<221> пйзс_Геа1иге <222> (1)..(1) <223> Хаа может быть любой природной аминокислотой <400> 45
Хаа Не Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а Не Ме( Зег А1а Зег Рго СИу 15 1015
СИи Ьуз Уа1 ТЬг Не ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Азп Не
2530
Н1з Тгр РЬе О1п СИп Ьуз Рго СИу ТЬг РЬе Рго Ьуз Ьеи Тгр Не Туг 35 4045
Зег ТЬг Зег ТЬг Ьеи А1а Зег СИу Уа1 Рго С1у Агд РЬе Зег С1у Зег 50 5560
О1у Зег СИу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Ме! СИу А1а СИи 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п С1п Агд Зег СИу Туг Рго РЬе ТЬг 85 9095
РЬе СИу Зег СИу ТЬг Ьуз Ьеи СИи Пе Ьуз Агд 100105 <210> 46
- 54 020130 <211> 107 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 46
Азр Пе О1п Ме1 ТЬг О1п Зег Рго А1а Пе Ме1 Зег А1а Зег Рго О1у 15 1015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Ме( Ткг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме( 20 2530
Туг Тгр Туг О1п СИп Ьуз Рго С1у Зег Зег Рго Агд Ьеи Ьеи Пе Туг 35 4045
Азр Зег ТЬг Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег С1у Зег 50 5560
СНу Зег СНу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Пе Зег Агд Ме( О1и А1а О1и 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр Зег ТЬг Туг Рго Ьеи ТЬг 85 9095
РЬе СНу А1а СНу ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз Агд 100105 <210> 47 <211> 108 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 47
СИп Пе Уа1 Ьеи ТЬг О1п Зег Рго А1а Пе Ме( Зег А1а Зег Рго СНу
1015
СНи Ьуз Уа1 ТЬг Ме1 ТЬг Суз Зег А1а Зег Зег Зег Уа1 Туг Туг МеГ 20 2530
Туг Тгр Туг 61п С1п Ьуз Рго СНу Зег Зег Рго Агд Ьеи Ьеи Пе Туг 35 4045
- 55 020130
Азр ТЬг 8ег Азп Ьеи А1а 8ег СНу Уа1 Рго Уа1 Агд РЬе Зег СНу Зег 50 5560
О1у Зег С1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд МеЧ О1и А1а О1и 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Тгр 8ег Зег Туг Рго Рго Не 85 9095
ТЬг РЬе О1у Уа1 СИ у ТЬг Ьуз Ьеи О1и Ьеи Ьуз Агд 100105 <210> 48 <211> 105 <212> ПРТ <213> Мизти8Си1и5 <400> 48
О1п Не Уа1 Зег ТЬг О1п 8ег Рго А1а Не МеЧ Зег А1а 8ег Рго О1у 15 1015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг МеЧ ТЬг Суз 8ег А1а Зег Зег Зег Агд Зег Туг МеЧ 20 2530
С1п Тгр Туг О1п О1п Ьуз Рго О1у ТЬг Зег Рго Ьуз Агд Тгр Не Тут 35 4045
Азр ТЬг Зег Ьуз Ьеи А1а Зег С1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег СНу Зег 50 5560
О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег МеЧ СИи А1а О1и 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Н1з (31 η Агд Зег 8ег Туг ТЬг РЬе (31у 85 9095
О1у С1у ТЬг Ьуз Ьеи С1и Не Ьуз Агд 100105
- 56 020130 <210> 49 <211> 107 <212> ПРТ <213> Миз шияси1из <400> 49
О1п ТЬг Уа1 Ьеи Зег О1п Зег Рго А1а Не Ьеи Зег А1а Зег Рго О1у
1015
О1и Ьуз Уа1 ТЬг Ме! ТЬг Суз Агд А1а Зег Зег Зег Уа1 ТЬг Туг 11е 20 2530
Н1з Тгр Туг С1п С1п Ьуз Рго О1у Зег Зег Рго Ьуз Зег Тгр Не Туг 35 4045
А1а ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег СНу Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег СНу Зег 50 5560
О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Агд Уа1 <31и А1а СНи 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз СНп Н13 Тгр Зег Зег Ьуз Рго Рго ТЬг 85 9095
РЬе О1у СНу СНу ТЬг Ьуз Ьеи СНи Не Ьуз Агд 100105 <210> 50 <211> 107 <212> ПРТ <213> Миз шизси1из <400> 50
СНп Зег Уа1 Ьеи Зег СНп Зег Рго А1а Не Ьеи Зег А1а Зег Рго СНу
1015
О1и Ьуз Уа1 Пе Ме! ТЬг Суз Зег Рго Зег Зег Зег Уа1 Зег Туг Ме! 20 2530
СНп Тгр Туг СНп СНп Ьуз Рго СНу Зег Зег Рго Ьуз Рго Тгр Пе Тут 35 4045
- 57 020130
Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а 8ег СЛу Уа1 Рго О1у Аг§ РЬе Зег С1у 01у 50 5560
О1у Зег О1у ТЬг Зег РЬе Зег Ьеи ТЬг Не Зег СЛу Уа101и А1а О1и 65 70 7580
Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз С1п О1п Туг Зег Зег Ηίβ Рго Ьеи ТЬг 85 9095
РЬе О1у О1у СЛу ТЬг Ьуз Ьеи СЛи Ьеи Ьуз Аг§ 100105 <210> 51 <211> 109 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 51
СЛи Азп Уа1 Ьеи ТЬг СЛп Зег Рго А1а Пе МеГ Зег А1а Зег Рго СЛу 15 1015
СЛи Ьуз Уа1 ТЬг Ме1 А1а Суз Аг§ А1а Зег 8ег Зег Уа1 Зег Зег ТЬг 20 2530
Туг Ьеи №з Тгр Туг СЛп <31п Ьуз Зег СЛу А1а Зег Рго Ьуз Ьеи Ьеи 35 4045
Пе Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Аг§ РЬе Зег 50 5560
СЛу Зег СЛу Зег СЛу ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Пе Зег Зег Уа101и 65 70 7580
А1а О1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п О1п Туг Зег СЛу Туг Рго 85 9095
Ьеи ТЬг РЬе СЛу А1а СЛу ТЬг Ьуз Ьеи СЛи Ьеи Ьуз Ατβ 100105
- 58 020130 <210> 52 <211> 110 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 52
Азр 11с Уа1 Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а Не МеС 8ег А1а Зег Теи 61 у
1015
61и Агд Уа1 ТЬг МеС ТЬг Суз ТЬг А1а Зег Зег Зег Уа1 Зег Зег Зег 20 2530
Азп Ьеи Из Тгр Туг О1п 61п Ьуз Рго 61у Зег Зег Рго Ьуз Ьеи Тгр 35 4045
Не Туг Зег ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго А1а Агд РЬе Зег 50 5560
61у Зег 61у Зег 61у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег МеС 61и
70 7580
А1а О1и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз Ηϊβ 61п Туг Из Агд Зег Рго 85 9095
Туг ТЬг РЬе О1у 61у С1у ТЬг Ьуз Ьеи 61и Не Ьуз Агд А1а 100 105110 <210> 53 <211> 109 <212> ПРТ <213> МизшизсЫиз <400> 53
Азр Пе 61п Ьеи ТЬг 61п Зег Рго А1а РЬе МеС А1а А1а Зег Рго 61у 15 10 15
61и Ьуз Уа1 ТЬг Пе ТЬг Суз Зег Уа1 Зег Зег Зег 11е Зег Зег Зег 20 25 30
Азп Ьеи Из Тгр Туг 61п 61п Туз Зег 61и ТЬг Зег Рго Туз Рго Тгр
- 59 020130
4045
Не Туг О1у ТЬг Зег Азп Ьеи А1а Зег О1у Уа1 Рго Уа1 Аг§ РЬе Зет 50 5560
О1у Зег О1у Зег О1у ТЬг Зег Туг Зег Ьеи ТЬг Не Зег Зег Ме101и 65 70 7580
А1а <31и Азр А1а А1а ТЬг Туг Туг Суз О1п С1п Тгр Азп Зег Туг Рго 85 9095
Туг ТЬг РЬе О1у СЯу СЯу ТЬг Ьуз Ьеи СЯи Не Ьуз Аг§ 100105 <210> 54 <211> 117 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 54
О1п Пе О1п Ьеи СЯп 61п Зег СЯу Рго СЯи Ьеи Уа1 Лг^ Рго СЯу А1а 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Пе Зег Суз Ьуз А1а Зег СЯу Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг 20 2530
Туг Пе ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз СЯп Агц Рго СЯу СЯи СЯу Ьеи СЯи Тгр Пе 35 4045
СЯу Тгр Пе Туг Рго О1у Зег <31у Азп ТЬг Ьуз Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз СЯу Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме! СЯп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СЯи Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095
А1а Агд СЯу СЯу Ьуз РЬе А1а Ме1 Азр Туг Тгр О1у О1п СЯу ТЬг Зег 100 105 ПО
- 60 020130
Уа1ТЬгУа1 Зег Зег 115 <210> 55 <211> 122 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 55
01п Уа1 СИп Ьеи СИп СИп Рго СИу А1а СИи Ьеи Ма1 Ьуз Рго О1у А1а 15 1015
8ег Уа1 Агд Ме1 8ег Суз Ьуз А1а 8ег СИу Туг ТЬг РЬе ТЬг Азп Туг 20 2530
Азп Ме( Туг Тгр Уа1 Ьуз СИп Зег Рго СИу СИп О1у Ьеи СИи Тгр Пе 35 4045
СИу Ие РЬе Туг Рго СИу Азп СИу Азр ТЬг 8ег Туг Азп СИп Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме1 СИп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
А1а Агд Зег СИу СИу Зег Туг Агд Туг Азр СИу СИу РЬе Азр Туг Тгр 100 105110
СИу СИп СИу ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг С а1 Зег Зег 115120 <210> 56 <211> 119 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 56
- 61 020130
01η С1у 01η Ьеи Οίη 01η Зег 01у А1а 01и Ьеи Уа1 Агд Рго 01у Зег 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег С1у Тут А1а РЬе Зег Зег РЬе 20 2530
Тгр Уа1 Азп Тгр Уа1 Ьуз 01п Агд Рго 01у 01п 01у Ьеи 01и Тгр Не 35 4045
О1у Οίη II© Туг Рго О1у Азр О1у Азр Азп Ьуз Туг Азп О1у Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег ТЬг ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме101п Ьеи Туг Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095
А1а Агд Зег О1у Азп Туг Рго Туг А1а Ме1 Азр Туг Тгр С1у О1п О1у 100 105110
ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115 <210> 57 <211> 120 <212> ПРТ <213> МизшизсЫиз <400> 57
О1п Уа101п Ьеи О1п О1п Зег О1у А1а О1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у А1а
1015
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530
Тгр Ме1 ΗΪ3 Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд Рго О1у Агд О1у Ьеи О1и Тгр Пе 35 4045
О1у Агд II© Азр Рго Азп Зег О1у О1у ТЬг Ьуз Туг Азп О1и Ьуз РЬе
- 62 020130
5560
Ьуз Зег Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Рго 8ег 8ег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме! О1п Ьеи 8ег 8ег Ьеи ТЬг 8ег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
А1а Агц Туг Азр Туг Туг О1у Зег Зег Туг РЬе Азр Туг Тгр О1у С1п 100 105110
О1у ТЬг ТЬг Уа1 ТЬг Уа1 Зег 8ег 115120 <210> 58 <211> 121 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 58
СИи Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Зег О1у Уа1 О1и Ьеи Уа1 Аг& А1а О1у Зег 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Ме1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Азп 20 2530
С1у Не Азп Тгр Уа1 Ьуз О1п Аг§ Рго СНу О1п СНу Ьеи СИи Тгр Не 35 4045
С1у Туг Азп Азп Рго О1у Азп С1у Туг Не А1а Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз СНу Ьуз ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Ьуз Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме101п Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Тут РЬе Суз 85 9095
А1а Аг§ Зег СЛи Туг Туг О1у СНу Зег Туг Ьуз РЬе Азр Туг Тгр СНу 100 105110
- 63 020130
01п 01у ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1Зег 8ег 115 120 <210> 59 <211> 120 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 59
О1п Не О1п Ьеи Οίη О1п Зег О1у Рго О1и Ьеи Уа1 Ьуз Рго О1у А1а
1015
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Азр Туг 20 2530
Туг Не Азп Тгр Ме1 Ьуз О1п Ьуз Рго О1у Οίη О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045
С1у Тгр Не Азр Рго О1у Зег О1у Азп ТЬг Ьуз Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр ТЬг Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме1 С1п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр ТЬг А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095
А1а Агд О1и Ьуз ТЬг ТЬг Туг Туг Тут А1а Ме1 Азр Туг Тгр С1у О1п 100 105110
О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег А1а
115120 <210> 60 <211> 120 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 60
- б4 020130
01п Уа101η Ьеи ΟΙη Οίη Зег О1у А1а О1и Ьеи Ме1 Ьуз Рго 01у А1а 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Не 8ег Суз Ьуз А1а ТЬг О1у Туг ТЬг РЬе 8ег 8ег РЬе 20 2530
Тгр Не О1и Тгр Уа1 Ьуз ΟΙη Агд Рго О1у Йз О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045
О1у О1и Не Ьеи Рго О1у 8ег О1у О1у ТЬг ΗΪ3 Туг Азп О1и Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг РЬе ТЬг А1а Азр Ьуз Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме101п Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег О1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
А1а Агд О1у ΗΪ3 Зег Туг Туг РЬе Туг Азр О1у Азр Туг Тгр О1у О1п 100 105110
О1у ТЬг Зег Уа1 ТЬг Уа1 Зег Зег 115120 <210> 61 <211> 124 <212> ПРТ <213> Мизшизси1из <400> 61
О1п Уа1 С1п Ьеи О1п О1п Зег О1у А1а О1и Ьеи Уа1 Агд А1а О1у Зег
1015
Зег Уа1 Ьуз Ме1 Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе ТЬг Зег Туг 20 2530
О1у Уа1 Азп Тгр Уа1 Ьуз О1п Агд Рго О1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045
О1у Туг Не Азп Рго О1у Ьуз О1у Туг Ьеи Зег Туг Азп О1и Ьуз РЬе
- 65 020130
5560
Ьуз О1у Ьуз ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Азр Агд Зег Зег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
Ме101п Ьеи Агд Зег Ьеи ТЬг Зег (Ли Азр А1а А1а Уа1 Туг РЬе Суз 85 9095
А1а Агд Зег РЬе Туг О1у СИу Зег Азр Ьеи А1а Уа1 Туг Туг РЬе Азр 100 105110
Зег Тгр СИу СИп СИу ТЬг ТЬг Ьеи ТЬг Уа1 Зег Зег
115120 <210> 62 <211> 116 <212> ПРТ <213> Мизтизси1из <400> 62
СИп Уа1 О1п Ьеи СИп О1и Зег СИу А1а СИи Уа1 Ме1 Ьуз Рго СИу А1а 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Не Зег Суз Ьуз А1а ТЬг СИу Туг ТЬг РЬе Зег ТЬг Туг
2530
Тгр Не (Ли Тгр Уа1 Ьуз СИп Агд Рго СИу Ηίβ СИу Ьеи СИи Тгр Ие 35 4045 (Иу (Ли Не Ьеи Рго С1у Зег (Лу Зег ТЬг Туг Тут Азп (Ли Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз О1у Ьуз А1а ТЬг РЬе ТЬг А1а Азр ТЬг Зег Зег Азп ТЬг А1а Туг 65 70 7580
МеС СИп Ьеи Зег Зег Ьеи ТЬг Зег СИи Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
А1а Агд О1у Азр СИу Азп Туг СИу Туг Тгр СИу О1п (Лу ТЬг ТЬг Ьеи 100 105110
- 66 020130
ТЬгУа13ег 8ег
115 <210> 63 <211> 116 <212> ПРТ <213> Миз тизси1из <400> 63
О1п Уа1 О1п Ьеи О1п О1п Зег 01у А1а 01и Ьеи Уа1 Ατβ Рго О1у А1а 15 1015
Зег Уа1 Ьуз Ьеи Зег Суз Ьуз А1а Зег О1у Туг ТЬг РЬе Не Зег Туг 20 2530
Тгр Не Азп Тгр Уа! Ьуз О1п Аг^ Рго С1у О1п О1у Ьеи О1и Тгр Не 35 4045
С1у Азп Не Туг Рго 8ег Азр 8ег Туг ТЬг Азп Туг Азп О1п Ьуз РЬе 50 5560
Ьуз Азр Ьуз А1а ТЬг Ьеи ТЬг \'а1 Азр Ьуз Зег 8ег Зег ТЬг А1а Туг 65 70 7580
МеГ О1п Ьеи Зег Зег Рго ТЬг Зег С1и Азр Зег А1а Уа1 Туг Туг Суз 85 9095
ТЬг Аг§ Азр Азр Азп Туг СИу А1а МеГ Азр Туг Тгр О1у С1п 61у ТЬг 100 105 ПО
ТЬгУа1ТЬгУа1
115

Claims (33)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Антитело позвоночного, которое связывается с гликотопом СА6, включающее по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, где последовательность данной вариабельной области тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ГО NО: 10 или 8Еф ГО NО: 11.
  2. 2. Антитело по п.1, где указанная вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ГО NО: 8.
  3. 3. Антитело по п.1 или 2, где указанная вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ГО NО: 11 и где указанная вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ГО NО: 8.
  4. 4. Антитело по любому из пп.1-3, полученное с помощью способа гуманизации, включающего:
    (а) сопоставление позиций исходя из распределений относительной доступности на основании рентгеновских кристаллографических структур совокупности вариабельных областей тяжелых и легких цепей антител человека и грызунов с получением набора экспонированных на поверхности позиций каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, где позиции в выравнивании для всех вариабельных областей грызунов и человека являются по меньшей мере на 98% идентичными;
    (б) определение для антитела грызуна или его эпитоп-связывающего фрагмента набора экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи с использованием названного набора экспонированных на поверхности позиций каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, созданного на указанной стадии (а);
    (в) идентификацию на основании аминокислотных последовательностей человеческих антител набора аминокислотных остатков, экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, которые наиболее близко идентичны названному набору
    - 67 020130 экспонированных на поверхности аминокислотных остатков антитела грызуна, определенному на указанной стадии (б);
    (г) замещение в аминокислотной последовательности каркаса вариабельной области названного антитела грызуна или его эпитоп-связывающего фрагмента этого названного набора экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, определенного на указанной стадии (б), указанным набором экспонированных по поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области тяжелой и легкой цепи, идентифицированным на указанной стадии (в);
    (д) конструирование трехмерных моделей указанных вариабельных областей названного антитела грызуна или его эпитоп-связывающего фрагмента и указанной вариабельной области указанного антитела грызуна или его эпитоп-связывающего фрагмента, являющихся результатом указанного замещения на стадии (г);
    (е) сравнение названных трехмерных моделей, сконструированных на указанной стадии (д), и идентификацию любых аминокислотных остатков из указанного набора, идентифицированного на указанных стадиях (б) или (в), которые находятся в пределах 5А от любого атома любого остатка в областях, определяющих комплементарность, указанного антитела грызуна или его эпитоп-связывающего фрагмента;
    (ж) изменение любых аминокислотных остатков, идентифицированных на указанной стадии (е), с человеческих на исходные аминокислотные остатки антитела грызуна, чтобы таким образом определить гуманизирующий набор экспонированных на поверхности аминокислотных остатков;
    (з) замену набора экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области антитела грызуна, определенного на стадии (б), гуманизирующим набором экспонированных на поверхности аминокислотных остатков каркаса вариабельной области, определенным на указанной стадии (ж);
    (и) получение указанного гуманизированного антитела грызуна или его эпитоп-связывающего фрагмента, которые связываются с СА6 гликотопом.
  5. 5. Антитело по п.4, где указанное антитело выбрано из группы, состоящей из ЕаЬ фрагмента, ЕаЬ' фрагмента, Е(аЬ')2 фрагмента, Еб фрагмента, в котором, необязательно, указанные аминокислотные остатки, экспонированные на поверхности, являются аминокислотными остатками, чья доступность для растворителя выше 30%.
  6. 6. Цитотоксический конъюгат, включающий антитело по любому из пп.1-5 и цитотоксический агент.
  7. 7. Цитотоксический конъюгат по п.6, где указанное антитело и указанный цитотоксический агент связаны ковалентно, в частности через линкерную группу РЕС или через тиоловую или дисульфидную функциональные группы цитотоксического агента.
  8. 8. Цитотоксический конъюгат по п.6, где указанное антитело является гуманизированным антителом.
  9. 9. Цитотоксический конъюгат по п.8, где указанное гуманизированное антитело является поверхностно-перестроенным антителом.
  10. 10. Цитотоксический конъюгат по пп.6-8, где указанный цитотоксический агент выбран из группы, состоящей из майтансиноидного соединения, таксоидного соединения, соединения СС-1065, соединения доластатина, соединения даунорубицина и соединения доксорубицина.
  11. 11. Цитотоксический конъюгат по п.10, где указанным цитотоксическим агентом является мейтансиноид ЭМ1 формулы (I) или указанным цитотоксическим агентом является мейтансиноид ЭМ4 формулы (II)
    - 68 020130 указанное антитело и указанный цитотоксический агент ковалентно связаны через линкер Νсукцинимидил-4-(2-пиридилдитио)бутаноата (8РЭВ), причем с указанным антителом связаны 1-10 молекул ΌΜ4, в частности с антителом связаны примерно 3 молекулы ΌΜ4;
    или указанный цитотоксический агент является майтансиноидом формулы (III) где Υ' означает (СП 1кнС1кС1ЬмС С) Ао(С1ик)т|).(СН СН +(С С).Β.(СΗ;I^)..СΗI^8Ζ.
    где В, и Κ2, каждый, являются независимо СН3, С2Н5 линейным алкилом или алкенилом, имеющим от 1 до 10 атомов углерода, разветвленным или циклическим алкилом или алкенилом, имеющим от 3 до 10 атомов углерода, фенилом, замещенным фенилом или гетероциклическим радикалом и дополнительно Κ2 может быть Н;
    А, В, Ό являются циклоалкилом или циклоалкенилом, имеющим 3-10 атомов углерода, простым или замещенным арилом или гетероциклическим ароматическим или гетероциклическим радикалом;
    Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7, Κ8, Κ9, Κ10, № и Κι2 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т, п, о, р, с.|, г, к, I и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно;
    Ζ означает Н, 8Κ или -СОП, где Κ означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал, или
    Κι означает метил, Κ2 означает Н, а Ζ означает Н, или
    Κι и Κ2 означают метил, а Ζ означает Н, или
    Κι означает метил, Κ2 означает Н, а Ζ означает -8СН3, или
    Κι и Κ2 означают метил, а Ζ означает -8СН3.
  12. 12. Цитотоксический конъюгат по п.10, где указанный цитотоксический агент выбран из группы, включающей формулы (ГУ-Ь), (ΙΥ-Ώ) и (1У-Э,Ь) (ΐν-Ь) (ΐν-ϋ) (ГУ-ЦЬ) где Υ означает ^^Κ^^ΟΚ^Κ^^ΟΚ^Κ^Ο^Κ^Ζ, где Κ1 и Κ2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал, при этом Κ2 может означать Н;
    Κ3, Κ4, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т и п независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом п может означать 0;
    Ζ означает Н, 8Κ или -СОЯ, где Κ означает линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал;
    Μау означает майтансиноид, несущий боковую цепь в положении С-3, С-14-гидроксиметил, С-15гидрокси или С-20-десметил, или
    Κ1 означает метил, Κ2 означает Н, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0, а Ζ означает Н, или
    Κ1 и Κ2 означают метил, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0, а Ζ означает Н, или
    Κ1 означает метил, Κ2 означает Н, Κ5, Κ6, Κ7 и Κ8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0, а
    - 69 020130
    Ζ означает -8СН3, или
    В1 и В2 означают метил, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η равно 0, а Ζ означает -8СН3.
  13. 13. Цитотоксический конъюгат по п.12, где цитотоксический агент представлен формулой (1У-Ь).
  14. 14. Цитотоксический конъюгат по п.10, где указанный цитотоксический агент является майтансиноидом формулы (У) где Υ означает (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)ηСВ1В28Ζ, где В1 и В2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал, при этом В2 может означать Н;
    В3, В4, В5, В6, В7 и В8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический ароматический или гетероциклический радикал;
    1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0;
    Ζ означает Н, 8В или -СОВ, где В означает линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал, или
    В1 означает метил, В2 означает Н, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η равно 0, а Ζ означает Н, или
    В1 и В2 означают метил, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η равно 0, а Ζ означает Н, или
    В1 означает метил, В2 означает Н, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, η равно 0, а Ζ означает -8СН3.
  15. 15. Цитотоксический конъюгат по п.10, где указанный цитотоксический агент выбран из группы, включающей формулы (УТ-Ь), (УТ-ϋ) и (УТ-О,Ь) (νι-Ь) (νι-ϋ) <νι-ο, ц где Υ2 означает (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)ηСВ1В28Ζ2, где В1 и В2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал, при этом В2 может означать Н;
    В3, В4, В5, В6, В7 и В8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т и η независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом η может означать 0;
    Ζ2 означает 8В или -СОВ, где В означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал;
    Мау означает майтансиноид или указанный цитотоксический агент является майтансиноидом формулы (УТТ)
    - 70 020130 где Υ2' означает (СЯ ШНСЯ.СЯ· ).(С С) Ао(СВ,К.)...|\(СВ СЯ ).(С С)..В.(СВ;Щ)..СВ·ΒΑΖ;, где Я1 и Я2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный или разветвленный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал, при этом Я2 может означать Н;
    А, В и Ό независимо друг от друга означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал;
    Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Я10, Яп и Я12 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т, п, о, р, с.|. г, 8, ΐ и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно;
    Ζ2 означает 8Я или -С0Я, где Я означает линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал, или
    Я1 означает метил, а Я2 означает Н, или где указанный цитотоксический агент является майтансиноидом формулы (VIII) где Υ1’означает (СЯ ШНСЯ.Я·).(С С) Ао(СВ,1<.)...|\(СВ СЯ ).(С С)..В.(СВ;Щ)..СВ·ВА-где А, В и Ό независимо друг от друга означают циклоалкил или циклоалкенил, содержащий 3-10 атомов углерода, простой или замещенный арил либо гетероциклический радикал;
    Я3, Я4, Я5, Я6, Я7, Я8, Я9, Я10, Яп и Я12 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т, п, о, р, с.|, г, 8, ΐ и и независимо друг от друга означают 0 или целое число от 1 до 5 при условии, что по крайней мере два из них не равны 0 одновременно, или
    Я1 означает метил, а Я2 означает Н, или
    Я1 и Я2 означают метил, или где указанный цитотоксический конъюгат выбран из группы, состоящей из формул (ΙΧ-Ь), (ΙΧ-Ό) и (1Х-Э,Ь)
    ΙΧ-Ь ΙΧ-ϋ ΙΧ-ϋΧ где Υι означает (СЯ7Я8)1(СЯ5Я6)т(СЯ3Я4)пСЯ1Я2§-, где Я! и Я2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический радикал, при этом Я2 может означать Н;
    Я3, Я4, Я5, Я6, Я7 и Я8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алке
    - 71 020130 нил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т и п независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом п может означать 0;
    Мау означает майтансиноид, несущий в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь, или
    В1 означает метил, а В2 означает Н, либо В1 и В2 означают метил, или
    В| означает метил, В2 означает Н, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0, или
    В1 и В2 означают метил, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0.
  16. 16. Цитотоксический конъюгат по п.15, где майтансиноид представлен формулой (ΙΧ-Ь) и В; означает метил, а В2 означает Н, либо В1 и В2 означают метил или В1 означает метил, В2 означает Н, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0.
  17. 17. Цитотоксический конъюгат по п.10, где указанный цитотоксический агент является майтансиноидом формулы (X) где Υ1 означает (СВ7В8)1(СВ5В6)т(СВ3В4)пСВ1В28-, где В1 и В2 независимо друг от друга означают СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил, гетероциклический радикал, при этом В2 может означать Н;
    В3, В4, В5, В6, В7 и В8 независимо друг от друга означают Н, СН3, С2Н5, линейный алкил или алкенил, содержащий от 1 до 10 атомов углерода, разветвленный или циклический алкил или алкенил, содержащий от 3 до 10 атомов углерода, фенил, замещенный фенил либо гетероциклический радикал;
    1, т и п независимо друг от друга означают целое число от 1 до 5, при этом п может означать 0,
    Мау означает майтансиноид, несущий в положении С-3, С-14-гидроксиметила, С-15-гидрокси или С-20-десметила боковую цепь, или
    В1 означает метил, В2 означает Н, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0, или
    В1 и В2 означают метил, В5, В6, В7 и В8 независимо означают Н, 1 и т равны 1, п равно 0.
  18. 18. Цитотоксический конъюгат по п.11, где указанное антитело является гуманизированной версией мышиного анти-СА6 моноклонального антитела Ό86, в котором вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 11, а вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 8, и где цитотоксический агент является ЭМ1 или ЭМ4.
  19. 19. Цитотоксический конъюгат по п.10, где цитотоксический агент является таксаном формулы (XI)
  20. 20. Способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей СА6 гликотоп, включающий обеспечение контактирования клетки, экспрессирующей СА6 гликотоп, с цитотоксическим конъюгатом по любому из пп.6-19.
  21. 21. Способ по п.20, где цитотоксический конъюгат включает анти-СА6 моноклональное антитело, в котором указанная вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф ΙΌ N0: 11, а вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Еф
    - 72 020130
    ΙΌ ΝΟ: 8, и где цитотоксическим агентом является ОМ1 или ОМ4.
  22. 22. Способ по п.20, который осуществляют ίη νίνο, ίη νίίΓο или ех νίνο.
  23. 23. Терапевтическая композиция, включающая цитотоксический конъюгат по любому из пп.6-19 и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.
  24. 24. Терапевтическая композиция по п.23, где цитотоксический конъюгат включает анти-СА6 моноклональное антитело, в котором указанная вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8ЕЦ ΙΌ ΝΟ: 11, а указанная вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 8, и где цитотоксическим агентом является ОМ1 или ОМ4.
  25. 25. Способ лечения субъекта, больного раком, при котором экспрессируется или сверхэкспрессируется СА6 гликотоп, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества терапевтической композиции по п.23.
  26. 26. Способ лечения субъекта по п.25, где рак выбран из группы, включающей серозную карциному яичника, эндометриоидную карциному яичника, новообразование шейки матки, новообразование эндометрия, новообразование вульвы, карциному молочной железы, опухоль поджелудочной железы и уротелиальную опухоль.
  27. 27. Набор для лечения субъекта, больного раком, включающий цитотоксический конъюгат по любому из пп.6-19 и инструкцию по использованию набора, где инструкция представляет собой инструкцию по лечению субъекта, больного раком, при котором экспрессируется или сверхэкспрессируется гликотоп СА6.
  28. 28. Набор по п.27, где рак выбран из группы, включающей серозную карциному яичника, эндометриоидную карциному яичника, новообразование шейки матки, новообразование эндометрия, новообразование вульвы, карциному молочной железы, опухоль поджелудочной железы и уротелиальную опухоль.
  29. 29. Набор для лечения субъекта, больного раком, включающий терапевтическую композицию по п.23 или 24 и инструкцию по применению набора, где инструкция представляет собой инструкцию по лечению субъекта, больного раком, при котором экспрессируется или сверхэкспрессируется гликотоп СА6.
  30. 30. Набор по п.29, где рак выбран из группы, включающей серозную карциному яичника, эндометриоидную карциному яичника, новообразование шейки матки, новообразование эндометрия, новообразование вульвы, карциному молочной железы, опухоль поджелудочной железы и уротелиальную опухоль.
  31. 31. Набор по п.30, где цитотоксический конъюгат включает анти-СА6 моноклональное антитело, включающее по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 11, а вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 8, и где цитотоксическим агентом является ОМ1 или ОМ4.
  32. 32. Способ по любому из пп.25-26, где цитотоксический конъюгат включает анти-СА6 моноклональное антитело, включающее по меньшей мере одну вариабельную область легкой цепи и по меньшей мере одну вариабельную область тяжелой цепи, где вариабельная область тяжелой цепи включает аминокислотную последовательность 8ЕО ΙΌ ΝΟ: 11, а вариабельная область легкой цепи включает аминокислотную последовательность 8Е0 ΙΌ ΝΟ: 8, и где цитотоксическим агентом является ОМ1 или ОМ4.
    - 73 020130
    А. Саоу-3
    В. Τ-47Ό
    Средняя флуоресценция , г Средняя флуоресценция ι δκ-ον-з
    О. Со1о205 [ти056] М
    Фиг. 1
    А. Саоу-3 / “Прошва ПротеиназаК Ό1 . ζ > Нейраминидаза Периодная' кислов ТВ: 086 С. 8ΚΜΕΙ28 ' а < Проназа ♦ · Протеиназа К # : - ··',, + : · · . .. +
    Нейраминидазу- Периодная, кислота
    ΙΒ: К24
    В. Саоу-3
    '///γ--/. +Ϊ++++++++2 + ' ' Прошва +;+Протеиназа К ··.> ° О + Нейраминидаза Периоднаякислота ГВ: СМ1 ϋ. Со1о205 . Протеиназа К Проназа О ;· --Ϊ··-· ' '· ··. --· +. ·
    Нейраминидаза Периодная кислоту
    Ш: С242
    Фиг. 2
    Фиг. 3
    - 74 020130
    Фиг. 4
    А. Саоу-З
    N
    В. Саоу-З
    РА а - + РТ Ьуз а - + РТ Ьуз
    ϋ. 8Κ-ΟΥ-3
    С. Т-47Е>
    а ΙΡ РТ Ьуз а ΙΡ РТ Ьуз
    Фиг. 5
    - 75 020130
    Е. Со1о205 р. Саоу-З
    Фиг. 5 (продолж.)
    А. Саоу-З
    1Р 086 086 \УВ; 1»8К У/В; СМ1
    В. НсЪа
    Фиг. б
    - 7б 020130
    С.
    Стандартная кривая для детектирующего антитела
    А. Стандарт I
    В. Стандарт 2
    Стрептавидин-НКР
    Биотин-086
    Стрептавидин-НКР
    Биотин-О8б
    Козье анти-1§6 мыши
    Фиг. 8
    - 77 020130
    А, Легкая цепь - 8Εζ) ΙΟ N0:7
    О I V Ь Т О Б Р А I Μ 3 А 3 РОЕ 1 САААТТОТТС ТСАСССАСТС ТССАОСААТС АТСЗТСТОСАТ СТССАОСООА
    СЕК1
    К V Т I Т С Б А Н Б 5 V 5 Г Μ Н
    51 СААСОТСАСС АТААССТССА ОТ5СССАСТС ААОТСТААОТ ТТСАТОСАСТ
    К Р 2 С К Р О Г 5 Р К ЕЙ! Υ 3_Т
    101 СОТТССАОСА ОААОССАОСС АСТТСТСССА ААСТСТООАТ ТТАТАОСАСА СБК2
    Б Б Е А 5 ОУ РАН Р О О 3 ОБО
    151 ТССАОССТСС СТТСТСОАОТ ссстостсес ТТСООТООСА СТООАТСТСО 201 Т 5 Υ ОАССТСТТАС 3 Ъ Т I 5 Я И ТСТСТСАСАА ТСАССССААТ Ξ А Е ООАСССТОАА Е А А ОАТССТОССА Т Υ Υ С СЕБ.З ООН ЗБРР Ь Т Р ОАО 251 СТТАТТАСТО ССАОСАААСО АОТАОТТТСС СОСТСАССТТ ССОТОСТООО
    Т К Е Е Е К Я
    301 АССААОСТОС АОСТСАААСЗ Т
    В .Тяжелая цепь - δΕζ> ГО N0:9
    О Α Υ Ь 003 О А Е Е V Н 3 ОАБ
    1 САОССТТАТС ТССАССАОТС ТСОСОСТОАО СТССТСАОСТ стеооесстс
    СЕН1 УКМ БОКА Б Ο Υ Т Ρ Т Б Υ N
    51 АОТОААОАТС ТССТОСААОО СТТСТООСТА САСАТТТАСС АОТТАСААТА
    М_Н И V КОТ Р 6 О О ЬЕИ I <3 Υ
    101 ТОСАСТССОТ АААССАОАСА ССТООАСАСО ОССЮОААТС ОАТТООАТАТ
    СЕК2
    ΙΥΡΟ И О Α Г Ν Υ НрКР КО К 151 АТТТАТССТО ОАЛАТбСТОС ТАСТААСТАС ААТСА0АА6Т ТСААСООСАА
    АТЕ Т А Е Р ЗББ ΤΑΥ Μ О I
    201 СОССАСАТТО АСТССАОАСС САТССТССАО САСАОССТАС АТССАОАТСА
  33. 3 3 Ь Т БЕЕ Э А V Υ ЕСА Я О_О
    251 ОСАОССТОАС АТСТОААОАС ТСТССООТСТ АТТТСТСТОС ААОАСОАОАТ
    СЕНЗ
    БУРГ Α Υ И ООО Т Ь V Т УЗА
    301 ТССОТСССОТ ТТОСТТАСТО О6СССАА6СО АСТСТТСТСА СТОТСТСТСС А
    Фиг. 9
    78 020130
    А. Легкая цепь
    СОЮ: 3 А Н 3 3 V 8 Р НН- ЗЕО ΪΒ N0:4 СОК2: 3 Т 5 3 ь А 3 • ЗЕЙ Ю N0:5 СОКЗ: 0 0 К 3 3 Р Р ь Т - ЭЕЙ ХО N0:6
    В. Тяжелая цепь
    СИИ: 3 Υ N м н - ЗЕЙ 1П N0:1 СОК2: Υ I Υ Р с N С А т ΝΥΝ <2 К Р К <3 - ЗЕЙ Ш N0:2 СОКЗ; 0 о 3 V ₽ Р А Υ - 5ЕЙ Ю N0:3
    С. Тяжелая цепь АЬМ
    СОК1: С Υ Т Р Т 3 Υ N И Н - ЭЕЙ Ю НО:20
    СПК2: Ύ I Υ Р С N С А Т N - ЗЕй ю N0:21
    СПКЗ: С О 3 V Р Р А Υ - 8ЕО хп N0’22
    Фиг. 10
    Легкая цепь 1дЛ7Кар4 (1) тиПЗбЬС (1) ХдЗ?Кар4 (51) МиОЗбЬС (51)
    Тяжелая цепь
    Хд'/Ь Ц558.41 тиПЗбНС
    1дУЬ Д558.41 тиПЗОНС
    1 50 (1) 0ΑΥΠ005ΟΆΕΕνΚ30ΆενΚΜε0ΚΑΞαΥΤΓΤδΥΝΜΗΗνΚΟΤΡ3δ3ΠΕΝΙ<3Υ (1) 0ΑΥΕ0ς3ΟΑΕΕνΗ3σΑ3νΚΜ3ΟΚΑ3ΟΥΤΕΤ3ΥΝΜΗΝνΚΟΤΡ«ς(3ΕΕΝΙβΥ
    51 ' 98 (51) ΙΥΡ<3Ν0θΤΝΥΝ0ΚΡΚαΚΑΤΕΤΑΐθ3β5ΤΑΥΜ0Ι33ΙιΤ3ΕΟ3ΑνΥΕ0ΑΕ (51} ΙΥΡ<3Ν<ϊ§ΓΝΥΝ0ΚΕΚΟΚΑΤΠΤΑΒ§333ΤΑ™2Ι33ΠΤ3Εη3ΑνΥΕ0ΑΚ
    Фиг. 11
    - 79 020130
    10 наиболее гомологичных последовательностей легкой цепи со структурами 1 ; 60 01УВТОЗ ΡΑΙΜ8 АЗРОЕКУГХТСЗ АНЗ - - 3 УЗРМНКГООКРОТЗ РКВНХУ ЗТЗЗВ АЗОУР О!УВТОЗ ΡΑΙΜ3 АР ΡΟΕΚντϊΤΟ 5АТ5 - - 3 νΝΥΜΗΗΡΟΟΚΡΟΤδ РКВИ1Υ533ΝΒΑ50νΡ XIУЕТ03 ΡΑΙΜ3 АЗ Р0ЕКУТ1ТС 8А53 - - 3 УЗИГГОНРООКРСТВ ΡΚΕΜΙX ЗТБТЬАЗОУР ΟΙ0ΜΤΟ3ΡΛΙΜ5Α5Ρ(3ΕΚνΤΜΤΟ8Α53--8ν5ΥΜΥΗΥ00ΚΕδ88ΡΗΒΒΙΥΟ8ΤΝΕΑ8θνΡ 0ΐνΐ.ΤΟ3ΕΑΙΜ8Α8Ρ0ΕΚνΤΜ|Τ€3Λδ8—ЗУГЖУИУООКЕОЗЗВНВЫЕПТЗЫВАЗеУР о X У8Т08 РА ΙΜ8 АЗ РСЕКУТМТСЗАЗЗЗНЗ - - УМ0НУ00КРСТ5 РКВИХ ΥΒΤ3ΚΒ АЗОУР ОТУЪЗОЗ РА! ВЗАЗ РС ЕКУТНуСКАЗ 3—3 УТХТННХООКРСЗ 3ΡΚ3ΗΊ Г ΑΤ5ΝΕ АЗСУР ОЗУЕЗОЗВАХЬЗАЗ РСЕКУХМТСЗРЗ 3—3 УЗ ΥΜ0ΗΥ00ΚΡ033ΡΚΡΗΙΥ8Τ3ΝΕ АЗС УР ЕНУЬТОЗ ΡΑΙΜ3Α3 РСЕКУТМ^СНАЗ 53 УЗ ЗТУВНИХООКЗОАЗ РКЬЫУ 3Τ8ΝΕ АЗО УР штатов РАГМЗ АЗ ЕС ЕКУТМТСТАЕ 55УЗ ЗЗЫЬН ΗΥ00ΚΡ08 3 РКЕНIΥ5Τ8ΝΒ А5С УР ϋ! 0ВТ03 РАЕМААЗ РСЕКУТХТСЗ УЗ5318 33ΝΕΗΗΥ00Κ5ΕΤ3 РКРИIΥΟΤ5ΝΒ АЗС V Р
    ши036ВС (1) 1£ох (1) 1рзК (1) 1ау1 (1) 1Ьа£ (1) Ιτηίιη (1) 1с1о (1) 1абе (1) 1£1д (1) 15с9 (1) На! (1) тиОЗбВС (59) 1£ох (59) 1рзк (59) 1ау1 (59) 1Ьа£ (59) Ιιηίτη (59) 1с1о (59) 1абЕ (59) 1£1д (61) 15с8 (61) 11а1 (61)
    61 111 АКР&ЗЗСЗСТЗУЗВТГ 3 НИЕАЕПААТУУСООВЗЗРР-ЬТРСАСТКЕЕЬК— ЛКРЗСЗСЗСТЗΥ8ΕΤΙ8 КМЕАЕОААТУУСООНЗЗ ΥΡ-1ТГС ЗСТКЬЕIККСНГЗС ЗС8СТ5УЗ ΕΤΙ5 ΚΜΟτψϋΑΑΤΥΥΟΟΟΒΕΟΥΡ-ΡΤΓΟ ЗСТКЪЕХКНтарзсзсзстзузвтх зкмеаеоаатуусооизту р- ътусасткв еекк тагзсзсзстБуз βτιзкм е аепдатуусооиз з υ рр ιτγοусткеевкнАКРЗСЗС ЗОТЗΥ3 ВТ!8 3«Е а^оаатууснонз 5 утрс&зткееткй. АКРЗСЗС Ξ0Τ5 Υ5 ΕΤΙЗЕТС АЕВААТУУСОНИЗ ЗКР - РТРСЭЗТКВЕХ КН6КГ8ССС ЗСТЗ РЗВТ! ЗСУЕ ΑΕΕΑΑΤΥΥΟΟΟΥΒ ЗНР- ВТ РССОТКВЕЕККАВГЗСЗСЗСТЗ Υ3Ι/ΓΙ3 8 УЕАЁОААТ УУСООУЗС ΥΡ - ЬТРОАСТКЪЕЬКК АДРЕС £0 5СТЗ ΥδΕΤΙ55ΜΕΑ®ΟΑΑΤΪΥΟΗΟΥΗΚ3 Р~ УТГОетЗТКЬЕ ΙΚΒΑ УКР8С ЗС ЗОТЗ Χ8ΕΤΙ35ΜΕΑΕΒΑΑΤΥΥΟΟΟΗΝ5 ΥΡ-УТРвЭСТКЕ ΕΙΚΚ(ЗЕО ΙΟ N0:7) (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО го го го ю го го го Ιϋ ΙΟ ΙΟ
    N0:44)
    N0:45)
    N0:46)
    N0:47)
    N0:48)
    N0:49)
    N0:50)
    N0:51)
    N0:52)
    N0:53)
    10 наиболее гомологичных последовательностей тяжелой цепи со структурами
    1 70
    0АУЕО05аАЕвтаЗвА5УКМЗСКА8СУТРТ8У1ЯМНнтаОТРСОвЕЕП1аУ1УРСМСАТНУЫОКРкаКАТЕ 0101.0030 РЕВтаРС АЗ УК1 ЗСКА8С ΥΤΡΤϋΥΎΙΗΗνΚΟΒΡΟΕΟΒΕΗ Ι(3ΗΙ ΥΒΟ δΟΝΤΚΥΝΕΚΓΚΟΚΑΤΒ ОУОЕООРСАВЕтарсАзтамзскАзсхтртнхннуиукозРбОСЕЕнхсхгуишаптзуыокгкхзкАТЕ ООО ЬООЗС АЕЕтаРСЗЗУК! ЗСКАЗС ТАРЗЗРНУЫНУКОПРСОСВЕИ X οα IΥΡΟΒ3ΌΝΚΥΝΟΚΓΚΟΚΑΤΒ О УОЬООЗО ДЕВ таРСАЗУКЬЗСКА'зС УТРТЗУНННИУКОНРСНСВЕМIСКГО ΡΝ5ΟΟΤΚΥΝΕΚΓΚ 5 КАТЕ ЕУавоозотЕвталоз з νκΜ30ΚΑΒαχτρτ3Ν<3 гонукокрсосвеию υννρονο υι αυνε крксктть α ίο воозовЕвтароАз νκι зскАЗахтвтштынмкокраоаЕ еихоых о ρξ βοντκυνεκρκοκατε О νΟΒΟΟδΟΛΕΒΜΚΡα АЗ νκΐ ЗСКАТОУТРЗЗРМХ ΕΗνκΟΗΡΟΗΟΕΕΗΙΟΕΙ В ВС 3ΟΟΤΗΥΝΕΚΡΚΟΚΑΤΡ ОУОВООЗС АЕВтаАОЗЗ УКНЗСКл/йУТРТЗ УСУЫИУКОНРСОСЕЕЙКЗ ΥΙΝ РСКО ΥΒ3 ΥΝΕΚΡΚΟΚΤΤΕ О УОГ.ОЕ5С АЕУМКРСАЗУК1 ЭСКАТО ΥΤΡ3ΤΥΝΙВНУКОНРО НОВЕЙ! □ ЕΙΒ РОЗО 8ΤΥΥΝΕΚ Г КСКАТР О УОвсозедЕвта РОАЗ укьзска&з хттхз тихннтао йрсосвенкжх у ввоз χτνυνο к укокать тиОЗбНС 1РЕС 1ΝΜΒ 1Г0К 1Ν0Β б РАВ 1АЕ6 ГО5В 1РАХ 1МВВ ЫНВ (1) (1) (1) (1) <1>
    (1) <11 (1) (1) ¢1) (1) тпиОЗ6НС
    1РЕС
    1ΝΜΒ
    1РОК
    1Ν0Β
    6 РАВ
    1АЕ6
    ГО5В
    1ΡΑΙ
    ГОЕВ юно (71) (71) (71) (71) (71) (71) (71) (71) (71) (71) (71)
    71 124
    ТАВРЗ 3 ЗТА ΥΜΟ133 ЕТЗЕРЗ АУУРСАНСОЗ УР------У А-УНСОСТЕУТУЗ А
    ТУХХГЗ 5 ЗТА ΥΜ0Ε5 3 ЬТЗЕВЗ АУУРСАНССК-------РАМОХНООСТЗ 77773 3
    Т АОКЗ 3ΝΤΑ ΥΜ0Ε5 5 ЬТН ЕРЗ АУУХСАПЗССБ УЯХ—РССРПУНООСТТЕТУЗ 5 таркззттахмовхзьтз воз αΙζυγοαμον- υ рУАмвуисоотдутуз з ТТОКРЗ 5ТА ΥΜ0Β8 ЗЕТЗ ЕОЗ АуУУСАКУОУУСЗ 5 УРРХИСОСТТУТУЗ 3 ТУОКЗЗ ЗТАУИОЬКЗЕТЗ ЕО5 АУУРСААНЕ УУС 05 ХКЕВУНСОСТТВТУЗ 3 ТТОТЗ 3 ЗТАΥΜ0Β3 ЗЬТЗЕОТАуУРСАЯЕКТТУ ТХАМ1)ХНС0СТ8УТУЗ А Т АОКЗ 8ΝΤΑΥΜ0Ε3 3 ЕТЗЕРЗ АУУУСАЕЮН ЗУХРУ—тс—вхисоотз ντν 3 3 ттон.5 з зтАхмоьке етзвоаауурсавзр УОСзоьАУУХГвзтеооттьтуз з Т ΑΟΤΒΒΝΤΑΥΜΟ ВВЗВТЗЕЕЗ АУУУС ΑΗΟΟΟΝΥΟ--------УИСОСТТВТУЗЗ
    ТУЕК535ТАУЖ}ЬЗН РТЗ ΕΏΞ АУУУСТЙГЙЖУС------ΑΜϋ ΥΜΟΟΟΤΤνΤν— (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗЕО (ЗВО (ЗЕО
    ГО ГО го ίο го го го го го го ίο
    N0:9) N0: 54} N0:55) N0:56) N0:57) N0:58) N0:59) N0:50) N0:51) N0:63) N0:63)
    Фиг. 12
    - 80 020130
    Фиг. 13 <О©>ги(Л“1и?-< - г’ т; и « о 5г><(л<п1>«о*4’--1 < я ш о -о £л >
    >зо 1 26415 йалк виг/ 1 КаЬа( Να 1 2 ΞΗ по г 3 5Я вигТ 2 веч Р А в¥й % асе 19.01 47.39 >30 «0 25*35 Лаг.к &игС 80 КзЬа! Но &9 во 5Й по 88 07 3 3 3 4 4 й 15.49 81 68 4 5 Я 2.19 62 69 $ ·??· 33.144 5 5 8 8 0 2502 ’??* 0 83 70 6 7 с 7,03 84 71 'Г?* 29.604 7 8 28.00 *7Г 28.48 2 65 Г2 а 9 <3 19.35 88 73 9 '77* 31,567 9 9 10 10 5 38.04 67 67 87 74 10 10 10 11 11 5 17.95 50 75 и 12 Г 24.68 69 78 ‘77* 20.2 12 13 5 25.93 *?г* 26.05 9 70 77 13 14 V 1.55 71 78 14 15 3 12.99 72 79 15 *??* 33.573 15 15 18 18 ί 0.03 73 80 16 17 т 10.68 74 81 25.601 17 18 1 0*0 & 73 82 18 13 13 10 19 3 24.84 78 93 19 20 Й 3214 77 *?7* 46.05 7 77 77 84 *??* 20.545 20 21 м 0.87 78 05 21 22 Е 2497 79 во 22 23 А 30 52 80 *??’ 27.05 80 87 23 24 Е 38.82 81 31 81 08 *7ΐ* 24 25 О 1.24 02 09 25 2« А 17.79 93 90 26 28 27 А 3.37 84 91 ‘7Г 27 25 Г 11.19 65 92 27А 27А 29 Υ 0-05 88 93 37В 30 Υ 4.25 87 94 27С '??· 27С 31 с □.04 86 95 270 32 0 1.10 69 90 57Е 33 о 0.23 90 97 17 Р 34 я 15.47 91 98 23 35 8 22.54 92 99 29 34 г 23 05 93 100 30 37 3.13 84 101 31 38 0.09 85 102 32 39 р 22 65 95Е 107 33 40 Р 9.70 95Р 106 34 41 1_ 6.52 96 10» 35 42 т 1197 97 110 30 43 Р 6.15 9» 111 37 44 <3 1.88 99 112 38 45 А 26.73 *??* 20.74 100 113 39 48 6 4,43 101 114 40 40 40 47 47 Г о.ю 102 115 41 41 41 40 40 К 29.39 *?г 29.57 3 103 118 ‘7?· 29.575 42 49 1 1.15 104 117 43 50 Е 27.47 27,17 105 118 44 51 ί 21.65 106 119 •77’ 29,675 45 52 К 35.78 107 107 107 121
    - 81 020130
    В. Расчеты для поверхности тяжелой цепи тиОЗб
    Ανβ 25- КеЬэ1 Дув КвЬэ! % ЭСС >30 35 Дэпк ьиг< Но ЗН по 8Я зигГ веч % ясе >30 25-35 Лэпк еиг? Να $К пч 5Р ίΐίτί а 84.68 1 1 1 2 2 К 39.06 64 54 64 70 70 А 15.65 2 3 0 39,4 65 Б5 65 71 71 Υ 31.6В 3 ч??* 31.88 3 3 4 4 К 16.56 ев 72 ί. 4,15В 4 5 А 2.096 87 73 О 20.33 “Т?’ золе 5 5 6 в Т 25.55 *ΊΤ 20,06 68 74 О 5.146 6 7 и 3-639 69 75 5 21.64 7 8 т 25.85 ЧТ 29.58 70 76 О 20.31 В 9 А 13,24 71 77 А 36,1В 9 О 9 10 10 0 21.35 72 76 е 21.23 10 11 Р 36.15 73 73 73 79 79 ί 49.11 11 11 11 12 12 5 43.82 74 74 74 ВО 80 V 10,25 12 13 5 24.62 75 Θ1 к 50.21 13 13 13 14 14 3 15,41 78 62 34.2 14 *7?· 34.2 14 14 15 15 т 5.118 77 63 с 29.39 ЧГ 26.73 15 16 А 0.4 88 76 84 А 18.34 18 17 Υ 15.94 79 85 3 25.54 27.06 17 18 м 0,282 80 8в V 4.2 18 19 0 22.29 61 8? к 38.43 10 10 19 20 20 1 1738 92 88 м 0.813 20 21 3 20,72 62А 69 3 13Л 21 22 3 31.21 823 31,10 825 823 90 90 с 0.529 22 23 к 0.63 82С 91 к 29.41 31.16 23 23 24 24 т 28.28 ч?’ 26.39 63 92 А 3.823 24 25 3 35.72 84 84 84 93 93 5 2179 25 2В Е 36.36 85 85 85 64 94 О 26.57 *??* 26 27 0 3,913 86 95 ¥ 13.69 27 28 3 14.42 87 93 Ϊ 34.52 26 Ч>7* 26 29 А 2.996 66 97 Р 3.192 29 30 V 16.13 89 98 т 22,22 30 31 Υ 1.019 90 99 $ 28.17 я7?’ 31 32 Р 2.811 91 100 Υ О 32 33 с 0 92 101 N О 33 34 А 0.198 93 102 М 14.35 34 35 Я 5.789 94 103 Н 11.3В 36 38 в 2ЛО4 65 104 0.83 35А 37 □ 15.92 8« 105 1.018 35В 38 3 25.28 *??· 97 106 ¥7 0.16 36 39 V 29.54 Т?‘ 96 107 V 0.5 37 40 Я 23.57 99 108 К 5.459 38 41 1379 100 109 а 10.03 30 42 12.67 100А 110 т 22.06 40 43 10.47 1003 111 Р 48,17 41 41 41 44 44 2.038 1О8С 112 о 43.05 42 42 42 45 45 2.919 1000 113 0 42.17 43 43 43 48 46 0.252 100В 114 с 11,9 44 47 9.522 100Р 115 ί 6.039 45 48 0 1ИС 118 Е 19Л 46 49 0 юон 11? νν 1.433 47 50 Р 0721 101 120 1 0.123 48 51 А 12.13 102 121 о 0 40 62 Υ 24.24 103 122 Υ 4.963 50 53 νν 7.003 104 123 1 2.468 51 54 3 1.847 105 124 ¥ 13,72 52 53 а 38.48 106 108 108 125 125 Р 2.199 52А 56 о 7.55 107 128 22.06 52В 57 т 1.038 108 127 39.1 52С 52С 58 с 25.8 '7?* 25,8 109 128 0 25,76 *7?' 53 59 V 1.059 110 129 N 0 54 во т 25.58 *7?‘ 28.55 111 130 О 0 55 01 V 7717 112 131 А 31.10 56 *??* 56 62 3 41 68 113 113 113 132 132 т 22.29 57 63 А N 21.14 58 64 Υ 14,28 59 85 N 6.902 60 68 0 47.15 61 61 61 67 67 К 43.58 62 62 82 65 ев Р 424 63 69
    - 82 020130
    Ват ΗΙ (9357)
    ΡυκΙΙ (1783)
    РииП (2717) нему (1021) ой (ЙШП (7877Щ
    1юР56 НС
    ЛшП (2143) ог)
    ЬСМУ
    ЕооК! (10068
    ЬийЗВ СС
    Β*1 ν.Ί (9681
    К Солз(ап( ρΓΩ56ν1-0
    АраЕ (7450)
    1дС1 сопз(ап( λ'Λ«Ι (6464)
    5У40 сг!рр!ей
    ΡΗΡΚ
    Фиг. 14
    А. Аминокислотная последовательность легкой цепи (вариабельные мышиные и человеческие остатки заштрихованы)
    КаЬаЬ # тиОЗбЬС ЬиОЗбЬС νΐ.01 ЪиОЗбЬС νΐ.21
    КаЬаЬ # гаиОЗбЬС
    ЬиОЗбЪС νΐ.01
    ЬиОЗбЕС νΐ.21
    КаЬаЬ # тиОЗбЬС
    ИиОЗбЬС νΐ.01
    ЬиОЗбЬС ν1·21
    102
    ТКЬЕОКН - ЗЕО Ю N0:7 ТКЪЕОКК - ЗЕО Ю N0:8 ТКЬЕОКК - ЗЕО ТО N0:8
    В. Аминокислотная последовательность тяжелой цепи (вариабельные мышиные и человеческие остатки заштрихованы)
    КаЬаС # тиОЗбНС
    ЬиОЗбНС νΐ.01
    ЬиОЗбНС VI.21
    1 50
    ОАрлдоЗОАЕЙУ^ОАЗУКМЗСКАЗеУТГТЗУНМННУКОТРаОдОЕШеУ О АдщС ЗОАВДУКНВ АЗТКМЗ СКАЗС ΥΤΕΤ3 ΥΝΜΗντνκοΤΡΟΟΟΕΕΜ ΙΟΥ Ώ4|гда ЗСАЕ№^а АЗУКМЗ СКАЗ ΟΥΤΕΤ5 ΥΝΜΗΜνΚΟΤΡΟΩΟΟΕΝ ΙΟΥ каЬаС # тиОЗбНС
    ЬиОЗбНС νΐ.01 ЬиОЗбНС νΐ.21
    КаЬае # тиОЗбНС
    ЬиОЗбНС νΐ.01
    ЬиОЗбНС VI. 21
    97 114 ·3νΡΓΆΥΤ/ίΟΟ<3ΤΕντνΞΑ ОТРГАУИООСТЫТТУЗА ЗУРГАУИСОСТЬУТУЗА ЗЕО
    ЗЕО
    ЗЕО
    ΙΟ ΙΟ ίο
    ΝΟ: 9 ΝΟ: 10 N0:11
    Фиг. 15
    - 83 020130
    Легкая цепь КиО86 (νΐ.01 и νΐ.21)- 8Εζ) ΙΟΝΟ:8
    Е. I V Ь таз РАТ М 3 А 3 Р С Е
    1 САСАТТОТТС ТСАСССАСТС ТССАССААСС АТСТСТССАТ СТССАССССА К V Т I Т С 3 А Н 5 3 V 5 Р М Н 51 САСССТСАСС АТААССТОСА СТССССАСТС ААСТСТААСТ ТТСАТССАСТ И Е 0 ΰ К Р С т з р к ь те г Υ 3 Т 101 ССТТССАССА СААСССАОСС АСТТСТСССА ААСТСТСЙАТ ТТАТАССАСА 8 8 Ь А Я О V РАК Г С С 3 С 5 С 151 ТССАСЗССТСО СТТСТССАСТ СССТССТСЗС ТТССОТСССА стосАтстса Т 3 Υ 5 Ь Т I 3 3 М Е А Е ПАА 201 САССТСТТАС ТСТСТСАСАА ТСАОСАССАТ ССАСССТОАА САТОСТСССА Т Υ ¥ С о а к 8 5 Г Р Ь Т Р ОАО 251 СТТАТТАСТО ССАССАААС© АОТАСТТТСС СССТСАССТТ состэстооо Т К Ь Е Ь К К 301 АССААССТСС АССТСАААСО Т
    Фиг. 16
    А.Тяжелая цепь 1ηιϋ86 νΐ.01 - 8Ер ГО N0:10
    0 А 0 Ь V 2 2 С А Е V V К Р САЗ
    1 САСССТСАСС ТССТССАСТС ТЮТСТ®5 СТССТСААСС сссссссстс
    V К М ЗСКА 3 С У ТГТ 3 У N
    51 АСТСААСАТС ТССТССААСС СТТСТСССТА САСАТТТАСС АСТТАСААТА м н и ν кот р с а с ьеи ι с γ ιοί тссастссст ааассасаса сстссасаос ссстссаатс сагтссатат
    I Υ Р С ИСА ΤΝΥ N о К Е О С К 151 АТТТАТССТС САААТССТСС ТАСТААСТАС ААТСАСААСТ ТССАССССАА
    А Т Ь Т Α Ό Т 8 3 8 Т Α Ϊ МОТ
    201 ССССАСАТТС АСТССАСАСА САТССТССАС САСАСССТАС АТОСАСАТСА
    3 3 Ь Т 3 Е И 3 А V Υ Г С А КОС
    2 51 ССАСССТСАС АТСТОААСАС ТСТССССТСТ ДТТТСТОТОС ААСАССАСАТ
    3 V Р Р А Υ К С β С т ь ν т V 3 А
    3 01 ТСССТССССТ ТТССТТАСТС сссссаассс астсттстса стзтстстсс
    351 С
    В.Тяжелая цепь ЬиОЗб νΐ.21 - 8Εζ> Π)ΝΟ:11
    0 А О Ь V О 3 САЕ V V К ₽ САЗ
    1 САСССТСАСС ТССТССАСТС ТСССССТСАС СТССТСААСС ССССССССТС
    V К М ЗСКА 3 С Ϊ ТУТ 3ΥΝ
    51 АСТСААСАТО ТССТССААСС СТТСТСССТА САСАТТТАСС АСТТАСААТА
    М Н К V кот Р С О С ЦЕН ΙΟΥ 101 ТССАСТСССТ АААССАСАСА ССТССАСАСС 6ССТССААТС САТТССАТАТ
    I Υ Р С К С Α ΤΝΥ N О К Е 2 С К 151 АТТТАТССТС САААТССТСС ТАСТААСТАС ААТСАСААСТ ТССАССОСАА
    А Т Ь Т Α ϋ Р 333 ΤΑΥ МОХ
    2 01 ССССАСАТТО АСТССАСАСС САТССТССАС САСАСССТАС АТССАОАТСА
    3 3 Ь Т ЗЕС 3 А V Υ ЕСА К С Ц
    251 ССАСССТСАС АТСТСААСАС ТСТОСССТСТ АТТТСТСТСС ААСАССАСАТ
    3 V Р Е Α Υ И СЦС Т Ь V Т V 3 А
    301 ТСССТССССТ ТТССТТАСТС СССССААССС АСТСТТСТСА СТСТСТСТСС
    351 С
    Фиг. 17
    - 84 020130
    Фиг. 19
    Фиг. 20
    120-1
    Ю-га 10-11 10-1° 10·® 10-® [тиО86],М
    Фиг. 21
    - 85 020130 тиО86 без сыворотки тиО86 сыворотка кролика »— тиОЗб сыворотка человека
    А.
    НРАС
    Средняя флууоресцеиция Средняя флууоресценция
    2К-75-1
    Фиг. 22 гпиО86 без сыворотки пни 086 сыворотка кролика —й— тиО86 сыворотка человека
    А. Линии клеток рака яичников человека [гпиО36-ОМ1],М [ Мэйтансин],М
    Фиг. 23
    Фиг. 23 (продолж.)
    - 86 020130
    С, Линии клеток рака шейки матки человека
    ЫЖИВШИХ КЛЕТОК
    Фиг. 23 (продолж.)
    А. ОУСАЯ5
    В. Т0У-21С
    С. Сао\'-3 [ти0561.М 1тиО86],М [тиО86],М
    ϋ. ΖΚ-75-1 Е. ВТ-20 Г. КВ [тиО86],М [тиО86],М [тиО56],М
    Фиг. 24
    Фиг. 24 (продолж.)
    - 87 020130
    А,
    Время (д) после прививки опухоли
    В.
    Время (д) после прививки опухоли
    Фиг. 25
    ОУСАК5
    А.
    в.
    Время (д) после прививки опухоли
    Контроль ЗФР ηιυΟ86-ΟΜ1 ς\ν х 2 600 мкг/кг (по ДМ1) 27.7 мг/кг (по антителу)
    24-,
    -М—г
    Контроль ЗФР
    ΠΗϊΌδό-ΏΜΙ ς\ν х 2
    600 мкг/кг (по ДМ1)
    27.7 мг/кг (по антителу) 40 50 60
    14·
    0 10 20 30 40 50 60 70
    Время (д) после прививки опухоли
    Фиг. 26
    - 88 020130
    ТОУ-21С
    с.
    Время (д) после прививки опухоли
    24-|
    - Контроль ЗФР — тиО86-ОМ1 ς\ν х 2 600 мкг/кг (по ДМ1) 27.7 мг/кг (по антителу)
    2216<205 н
    о и да
    Контроль ЗФР —— тиО86-ОМ1 ςνν х 2
    600 мкг/кг (по ДМ1) 27.7 мг/кг (по антителу) ΐ-,.Τ ,
    10 20
    14- 0 10 20 30 40 50 60 70
    Время (д) после прививки опухоли
    Фиг. 26 (продолж.)
    НРАС
    Время (д) после прививки опухоли
    Контроль ЗФР τηυΟ86-ϋΜ1 ςνν х 2 600 мкг/кг (по ДМ I) 27.7 мг/кг (по антителу)
    24η
    1816и —·- Контроль ЗФР —— ПП1В86-ОМ1 ς\ν х 2
    600 мкг/кг (по ДМ 1)
    27.7 мг/кг (по антителу)
    40 50 60
    14·
    0 10 20 30 40 50 60 70
    Время (д) после прививки опухоли
    Фиг. 26 (продолж.)
    50 60 70 — Контроль ЗФР шиО£6-ЭМ1 φν х 2
    600 мкг/кг (по ДМ.1) 27.7 мг/кг (по антителу)
    Время (д) после прививки опухоли
    Фиг. 26 (продолж.) — Контроль ЗФР тиГ36ОМ1 <ρν χ 2 600 мкг/кг (по ДМ1) 27.7 мг/кг (по антителу)
    Время (д) после прививки опухоли | = дни введения
    Фиг. 27
    - 89 020130
    Фиг. 28
    - 90 020130
    в.
    Время (д) после инокуляции
    Фиг. 30
    О Евразийская патентная организация, ЕАПВ
    Россия, 109012, Москва, Малый Черкасский пер., 2
EA200800642A 2005-08-22 2005-08-22 Специфичное к антигену са6 антитело, содержащий его цитотоксический конъюгат и способы применения конъюгата EA020130B9 (ru)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2005/030115 WO2007024222A1 (en) 2005-08-22 2005-08-22 A ca6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same

Publications (3)

Publication Number Publication Date
EA200800642A1 EA200800642A1 (ru) 2008-08-29
EA020130B1 true EA020130B1 (ru) 2014-08-29
EA020130B9 EA020130B9 (ru) 2014-10-30

Family

ID=37771883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200800642A EA020130B9 (ru) 2005-08-22 2005-08-22 Специфичное к антигену са6 антитело, содержащий его цитотоксический конъюгат и способы применения конъюгата

Country Status (13)

Country Link
EP (1) EP1917034A4 (ru)
JP (1) JP2009504193A (ru)
CN (1) CN101242855A (ru)
AU (1) AU2005335743A1 (ru)
BR (1) BRPI0520509A2 (ru)
CA (1) CA2615761A1 (ru)
EA (1) EA020130B9 (ru)
EC (1) ECSP088241A (ru)
HK (1) HK1211965A1 (ru)
IL (2) IL189628A0 (ru)
MX (1) MX2008002607A (ru)
NO (1) NO20080893L (ru)
WO (1) WO2007024222A1 (ru)

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9353150B2 (en) 2012-12-04 2016-05-31 Massachusetts Institute Of Technology Substituted pyrazino[1′,2′:1 ,5]pyrrolo[2,3-b]-indole-1,4-diones for cancer treatment
CA2900154A1 (en) * 2013-02-05 2014-08-14 Sanofi Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
US9844607B2 (en) 2013-02-05 2017-12-19 Sanofi Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
AU2014214997A1 (en) * 2013-02-05 2015-08-20 Sanofi Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
US9989524B2 (en) 2013-02-05 2018-06-05 Sanofi Immuno imaging agent for use with antibody-drug conjugate therapy
JP2016525560A (ja) * 2013-08-02 2016-08-25 サノフイ 固形腫瘍を処置するための抗−Ｍｕｃ１メイタンシノイドイムノコンジュゲート抗体の使用
MA42561A (fr) 2014-09-02 2018-04-25 Immunogen Inc Procédés de formulation de compositions de conjugués anticorps-médicament
PL3189056T3 (pl) 2014-09-03 2020-11-02 Immunogen, Inc. Cytotoksyczne pochodne benzodiazepinowe
JP2017527562A (ja) 2014-09-03 2017-09-21 イミュノジェン・インコーポレーテッド 細胞毒性ベンゾジアゼピン誘導体
JP2019501139A (ja) 2015-11-25 2019-01-17 イミュノジェン・インコーポレーテッド 医薬製剤及びその使用
US10918627B2 (en) 2016-05-11 2021-02-16 Massachusetts Institute Of Technology Convergent and enantioselective total synthesis of Communesin analogs
CN110366431B (zh) 2017-02-28 2023-07-18 伊缪诺金公司 具有自分解肽接头的类美登素衍生物和其缀合物
TW201839001A (zh) 2017-04-20 2018-11-01 美商伊繆諾金公司 細胞毒性苯并二氮平衍生物及其綴合物
US11932650B2 (en) 2017-05-11 2024-03-19 Massachusetts Institute Of Technology Potent agelastatin derivatives as modulators for cancer invasion and metastasis
US10640508B2 (en) 2017-10-13 2020-05-05 Massachusetts Institute Of Technology Diazene directed modular synthesis of compounds with quaternary carbon centers
TWI827575B (zh) 2017-12-28 2024-01-01 美商伊繆諾金公司 苯二氮平衍生物
WO2020247054A1 (en) 2019-06-05 2020-12-10 Massachusetts Institute Of Technology Compounds, conjugates, and compositions of epipolythiodiketopiperazines and polythiodiketopiperazines and uses thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6596503B1 (en) * 2000-08-18 2003-07-22 East Carolina University Monoclonal antibody DS6, tumor-associated antigen CA6, and methods of use thereof
KR101424624B1 (ko) * 2003-05-14 2014-07-31 이뮤노젠 아이엔씨 약물 콘쥬게이트 조성물
US20050123549A1 (en) * 2003-07-21 2005-06-09 Immunogen Inc. CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAYNE et al. (a) (PG PUB 20050123549 A1) 9 June 2005 (09.06 2005), Abstract and Summary of invetion in particular *
PAYNE et al. (b) (WO 2005/009369) 3 February 2005 (03.02.2005), Abstract and Summary of invetion in particular *

Also Published As

Publication number Publication date
CN101242855A (zh) 2008-08-13
EP1917034A1 (en) 2008-05-07
WO2007024222A1 (en) 2007-03-01
IL189628A0 (en) 2008-06-05
IL238798A0 (en) 2015-06-30
JP2009504193A (ja) 2009-02-05
CA2615761A1 (en) 2007-03-01
EP1917034A4 (en) 2009-04-29
ECSP088241A (es) 2008-04-28
BRPI0520509A2 (pt) 2009-05-12
EA200800642A1 (ru) 2008-08-29
MX2008002607A (es) 2008-03-19
AU2005335743A1 (en) 2007-03-01
EA020130B9 (ru) 2014-10-30
HK1211965A1 (en) 2016-06-03
NO20080893L (no) 2008-05-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA020130B1 (ru) Специфичное к антигену са6 антитело, содержащий его цитотоксический конъюгат и способы применения конъюгата
EA014640B1 (ru) Антитело или его эпитоп-связывающий фрагмент, которые связываются с гликотопом са6, и способы их применения
US9822183B2 (en) CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
EA020324B1 (ru) АНТИТЕЛА К РЕЦЕПТОРУ ЭФРИНА EphA2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
EA021600B1 (ru) Антитела к csf-1r
JP2010508043A (ja) 抗体産生を改善するための方法
AU2008361352B2 (en) Anti-extended Type I glycosphingolipid antibody, derivatives thereof and use
AU2012201260B2 (en) A CA6 antigen-specific cytotoxic conjugate and methods of using the same
CN104804094A (zh) Ca6抗原特异性细胞毒性偶联物及其应用方法
JP2012161321A (ja) Ｃａ６抗原特異的細胞傷害性コンジュゲート、および該コンジュゲートを用いる方法

Legal Events

Date Code Title Description
TH4A Publication of the corrected specification to eurasian patent
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): MD

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM