EA019514B1 - Сенсоры coрастений, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, способы их получения и применение - Google Patents

Сенсоры coрастений, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, способы их получения и применение Download PDF

Info

Publication number
EA019514B1
EA019514B1 EA200901457A EA200901457A EA019514B1 EA 019514 B1 EA019514 B1 EA 019514B1 EA 200901457 A EA200901457 A EA 200901457A EA 200901457 A EA200901457 A EA 200901457A EA 019514 B1 EA019514 B1 EA 019514B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
plant
cell
expression
nucleic acid
gene
Prior art date
Application number
EA200901457A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200901457A1 (ru
Inventor
Джулиан Шрёдер
Мария Израэлсон
Джозеф М. Кун
Инчжэнь Ян
Хонхон Ху
Орелиен Бойсон-Дерньер
Original Assignee
Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния filed Critical Те Риджентс Оф Те Юниверсити Оф Калифорния
Publication of EA200901457A1 publication Critical patent/EA200901457A1/ru
Publication of EA019514B1 publication Critical patent/EA019514B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8218—Antisense, co-suppression, viral induced gene silencing [VIGS], post-transcriptional induced gene silencing [PTGS]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/8223—Vegetative tissue-specific promoters
    • C12N15/8225—Leaf-specific, e.g. including petioles, stomata
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y402/00—Carbon-oxygen lyases (4.2)
    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01001—Carbonate dehydratase (4.2.1.1), i.e. carbonic anhydrase
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
    • Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
    • Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P60/00—Technologies relating to agriculture, livestock or agroalimentary industries
    • Y02P60/20—Reduction of greenhouse gas [GHG] emissions in agriculture, e.g. CO2

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования обменом воды и/или диоксида углерода (CO) через устьица растений посредством регуляции генов сенсоров СО. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для повышения или оптимизации накопления биомассы в растении. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для раскрывания или закрывания устьичной щели на замыкающей клетке в эпидермисе растения. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для увеличения или уменьшения эффективности оксигенации и/или фиксации углерода в замыкающей клетке в эпидермисе растения посредством манипулирования экспрессией рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксинегазы. Настоящее изобретение обеспечивает промоторы для регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты в замыкающей клетке растения.

Description

Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится, в общем, к молекулярной и клеточной биологии растений. В частности, изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования обменом воды и/или диоксида углерода (СО2) через устьица растений посредством экспрессии и регуляции генов сенсоров СО2, в том числе новых генов сенсоров СО2 этого изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает также засухоустойчивые растения и способы конструирования растений с увеличенной эффективностью использования воды и засухоустойчивых растений.
Предшествующий уровень техники
Устьичные щели в эпидермисе листьев растений способны регулировать потерю воды растений и поступление СО2 в растение из атмосферы. Диоксид углерода поглощается для фиксации фотосинтетического углерода, а вода теряется посредством процесса транспирации через эти устьичные щели. Каждое устьице устроено из специализированной пары клеток, называемых замыкающими клетками, которые могут модифицировать размер устьичной щели регуляцией тургорного состояния замыкающих клеток. Эффективность использования воды растений является важным признаком в сельском хозяйстве, в биотехнологических применениях и продуцировании биологического топлива. Эффективность использования воды определяет, насколько хорошо растение может уравновешивать потерю воды через устьица нетто-поглощением СО2 в листья для фотосинтеза и, следовательно, накоплением его биомассы. Несколько биотических и абиотических факторов влияют на состояние раскрывания устьиц, оптимизируя посредством этого эффективность использования воды растения в конкретном состоянии. Концентрация СО2 регулирует устьичные движения, причем высокие уровни СО2 будут приводить к устьичному закрыванию, а низкие уровни СО2 будут индуцировать устьичное раскрывание. Таким образом, СО2 регулирует вхождение СО2 в растение и потерю воды растения в глобальном масштабе. Однако в настоящее время не были идентифицированы сенсоры (рецепторы) СО2. Знание о рецепторах СО2, которые регулируют СО2-реакции, могло бы быть использовано для манипулирования СО2-реакцией таким образом, что эффективность использования воды во время роста растений могла бы быть усилена посредством генетической инженерии.
Каким образом растения воспринимают (распознают) уровень диоксида углерода (СО2), остается неизвестным. Сведения о том, каким образом СО2 воспринимается (ощущается) растением, могло бы быть использовано для манипулирования СО2-реакцией таким образом, что эффективность использования углерода и воды во время роста растений могла бы быть увеличена.
Фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилаза (ФЕПК; ЕС 4.1.1.31) является ключевым ферментом фотосинтеза в видах растений, обнаруживающих С4- или САМ-путь фиксации СО2. Главным субстратом ФЕПК является свободная форма ФЕП. ФЕПК катализирует превращение ФЕП и бикарбоната в неорганический фосфат щавелевоуксусной кислоты (Ρί). Эта реакция является первой стадией метаболического пути, известного как путь С4-дикарбоновых кислот, который минимизирует потери энергии, продуцируемые фотодыханием. ФЕПК присутствует в растениях, водорослях, цианобактериях и бактериях.
Фиксация углерода, или превращение СО2 в восстановленные формы, поддающиеся клеточной биохимии, происходит посредством нескольких метаболических путей в различных организмах. Наиболее известными из них являются цикл Кальвина (или цикл Кальвина-Бенсона), который присутствует в цианобактериях и их пластидных производных, таких как хлоропласты, и протеобактериях. Цикл Кальвина использует фермент Рубиско, или рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазу/оксигеназу. Рубиско существует по меньшей мере в двух формах: Рубиско формы I обнаруживается в протеобактериях, цианобактериях и пластидах, например октодимер, состоящий из восьми больших субъединиц и восьми малых субъединиц; Рубиско формы II является димерной формой этого фермента, например, обнаруженной в протеобактериях. Рубиско содержит две конкурирующие ферментативные активности: оксигеназную и карбоксилазную активности. Реакция оксигенации, катализируемая Рубиско, является расточительным процессом, так как она конкурирует с нетто-количеством фиксированного углерода и значительно уменьшает нетто-количество фиксированного углерода. Разновидности фермента Рубиско, кодируемые в разных фотосинтетических организмах, были отобраны природной эволюцией для обеспечения высших растений ферментом Рубиско, который является существенно более эффективным при карбоксилировании в присутствии атмосферного кислорода.
Сущность изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования обменом воды и/или диоксида углерода (СО2) через устьица растений посредством регуляции генов сенсоров СО2, в том числе новых генов сенсоров СО2 этого изобретения, названных генами СО28еи. Способы этого изобретения посредством контроля как СО2 воспринимается растением, могут быть использованы для манипулирования СО2-реакцией таким образом, что углерод и вода используются более (или менее) эффективно во время роста растений. Таким образом, способы этого изобретения могут быть использованы для модификации эффективности нетто-поглощения СО2 и воды в растениях манипулированием экспрессией и/или активностью генов сенсоров СО2, в том числе любого из новых генов сенсоров СО2 этого изобретения, или их любой комбинацией. Эти открытия демонстрируют потенциально жизненно важную роль генов сенсоров СО2, в том числе любого из новых генов сенсоров СО2 этого изобретения, в восприятии
- 1 019514 и/или передаче сигнала восприятия СО2 в растениях.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы манипулирования обменом воды и СО2 через устьица посредством регуляции генов сенсоров СО2, в том числе любого из новых генов сенсоров СО2 этого изобретения, в том числе повышающей или понижающей регуляции генов и/или транскриптов сенсоров СО2, включающих в себя последовательность этого изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для модификации эффективности использования неттопоглощения СО2 и воды в растениях. Настоящее изобретение обеспечивает растения, например, трансгенные растения, которые обнаруживают улучшенный рост в условиях недостатка воды; таким образом, изобретение обеспечивает засухоустойчивые растения (например, сельскохозяйственные растения). Настоящее изобретение обеспечивает способы генетического конструирования повышенной эффективности использования воды в растениях или засухоустойчивости в растениях (например, сельскохозяйственных растениях). Изобретение обеспечивает композиции и способы манипулирования накоплением биомассы и/или продуцированием биологического топлива в растении посредством регуляции одного, двух или трех новых обнаруженных генов и/или транскриптов сенсоров этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования раскрыванием или закрыванием устьичных щелей на замыкающих клетках в эпидермисе листьев растений, делая возможной посредством этого регуляцию потери воды и вхождения СО2 в растения из атмосферы. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования поглощением диоксида углерода, фотосинтетической фиксацией углерода и/или потерей воды через процесс транспирации через устьичные щели; каждое устьице устроено специализированной парой клеток, называемых замыкающими клетками, которые могут модифицировать размер устьичной щели регуляцией тургорного состояния замыкающих клеток. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования тургорным состоянием замыкающих клеток.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для увеличения продуцирования биомассы для получения биологического топлива манипулированием эффективностью использования воды растений; эффективность использования воды определяет, насколько хорошо растение может уравновешивать потерю воды через устьица нетто-поглощением СО2 для фотосинтеза и, следовательно, накоплением его биомассы.
Авторы этого изобретения идентифицировали двойной мутант и тройной мутант в АгаЫборык 1НаИапа, который лишен полноразмерной экспрессии гомологичных генов, которые экспрессируются в высокой степени в замыкающих клетках дикого типа, в соответствии с клеткоспецифическими анализами микроматриц. Двойной мутант и тройной мутант СО28еп обнаруживают нарушенную устьичную реакцию, как измерено анализом газообмена реального времени на изменения концентрации диоксида углерода ([СО2]); как в отношении изменений от 365 м.д. СО2 окружающей среды до повышенной 800 м.д. СО2, так и в отношении изменений от 800 м.д. СО2 до пониженной 100 м.д. СО2. Известно, что кодируемые СО28еп белки связывают СО2. Эти открытия демонстрируют роль нуклеиновых кислот этого изобретения, так называемых генов СО28еп, в восприятии/передаче сигнала восприятия СО2. Настоящее изобретение обеспечивает способ для контроля, как растения воспринимают СО2, обеспечивая тем самым способ получения сельскохозяйственных культур с измененной эффективностью использования углерода и воды. Таким образом, изобретение обеспечивает композиции (например, трансгенные растения) и способы для ослабления действий повышения атмосферной [СО2] на различные виды растений.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования тем, как СО2 воспринимается в растениях, и композиции и способы для регуляции получения сельскохозяйственных культур с измененной эффективностью использования воды (^ИЕ). Многие растения обнаруживают слабую реакцию устьичных движений на различные концентрации СО2. Данные, полученные с двойным мутантом этого изобретения (генов СА1/СА4), обнаруживают нарушенную устьичную реакцию на измененную [СО2], и сверхэкспрессия любого гена в замыкающих клетках разительно увеличивает эффективность использования воды растений. Эти данные демонстрируют, что сверхэкспрессия всех или одного из этих генов (например, генов СО28еп этого изобретения) индуцирует улучшенную СО2-реакцию. Таким образом, сверхэкспрессия нуклеиновых кислот этого изобретения (приводящая к сверхэкспрессии кодируемых СО28еп белков) увеличивает ^ИЕ в свете непрерывно повышающихся концентраций атмосферного СО2. Трансгенные или подвергнутые манипулированию растения (например, сельскохозяйственные культуры) этого изобретения будут закрывать их устьица до более значительной степени, чем растения дикого типа, предохраняя посредством этого их водопотребление; изобретение обеспечивает способы для сверхэкспрессии кодируемых СО28еп белков, например, инсертированием или инфицированием растений СО28еп-кодируюшцми нуклеиновыми кислотами, например плазмидами, вирусами и т.п. В результате, растения (например, сельскохозяйственные культуры) этого изобретения будут иметь более высокую эффективность использования воды и будут иметь повышенную засухоустойчивость.
Настоящее изобретение обеспечивает также композиции и способы для ингибирования экспрессии генов, транскриптов СО28еп и белков СО28еп, например, антисмысловой и/или ΒΝΑί-репрессией сенсоров СО2 в замыкающих клетках. Сельскохозяйственные культуры могут обнаруживать сильную реакцию на повышенный атмосферный СО2, так что они закрывают их устьица относительно сильно, что имеет
- 2 019514 несколько недостатков для сельскохозяйственной продукции и урожаев, например сильная СО2индуцированная реакция закрывания устьиц будет ограничивать способность этих культур фиксировать углерод для максимального роста. Пониженная экспрессия СО28еп трансгенных растений или растения с пониженной экспрессией СО28еи этого изобретения решает эту проблему открыванием их устьиц до более значительной степени, чем открывание устьиц растений дикого типа, предотвращая ограниченные урожаи при достаточной доступности воды.
Настоящее изобретение обеспечивает также композиции и способы, которые решают основную проблему, когда сельскохозяйственные культуры не могут противостоять увеличенным температурам, приводящим к разрушению метаболизма, фотосинтеза и роста: повышенный СО2 заставляет устьица закрываться, и это увеличивает температуру листа вследствие уменьшенного испарения воды (транспирации) из листьев. Таким образом, композиции и способы этого изобретения, посредством ингибирования экспрессии СО28еи-нуклеиновых кислот и/или СО28еи-белков, помогают сельскохозяйственным культурам, которые в противном случае были бы чувствительными к повышенным температурам, справляться с увеличенными атмосферными концентрациями СО2, уменьшая или ослабляя также ускоренное увеличение температур листьев. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы, использующие антисмысловую РНК и ΡΝΛί (интерференции РНК) для репрессии сенсоров СО2 в замыкающих клетках. В одном аспекте, промотор замыкающей клетки обеспечивает средство для уменьшения температуры листьев через усиление транспирации в этих сельскохозяйственных культурах, а также для максимизации урожайности.
Композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для манипулирования способами восприятия СО2 растениями, и, следовательно, применение на практике этого изобретения может способствовать получению сельскохозяйственных культур с измененной и улучшенной эффективностью использования углерода и воды. Применение на практике этого изобретения улучшает также предсказания действий увеличивающихся концентраций атмосферного СО2 на разные виды растений. Настоящее изобретение демонстрирует также жизненно важную роль идентифицированных генов СО28еи в восприятии/передаче сигнала восприятия СО2. Композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для манипулирования ростом растений, например, манипулированием способа восприятия СО2 в растении, и композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для манипулирования реакцией СО2 растений, так что эффективность использования углерода и воды во время роста растения увеличивается.
Здесь обеспечены также наборы, содержащие нуклеиновые кислоты и/или белки этого изобретения и инструкции для их получения и применения и инструкции для применения на практике обеспеченных здесь способов.
Настоящее изобретение обеспечивает выделенные, синтетические или рекомбинантные нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), содержащие:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), кодирующую 8ЕЦ ΙΌ NО:3, 8ЕЦ ΙΌ NО:6 или 8ЕЦ ΙΌ NО:9, или их функциональные фрагменты, где этот функциональный фрагмент имеет активность белка СО28еи (сенсора СО2), карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность;
(b) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), имеющую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную идентичность последовательности с 8ЕЦ ΙΌ NО:1, 8ЕЦ ΙΌ ΝΘ:2, 8ЕО ΙΌ ^:4, 8ЕО ΙΌ ^:5, 8ЕО ΙΌ ^:7, 8ЕО ΙΌ ^:8, 8ЕО ΙΌ ^:20, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:21, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:22, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:23, 8ЕО ΙΌ ^:24, 8ЕО ΙΌ ^:25, 8ЕО ΙΌ ^:26, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:28, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:29, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:30, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:31, 8ЕО ΙΌ ΝΘ:32, 8ЕО ΙΌ ^:33, 8ЕО ΙΌ ^:34 и/или 8ЕО ΙΌ ^:35, на протяжении района по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 или более остатков, или на протяжении полной длины кодирующей белок последовательности (транскрипта) или гена, где эта нуклеиновая кислота кодирует:
(ί) белок СО28еи (сенсор СО2), который имеет активность белка СО28еи (сенсора СО2), (ίί) полипептид, имеющий карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или βкарбоангидразную активность; или (ш) полипептид или пептид, способный генерировать антитело, которое связывается специфически с полипептидом, имеющим последовательность 8ЕЦ ΙΌ NО:3, 8ЕЦ ΙΌ NО:6 и/или 8ЕЦ ΙΌ NО:9;
(c) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), кодирующую функциональный фрагмент белка, кодируемого нуклеиновой кислотой (Ь), где этот функциональный фрагмент имеет активность белка СО28еп (сенсора СО2) или карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность;
(ά) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), имеющую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную идентичность последовательности с 8ЕЦ ΙΌ NО:10 и/или 8ЕЦ
- 3 019514
ΙΌ N0:11, на протяжении района по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850 или более остатков, или на протяжении полной длины промотора, имеющего специфическую для замыкающих клеток активность, или регуляторного района транскрипции, имеющего специфическую для замыкающих клеток активность, где эта нуклеиновая кислота содержит специфический для замыкающих клеток промотор или специфический для замыкающих клеток регуляторный район транскрипции или состоит из специфического для замыкающих клеток промотора или специфического для замыкающих клеток регуляторного района транскрипции;
(е) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид) (Ь) или (б), где идентичность последовательности рассчитывают с использованием алгоритма сравнения последовательностей, состоящего из алгоритма ВЬА8Т уегаюп 2.2.2, где фильтрующее значение параметра устанавливают на Ь1айа11-р Ь1айр-б пг ра!аа -Р Р, а все другие опции устанавливают по умолчанию;
(I) последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), которая гибридизуется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей:
(ί) 8ЕО ΙΌ N0:1, 8ЕО ΙΌ N0:2, 8ЕО ΙΌ N0:4, 8ЕО ΙΌ N0:5, 8ЕО ΙΌ N0:7, 8ЕО ΙΌ N0:8, 8ЕО ΙΌ N0:20, 8ЕО ΙΌ N0:21, 8ЕО ΙΌ N0:22, 8ЕО ΙΌ N0:23, 8ЕО ΙΌ N0:24, 8ЕО ΙΌ N0:25, 8ЕО ΙΌ N0:26, 8ЕО ΙΌ N0:28, 8ЕО ΙΌ N0:29, 8ЕО ΙΌ N0:30, 8ЕО ΙΌ N0:31, 8ЕО ΙΌ N0:32, 8ЕО ΙΌ N0:33, 8ЕО ΙΌ N0:34 и/или 8Е0 ΙΌ N0:35, где эта нуклеиновая кислота кодирует (A) белок С028еп (сенсор СО2), который имеет активность белка С028Сп (сенсора СО2), или (B) полипептид, имеющий карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или βкарбоангидразную активность;
(ίί) 8Е0 ΙΌ N0:10 или 8Е0 ΙΌ N0:11, где эта нуклеиновая кислота имеет специфическую для замыкающих клеток промоторную активность или специфическую для замыкающих клеток регуляторную активность транскрипции;
и эти строгие условия включают в себя стадию промывки, включающую в себя промывку в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин;
(д) нуклеиновую кислоту (ί), где эта нуклеиновая кислота имеет длину по меньшей мере приблизительно 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 или более остатков или полную длину кодирующего белок района или гена, или промотора или регуляторного района транскрипции; или (II) нуклеиновую кислоту (полинуклеотид), полностью комплементарную любой из (а)-(д).
Настоящее изобретение обеспечивает антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие:
(a) последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную последовательности этого изобретения или способную гибридизоваться при строгих условиях с последовательностью этого изобретения, или ее субпоследовательность; или (b) антисмысловой олигонуклеотид (а), где этот антисмысловой олигонуклеотид имеет длину приблизительно 10-50, приблизительно 20-60, приблизительно 30-70, приблизительно 40-80 или приблизительно 60-100 оснований.
Настоящее изобретение обеспечивает способы ингибирования или уменьшения трансляции кодирующего белок С028еп (сенсор СО2) мессенджера (мРНК, или первичного транскрипта) в клетке или растении или в растении или части растения, предусматривающие введение в эту клетку или в растение, или часть растения, или экспрессию в этой клетке, или в растении или части растения, антисмыслового олигонуклеотида, содержащего (а) нуклеиновую кислоту этого изобретения; или (Ь) последовательность нуклеиновой кислоты, комплементарную нуклеиновой кислоте этого изобретения или способную гибридизоваться при строгих условиях с нуклеиновой кислотой этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает:
(a) двухцепочечные ингибирующие молекулы РНК (КНА1), содержащие субпоследовательность нуклеиновой кислоты этого изобретения;
(b) двухцепочечную ингибирующую молекулу РНК (КНА1) (а), где этой двухцепочечной ингибирующей РНК является молекула аКИА или тЖИА, или (c) двухцепочечную ингибирующую молекулу РНК (КНА1) (а) или (Ь), имеющую длину приблизительно 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов.
Настоящее изобретение обеспечивает способы ингибирования или уменьшения экспрессии белка С028еп (сенсора СО2) и/или мессенджера (мРНК, или первичного транскрпита) С028еп в клетке, или растении или части растения, предусматривающие введение в эту клетку, или в растение или часть растения, или экспрессию в этой клетке, или в растении или части растения: (а) двухцепочечной ингибирующей молекулы РНК (РКА1) этого изобретения или (Ь) двухцепочечной ингибирующей молекулы РНК (ЖИА), где эта РНК содержит субпоследовательность последовательности нуклеиновой кислоты этого изобретения, где в одном аспекте эта РКА1 является молекулой кЖНА или ттККА.
Настоящее изобретение обеспечивает:
(а) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому, содержащие нуклеиновую кислоту (последовательность) этого изобретения;
- 4 019514 (b) экспрессионную кассету, плазмиду, вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому (а), где нуклеиновая кислота этого изобретения содержит (или состоит из нее) кодирующую белок СО28еп (сенсор СО2) последовательность, и эта кодирующая белок последовательность функционально связана с промотором или регуляторным районом транскрипции;
(c) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому (Ь), где этот промотор является специфическим для замыкающих клеток промотором или специфическим для замыкающих клеток регуляторным районом транскрипции;
(ά) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому (с), где нуклеиновая кислота этого изобретения содержит (или состоит из него) специфический для замыкающих клеток промотор или специфический для замыкающих клеток регуляторный район транскрипции, и этот промотор функционально связан с кодирующей белок последовательностью;
(е) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому (ά), где эта кодирующая белок последовательность кодирует полипептид, имеющий карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность;
(ί) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому (Ь), где этот промотор или регуляторный район транскрипции содержит конститутивный промотор или регуляторный район транскрипции, тканеспецифический промотор или регуляторный район транскрипции, индуцибельный промотор или регуляторный район транскрипции, молчащий промотор, СО2-воспринимающий промотор;
(д) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому любого из (а)-(П), где этот рекомбинантный вирус является вирусом растения или этот вектор является вектором растения; или (й) экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому любого из (а)-(д), где этот промотор содержит промоторную последовательность или регуляторный район транскрипции 8ЕС Ш N0:10 или 8ЕС Ш N0:11, или их функциональные (регулирующие транскрипцию) субпоследовательности.
Настоящее изобретение обеспечивает:
(a) трансдуцированную или трансформированную клетку, содержащую экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому этого изобретения или нуклеиновую кислоту (последовательность) этого изобретения;
(b) трансдуцированную или трансформированную клетку (а), где эта клетка является бактериальной клеткой, клеткой млекопитающего, грибной клеткой, дрожжевой клеткой, клеткой насекомого или клеткой растения;
(c) трансдуцированную или трансформированную клетку (а), где эта клетка является замыкающей клеткой растения.
Настоящее изобретение обеспечивает:
(a) растение, клетку растения, орган растения, лист растения, плод или семя растения, содержащие экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому этого изобретения, или нуклеиновую кислоту (последовательность) этого изобретения;
(b) растение, клетку растения, орган растения, лист растения, плод или семя растения (а), где это растение является одним из указанных ниже растений или клетка растения, орган растения, лист растения, плод или семя растения получены из: (ί) двудольного или однодольного растения; (и) пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, сорго, маиса (кукурузы), табака, бобового растения, люпинов, картофеля, сахарной свеклы, гороха, фасоли, сои, крестоцветного растения, цветной капусты, рапса (или турнепса или канолы), тростника (сахарного тростника), льна, хлопчатника, пальмы, сахарной свеклы, арахиса, дерева, тополя, люпина, хлопкового дерева (капока), пустынной ивы, креозотного кустарника, терескена шерстистого, бальзы, рами, кенафа, конопли, розеллы, джута или абаки (банана текстильного); или (с) вида из родов Апасагбтт, Агасй1к, Акрагадик, А1тора, Ауепа, Вгаккюа, Сйтик, Сйти11ик, Саркюит, Саййатик, Сосок, Сойеа, Сисит1к, СисигЬйа, Паисик, Е1ае1к, Егадапа, С1усше, Соккуртт, НейаШйик, Не1егосаШк, Ногбеит, Нуоксуатик, Ьас1иса, Ыпит, Ьо1шт, Ьиршик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МашйоЕ Ма_)огапа, Мебюадо, Мсойапа, 01еа, Огу/а, Ратеит, РапткеШт, Регкеа, Рйакео1ик, Р1к1асй1а, Р1кит, Ругик, Ргипик, Варйапик, Вюшик, 8еса1е, 8епесю, 8шар1к, 8о1агшт, Зогдйит, ТйеоЬготик, Тпдопе11а, ТгШсит, Ую1а, УШк, У1дпа или 2еа.
Настоящее изобретение обеспечивает:
(a) трансгенные растение, клетку растения, часть растения, лист растения, орган растения, плод или семя растения, содержащие гетерологичную нуклеиновую кислоту, где эта гетерологичная нуклеиновая кислота содержит нуклеиновую кислоту (последовательность) этого изобретения или экспрессионную кассету, плазмиду, вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому этого изобретения;
(b) трансгенные растение, клетку растения, часть растения, лист растения, орган растения, плод или семя растения (а), где эта клетка растения является замыкающей клеткой растения; или (c) трансгенные растение, клетку растения, часть растения, лист растения, орган растения, плод или семя растения (а), где это растение является одним из указанных ниже растений или клетка растения,
- 5 019514 орган растения, лист растения, плод или семя растения получены из: (1) двудольного или однодольного растения; (ίί) пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, сорго, маиса (кукурузы), табака, бобового растения, люпинов, картофеля, сахарной свеклы, гороха, фасоли, сои, крестоцветного растения, цветной капусты, рапса (или турнепса или канолы), тростника (сахарного тростника), льна, хлопчатника, пальмы, сахарной свеклы, арахиса, дерева, тополя, люпина, хлопкового дерева (капока), пустынной ивы, креозотного кустарника, терескена шерстистого, бальзы, рами, кенафа, конопли, розеллы, джута или абаки (банана текстильного); или (с) вида из родов Лиасагбшш, ЛтасЫк, Лкрагадик, Л1гора. Луепа, Втаккюа, Сйтик, Сйти11ик, Саркюит, Саййатик, Сосок, Сойеа, Сисит1к, СисигЬйа, Баисик, Е1ае1к, Етадапа, 61усше, Соккуршт, НейапШик, Не1егосаШк, Ногбеиш, Нуоксуатик, БасШса, Ьшит, Бойит, Бир1пик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МапШоЕ М/огама, МеШсадо, Мсойапа, О1еа, Огу/а, Рашеит, РапткеЩт, Регкеа, Рйакео1ик, РМасЫа, Р1кит, Ругик, Ргипик, Еарйапик, Шсшик, 8еса1е, 8епесю, 8шар1к, 8о1агшт, Зогдйит, ТйеоЬготик, ТгфопеПа, Ттйюит, Ук1а, УШк, Ущпа или 2еа.
Настоящее изобретение обеспечивает выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды, содержащие:
(a) аминокислотную последовательность, содержащую последовательность 8ЕО ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:6 или 8Е0 ГО N0:9, или ее функциональные фрагменты, где этот функциональный фрагмент имеет активность белка СО28еп (сенсора СО2) или карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность;
(b) аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полную идентичность аминокислотной последовательности с 8Е0 ГО N0:3, 8Е0 ГО N0:6 и/или 8Е0 ГО N0:9, на протяжении района по меньшей мере из приблизительно 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 или более остатков или на протяжении полной длины этого полипептида, где этот полипептид имеет активность белка С028еп (сенсора СО2) или карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность, или этот полипептид способен генерировать антитело, которое связывается специфически с полипептидом, имеющим последовательность 8ЕС) ГО N0:3, 8ЕО ГО N0:6 и/или 8ЕО ГО N0:9;
(c) функциональный фрагмент полипептида (Ь), где этот функциональный фрагмент имеет активность белка С028еп (сенсора СО2) или карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или βкарбоангидразную активность;
(ά) полипептид (Ь), где эту идентичность последовательности рассчитывают с использованием алгоритма сравнения последовательностей, состоящего из алгоритма ВБА8Т уеткюп 2.2.2, где фильтрующее значение параметра устанавливают на Ь1ак1а11-р Ь1ак!р-б пг ра!аа -Ε Е, а все другие опции устанавливают по умолчанию;
(е) полипептид по любому из (а)-(б), имеющий по меньшей мере одну консервативную аминокислотную замену и сохраняющий его активность белка С028еп (сенсора СО2) или карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность;
(ί) полипептид (е), где эта по меньшей мере одна консервативная аминокислотная замена содержит замену одной аминокислоты другой аминокислотой со сходными характеристиками; или консервативная замена содержит замену одной алифатической аминокислоты другой алифатической аминокислотой; замену серина треонином или уюе уетка (наоборот); замену одного кислотного остатка другим кислотным остатком; замену одного остатка, несущего амидную группу, другим остатком, несущим амидную группу; замену одного основного остатка другим основным остатком или замену одного ароматического остатка другим ароматическим остатком;
(д) полипептид по любому из (а)-(£), дополнительно содержащий гетерологичную аминокислотную последовательность.
Настоящее изобретение обеспечивает:
(a) трансгенные растение, клетку растения, часть растения, лист растения, орган растения, плод или семя растения, содержащие гетерологичный или синтетический полипептид, содержащие полипептид этого изобретения;
(b) трансгенные растение, клетку растения, часть растения, лист растения, орган растения, плод или семя растения (а), где эта клетка растения является замыкающей клеткой растения; или (c) трансгенные растение, клетку растения, часть растения, лист растения, орган растения, плод или семя растения (а), где это растение является одним из указанных ниже растений или клетка растения, орган растения, лист растения, плод или семя растения выделены или получены из: (ί) двудольного или однодольного растения; (ίί) пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, сорго, маиса (кукурузы), табака, бобового растения, люпинов, картофеля, сахарной свеклы, гороха, фасоли, сои, крестоцветного растения, цветной капусты, рапса (или турнепса или канолы), тростника (сахарного тростника), льна, хлопчатника, пальмы, сахарной свеклы, арахиса, дерева, тополя, люпина, хлопкового дерева (капока), пустынной ивы, креозотного кустарника, терескена шерстистого, бальзы, рами, кенафа, конопли, розеллы, джута или абаки (банана текстильного); или (с) вида из родов Лпасатбшт, АгасЫк, Лкрагадик, А1гора, Луепа, Втаккюа, Сйтик,
- 6 019514
Сйти11ик, Саркюит, СайВатик, Сосок, СоГГеа. Сиситщ СисигЬйа, Оанснк. Е1ае1к, Етадапа, С1усте, Соккурнни. НеВапНик, Не1егосаШк. Ногбеит, Нуоксуатик, Ьас1иса. Ьтит, Ьо1шт, Ьиршик, Ьусорегккоп, Ма1ик, МашВо!, Ма)огапа. Мебюадо, Мсойапа, О1еа, Огуха. Рашеит, РапшкеШт. Регкеа, РВакео1ик, Р1к1асЫа, Р1кит, Ругик, Ргипик, КарВапик, Шстик, 8еса1е, 8епесю, 8тар1к, 8о1апит, ЗотдВит, ТВеоЬготик, Тпдопе11а, ТпВсшп. УШа. УШк, У1дпа или 2еа.
Настоящее изобретение обеспечивает препарат белка, содержащий полипептид этого изобретения, где этот препарат белка содержит жидкость, твердое вещество или гель.
Настоящее изобретение обеспечивает иммобилизованный белок или иммобилизованный полинуклеотид, где этот белок содержит полипептид этого изобретения, а этот полинуклеотид содержит нуклеиновую кислоту этого изобретения, причем в одном аспекте этот белок или полинуклеотид иммобилизован на древесном чипе (микропроцессоре), бумаге, ячейке, металле, смоле, полимере, керамике, стекле, микроэлектроде, графитной частице, грануле, планшете, матрице или капиллярной трубке.
Настоящее изобретение обеспечивает выделенное, синтетическое или рекомбинантное антитело, которое специфически связывается с полипептидом этого изобретения, причем в одном аспекте это антитело является моноклональным или поликлональным антителом или одноцепочечным антителом.
Настоящее изобретение обеспечивает гибридому, содержащую антитело этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает матрицу, содержащую иммобилизованный белок или иммобилизованный полинуклеотид этого изобретения или антитело этого изобретения или их комбинацию.
Настоящее изобретение обеспечивает способ получения рекомбинантного полипептида, предусматривающий стадии: (а) обеспечения нуклеиновой кислоты, функционально связанной с промотором, где эта нуклеиновая кислота содержит последовательность нуклеиновой кислоты этого изобретения; и (Ь) экспрессии нуклеиновой кислоты стадии (а) при условиях, которые позволяют экспрессию этого полипептида, с получением посредством этого рекомбинантного полипептида, и в одном аспекте этот способ дополнительно предусматривает трансформацию клетки-хозяина нуклеиновой кислотой стадии (а) с последующей экспрессией нуклеиновой кислоты стадии (а), с получением посредством этого рекомбинантного полипептида в трансформированной клетке.
Настоящее изобретение обеспечивает способ ферментативного катализа превращения диоксида углерода в бикарбонат и протоны, предусматривающий контактирование полипептида этого изобретения или полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой этого изобретения, с диоксидом углерода при условиях, позволяющих ферментативный катализ превращения диоксида углерода в бикарбонат и протоны.
Настоящее изобретение обеспечивает способы понижающей регуляции или уменьшения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие:
(А) (а) обеспечение:
(ί) экспрессирующей белок СО28еп (сенсор СО2) нуклеиновой кислоты и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еп;
(ίί) нуклеиновой кислоты или гена СО28еп (ί), где эта экспрессирующая белок нуклеиновая кислота или ген или транскрипт (мРНК) СО28еп содержит последовательность этого изобретения, и/или экспрессирующую белок нуклеиновую кислоту, и/или белок СО28еп содержит аминокислотную последовательность этого изобретения;
(ш) полипептида, имеющего карбоангидразную (СА) активность или β-карбоангидразную активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид СА;
(ίν) нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид СА, где эта нуклеиновая кислота содержит 8ΕΟ ΙΌ ЫО:1, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:2, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:4, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:5, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:7, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:8, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:20, 8ΕΕ) ΙΌ ΝΘ:21, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:22, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:23, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:24, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:25, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:26, 8ΕΕ) ΙΌ ЫО:28, 8ΕΕ) ΙΌ ^:29, 8ΕΕ) ΙΌ ^:30, 8ΕΕ) ΙΌ ^:31, 8ΕΕ) ΙΌ ^:32, 8ΕΕ) ΙΌ ^:33, 8ΕΕ) ΙΌ ^:34 апб/ог 8ΕΕ) ΙΌ ^:35;
(ν) антисмысловой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты, ингибирующей экспрессию кодирующей полипептид ФЕПК нуклеиновой кислоты; и/или (νί) способа (ν), где эта антисмысловая или ингибирующая нуклеиновая кислота нацелены на кодирующую полипептид фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазу (или ФЕП-карбоксилазу, или ФЕПК) нуклеиновую кислоту, содержащую 8Εβ ΙΌ NО:12, 8Εβ ΙΌ NО:13, 8Εβ ΙΌ NО:14 и/или 8Εβ ΙΌ NО:15; и (Ь) (ί) экспрессии или сверхэкспрессии нуклеиновой кислоты или гена (а), или экспрессирующей белок СО28еп (сенсор СО2) нуклеиновой кислоты и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еп, и/или экспрессирующей карбоангидразу или β-карбоангидразу нуклеиновой кислоты, в замыкающей клетке, или (ίί) экспрессии антисмысловой нуклеиновой кислоты или нуклеиновой кислоты, ингибирующей экспрессию кодирующей полипептид ФЕПК нуклеиновой кислоты, в замыкающей клетке, или (ш) контактирования этой замыкающей клетки с полипептидом, имеющим карбоангидразную активность, с повышающей регуляцией или увеличением посредством этого обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке;
- 7 019514 (B) способ по (А), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(C) способ по (А) или (В), где это растение характеризуется регулируемым СО2-обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или это растение характеризуется регулируемым водным обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или (Ό) способ по любому из (А)-(С), где эта антисмысловая нуклеиновая кислота или нуклеиновая кислота, ингибирующая экспрессию кодирующей полипептид ФЕПК нуклеиновой кислоты, содержит ιηίΚΝΛ или δίΚΝΆ или антисмысловой олигонуклеотид.
Настоящее изобретение обеспечивает способы для повышающей регуляции или увеличения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие:
(A) (а) обеспечение:
(ί) нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно гена или транскрипта (мРНК) СО28еп или иным образом ингибирующей экспрессию гена или транскрипта (мРНК) С(=О), где этот ген или транскрипт (мРНК) СО28еп содержит последовательность этого изобретения, и/или последовательность, кодирующую белок СО28еп этого изобретения;
(ίί) нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения, или иным образом ингибирующей нуклеиновую кислоту, кодирующую карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения;
(ίίί) экспрессирующей белок фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазу (или ФЕП-карбоксилазу или ФЕПК) нуклеиновой кислоты и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК и/или (ίν) полипептида фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазы (или ФЕП-карбоксилазы или ФЕПК); и (Ь) (ί) экспрессии этой антисмысловой или ингибирующей нуклеиновой кислоты в замыкающей клетке или (ίί) экспрессии экспрессирующей белок ФЕПК нуклеиновой кислоты и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК в этой замыкающей клетке, или (ίίί) контактирования этой замыкающей клетки с полипептидом, имеющим ФЕПК-активность, с повышающей регуляцией или увеличением обмена диоксида углерода и/или воды посредством этого в замыкающей клетке;
(B) способ (А), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(C) способ по (А) или (В), где это растение характеризуется регулируемым СО2-обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или это растение характеризуется регулируемым водным обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или (Ό) способ по (А), (В) или (С), где эта нуклеиновая кислота, антисмысловая или иным образом ингибирующая экспрессию гена или транскрипта (мРНК) СОЧеп. или антисмысловая или иным образом ингибирующая экспрессию карбоангидразы (СА) или β-карбоангидразы, содержит антисмысловой олигонуклеотид этого изобретения или двухцепочечную ингибирующую молекулу РНК (ΚΝΆί) этого изобретения ιηίΚΝΛ или δίΚΝΆ.
Настоящее изобретение обеспечивает способы для регуляции водного обмена в растении, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие:
(A) сверхэкспрессию или недостаточную экспрессию в растении, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения:
(ΐ) белка СО28еп (сенсора СО2) и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еп, где этот ген или транскрипт (мРНК) СО28еп содержит последовательность этого изобретения, и/или белок СО28еп содержит аминокислотную последовательность этого изобретения, или (ίί) полипептида, имеющего карбоангидразную (СА) активность или β-карбоангидразную активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид карбоангидразу; или (ш) полипептида, имеющего фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазную (или ФЕП-карбоксилазную, или ФЕПК) активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид ФЕПК; или (ίν) полипептида, имеющего рибулозо-1,5-бисфофаткарбоксилазную/оксигеназную или Рубискоактивность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид Рубиско, с регуляцией посредством этого водного обмена (понижающей регуляцией или уменьшением водного обмена сверхэкспрессией белка СО28еп или СА или повышающей регуляцией или увеличением водного обмена недостаточной экспрессией белка СО28еп или СА) в растении, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения;
(B) способ (А), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением,
- 8 019514 трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(С) способ по (А) или (В), где это растение характеризуется регулируемым СО2-обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или это растение характеризуется регулируемым водным обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2; или (Ό) способ по любому из (А)-(С), где сверхэкспрессия или увеличенная экспрессия или недостаточная экспрессия или ингибирование имеют место в замыкающей клетке растения; или (Е) способ по любому из (Α)-(Ό), где сверхэкспрессия белка СО28еи (сенсора СО2) или карбоангидразы или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи или карбоангидразы уменьшает водный обмен, а недостаточная экспрессия или ингибирование экспрессии белка СО28еи (сенсора СО2) или карбоангидразы или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи или карбоангидразы увеличивает водный обмен; или (Е) способ по любому из (Α)-(Ό), где недостаточная экспрессия или ингибирование экспрессии белка ФЕПК и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК уменьшает водный обмен, или сверхэкспрессия белка ФЕПК и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК увеличивает водный обмен.
Настоящее изобретение обеспечивает способы регуляции поглощения воды или потери воды в растении, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие сверхэкспрессию или недостаточную экспрессию в растении, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения:
(A) (ί) белка СО28еи (сенсора СО2) и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи, где этот ген или транскрипт (мРНК) СО28еи содержит последовательность этого изобретения, и/или белок СО28еи содержит аминокислотную последовательность этого изобретения, или (ίί) полипептида, имеющего карбоангидразную (СА) активность или β-карбоангидразную активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид; или (ш) полипептида, имеющего фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазную (или ФЕП-карбоксилазную, или ФЕПК) активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид ФЕПК; или (ίν) полипептида, имеющего рибулозо-1,5-бисфофаткарбоксилазную/оксигеназную или Рубискоактивность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид Рубиско, с регуляцией посредством этого поглощения воды или потери воды (понижающей регуляцией поглощения воды, или вызыванием консервации воды, сверхэкспрессией белка СО28еи или СА или повышающей регуляцией водного обмена или увеличением потери воды недостаточной экспрессией белка СО28еи или СА) в растении, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения;
(B) способ (А), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(C) способ по (А) или (В), где это растение характеризуется регулируемым СО2-обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или это растение характеризуется регулируемым водным обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2; или (Ό) способ по любому из (А)-(С), где сверхэкспрессия или увеличенная экспрессия, или недостаточная экспрессия, или ингибирование имеют место в замыкающей клетке растения; или (Е) способ по любому из (А)-(Э). где сверхэкспрессия белка СО28еи (сенсора СО2) или карбоангидразы или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи или карбоангидразы уменьшает потерю воды, а недостаточная экспрессия или ингибирование экспрессии белка СО28еи (сенсора СО2) и/или карбоангидразы или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи или карбоангидразы увеличивает потерю воды; или (Е) способ по любому из (А)-(О), где недостаточная экспрессия или ингибирование экспрессии белка ФЕПК и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК уменьшает потерю воды, или сверхэкспрессия белка ФЕПК и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК увеличивает потерю воды.
Настоящее изобретение обеспечивает способы получения растения с повышенной эффективностью использования воды (^ИЕ), или засухоустойчивого растения, предусматривающие:
(А) сверхэкспрессию или увеличение экспрессии:
(ί) белка СО28еи (сенсора СО2) и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи, где этот ген или транскрипт (мРНК) СО28еи содержит последовательность этого изобретения, и/или белок СО28еи содержит аминокислотную последовательность этого изобретения, или (ίί) полипептида, имеющего карбоангидразную (СА) активность или β-карбоангидразную активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид; или (ш) полипептида, имеющего фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазную (или ФЕП-карбоксилазную, или ФЕПК) активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид ФЕПК; или (ίν) полипептида, имеющего рибулозо-1,5-бисфофаткарбоксилазную/оксигеназную или Рубиско
- 9 019514 активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид Рубиско, с получением посредством этого растения с повышенной эффективностью использования воды (^ИЕ), или засухоустойчивого растения;
(B) способ (А), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(C) способ по (А) или (В), где эта сверхэкспрессия или увеличенная экспрессия имеет место в замыкающей клетке растения; или (Ό) способ по любому из (А)-(С), где сверхэкспрессия белка СО28еи (сенсора СО2) или карбоангидразы или гена и/или транскрипта (мРНК) СО28еи или карбоангидразы повышает эффективность использования воды (^ИЕ), или повышает засухоустойчивость, а недостаточная экспрессия или ингибирование экспрессии белка СО28еи (сенсора СО2) или карбоангидразы и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи или карбоангидразы увеличивает потерю воды или уменьшает ^ИЕ; или (Е) способ по любому из (А)-(С), где недостаточная экспрессия или ингибирование экспрессии белка ФЕПК и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК повышает эффективность использования воды (^ИЕ), или повышает засухоустойчивость, или сверхэкспрессия белка ФЕПК и/или гена или транскрипта (мРНК) ФЕПК увеличивает потерю воды или уменьшает ^ИЕ.
Настоящее изобретение обеспечивает растение, часть растения, орган, лист или семя растения (а) полученные при помощи процесса, включающего в себя способ этого изобретения; или (Ь) полученные при помощи процесса, включающего в себя способ этого изобретения, где это растений выделено и/или получено из: (ί) двудольного или однодольного растения; (и) пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, сорго, маиса (кукурузы), табака, бобового растения, люпинов, картофеля, сахарной свеклы, гороха, фасоли, сои, крестоцветного растения, цветной капусты, рапса (или турнепса или канолы), тростника (сахарного тростника), льна, хлопчатника, пальмы, сахарной свеклы, арахиса, дерева, тополя, люпина, хлопкового дерева (капока), пустынной ивы, креозотного кустарника, терескена шерстистого, бальзы, рами, кенафа, конопли, розеллы, джута или абаки (банана текстильного); или (с) вида из родов Аиасатбшт, АтасЫк, Акрагадик, А1тора, Ауеиа, Втаккюа, Сйтик, Сйти11ик, Сарысит, СаПЕатик, Сосок, СоГГеа, Сисит1к, СисигЬйа, Эанснк. Е1ае1к, Етадапа, 61усше, Соккуршт, НеНаиШик, Не1етосаШк, Ногбеит, Нуоксуатик, Ьас1иса, Ьтит, Ьо1шт, Еиртик, Ьусорегкюои, Ма1ик, Машйо!, Мфогапа, Меб1садо, Мсобапа, О1еа, Огуха, Рашеит, РаишкеШт, Регкеа, Рйакео1ик, РШасЫа, Р1кит, Ругик, Ргипик, Карйаиик, Ктстик, 8еса1е, 8еиесю, 81иар1к, 8о1агшт, Зогдйит, ТйеоЬготик, Тпдоие11а, ТпЦсит, Ую1а, УШк, У1диа или 2еа.
Настоящее изобретение обеспечивает способы получения теплостойкого растения, имеющего недостаточную экспрессию белка СО28еи и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еи, или карбоангидразы (СА) в клетке или клетках растения, причем этот способ предусматривает:
(A) (а) обеспечение:
(ί) нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно гена или транскрипта (мРНК) СО28еи или иным образом ингибирующей экспрессию гена или транскрипта (мРНК) СО28еи, где этот ген или транскрипт (мРНК) СО28еи содержит последовательность этого изобретения, и/или последовательность, кодирующую белок СО28еи этого изобретения;
(ίί) нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения, или иным образом ингибирующей нуклеиновую кислоту, кодирующую карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения;
(ш) нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазу (или ФЕПкарбоксилазу, или ФЕПК), и (Ь) экспрессию антисмысловой или ингибирующей СО28еи или СА нуклеиновой кислоты в замыкающей клетке и/или экспрессию ФЕПК-кодирующей нуклеиновой кислоты, с получением посредством этого теплостойкого растения повышающей регуляцией или увеличением обмена диоксида углерода и/или водного обмена в клетке или клетках растения;
(B) способ (А), где эта клетка является замыкающей клеткой растения;
(C) способ (А) или (В), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(Ό) способ по любому из (А)-(С), где это растение характеризуется регулируемым СО2-обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или это растение характеризуется регулируемым водным обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2; или (Е) способ по любому из (А)-(О), где эта нуклеиновая кислота, антисмысловая или иным образом ингибирующая экспрессию гена или транскрипта (мРНК) СО28еи, или антисмысловая или иным образом ингибирующая экспрессию карбоангидразы (СА) или β-карбоангидразы, содержит антисмысловой оли
- 10 019514 гонуклеотид этого изобретения или двухцепочечную ингибирующую молекулу РНК (ΒΝΑί) этого изобретения или πιίΒΝΑ или κίΚ,ΝΑ.
Настоящее изобретение обеспечивает растение, часть растения, орган, лист или семя растения (а), полученные при помощи процесса, включающего в себя способ этого изобретения; или (Ь) полученные при помощи процесса, включающего в себя способ этого изобретения: где это растение выделено и/или получено из: (1) двудольного или однодольного растения; (ίί) пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, сорго, маиса (кукурузы), табака, бобового растения, люпинов, картофеля, сахарной свеклы, гороха, фасоли, сои, крестоцветного растения, цветной капусты, рапса (или турнепса или канолы), тростника (сахарного тростника), льна, хлопчатника, пальмы, сахарной свеклы, арахиса, дерева, тополя, люпина, хлопкового дерева (капока), пустынной ивы, креозотного кустарника, терескена шерстистого, бальзы, рами, кенафа, конопли, розеллы, джута или абаки (банана текстильного); или (с) вида из родов Апасатйшш, АтасЫк, Акрагадик, АГтора, Ауепа, Втаккюа, Сйтик, Сйгийик, Саркюиш, СатЙатик, Сосок, СоГГеа, Сисшшк, СисигЬйа, Эанснк, Е1ае1к, Етадапа, О1усше, Ооккуршш, НейапШик, Не!етоса1йк, Нотйеит, Нуоксуатик, Ьас!иса, Ьтит, Ьойит, Ьиртик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, Машйо!, Мфогапа, Мейюадо, Мсобапа, О1еа, Огуха, Рашеит, РапшкеФт, Регкеа, Рйакео1ик, Р1к!асй1а, Р1кит, Ругик, Ргипик, Варйапик, Вютик, Зеса1е, Зепесю, 8тарщ, 8о1агшт, Зогдйит, ТйеоЬготик, ТпдопеПа, ТгШсиш, Ую1а, УШк, У1дпа или 2еа.
Настоящее изобретение обеспечивает способы для раскрывания устьичной щели в растении, части растения, органе растения, листе растения или клетке растения, имеющих недостаточную экспрессию или ингибирование экспрессии белка СО2Зеп и/или гена или транскрипта (мРНК) СО2Зеп или карбоангидразы (СА) в клетке или клетках растения, части растения, органа растения листе растения или клетке растения, причем этот способ предусматривает:
(Α) (а) обеспечение:
(ί) нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно гена или транскрипта (мРНК) СО2Зеп или иным образом ингибирующей экспрессию гена или транскрипта (мРНК) СО2Зеп, где этот ген или транскрипт (мРНК) СО2Зеп содержит последовательность этого изобретения, и/или последовательность, кодирующую белок СО2Зеп этого изобретения;
(ίί) нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения, или иным образом ингибирующей нуклеиновую кислоту, кодирующую карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения; и/или (ίίί) нуклеиновой кислоты, кодирующей фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазу (или ФЕПкарбоксилазу, или ФЕПК), и (Ь) экспрессию антисмысловой или ингибирующей СО2Зеп и/или СА нуклеиновой кислоты в клетке или клетках этого растения, части растения, органе растения, листе растения или клетке растения или экспрессию ФЕПК-кодирующей нуклеиновой кислоты в этом растении, части растения, органе растения, листе растения или клетке растения, с вызыванием посредством этого недостаточной экспрессии и/или ингибирования экспрессии белка СО2Зеп и/или гена или транскрипта (мРНК) СО2Зеп, и/или карбоангидразы (СА), и/или экспрессии ФЕПК, и вызыванием раскрывания устьичной щели;
(B) способ (А), где эта клетка является замыкающей клеткой растения;
(C) способ по (А) или (В), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения;
(Ό) способ по любому из (А)-(С), где это растение характеризуется регулируемым СО2-обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2, или это растение характеризуется регулируемым водным обменом при 365 м.д. СО2 окружающей среды, повышенных м.д. СО2 или пониженных м.д. СО2; или (Е) способ по любому из (А)-(Э), где эта нуклеиновая кислота, антисмысловая или иным образом ингибирующая экспрессию гена или транскрипта (мРНК) СО2Зеп, или антисмысловая или иным образом ингибирующая экспрессию карбоангидразы (СА) или β-карбоангидразы, содержит антисмысловой олигонуклеотид этого изобретения или двухцепочечную ингибирующую молекулу РНК (ΒΝΑί) этого изобретения или πιίΒΝΑ или ΕΒΝΑ.
Настоящее изобретение обеспечивает способы для закрывания устьичной щели на замыкающей клетке в эпидермисе растения, листе растения, органе растения или клетке растения, имеющих сверхэкспрессию белка СО2Зеп и/или гена или транскрипта (мРНК)СО2Зеп в клетке или клетках растения, предусматривающие:
(Α) (а) сверхэкспрессию или увеличение экспрессии:
(ί) белка СО2Зеп (сенсора СО2) и/или гена или транскрипта (мРНК) СО2Зеп, где этот ген или транскрипт (мРНК) СО2Зеп содержит последовательность этого изобретения, и/или белок СО2Зеп содержит аминокислотную последовательность этого изобретения, или (ίί) полипептида, имеющего карбоангидразную (СА) активность или β-карбоангидразную актив
- 11 019514 ность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей этот полипептид;
с вызыванием посредством этого сверхэкспрессии и/или увеличения экспрессии белка СО28еп и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еп и/или карбоангидразы (СА), и вызыванием закрывания устьичной щели, или
Ь) ингибирование или уменьшение экспрессии гена или мРНК (транскрипта) фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазы (или ФЕП-карбоксилазы, или ФЕПК);
(B) способ (А), где эта клетка является замыкающей клеткой растения; или (C) способ (А) или (В), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает способы увеличения или оптимизации накопления биомассы в растении, листе растения, органе растения, клетке или семени растения уравновешиванием потери воды через устьица нетто-поглощением СО2 для фотосинтеза и, следовательно, увеличением или оптимизацией накопления биомассы в этом растении, листе растения, органе растения, клетке или семени растения, предусматривающие раскрывание или закрывание устьичных щелей с использованием композиции и/или способа этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает способы уменьшения температуры листьев и усиления транспирации в растении, листе растения, органе растения, клетке растения, предусматривающие раскрывание устьичной щели клетки или клеток этого растения с использованием композиции и/или способа этого изобретения.
В альтернативных вариантах осуществления любого из способов этого изобретения это растение или клетка растения выделены и/или получены из: (ί) двудольного или однодольного растения; (ίί) пшеницы, овса, ржи, ячменя, риса, сорго, маиса (кукурузы), табака, бобового растения, люпинов, картофеля, сахарной свеклы, гороха, фасоли, сои, крестоцветного растения, цветной капусты, рапса (или турнепса или канолы), тростника (сахарного тростника), льна, хлопчатника, пальмы, сахарной свеклы, арахиса, дерева, тополя, люпина, хлопкового дерева (капока), пустынной ивы, креозотного кустарника, терескена шерстистого, бальзы, рами, кенафа, конопли, розеллы, джута или абаки (банана текстильного); или (с) вида из родов Аиасатбшт, АтасЫз, Азрагадиз, Айора, Ауеиа, Втаззюа, С1йиз, Сйги11из, Сарз1сит, Саййатиз, Сосоз, Сойеа, Сисит1з, СиситЬйа, Паисиз, Е1ае1з, Етадайа, 61усше, Соззуршт, Нейаййиз, Не1егоса1118, Нотбеит, Нуозсуатиз, ЬасФса, Ьтит, Ьойит, Ьиртиз, Ьусорегзюои, Ма1из, Мапйюк Ма_)огапа, Меб1садо, Мсойапа, О1еа, Огу/а, Рашеит, РаишзеФт, Регзеа, Рйазео1из, Р1з1асй1а, Р1зит, Ругиз, Ргипиз, Варйапиз, Шстиз, 8еса1е, 8епесю, 8шар1з, 8о1апит, Зотдйит, ТйеоЬготиз, Тпдопе11а, Тййсит, Ую1а, Уйтз, У1дпа или 2еа.
Настоящее изобретение обеспечивает активаторы транскрипции, например, действующие в качестве промоторов или энхансеров, для регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке растения, где этот активатор транскрипции (например, промотор) содержит последовательность, представленную в 8ЕО ГО ЫО:10 или 8ЕО ГО ЫО:11, или их функциональные (регулирующие транскрипцию) субпоследовательности, причем в одном аспекте этот активатор транскрипции (например, промотор) повышает транскрипцию специфическим для замыкающей клетки образом, и в одном аспекте эта замыкающая клетка является замыкающей клеткой листа или замыкающей клеткой стебля.
Настоящее изобретение обеспечивает способы для уменьшения эффективности оксигенации и увеличения фиксации углерода в замыкающей клетке в эпидермисе растения, листе растения, органе растения или клетке растения, включающие в себя ингибирование или уменьшение активности фермента рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, или Рубиско, и/или гена или транскрипта (мРНК) Рубиско в клетке или клетках этого растения, предусматривающие:
(A) (а) обеспечение нуклеиновой кислоты, антисмысловой относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей Рубиско растения, или иным образом ингибирующей экспрессию нуклеиновой кислоты Рубиско растения; и (Ь) ингибирование или уменьшение экспрессии гена или мРНК (транскрипта) Рубиско в замыкающей клетке растения;
(B) способ (А), где эта клетка является замыкающей клеткой растения;
(C) способ (А) или (В), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения; или (Ό) способ по любому из (А)-(С), где кодирующая Рубиско нуклеиновая кислота является геном или мРНК (транскриптом) Рубиско или кодирующая Рубиско нуклеиновая кислота содержит полную последовательность или субпоследовательность 8ЕО ГО ЫО:16, 8ЕО ГО ЫО:17, 8ЕО ГО ЫО:18 или 8ЕО ГО ΝΘ:19.
Настоящее изобретение обеспечивает способы для увеличения эффективности оксигенации и уменьшения фиксации углерода в замыкающей клетке в эпидермисе растения, листе растения, органе
- 12 019514 растения или клетке растения, включающие в себя увеличение экспрессии фермента рибулозо-1,5бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, или Рубиско, и/или гена или транскрипта (мРНК) Рубиско в клетке или клетках этого растения, предусматривающие:
(A) (а) обеспечение нуклеиновой кислоты, кодирующей Рубиско растения; и (Ь) экспрессию Рубиско-кодирующей нуклеиновой кислоты в замыкающей клетке растения;
(B) способ (А), где эта клетка является замыкающей клеткой растения;
(C) способ (А) или (В), где это растение является трансгенным растением этого изобретения или растением, трансдуцированным, трансформированным или инфицированным экспрессионной кассетой, плазмидой, вирусом или вектором этого изобретения, или эта клетка растения является трансдуцированной клеткой этого изобретения; или (Ό) способ по любому из (А)-(С), где кодирующая Рубиско нуклеиновая кислота является геном или мРНК (транскриптом) Рубиско или кодирующая Рубиско нуклеиновая кислота содержит полную последовательность или субпоследовательность 8ЕО ΙΌ N0:16, 8Е0 ΙΌ N0:17, 8Е0 ΙΌ N0:18 или 8Е0 ГО N0:19.
Подробности одного или нескольких вариантов осуществления этого изобретения представлены в сопутствующих фигурах и приведенном ниже описании. Другие признаки, цели и преимущества этого изобретения будут очевидными из этого описания и этих фигур и из формулы изобретения.
Все публикации, патенты, заявки на патенты, последовательности СепВапк и депозиты АТСС, цитируемые здесь, особо включены здесь в качестве ссылки для всех целей.
Описание фигур
Настоящая заявка содержит по меньшей мере один рисунок, выполненный в цвете. Копии публикации заявки на патент с цветным рисунком (цветными рисунками) будут обеспечены патентным ведомством после запроса и уплаты необходимого гонорара.
Фиг. 1 графически иллюстрирует данные, показывающие устьичную проводимость в АгаЫборык 111аНапа дикого типа и воспринимающий СО2 двойной мутант этого изобретения; описанные подробно в примере 1 ниже.
Фиг. 2 иллюстрирует изображения, показывающие различные уровни экспрессии в разных стадиях развития замыкающей клетки (СС); фиг. 2А: различные уровни экспрессии в разных стадиях развития замыкающей клетки; фиг. 2В: экспрессия 27-СИ8 в молодом листе и черешках листьев; фигура 2С: экспрессия 27-СИ8 в верхнем уровне гипокотиля; фиг. 2Ό: экспрессия 27-СИ8 в черешке и на краю листа; фиг. 2Е и 2Е: четыре выступа в диком типе (\\1); описанные подробно в примере 1 ниже.
Фиг. 3А-Н являются изображениями, показывающими экспрессию 27-УС3.6 (8Е0 ГО N0:10) в СС на стебле вблизи листа, но в не очень молодом листе (очерчено) (А & А'). 27-УС3.6 экспрессируется в основном в зрелой СС, очень слабо в молодой или незрелой СС (белая стрелка в В & В'). 27-УС3.60 (8Е0 ГО N0:11) экспрессируется также в СС на гипокотиле (С & С). 27-УС3.6 (8Е0 ГО N0:10) экспрессируется также в СС на чашелистиках (Ό & Ό'); как описано подробно в примере 1 ниже.
Фиг. 4А графически иллюстрирует данные, показывающие, что в двойном мутанте 8Е0 ГО Н0:1/8Е0 ГО N0:7 потеря растениями способности экспрессировать эти два гена приводила к сильному нарушению в СО2-индуцированном закрывании устьиц в сравнении с растениями дикого типа (\\1); фиг. 4В графически иллюстрирует исследования, показывающие комплементацию СО2-фенотипа двойного мутанта 8Е0 ГО Х0:1/8Е0 ГО N0:7 трансгенной экспрессией кДНК С0ЕР1 (8Е0 ГО N0:7); фиг. 4а и фиг. 4Ь иллюстрируют (а) относительные устьичные проводимости двойного мутанта (согр1 согр2), \УТ (дикого типа) и (Ь) трансгенной комплементированной линии (С0ЕР1/согр1 согр2), экспрессирующей С0ЕР1 в ответ на изменения концентрации СО2 (Х-ось: м.д. [СО2]); фиг. 4С графически иллюстрирует данные, показывающие, что растения двойного мутанта согр1/согр2 не обнаруживали нарушения других важных путей передачи сигналов в замыкающих клетках, в том числе закрывания устьиц, индуцированного индуцированным засухой гормоном абсцизовой кислотой (АВА), фиг. 4(с) графически иллюстрирует данные, демонстрирующие интактную реакцию 8Е0 ГО Х0:7/8ЕО ГО N0:1, или согр1/согр2, двойного мутанта и \УТ-растений на абсцизовую кислоту (АВА); как показано подробно в примере 2, ниже.
Фиг. 5А и фиг. 5В графически иллюстрируют данные, показывающие, что как СА1 (8Е0 ГО N0:7), так и СА4 (8Е0 ГО N0:1) могут комплементировать двойные мутанты са1са4 (мутанты обозначены курсивом строчными буквами) в варьирующейся степени; как описано подробно в примере 2 ниже.
Фиг. 6 и 7: фиг. 6 иллюстрирует данные, показывающие относительную устьичную проводимость, которая отражает эффективность газообмена и эффективность использования воды (^ИЕ), СА1 (8Е0 ГО N0:7) и СА4 (8Е0 ГО N0:1) в комплементированных растениях; эти результаты суммированы и графически иллюстрированы на фиг. 7; как описано подробно в примере 2 ниже.
Фиг. 8 иллюстрирует микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8Е0 ГО N0:7) и СА4 (8Е0 ГО N0:1) в комплементированных растениях, в частности, в листьях, и в замыкающих клетках и в мезофильных клетках, как указано на этих фигурах; как описано подробно в примере 2 ниже.
Фиг. 9А и 9В иллюстрируют микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8Е0 ГО N0:7) и СА4 (8Е0 ГО N0:1) в растениях с двойным нокаутом (СА1 (8Е0 ГО N0:7) и СА4
- 13 019514 (8ЕО ΙΌ N0:1)). Фиг. 9С, 9Ό и 9Е иллюстрируют данные из сенсора СО2, показывающие недостаточную СО2-регуляцию газообмена обратите внимание: световые условия = красный свет (50 мкмоль-щ+с'1), синий свет (6 мкмоль-т-2-с-1); как описано подробно в примере 2 и примере 4 ниже.
Фиг. 10А графически иллюстрирует суммирование данных, показывающих интактную реакцию на абсцизовую кислоту в двойном мутанте са1са4 (СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и СА4 (8Е0 ΙΌ ΝΟ:1)).Φ^. 10В графически иллюстрирует суммирование данных, показывающих, что ингибитор СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и/или СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1) имитирует СО2-нечувствительность в растениях дикого типа (^Т); как описано подробно в примере 2 и примере 4 ниже.
Фиг. 11А и 11В иллюстрируют микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1) в растениях с двойным нокаутом СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1)), а фиг. 11С графически иллюстрирует данные, показывающие, что геномные ДНК генов СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) или СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1) могут комплементировать СО2-реакцию; световые условия: красный свет (50 мкмоль-т-2-с-1), синий свет (6 мкмоль-т-2-с-1); как описано подробно в примере 2 и примере 4 ниже.
Фиг. 12А, 12В и 12С, графически иллюстрируют суммирование данных, показывающих, что фотосинтез не нарушается в мутанте с двойным нокаутом сенсора СО2: свет во время предварительной адаптации, перед измерениями Ρδ-флуоресценции: 50 мкмоль-т-2-с-1) 88% красный свет, 12% синий свет; 2000 мкмоль-т-2-с-1: 90% красный свет, 10% синий свет. Фиг. 12Ό иллюстрирует скорость ассимиляции СО2 в темноте и на красном свете (где этот красный свет: 300 мкмоль-т-2-с-1); как описано подробно в примере 2 и 4 ниже
Фиг. 13А, 13В, 13С и 13Ό графически и в виде изображений иллюстрируют, что обесцвеченные листья с нарушенным фотосинтезом обнаруживают интактную СО2-регуляцию газообмена; как описано подробно в примере 2 и 4 ниже.
Фиг. 14А и 14В иллюстрируют микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1) в растениях с двойным нокаутом (СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1)); а фиг. 14С и 14Ό графически и в виде изображений иллюстрируют, что растения со сверхэкспрессией сенсора СО2, в которых СА1 (8Е0 ΙΌ N0:7) и СА4 (8Е0 ΙΌ N0:1) функционально связаны с нацеленными на замыкающие клетки промоторами этого изобретения, обнаруживают повышенную эффективность использования воды (^ИЕ); на фиг. 14Ό эти данные не обнаруживают действия, наблюдаемого во время цветения; как описано подробно в примере 2 и 4 ниже.
Фиг. 15 графически суммирует данные, показывающие профили транскрипции экспрессируемых в замыкающей клетке генов как в замыкающих клетках, так и мезофильных клетках; как описано подробно в примере 3 ниже.
Фиг. 16 является последовательностью нуклеиновой кислоты 0С1 (8Е0 ΙΌ N0: 10); как описано подробно в примере 3 ниже.
Фиг. 17А-Ь иллюстрирует микрофотографии анализа экспрессии гена 0С1 (А11д22690) в ответ на различные обработки: фиг. 17А иллюстрирует изображение, показывающее, что промотор 0С1 опосредует сильную экспрессию рецептора в замыкающих клетках проростков АтаЫбор818 дикого типа, причем это изображение показывает двухнедельный трансгенный проросток рОС1::ОИ8; фиг. 17В иллюстрирует, что рОС1::ОИ8 создавал сильную экспрессию 0И8 в замыкающих клетках в листьях, а также в замыкающих клетках в черешках и гипокотилях, как иллюстрировано на фиг. 17С, Ό, Е; более молодые или незрелые замыкающие клетки не обнаруживали экспрессии ΟΕΡ или обнаруживали гораздо более слабую экспрессию ΟΕΡ, как иллюстрировано на фиг. 17Е, О; и замыкающие клетки в чашелистиках и гипокотилях также обнаруживали экспрессию ΟΕΡ, как иллюстрировано на фиг. 17Н, Ι, 1, К; и окрашивание 0И8 показало экспрессию репортерного гена в образовавших скопления устьицах в 1тш-растениях, трансформированных рОС1::УС1. 60, как иллюстрировано на фиг. 17М; и сильную экспрессию ΟΕΡ замыкающими клетками наблюдали в листьях табака, как иллюстрировано на фиг. 17N, как описано подробно в примере 3 ниже.
Фиг. 18А иллюстрирует фотографии, которые являются репрезентативными Т1 растениями из различных трансгенных линий промотор::0И8; а фиг. 18В графически иллюстрирует последовательную (структурную или в виде последовательности) делецию промотора рОС1 для определения районов для экспрессии замыкающих клеток, как описано подробно в примере 3 ниже.
Фиг. 19 иллюстрирует наложенные внутриклеточные временные (транзиторные) концентрации кальция в экспрессирующих рОС1::УС3.60 замыкающих клетках и спонтанные временные концентрации кальция в замыкающих клетках интактных трансгенных растений рССЕ:УС3.60; фиг. 19А иллюстрирует изображение флуоресценции эпидермиса листа трансгенного растения рССЕ:УС3.60; фиг. 19В иллюстрирует данные, показывающие, что все 6 замыкающих клеток в панели А продуцировали внутриклеточные транзиторные концентрации кальция в ответ на прилагаемые колебания кальция; фиг. 19С иллюстрирует псевдоокрашенное логометрическое изображение листа из интактных растений Со1, трансформированных рССЕ:УС3.60; фиг. 19Ό иллюстрирует временной ход отношений испускания двух замыкающих клеток, отмеченных стрелкой на фиг. С, который показывает, что транзиторные концентрации каль- 14 019514 ция встречаются в интактных растениях ЛгаЫйор818, как описано подробно в примере 3 ниже.
Фиг. 20 иллюстрирует микрофотографии вызванного рСС1(О1)::анти-СЕР уменьшения экспрессии СЕР в замыкающих клетках растений 358::СЕР; фиг. 20А иллюстрирует эпидермис листа трансгенного растения 358::СЕР (яркое поле с СЕР-фильтром); фиг. 20В иллюстрирует изображение флуоресценции того же самого эпидермиса листа, показанного на фигуре 20А; фиг. 20С иллюстрирует эпидермис листа трансгенного растения Т1, экспрессирующего рСС1(Э1)::анти-СЕР в фенотипе 358::СЕР; фиг. 20Ό иллюстрирует изображение флуоресценции того же самого эпидермиса листа, показанного на фигуре 20С, как описано подробно в примере 3 ниже.
Фиг. 21А, фиг. 21В, фиг. 21С и фиг. 21Ό иллюстрируют, что сверхэкспрессия сенсора СО2, нацеленная на замыкающие клетки, в растениях показывает повышенные СО2-реакции в регуляции газообмена, как подробно описано в примере 3 ниже.
Фиг. 22 иллюстрирует филогенетическое дерево карбоангидраз ЛгаЫйор818, как описано подробно в примере 4 ниже.
Фиг. 23 графически иллюстрирует данные, показывающие, что растения с мутантной карбоангидразой обнаруживали сильные устьичные реакции на синий свет и переход свет-темнота, как описано подробно в примере 4 ниже.
Фиг. 24А иллюстрирует данные, показывающие, что двойные мутанты са4са6 проявляют интактные СО2-реакции, в то время как са1са4 и са1са4са6 проявляют одно и то же ухудшение восприятия СО2; фиг. 24В, фиг. 24С, фиг. 24Ό и фиг. 24Е графически иллюстрируют устьичную проводимость в моль воды м-2 сек-1, как подробно описано в примере 4 ниже.
Фиг. 25 иллюстрирует данные, демонстрирующие, что несколько независимых трансгенных линий са1са4, трансформированных копией дикого типа либо СА1, либо СА4, обнаруживают возобновление индуцированных изменениями [СО2] реакций: две дополнительные комплементированные линии с СА1, СА1#2 (фиг. 25А) и СА1#3 (фиг. 25В) или СА4, СА4#2 (фиг. 25С) и СА4#3 (фиг. 25Ό) обнаруживают нормальное увеличение и уменьшение устьичной проводимости в ответ на изменения [СО2], как описано подробно в примере 4 ниже.
Фиг. 26 иллюстрирует флуоресцентные картины (конфокальное изображение) клеток с различными распределениями локализации СА1-УЕР и СА4-УЕР в протопластах табака: плазмиды, кодирующие УЕР, ЕБ82-УЕР. СА1-УЕР и СА4-УЕР, транзиторно экспрессировались в протопластах табака; фильтры указаны над фигурой, тогда как слияния указаны слева от фигуры; картины, крайние справа фиг. 26, показывают совмещение изображений УЕР и хлорофилла, как описано подробно в примере 4 ниже.
Фиг. 27А-С и фиг. 14С графически иллюстрируют данные, показывающие, что запускаемая преимущественно замыкающими клетками экспрессия кДНК СА1 или СА4 восстанавливает восприятие СО2 в са1са4 и сверхэкспрессирующие СА растения обнаруживают улучшенную эффективность использования воды: фиг. 27А и 27В графически иллюстрируют ОТ-ПЦР-анализ экспрессии СА1 и СА4 в протопластах замыкающих клеток и мезофильных клетках комплементированных растений с СА1 или СА4, запускаемой нацеленным на замыкающие клетки промотором этого изобретения; фиг. 27С и 27Ό графически иллюстрируют СО2-индуцированное изменение устьичной проводимости нацеленных на замыкающие клетки линий, двойного мутанта са1са4 и растений дикого типа (^Т) в ответ на указанные смещения [СО2]: экспрессия СА1 или СА4 в замыкающих клетках является достаточной для возобновления СО2-реакции; фиг. 27Е графически иллюстрирует устьичную проводимость листьев са1са4, дикого типа, 1111-2 и тройного мутанта са1са41111-2 в ответ на указанные изменения [СО2]; фиг. 27Е и 27С графически иллюстрируют устьичную проводимость сверхэкспрессирующих СА линий и растений дикого типа в ответ на указанные изменения [СО2], как описано подробно в примере 4 ниже.
Фиг. 28А-Е графически иллюстрируют, что специфическая для замыкающих клеток комплементация либо СА1, либо СА4 восстанавливает устьичные реакции на СО2 в са1са4: данные СО2-реакции одной дополнительной линии, комплементированной специфической для замыкающих клеток экспрессией СА1 или СА4, графически иллюстрированные на фиг. 28А и 28В, и СО2-реакцию относительной устьичной проводимости 4 нацеленных на замыкающие клетки независимых комплементированных линий анализировали; две на фиг. 27С и 27Ό; две на фиг. 28А и 28В; фиг. 28С-Е графически иллюстрируют величины относительной устьичной проводимости, которые были нормализованы относительно последней точки данных перед переключением на 365-800 м.д. СО2, как описано подробно в примере 4 ниже.
Фиг. 29 графически иллюстрирует данные, показывающие, что сверхэкспрессия либо СА1, либо СА4 в замыкающих клетках дикого типа уменьшает общую устьичную проводимость и слегка увеличивает величину устьичной СО2-реакции; фиг. 29С и 29Ό графически иллюстрируют ОТ-ПЦР-анализ СА1 или СА4 в листьях сверхэкспрессирующих линий, запускаемых предпочтительным для замыкающих клеток промотором рСС1; и измерения устьичной проводимости дополнительной линии, сверхэкспрессирующей ген СА1, показанные на фиг. 29А, и дополнительной линии, сверохэкспрессирующей ген СА4, показанные на фиг. 29В. Относительные величины устьичной проводимости, показанные на фиг. 29С, 29Ό, 29Е и 29Е, нормализовали относительно последней точки данных перед переключением на 365-800 м.д. СО2, как описано подробно в примере 4 ниже.
Одинаковые ссылочные символы в различных фигурах указывают одинаковые элементы.
- 15 019514
Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования обменом воды и диоксида углерода (СО2) через устьица растений регуляцией генов сенсоров СО2, названных генами СО28еп, включающие в себя нуклеиновые кислоты сенсоров СО2 (например, гены или мРНК, или первичные транскрипты) и полипептиды этого изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для сверхэкспрессии или недостаточной экспрессии нуклеиновых кислот сенсоров СО2 и полипептидов сенсоров СО2, включающих в себя нуклеиновые кислоты и полипептиды сенсоров СО2 этого изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для сверэкспрессии нуклеиновых кислот сенсоров этого изобретения и полипептидов сенсоров СО2 для конструирования улучшенной реакции на СО2 в растении, части растения, органе растения, листе и т.п.
Сверхэкспрессия одного или нескольких генов сенсоров СО2, названных генами СО28еп, включающих в себя нуклеиновые кислоты сенсоров СО2 (например, гены или мРНК, или первичные транскрипты) и полипептиды сенсоров СО2, включающие в себя полипептиды сенсоров СО2 этого изобретения, индуцирует улучшенную СО2-реакцию. Таким образом, сверхэкспрессия всех или одной из нуклеиновых кислот этого изобретения (для сверхэкспрессии белков СО28еп) повышает \νυΕ и производит более эффективное и засухоустойчивое растение, в частности, в свете непрерывно повышающихся концентраций атмосферного СО2. Трансгенные растения (например, сельскохозяйственные культуры) этого изобретения (посредством сверхэкспрессии всех или одного из белков СО28еп этого изобретения) закрывают их устьица до большей степени, чем растения дикого типа, консервируя посредством этого их водопотребление. Поскольку эффективность использования воды определяет, насколько хорошо растение может уравновешивать потерю воды через устьица нетто-поглощением СО2 для фотосинтеза и, следовательно, накоплением его биомассы, Настоящее изобретение может быть использовано в увеличении биомассы растения, и, следовательно, способы этого изобретения имеют применения в области биологических видов топлива/альтернативной энергии.
Настоящее изобретение обеспечивает также композиции и способы для ингибирования экспрессии генов, транскриптов СО28еп и белков СО28еп, например, посредством антисмысловой и/или Κ,ΝΑίрепрессии сенсоров СО2 в замыкающих клетках в любом растении или любой растительной клетке, например, сельскохозяйственных культур. Недостаточная экспрессия СО28еп трансгенных растений или недостаточно экспрессирующие СО28еп растения этого изобретения могут раскрывать их устьица в большей степени, чем растения дикого типа.
Настоящее изобретение обеспечивает также растения, например, сельскохозяйственные культуры, которые могут выдерживать повышенные температуры, предотвращая таким образом «разрушение» метаболизма, фотосинтеза и роста. Таким образом, композиции и способы этого изобретения, посредством ингибирования экспрессии нуклеиновых кислот СО28еп и/или белков СО28еп, помогают сельскохозяйственным культурам, которые в противном случае были бы чувствительными к повышенным температурам, справляться с увеличенными атмосферными концентрациями СО2, уменьшая или ослабляя также ускоренное увеличение температур листьев. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы, использующие антисмысловую РНК и Κ,ΝΑί для репрессии сенсоров СО2 в замыкающих клетках. В одном аспекте промотор замыкающей клетки обеспечивает средство для уменьшения температуры листьев через усиление транспирации в этих сельскохозяйственных культурах, а также для максимизации урожайности.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для понижающей регуляции/уменьшения или альтернативно увеличения обмена диоксида СО2 (СО2) и/или воды в растении, например, через замыкающую клетку растения, клетки растения, листа растения, органа растения или части растения, предусматривающие т1ег аНа использование полипептида, имеющего карбоангидразную активность, фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазную (или ФЕП-карбоксилазную, или ФЕПК) активность и/или рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазную/оксигеназную активность (или активность фермента Рубиско).
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для манипулирования ФЕПкарбоксилазой, которая является ключевым ферментом в фотосинтезе в С4-растениях. Поскольку ФЕПкарбоксилаза, или ФЕПК, не может использовать СО2 непосредственно в качестве субстрата, ФЕПК зависит от карбоангидразы (СА) для обеспечения НСО3 -. Реакция, катализируемая ФЕП-карбоксилазой (ФЕПК), является следующей (обратите внимание: Ρί обозначает неорганический фосфат):
ФЕП + НСО3 - <=> оксалоацетат (ОАА) + Ρί
Затем ОАА восстанавливается в малат. В некоторых клетках растений СО2 высвобождается для Рубиско и СЗ-фотосинтеза.
В С4-растениях (использующих С4-путь фиксации углерода, также называемый путем ХетчаСлека) малат может транспортироваться в клетки обкладки сосудистых пучков (в С4-растениях клетки обкладки сосудистых пучков являются фотосинтетическими клетками, помещенными в плотно упакованные пучки вокруг жилок листа; цикл Кальвина заключен в хлоропласта клеток обкладки сосудистых пучков), где СО2 высвобождается для Рубиско и С3-фотосинтеза; и изобретение обеспечивает также композиции и способы для манипуляции ферментами Рубиско. В одном аспекте этого изобретения экс
- 16 019514 прессия ферментов Рубиско, например, малой субъединицы Рубиско, ингибируется или репрессируется (уменьшается), например, в замыкающей клетке растения. Ингибированием или репрессией (уменьшением) экспрессии Рубиско, эффективность оксигенации уменьшается, и фиксация углерода может увеличиваться, и уровни СО2 в замыкающих клетках понижаются. Это могло бы уменьшать СО2-регуляцию закрывания устьиц.
В одном аспекте этого изобретения высокие или пониженные уровни ФЕП-карбоксилазы, или ФЕПК, создаются искусственно в замыкающих клетках растений для манипулирования СО2-регуляцией устьичных движений и количеством внутриклеточного органического аниона малата2-. Увеличение уровней ФЕПК будет индуцировать раскрывание устьиц; уменьшение ФЕПК будет приводить к закрыванию устьиц; таким образом, хотя изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, увеличение уровней ФЕПК будет индуцировать увеличение малата, который уравновешивает положительное накопление иона калия (К+) во время открывания устьиц; и вследствие увеличения внутриклеточной концентрации соли калия (К+) это будет индуцировать открывание устьиц. Таким образом, Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для открывания и закрывания устьиц растений или увеличения или уменьшения количества устьиц, посредством сверхэкспрессии или недостаточной экспрессии ФЕПК, соответственно.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции обмена диоксида углерода (СО2) и использования и поглощения СО2 в растении или части растения, например, листе, манипулированием экспрессии СО2-связывающего белка фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазы (или ФЕПкарбоксилазы, или ФЕПК) и/или рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, или фермента Рубиско; таким образом, изобретение обеспечивает также композиции и способы манипулирования трансдукцией сигнала СО2 и регуляцией газообмена в растении или части растения. Например, в одном аспекте, Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для создания увеличенного количества ФЕПК (для облегчения открывания устьиц) и/или создания такого количества фермента Рубиско.
В альтернативных аспектах этого изобретения нуклеиновые кислоты ФЕПК и Рубиско экспрессируюися в клетках растений, например, в замыкающих клетках и мезофильных клетках растений; и в одном аспекте, они экспрессируются при высоких уровнях (более высоких, чем уровни дикого типа); или экспрессия нуклеиновых кислот ФЕПК и Рубиско ингибируется, уменьшается или репрессируется в клетках растений, например, в замыкающих клетках и мезофильных клетках растений; и в одном аспекте, они экспрессируются при более низких уровнях (более низких, чем уровни дикого типа). Клетки растений, сконструированные в этих альтернативных вариантах осуществления, включают в себя выделенные, культивируемые или трансгенные растения и клетки растений этого изобретения.
Регуляторные элементы транскрипции
Настоящее изобретение обеспечивает также промоторы для регуляции экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке растения, где этот промотор содержит последовательность, представленную в δΕΟ ΙΌ ΝО:10 или δΕΟ ΙΌ ΝО:11, или их функциональные (регулирующие транскрипцию) субпоследовательности, причем в одном аспекте этот промотор повышающим образом регулирует транскрипцию, а в одном аспекте этот промотор повышающим образом регулирует транскрипцию в замыкающих клетках растения специфическим образом, и в одном аспекте эта замыкающая клетка является замыкающей клеткой листа или замыкающей клеткой стебля. Изобретение обеспечивает также экспрессионные кассеты, плазмиды, вирусы и векторы, содержащие промотор этого изобретения. В одном аспекте изобретение обеспечивает также экспрессионные кассеты, плазмиды, вирусы и векторы, содержащие промотор этого изобретения, функционально связанный с нуклеиновой кислотой этого изобретения, например, любым родом полинуклеотидов на основе примерных δΕΟ ΙΌ ΝО:1, δΕΟ ΙΌ ΝО:2, δΕΟ ΙΌ ΝО:4, δΕΟ ΙΌ ΝО:5, δΕΕ) ΙΌ ^:7 или δΕΕ) ΙΌ ΝΘ:8.
Этот промотор данного изобретения является сильным промотором, в частности, в замыкающих клетках растений, и в некоторых вариантах осуществления является специфическим для замыкающих клеток, например, δΕΟ ΙΌ ΝО:10 и δΕΟ ΙΌ ΝО:11 (его экспрессия может быть слабой в других клетках, например, в эпидермальных клетках или мезофильных клетках и все еще рассматриваться как специфическая для замыкающих клеток).
На основе данных множественных микроматриц, промоторы этого изобретения являются приблизительно в 20 раз более сильными, чем известный промотор КАТ1 замыкающих клеток, а также более сильными в замыкающих клетках, чем известный промотор 35δ вируса мозаичной болезни цветной капусты. См. фигуры этого изобретения и примеры ниже.
Хотя нуклеиновая кислота этого изобретения может быть функционально связана с промотором этого изобретения, в альтернативных вариантах осуществления она может быть функционально связана с любым конститутивным и/или растениеспецифическим или специфическим для клетки растения промотором, например, промотором 35δ вируса мозаичной болезни цветной капусты (СаМУ), промотором маннопинсинтазы (ΜΑδ), а 1' или 2' промотором, произведенным из Т-ДНК АдгоЬас1егшт ШтеГаДепк, промотором 34δ вируса мозаичной болезни норичника шишковатого, промотором актина, промотором актина риса, промотором убиквитина, например, промотором убиквитина-1 кукурузы и т.п.
Примеры конститутивных промоторов растений, которые могут быть применимы для экспрессии
- 17 019514 последовательности ТР, включают в себя: промотор 358 вируса мозаичной болезни цветной капусты (СаМУ), который придает конститутивную экспрессию высокого уровня в большинстве тканей растений (см., например, 0бе11 е! а1. (1985) №11иге 313: 810-812); промотор нопалинсинтазы (Ап е! а1. (1988) Р1ап1 РЬузю1. 88: 547-552); и промотор октопинсинтазы (Рготт е! а1. (1989) Р1ап! Се11 1: 977-984).
Факторы транскрипции (например, промоторы) этого изобретения или другие факторы транскрипции могут быть функционально связаны с кодирующей последовательностью этого изобретения, например регуляторного белка С02 этого изобретения. Регуляторные белки СО2 этого изобретения могут быть функционально связаны со специфическим промотором или энхансером, который заставляет этот фактор транскрипции и, следовательно, кодирующую последовательность экспрессироваться в ответ на сигналы окружающей среды, тканеспецифические или временные сигналы. Большое разнообразие промоторов генов растений, которые регулируют экспрессию генов в ответ на сигналы окружающей среды, гормональные, химические сигналы, связанные со стадией развития сигналы тканеактивным образом, может быть использовано для экспрессии последовательности ТР в растениях. Выбор промотора основан в значительной степени на представляющем интерес фенотипе и определяется такими факторами, как ткань (например, семя, плод, корень, пыльца, сосудистая ткань, цветок, плодолистик и т.д.), индуцибельность (например, в ответ на поранение, тепло, холод, засуха, свет, патогены и т.д.), тайминг, стадия развития и т.п.
Многочисленные известные промоторы были охарактеризованы и могут быть с пользой использованы для стимуляции экспрессии полинуклеотида этого изобретения в трансгенном растении или представляющей интерес клетке. Например, тканеспецифические промоторы включают в себя: семеноспецифические промоторы (такие как промотор напина, фазеолина или ЭС3, описанные в Патенте США № 5773697), плодоспецифические промоторы, которые являются активными во время созревания плодов (такие как промотор бги 1 (Патент США № 5783393), или промотор 2А11 (например, см. Патент США № 4943674) и промотор полигалактуронидазы томата (например, см. В1гб е! а1. (1988) Р1ап! Мо1. Вю1. 11: 651-662), корнеспецифические промоторы, такие как промоторы, описанные в Патентах США с номерами 5618988, 5837848 и 5905186, активные в пыльце промоторы, такие как РТА29, РТА26 и РТА13 (см., например, Патент США № 5792929), промоторы, активные в сосудистой ткани (см., например, К1пд11 апб Ке11ег (1998) Р1ап! Мо1. Вю1. 37: 977-988), специфические для цветков промоторы (см., например, Ка1зег е! а1. (1995) Р1ап! Мо1. Вю1. 28: 231-243), пыльцы (см., например, Ваегзоп е! а1. (1994) Р1ап! Мо1. Вю1. 26: 1947-1959), плодолистиков (см., например, 011 е! а1. (1990) Р1ап! Се11 2: 837-848), пыльцы и яйцеклеток (см., например, Ваегзоп е! а1. (1993) Р1ап! Мо1. Вю1. 22: 255-267), индуцируемые ауксином промоторы (такие как промоторы, описанные уап бег Кор е! а1. (1999) Р1ап! Мо1. Вю1. 39: 979-990 или Ваитапп е! а1., (1999) Р1ап! Се11 11: 323-334), индуцируемый цитокинином промотор (см., например, биеуага-багаа (1998) Р1ап! Мо1. Вю1. 38: 743-753), промоторы, отвечающие на гиббереллин (см., например, 8Ы е! а1. (1998) Р1ап! Мо1. Вю1. 38: 1053-1060, №Што!! е! а1. (1998) Р1ап! Мо1ес. Вю1. 38: 817-825) и т.п.
Дополнительными промоторами, которые могут быть использованы для применения на практике этого изобретения, являются промоторы, которые индуцируют экспрессию в ответ на тепло (см., например, А1п1еу е! а1. (1993) Р1ап! Мо1. Вю1. 22: 13-23), свет (см., например, промотор гЬс8-3А гороха, КиЫете1ег е! а1. (1989) Р1ап! Се11 1: 471-478, и промотор гЬс8 кукурузы, 8с1айБег апб 8Нееп (1991) Р1ап! Се11 3: 997-1012); поранение (см., например, λνιπιΕ 81еЬег1х е! а1. (1989) Р1ап! Се11 1: 961-968); патогены (такие как промотор РВ-Ι, описанный в ВисНе1 е! а1. (1999) Р1ап! Мо1. Вю1. 40: 387-396, и промотор РЭР1.2, описанный в Маппегз е! а1. (1998) Р1ап! Мо1. Вю1. 38: 1071-1080) и химикалии, такие как метилжасмонат или салициловая кислота (см., например, Са!/ (1997) Аппи. Веу. Р1ап! Р1узю1. Р1ап! Мо1. Вю1. 48: 89-108). Кроме того, тайминг экспрессии может регулироваться с использованием промоторов, таких как промоторы, действующие при старении (см., например, Сап апб Атазто (1995) 8аепсе 270: 1986-1988); или в позднем развитии семян (см., например, 0бе11 е! а1. (1994) Р1ап! Р1узю1. 106: 447-458).
Тканеспецифические промоторы могут стимулировать транскрипцию только в некотором временном диапазоне стадии развития в пределах этой ткани. См., например, В1ахс.|иех (1998) Р1ап! Се11 10:791800, где охарактеризован промотор гена БЕАРУ АгаЬ1борз1з. См. также Сагбоп (1997) Р1ап! 1 12:367-77, где описан фактор транскрипции 8РБ3, который узнает консервативный мотив последовательности в промоторном районе гена АР1 идентичности меристемы цветков; и Мапбе1 (1995) Р1ап! Мо1еси1аг Вю1оду, уо1. 29, рр 995-1004, где описан промотор еШ4 меристемы. Могут быть использованы тканеспецифические промоторы, которые активны на протяжении жизненного цикла конкретной ткани. В одном аспекте нуклеиновые кислоты этого изобретения функционально связаны с промотором, активным прежде всего только в клетках волокон хлопчатника. В одном аспекте нуклеиновые кислоты этого изобретения функционально связаны с промотором, активным прежде всего во время стадий удлинения клеток волокна хлопчатника, например, как описано ВтеЬай (1996) зирга. Эти нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с промотором гена РЬ12А, чтобы экспрессироваться преимущественно в клетках волокна хлопчатника (^ϊ6). См. также, кНп (1997) Ргос. №111. Асаб. 8с! И8А 89:5769-5773; 1о1п, е! а1., Патенты США с номерами 5608148 и 5602321, описывающие специфические для волокна хлопчатника промоторы и способы конструирования трансгенных растений хлопчатника. Специфические для корней промоторы могут быть также использованы для экспрессии нуклеиновых кислот этого изобретения.
- 18 019514
Примеры специфических для корней промоторов включают в себя промотор из гена алкогольдегидрогеназы (ПеЬ1к1е (1990) Ιηΐ. Реу. Су1о1. 123:39-60). Другие промоторы, которые могут быть также использованы для экспрессии нуклеиновых кислот этого изобретения, включают в себя, например, специфические для семяпочки, эмбриоспецифические, специфические для эндосперма, специфические для интегумента (покрова семяпочки), специфические для семенной оболочки промоторы или некую их комбинацию; специфический для листа промотор (см., например, Викк (1997) Р1ап! 1. 11: 1285-1295, где описан специфический для листа промотор в кукурузе); промотор ОКР13 из АдгоЬас!егшт гЫходепек (который проявляет высокую активность в корнях, см., например, Напкеп (1997) кирга); специфический для пыльцы кукурузы промотор (см., например, Сиеггего (1990) Мо1. Сеп. Сепе1. 224:161-168); может быть также использован промотор томата, активный во время созревания, старения и опадения листьев и, в меньшей степени цветков (см., например, В1ите (1997) Р1ап! ί. 12:731-746); специфический для пестика промотор из гена 8К2 картофеля (см., например, Искег (1997) Р1ап1 Мо1. Вю1. 35:425-431); гена В1ес4 из гороха, который является активным в эпидермальной ткани апексов вегетативных и цветковых побегов люцерны, что делает его полезным инструментом для нацеливания экспрессии чужеродных генов на эпидермальный слой активно растущих побегов или волокон; специфический для семяпочки ген ВЕЬ1 (см., например, Ве1кег (1995) Се11 83:735-742, СепВапк №. И39944); и/или промотор в К1ее, Патенте США № 5589583, где описан район промотора растения, который способен придавать высокие уровни транскрипции в меристематической ткани и/или быстро делящихся клетках.
Альтернативно, промоторы растений, которые являются индуцибельными после подвергания действию гормонов растений, таких как ауксины, используют для экспрессии нуклеиновых кислот этого изобретения. Например, изобретение может использовать фрагмент промотора ауксин-чувствительных элементов Е1 (АихКЕ) в сое (С1усше тах Ь.) (Ьш (1997) Р1ап1 РЬуяок 115:397-407); ауксинчувствительный промотор С8Т6 АгаЬ1йорк1к (также чувствительный к салициловой кислоте и пероксиду водорода (Сйеп (1996) Р1ап! ί. 10: 955-966); ауксин-индуцибельный промотор рагС из табака (8ака1 (1996) 37:906-913); чувствительный к биотину элемент растения (8!гей (1997) Мо1. Р1ап1 МкгоЬе [п!егас(. 10:933-937); и промотор, чувствительный к стрессовому гормону абсцизовой кислоте (811ееп (1996) 8аепсе 274:1900-1902).
Нуклеиновые кислоты этого изобретения могут быть также функционально связаны с промоторами растений, которые являются индуцибельными после воздействия химическими реагентами, которые могут наноситься на растение, такими как гербициды или антибиотики. Например, может быть использован промотор Ι112-2 кукурузы, активированный бензолсульфонамидными гербицидными защитными агентами (Эе УеуИег (1997) Р1ап! Се11 Р11у№1. 38:568-577); нанесение различных гербицидных защитных агентов индуцирует различные картины экспрессии генов, включающие в себя экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующая последовательность может находиться под контролем, например, индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген аргининдекарбоксилазы Ауепа каПуа Ь. (овса) (Макдгаи (1997) Р1ап! ί. 11:465-473); или чувствительный к салициловой кислоте элемент (8!апде (1997) Р1ап! 1. 11:1315-1324). С использованием химически (например, гормоном или пестицидом) индуцируемых промоторов, т.е. промоторов, чувствительных к химикалию, который может быть нанесен на трансгенное растение в поле, в конкретной стадии развития этого растения может быть индуцирована экспрессия полипептида этого изобретения. Таким образом, изобретение обеспечивает также трансгенные растения, содержащие индуцибельный ген, кодирующий полипептиды этого изобретения, диапазон хозяев которого ограничен видами растений-мишеней, такими как кукуруза, рис, ячмень, пшеница, картофель или другие сельскохозяйственные культуры, индуцибельные на любой стадии развития этой культуры.
Квалифицированному в данной области специалисту будет понятно, что тканеспецифический промотор может запускать экспрессию функционально связанных последовательностей в тканях, других, чем эта ткань-мишень. Таким образом, тканеспецифическим промотором является промотор, который запускает экспрессию преимущественно в ткани-мишени или клеточном типе-мишени, но также приводит к некоторой экспрессии и в других клетках.
Нуклеиновые кислоты этого изобретения могут быть также функционально связаны с промоторами растений, которые являются индуцируемыми после подвергания действию химических реагентов. Эти реагенты включают в себя, например, гербициды, синтетические ауксины или антибиотики, которые могут наноситься, например, разбрызгиваться, на трансгенные растения. Индуцибельная экспрессия нуклеиновых кислот этого изобретения позволит фермеру отбирать растения с оптимальной экспрессией и/или активностью белков. Таким образом, может контролироваться развитие частей растений. Таким путем изобретение обеспечивает средство для облегчения сбора урожая растений и частей растений. Например, в различных вариантах осуществления используют промотор Ш2-2 кукурузы, активируемый бензолсульфонамидными гербицидными защитными агентами (Эе УеуИег (1997) Р1ап! Се11 Р11у№1. 38:568-577); нанесение различных гербицидных защитных агентов индуцирует разные картины экспрессии генов, включающие в себя экспрессию в корне, гидатодах и апикальной меристеме побегов. Кодирующие последовательности этого изобретения могут также находиться под контролем индуцируемого тетрациклином промотора, например, как описано для трансгенных растений табака, содержащих ген
- 19 019514 аргининдекарбоксилазы Аνеηа ка(|уа Ь. (овса) (Макдгаи (1997) Р1ап1 ί. 11:465-473); или чувствительный к салициловой кислоте элемент (81апде (1997) Р1ап( I. 11:1315-1324).
В некоторых аспектах, правильная экспрессия полипептида может требовать района полиаденилирования на 3'-конце кодирующего района. Этот район полиаденилирования может быть произведен из природного гена, из различных генов другого растения (или животного или другого источника), из генов в Т-ДНК АдгоЫас1ег1ит.
Растения, содержащие нуклеиновую кислоту этого изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает трансгенные растения и семена, содержащие нуклеиновую кислоту, полипептид (например, белок СО28еп), экспрессионную кассету или вектор или трансфицированную или трансформированную клетку этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает также продукты растений, например семена, листья, экстракты и т.п., содержащие нуклеиновую кислоту и/или полипептид (например, белок СО28еп) этого изобретения. Это трансгенное растение может быть двудольным или однодольным. Настоящее изобретение обеспечивает также способы получения и применения этих трансгенных растений и семян. Трансгенные растение или клетка растения, экспрессирующие полипептид данного изобретения, могут быть сконструированы в соответствии с любым известным в данной области способом. См., например, Патент США № 6309872.
Нуклеиновые кислоты и экспрессионные конструкции этого изобретения могут быть введены в клетку растения любым способом. Например, нуклеиновые кислоты или экспрессионные конструкции могут быть введены в геном желаемой клетки-хозяина, или эти нуклеиновые кислоты или экспрессионные конструкции могут быть эписомами. Введение в геном желаемого растения может быть таким, что продуцирование белка СО28еп хозяина регулируется эндогенными регуляторными элементами транскрипции или трансляции, или гетерологичным промотором, например, промотором этого изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает также растения с нокаутом, в которых инсерция последовательности гена, например, гомологичной рекомбинацией, была разрушена экспрессией эндогенного гена. Способы генерирования растений с нокаутом хорошо известны в данной области.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды этого изобретения могут быть экспрессированы или инсертированы в любом растении, части растения, клетке или семени растения. Трансгенные растения этого изобретения или растение или клетка растения, содержащие нуклеиновую кислоту этого изобретения (например, трансфицированная, инфицированная или трансформированная клетка), могут быть двудольными или однодольными. Примеры однодольных растений, содержащих нуклеиновую кислоту этого изобретения, например, однодольные трансгенные растения этого изобретения, являются травами, такими как мятлик луговой (Ыие дгакк, Роа), кормовая трава, такая как овсяница, плевел, 1етрега1е дгакк, такая как АдтокВк, и злаки, например, пшеница, овсы, рожь, ячмень, рис, сорго и маис (кукуруза). Примерами двудольных, содержащих нуклеиновую кислоту этого изобретения, например, двудольных трансгенных растений этого изобретения, являются табак, бобовые растения, такие как люпины, картофель, сахарная свекла, горох, фасоль и соя, и крестоцветные растения (семейства Втаккюасеае), такие как цветная капуста, рапс и близкородственный модельный организм АтаЫИоркй (Вайапа. Таким образом, растение или клетка растения, содержащие нуклеиновую кислоту этого изобретения, в том числе трансгенные растения и семена этого изобретения, включают в себя широкий диапазон растений, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, виды из родов АпасатВшт, АтасЫк, Акрагадик, Айора, Аνепа, Втаккка, СВтик, С1(ги11и8, Саркюит, СаЛВатик, Сосок, СоГГеа, Сиситэк, СисигЫВа, Эаисик, Е1ае1к, Егадапа, С1усте, Соккуршт, НеВайВик, Не1егоса1Вк, НотВеит, Нуоксуатик, Ьайиса, Ыпит, ЬоВит, Ьиршик, Ьусорегккоп, Ма1ик, МашВок Ма)огапа, МеВюадо, МсоВапа, О1еа, Оту/а, Рашеит, Рапйкейт, Регкеа, РВакео1ик, Р1к(асВ1а, Р1кит, Ругик, Ргипик, ВарВапик, Вютик, 8еса1е, 8епесю, Зтарй, 8о1апит, 8огдВит, ТВеоЫготик, ТпдопеПа, ТВВсит, УЮа, У1Вк, У1дпа или 2еа.
Нуклеиновые кислоты и полипептиды этого изобретения могут быть экспрессированы или инсертированы в любой клетке, органе, семени или ткани растения, в том числе дифференцированной и недифференцированной тканях или растениях, включающих в себя, но не ограничивающихся ими, корни, стебли, побеги, семядоли, эпикотиль, гипокотиль, листья, пыльцу, семена, опухолевую ткань и различные формы клеток в культуре, такие как отдельные клетки, протопласт, зародыши и каллусная ткань. Эта ткань растения может находиться в растении или в органе, культуре ткани или клеток.
Трансгенные растения
Настоящее изобретение обеспечивает трансгенные растения, содержащие и экспрессирующие гены СО28еп и белки этого изобретения; например, изобретение обеспечивает растения, например, трансгенные растения, которые обнаруживают улучшенный рост в условиях ограничения воды; таким образом, изобретение обеспечивает засухоустойчивые растения (например, сельскохозяйственные культуры).
Трансгенное растение этого изобретения может также включать в себя аппарат, необходимый для экспрессии или изменения активности полипептида, кодируемого эндогенным геном, например, изменением состояния фосфорилирования этого полипептида для поддержания его в активированном состоянии.
Трансгенные растения (или клетки растения или эксплантаты растения или ткани растения), вклю
- 20 019514 чающие в себя полинуклеотиды этого изобретения и/или экспрессирующие полипептиды этого изобретения, могут быть получены разнообразными хорошо установленными способами, как описано выше. После конструирования вектора, наиболее типично, экспрессионной кассеты, включающей в себя полинуклеотид, например, кодирующий фактор транскрипции или гомолог фактора транскрипции, этого изобретения, могут быть использованы стандартные способы для введения этого полинуклеотида в представляющие интерес растение, клетку растения, эксплантат растения или ткань растения. В одном аспекте, эти клетка, эксплантат или ткань растения могут быть регенерированы с получением трансгенного растения.
Это растение может быть любым высшим растением, в том числе голосемянными растениями, однодольными и двудольными растениями. Подходящие протоколы доступны для семейств Б-едиттокае (люцерны, сои, клевера и т.д.), ИтЬеШБегае (моркови, сельдерея, пастернака), Сгисйегае (капусты, редьки, рапса, брокколи и т.д.), СигсигЬйасеае (дынь и огурцов), бгаттеае (пшеницы кукурузы, риса, ячменя, проса и т.д.), 8о1апасеае (картофеля, томата, табака, перцев и т.д.) и различных других сельскохозяйственных культур. См. протоколы, описанные в АшшиШо е! а1., ебк., (1984) НапбЬоок оП Р1ап1 Се11 СиЙигеСгор 8рес1ек, МастШап РиЬ1. Со., Νονν Уогк, N. Υ.; 81шпа1по1о е! а1. (1989) №11иге 338: 274-276; Егошш е! а1. (1990) Вю/ТесЬпо1. 8: 833-839; и УакП е! а1. (1990) Бю/ТесЬпо1. 8: 429-434.
Трансформация и регенерация клеток как однодольных, так и двудольных растений является в настоящее время рутиной, и выбор наиболее подходящего способа трансформации будет определяться практикой. Выбор способа будет варьироваться в зависимости от типа растения, которое должно быть трансформировано; квалифицированные в данной области специалисты смогут определить подходящие конкретные способы для конкретных типов растений. Подходящие способы могут включать в себя, но не ограничиваются ими, электропорацию протопластов растений; опосредованную липосомами трансформацию; опосредованную полиэтиленгликолем (ПЭГ) трансформацию; трансформацию с использованием вирусов; микроинъекцию в клетки растений; бомбардировку микроснарядами клеток растений; вакууминфильтрацию и опосредованную АдгоЬас1егшт ШтеБааепк трансформацию. Трансформация обозначает введение нуклеотидной последовательности в растение способом, вызывающим стабильную или транзиторную экспрессию этой последовательности.
Успешные примеры модификации свойств растений трансформацией клонированными последовательностями, которые служат для иллюстрации существующего знания в этой области, включают в себя, например: Патенты США с номерами 5571706; 5677175; 5510471; 5750386; 5597945; 5589615; 5750871; 5268526;5780708;5538880;577369;5736369 и 5619042.
После трансформации растения предпочтительно отбирают с использованием доминантного селектируемого маркера, включенного в трансформирующий вектор. Обычно, такой маркер будет придавать устойчивость к антибиотикам или гербицидам трансформированным растениям, и отбор трансформантов может выполняться подверганием этих растений действию подходящих концентраций этого антибиотика или этого гербицида.
После отбора и выращивания до зрелого состояния трансформированных растений, растения, обнаруживающие модифицированный признак, идентифицируют. Этот модифицированный признак может быть любым из описанных выше признаков. Кроме того, для подтверждения того, что этот модифицированный признак обусловлен изменениями в уровнях экспрессии или активности полипептида или полинуклеотида этого изобретения, может быть использован анализ экспрессии мРНК с использованием Нозерн-блотов, ОТ-ПЦР или микроматриц, или экспрессии белка с использованием иммуноблотов или Вестерн-блотов или анализы смещения в геле.
Нуклеиновые кислоты и экспрессионные конструкции этого изобретения могут быть введены в клетку растения любыми способами. Например, нуклеиновые кислоты и экспрессионные конструкции могут быть введены в геном желаемого растения-хозяина, или нуклеиновые кислоты и экспрессионные конструкции могут быть эписомами. Введение в геном желаемого растения может быть таким, что продуцирование сенсора СО2 хозяина регулируется эндогенными регуляторными элементами транскрипции или трансляции.
Настоящее изобретение обеспечивает также нокаут-растения, в которых инсерция последовательности гена, например, гомологичной рекомбинацией, разрушила экспрессию этого эндогенного гена. Способы генерирования нокаут-растений хорошо известны в данной области, см., например, 81герр (1998) Ргос Асаб. 8ск И8А 95:4368-4373; М1ао (1995) Р1ап! Б 7:359-365. См. обсуждение в отношении трансгенных растений ниже.
В одном аспекте получение трансгенных растений или семян предусматривает включение последовательностей этого изобретения и, в одном аспекте (необязательно), маркерных генов в экспрессионную конструкцию-мишень (например, плазмиду) вместе с помещением последовательностей промотора и терминатора. Оно может включать в себя перенос модифицированного гена в растение посредством подходящего способа. Например, конструкция может быть введена непосредственно в геномную ДНК клетки растения с использованием таких способов, как электропорация и микроинъекция протопластов клеток растений, или эти конструкции могут быть введены непосредственно в ткань растения с использованием баллистических способов, таких как бомбардировка частицами ДНК. Например, см. СйпкШи (1997)
- 21 019514
Р1ап! Μοί. ΒίοΙ. 35:197-203; Раик^кИ (1996) Μοί. Бю1есЬло1. 6:17-30; ΚΙβίη (1987) Уинге 327:70-73; Такиш1 (1997) Сепек Сепек 8ук1. 72:63-69, в которых обсуждается использование бомбардировки частицами для введения трансгенов в пшеницу; и Абат (1997) кирга, в отношении использования бомбардировки частицами для введения УЛС в клетки растений. Например, Втекай (1997) кирга использовал бомбардировку частицами для генерирования трансгенных растений хлопчатника. Устройство для ускорения частиц описано в Патенте США № 5015580; и коммерчески доступно устройство для ускорения частиц ΒίοВаб (Βΐοΐΐκΐϊοκ) ΡΌ8-2000; см. также ΙοΗη, Патент США № 5608148; и ЕШк, Патент США № 5681730, описывающие опосредованную частицами трансформацию голосемянных растений.
В одном аспекте протоплаты могут быть иммобилизованы и инъецированы нуклеиновыми кислотами, например экспрессионной конструкцией. Хотя регенерация растений из протопластов с использованием злаков не является легкой, регенерация растений возможна в случае бобовых растений с использованием соматического эмбриогенеза из полученного из протопласта каллуса. Организованные ткани могут быть трансформированы голой ДНК с использованием способа генного пистолета, в котором ДНК наносят на микроснаряды из вольфрама, стреляющие на расстояние 1/100 размера клеток, которые несут эту ДНК глубоко в клетки и органеллы. Затем трансформированную ткань индуцируют для регенерации, обычно соматическим эмбриогенезом. Этот способ был успешным в нескольких видах злаков, в том числе в кукурузе и рисе.
В одном аспекте третья стадия может включать в себя отбор и регенерацию целых растений, способных передавать включенный ген-мишень следующей генерации. Такие способы регенерации основываются на манипуляции определенными фитогормонами в среде для выращивания культур тканей, обычно основывающейся на биоцидном и/или гербицидном маркере, который был введен вместе с желаемыми нуклеотидными последовательностями. Регенерация растений из культивируемых протопластов описана в Еуапк е! а1., РгоЮр1ак1к Ικοίηΐίοη апб СиИиге, ΗаηбЬοοк ο£ Р1ап1 Се11 Си11иге, рр. 124-176, МасМбШап РиЬЕкЫпд Сотрат', Ыете ΥοτΕ 1983; и Бтбшд, Ведепега1юп ο£ Р1ап!к, Р1ап! РгоЮркМк, рр. 21-73, СВС Ргекк, Βοса ВаЮп, 1985. Регенерация может быть также получена из каллуса растений, эксплантатов, органов или их частей. Такие способы регенерации описаны в общем виде в К1ее (1987) Апп. Веу. ο£ Р1ап! Рйук. 38:467-486. Для получения целых растений из трансгенных тканей, таких как незрелые зародыши, они могут выращиваться при контролируемых условиях окружающей среды в серии сред, содержащих питательные вещества и гормоны, в процессе, известном как культура ткани. Как только целые растения образуются и продуцируют семена, начинается оценивание этого потомства.
После стабильного введения экспрессионной кассеты в трансгенные растения она может быть введена в другие растения половым скрещиванием. Может быть использован любой из ряда стандартных способов разведения, в зависимости от подлежащего скрещиванию вида. Поскольку трансгенная экспрессия нуклеиновых кислот этого изобретения приводит к фенотипическим изменениям, растения, содержащие рекомбинантные нуклеиновые кислоты этого изобретения, могут быть скрещены половым путем со вторым растением для получения конечного продукта. Таким образом, семя этого изобретения может быть получено из гибрида между двумя трансгенными растениями этого изобретения гибрида или гибрида между растением этого изобретения и другим растением. Желаемые эффекты (например, экспрессия полипептидов этого изобретения для продуцирования растения, в котором изменено поведение цветения) могут быть усилены, когда оба родительских растения экспрессируют эти полипептиды, например, сенсор СО2 этого изобретения. Эти желаемые эффекты могут передаваться следующим генерациям растений стандартными способами размножения.
Антисмысловые ингибирующие молекулы
В одном аспекте изобретение обеспечивает антисмысловые ингибирующие молекулы, содержащие последовательность этого изобретения (которые включают в себя как смысловые, так и антисмысловые цепи). В качестве антисмысловых олигонуклеотидов могут быть использованы природно-встречающиеся или синтетические нуклеиновые кислоты. Эти антисмысловые олигонуклеотиды могут иметь любую длину; например, в альтернативных аспектах, антисмысловые олигонуклеотиды имеют длину приблизительно 5-100, приблизительно 10-80, приблизительно 15-60, приблизительно 18-40. Оптимальная длина может быть определена рутинным скринингом. Антисмысловые олигонуклеотиды могут присутствовать в любой концентрации. Оптимальная концентрация может быть определена рутинным скринингом. Известно большое разнообразие синтетических, не встречающихся в природе нуклеотидных аналогов и аналогов нуклеиновых кислот, которые могут решить эту потенциальную проблему. Например, могут быть использованы пептиднуклеиновые кислоты (ПНК), содержащие неионогенные структуры, такие как единицы Ы-(2аминоэтил)глицина. Могут быть также использованы антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие фосфоротиоатные связи, как описано в \ЕО 97/03211; \ЕО 96/39154; Ма!а (1997) ΤοχΕο1 Арр1 Рйагта^ 144:189-197; АпРкепке Тйегареийск, еб. Адга\\'а1 (Нитапа Ргекк, ΤοΙο\\Ή, N1., 1996). Антисмысловые олигонуклеотиды, имеющие синтетические аналоги молекулярного скелета ДНК, обеспеченные этим изобретением, могут также включать в себя фосфородитиоатные, метилфосфонатные, фосфорамидатные, алкилфосфотриэфирные, сульфаматные, 3'-тиоацетальные, метилен(метилимино), 3'-Νкарбаматные и морфолинокарбаматные нуклеиновые кислоты, как описано выше.
- 22 019514
Интерференция РНК (ΚΝΑί)
В одном аспекте изобретение обеспечивает ингибирующую молекулу РНК, так называемую молекулу ΚΝΑί, содержащую последовательность этого изобретения. В одном аспекте эта молекула Κ,ΝΑί содержит двухцепочечную РНК (άδΚΝΑ). Молекула ΚΝΑί может содержать двухцепочечную молекулу РНК (άδΚΝΑ), например, δίΚΝΑ (короткую интерферирующую (ингибирующую) РНК)), ιηίΚΝΑ (микроРНК), и/или молекулы коротких шпилечных ΚΝΑ (δΗΚΝΑ). Молекула ΚΝΑί, например, δίΚΝΑ (малая ингибирующая РНК), может ингибировать экспрессию генов СО28еп и/или ιηίΚΝΑ (микроРНК) может ингибировать трансляцию гена СО28еп или любых родственных генов сенсоров СО2.
В альтернативных аспектах ΚΝΑί имеет длину приблизительно 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 или более дуплексных нуклеотидов. Хотя настоящее изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, ΚΝΑί может входить в клетку и вызывать деградацию одноцепочечной РНК (δδΚΝΑ) сходных или идентичных последовательностей, в том числе эндогенных мРНК. Когда клетку подвергают действию двухцепочечной РНК (άδΚΝΑ), мРНК из гомологичного гена селективно деградируется посредством процесса, называемого интерференцией РНК (ΚΝΑί). Возможным механизмом, лежащим в основе ΚΝΑί (интерференции РНК), например, δίΚΝΑ для ингибирования транскрипции и/или ιηίΚΝΑ для ингибирования трансляции, является разрушение двухцепочечной РНК (άδΚΝΑ), совпадающей с конкретной последовательностью гена в коротких участках, называемых короткими интерферирующими РНК, которые запускают деградацию мРНК, которая совпадает с его последовательностью. В одном аспекте ΚΝΑί этого изобретения используют в терапевтических веществах для сайленсинга генов, см., например, 8йпеу (2002) Бгид Όίδοον. Топау 7:1040-1046. В одном аспекте изобретение обеспечивает способы селективной деградации РНК с использованием ΚΝΑί этого изобретения. Этот способ может быть использован на практике ш νίΐΓο, ех νίνο или ίπ νίνο. В одном аспекте молекулы ΚΝΑί этого изобретения могут быть использованы для генерирования мутации с потерей функции в клетке, ткани растения или органе или семени растения или в растении.
В одном аспекте внутриклеточное введение ΚΝΑί (например, ιηίΚΝΑ или δίΚΝΑ) происходит посредством интернализации специфического для клетки-мишени лиганда, связанного с РНКсвязывающим белком, содержащим адсорбированную ΚΝΑί (например, πιιογοΚΝΑ). Этот лиганд является специфическим в отношении уникального антигена поверхности клетки-мишени. Если этот уникальный антиген поверхности клетки не интернализуется после связывания с его лигандом, интернализацию стимулируют включением богатого аргинином пептида, или другого проникающего через мембрану пептида, в структуру этого лиганда или РНК-связывающего белка или присоединением такого пептида к этому лиганду или РНК-связывающему белку. См., например, Публикации патентов США с номерами 20060030003; 20060025361; 20060019286; 20060019258. В одном аспекте изобретение обеспечивает формы на основе липидов для доставки, например, для введения нуклеиновых кислот этого изобретения в виде частиц нуклеиновая кислота-липид, содержащих молекулу ΚΝΑί, в клетку, см., например, публикацию патента США № 20060008910.
Способы получения и использования молекул ΚΝΑί, например δίΚΝΑ и/или ιηίΚΝΑ, для селективной деградации РНК хорошо известны в данной области, см., например, патенты США с номерами 6506559;6511824;6515109;6489127.
Способы получения экспрессионных конструкций, например, векторов или плазмид, из которых транскрибируется ингибирующий ген СО28еп полинуклеотид (например, дуплексная δίΚΝΑ этого изобретения), хорошо известны и являются рутинными. Регуляторный район (например, промотор, энхансер, сайленсер, донор, акцептор сплайсинга и т.д.) может быть использован для транскрипции цепи РНК или цепей РНК ингибирующего ген СО28еп полинуклеотида из этой экспрессионной конструкции. При получении дуплексной молекулы δίΚΝΑ, ингибирующей ген СО28еп, смысловая и антисмысловая цепи части-мишени ΙΚΕδ-мишени могут транскрибироваться в виде двух отдельных РНК-цепей, которые будут отжигаться (гибридизоваться) вместе, или в виде единственной РНК-цепи, которая будет образовывать шпилечную петлю и гибридизоваться сама с собой. Например, конструкцию, нацеленную на часть гена СО28еп, встраивают между двумя промоторами (например, двумя промоторами растений, вирусов, бактериофага Т7 или другими промоторами), так что транскрипция происходит в двух направлениях и будет приводить к комплементарным РНК-цепям, которые могут впоследствии отжигаться (гибридизоваться) с образованием ингибирующей δίΚΝΑ этого изобретения. Альтернативно, часть-мишень гена СО28еп может быть сконструирована в виде первого и второго кодирующего района вместе на одном экспрессирующем векторе, где этот первый кодирующий район гена-мишени СО28еп находится в смысловой ориентации относительно контролирующего его промотора и где второй кодирующий район гена СО28еп находится в антисмысловой ориентации относительно контролирующего его промотора. Если транскрипция смыслового и антисмыслового кодирующих районов этой части-мишени гена СО28епмишени происходит от двух отдельных промоторов, результатом могут быть две отдельные РНК-цепи, которые могут быть затем гибридизованы с образованием ингибирующей ген СО28еп δίΚΝΑ, например ингибирующей ген СО28еп δίΚΝΑ этого изобретения.
В другом аспекте транскрипция смысловой и антисмысловой части гена-мишени СО28еп контролируется единственным промотором, и полученный транскрипт будет единственной шпилечной РНК
- 23 019514 цепью, которая является самокомплементарной, т.е. образует дуплекс укладыванием обратно на себя с образованием ингибирующей ген СО28еп молекулы δίΚ,ΝΛ. В этой конфигурации спейсер, например, нуклеотиды, между смысловым и антисмысловым кодирующими районами этой части-мишени гена СО28еп-мишени может улучшать способность этой одноцепочечной РНК образовывать шпилечную петлю, причем эта шпилечная петля содержит этот спейсер. В одном варианте осуществления этот спейсер имеет длину нуклеотидов приблизительно 5-50 нуклеотидов. В одном аспекте смысловой и антисмысловой кодирующие районы этой 81№А, каждый, может находиться на отдельном экспрессирующем векторе и под контролем его собственного промотора.
Ингибирующие рибозимы
Настоящее изобретение обеспечивает рибозимы, способные связывать мРНК гена сенсора СО2. Эти рибозимы могут ингибировать активность гена сенсора СО2, например, действием на мРНК. Стратегии для конструирования рибозимов и отбора специфической для гена сенсора СО2 антисмысловой последовательности хорошо описаны в научной и патентной литературе, и квалифицированный специалист может конструировать такие рибозимы с использованием новых реагентов этого изобретения. Рибозимы действуют посредством связывания РНК-мишени через связывающую эту РНК-мишень часть рибозима, которая удерживается в тесной близости с ферментативной частью этой РНК, чтобы расщеплять РНКмишень. Таким образом, этот рибозим узнает и связывает РНК-мишень комплементарным связыванием оснований и после связывания с правильным сайтом действует ферментативно для расщепления и инактивации РНК-мишени. Расщепление РНК-мишени таким образом будет разрушать ее способность управлять синтезом кодируемого белка, если это расщепление имеет место в этой кодирующей последовательности. После связывания рибозима и расщепления его РНК-мишени он может высвобождаться из этой РНК для повторяемого связывания и расщепления новых мишеней.
Карбоангидраза (карбонатдегидратаза)
Настоящее изобретение обеспечивает способы понижающей регуляции или уменьшения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие экспрессию в клетке полипептида, имеющего карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность. В альтернативных аспектах может быть использована любая карбоангидраза (карбонатдегидратаза), в том числе, например, ферменты растительная или бактериальная карбоангидраза (карбонатдегидратаза). Примерные карбоангидразные (карбонатдегидратазные) ферменты, которые могут быть использованы для применения на практике этого изобретения, включают в себя карбангидразные (карбонатдегидратазные) ферменты, выделенные или полученные из таких растений, как
Рис (Огу/а «айуа)
ΝΜ 00 1072713 (= СепЬапк ассеззюп пшпЬег) мРНК Огуга зайуа Оарошса си111Уаг-§гоир) 0з12§0153500 (0з12§0153500), полная сск Βί|115487387|κί]ΝΜ_001072713.1|[115487387] ΝΜ ОО 1072308 (= СепЬапк ассеззюп питЬег) мРНК Огуга зайча 0арошса си1Нуаг-§гоир) Оз11§0153200 (Оз 11^0153200), полная εάδ8ί|115484228(Γβί|ΝΜ_001072308.1|[115484228]
ΝΜ ОО 1069944 (= СепЬапк ассеззюп питЬег) мРНК Огуга заГгуа (|аротса си11гуаг-§гоир) 0з09§0464000 (0з09§0464000), полная с4з §ί|115479630|Γβί|ΝΜ_001069944.1|[1 15479630]
ΝΜ_001069887 (= СепЬапк ассеззюп питЬег) мРНК Огуга зайуа Оаропгса си11гуаг-§гоир) 0з09§0454500 (0з09§0454500), полная с4з ех|115479516|гс(ШМ_001069887.11[115479516]
ΝΜ 001068550 (= СепЬапк ассеззюп питЬег) мРНК Огуга заГгча Оаротса сикгуаг-§гоир) 0з08§0470200 (0з08§0470200), полная сйз §ί|115476837|Γβί1ΝΜ_001068550.1 |[115476837] ΝΜ 001068366 (= СепЬапк ассеззгоп питЬег) мРНК Огуга забса Дарогнса си111уаг-§гоир) 0з08§0423500 (0з08д0423500), полная сбз §г| 115476469|ΓβΟΝΜ_001068366.11[115476469]
ΝΜ_001064586 (= СепЬапк ассеззгоп питЬег) мРНК Огуга зайуа Оарошса сиШуаг-§гоир) 0з0б§0610100 (0з06§0610100), полная сдз §ί| 115468903|ге1ШМ_001064586.11[115468903] ; ΝΜ_001053565 (= СепЬапк ассеззгоп питЬег) мРНК Огуга заЦуа 0аротса сиШуаг-егоир) 0з02§0533300 (0з02§0533300), полная ο438ί|115446500γΐΝΜ_001053565.1][115446500]
ΝΜ_001050212 (= СепЬапк ассеззюп питЬег) мРНК Огуга зайуа Оарошса си111уаг-§гоир) Оз01 §0640000 (Оз01 §0640000), полная
- 24 019514 сбз 8ί|115438794|Γεί1ΝΜ_001050212.1|[115438794]
ΝΜ_001050211 (= ОепЬапк ассеззшп пшпЬег) мРНК Огуга зайуа Царошса си1йуаг-8гоир) Оз01§0639900 (ОзО 1§0639900), частичная с* §ί|115438792|τεί|ΝΜ_001050211.11 [115438792]
ЕГ576561 мРНК карбоангидразы Огуга зайуа (тсйса сн1йуаг-§гоир) с1опе 058-385-480-610, частичная сйз §ί|149392692|§Ь|ЕР576561.11[149392692]
АР182806 мРНК карбоангидразы 3 Огуга зайуа, полная сйз §1|5917782|§Ь|АР182806.1|АГ182806[5917782] и08404 мРНК карбоангидразы хлоропласта Огуга зайуа, полная сбз §1.606816|§Ы и08404.11081308404 [606816]
Кукуруза: (Тл-я шау)
ΝΜ_ΟΟ1111889 мРНК карбоангидразы Ζ-еа тауз (ЬОС542302), §ί[162459146|геЯИМ_0011118 89.11[162459146]
1Ю8403 мРНК карбоангидразы 2еа тауз ОоИеп Вап1ат, полная сбз §ΐ|606814[§Β|ϋ08403.1 ΙΖΜ1308403 [606814]
1108401 мРНК карбоангидразы Ъга тауз, полная сйз §ί|606810|§Ь|и08401.1ΙΖΜΙΙ08401 [606810]
М95073 мРНК предположительного гомолога карбоангидразы Ζεπ тауз, частичная сйз §ΐ|168561 |§Ь|М95073.1 |ΜΖΕΟΚΡΝ[168561]
Соя: (С1усте)
ΑΙ239132 мРНК карбоангидразы О1ус1пе тах §1|4902524|етЬ[А3239132.1Ц4902524]
Томат (Ьусорегысоп)
А1849376 мРНК хлоропластной карбоангидразы (гена са2) Ьусорегз1соп езсикпйип Ё(56562176]етЬ|А.Т849376.1|[56562176]
АШ9375 мРНК карбоангидразы (гена са1) Ьусорегзкон езсч1еп1ит
- 25 019514 £1|56562174|етЬ|А2849375.1|[56562174]
Табак (Рйсойапа)
АГ492468 мРНК нектарина III (ΝΕ03) Мсойапа 1ап£5с1ог£Гй х Мсойапа заЫегае, полная ссЕ В1|29468279|ёЬ|АН492468.1|[29468279]
АР454759 мРНК бета-карбоангидразы (СА) ЬИсойапа (аЬасит, полная сдз; ядерный ген для продукта хлоропласта §ΐ|22550385|§Ь|АР454759.2|(22550385]
АВ009887 мРНК карбоангидразы ЬЛсойапа (аЬасит, частичная сйз §1|8096276|(1ЬЛАВ009887.1 ([8096276]
АВО12863 мРНК ΝΡΓΑ1 ТЧ1сойапа рап1си1а1а, полная сбз §ί|306127θ1άΒί|ΑΒ012863.11(3061270]
Ь19255 мРНК хлоропластной карбоангидразы Ыкойапа 1аЪасит, 3’-конец
Й1131О92О!§Ь|Ы9255.1 |ΤΟΒΌΑΚΆΝΗΥ[310920]
М94135
Ген хлоропластной карбоангидразы МЗсойапа ьаЬасшп, полная сйз ё1|170218|ёЬ|М94135.1|ТОВСЬСАА[170218]
ΑΥ974608 мРНК хлоропластной карбоангидразы №сойапа ЪепЛаппапа с1опе 30Р62, частичная сйз; ядерный ген для продукта хлоропласта βί(62865756|^[ΑΥ974608Л |[62865756]
ΑΥ974607 частичная мРНК хлоропластной карбоангидразы с^з;
ЬПсойапа
Ьеп1Ьапмапа с!опе 30С84, ядерный ген для продукта хлоропласта 8ί|62865754^Β|ΑΥ974607Η|[62865754]
ΑΥ974606 мРНК хлоропластной карбоангидразы
ЬПсойапа
Ъепйапйапа с!опе ЗОВ 10, частичная сйз;
ядерный ген для продукта хлоропласта §1|62865752|§Ь|АУ974606Л|[62865752]
Ячмень (Ногйеит)
136959 мРНК карбоангидразы
Ногйеит уи!§аге, полная сск ^|5584981ёЬ1Ь36959.1|ВЬУСА[558498]
Хлопчатник (Соззуршт)
- 26 019514
АР132855 мРНК карбоангидразы изоформы 2 (СА2) Созяуршт Ыгзитт, частичная сс!з:
ядерный ген для продукта пластид £Ϊ|4754914|(>Ь|АР 132855.1 |АР 132855(4754914]
АР132854 мРНК карбоангидразы изоформы 1 (СА1) Соззур1ит Ыгяийпп, частичная с4з;
ядерный ген для продукта пластид ®1|4754912|®Ь|АН 132854.1]АР132854(4754912]
Тополь
1155837 мРНК карбоангидразы (СА1а) Рори1из 1гети1а х Рори1из 1гети1о1йез, ядерный ген, кодирующий хлоропластный белок, полная с4з ©I1354514|вЬ|1155837.1 |РТи55837[1354514] :1155838 мРНК карбоангидразы (СА1Ь) Рори1из 1геши1а х Рори1из 1гети1оМез, ядерный ген, кодирующий хлоропластный белок, полная сйз §1|1354516|§Ь|и55838.1|РТи55838[135451б]
Сисишк
09641132 мРНК карбоангидразы Сисипмз яайуиз с1опе СТ18ГЗ, частичная сйз §ί| 1176631591цЬ'ООб! 113 2.11 [ 117663159]
Ьуеорегмсоп
А1849376 мРНК хлоропластной карбоангидразы (ген са2) Ьусорегзкоп езсикпйпп
81|56562176|етЬ|А1849376.1|[56562176]
А1849375 мРНК карбоангидразы (ген са1) Ьусорегзкоп езси1еп1шп §1|56562174|етЬ|А1849375.1|[56562174]
Мей1са£0
Х93312 мРНК карбоангидразы М.зайуатКИА £1|1938226|етЬ|Х93312.1|[1938226]
РЬазео1из
А1547634
Частичная мРНК карбоангидразы (ген СА) РЬазеоки уц^айя и|285564291стЪ|А1547634.1|[285 56429]
Рйит
Х52558 мРНК карбоангидразы Реасар (ЕС 4.2.1.1) @1|20672|етЬ|Х52558.11(20672]
М63627 мРНК карбоангидразы Р. яайтат, полная сйз §ί| 169056|£Ь|М63627.1 )РЕАСАМКА[169056]
Ругая
АР 195204 мРНК карбоангидразы изоформы 1 (СА1) штамма Ругня рупРоПа ХУЬапцксотЬае, полная сйя §1|8698882|§Ь|АР 195204.11АГ195204[8698882]
Ргипиз
ЕР640698
Предположительная мРНК карбоангидразы Ргипиз <1и1с1з с1опе Р<1Ься-Е45, частичная сйя §ΐ| 148807206|«Ь|ЕГ640698.1 |[148807206]
У1<р)а
АР139464 мРНК карбоангидразы (С1рСА1) Ущпа га&аГа, полная сйз; ядерный ген для хлоропластного продукта @1|8954288(8Ь|АР139464.2|АГ139464(8954288]
Кодирующие карбоангидразу нуклеиновые кислоты из любого гена карбоангидразы, например, в том числе генов растений и бактерий, могут быть использованы для применения на практике этого изобретения; например, может быть использована нуклеиновая кислота из любого гена карбоангидразы любого растения, в том числе любая кодирующая карбоангидразу последовательность нуклеиновой кислоты из любого семейства генов АгаЫборык, например любая кодирующая карбоангидразу последователь
- 27 019514 ность нуклеиновой кислоты из семейства АтаЫборык, например из АтаЫборык (НаНапа. может быть использована для применения на практике композиций и способов этого изобретения, такая как примерные кодирующие карбоангидразу последовательности нуклеиновых кислот (см. пример 6 ниже):
Семейство Номер ΑΟΙ’ Официальная Обозначение генов номенклатура11 альфа (а) А13§52720
А12828210
А15§04180
Л(4ц20990
АН 808065
А14§21000
А11§08080
Αΐ5§56330 бетаф) Λι3β01500
А15§14740
АН §23730
А11§70410
А14§33580
А11§58180 гамма (γ) А11§19580
АН §47260
А15§66510
А15§63510
А13 §48680
А1аСА1
А(аСА2
А1аСАЗ
А1аСА4
А1аСА5
АШСА6
А1аСА7
АЫСА8
ΛΙβΟΑΙ
АфСА2
АфСАЗ
АфСА4 СА4
АфСА5
А1рСА6
АгуСА1
А1уСА2
АгуСАЗ
ΑιγΟΑΕΙ
А|уСАЬ2 (8Е<2
5Ер ГО N0:21
8Е<2 ΙΟ N0:22
8Е() ГО N0:23
КЕГ) ГО N0:24
5>ΕΟ!ΗΝΟ:25
ΚΕζ) И) N0:26
5Ε(}ΙΟΝΟ:27
8Е0 ГО N0:28
СА1 (8Е() ГО N0:7)
СА2 (8ЕС) ГО N0:20)
8Е<2 ГО N0:29 №N0:1)
8ΕΓ>1ΗΝΟ:30
СА6 (8Е0 Ιϋ N0:4
8Ε(2ΙΏΝ0:31
8ЕГ) ГО N0:32
8Е<2 ГО N0:33
8Ε(2Π)ΝΟ:34
8Ε(3ΙΡΝΟ:35 аИнициативные номера локусов генома АгаЫборык (НаНапа Ьв соответствии с РаЬге Ν. е( а1. (2007) Р1ап(, Се11 Εην^^опшеηΐ 30:617-629; или из веб-сайта АгаЫборк1к [пГоппаНоп Кекоигсе (Сагпед1е [пкШиНоп Гог Заепсе, Рерайтей оГ Р1ап( Вю1оду, 81апГогб, СА, Гипбеб Ьу (Не №(юпа1 Заепсе РоипбаВоп).
Таким образом, в альтернативных аспектах, для применения на практике этого изобретения может быть использована любая карбоангидраза (карбонатдегидратаза).
Генерирование нуклеиновых кислот и манипулирование нуклеиновыми кислотами
В альтернативных аспектах изобретение обеспечивает, например, выделенные, синтетические и/или рекомбинантные нуклеиновые кислоты, кодирующие новые гены сенсоров СО2, и кодирующие последовательности этого изобретения, нуклеиновые кислоты (например, ΒΡ-ΝΑ. микро-ΚΝΑ, антисмысловые РНК), которые могут ингибировать экспрессию генов или мРНК сенсоров СО2, и специфические для замыкающих клеток регуляторные элементы транскрипции, такие как промоторы. Нуклеиновые кислоты этого изобретения могут быть получены, выделены или получены манипулированием, например клонированием и экспрессией библиотек кДНК, амплификацией мРНК или геномной ДНК при помощи ПЦР и
т.п.
Нуклеиновые кислоты, используемые для применения на практике этого изобретения, независимо от того, являются ли они РНК, 1ΚΝΑ, антисмысловой нуклеиновой кислотой, кДНК, геномной ДНК, векторами, вирусами или их гибридами, могут быть выделены из различных источников, генетически сконструированы, амплифицированы и/или экспрессированы/генерированы рекомбинантно.
Рекомбинантные полипептиды (например, гликозилгидролазы этого изобретения), генерированные из этих нуклеиновых кислот, могут быть индивидуально выделены или клонированы и испытаны на желаемую активность. Может быть использована любая рекомбинантная экспрессионная система, в том числе системы экспрессии бактерий, грибов, млекопитающих, дрожжей, насекомых или растений.
Альтернативно, эти нуклеиновые кислоты могут быть синтезированы ш уйго хорошо известными способами химического синтеза, как описано, например, в Абатк (1983) ί. Ат. СНет. 8ос. 105:661; Ве1оикоу (1997) №с1ею Ас1бк Кек. 25:3440-3444; Ргепке1 (1995) Ргее Каб1с. Вю1. Меб. 19:373-380; В1оттегк (1994) ВюсНеткНу 33:7886-7896; №гапд (1979) Ме(Н. Εпζушо1. 68:90; Вгозтп (1979) Ме(Н. Εпζушо1. 68:109; Веаисаде (1981) Тейа. Ьей. 22:1859; и.З. Ра(еп( №. 4458066.
Способы для манипулирования с использованием нуклеиновых кислот, такие как, например, субклонирование, меченые зонды (например, мечение случайным праймером с использованием полимеразы Кленова, ник-трансляция, амплификация), секвенирование, гибридизация и т.п. хорошо описаны в научной и патентной литературе, см., например, ЗатЬгоок, еб., МО^ΕСυ^ΑК С^ОNINС: А ЬАВОКАТОКУ МА^АЬ (2-пб ΕΡ.), Уо1к. 1-3, Со1б Зрппд НагЬог ЬаЬогаЮгу, (1989); СиК^ОТ РКОТОСОЬЗ ΙΝ МОΕΕΓΕΕ.ΛΚ ВЮЬОСУ, АикиЬе1, еб. .1оНп \УИеу & Зопк, Ыс., №\\ Уогк (1997); ЬАВОКАТОКУ ТΕСНΝΙβυΕδ ΙΝ ВМС^М^^У АИР МО^ΕСυ^ΑК ВЮЬОСУ: НΥВКI^IΖΑТЮN \АЕЕН ΝΕΦΕΕΙΦ АСЮ РКОВΕ8, Рай Ι. ТНеогу апб №с1ею Ас1б Ргерагайоп, Туккеп, еб. Ε№\Λγ. Ν.Υ. (1993).
Другим применимым способом получения и манипулирования с использованием нуклеиновых кислот, используемым для применения на практике способов этого изобретения, является клонирование из геномных проб и, если желательно, скрининг и повторное клонирование инсертов, выделенных или амплифицированных, например, из геномных клонов или кДНК-клонов. Источники нуклеиновых кислот,
- 28 019514 используемых в способах этого изобретения, включают в себя библиотеки геномных ДНК или кДНК, содержащиеся, например, в искусственных хромосомах млекопитающих (МАС), см., например, Патенты США с номерами 5721118; 6025155; искусственных хромосомах человека, см., например, РозепГе1б (1997) №11. Сепе1. 15:333-335; искусственных хромосомах дрожжей (УАС); бактериальных искусственных хромосомах (ВАС); искусственных хромосомах Р1, см., например, №ооп (1998) Сепопнсз 50:306316; Р1-произведенных векторах (РАС), см., например, Кет (1997) В1о1ес11пк|иез 23:120-124; космиды, рекомбинантные вирусы, фаги или плазмиды.
Настоящее изобретение обеспечивает слитые белки и кодирующие их нуклеиновые кислоты. Полипептид этого изобретения может быть слит с гетерологичным пептидом или полипептидом, таким как Νконцевые идентификационные пептиды, которые придают желаемые характеристики, такие как флуоресцентное детектирование, увеличенная стабильность и/или упрощенная очистка. Пептиды и полипептиды этого изобретения могут быть также синтезированы и экспрессированы в виде слитых белков с одним или несколькими дополнительными доменами, связанными с ними, например, для получения более иммуногенного пептида, для более легкого выделения рекомбинантно синтезированного пептида, для идентификации и выделения антител и экспрессирующих антитела В-клеток и т.п. Облегчающие детектирование и очистку домены включают в себя, например, образующие хелаты металлов пептиды, такие как полигистидиновые участки и модули гистидин-триптофан, которые делают возможной очистку на иммобилизованных металлах, домены белка А, которые делают возможной очистку на иммобилизованном иммуноглобулине, и домен, используемый в системе ЕЬАС8-удлинение/аффинная очистка (1ттипех Согр, 8еай1е №А). Включение расщепляемых линкерных последовательностей, таких как Фактор Ха или энтерокиназа (1пуйгодеп, 8ап Э1едо СА), между доменом очистки и содержащим мотив пептидом или полипептидом, облегчает очистку. Например, экспрессирующий вектор может включать в себя эпитопкодирующую последовательность нуклеиновой кислоты, связанную с шестью остатками гистидина, за которыми следуют тиоредоксин и сайт расщепления энтерокиназой (см., например, №1Шатз (1995) Вюсйепнзйу 34:1787-1797; ЭоЬей (1998) Рго1ет Ехрг. РилГ. 12:404-414). Эти остатки гистидина облегчают детектирование и очистку, тогда как сайт расщепления энтерокиназой обеспечивает средство для очистки эпитопа от остальной части этого слитого белка. Технология, относящаяся к векторам, кодирующим слитые белки, и применению слитых белков, хорошо описана в научной и патентной литературе, см., например, Кго11 (1993) ΩΝΛ Се11. Вю1., 12:441-53.
Нуклеиновые кислоты или последовательности нуклеиновых кислот этого изобретения могут быть олигонуклеотидом, нуклеотидом, полинуклеотидом или фрагментом любого из них, или ДНК или РНК геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять смысловую или антисмысловую цепь, пептиднуклеиновой кислотой (ПНК) или любым ДНК-подобным или РНК-подобным материалом природного или синтетического происхождения. Фразы нуклеиновая кислота или последовательность нуклеиновой кислоты включает в себя любые от олигонуклеотида, нуклеотида, полинуклеотида или фрагмента до ДНК или РНК (например, мРНК, рРНК, тРНК, иРНК) геномного или синтетического происхождения, которые могут быть одноцепочечными или двухцепочечными и могут представлять смысловую или антисмысловую цепь, до пептиднуклеиновой кислоты (ПНК) или до любого ДНК-подобного или РНК-подобного материала, природного или синтетического происхождения, в том числе, например, иРНК, рибонуклеопротеины (например, двухцепочечные иРНК, например, иРНП). Этот термин включает в себя нуклеиновые кислоты, т.е. олигонуклеотиды, содержащие известные аналоги природных нуклеотидов. Этот термин включает в себя также подобные нуклеиновым кислотам структуры с синтетическим молекулярным скелетом, см., например, Ма1а (1997) Тох1со1. Арр1. Рйагтасо1. 144:189-197; 81гаизз-8оикир (1997) Вюсйепнзйу 36:86928698; 8атз1ад (1996) АпНзепзе №.1с1е1с Лай Эгад Эеу 6:153-156. Олигонуклеотид включает в себя либо одноцепочечный полидезоксинуклеотид, либо две комплементарные полидезоксинуклеотидные цепи, которые могут быть химически синтезированы. Такие синтетические олигонуклеотиды не имеют 5'фосфата и, следовательно, не будут лигироваться с другим олигонуклеотидом без добавления фосфата с АТФ в присутствии киназы. Синтетический олигонуклеотид может лигироваться с фрагментом, который не был дефосфорилирован.
В альтернативных аспектах термин ген означает сегмент ДНК, участвующий в продуцировании полипептидной цепи; он может включает в себя районы, предшествующие кодирующему району и следующие за кодирующим районом (лидер и трейлер), а также, при необходимости, промежуточные последовательности (интроны) между отдельными кодирующими сегментами (экзонами). Функционально связанные может относиться к функциональной взаимосвязи между двумя или более сегментами нуклеиновой кислоты (например, ДНК). В альтернативных аспектах этот термин может относиться к функциональной взаимосвязи регуляторной последовательности транскрипции с транскрибируемой последовательностью. Например, промотор функционально связан с кодирующей последовательностью, такой как нуклеиновая кислота этого изобретения, если он стимулирует или модулирует транскрипцию этой кодирующей последовательности в подходящей клетке-хозяине или другой системе экспрессии. В альтернативных аспектах промоторные регуляторные последовательности транскрипции могут быть функционально связаны с транскрибируемой последовательностью, где они могут быть физически смежными
- 29 019514 с этой транскрибируемой последовательностью, т.е. они могут быть цис-действующими. В альтернативных аспектах, регуляторные последовательности транскрипции могут не быть физически смежными или локализованными в тесной близости с кодирующими последовательностями, транскрипцию которых они усиливают.
В альтернативных аспектах изобретение обеспечивает экспрессионную кассету, содержащую нуклеотидную последовательность этого изобретения, которая может быть способна выполнять экспрессию этой нуклеиновой кислоты, например, структурного гена (т.е. кодирующей белок последовательности этого изобретения) в хозяине, совместимом с такими последовательностями. Экспрессионные кассеты могут включать в себя, по меньшей мере, промотор, функционально связанный с кодирующей этот полипептид последовательностью; и, в одном аспекте, с другими последовательностями, например сигналами терминации транскрипции. Дополнительные факторы, необходимые или полезные в выполнении экспрессии, например, энхансеры, также могут быть использованы. В альтернативных аспектах экспрессионные кассеты включают в себя также плазмиды, экспрессирующие векторы, рекомбинантные вирусы, любую форму рекомбинантого вектора в виде голой ДНК и т.п. В альтернативных аспектах вектор этого изобретения может содержать нуклеиновую кислоту, которая может инфицировать, трансфицировать, транзиторно или перманентно трансдуцировать клетку. В альтернативных аспектах вектор может быть голой нуклеиновой кислотой или нуклеиновой кислотой, находящейся в комплексе с белком или липидом. В альтернативных аспектах векторы содержат вирусные или бактериальные нуклеиновые кислоты и/или белки и/или мембраны (например, мембрану клетки, липидную оболочку вируса и т.д.). В альтернативных аспектах, векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, репликоны (например, РНК-репликоны, бактериофаги), к которым могут присоединяться и становиться реплицируемыми фрагменты ДНК. Таким образом, векторы включают в себя, но не ограничиваются ими, РНК, автономную самореплицирующуюся кольцевую или линейную ДНК или РНК (например, плазмиды, вирусы и т.п., см., например, Патент США № 5217879) и включают в себя как экспрессирующие плазмиды, так и неэкспрессирующие плазмиды. В альтернативных аспектах этот вектор либо может стабильно реплицироваться клетками во время митоза в качестве автономной структуры, либо может быть включен в геноме хозяина.
В альтернативных аспектах термин промотор, используемый для применения на практике этого изобретения, включают в себя все последовательности, способные запускать транскрипцию кодирующей последовательности в клетке, например, в клетке растения. Таким образом, промоторы, используемые в конструкциях этого изобретения, включают в себя цис-действующие элементы регуляции транскрипции и регуляторные последовательности, которые участвуют в регуляции или модуляции тайминга и/или скорости транскрипции гена. Например, промотор, используемый для применения на практике этого изобретения, может быть цис-действующим элементом регуляции транскрипции, включающим в себя энхансер, промотор, терминатор транскрипци, сайт инициации репликации, последовательность хромосомной интеграции, 5'- и З'-нетранслируемые районы, или интронную последовательность, которые участвуют в регуляции транскрипции. Эти цис-действующие последовательности обычно взаимодействуют с белками или другими биомолекулами для проведения (включения/выключения, регуляции, модуляции и т.д.) транскрипции. Конститутивные промоторы, используемые для выполнения на практике этого изобретения, могут быть промоторами, которые запускают экспрессию непрерывно при большинстве условий окружающей среды и состояний развития или дифференцировки клеток. Индуцибельные или регулируемые промоторы, используемые для применения на практике этого изобретения, могут управлять экспрессией нуклеиновой кислоты этого изобретения под влиянием условий окружающей среды или состояний развития. Примеры условий окружающей среды, которые могут влиять на транскрипцию при участии индуцибельных промоторов, используемых для применения на практике этого изобретения, включают в себя анаэробные условия, повышенную температуру, засуху или присутствие света. Тканеспецифические промоторы, используемые для применения на практике этого изобретения, могут быть регуляторными элементами транскрипции, которые являются активными только в конкретных клетках или тканях или органах, например, в растениях или животных. Тканеспецифическая регуляция может достигаться определенными внутренними факторами, которые гарантируют, что экспрессируются гены, кодирующие белки, специфические для конкретной ткани.
Гибридизацией называют процесс, посредством которого цепь нуклеиновой кислоты соединяется с комплементарной цепью через спаривание оснований. Реакции гибридизации могут быть чувствительными и селективными, так что конкретная представляющая интерес последовательность может быть идентифицирована даже в пробах, в которых она присутствует при малых концентрациях. Подходящие строгие условия могут определяться, например, концентрациями соли или формамида в предварительной гибридизации и гибридизационных растворах или температурой гибридизации и хорошо известны в данной области. В частности, строгость может быть увеличена уменьшением концентрации соли, увеличением концентрации формамида или повышением температуры гибридизации. В альтернативных аспектах нуклеиновые кислоты этого изобретения определяются по их способности гибридизоваться при различных условиях строгости (например, высокой, средней и низкой строгости), как установлено здесь.
Например, гибридизация при условиях высокой строгости могла бы происходить в приблизительно
- 30 019514
50% формамиде при приблизительно 37-42°С. Гибридизация могла бы происходить при условиях уменьшенной строгости в приблизительно 35-25% формамиде при приблизительно 30-35°С. В частности, гибридизация могла бы происходить при условиях высокой строгости при 42°С в 50% формамиде, 5Х δδΡΕ, 0,3% ДСН и 200 мкг/мл подвергнутой срезающему усилию и денатурированной ДНК спермы лосося. Гибридизация могла бы происходить при условиях уменьшенной строгости, описанных выше, но в 35% формамиде при пониженной температуре 35°С. Диапазон температур, соответствующий конкретному уровню строгости, может быть дополнительно сужен расчетом отношения пуринов к пиримидинам представляющей интерес нуклеиновой кислоты и корректированием температуры, если желательно. Вариации относительно приведенных выше диапазонов и условий хорошо известны в данной области.
Гомологии белка и/или последовательности нуклеиновой кислоты могут оцениваться с использованием любого из различных алгоритмов и программ сравнения последовательностей, известных в данной области. Такие алгоритмы и программы включают в себя, но ни в коем случае не ограничиваются ими, ΤΒΓΑδΤΝ, ΒΓΑδΤΡ, ΓΑδΤΑ, ΤΓΑδΤΑ и (Ί.υδΤΑΙΔν (Реаткоп апй Ыртап, Ргос. Ναίΐ. Асай. 8сГ υδΑ 85(8):2444-2448, 1988; Αΐΐδ^ιιιΐ е! а1., 1. Μοί. ΒίοΙ. 215(3):403-410, 1990; Нютркоп е! а1., №1с1ею Αα^ Кек. 22(2):4673-4680, 1994; Шддшк е! а1., Ме!Нойк Εпζутο1. 266:383-402, 1996; Α11^1ιι.ι1 е! а1., 1. Мо1. Βίο1. 215(3):403-410, 1990; Α1!κΛπ1 е! а1., Чипе СепеИск 3:266-272, 1993).
Гомологию или идентичность часто измеряют с использованием программного обеспечения для анализа последовательностей (например, δе^иеηсе Αпа1ук^к δοΠ\νа^е Раскаде оГ (Не СепеОск Сотри!ег Сгоир, ипКеткйу оГ Ч1ксопкт Вю!есЬпо1оду Сеп!ег, 1710 ипщеткйу Ανепие, Майкоп, νΙ 53705). Такое программное обеспечение сопоставляет сходные последовательности приписыванием степеней гомологии различным делециям, заменам и другим модификациям. Термины гомология и идентичность в контексте двух или более нуклеиновых кислот или полипептидных последовательностей относится к двум или более последовательностям или субпоследовательностям, которые являются одинаковыми при сравнении и сопоставлении для максимального соответствия на протяжении окна сравнения или определенного района при измерении с использованием любого количества алгоритмов сравнения последовательностей или ручного сопоставления и визуального исследования.
Одним примером применимых алгоритмов являются алгоритмы ΒΓΑδΤ и ΒΓΑδΤ 2.0, которые описаны в Α11^1ιιι1 е! а1., Чс. Αα^ Кек. 25:3389-3402, 1977 и Α1ΐ8Ηιιι1 е! а1., 1. Мо1. ΒώΕ 215:403-410, 1990, соответственно. Программное обеспечение для выполнения анализов ΒΓΑδΤ является публично доступным через №-11юпа1 Сеп!ег Гог Β^ο!есйпο1οду ГтГогтаОоп. Этот алгоритм включает в себя сначала идентификацию пар последовательностей высокой оценки (ΗδΡ) идентификацией коротких слов длины V в запрашиваемой последовательности, которые либо соответствуют, либо удовлетворяют некоторой положительно оцениваемой пороговой оценке Т, при сопоставлении со словом той же самой длины в последовательности базы данных. Т называют порогом оценки соседнего слова (Α1ΐ8θΗϋ1 е! а1., кирга). Эти начальные совпадения соседнего слова действуют как инициирующие значения для инициации поисков для нахождения более длинных ΗδΡ, содержащих их. Эти совпадения слов удлиняют в обоих направлениях вдоль каждой последовательности до тех пор, пока кумулятивнвя оценка сопоставления может увеличиваться. Кумулятивные оценки рассчитывают с использованием, для нуклеотидных последовательностей, параметров М (те^атй-оценка для пары совпадающих остатков; всегда >0). Для аминокислотных последовательностей используют матрицу оценок для расчета кумулятивной оценки. Удлинение совпадений слова в каждом направлении останавливают, когда кумулятивная оценка сопоставления уменьшается на величину X от ее максимально достигаемой величины; кумулятивная оценка спускается до 0 или ниже нуля, вследствие накапливания сопоставлений одного или нескольких отрицательно оцениваемых остатков; или достигается конец любой последовательности. Параметры V, Т и Х алгоритма ΒΓΑδΤ определяют чувствительность и скорость этого сопоставления. Программа ΒΓΑδΤΝ (для нуклеотидных последовательностей) использует по умолчанию длину слова (V) оГ 11, ожидание (Е) 10, М=5, Ν=-4 и сравнение обеих цепей. Для аминокислотных последовательностей программа ΒΓΑδΤΡ использует по умолчанию длину слова 3 и ожидания (Е) 10, и матрица оценок Β^δυΜ62 (см. НешкоГГ & НешкоГГ, йгос. №!1. Αсай. δ^. υδΑ 89:10915, 1989) использует сопоставления (В) 50, ожидание (Е) 10, М-5, Ν=-4 и сравнение обеих цепей.
В одном аспекте гомологии последовательностей белка и нуклеиновых кислот оценивают с использованием Βη^ Госа1 Α1^дηтеη! δеа^сН Шо1 (ΒΓΑδΤ). В частности, используют пять конкретных программ ΒΓΑδΤ для выполнения следующей задачи:
(1) ΒΓΑδΤΡ и ΒΓΑδΤ3 сравнивают аминокислотную запрашиваемую последовательность с базой данных последовательностей белков;
(2) ΒΓΑδΤΝ сравнивает нуклеотидную запрашиваемую последовательность с базой данных нуклеотидных последовательностей;
(3) ΒΓΑδΤΧ сравнивает шестикадровые концептуальные результаты трансляции (преобразования) запрашиваемой нуклеотидной последовательности (обеих цепей) с базой данных последовательностей белков;
(4) ΤΒΓΑδΤΝ сравнивает запрашиваемую последовательность белка с базой данных нуклеотидных последовательностей, транслированных во всех шести кадрах считывания (обеих цепей); и
- 31 019514 (5) ТВЬА8ТХ сравнивает шестикадровые трансляции нуклеотидной запрашиваемой последовательности с шести-кадровыми трансляциями базы данных нуклеотидных последовательностей.
Полипептиды и пептиды
В одном аспекте изобретение обеспечивает выделенные, синтетические или рекомбинантные полипептиды и пептиды, имеющие активность сенсоров СО2, или полипептиды и пептиды, способные генерировать антитело, которое специфически связывается с сенсором СО2, в том числе сенсором С02 этого изобретения, включающие в себя аминокислотные последовательности этого изобретения, которые включают в себя аминокислотные последовательности, имеющие по меньшей мере 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую, или 100% (полную) идентичность последовательности с примерным полипептидом, являющимся сенсором СО2, этого изобретения.
Например, примерные последовательности этого изобретения включают в себя: СА4 А11§70410 С028еп-белок-кодирующий ген (С028еп), кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (8Ер Ιϋ N0:1):
Кодирует: СО2-чувствительный белок 2 (Ο0ΚΡ2) (8Ер Ιϋ N0:3).
Также обозначаемый СА4, или А11§70410 или 8Ер Ιϋ N0:1.
(8ЕО ΙΡ N0:1) Полноразмерная кДНК СО£еп ССААСОСТСОТСАТААТТССТТОАААССТССААААТССАААААСССАТАТССААТСТТСТТСССАТАТАААТТААОАТТТТТАТТТАТТТАТТТОТТТАСТ ТАТТТСААТТСССААААТССТСТОССТСАТСАТСТТСАААСТСТТАССАСеТССАТАСССТТСТСаААСАССТАССААОАСССТТАССААОАССТТСТТСТ ТССССТААСАТТТА<ЗСТТО<ЗТА<ЗОАОАА<ЗСАААОСААаАСАТСАТТТАТААТООСТССТССАТТСааААААТСТТТСАТСТТСТаСТаС<5СТААААССТСС ССОСАААААОАССАААТО<ЗСААСа<ЗААТСОТАС<ЗААаСС(ЗССАТТАААа<ЗАСТСААТ(ЗАТСТТСТСАСТАССААА(ЗС(ЗСАТСТС(3<ЗАААССТССССССС(ЗС СААОАТСАААСССТТСАССССССАССТАААССАССТТСАСТСААОСААТТСАСАСССААТТбААСОААТСААОАССССзТТТТАСТСААТТСААААСССАСА ААТАТТТСАА<ЗААТАСТАСТТТаТТСААТСАТСТТ<ЗССАА<ЗАСТСАОАССССАААСТТТСТО<ЗТ<ЗТТТ(ЗСТТеСТСТСАТТСТССАОТТТОТССАТСТСАС АТСТТСААТТТССААССТС(ЗТаАО(ЗСТТТТаТТСТСАаАААСАТА(ЗССААТАТСеТТССАССТТТТСАССАСААОАОАСАСТСТааАСТТ<ЗСССССаСС<ЗТ ТСААТАСССАаТТСТАСАТСТСААССТССАОААСАТТТТССЗТОАТАССССАТАССТССТСТССЗТССТАТТААООСАСТСАТаТССАТТСААСАТСАТОСТО ССССААСТСАААСТвАСТТСАТТСААААТТ<ЗО<ЗТ<ЗАА<ЗАТАОаСССАТСАСССА<3<ЗААСААСАТСАА(ЗОАСОААСАТААА<ЗАСТТаАССТАСаАТ(ЗАТСАА ТОСААСАА<ЗТ(ЗТСАСЗАА(ЗаААаСТСТСААСС;ТАТСеСТТООАААСТТССТТТС(ЗТАСССАТТССТ<ЗА<ЗАССТ<ЗАСата(ЗТОААаААСАСАСТТ<ЗСААТААС АССАОСТСАСТАСААТТТСОТСАААСаААС(ЗТТТСАТСТСТОООА(ЗСТС(ЗАТТТСААаАССАСТССТаСТТТТСССТТСТСТТААОАААОАААССТАСССС ААСАТАТААААСТСТТТТСАСАТАААААААСАСАСТТТСАСТСАТСТТТСТТСАТТСТСТСАТаТТОАТеАТТССТСТССААСТТСТТТОАТТТСТТТТТС ТТААТТСААААСТТСААСТТТССТОСТТСТАТТТСААААССТСАААСААТАААССТаТААССААССТТТСАААСТТСТАТАТТТОТСТААТТОАТвТТТОА АСОААОАТТТОААСТТТССТТСТ (8ЕОΙΡ N0:2) Полноразмерная СР8 СО^Зеп
АТСССТССТаСАТТСаСААААТСТТТСАТаТТСТаСТОСССТААААССТСССС<3<ЗААААА<ЗАСОАААТОССААС(3(ЗААТС(ЗТАС<ЗАА<ЗСС<ЗССАТТААА(3<3 АСТСААТОАТСТТСТСАСТАССАААОССЮАТСТСООАААСОТСОСССССОССААОАТСАААОССТТСАССССССАССТАААОСАОСТТСАСТСААССААТТ САСАСССААТТСААССААТСАА(ЗАСС<3(ЗТТТТАСТСААТТСААААСС(ЗАОАААТАТТТСААОААТАСТАСТТТСТТСААТСАТСТТаССААеАСТСАСАСС ССАААСТТТСТССТСТТТССТТаСТСТСАТТСТССАСТТТСТССАТСТСАСАТСТТаААТТТССААССТОСТСАСССТТТТСЗТТОТСАСАААСАТАСССАА ТАТССТТССАССТТТТСАССАОААаАаАСАСТСТСОАСТТССССССССССТТОААТАСССАаТТСТАСАТСТСААССТСаАаААСАТТТТССТСАТАООСС АТАОСТаСТОТОСТСаТАТТААООаАСТСАТСТССАТТОААСАТСАТССТСССССААСТСАААСТОАСТТСАТТСААААТТСССТвААСАТАСССаСАТСА <ЗССАССААСАА(ЗАТСААС(ЗА®ЗААСАТАААСАСТТОАССТАССАТОАТСААТССААСААвТ(ЗТСАаАА(3<ЗААвСТ(ЗТОААССТАТС(ЗСТТОСАААСТТССТ ТТССТАСССАТТССТСАСАССТСАССТССТаАА<ЗААСАСАСТТССААТААОАС(ЗА<ЗСТСАСТАСААТТТССТСАААОСААСаТТТ(ЗАТСТСТ(3(ЗСАаСТСС АТТТСААСАССАСТССТССТТТТСССТТСТСТТАА ['8ЕО ΙΡ N0:3) Последовательность белка СО?8еп: СО;-чувствительный белок 2 (СОКР2)
Кодируемый, например, СА4, или А11§70410 или 8Εζ) 10 N0:1.
МАРАРСКСРМРССАКТЗРЕКОЕМАТЕЗУЕАА1КСЬЫОЬЬЗТКАОЬСПУАААК1КАЬТАЕЬКЕЬПЗЗПЗОА1ЕК1КТаРТСРКТЕКУЬКЫЗТЬРМНЬАКТ0Т ΡΚΡΏνΡΑσ3Ο3Ρν0Ρ3ΗΙΕΝΡ0ΡΘΕΑΕννΚΝΙΑΝΜνΡΡΡΌ0ΚΡ.Η3ανθΑΑνΕΥΑννΗΣΚνΕΝΙΕνΐαΗ3σ0Ο<3ΙΚ<3ΕΜ3ΙΕΟΌΑΑΡΤ03ΟΡΙΕΝΗνΚΙ<3Α5 АКПК1КЕЕНКГЬ5У00ССЫКСЕКЕА71ЯУЗЬСЫЬЬ5УРРУЙАЕУУКЫТ1Д1НССНУКРУК(ЗТР0ЬИЕЬ0РКТТРАРАРЗ
СА6 АН §58180 СОгЗеп-белок-кодирующий ген (СО^ея), кодирующий последовательность нуклеиновой кислоты:
Кодирует 8Εζ) Ιϋ N0:6, СО2-чувствительный белок.
(8Е<3 Ю N0:4) Полноразмерная кДНК СО28еп
СААААТТСАТСТСТТАОТТСТТСТТСТТТАСААААТТОАОТТТАААСТОТТТТАТТАСТААТССАААТСАОСААТСАСТТТСЗСАСТАТТААТАСААААТАА ТАСАСААССАААСАТСТААААОАТАСТАТААТАСТАСАСАТСАААОАССТОАССАААААСТОАААСАААААААААААААААААААААСАСТТСТССТСААА ААТаССаТТТАСАСТАССТССААСАССТССТССТСТАСТСТСТССААСАТСАСТТСАТСААААТССТТССТТАСАСАААСТаСААСАААТТСаАТСССАТС ССТТТСАССТТССТСААССААААССААТААОАТТАСТАСССАССАСзААСАААСАТООТТСААОААТТАССААТСАЗОСААСЗААТТТАТаСАТСТАААСАСА (ЗАААСАСАСАСААСТТАТОАТТТТСТССАТОАААТ&АОАСАСАСАТТТСТаАААТТСААСЗАСАСААААСТАТСТАССОСАСАТАОААААСТТТАААаСТТТ ССССАТАОСТСААТСАССАААССТААТОСТСАТАССАТЭТССАОАТТСААСОСТАТСТССАТСТТА’ГСТАСТАОСАТТТСААССТОСТСААССТТТТАСТА ТСССАААТСТССССААТСТССТТАССССССТТСАСААТССАССААСАаАААССААСТССССТСТТСАСТТТССССТСАССАСТСТТСАССТТСАСААСАТТ АТАСТТАТСССТСАТАССААТТеТСОАСЗСААТТССАСЗСАСТТАТСАаТСАТСААААССАССААСаСЗСААСАСТСТАОТТТАСЗТАСАААССЗТСОСТТАТОАА ТСССАААСССССТААСТТААОААСАСААТТАаСТТСАТСАСАТТТАТССТТТОАТСААСААТССАСЗАААСТСТСАСЗААСОААТСТАТАААаОАТТСТСТОА ТСААТТТОАТААСТТАТТСАТССАТААОАСАТАСАаТАААОАОАССТСААСТСААСАТТСАТааАТСТТАТТАСААТТТаТСАСАТТСТАСТСТТОАО-ААС ТССАаАТТААСТТСАОАСААСАСТААСТАТССАТТСТАТАТТТСАСАСАСАОАОАТАТССАСТТСАСТАААТАТТОААСААТССТСАСТТСТААТАТТСАС АТЭТАТСТТТСТАСАТАССАААТСАТАТТТАСАСААТТСС (ЗЕО ΙΡ N0:5) Полноразмерная ОРЗ СО^Зеп
АТССССТТТАСАСТАССТОСААСАеСТССТССТСТАСТСТСТаСААСАТСАСТТСАТСААААТОаТТССТТАСАСАААСТССААСАААТТаСАТСОСАТСС СТТТСАССТТСеТСААаСААААССААТААОАТТАСТАСССАСОАСААСАААСАТСаТТСААСААТТАССААТСАОООААОААТТТАТССАТСТАААСАСАСЗ АААСАСАСАСААСТТАТСАТТТТСТОСАТСАААТОАОАСАСАСАТТТСТСАААТТСААСАСАСААААСТАТСТАССССАОАТАСААААСТТТАААССТТТО СССАТА(ЗСТСААТСАССАААО(5ТААТ<3<ЗТ<ЗАТА<ЗаАТСТОСА<ЗАТТСАА(ЗССТАТСТССАТСТТАТСТАСТА(КЗАТТТСААССТаСТаААвСТТТТАСТАТ СССАААТСТССССААТСТССТТАССССССТТСАСААТССАССААСАСАААССААСТССССТСТТаАСТТТССССТСАССАСТСТТСАССТТСАСААСАТТА ТАСТТАТОСОТСАТАССААТТСТОСАСОААТТаСАССАСТТАТСАаТСАТСААААССАССААОСССААСАСТСТАСТТТАСТАСАААСОТСЗСЗОТТАТСААТ СССАААСССССТААСТТААСААСАСААТТАССТТСАТСАСАТТТАТССТТТСАТСААСААТССАСАААСТСТСАОААССААТСТАТАААССАТТСТСТОАТ СААТТТОАТААСТТАТТСАТСОАТААСАОАТАСАаТАААСАСАОСТЗААСТСААСАТТСАТССАТСТТАТТАСААТТТСТСАОАТТСЗТАаТСТТаАОААСТ ОСАСАТТААСТТСАаАСААбАСТААСТАТОСАТТСТАТАТТТСАСАСАбАСАСАТАТОСАСТТаА (ЗЕО ΙΡ N0:6) Последовательность белка С0?8еп. СО^-чувствительный белок
Кодируемая, например, 8Е() ΙΡ N0:4, или СА6, или АН§58180, СОгЗеп-белок-кодирующим геном (СОгЗем)
- 32 019514
МАРТЬООВАВВЬУ5АТ5УН0ЫССЬНКЬСС1СЗПВР0ЬОЕАКА1ВЬЬРККТЫМУ0ЕЬО1КЕЕРМПЬЫВЕТЕТЗУПРЬПЕМВНВРЬКРКВ0КУЬРЕ1ЕКРКАЬА1АСЗР 7МУ1ССАОЗКУСРЗУУЬСР0РаЕАРТ1КЫУАМЬ7ТРУаИСРТЕТЫЗАЬЕРАУТТЬ0УЕЫ117МСНЗЫССС1ААЬМЗН0ЫН0ССН38ЬУЕКМ7МЫ(ЗКААКЬКТ0ЬАЗЗ ЬЗРОЕ0СНЫСЕКЕЗИФЗУМЫЫТУЗК1ЕВКУККаЕУК1Н(ЗСУ¥ЫЬЗПСЗЬЕКНКЬЗЗЕКТЫ¥СРУ13ОКЕ1ИЗ
СА1: СО?8еп-белок-кодируюший ген (8ЕО ΙΡ N0:7)
Кодирует: СОг-чувствительный белок 1 (СОКР1) (8Е0 ГО N0:9).
Также обозначаемый САГ, или Αΐ3§01500 или 8ЕС) ГО N0:7.
СА1 Αΐ3§01500: СО28еп-белок-кодирующий ген (СО^5еп), кодирующая последовательность нуклеиновой кислоты (ЗЕ() ГО N0:7) Полноразмерная кДНК ССЪ^п
АТОАОАСТССОТТСТТТТАААСТСССАААТСТТТСААССААТСССАТТАТТСАСТТААОТАТАТАОТАССТТССАТААОАОТСТТАОТТСТААСТАТАААТ АСАСАТАТСТСАСТСТСТСТСАТСТССаСТТСТСТТСЗССААСАААТСТСОАСС(ЗСТССТСТСТСС(3(ЗСТТСТТТСТСАСТТСАСТТТСТССТТСТСААТС ТТСТСТССАОАААСТСТСТСТТССТАСТТСТТССАССОТСОСТТОССТСССАССССССТСТТСТТСТТССТСАТСТТССТССТССТСОТСТТСССОТТССО ТТССААСССТТАТСССТААССЗАаССАСТТТТТОССОСТССТОСТССТАТСАТТСССССТТАТТООАОТСААОАСАТСЗСОААСССААОСАТАСОАСОАООСТ АТТОААОСТСТСАА(ЗААССТТСТСАТССАОААОСАА<ЗА(ЗСТАААОАССеТТССАСССаСАААС(ЗТО(ЗА<ЗСА(ЗАТСАСАССааСТСТТСАСАСАССТАСТТС АТСС<ЗАСААОАААССТТТСаАССССС5ТС(ЗАААССАТТАА(ЗСАС(ЗССТТСАТСАААТТСААСААеСАаАААТАС<ЗАААССААСССТ(ЗСТТТ(ЗТАСС(ЗТОАСЗС ТСОСАААСССТСАААСТССТААСТАСАТССТОТТТССТТСТТСАСАСТСАССТСТСТСТССАТСАСАССТТСТССАСТТТСАСССАССАСАТСССТТСОТС СТСССТААСАТАСССААСАТОСТТССТССТТТСОАСААССТСАААТАСаОТСаСОТТдаАаСАаССАТТОААТАСаСССТСТТАСАССТТААССТООАСАА САТТОТддТОАТАОСАСАСАОТаСАТатдСЗТОСОАТСАААСОдСТТАТСТСТТТССССТТАОАТОСАААСААСТССАСТСАСТТСАТАОАдОАСТСЮСТСА АААТСТОТТТАССАОССААОТСАААООТТАТАТСАСААСТТООАСАТТСАОССТТТОААСАТСААТОТООССОАТеТОАААаООАОССССЗТОААТОТТТСА СТАОСАААССТАТТОА(^ТАТССАТТТатдА(^САА(МАСТТаТСААОаСААС7ЮТТаСТТТСАА(^АСаСТАСТАТСАСТТСдТСААС(КТаСТТТТ<ЗА ССТТТаСОаАСТТОААТТТООССТСТССОАААСТАОСТСТСТТАААОАТОТООСТАССАТАСТАСАТТООААССТОТАООАААСТСТТТОААСССТТАССС ОАТТТСАСАТТСТСААТТСААТААСАССААОТТСТТОТТТАСАТССАОАТСТТСАТСАААСТООТТТТТОАТТТТАСАОААТТААААТСТТОООООАСАСА ААТТТС (8Е0 ΙΡ N0:8) Полноразмерная СР8
АТСТСОАССОСТССТСТСТССОССТТСТТТСТСАСТТСАСТТТСТССТТСТСААТСТТСТСТССАСАААСТСТСТСТТСОТАСТТСТТССАССОТСОСТТО ССТСССАСССОССТСТТСТТСТТССТСАТСТТССТССТССТССТСТТСССОТТСССТТССААСССТТАТСССТААССАОССАСТТТТТСССдСТССТССТС СТАТСАТТаССССТТАТТССАСТСААОАСАТООСААССдААССАТАСОАССЗАаОСТАТТдААОСТСТСААСААССТТСТСАТССАОААСОААОАССТАААС АСООТТОСАОСООСАААОСТООАОСАОАТСАСАОСООСТСТТСАОАСАООТАСТТСАТССОАСААСАААОСТТТСОАССССаТСОАААССАТТААОСАООО СТТСАТСАААТТСААОААССАСАААТАСОАААССААСССТОСТТТОТАСООТСЗАОСТСОСАААаоатСАААОТССТААОТАСАТООТОТТТОСТТОТТСАО
АСТСАС<ЗТОТ<2ТСТССАТСАСАСОТТСТОСЗАСТТТСА<ЗССА(3(ЗА(ЗАТОССТТС<ЗТСЗОТССОТААСАТА<ЗССААСАТО(ЗТТССТССТТТССАСААООТСААА ТАССЗдТООСОТТООАОСАдССАТТСААТАСОСЗатСТТАСАССТТААОаТООАОААСАТТаТСеТОАТАООАСАСАОТОСАТОТОаТОСОАТСАААдООСТ ТАТ<ЗТСТТТССССТТА<ЗАТС<ЗАААСААСТССАСТ<ЗАСТТСАТАОАС(ЗАСТССдТСААААТСТОТТТАССАСССААСТСАААССТТАТАТСАСААСТТедАд АТТСА<ЗССТТТСААОАТСААТаТ<ЗСССаАТОТОААА(ЗС(ЗАаасаСТаААТСТТТСАСТА(ЗСАААССТАТТСАСАТАТССАТТТСТСАдАОААССАСТТ(ЗТО ААОСаААСАСТТОСТТТОААССЗСАддСТАСТАТСАСТТССТСААСЗОаТССТТТТСАССТТТасдОАСТТСААТТТСОССТСТСССАААСТАаСТСТдТТАА АСАТ(ЗТСОСТАССАТАСТАСАТТСОААССТСТА(3 (8Е0ΙΡ N0:9) Последовательность белка для СОэ-чувствительного белка 1 (СОКИ)
Кодируемая, например, геном (кодирующей последовательностью), обзначаемой САГ, или Αΐ3§01500 или 8Εζ) ΙΡ N0:7.
МЗТАРЪЗбРРЬТЗЪЗРЗСЗЗЬОКЪЗЬКТЗЗТУАСЬРРАЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗЗКЗУРТЪИШЕРУРААРАРИАРУИЗЕЕМСТЕАУПЕАТЕАЪККЬЫЕКЕЕЬК ТУАААКУЕ01ТААЬ0ТСТ850ККАЕЕРУЕТ1КССГ1КРККЕКУЕТЫРАЬУдЕЬАКС08РК¥МУЕАСЗЕ8КУСР5НУЬОР0РСПАРУУКЫ1АЖ7РРЕОКУК ΥΟ6νΘΑΑΙΕΥΑνΒΗΕΚνΕΝΐννΐαΗ8Αα(3αΐΚ(3ΕΜ3ΡΡΕΟΟΝΝ5ΤΌΡΙΕΡνίνΚΙ^₽ΑΚ8Κνΐ3ΕΕαϋ8ΑΓΈϋ0ΟΘΚΟΕΚΕΑνΝν3ΙΑΝΕΕΤΥΡΓνΗΕΘΕν КСТЬАЬКОО¥УОГУКаАРЕЬИОЬЕГОЬ8ЕТЗЗУКОУАТ1ЬНИКЬ
Промотор замыкающих клеток этого изобретения (8Е0ΙΡ N0 :10):
ОАОТАААОАТТСАОТААССССАТССТССТ<ЗСТСТТССТСААСАССТТССТТСАТТСССС0СС(ЗаТАТ6ТТСТСС<ЗТСТ<ЗТС<ЗТА<ЗСОССТТТаОААСАСТ СТАССААС<ЗССеССАТСАААО(ЗАТСТСТСАТ0<ЗССаСАОО<ЗОАССТ<ЗТТСТТСТТАСАТСТ<Э6ТСТТА(3<ЗОСТАТО<ЗТТАСТССА<ЗТ<ЭАаСАСЗСаАСАС<3 САА6АСОТТССТТААТСАТТС0ТТТТТСС<36ТОАТАСОАСААСТСТТТАОСТТТАССО66АА<ЭСТТТТСССАТ(ЗААААТ<Эе<ЗАТ<ЗССАА<ЭТ(3(ЗАТ6(ЗА6А (ЗОА6ТГОСССОА<ЗАСТТ0СС<ЗСА(ЗААТАС<2АО(3(ЗААТТО(ЗАО(ЗАС6А(3<ЗААОА(ЗА<ЗТСАТССЭССО<36ТТ<ЗАААТ0ТТААСС<ЗТСвА<ЗОА(ЗААГТТСАСС<3 АбТТедАТС6ТСТА6ТАССТАСААТТССССТССТТ0СССААСТАТССАТЁсаааагадСдгС1:адсгггддасгСдадаасШ:дСгдСсесееЬдагсСс гсееаеаеаааассееддасдедеаддасааасССдСсаасаСаадааасааааеддесдсаасадададдаСдаасегаСаадеееесаасассдсеъе есееаЬеадасддасаасааесЪаЬадеддадЬаааеъебеаЪеъееддеааааедде1:адедаа1:есаааеаЪсЪаааее1:едедасесас1саасаЬеа асаааеаЬдсаеаадасаеаааааааадааадааеааеесееаедааасаадаааааааассЬаеасаагсааесеьпаддааседасдаедСадааеед СадаедаСаааСССесесаааеагадаСдддссеааедаадддЬдссдсееаеЪддаесСдасссаеъеЪдаддасаееааеаегессаееддСеаеаад ссееееааесааааеедЪсаеЪаааССдаедесесссесесдддСсаСсеЬссееесесссесасааесааСдеадассесадсааеесдсасдсСдедс ееедесеесаеаеееадеаасасааасаеессдасеедЬсесдСададСесеесессесеаееесссеаЪссааеагдаааасеаааадедеесесдСае асаеаеаегааааееааадааассСаСдаааасассааеасаааедсдагаседеееесадессдасдееесасдееедееадааааССЪсеааедасдЪ еьдеаЬааааЪадасааесааасдссааасасСасаСсСдедгеессдаасааеаеедсдесСдсдееессеесаЪсеаесСсСсСсадедСсасааедЪ сгдаасЬаададасадсСдСааасгагсассаадасаСааасСассааадгаесаадсЬаасдеаааааеьасссСсагссссасдСаасаааЬСдадее адсееаадаСаееадедааасЪаддее1;дааЫ:еес1:ЬсЪСсЩ:сСЬссаЬдсаЪссСссдаааааадддаассаа1:саааасгдС.еедса1:агсааасЪ ссаасасггсасадсаааСдсааСсСагаассСдСдаСЬгаСссааСааааассСдЬдаССгаСдСсгддссссадсдагдааадСсСагдсаСдгдаСс есеаессаасаедадеааеедеесадааааСааааадеадседаааСдСаесеаеаеааадааСсаессасаадеасеаеесесасасасеасеесаааа СсасЬасесаадаааС (ЗЕф 10 N0:10)
Альтернативный промотор замыкающих клеток этого изобретения (8Е0 ГО N0:11). укороченный, но более сильный промотор, чем промотор 8Е0 ΙΡ N0:10: а£дд(:ЬдсаасадададдаЬдааЫЬаЬаадеЫЬсаасассдс1ЬЬЬсЫаЫадасддасаасааЬс'ЬаЬадЬддадЬаааЬЫЫаЬ£ЬЬЬддЬааааЬдд£Ьад(:дааЬЬсааа1:аЬ сеаааееъе.дедасесасЪаасаееаасаааеаСдсаеаадасаеаааааааадааадааСааессС.СагдааасаадаааааааассСаСасааСсааесессаддаа'СедасдаедСад ааеедЬадаС.дагааагееесСсаааСаСадаедддссСаа!:даадддСдссдсес.а1:СддаЪседасссаСЪСедаддасаС1:ааСаС1:еесаееддееаеаадссеегсааесааааеъ десассаааеедаедесссссесесдддесаъесессССесесссесасаассааедеадассееадсааеесдсасдсгдедс ееедесесеаСа-еееадСаасасааасаЪееедасседесеедЪададСгсеесесеееЪаееееъсеаессааеаедаааасеаааад-едессесдеае асагаСагс.ааааСЬааадааасс1:аСдаааасассаагасаааСдсдагагедЬС.ьгсадгссдасдсгссаСдг.ЬСдггадааааС1:гсСааСдасдг седеаеаааагадасааСЪааасдссааасасЬасаеседедССЕесдаасааеае.1:дсдЪседсдееессЪесаесеаЪс1:сСсС.садедесасааСдг седаасеаададасадседеааасеаесаССаадасаеааасеассааадеаесаадсеааедеааааасеасесесаеесссасдСаасаааеедадег адсееаадаСаееадедааасеаддееедааесеесеесеесеесеессаедсаЪссессдаааааадддаассааесаааасЪдееЪдсаЬаесааасг ссаасасепсасадсаааедсааСсСаеааесгдедаесеаессааеааааасседЪдаеееаедеьеддсессадсдагдааадесеагдсаедедаЪс ЬеС;аЬссаасаедадсаассдсссадааааСааааадЬадсгдааагд1:аЬсСагагааадаассаСссасаадСасСагсгСсасасасСасс.ссаааа ЬсасСасесаадааае (ЗЕО Ю N0:11)
Полипептиды и пептиды этого изобретения могут быть выделены из природных источников, быть синтетическими или быть рекомбинантно генерированными полипептидами. Пептиды и белки могут быть рекомбинантно экспрессированы т уйго или т у1уо. Пептиды и белки этого изобретения могут быть получены и выделены с использованием любого способа, известного в данной области. Полипептиды и пептиды этого изобретения могут быть также синтезированы, полностью или частично, с использованием химических способов, хорошо известных в данной области. См., например, Саги1йегк (1980) N11с1е1с Ас1бк Век. 8утр. 8ег. 215-223; Ногп (1980) N4^^ АсИк Век. 8утр. 8ег. 225-232; Вапда, А.К., ТйегареиИс РерИбек апб Рго1етк, Еогти1аИоп, Ргосекктд апб ЭеНуегу 8ук1етк (1995) Тесйпотгс РиЬИкйтд Со., Ьапсак1ег, РА. Например, синтез пептидов может выполняться с использованием различных твердофазных способов (см., например, ВоЬегде (1995) 8с1епсе 269:202; МеглйеМ (1997) Ме1йобк Епгуто1. 289:3
- 33 019514
13) и автоматизированный синтез может выполняться с использованием пептидного синтезатора АВI 43 ΙΑ (Регкш Е1тег) в соответствии с инструкциями, обеспечиваемыми изготовителем.
Пептиды и полипептиды этого изобретения могут быть также гликозилированными. Гликозилирование может быть добавлено посттрансляционно либо химически, либо с использованием клеточных биосинтетических механизмов, где последние способы включают в себя применение известных мотивов гликозилирования, которые могут быть природными для этой последовательности или могут быть добавлены в виде пептида или добавлены в виде кодирующей последовательности нуклеиновой кислоты. Это гликозилирование может быть О-связанным или Ν-связанным.
В альтернативных аспектах аминокислоты и/или аминокислотные последовательности этого изобретения включают в себя последовательность олигонуклеотида, пептида, полипептида или белка или фрагмента, части или субъединицы любого из них и природно-встречающихся или синтетических молекул. В альтернативных аспектах полипептиды этого изобретения являются аминокислотами, присоединенными друг к другу пептидными связями или модифицированными пептидными связями, и могут содержать модифицированные аминокислоты, другие, чем 20 кодируемых генами аминокислот. Эти полипептиды могут быть модифицированы либо природными процессами, такими как посттрансляционный процессинг, либо химическими способами модификации, которые хорошо известны в данной области. Модификации могут встречаться в любом месте в полипептиде, в том числе в пептидном скелете, боковых цепях аминокислот и в амино- и карбоксиконцах. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одной и той же степени или в варьирующихся степенях в нескольких сайтах в конкретном полипептиде. Конкретный полипептид может также иметь многие типы модификаций. Модификации включают в себя ацетилирование, ацилирование, АДФ-рибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение радикала гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, сшивающую циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гамма-карбоксилирование, гликозилирование, образование СРБякоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пэгилирование, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белку, например аргинилирование. См., например, СгещЫоп. Т.Е., Рго!етк - 8!гис!иге апй Мо1еси1аг Ргорегйек 2пй Ей., \У.Н. Бгеетап апй Сотрапу, №\ν Уогк (1993); Рокйгапк1айопа1 Сома1еп1 МойШсайоп о£ РгсИетк, В.С. кИпкоп, Ей., Асайетк Ргекк, №\ν Уогк, рр. 1-12 (1983)).
Пептиды и полипептиды этого изобретения, описанные выше, включают в себя все миметические и пептидомиметические формы. Термины миметическое и пептидомиметическое относятся к синтетическому химическому соединению, которое имеет по существу те же самые структурные и/или функциональные характеристики, что и полипептиды этого изобретения. Миметик может быть либо полностью состоящим из синтетических, неприродных аналогов аминокислот, либо является химерной молекулой частично природных пептидных аминокислот и частично неприродных аналогов аминокислот. Этот миметик может также включать в себя любое количество консервативных замен природных аминокислот, пока такие замены также по существу не изменяют структуру и/или активность этого миметика. Что касается полипептидов этого изобретения, которые являются консервативными вариантами, рутинное экспериментирование определит, находится ли миметик в объеме этого изобретения, т.е. является ли его структура и/или функция по существу не измененной. Таким образом, в одном аспекте композиция миметика находится в объеме этого изобретения, если она имеет активность сенсора СО2.
Композиции миметических полипептидов этого изобретения могут содержать любую комбинацию неприродных структурных компонентов. В альтернативном аспекте миметические композиции этого изобретения включают в себя одну или все из следующих трех структурных групп: а) группы связывания остатков, другие, чем природные имеющие амидную связь (пептидную связь) связи; Ь) неприродные остатки вместо природно-встречающихся аминокислотных остатков; или с) остатки, которые индуцируют мимикрию вторичной структуры, т.е. для индукции или стабилизации вторичной структуры, например, конформации бета-витка, гамма-витка, бета-складки, альфа-спирали и т.п. Например, полипептид этого изобретения может быть охарактеризован как миметик, когда все или некоторые из его остатков соединены химическими средствами, другими, чем природные пептидные связи. Индивидуальные остатки пептидомиметиков могут быть соединены пептидными связями, другими химическими связями или средствами сопряжения, такими как, например, глутаровый альдегид, Ν-гидроксисукцинимидные эфиры, бифункциональные малеимиды, Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ОСС) или Ν,Ν'-диизопропилкарбодиимид (РТС). Связывающие группы, которые могут быть альтернативой традиционным амидным связям (пептидной связи), включают в себя, например, кетометилен (например, -С(=О)-СН2- вместо -Ο(=Θ)-ΝΗ-), аминометилен (СЩ-ΝΗ), этилен, олефин (СН=СН), простой эфир (СН2-О), тиоэфир (СН28), тетразол (СЩ-), тиазол, ретроамид, тиоамид или сложный эфир (см., например, 8раЮ1а (1983) ш С11епик1гу апй Вюс11епик1гу о£ Атто Ас1йк, Рерййек апй Ргоктк, уо1. 7, рр. 267-357, РерОйе ВаскЬопе Моййкайопк, Магсе11 Эеккег, ΝΥ).
- 34 019514
Полипептид этого изобретения может быть также охарактеризован как миметик по наличию всех или некоторых неприродных остатков вместо природно-встречающихся аминокислотных остатков. Неприродные остатки хорошо описаны в научной и патентной литературе: ниже описаны несколько неприродных композиций, применимых в качестве миметиков природных аминокислотных остатков, и руководства. Миметики ароматических аминокислот могут быть генерированы заменой, например, Ό- или Ьнафтилаланином; Ό- или Ь-фенилглицином; Ό- или Ь-2-тиенилаланином; Ό- или Ь-1-, 2-, 3- или 4пиренеилаланином; Ό- или Ь-3-тиенеилаланином; Ό- или Ь-(2-пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(3пиридинил)аланином; Ό- или Ь-(2-пиразинил)аланином; Ό- или Ь-(4-изопропил)фенилглицином; Ό(трифторметил)фенилглицином; О-(трифторметил)фенилаланином; Ό-п-торфенилаланином; Ό- или Ь-пбифенилфенилаланином; Ό- или Ь-п-метоксибифенилфенилаланином; Ό- или Ь-2-индол(алкил)аланинами и Ό- или Ь-алкилаланинами, где алкил может быть замещенным или незамещенным метилом, этилом, пропилом, гексилом, бутилом, пентилом, изопропилом, изобутилом, втор-изобутилом, изопентилом или аминокислотами некислотного характера. Ароматические кольца неприродной аминокислоты включают в себя, например, тиазолильные, тиофенильные, пиразолильные, бензимидазоильные, нафтильные, фуранильные, пирролильные и пиридильные ароматические кольца.
Миметики аминокислот кислотного характера могут быть генерированы заменой, например, некарбоксилатными аминокислотами, при сохранении отрицательного заряда; (фосфоно)аланином; сульфатированным треонином. Карбоксильные боковые группы (например, аспартил или глутамил) могут быть также селективно модифицированны реакцией с карбодиимидами (Β'-Ν-Ο'-Ν-Β'), такими как, например, 1 -циклогексил-3 -(2-морфолинил-(4-этил)карбодиимид или 1 -этил-3 -(4-азониа-4,4-диметилпентил)карбодиимид. Аспартил или глутамил могут быть также превращены в остатки аспарагинил и глутаминил реакцией с ионами аммония. Миметики основных аминокислот могут быть генерированы заменой, например, (в дополнение к лизину и аргинину) аминокислотами орнитином, цитруллином или (гуанидино)уксусной кислотой или (гуанидино)алкилуксусной кислотой, где алкил имеет определенные выше значения. Производное нитрила (например, содержащее СЫ-группу вместо СООН) может заменять аспарагин или глутамин. Остатки аспарагинил и глутаминил могут быть деаминированы в соответствующие остатки аспартил и глутамил. Миметики остатков аргинина могут быть генерированы реакцией аргинила, например, с одним или несколькими общепринятыми реагентами, включающими в себя, например, фенилглиоксаль, 2,3-бутандион, 1,2-циклогександион или нингидрин, предпочтительно при щелочных условиях. Миметики остатков тирозина могут быть генерированы реакцией тирозила, например, с ароматическими соединениями диазония или тетранитрометаном. Ν-ацетилимидазол и тетранитрометан могут быть использованы для образования О-ацетилтирозил-разновидностей и 3-нитропроизводных, соответственно. Миметики остатков цистеина могут быть генерированы реакцией цистеинильных остатков, например, с альфа-галогенацетатами, такими как 2-хлоруксусная кислота или хлорацетамид и соответствующие амины; с получением содержащих карбоксиметил или карбоксиамидометил производных. Миметики остатков цистеина могут быть также генерированы реакцией цистеинильных остатков, например, с бромтрифлорацетоном, альфа-бром-бета-(5-имидазоил)пропионовой кислотой; хлорацетилфосфатом, Ν-алилмалеимидами, 3-нитро-2-пиридилдисульфидом; метил-2-пиридилдисульфидом; пхлормеркурибензоатом; 2-хлормеркури-4-нитрофенолом или хлор-7-нитробензоокса-1,3-диазолом. Миметики лизина могут быть генерированы (и аминоконцевые остатки могут быть изменены) реакцией лизинила, например, с янтарным ангидридом или ангидридами других карбоновых кислот. Миметики лизина и других альфа-амино-содержащих остатков могут быть также генерированы реакцией с имидоэфирами, такими как метилпиколинимидат, пиридоксальфосфат, пиридоксаль, хлорборгидрид, тринитробензолсульфоновая кислота, О-метилизомочевина, 2,4-пентандион, и катализируемыми трансамидазой реакциями с глиоксилатом. Миметики метионина могут быть генерированы реакцией, например, с метионинсульфоксидом. Миметики пролина включают в себя, например, пипеколиновую кислоту, тиазолидинкарбоновую кислоту, 3- или 4-гидроксипролин, дегидропролин, 3- или 4-метилпролин или 3,3диметилпролин. Миметики остатков гистидина могут быть генерированы реакцией гистидила, например, с диэтилпирокарбонатом или пара-бромфенацилбромидом. Другие миметики включают в себя, например, миметики, генерированные гидроксилированием пролина и лизина; фосфорилированием гидроксильных групп серильных или треонильных остатков; метилированием альфа-аминогрупп лизина, аргинина и гистидина; ацетилированием Ν-концевого амина; метилированием амидных остатков основной цепи или заменой Ν-метиламинокислотами; или амидированием С-концевых карбоксильных групп.
Настоящее изобретение обеспечивает также способы модификации полипептидов этого изобретения либо природными процессами, такими как посттрансляционный процессинг (например, фосфорилированием, ацилированием и т.д.) или химическими способами модификации, и получение модифицированных полипептидов. Модификации могут иметь место где-нибудь в этом полипептиде, в том числе в пептидном скелете, боковых цепях аминокислот и в амино- или карбоксиконце. Будет понятно, что один и тот же тип модификации может присутствовать в одной и той же степени или в варьирующихся степенях в нескольких сайтах в конкретном полипептиде. Конкретный полипептид может также иметь многие типы модификаций. Модификации включают в себя ацетилирование, ацилирование, АДФрибозилирование, амидирование, ковалентное присоединение флавина, ковалентное присоединение ра
- 35 019514 дикала гема, ковалентное присоединение нуклеотида или производного нуклеотида, ковалентное присоединение липида или производного липида, ковалентное присоединение фосфатидилинозита, сшивающую циклизацию, образование дисульфидной связи, деметилирование, образование ковалентных поперечных связей, образование цистеина, образование пироглутамата, формилирование, гаммакарбоксилирование, гликозилирование, образование СРЕякоря, гидроксилирование, иодинирование, метилирование, миристоилирование, окисление, пэгилирование, фосфорилирование, пренилирование, рацемизацию, селеноилирование, сульфатирование и опосредованное транспортной РНК добавление аминокислот к белку, например, аргинилирование. См., например, Сте1дй!оп, Т.Е., Рго!е1пз - 8йис!ите апб Мо1еси1аг РгорегЕез 2пб Еб., \У.Н. Ргеетап апб Сотрапу, №\ν Уогк (1993); Розйгапз1айопа1 Соуа1еп! Моб|Псайоп о1 Рго!е1пз, В.С. 1оЬпзоп, Еб., Асабетк Ргезз, №\ν Уогк, рр. 1-12 (1983).
Способы твердофазного химического синтеза пептидов могут быть также использованы для синтеза полипептида или фрагментов этого изобретения. Такой способ был известен в данной области с ранних 1960-ых годов (Метйе1б, В. В., 1. Ат. СНет. 8ос, 85:2149-2154, 1963) (см. также 81е\\ай 1. М. и Уоипд, 1. Ό., 8о11б РЬазе Рерйбе 8уп!1ез1з, 2пб Еб., Р1егсе СНет1са1 Со., Воск&гб, 111, рр. 11-12)) и был недавно использован в коммерчески доступных лабораторных наборах для конструирования и синтеза пептидов (СатЬпбде ВезеагсЬ Вюсйетка1з). Такие коммерчески доступные лабораторные наборы обычно использовали рекомендации Н. М. Сеузеп е! а1., Ргос. №И. Асаб. 8ск, И8А, 81:3998 (1984) и обеспечивают синтез пептидов на кончиках множества штифтов или стержней, все из которых соединены с единственным планшетом. При использовании такой системы планшет штифтов и стержней перевертывали и вставляли во второй планшет соответствующих лунок или резервуаров, которые содержат растворы для прикрепления или заякоривания подходящей аминокислоты к кончикам этих стержней или штифтов. Посредством повторения такой стадии процесса, т.е. перевертывания и вставления кончиков штифтов и стержней в подходящие растворы, аминокислоты выстраивались в желаемые пептиды. Кроме того, доступен ряд систем синтеза РМ0С пептида. Например, сборка полипептида или фрагмента может проводиться на твердом носителе с использованием автоматизированного пептидного синтезатора Аррйеб В1озуз!етз, Шс. Мобе1 431А™. Такое оборудование обеспечивает легкий доступ к пептидам этого изобретения, либо посредством прямого синтеза, либо посредством синтеза ряда фрагментов, которые могут быть связаны с использованием других известных способов.
Настоящее изобретение включает в себя полипептиды этого изобретения с сигнальными последовательностями, т.е. лидерными последовательностями, и без сигнальных последовательностей, т.е. лидерных последовательностей. Этим полипептидом, содержащим сигнальную последовательность этого изобретения, может быть сенсор СО2 этого изобретения или другой сенсор СО2 или другой фермент или другой полипептид.
Антитела и способы скрининга на основе антител
Настоящее изобретение обеспечивает выделенные, синтетические или рекомбинантные антитела, которые специфически связываются с сенсором СО2 этого изобретения. Эти антитела могут быть использованы для выделения, идентификации или количественного определения полипептидов сенсора СО2 этого изобретения или родственных полипептидов. Эти антитела могут быть использованы для выделения других полипептидов в пределах объема этого изобретения или других родственных сенсоров СО2. Эти антитела могут быть сконструированы для связывания с активным центром сенсора СО2. Таким образом, изобретение обеспечивает способы ингибирования сенсора СО2 с использованием антител этого изобретения.
Настоящее изобретение обеспечивает фрагменты ферментов этого изобретения, в том числе иммуногенные фрагменты полипептида этого изобретения. Настоящее изобретение обеспечивает композиции, содержащие полипептид или пептид этого изобретения и адъюванты или носители и т.п.
Эти антитела могут быть использованы в иммунопреципитации, окрашивании, в иммуноаффинных колонках и т.п. Если желательно, последовательности нуклеиновых кислот, кодирующие специфические антигены, могут быть генерированы иммунизацией с последующим выделением полипептида или нуклеиновой кислоты, амплификацией или клонированием и иммобилизацией полипептида на матрице этого изобретения. Альтернативно, способы этого изобретения могут быть использованы для модификации структуры антитела, продуцируемого подлежащей модификации клеткой, например, аффинность антитела может быть увеличена или уменьшена. Кроме того, способность получать или модифицировать антитела может быть фенотипом, встроенным в клетку способами этого изобретения.
В альтернативных аспектах антитело этого изобретения включает в себя пептид или полипептид, полученный из гена иммуноглобулина или из генов иммуноглобулинов, или их фрагментов, смоделированный в соответствии с ними или по существу кодируемый ими, способный специфически связывать антиген или эпитоп, см., например, Рипбатеп!а1 Iттипо1оду, ТЫгб Ебйюп, ^.Е. Раи1, еб., Вауеп Ргезз, КУ. (1993); ХУПзоп (1994) 1. Тттипо1. Ме!1обз 175:267-273; УагтнзН (1992) 1. ВюсНет. ВюрНуз. Ме!1обз 25:85-97. Термин антитело включает в себя антигенсвязывающие части, т.е. антигенсвязывающие сайты (например, фрагменты, субпоследовательности, определяющие комплементарность районы (СОВ), которые сохраняют способность связывать антиген, включающие в себя (ί) фрагмент РаЬ, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов УЪ, УН, СЬ и СН1; (ίί) фрагмент Р(аЬ')2, бивалентный фрагмент,
- 36 019514 содержащий два фрагмента ЕаЫ, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (ίίί) фрагмент ЕВ, состоящий из доменов УН и СН1; (ίν) фрагмент Εν, состоящий из доменов УЬ и УН единственного плеча антитела, (ν) фрагмент ВАЫ Ггадтей (АагВ е( а1., (1989) ЫаШге 341:544-546), который состоит из домена УН; и (νί) выделенный определяющий комплементарность район (СОВ). Одноцепочечные антитела также включены в термин антитело.
Способы иммунизации, получения и выделения антител (поликлональных и моноклональных) известны квалифицированным в данной области специалистам и описаны в научной и патентной литературе, см., например, СЕВВЕХТ РВОТОСОЬ8 ΙΝ 1ММиЫОЬОС¥, АВеу/Сгеепе, ΝΥ (1991); 81Нек (еВк.) ВА81С ΛΝΌ СЕШС/АЕ IММυNО^ОСΥ (7ίΒ еВ.) Ьапде МеВ1са1 РиЫВсаВопз, Ьок АВок, СА (8Шек); СоВтд, МОХОСЕОХАЕ АХПВОП1Е8: РВ1ХС1РЕЕ8 АХО РВАСТ1СЕ (2В еВ.) АсаВетк Ргекк, Хе\\ ХогЕ, ^Υ (1986); КоВ1ег (1975) ХаИие 256:495; Найоте (1988) АКЛВОПШБ, А ^ΛВОВАТОВΥ МАХ иАЬ, Со1В 8рппд НагЫог РиЫВсаВопк, Хе\у Υо^к. Антитела могут быть также генерированы ш νίΙΐΌ, например, с использованием библиотек фагового дисплея, экспрессирующих сайты связывания рекомбинантных антител, наряду с традиционными способами ш νί\Ό с использованием животных. См., например, НоодепЫоот (1997) ТгепВк Вю!есВпо1. 15:62-70; Ка1х (1997) Аппи. Веν. ВюрВук. Вюто1. 81гисЕ 26:27-45.
Матрицы или биочипы
Нуклеиновые кислоты и/или полипептиды этого изобретения могут быть иммобилизованы на матрице, например, биочипе (микропроцессоре). Матрицы могут быть использованы для скрининга для мониторинга библиотек композиций (например, малых молекул, антител, нуклеиновых кислот и т.д.) на их способность связываться с нуклеиновой кислотой или полипептидом или модулировать активность нуклеиновой кислоты или полипептида этого изобретения. Например, в одном аспекте этого изобретения подвергаемым мониторингу параметром является экспрессия транскрипта гена сенсора СО2. Один или несколько или все транскрипты клетки могут быть измерены гибридизацией пробы, содержащей транскрипты клетки, или нуклеиновые кислоты, репрезентативные в отношении транскриптов клетки или комплементарные транскриптам клетки, посредством гибридизации с иммобилизованными нуклеиновыми кислотами на матрице, или биочипе. С использованием матрицы нуклеиновых кислот на микрочипе могут быть количественно определены одновременно несколько или все из транскриптов клетки. Альтернативно, матрицы, содержащие геномную нуклеиновую кислоту, также могут быть использованы для определения генотипа нового сконструированного штамма, полученного способами этого изобретения. Полипептидные матрицы могут также быть использованы для одновременного количественного определения множества белков. Данное изобретение может использоваться на практике с любой известной матрицей, также называемой микроматрицей или матрицей нуклеиновых кислот или матрицей полипептидов или матрицей антител или биочипом, или их вариацией. Матрицы являются в общем смысле множеством пятен или элементов-мишеней, причем каждый элемент-мишень содержит определенное количество одной или нескольких биологических молекул, например олигонуклеотидов, иммобилизованных на определенной площади поверхности-субстрата для специфического связывания с молекулой пробы, например, мРНК-транскриптами.
Термины матрица или микроматрица или биочип или чип обозначают в данном контексте множество элементов-мишеней, причем каждый элемент-мишень содержит определенное количество одного или нескольких полипептидов (в том числе антител) или нуклеиновых кислот, иммобилизованных на определенной площади поверхности-субстрата, как обсуждается более подробно ниже.
В применении на практике способов этого изобретения, любая известная матрица и/или любой известный способ получения и применения матриц могут быть включены в полном виде или частично, или в виде их вариаций, как описано, например, в Патентах США с номерами 6277628; 6277489; 6261776; 6258606; 6054270; 6048695; 6045996; 6022963; 6013440; 5965452; 5959098; 5856174; 5830645; 5770456; 5632957; 5556752; 5143854; 5807522; 5800992; 5744305; 5700637; 5556752; 5434049; см.также, например, АО 99/51773; АО 99/09217; АО 97/46313; АО 96/17958; см. также, например, 1оВпкЮп (1998) Сигг. Вю1. 8:В171-В174; 8сВиттег (1997) Вю1есВпк.|иек 23:1087-1092; Кет (1997) Вю1есВпк.|иек 23:120-124; 8оВиакТо1Во (1997) Сепек, СВготокотек & Сапсег 20:399-407; Во\\1е11 (1999) ХаВие СепеВск 8ирр. 21:25-32. См. также опубликованные заявки на патент США с номерами 20010018642; 20010019827; 20010016322; 20010014449; 20010014448;20010012537;20010008765.
Наборы и библиотеки
Настоящее изобретение обеспечивает наборы, содержащие композиции и способы этого изобретения, включающие в себя клетки и/или фиши этого изобретения, последовательности-мишени, трансфицирующие агенты, трансдуцирующие агенты, инструкции (касающиеся способов этого изобретения) или любые их комбинации. Такие наборы, клетки, векторы и т.п. обеспечены здесь.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для модуляции размера и/или высоты растения; в том числе, например, модуляция отбора, например, целого растения или конкретной части растения, или скорости роста или мощности проростков позволяет получать растения, более подходящие для конкретной отрасли промышленности. Например, уменьшения высоты конкретных сельскохозяйственных растений и древесных видов могут быть полезными для более легкого сбора урожая. Альтерна
- 37 019514 тивно, увеличение высоты, толщины или размера органа, количества органов может быть выгодным вследствие обеспечения большей биомассы для переработки в пищевые продукты, корма, топлива и/или химикалии. Другие примеры коммерчески желательных признаков включают в себя увеличение длины цветковых стеблей срезанных цветков, увеличение или изменение размера и формы листа или увеличение размера семян и/или плодов. Изменения размера органов, количества органов и биомассы приводит также к изменениям массы составляющих молекул, таких как вторичные продукты, и превращают эти растения в фабрики для этих соединений. Таким образом, композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для модуляции размера растения, вегетативного роста, скорости роста растения, количества органов, архитектуры растения и/или биомассы.
Далее изобретение будет объясняться со ссылкой на следующие примеры; однако должно быть понятно, что изобретение не ограничивается этими примерами.
Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Манипулирование обменом воды и диоксида углерода (СО2) через устьица растений посредством регуляции генов сенсоров СО2 этого изобретения
Настоящее изобретение обеспечивает способы манипулирования обменом воды и диоксида углерода (СО2) через устьица растений посредством регуляции генов сенсоров СО2 этого изобретения.
Конструировали двойной мутант А^аЬ^бοрк^к ШаЕапа: этот двойной мутант лишен полноразмерной экспрессии двух гомологичных генов, которые в высокой степени экспрессируются в замыкающих клетках дикого типа, в соответствии с анализами клеткоспецифических микроматриц.
Этот двойной мутант СО28еп лишен полноразмерной экспрессии гомологичных генов, которые в высокой степени экспрессируются в замыкающих клетках дикого типа, в соответствии с анализами клеткоспецифических микроматриц. Этот двойной мутант СО28еп обнаруживает нарушенную устьичную реакцию, измеренную анализом газообмена реального времени, на изменения [СО2]; как в отношении изменений с 365 м.д. СО2 до повышенных 800 м.д. СО2 окружающей среды, так и в отношении изменений с 800 м.д. СО2 до уменьшенных 100 м.д. СО2. Эти кодируемые белки СО28еп-типа связывают СО2.
Фиг. 1 графически иллюстрирует данные, показывающие устьичную проводимость в экотипе ί,'ο1итЫа А^аЬ^бοрк^к ШаЛапа дикого типа и СО28еп-двойном мутанте. 365 м.д. СО2 окружающей среды 01800 с, 800 м.д. СО2 1800-3600 с, 100 м.д. СО2 3600-9000 с.
Фиг. 2 иллюстрирует различные уровни экспрессии в разных стадиях развития замыкающих клеток (СС):
фиг. 2А - различные уровни экспрессии в разных стадиях развития СС;
фиг. 2В - экспрессия 27-СИ8 в молодых листьях и молодых стеблях листьев;
фиг. 2С - экспрессия 27-СИ8 в верхнем уровне гипокотиля;
фиг. 2Ό - экспрессия 27-СИ8 в стебле и крае листа;
фиг. 2Е и 2Е - четыре выступа в диком типе.
Фиг. 3 иллюстрирует экспрессию 27-ΥΕ3.6 (8ЕО ΙΌ NО: 10) в СС на стебле соседнего листа, но не в очень молодом листе (очерчено) (А и А'). 27-ΥΕ3.6 экспрессируется в основном в зрелых СС, очень слабо в молодых или незрелых СС (белая стрелка в В и В'). 27-ΥΕ3.60 (8ЕО ΙΌ NО:11) экспрессируется также в СС на гипокотиле (С и С'). 27-ΥΕ3.6 (8ЕО ΙΌ NО: 10) экспрессируется также в СС на чашелистиках (Ό и Ό').
Пример 2. Характеристика рецепторов СО2, которые регулируют поглощение СО2 и эффективность использования воды растениями
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции открывания и/или закрывания устьичных щелей растений. Устьичные щели образованы парами замыкающих клеток в эпидермисе листьев и делают возможной регуляцию потери воды растением и вхождения диоксида углерода (СО2) в растения. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции количества СО2, поглощенного для фотосинтетической фиксации углерода, и количества воды, теряемой через процесс транспирации через эти регулируемые устьичные щели. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для обеспечения механизмов трансдукции сигнала в замыкающих клетках для восприятия уровней СО2, водного режима, света и других стимулов окружающей среды для регуляции устьичных щелей для оптимизации вхождения СО2, потери воды и роста растений при различных условиях.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для сенсибилизирования растений к высоким уровням СО2 для запуска закрывания устьиц и для сенсибилизирования растений к низким уровням СО2 для индукции раскрывания устьиц. В одном аспекте эти композиции и способы данного изобретения используют для содействия секвестрации атмосферной [СО2] (что в одном аспекте выполняется ингибированием экспрессии СО2-чувствительных белков ш νίνο или ш кПи), например, для ослабления увеличивающихся уровней атмосферных [СО2], которые, как предсказывается, будет удваиваться в этом столетии. В одном аспекте композиции и способы этого изобретения будут улучшать эффект закрытости устьиц увеличивающихся уровней атмосферной [СО2] (что в одном аспекте осуществляется увеличением экспрессии СО2-чувствительных белков ш νίνο и ш кПи), поскольку, как следует отметить, увеличения СО2 окружающей среды будут уменьшать устьичные щели различных видов растений мак
- 38 019514 симально на 40%. В одном аспекте композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для ослабления сильных действий на газообмен, фиксацию углерода, температуру листа и/или эффективность использования воды растений, вызываемые, например, в глобальном масштабе, увеличением уровней атмосферной [СО2].
Авторами этого изобретения были впервые получены и охарактеризованы мутанты, которые обнаруживают отсутствие чувствительности к устьичным реакциям на СО2, но не нарушают реакций опадения листьев. При помощи специфического для замыкающих клеток анализа с применением микроматриц изобретение идентифицировало двойной мутант в двух гомологичных генах, названных: СО2чувствительный белок 1 (СОНР1), также обозначаемый СА1'', или Αΐ3§01500 или 8ЕЦ ΙΌ ЫО:7; и СО2чувствительный белок 2 (СОНР2), также обозначаемый СА4, или Αΐ1§70410 или 8ЕЦ ΙΌ ЫО:1; оба из которых в высокой степени экспрессируются в замыкающих клетках растений ΑπιΝάορδίδ. В то время как мутанты с единственным нокаутом не обнаруживали изменения фенотипа, растения двойных мутантов с мутациями в этих двух генах обнаруживали сильное нарушение в СО2-индуцируемой закрытости устьиц в сравнении с растениями дикого типа как показано на фиг. 4а. Исследования показывают комплементацию этого СО2-фенотипа трансгенной экспрессией кДНК СОНР1 (8ЕЦ ΙΌ ΝΘ:7), как иллюстрировано на фиг. 4Ь. Фиг. 4а и 4Ь иллюстрируют относительные устьичные проводимости двойного мутанта (οοτρ1/οοτρ2), \УТ (дикого типа) (Ь) трансгенно комплементированной линии (СОПРЬте^ οοτρ2), экспрессирующей СОНР1 в ответ на изменения в концентрациях СО2 (Х-ось: м.д. [СО2]).
Белки СОНР, связывающие СО2, οοτρ1 (кодируемый, например, 8ЕЦ ΙΌ ЫО:7) и οοτρ2 (кодируемый, например, 8ЕЦ ΙΌ ΝΌ:1), также экспрессируются в других клетках растений. Растения двойного мутанта οοτρ1/οοτρ2 не обнаруживали нарушения других важных путей передачи сигналов в замыкающих клетках, в том числе закрытости устьиц, вызываемой индуцируемым засухой гормоном абсцизовой кислотой (ΑΒΑ), как иллюстрировано на фиг. 4с. Фиг. 4(с) графически иллюстрирует данные, демонстрирующие интактную реакцию ЗЕЦ ΙΌ ЫО:7/8Ер ΙΌ ЫО:1, или οοτρ1/οοτρ2, двойного мутанта и растений \УТ на абсцизовую кислоту (ΑΒΑ).
Эти данные демонстрируют, что СОНР1 (кодируемый, например, 8ЕЦ ΙΌ ЫО:7) и οοτρ2 (ЗЕЦ ΙΌ ЫО:1) функционируют в качестве рецепторов СО2 в замыкающих клетках, которые регулируют глобальный газообмен растения и являются важными для достижения понимания молекулярных механизмов, которые опосредуют трансдукцию сигнала СО2 через СОНР1 (кодируемый, например, 8ЕЦ ΙΌ ЫО:7) и СОНР2 (кодируемый, например, 8ЕЦ ΙΌ ЫО:1) в замыкающих клетках.
В другом аспекте для облегчения анализов субклеточной локализации (субклеточных локализаций) белков СОЕР, в том числе белков СОЕР этого изобретения, например, белков СОНР1 и СОНР2, Настоящее изобретение обеспечивает также Ν- и С-концевые метки (например, УБР-слияния) с белками СОБР, в том числе белками СОНР этого изобретения, например СОНР1 и СОНР2. Эти меченые белки СОНР вводят в растения дикого типа и двойные мутантные растения οοτρ1 οοτρ2. Анализируют клеточную локализацию и одновременную комплементацию.
В другом аспекте СОНР-кодирующие гены, такие как нуклеиновые кислоты этого изобретения, кодирующие белки СОИР, например, οοτρ1 и οοτρ2, функционально связывают с различными регулирующими транскрипцию последовательностями, например промоторами, такими как специфические для замыкающих клеток регуляторные последовательности транскрипции, например специфические для замыкающих клеток промоторы этого изобретения. Эти нуклеиновые кислоты используют для определения, могут ли СОЯР1 и/или СОЯР2 быть экспрессированы в замыкающих клетках для функциональной передачи сигнала устьичного СО2; например, являются ли СОЯР1 и/или СОЯР2 отдельно или вместе достаточными для функциональной передачи сигнала устьичной СО2 в клетке, ткани или органе растения.
В одном аспекте изобретение вводит эти два гена под контролем специфического для замыкающих клеток промотора, например, специфических для замыкающих клеток регуляторных последовательностей транскрипции этого изобретения, например, специфических для замыкающих клеток промоторов этого изобретения, специфического для мезофильных клеток промотора и/или эктопического промотора 358, в растения двойного мутанта οοτρ1 οοτρ2 для определения клетко-специфической необходимости в отношении комплементации нарушенной реакции на СО2. Для этой задачи проводят анализ газообмена и анализ трансдукции сигнала устьиц. Результаты показали, что эти рецепторы функционируют в передаче сигнала устьичного СО2 в замыкающих клетках.
В одном аспекте изобретение характеризует механизмы передачи сигнала СО2, опосредуемой белками СОЯР, например, с использованием СОЯР-кодирующих нуклеиновых кислот этого изобретения, и в одном примерном способе взаимодействующие с СО^Р белки выделяют из клеток растения, бактерий или других клеток. В одном аспекте способы предусматриают применение дрожжевых двухгибридных систем скрининга, системы скрининга с расщеплением убиквитина и/или систем коиммунопреципитации с использованием, например, УБР-меченых (или эквивалентно меченых) белков СО^Р. Функции взаимодействующих СО^Р в трансдукции сигнала СО2 идентифицируют и анализируют.
В одном аспекте изобретение обеспечивает клетки, ткани, органы и/или линии клеток с клеткоспецифической сверхэкспрессией СО^Р, например для анализа эффективности использования воды рас
- 39 019514 тений при различных концентрациях СО2 и создания улучшенной эффективности использования воды в АгаЬ1борз1з и выбранных важных экономических сельскохозяйственных культурах, например, экономически важных для фиксации углерода. Результаты показывают большее чем 50%-ное увеличение эффективности использования воды в АгаЬ1борз1з посредством сверхэкспрессии СОВР (с использованием согркодирующих нуклеиновых кислот этого изобретения).
Выполняли комплементацию двойного мутанта двух гомологичных генов СО2-чувствительного белка 1, (СОВР1), также обозначаемого СА1'', или А13д01500 или 8Е0 ГО NО:7; и СО2-чувствительного белка 2 (СОВР2), также обозначаемого СА4, или А11д70410 или 8Е0 ГО NО:1 (СОВР1). Авторы измеряли устьичный индекс комплементированных растений и сверхэкспрессирующих растений. Как показано на фиг. 5А и 5В, как СА1 (8Е0 ГО ΝΘ:7), так и СА4 (8Е0 ГО NО:1) могут комплементировать эти двойные мутанты в варьирующихся степенях. Сверхэкспрессия СА1 уменьшает устьичный индекс. Устьичный индекс определяется как: (количество устьиц на мм2 х 100)/(количество устьиц на мм2 + количество эпидермальных клеток на мм2; или выражаясь альтернативно: Устьичный индекс (I) = [8/(Е+8)] -100, где 8 обозначает количество устьиц на единицу площади, и Е обозначает количество эпидермальных клеток на ту же самую единицу площади. Эта величина устьичного индекса может быть применима в сравнении листьев разных размеров; относительная влажность и интенсивность света во время развития листа влияет на величину устьичного индекса.
Измеряли также газообмен и эффективность использования воды (№ИЕ) СА1- (8ЕО ГО NО:7) и СА4- (8ЕО ГО NО:1) комплементированных растений. Газообмен и №ИЕ растений измеряют утром. Примерные результаты анализированы и показаны на фиг. 6, и они показывают относительную устьичную проводимость; причем эти результаты суммированы и графически иллюстрированы на фиг. 7.
Фиг. 8 иллюстрирует микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8ЕО ГО NО:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1) в комплементированных растениях, в частности в листьях, и в замыкающих клетках и в мезофильных клетках.
Фиг. 9А и 9В иллюстрирует микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8ЕС) ГО ^:7) и СА4 (8ЕО ГО ΝΘ:1) в случае двойных нокаутов (СА1 (8ЕО ГО ΝΘ:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1). Фиг. 9С, 9Ό и 9Е иллюстрируют данные из сенсора СО2, показывающие недостаточную регуляцию СО2 газообмена; обратите внимание: Световые условия = красный свет (50 мкмоль-м-2-с-1), синий свет (6 мкмоль-м-2-с-1).
Фиг. 10А графически иллюстрирует суммирование данных, показывающих интактную реакцию на абсцизовую кислоту в двойном мутанте са1са4 (СА1 (8ЕО ГО NО:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1)). Фиг. 10В графически иллюстрирует суммирование данных, показывающих, что ингибитор СА1 (8ЕО ГО NО:7) и/или СА4 (8ЕО ГО NО: 1) имитирует СО2-нечувствительность в растениях дикого типа (№Т).
Фиг. 11А и 11В иллюстрируют микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8ЕО ГО NО:7) апб СА4 (8ЕО ГО NО:1) в растениях с двойным нокаутом СА1 (8ЕО ГО NО:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1)), а фиг. 11С графически иллюстрирует данные, показывающие, что геномные ДНК генов СА1 (8ЕО ГО NО:7) или СА4 (8ЕО ГО NО:1) могут комплементировать СО2-реакцию при различных световых условиях: красный свет (50 мкмоль.м-2-с-1), синий свет (6 мкмоль.м-2-с-1).
Фиг. 12А, 12В и 12С графически иллюстрируют суммирование данных, показывающих, что фотосинтез не нарушается в мутантных растениях са1са4 с двойным нокаутом сенсора СО2. Свет во время предварительной адаптации, перед измерениями Р8-флуоресценции: 50 мкмоль-т-2-с-1) 88% красный свет, 12% синий свет; 2000 мкмоль-т-2-с-1 : 90% красный свет, 10% синий свет. Фиг. 12Ό иллюстрирует скорость ассимиляции СО2 в темноте и на красном свете (где этот красный свет: 300 мкмоль-т-2-с-1).
Фиг. 13А, 13В, 13С и 13Ό графически и в виде изображений иллюстрируют, что обесцвеченные листья с нарушенным фотосинтезом обнаруживают интактную СО2-регуляцию газообмена.
Фиг. 14А и 14В иллюстрируют микрофотографии Нозерн-блотов, показывающих уровень экспрессии СА1 (8ЕО ГО NО:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1) в растениях с двойным нокаутом (СА1 (8ЕО ГО NО:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1)); а фиг. 14С и 14Ό графически и в виде изображений иллюстрируют, что растения со сверхэкспрессией сенсора СО2, в которых СА1 (8ЕО ГО NО:7) и СА4 (8ЕО ГО NО:1) функционально связаны с нацеленными на замыкающие клетки промоторами этого изобретения, обнаруживают повышенную эффективность использования воды (№ИЕ). На фиг. 14Ό эти данные не обнаруживают действия, наблюдаемого в отношении времени цветения.
Пример 3. Выделение и характеристика сильного промотора замыкающих клеток АгаЬ1борз1з и его применение в качестве активатора транскрипции замыкающих клеток
Настоящее изобретение обеспечивает активаторы транскрипции, которые являются очень активными в замыкающих клетках растений; в том числе специфические для замыкающих клеток активаторы транскрипци, такие как промоторы. Например, изобретение обеспечивает нуклеиновые кислоты (полинуклеотиды), имеющие последовательность, имеющую по меньшей мере 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99%, или большую или полную идентичность последовательности с 8ЕО ГО NО:10 и/или 8ЕО ГО:11, на протяжении района по меньшей мере приблизительно 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 или
- 40 019514 более остатков, или на протяжении полной длины промотора, имеющего специфическую для замыкающих клеток активность, где эти нуклеиновые кислоты содержат специфический для замыкающих клеток промотор или специфический для замыкающих клеток район регуляции транскрипции или состоят из специфического для замыкающих клеток промотора или специфического для замыкающих клеток района регуляции транскрипции.
В одном аспекте изобретение обеспечивает районы регуляции транскрипции замыкающих клеток, которые постоянно дают высокую экспрессию гетерологичных последовательностей в клетке растения, например, постоянно дают высокую экспрессию представляющих интерес трансгенов. В одном аспекте, районы регуляции транскрипции этого изобретения используют для улучшения доступных способов для нацеленной экспрессии генов в замыкающих клетках.
Кандидаты сильных промоторов замыкающих клеток выделяли на основе новых анализов специфических для замыкающих клеток микроматриц 23000 генов. Подход на основе анализа специфических для замыкающих клеток микроматриц использовали для анализа предположительных сильных специфических для замыкающих клеток промоторов. Промотор рСС1 (Α!1§22690) запускал очень сильную экспрессию репортерных генов (С^ и кальциевого репортера на основе СΕΡ) в замыкающих клетках как Α^аЬ^йοрк^к, так и табака. Специфическая супрессия генов в замыкающих клетках достигалась также рСС1, запускающим антисмысловую репрессию.
Результаты: Промотор рСС1 (Α!1§22690) запускал сильную и относительно специфическую экспрессию репортерного гена в замыкающих клетках, в том числе С^ (бета-галактуронидазы) и уе11о\у сате1еоп УС3.60 (кальциевого ΕΚΕΤ-репортера на основе СΕΡ). Экспрессия репортерного гена была более слабой в незрелых замыкающих клетках.
Экспрессия УС3.60 была достаточной сильной для визуализации внутриклеточной динамики Са2+ в замыкающих клетках интактных растений и показала спонтанные транзиторные количества кальция в замыкающих клетках. Промотор СС1 опосредовал также сильную экспрессию репортера в образующих скопления устьицах в мутанте устьичного развития !оо-таиу-тои!Й8 (!тт).
Кроме того, те же самые конструкции промотор::репортер запускали также специфическую для замыкающих клеток экспрессию репортера в табаке, иллюстрируя потенциал этого промотора в качестве способа экспрессии высокого уровня в замыкающих клетках. Последовательная делеция этого промотора определила район промотора экспрессии замыкающих клеток. Кроме того, антисмысловая репрессия с использованием рСС1 была эффективной для уменьшения экспрессии специфического гена СΕΡ в замыкающих клетках, тогда как экспрессия в эпидермальных клетках листа не репрессировалась, что демонстрирует сильную преимущественную для определенного типа клеток репрессию гена.
Заключение: Промотор рСС1 этого изобретения запускает сильную экспрессию репортера в замыкающих клетках растений ^аМ^рак и табака. Эти промоторы данного изобретения могут обеспечить сильный инструмент для нацеленной на замыкающие клетки экспрессии или сайленсинга генов. Промоторы этого изобретения могут быть использованы для уменьшения экспрессии специфического гена в замыкающих клетках, обеспечивая способ обхода недостатков, возникающих из генетической избыточности и летальности. Промоторы этого изобретения могут быть использованы для манипулирования путями передачи сигналов в замыкающих клетках и модификации производительности (урожайности) растений при стрессовых условиях.
Результаты
Выделение рСС1, сильного промотора замыкающих клеток
Результаты специфических для замыкающих клеток микроматриц анализировали последовательно с результатами специфических для мезофильных клеток микроматриц (см. ссылку 26, цитируемую ниже) для поиска на сильные кандидаты специфических для замыкающих клеток промоторов с низкими уровнями экспрессии в мезофильных клетках. Дополнительные эксперименты с микроматрицами замыкающих клеток и мезофильных клеток проводили с охватом 234000 генов (источник: АТН1 Αί'ίνιικΙπχ, δаη!а С1ага, СΑ). Кроме того, кандидатные гены анализировали при помощи СΕΝΕVΕδΤIСΑΤОΚ™ для отбора генов с низкими уровнями экспрессии в тканях других, чем ткани листа, в более чем 2000 экспериментов с микроматрицами (см. ссылку 27, цитируемую ниже). Замыкающие клетки и мезофильные клетки, подвергнутые действию ΑΒΑ, также анализировали, так как синтез ΑΒΑ индуцируется при некоторых стрессовых условиях. Следующие критерии использовали для отбора кандидатов сильных промоторов замыкающих клеток. Исходный сигнал в замыкающих клетках устанавливали выше 10000, исходный сигнал в мезофильных клетках устанавливали ниже 1000 и кратное уменьшение или кратную индукцию под действием ΑΒΑ устанавливали ниже 2. Профили транскрипции нескольких генов проводили через эти критерии, см. фиг. 15, которая графически суммирует данные, показывающие профили транскрипции экспрессируемых замыкающими клетками генов как в замыкающих клетках, так и в мезофильных клетках.
На фиг. 15 изображены средние уровни транскрптов ΚΑΤ1 (Α!5§46240), ΑίΜΎΒοО (Α!1§08810), ΑίΜΥΒ61 (Α!1§09540), ΚΑΒ18 (Α!5§66400), СС1 (Α!1§22690) (δΕΟ ΙΌ ^: 10) и ΑίΆΟΤ7 (Α!5§09810) из двух независимых микроматриц. Хотя ΚΑΤ1, ΑίΜΎΒ60 и СС1 все проявляли специфическую для замыкающих клеток экспрессию, уровень транскрипта СС1 был наивысшим среди этих трех генов. ΚΑΒ18
- 41 019514 также обнаруживал очень высокую экспрессию в замыкающих клетках, но его экспрессия в мезофильных клетках сильно индуцировалась обработкой АВА.
Эти предположительные промоторы (на 1-2 т.п.н. справа от аннотированного стартового кодона АТС, см. фиг. 16) амплифицировали при помощи ПЦР и клонировали в вектор с репортером СИ8. СИ8окрашивание трансгенных растений Т1, показавших специфическое для замыкающих клеток окрашивание для одного конкретного промотора-кандидата (А11д22690), было обозначено как рСС1. Λΐ1β22690 находится среди наиболее высоко экспрессируемых генов в замыкающих клетках. Он показал относительно высокую экспрессию в замыкающих клетках и низкую экспрессию в мезофильных клетках. А11д22690 кодирует малый богатый цистеином белок (119 аминокислот). Он принадлежит к семейству СА8А (белка-гомолога СА-стимулируемого транскрипта (СА8Т1)). Исследование ^1доба е1 а1. [28] предполагает, что С1Р2 (белок СА8А из гибрида РеШша) проявлял ίη р1ап1а антиоксидантную активность. Т-^NА-инсерционная линия в АПд22690 не давала каких-либо достойных внимания устьичных фенотипов в обычных лабораторных условиях авторов (неопубликованные данные). Кроме того, результаты микроматриц замыкающих клеток авторов показали, что два других гена СА8А также показали высокий уровень экспрессии в замыкающих клетках (СА8А 1 (А11д75750) и СА8А 4 (А15д15230).
Фиг. 16 является промоторной последовательностью СС1 (8ЕЭ ΙΌ N0:10, но последовательность фиг. 16 также имеет АТС, добавленный на 3'-конце): в СС1 стартовый сайт транскрипции обозначен как +1, и предположительный стартовый кодон (АТС) локализован при +23/+25 п.н. Сайты-мишени ЭоГ. 5'ТАААС-3'(+) или 5'-СТТТА-3'(-), которые, как было показано, способствуют экспрессии специфического для замыкающих клеток гена [24], находятся в блоках. АВЕЕ, чувствительный к абсцизовой кислоте элемент, 5'-АССТС-3' (+) или 5'-САССТ-3' (-), подчеркнуты и отмечены. ТАТА-бокс (5'-ТАТАТАА-3') и стартовый кодон (АТС) показаны жирным шрифтом с заштрихованными блоками. Острия стрелок отмечают положения для делеционных анализов на фиг. 18.
Авторы анализировали экспрессию гена СС1 (А11д22690) в ответ на различные обработки в результатах микроматриц, компилированных при помощи СЕИЕУЕ8Т1САТ0Е™ [27, 29]. Среди 96 обработок 8 обработок влияли на экспрессию А11д22690 более чем в 2 раза. Солевой и осмотический стресс разительно уменьшал экспрессию гена А11д22690 (более чем в 10 раз) [30]. Между тем, свет, АВА, СА, холод или засуха не индуцировали большего, чем двухкратное изменение, в экспрессии гена АПд22690. Это позволяет предположить, что СС1 (АПд22690) имеет относительно постоянную экспрессию в большинстве обычных ситуаций.
Интересно, что рСС1::СИ8 обеспечивал сильную экспрессию СИ8 в замыкающих клетках не только в листьях (фиг. 17 А, В), но и в замыкающих клетках черешков и гипокотилей (фиг. 17С, Ό, Е). СИ8окрашивание из других кандидатных слияний промотор-СИ8 было или не очень сильным в замыкающих клетках и/или показывало экспрессию репортера в других тканях. Таким образом, авторы изобретения сосредоточили внимание на рСС1 в остальной части этого исследования. Промотор рСС1 был также слит со вторым репортером, кальциевым репортером на основе СЕР, уе11о\у сате1еоп 3.60 (УС3.60) [31]. Большинство трансгенных растений Т1 (приблизительно 75%), трансформированных рСС1::УС3.60, проявляли сильную специфическую для замыкающих клеток флуоресценцию, которая указывала на высокую степень эффективности экспрессии в замыкающих клетках на один трансформант. Некоторые растения обнаруживали также флуоресценцию в некоторых эпидермальных клетках листа (данные не показаны). Однако более молодые или незрелые замыкающие клетки не обнаруживали экспрессии или обнаруживали гораздо меньшую экспрессию СЕР (фиг. 17Е, С). Кроме того, замыкающие клетки в чашелистиках и гипокотилях также обнаруживали экспрессию СЕР (фиг. 17Н, I, 1, К).
Далее авторы изобретения исследовали, может ли промотор СС1 (8ЕЭ ΙΌ N0:10) запускать специфическую для замыкающих клеток экспрессию в мутанте, связанном с развитием, 1оо тапу тоШ115 (1тт) [32]. Мутант 1шт трансформировали либо конструкцией рСС1::СИ8, либо конструкцией рСС1::УС3.60. СИ8-окрашивание показало экспрессию репортерного гена в образовавших скопления устьицах (фиг. 17Ь). Сходным образом, экспрессию СЕР наблюдали в образовавших скопления устьицах в растениях 1шш, трансформированных рСС1::УС3.60 (фиг. 17М).
Для испытания, может ли промотор рСС1 запускать специфическую для замыкающих клеток экспрессию репортерного гена в растениях, других, чем АшМ^ркЕ, авторы изобретения трансформировали также рСС16:УС8.60 в растения табака. Интересно, что сильную экспрессию СЕР в замыкающих клетках наблюдали в листьях табака, см. фиг. 17И.
Резюме для фиг. 17: промотор СС1 опосредует сильную экспрессию репортера в замыкающих клетках проростков АгаЫборЦк, мутанте 1оо тапу тои1115, а также в табаке:
Фиг. 17А - двухнедельный трансгенный проросток рСС1-СИ8.
Фиг. 17В - различные стадии замыкающих клеток проявляли различные уровни экспрессии СИ8.
Фиг. 17С - верхняя часть гипокотиля.
Фиг. 17Ό - молодой лист и черешок.
Фиг. 17Е - край листа и черешок.
Фиг. 17Е и 17С - рСС1::УС3.60 в основном экспрессировался в зрелых замыкающих клетках, клетках, очень слабо в молодых или незрелых замыкающих клетках (белые стрелки в (Г) и (д)).
- 42 019514
Фиг. 17Н и 171 - рСС1::УС3.60 экспрессировался в замыкающих клетках на гипокотиле.
Фиг. 171 и 17К - рСС1::УС3.60 экспрессировался в замыкающих клетках на чашелистике.
Фиг. 17Ь и 17М - рСС1-опосредованная экспрессия репортера 6И8 (Ь) и СЕР (М) в образовавших скопления устьицах в мутанте 1оо тапу тонШк.
Фиг. 17N - рСС1 - опосредованная сильная экспрессия репортера в замыкающих клетках табака.
Последовательные делеции промотора определяют район для специфичности в отношении замыкающих клеток и силы. Промоторный район может содержать как энхансерные, так и репрессорные элементы. Для испытания, какая часть исходного промотора из 1716 пар оснований (п.н.) (полная длина, ЕЬ, -1693 п.н./+23 п.н.) необходима для сильной экспрессии специфического для замыкающих клеток репортера, генерировали четыре 5'-укороченные версии промотора рСС1 (8ЕЦ ГО N0:10) в виде Ό1 (-1140 п.н./+23 п.н.), Ό2 (-861 п.н./+23 п.н.), Ό3 (-43 п.н./+23 п.н.) и Ό4 (-224 п.н./+23 п.н.), см. фиг. 18. Эти укороченные промоторы сливали с репортером СБ8 для генерирования следующих конструкций: р6С1(Б1)::би8, рСС1(И2)::би8, рСС1(И3)::би8 и рСС1(И4)::би8. Эти конструкции с репортером Си8 трансформировали в растения Со1итЬ1а дикого типа последовательно исходной конструкцией р6С1(ЕЬ)::би8. Проростки Т1 (п=50-100) из каждого события трансформаци объединяли и окрашивали. Укороченный рСС1(Б1) запускал одинаковую или более сильную экспрессию 6И8 в проростках в сравнении с исходным полноразмерным промотором (фиг. 4А), что предполагает, что элементы в районе от 1693 до -1140 п.н. могут репрессировать промоторную активность в замыкающих клетках. Промоторы рСС1(П2) и рСС1(Б3) приводили к более слабой экспрессии репортерного гена в замыкающих клетках, чем в случае рСС1 (ЕЬ), что предполагает, что элементы в районе от -1140 до -443 п.н. могут усиливать промоторную активность в замыкающих клетках. Самый короткий промотор, рСС1(П4), запускал экспрессию репортерного гена в тканях, других, чем замыкающие клетки, таких как корни и оболочки семян, что предполагает, что район от -861 до -224 п.н. требовался для специфической для замыкающих клеток активности. Этот район содержит 8 элементов (ТУЛ)ЛЛЛС, которые, как было показано, необходимы для специфической для замыкающих клеток активности промотора К8Т1 в картофеле [24]. Этот укороченный промотор, рСС1(Б1), проявлял сильную экспрессию в замыкающих клетках, что позволяет предположить, что он содержит элементы, необходимые как для специфичности, так и для силы промотора. Таким образом, изобретение обеспечивает активаторы транскрипции (такие как промоторы), которые являются специфическими для замыкающих клеток, которые содержат (или, по существу, состоят из него) район от -861 до -224 п.н.; и обеспечивает активаторы транскрипции (такие как промоторы), которые являются специфическими для замыкающих клеток, которые содержат (или, по существу, состоят из него) район от -1140 до -443 п.н.
В целом, фиг. 18 иллюстрирует последовательные делеции промотора рСС1 для определения районов для экспрессии в замыкающих клетках, где фиг. 18А иллюстрирует фотографии, которые являются репрезентативными растениями Т1 из различных трансгенных линий промотор::СИ8. Промотор рСС1(П1) (-1140/+23) опосредовал более сильную экспрессию СИ8 в замыкающих клетках, чем исходный полноразмерный промотор (ЕЬ) (-1693/+23). Экспрессия 6И8 рСС1(Б2)::Си8 и рСС1(Б3)::Си8 была более слабой, чем экспрессия р6С1(ЕЬ)::би8 и рСС1(Б1)::Си8. Самый короткий промотор рСС1(П4) (-224/+23) запускает экспрессию репортера в тканях и клетках, наряду с замыкающими клетками.
Фиг. 18В графически иллюстрирует последовательную делецию (структурную или в последовательности) промотора рСС1 для определения районов экспрессии замыкающих клеток. Острия черных стрелок обозначают элементы ТЛЛЛС, тогда как острия меньших белых стрелок обозначает элементы ЛЛЛЛС. Острия на верхней части линии промотора находятся на смысловой цепи, тогда как острия ниже линии промотора находятся на антисмысловой цепи. Центральный ТЛЛЛС на смысловой цепи был также отмечен звездой и был выбран для блок-мутагенеза. Район от -1693 до -1140 содержит репрессорные элементы для экспрессии замыкающих клеток, а район от -1140 до -224 содержит элементы для специфичности замыкающих клеток, а также энхансерные элементы для экспрессии замыкающих клеток.
Кальций-визуализация в замыкающих клетках интактных растений
Многие физиологические стимулы в клетках растений индуцируют изменения во внутриклеточном содержании кальция. Кальций действует в качестве вторичного мессенджера во многих каскадах трансдукции сигналов [33]. Цитозольные концентрации кальция могут быть подвергнуты мониторингу либо посредством химических репортеров, таких как логометрический Са-чувствительный флуоресцентный краситель £ита-2 [34, 35], генетически кодируемый кальций-чувствительный люминесцентный белок экворин [14] или флуоресцентный логометрический репортер кальция уе11о\у сате1еоп [12, 15, 36]. Было показано, что сигналы закрывания устьиц, такие как ЛВЛ и СО2, индуцируют увеличения кальция в замыкающих клетках [16, 18, 19, 37-42]. Спонтанные транзиторные концентрации кальция в эпидермальных пробах листа наблюдали также без какой-либо обработки ЛВЛ [15, 43, 44]. Неясно, встречаются ли спонтанные транзиторные концентрации кальция в замыкающих клетках в интактных растениях, так как краситель £ита-2, инъецированный в замыкающие клетки У1ща £аЬа, не обнаруживал таких транзиторных концентраций кальция [45].
Индикатор кальция нового поколения, уе11о\у сате1еоп, УС3.60, показывает увеличенное кальций
- 43 019514 зависимое изменение в отношении ΥΡΡ/СΕΡ почти на 600% в сравнении с \Ό11ο\ν сате^п 2.1 [31]. Посредством объединения промотора рСС1 (8ЕО ΙΌ NО:10) с ΥС3.60, рСС1:УС3.60, как описано ранее, авторы изобретения наблюдали сильную экспрессию ΥС3.60 в замыкающих клетках в интактных листьях, гипокотилях и чашелистиках, как иллюстрировано на фиг. 19.
Вкратце, фиг. 19 иллюстрирует совмещенные внутриклеточные транзиторные концентрации кальция в экспрессирующих рСС1^С3,60 замыкающих клетках, и спонтанные транзиторные концентрации кальция встречаются в замыкающих клетках интактных рСС1:УС3.60 трансгенных растений.
Фиг. 19А иллюстрирует изображение флуоресценции эпидермиса листа рСС1:УС3.60 трансгенного растения. Обратите внимание, что окружающие эпидермальные клетки не были флуоресцентными.
Фиг. 19В иллюстрирует, что шесть замыкающих клеток в панели А, все, продуцировали внутриклеточные транзиторные концентрации кальция в ответ на наложенные колебания кальция. Стрелки отмечают точку переключения от деполяризующего буфера к Са2+-содержащему гиперполяризующему буферу (см. раздел Способы).
Фиг. 19С иллюстрирует псевдоокрашенное логометрическое изображение листа из интактных ί.'ο1растений, трансформированных рСС1:УС3.60. Оранжево-желтая окраска указывает на более высокую [Са2+], а синяя окраска указывает на более низкую [Са2+]. Спонтанные транзиторные концентрации кальция встречались в листьях интактных растений А^аЬ^бοрк^к.
Фиг. 19Ό иллюстрирует временной ход (25 мин) отношений испускания двух замыкающих клеток, отмеченных стрелкой на фиг. 19С, который показывает, что спонтанные транзиторные концентрации кальция встречаются в интактных растениях А^аЬ^бοрк^к. Это отношение рассчитывали для индивидуальных клеток делением интенсивности испускания ΥΡΓ на интенсивность испускания СЕР.
Авторы изобретения сначала измеряли транзиторные концентрации кальция в эпидермисе интактного листа из растений, трансформированных рСС1:^С3.60, наложением колебаний кальция, как описано ранее [11, 46]. Можно было наблюдать в замыкающих клетках большие транзиторные концентрации кальция с логометрическими изменениями до фактора 4 относительно фонового отношения, см. фигуру 19В. Наблюдали логометрические изменения приблизительно 0,5 с использованием 358::Υί.'2.1 в ответ на наложенные транзиторные концентрации кальция [15, 43, 44, 46]. Этот результат дополнительно подтверждали сильным логометрическим сигналом относительно эффективности шума ΥС3.60.
Затем авторы изобретения выполняли кальций-визуализацию в интактных проростках А^аЬ^бοрк^к приготовлением препаратов листьев на покровном стекле для микроскопа. Испытывали два разных способа: первый способ был погружением только корня под воду с оставлением побега в воздухе, а второй был погружением всего растения в воду. Спонтанные транзиторные концентрации кальция детектировали при обоих условиях, см. табл. 1 ниже.
Репрезентативные транзиторные концентрации кальция/временной ход показаны на фиг. 19Ό. Интересно, что спонтанные транзиторные концентрации кальция двух замыкающих клеток из одного и того же устьтца часто не были синхронизированными, см. фиг. 19С, Ό. Эти эксперименты ясно демонстрируют, что спонтанные транзиторные концентрации кальция встречались в замыкающих клетках интактных растений, а не были артефактом визуализации вырезанного эпидермиса и иллюстрируют потенциал промотора рСС1 (8ЕО ΙΌ NО: 10) этого изобретения в качестве способа для запуска экспрессии трансгена и репортера в замыкающих клетках.
Применение рСС1 для манипуляции экспрессией конкретных генов в замыкающих клетках
Манипуляция экспрессией конкретных генов в замыкающих клетках, либо посредством высокой экспрессии гена дикого типа или доминантной мутантной формы, либо посредством уменьшения этой экспрессии в замыкающих клетках, могла бы быть очень эффективной для испытания функции конкретного гена в замыкающих клетках. Для дополнительного исследования применения промотора СС1 (8ЕО ΙΌ NО: 10) авторы изобретения использовали антисмысловой подход для анализа уменьшения экспрессии гена в замыкающих клетках. Для этой цели, трансгенную линию 358::СЕР со стабильной экспрессией СЕР как в замыкающих клетках, так и в эпидермальных клетках, см. фиг. 20А, В, трансформировали конструкцией рСС1(О1)::анти-СЕР (анти-СЕР, слитым с укороченным промотором СС1 рСС1(Э1)). 34 из 40 растений Т1 358::СЕР, трансформированных рСС1(П1)::анти-СЕР, обнаруживали значительно уменьшенную экспрессию СЕР в замыкающих клетках, тогда как уровень экспрессии СЕР в эпидермальных клетках был неизмененным, как иллюстрировано на фиг. 20С, Ό.
В целом, фиг. 20 иллюстрирует микрофотографии вызываемого рСС1(О1)::анти-СЕР уменьшения экспрессии СЕР в замыкающих клетках растений 358::СЕР:
Фиг. 20А иллюстрирует эпидермис листа трансгенного растения 358::СЕР (яркое поле зрения с СЕР-фильтром). Стрелки отмечают устьица.
Фиг. 20В иллюстрирует изображение флуоресценции того же эпидермиса листа, показанного на фиг. 20А. Устьица отмечены более светлыми (желтыми) стрелками. Обратите внимание на то, чтообе замыкающие клетки и окружающие их клетки эпидермиса являются флуоресцентными.
Фиг. 20С иллстрирует эпидермис листа трансгенного растения Т1, экспрессирующего рСС1(О1)::анти-СЕР в генетическом фоне 358::СЕР. Все устьица отмечены более светлыми (оранжевыми) стрелками.
- 44 019514
Фиг. 20Ό иллюстрирует изображение флуоресценции того же эпидермиса листа, показанного на фиг. 20С. Обратите внимание на то, что 7 (отмеченные относительно более темными (синими) стрелками) из 8 устьиц обнаруживали уменьшенную экспрессию СЕР в сравнении с окружающими эпидермальными клетками. Одна пара замыкающих клеток (отмеченных более светлой (оранжевой) стрелкой) все еще проявляла умеренную экспрессию СЕР. Это устьице было относительно незрелым в сравнении с остальными 7 устьицами.
Эти наблюдения демонстрируют значительную эффективность антисмысловой репрессии с использованием последовательности этого изобретения рСС1(О1) (ЗЕф ΙΌ ИО:10). Интересно, что меньшую супрессию экспрессии СЕР наблюдали в незрелых замыкающих клетках (см. более светлую (оранжевую) стрелку на фиг. 20Ό, в сравнении с относительно более темными (синими) стрелками). Это согласуется с наблюдением, что рСС1 запускает меньшую экспрессию репортерного гена в незрелых замыкающих клетках, см., например, фигуру 17С, обсуждаемую выше. Этот эксперимент демонстрирует, что антисмысловой подход с использованием последовательностей этого изобретения может быть использован для уменьшения экспрессии выбранных генов в замыкающих клетках без влияния на их экспрессию в других типах клеток.
Обсуждение
Настоящее изобретение впервые идентифицирует сильный промотор замыкающих клеток АтаЫйор818, рСС1 (ЗЕф ΙΌ ИО:10). Анализы слияния промотор::репортер показали, что рСС1 (ЗЕф ΙΌ ИО:10) имеет сильную экспрессию специфического репортерного гена замыкающих клеток, например, в растениях АтаЬ1йорк1к дикого типа и мутанте развития замыкающих клеток, 1оо тапу тоШйк [32], а также растениях табака. Последовательные делеции промотора СС1 (ЗЕф ΙΌ ИО:10) определили районы для экспрессии в замыкающих клетках. Кальций-визуализация в замыкающих клетках в интактных растениях была сделана возможной посредством объединения промотора СС1 (ЗЕф ΙΌ ИО:10) и репортера кальция нового поколения, УС3.60 [31]. Промотор СС1 (ЗЕф ΙΌ ИО:10) этого изобретения был также сильным для нокдауна (понижения) экспрессии конкретного гена в замыкающих клетках с использованием антисмыслового подхода.
Сравнение между промотором СС1 и другими известными промоторами замыкающих клеток
В качестве центрального регулятора транспирации воды и поглощения СО2 замыкающие клетки были развиты в виде интегративной (составной) модельной системы для исследования взаимодействия между активностями ионного канала/транспортера, светом, гормонами растений, вторичными мессенджерами, цитоскелетом и мембранной направленной миграцией в регуляции физиологического результата: устьичной щели [2, 4, 5, 47, 48]. Сообщались несколько промоторов замыкающих клеток. Промотор КАТ1 (А!5д46240) обеспечивал экспрессию специфического репортера в замыкающих клетках, даже хотя он иногда индуцировал экспрессию репортера в других клетках и тканях, таких как корни и соцветия [25]. А1МУВ60 (А(1д08810) также проявлял специфическую экспрессию в замыкающих клетках на основе исследования слияний промотр::СИЗ и промотор::СЕР [49]. Было также показано, что А1МУВ61 (А!1д09540) экспрессировался в основном в замыкающих клетках [50].
На основе данных специфических для замыкающих клеток микроматриц авторы этого изобретения определили приближенно средние уровни транскрипции на фигуре 15, обсуждаемой выше. Сигнал экспрессии гена А1МУВ61 был самым низким среди этих генов. В случае КАТ1, его экспрессия в специфических для замыкающих клеток была гораздо более высокой, чем экспрессия в мезофильных клетках. Но его исходный сигнал был приблизительно в 5-10 раз более низким, чем сигнал СС1. А1МУВ60 также обнаруживал высоко специфическую для замыкающих клеток экспрессию в сравнении с его экспрессией в мезофильных клетках. Однако, этот исходный сигнал А1МУВ60 составлял только приблизительно одну треть сигнала промотора СС1 этого изобретения (ЗЕф ΙΌ ИО:10). Кроме того, А1МУВ60 также в высокой степени экспрессируется в семенах на основе анализов микроматриц СЕNЕУЕЗТIСΑТОΒ™ [27, 29, 51-54]. Подобным образом, ВАВ 18 (А!5д66400) также высоко экспрессируется в семенах, наряду с экспрессией в замыкающих клетках. рСС1 запускал очень сильную и специфическую экспрессию репортерного гена в замыкающих клетках (экспрессия была очень низкой в тканях/органах, не являющихся листьями), хотя экспрессию репортерного гена наблюдали в эпидермальных клетках в некоторых растениях, трансформированных рСС1::УС3.60. В целом, промотор СС1 является очень сильным специфическим для замыкающих клеток промотором среди анализированных промоторов.
Спонтанные транзиторные концентрации кальция в замыкающих клетках
Исследования с интактными растениями АгаЬИорык с использованием генетически кодируемого репортера кальция УС3.60, запускаемого промотором СС1, показали, что спонтанные транзиторные концентрации кальция встречались в интактных растениях АтаЫйоркщ. Это согласуется с более ранними наблюдениями спонтанных транзиторных концентраций кальция в замыкающих клетках АтаЫйоркщ [15, 43, 44]. Однако механизмы, вызывающие спонтанные транзиторные концентрации кальция, еще не выяснены полностью. Несколько линий доказательств предполагают связь между гиперполяризацией плазматической мембраны замыкающих клетках и спонтанными транзиторными концентрациями кальция в замыкающих клетках.
В экспериментах, в которых одновременно измеряли мембранный потенциал и [Са2+]су1, гиперполя
- 45 019514 ризация вызывала АВА-индуцируемые увеличения |Са:'|су|. Поддержание замыкающих клеток в более гиперполяризованном состоянии производило спонтанные колебания [Са+]су| в замыкающих клетках в Ую1а ГаЬа [38], в субпопуляции замыкающих клеток СоттеЕпа [39] и в замыкающих клетках АгаЬ1йорк1к [43]. Анализы кальций-визуализации в интаткных растениях АгаЬ1йорк1к с использованием рСС1:УС3.60 показывают, что спонтанные транзиторные концентрации кальция происходят также и в интактных растениях.
Эти спонтанные транзиторные концентрации Са2+ могут также быть результатом интегрированной передачи сигнала множественными стимулами, сходящимися в замыкающих клетках, таких как световые условия, баланс СО2 и водный баланс. В Ую1а ГаЬа не наблюдали спонтанных транзиторных концентраций кальция в замыкающих клетках в интактных растениях [45]. В этом случае краситель Гига-2 (приблизительно 100 мкМ) инъецировали в замыкающие клетки. Высокие концентрации Гига-2 могут ингибировать спонтанные увеличения кальция, так как внесение близкого аналога Гига-2, ВАРТА, в замыкающие клетки АгаЬ1йорк1к эффективно ингибирует эти транзиторные концентрации кальция [44].
В противоположность этому, приближенно определенная концентрация белка-красителя уе11о\т сате1еоп в замыкающих клетках трансгенных растений рСС1 (8ЕЦ ΙΌ NО:10)::ΥС3.60 была равна приблизительно 1 мкМ (см. раздел Способы, обсуждаемый здесь). Эта более низкая концентрация уе11о\т сате1еоп должна меньше препятствовать гомеостазу кальция замыкающих клеток и может обеспечивать более достоверную динамику концентрации кальция. Обратите внимание на то, что низкие концентрации инъецированного красителя Гига-2 также позволяли разделять повторяющиеся транзиторные концентрации кальция в замыкающих клетках [38, 39]. Обратите внимание на то, что произведенные из ВАРТА флуоресцентные красители, такие как Гига-2 и тйо-1, имели определенные преимущества над сате1еоп, так как они могут вводиться в клетки, которые не могут быть легко трансформированы [55], и эти красители могут сообщать быстрые, с миллисекундной шкалой, транзиторные концентрации Са, которые встречаются в нейронах [56], но в настоящее время еще не сообщались для растений при использовании Гига-2 или тйо-1.
Циркадные колебания кальция на уровне листа целого растения с суточным ритмом были продемонстрированы несколькими группами исследователей с использованием экворина в качестве репортера кальция [57-59]. Наиболее вероятно, это циркадное колебание кальция приводит к синхронным изменениям в фоне цитозольного кальция в популяции клеток [60]. Поскольку это циркадное колебание кальция связано с фоном внутриклеточного кальция, быстрые спонтанные транзиторные концентрации кальция в отдельных замыкающих клетках могли бы быть отфильтрованы от циркадных измерений кальция [60]. Повторяющиеся транзиторные концентрации кальция могут отражать функции, которые включают в себя непрерывный гомеостаз между внеклеточным кальцием, цитоплазматическим кальцием и внутриклеточными запасами кальция. Спонтанные транзиторные концентрации кальция в замыкающих клетках также коррелируют с недавно предложенной гипотезой праймирования сенсора кальция в отношении специфичности кальция в передаче сигналов, в которой сигналы закрывания устьиц АВА и СО2 предложены для праймирования (деинактивации) кальций-чувствительных стадий, которые опосредуют закрывание устьиц [44, 61].
Цис-элементы (Т/А)АААС и специфическая для замыкающих клеток экспрессия
Было сделано предположение, что (Т/А)АААС, мотив связывания для факторов транскрипции цинкового пальца ОоГ, играет решающую роль для специфической для замыкающих клеток экспрессии активности промотора К8Т1 в картофеле, на основе блок-мутагенеза [24]. Однако, все предположительные районы этого промотора (1800 п.н. перед стартовым кодоном АТС) для А1АСТ7 (А!5д09810), К8Т1 (А!5§46240), КАВ18 (А!5§66400), АΐМΥВ60 (А11§08810), АΐМΥВ61 (А11§09540) и СС1 (АЩ22690) содержат одинаковое количество мотивов связывания фактора ОоГ, элементов (Т/А)АААС, даже хотя некоторые из них не обнаруживают предпочтительности в отношении экспрессии в замыкающих клетках. АίМΥВ61, который показал низкую экспрессию в замыкающих клетках (фиг. 15), содержит 29 элементов (Т/А)АААС в его предположительном промоторном районе, тогда как промотор А1АСТ7 содержит 23 элемента (Т/А)АААС. Укорочение промотора предполагает, что район от -861 п.н. до -224 п.н. в этом промоторе СС1 (8ЕЦ ΙΌ NО:10) содержит элементы для специфической для замыкающих клеток промоторной активности; см. фиг. 18, обсуждаемую выше. Этот район содержит 8 элементов (Т/А) АААС. Однако, блок-мутагенез центрального мотива ТАААС на смысловой цепи (отмеченный звездой на фиг. 18В) в этом районе не влиял на экспрессию репортера в замыкающих клетках. Таким образом, один элемент (Т/А)АААС не может объяснить, почему СС1 и другие специфические для замыкающих клеток гены не обнаруживали специфической для замыкающих клеток экспрессии.
Выводы
Анализ микроматриц (АТН1) экспрессируемых в замыкающих клетках генов использовали для выделения и характеристики нового сильного промотора в замыкающих клетках этого изобретения, рСС1 (8ЕЦ ΙΌ NО:10). Авторы изобретения анализировали потенциал рСС1 (8ЕЦ ΙΌ NО:10) в качестве инструмента для манипулирования экспрессией генов в замыкающих клетках. Промотор СС1 (8ЕЦ ΙΌ NО:10) использовали для тестирования нескольких экспериментальных манипулирований. Промотор СС1 (8ЕЦ ΙΌ NО:10) использовали для экспрессии репортера кальция ΥС3.60 в замыкающих клетках.
- 46 019514
Это позволило авторам изобретения выполнить эксперименты по визуализации кальция в замыкающих клетках интактных растений АгаЫборзхз.
Для инсерционных мутантов Т-ДНК требуется часто генерирование сотен трансформантов для получения самое большее нескольких линий, экспрессирующих репортерный ген в замыкающих клетках, при использовании промотора 358. в противоположность этому, применение промотора СС1 (8Е0 ΙΌ N0:10) этого изобретения обеспечивает способ разительного увеличения степени успеха экспрессии репортерного гена. Кроме того, специфическая для замыкающих клеток антисмысловая экспрессия СРР с использованием промотора СС1 эффективно обеспечивала сайленсинг экспрессии СРР в замыкающих клетках трансгенных 358::СРР-растений.
Эти данные и высокая эффективность трансформации вместе демонстрируют, что промоторы этого изобретения, в том числе промотор СС1 (8Е0 ΙΌ N0:10) этого изобретения, обеспечивают мощный инструмент для манипулирования экспрессией компонентов передачи сигналов в замыкающих клетках и для экспрессии репортеров различных вторичных мессенджеров. Таким образом, промоторы этого изобретения, в том числе промотор СС1 (8Е0 ΙΌ N0:10) этого изобретения, обеспечивают композиции и способы для селективного усиления экспрессии в замыкающих клетках, для мониторинга событий передачи сигналов в замыкающих клетках в ответ на различные обработки и для исследования реакций целых растений в специфических для замыкающих клеток трансгенных мутантах.
Материалы и методы Растительный материал
Растения АгаЬ1борз1з !Ьайапа (экотипа Со1итЬ1а) использовали для экспериментов по трансформации, если нет других указаний. Трансгенную линию 358::СРР генерировали для предварительного исследования [62]. Мутант, связанный с развитием замыкающих клеток, названный !оо тапу тоШНз, был любезным подарком доктора Фреда Зака из Ишуегзйу о1 ВпЦзЫ Со1итЬ1а, Уапсоиуег.
Эксперименты с использованием микроматриц генных чипов
Выращивание растений, обработку абсцизовой кислотой (АВА), выделение протопластов замыкающих клеток и экстракцию РНК выполняли, как описано ранее [26]. Использовали матрицы генома АгаЫборзхз АТН1 Лίίутеι^^x (Лίίутеι^^x. 8ап!а С1ага, СА), представляющие приблизительно 24000 генов. Транскрипты амплифицировали, метили и гибридизовали в !1е ишуегзйу о1 СаНотша, 8ап Э1едо Сепе СЫр Соге Еасййу. Для каждого условия (с обработкой или без обработки АВА, замыкающей клетки или мезофильной клетки) выполняли две независимые гибридизации. Ингибиторы транскрипции (33 мг/л актиномицина Ό и 100 мг/л кордицепина) добавляли во время выделения протопластов для проб РНК для четырех гибридизаций на чипе, как описано [26]. Данные микроматриц АТН1 депонировали в М^ЛМЕXРВЕ88™ [63] с номером доступа Е-МЕХР-1443.
Конструирование рекомбинантных плазмид
Для амплификации промотора СС1 (А!1д22690) из геномной ДНК Со1 (Со1итЬ1а) при помощи ПЦР использовали праймеры ΥΖ27 (5'-САТСССАТССа!йс!!дад!ад1да!!йдаад-3', непосредственно справа перед стартовым кодоном АТС с сайтом №оЦ и ΥΖ28 (5'-АССССТССАСдад1ааада!!сад!аасссд-3', 1693 п.н. справа от стартового кодона транскрипции (фиг. 16) с сайтом 8аН). Продукт ПЦР клонировали в вектор рСЕМ-Теазу ([пуйгодеп, Саг1зЬаб, СА) с получением рСЕМ-Т-рСС1.
Для клонирования промотора СС1 в вектор рВП01, рСЕМ-Т-рСС1 сначала разрезали Исо! Затем липкий конец достраивали с использованием ДНК-полимеразы Т4 (№\ν Епд1апб ВюЬаЬз) с получением тупого конца. Затем фрагмент рСС1 высвобождали расщеплением при помощи 8а1Е Между тем, заданный вектор, рВН01 разрезали последовательно с использованием 8таI и 8а1Е Затем рСС1-фрагмент инсертировали справа от репортерного гена СИ8 в векторе рВН01 с получением конструкции рВН01рСС1::СИ8 (укпрощенно называемой рСС1::СИ8).
Для создания серии 5'-делеций промотора рСС1 использовали праймер ΥΖ27 с праймерами ΥΖ159 (5'-СССТССАСа!ддйдсаасадададда!да-3', 1141 п.н. справа от старта транскрипции, Ό1), ΥΖ160 (5'СССТССАСс1аа!дааддд1дссдсйайд-3', 861 п.н. справа от старта транскрипции, Ό2), ΥΖ161 (5'-СССТСС АСсаа1айдсд!с!дсдй!сс!-3', 466 п.н. справа от старта транскрипции, Ό3) и ΥΖ162 (5'- СССТССАСдаассаа!саааас!дй!дса!а-3', 224 п.н. справа от старта транскрипции, Ό4), соответственно, для геномной ПЦР для амплификации рСС1(Э1), рСС1(Э2), рСС1(Э3) и рСС1(Э4), соответственно (фиг. 4). Затем эти фрагменты ПЦР клонировали в вектор рСЕМ-Т-еазу и затем субклонировали в вектор рВН01 с получением рВН01-рСС1(П1)::Си8, рВН01-рСС1(П2)::Си8, рВН01-рСС1(П3)::Си8 и рВН01-рСС1(П4)::Си8.
Для создания конструкции рВН01-рСС1^С3.60, ΥС3.60 сначала высвобождали из ркДНК3ΥС3.60 [31] двойным расщеплением ЕсоШ/ВатНЕ Затем !Ые ВатНI-5'-ΥС5.60-3'-ЕсоВI-фрагмент клонировали в вектор р8К (полученный расщеплением ЕсоВI и ВатШ) с получением конструкции р8КΥС3.60. Затем р8К-УС3.60 расщепляли и NсоI с получением фрагмента NоΐI-5'-рСС7-3'-NсоI из рСЕМ-Т-рСС1. Это лигирование приводило к р8К-рСС1::ΥС3.60. Этот фрагмент рСС1::ΥС3.60 высвобождали двойным расщеплением 8ι1Ι/8ι^, между тем вектор рВН01 расщепляли 8ι1Ι/8ι^ для удаления репортерного гена СИ8. рВ^^аЛ/ЗасТ) лигировали с 8а1I-5'-рСС1::ΥС3.60-3'-8асI с получением конструкции рВI101-рСС1::ΥС3.60.
Для создания бинарного вектора рСтеепЛ 0179-рСС1(Э1)::анти-СРР с селективным в отношении
- 47 019514 гигромицина маркером в растении терминатор 358 амплифицировали с праймерами ΥΖ439 (5'ААСАСАТСТАТСТАСАСТССССАА-3', с ХЬа1) и ΥΖ440 (5'-ССАСССТССАССТСд!сас!дда!Шддййадд3', с сайтом 8ас1) из вектора рАУА319 [64]. Затем продукт ПЦР последовательно расщепляли ХЬа1 и 8ас1. Тйе 5'-ХЬа1-терминатор 358-8ас1-3' лигировали в рСгееи110179-ХЬа1...8ас1 с получением рСгееиН 0179-терминатор. Тйе рСС1(Э1) высвобождали из рСЕМ-Т-рСС1(Э1) расщеплением ЫоИ, затем достраивали, затем разрезали 8а11 с получением 5'-8а11-рСС1(Э1)-№1Е1 (достроенный тупой конец). Между тем, рСтееиП 0179-терминатор расщепляли двойным расщеплением с использованием 8а11 и ЕсоВУ. Эти два фрагмента лигировали с получением вектора рСтееиЛ 0179-рССР(Э1)-терминатор. Антисмысловой СЕР амплифицировали с праймерами ΥΖ449 (5'-АСАТСССАТССПас11д1асадс1сд1сса1дсс-3'. обращенный конец СЕР с Ысо1) и ΥΖ513 (5'-с!адТСТАСАа!дд!дадсаадддсдадд-3', старт СЕР с ХЬа1). Этот фрагмент ПЦР расщепляли двойным расщеплением Ысо1 и ХЬа1. рСгееиИ0179-рСС1 (Э1)-Терминатор расщепляли двойным расщеплением Ысо1 и ХЬа1. Этот фрагмент рСгееи110179-рСС1(П1)-Терминатор лигировали с 5'Ысо1-анти-СЕР-ХЬа1-3' с получением бинарной конструкции рС^ееηII0179-рСС1(^1)::анти-СЕР.
Центральный мотив ТАААС (-579^ -575) на смысловой цепи изменяли на ССССА блокмутагенезом с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза РШСКСНАЫСЕ™ из 81га1адеие (Ьа 1о11а, СайГотша).
Трансформация и отбор АгаЫбормз
Бинарные конструкции, рВ1101-рСС1:УС3.60, рВ1101-рСС1::СИ8, рВ1101-рССКП1)::СИ8, рВ1101рСС1(Э2)::Си8, рВ1101-рСС1(Э3)::Си8 и рВ1101-рСС1(Э4)::Си8 трансформировали в штамм АдгоЬас!етшт ШтеГааеик СУ3101 электропорацией. Трансформанты отбирали на ЬВ-чашках как с канамицином (селективным маркером для этой конструкции), так и с гентамицином (селективным маркером для АдгоЬас!етшт). Затем растения АгаЫборкЬ трансформировали АдтоЬас!етшт СУ3101, несущим соответствующие конструкции в соответствии со способом погружения, описанным С1оидй аиб Веи! [65]. Семена Т0 отбирали на чашках с '/2 М8 с 50 мкг/мл канамицина.
В случае рС^ееηII0179-рСС1(^1):: анти-СЕР, СУ3101 с хелперной плазмидой р8ОИР использовали в качестве штамма-хозяина, и отбор на трансформанты.
АдтоЬас!етшт проводили на ЬВ-чашках с канамицином, гентамицином и тетрациклином. Это использовали для трансформации 358::СЕР-трансгенных растений (устойчивых к канамицину). Семена Т0 отбирали на чашках с '/2 М8 с 25 мкг/мл гигромицина (Восйе).
Окрашивание с использованием С-Ц8
Проростки окрашивали согласно ранее описанному протоколу [62].
Получение изображений эпи-флуоресценции
Трансгенные проростки или чашелистики АтаЫборык рВ1101-рСС1::УС3.60 просто помещали между предметным стеклом и покровным стеклом для микроскопа. К микроскопу подсоединяли цифровую камеру ΝΣΚΘΝ™. Время экспозиции для яркого изображения равно 5 и 15-25 с для изображения флуоресценции (длина волны возбуждения равна 440 нм). Для растений 358::СЕР и растений 358::СЕР, трансформированных рСВЕЕ№1™0179-рСС1(П1)::анти-СЕР, для получения изображения флуоресценции использовали эпидермис интактных листьев.
Трансформация растений табака
Стерильные культуры побегов ш уйго Мсойаиа !аЬасиш су. 8В1 поддерживали на '/2 М8-агаровой среде, содержащей 15 г/л сахарозы. рН доводили до 5,5 перед автоклавированием. Культуру табака выращивали при 25°С, с циклом свет/темнота 16/8 ч (интенсивность света была приблизительно 70 мкмоль-м-2 с-1). Стабильную трансформацию МсоРаиа !аЬасит 8В1 рВ1101-рСС1-УС3.60 выполняли, как описано ранее [66]. Трансгенные регенерированные побеги табака отбирали по устойчивости к канамицину (100 мкг/мл) и затем переносили на '/2 М8-агаровую среду, содержащую 15 г/л сахарозы, дополненную канамицином (100 мкг/мл) и цефотаксимом (200 мкг/мл). Регенерированные растения Т1, которые были способны устанавливать органогенез корней в присутствии канамицина, анализировали затем на экспрессию сате1еои.
Конфокальный анализ трансгенного табака
Листья табака растения, трансформированного рВ1101-рСС1-УС3.60, наблюдали под лазерным конфокальным микроскопом Ьеюа ТС8 8Р2™ (Ьека М1стокук!етк). Для детектирования сате1еои длина волны возбуждения была равна 514 нм и длина волны испускания находилась между 525 и 540 нм. Изображения, полученные с использованием конфокального микроскопа, обрабатывали с использованием 1МАСЕ I™ [67].
Кальций-визуализация и наложенные транзиторные концентрации Са2+
Всю кальций-визуализацию в этой работе выполняли с использованием инвертированного микроскопа ТЕ300™ с использованием присоединения ТЕ-ЕМ™ эпи-флуоресценции (№кои 1ис. Ме1уб1е, ΝΥ). Возбуждение при помощи ксеноновой лампы 75 Вт (Окгат, Сегтаиу) всегда ослабляли на 97% с использованием фильтров как с 4-х-, так и с 8-нейтральной плотностью (3% пропускание) для уменьшения обесцвечивания репортеров во время разделенной во времени визуализации. Получали специфичность в отношении длины волны с набором сате1еои-фильтров (440/20 возбуждение, 485/40 испускание, 535/30
- 48 019514 возбуждение 2, 455ОСЬР™ дихроическое; набор фильтров 71007а™ Сйгота Тесйпо1оду, Восктдйат, УТ). Круг фильтров, прерыватель и камера СООЕ8НАР™ ССЭ из РйоЮтепсз (Ворег 8с1епйГ1с, Сегтапу) регулировались программным обеспечением МЕТАЕЬиОВ™ (МО8, 1пс., ТогоШо, Сапаба).
Эпидермисы интактных листьев трансгенных растений рСС1::УС3.60 готовили для микроскопии, как описано Мой е1 а1. (2006)[11]. На микроскопе, интактный эпидермис перфузировали буфером деполяризации (10 мМ МЕ8-Трис-буфер, рН 6,1, содержащий 25 мМ дикалий-иминодиацетат и 100 мкМ 100 рМ ВАРТА) в течение 10 мин для получения фона. Затем наносили буфер деполяризации, содержащий Са2+ (10 мМ МЕ8-Трис-буфер, рН 6,1, 1 мМ дикалий-иминодиацетат и 1 мМ СаС12) с 2-минутными интервалами с последующими 5 мин деполяризирующего буфера.
Кальций-визуализация в замыкающих клетках интактных растений
В этом исследовании использовали как интактные листья, так и интактные растения. Для прикрепления листьев к покровным стеклам для микроскопа использовали медицинский клей (Но1йз1ет 1пс., Ь1ЬейууШе, 1Ь). Кисть для красок использовали для осторожного прижимания листа к покровному стеклу. В случае интактных растений использовали два различных способа. Первым способом было погружение только корня в воду, тогда как побег оставляли в воздухе. Вторым способом было полное погружение проростков в воду. Иногда погружение в воду только корня, но не побега вызывало увядание прикрепленного к покровному стеклу листа за менее чем 10 мин с последующим закрыванием устьиц. Таким образом, большинство экспериментов с визуализацией интактных растений проводили с погружением как побега (листьев), так и корня в воду. Погружение целого растения предотвращало высыхание листа, и закрывание устьиц не наблюдали в течение более 50 мин. Этот протокол визуализации был таким же, что и протокол, описанный в Мой е1 а1., 2006 [Н].
Оценивание концентрации белка уе11оте сате1еоп в замыкающих клетках
Рекомбинантный белок уейоте сате1еоп выделяли после экспрессии в Е. сой. Затем рекомбинантный белок сате1еоп добавляли при определенных концентрациях на покровное стекло для флуоресцентной визуализации. Затем использовали два дополнительных покровных стекла для создания наклонного градиента толщины раствора сате1еоп. Это позволяло анализировать различные величины толщины в диапазоне толщины устьичных замыкающих клеток. Разведенные растворы белка уе11о\т сате1еоп при различных концентрациях анализировали и интенсивность флуоресценции измеряли для каждой концентрации при различной толщине. Получали калибровочные кривые для концентраций белка и интенсивностей флуоресценции при различной толщине. Их использовали для определения концентрации белка уе11о\т сате1еоп в замыкающих клетках трансгенных растений рОС1::УС3.6.
Ссылки
1. МасВоЬЫе ЕАС: 81дпа1 йапзбисйоп апб юп сйаппе1з ΐπ диагб се11з. РЫ1 Тгапз Воу 8ос Ьопбоп 1998, 1374:1475-1488.
2. НеЫеппдЮп А.М., №ооб\\'агб Ε.Ι.: Тйе го1е оГ з1ота1а т зепзшд апб бйутд епуйоптеп1а1 сйапде. Уинге 2003, 21:901-908.
3. Аззтапп 8.М., 81птаха1<1 К.: Тйе тнШзепзогу диагб се11. 81ота1а1 гезропзез Ю Ь1ие йдй1 апб аЬзшзю ас1б. Р1ап1 Рйузю1 1999, 119:809-816.
4. 8сйгоебег И., А11еп С.к, Нидоиу1еих У., Клеак ЕМ., №апег Ό.: Оиатб се11 з1дпа1 йапзбисйоп. Апп Веу Р1 Рйузю1 & Р1 Мо1 Бю1 2001, 52:627-658.
5. 8Ытахак| К., Эо1 М., Аззтапп 8.М., Ктозййа Т.: ЫдЫ геди1айоп оГ з1ота1а1 тоуетеШ. Аппи Веу Р1ап1 Бю1 2007, 58:219-247.
6. Ре1 Ζ.-М., Мига1а Υ., Вептпд С., Тйотте 8., К1изепег В., А11еп С.1, ОЙ11 Е., 8сйгоебег II.: Са1сшт сйаппе1з асйуа1еб Ьу йубгодеп регох1бе теб1а1е аЬзазю ааб з1дпа11тд т диагб се11з. Уйиге 2000, 406:731734.
7. ЬетЫг-Сййей Е., МасВоЬЫе Е.А., №еЬЬ А.А., Матзоп Ν.Ε., Вго\\т11ее С., 8керрег ΙΝ., Сйеп I., Ргез1и1сй ΟΌ, Втеайеу СА: 1позйо1 йехак1зрйозрйа1е тоЬЫхез ап епботетЬгапе зЮге оГ са1сшт ш диагб се11з. Ргос №11 Асаб 80 И8А 2003, 100:10091-10095.
8. Соигзо1 8., Еап Ь.М., Ье 81нпГГ Н., 8р1еде1 8., Сйгоу 8., Аззтапп 8.М.: 8рЫпдойр1б з1дпа11тд ш АгаЬ1борз1з диагб се11з туокез йМегсИптепс С ргоШпз. №1иге 2003, 423:651-654.
9. №еЬЬ А.А., Ьагтап М.С., МоШдотегу Ь.Т., Тау1ог !Е., Не1йейпд1оп А.М.: Тйе го1е оГ са1сшт т АВА-тбисеб депе ехргеззюп апб з1ота1а1 тоуетеШз. Р1ап1 ί 2001, 26:351-362.
10. Ν§ С., Сагг К., МсАтзй М., Ро\ее11 В., Не1йейпд1оп А.: ОгоидЫ-тбисеб диагб се11 з1дпа1 йапзбисЙоп туокез зрйтдозте-1-рйозрйа1е. Уинге 2001,410:596-599.
11. Мой 1.С., Мигай Υ., ΥηΓίρ Υ., Мипетаза 8., №апд Υ.Ε., Апбгеой 8., Ттас Н., А1опзо ЕМ., Нагрег ЕЕ., Ескег ЕВ. е1 а1 СЭРКз СРК6 апб СРК3 Гипсйоп т АВА геди1айоп оГ диагб се11 8-1уре апюп- апб Са2+ регтеаЬ1е сйаппе1з апб з!ота1а1 с1озиге. РЬо8 Вю1 2006, 4:1749-1762.
12. М1уатак1 А., СйезЬеск О., Нет В., Тз1еп В.У.: Рупатк апб диапШайуе Са2+ теазигетеЫз изтд тргоуеб сате1еопз. Ргос Уи1 Асаб 8с1 И8А 1999, 96:2135-2140.
13. Ве1оизоу №., Егабкоу А.Е., Ьикуапоу К.А., 81агоуегоу ЭВ, 8йакйЬахоу К8, Тегзк1кй АУ, Ьикуапоу 8: Сепейсайу епсобеб йиотезсеЫ тбюаЫт Гог 1п1тасе11и1аг йубгодеп регох1бе. ΝηΙ МеЫобз 2006, 3:281-286.
- 49 019514
14. Кп1дН1 Μ.Κ., СатρЬе11 Α.Κ., 8т!к 8.Μ., ΤΐΌ\ν;·ιν;·ΐδ Α.Ε: Тгащдешс р1ап( аес.|1юпп ΐΌροΠδ 1ке ейес18 οΓ ЮисН апй сο1й-δ1юск апй е11С1Ю^ οп сукр^тк са1сшт. Ыа!иге 1991, 8:524-526.
15. Α1Κη 6.Е, Ктеак ΙΜ., Ски 8.Р., Ηορίδ I., Т81сп Κ.Υ., На1рег Р.Е, 8скгоейег Ι.Ι.: Сате^п са1сшт тйкакг ΐΌροΠδ суГОрк-^тк са1сшт йуπат^сδ т ΑηΝάορδίδ диагй се1К Р1ап1 кигпа1 1999Ь, 19:735-738.
16. 6йгоу 8., Ргккег Μ.Ό., Реай Ν.Ό., Τ^етеаνаδ Α.Ε: ΚοΚ οΓ сакшт ш δ^дπа1 1гап8йис1кп οΓ Соттекпа диагй се1К Р1ап! Се11 1991, 3:333-344.
17. Α1Κη 6.Е, КисЫки К., Ски 8.Р., Мига1а Υ., 8скгоейег кк: ΑιηΜάορδίδ аЬ11-1 апй аЬ12-1 ρΡοδρкаίаδе ιηιιΐηΐίοηδ гейисе ак^к ас1й-тйисей сукр^тк са1сшт п8С8 т диагй се1Щ. Р1ап1 Се11 1999а, 11:1780-1798.
18. ΜсΑ^ηδк Μ.Κ., Вго\уп1ее С., НекеппдГОп Α.Μ.: ΑΕδάδκ аай-шйисей екуа!кп οΓ диагй се11 су!οδο1к Са2+ ргсссйс8 δΐοтаίа1 с1οδи^е. Ыа!иге 1990, 343:186-188.
19. 8скгаейег кк, Над1теага 8.: Κеρеί^ί^νе ^пс^еаδеδ т ^1οδο1χ Са2+ οΓ диагй се1Щ Ьу ак^к ас1й асйνηΐίοη οΓ ^п^екс^е Са2+-регтеаЬ1е скаппек Ргас Νη11 Αсай 8с1 υ8Α 1990, 87:9305-9309.
20. Вепкеу Р.К, Реп Ь., Скиа Ν.Η.: Тке СаΜV 358 епкапсег ^ηΐηίηδ а! 1еаδΐ Ινο ^тат теккк сап ^πίεΓ й1ГГегеп( йеνе1ορтепίа1 апй ^ие^ресШс еxρ^еδδ^οπ раОепъ. ЕΜΒО 1 1989, 8:2195-2202.
21. Ктеак Ι.Μ., ΜισηΟ-ι Υ., Βа^ζаЬа1-Αди^^^е ν.Μ., Μе^^^11 1., Уапд 1., Кетрег Α., Натеке Ό., Та11тап 6., 8скгаейег кк: Όοι^· педакуе диагй се11 К+ скаппе1 ткапк гейисе ттеагй гесйГушд К+ сиггепк апй НдкЬшйисей δΐοтаΐа1 ορеπ^πд т Α^аЬ^йορδ^δ. Р1ап! Ρкуδ^ο1 2001, 127:1-13.
22. кк1йа Α.Μ., Ре1 Ζ-Μ, Βа^ζаЬа1-Αди^^^е V., Тигпег К.к, 8скгаейег кк: Еxρ^еδδ^οη οΓ а Сδ+ ΐΌδίδΙηηΙ диагй се11 К+ скаппе1 тонГе^ Сδ+-^еδ^δ!аπ! кдк!-тйисей δΐοтаΐа1 ορеπ^πд т ГОтдешс Α^аЬ^йορδ^δ. Р1ап! Се11 1997, 9:1843-1857.
23. Ы 1., Уап! X., Уа!δοπ Μ.Β., Αδδтаππ 8.Μ.: Κеди1а!^οπ οΓ а^сКс ас1й-тйисей δΐοтаίа1 с1οδи^е апй апкп скаппек Ьу диагй се11 ΑΑΡΚ ките. 8скпсе 2000, 287:300-303.
24. Р1с8с11 6., Екгкагй! Т., Μие11е^-ΚοеЬе^ В.: Iпνο1νетепΐ οΓ ΤΑΑΑ6 е1етепк δиддеδΐδ а га1е Γοτ ΌοΓ Ιηηδ^ίρΙίοη Гаскга т диагй сек^ресШс депе еxρ^еδδ^οπ. Р1ап! 1 2001, 28:455-464.
25. Ыакатига Κ.Κ, ΜсΚепй^ее У.Ь., Нтск кЕ., 8ейЬ^οοк кС., 6аЬег Κ.Ρ., 8иδδтап Μ.Κ.: Еxρ^еδδ^οπ οΓ ап Α^аЬ^йορδ^δ ροϊηδδίιιιη скаппе1 депе ίπ диагй се1Щ. Р1ап! Ρкуδ^ο1 1995, 109:371-374.
26. ^еοπка^й! Ν., Ктеак Ι.Μ., Κο^ή Ν., Уапег Ό., ^еοπка^й! Ν., 8скгоейег кк: ΜιοΌβιτΗγ еxρ^еδδ^οπ аπа1уδеδ οΓ Α^аЬ^йορδ^δ диагй се1Щ апй ίδοΕιΙίοη οΓ а ^есеδδ^νе ΑΒΑ курегееглкке РР2С ти!ап!. Р1ап! Се11 2004, 16:596-615.
27. Α^аЬ^йορδ^δ 1какапа ткгоаггау йа1аЬа8е апй ππη/νδίδ Ιοο1Εο.χ.
28. У^дοйа Ν., Веп-Νίδδηη 6., ΟηηοΙ Ό., 8ск\хаг1х Α., \Ус188 Ό.: Тке дЬЬегеШп-тйисей, сухЮте-пск рго1ет 6ЛР2 кгот Ре!иша куЬпйа ехкЫк ίπ р1ап!а ап!кх1йап! асОхку Р1ап! 12006, 48:796-805.
29. Ζίιηιικπηηηη Р., Η^^δск-ΗοΓΓтаππ Μ., Нептд Ь., 6^и^δδет У.: 6ЕNЕVЕ8ΤI6ΑΤОΚ. Α^аЬ^йορδ^δ ткгоаггау йа!аЬа8е апй аπа1уδ^δ Ιοο1Εο.χ. Р1ап! Ρкуδ^ο1 2004, 136:2621-2632.
30. К1кап 1., Ук!екеай Ό., ^гак 1., Уапке Ό., \Ует1 8., Ва^бс О., ^'Απде1ο С., ΒοтЬе^д-Βаие^ Е., Кий1а 1., Найег К.: Тке Α!6еπЕxρ^еδδ дкЬа1 81гс88 еxρ^еδδ^οη йа!а δеΐ: ρΐΌΐο^1δ, еνа1иаί^οπ апй тοйе1 йа!а πιπ-ιΕ-δίδ οΓ υν-Β 11дк1, йгаидк! апй то1й 81гс88 ΐΌδροι^δ. Р1ап! 1 2007, 50:347-363.
31. Ыада1 Т., Υатайа 8., ^т^да Т., [сккатеа Μ., ΜίνηνηΚί Α.: Ехрапйей йупатк гапде οΓ ΠιιοϊΌδсеп! тйкакга кэг Са2+ Ьу скси1аг1у регти!ей уе1кте Γ1иο^еδсеπ! ρτοΚίπδ. Ргас Νη11 Αсай 8с1 υ8Α 2004, 101:10554-10559.
32. Υηη§ Μ., 8аск Ρ.Ό.: Тке !οο тапу ιηοιιΐΐΐδ апй Γοιιγ 1ίρδ тикЕк^ аПсс! δΐοтаίа1 ргойис1кп ίπ ΑηΜ^ρδίδ. Р1ап! Се11 1995, 7:2227-2239.
33. Не1кегтдкп Α.Μ., Β^οтеπ1ее С.: Тке депега1кп οΓ Са2+ δ^дπа1δ ίπ ρ1ηηΙδ. Αηηυ ^ν Р1ап! Βίο1 2004, 55:401-427.
34. Екгкагй! ЭЛУ., Уп18 Κ., Εοη§ 8.Κ.: Са1сшт δρίΚίηβ ίπ р1ап! τοοΐ ΗηίΓδ [ΐδροι^ι^ ίο ΚΜζοΜπι гюйи1а1кп δ^дπа1δ. Се11 1996, 85:673-681.
35. Р^^п Е.8., Μί1ΕΓ Ό.Ό., Са11акат Ό.Α., узп Αкеπ 1., Наске!! 6., Нер1ег Р.К.: Τ^ρ-1οса1^ζей са1сшт еп!гу ПисШа^ йигтд ρο1Κπ !иЬе дготе!к. Бсу Βίο1 1996, 174:160-173.
36. Μ^уатеак^ Α., Ηορίδ 1., Нет Κ., ΜсСаПΓе^ν Ι.Μ., Αйатδ Ι.Μ., Бсига Ι.Α., Т81сп Μ.: Итог^се·! ίπйкакга Γογ Са2+ к^ей οπ дгееп Γ1иο^еδсеπ! ρτοΚίπδ апй са1тοйи1^π. Ыа!иге 1997, 388:882-887.
37. Α1Κπ 6.Е, Ски 8.Р., 8скитаскег К., 81шшиак| С.Т., VаПеайοδ Ό., Кетрег Α., Натеке 8.Ό., Та11тап 6., Т81сп Κ.Υ., Нагрег ЕР. е! а1.: Α1!е^аί^οπ οΓ δ!^ти1иδ-δρес^П^с диагй се11 са1сшт οδ^^ΐίο^ апй δ!οта!а1 с1οδ^πд ίπ Α^аЬ^йορδ^δ йе!3 ти!ап!. 8скпсе 2000, 289:2338-2342.
38. ΟηΕον Α., Β1ηΙΙ Μ.Κ.: ΜетЬ^аπе νοкаде ^η^ί^аίеδ Са2+ теаνеδ апй ρο^πώ^ Са2+ ^πс^еаδеδ текк аЬ8с181с ас1й ίπ δ!οтаίа1 диагй сеП-δ. Ргос Ыа!1 Αсай 8с1 υ8Α 1998, 95:4778-4783.
39. 8!ахеп Ι., Рка1 С., Μοπ!дοте^ν Ь.Т., 6гау ЕЕ., НеШегшдкп Α.Μ., ΜсΑ^πδк ΜΚ: ΑЬδС^δ^с ас1й ίπйисс8 οδ^^ΐίο^ ίπ диагй-се11 су!οδο1^с Рее са1сшт !ка! клюке ρкοδρкο^ποδ^ί^йе-δρес^П1с ρкοδρкο1^ρаδе С. Ргос Ыа!1 Αсай 8с1 υ8Α 1999, 96:1779-1784.
40. Α11ηη Α,Ο., Ркскег Μ.Ό., \Уагй ЕЬ., Βеа1е ΜΚ, Τ^етеаνаδ Α.Ε: Т\\ю !^аπδйисί^οπ ρаίктеауδ тей1а!е гар1й ейсс^ οΓ ηΕδαδχ ас1й ίπ Соттекпа диагй сс118. Р1ап! Се11 1994, 6:1319-1328.
41. Ιτνί^ Н.К, 6екг1пд 6Α., Ρа^^δк ^.У.: Скаπдеδ ίπ су!οδο1^с рН апй са1сшт οΓ диагй сеП-δ ргесейе
- 50 019514 к(ота(а1 тоνетейк. Ргос №1(1 АсаВ 8с1 И8А 1992, 89:1790-1794.
42. Майеп Н., КопгаВ К.В., О1е1г1сВ Р., ВоеГкета М.В., НеВйсВ В.: Са2+-ВерепВей апВ -тВерепВей аЫкскк ас1В асВуаВоп оГ р1акта тетЫгапе ашоп сВаппе1к ш диагВ се11к оГ №соиапа (аЫасит. Р1ап( РВукю1 2007, 143:28-37.
43. К1икепег В., Υоипд ί., Мига(а Υ., А11еп С., Мой I., Нидоихких У., 8сВгоеВег II.: Сопуегдепсе оГ са1сшт к1дпа1тд ра(В\\аук оГ раНодешс ейсйогк апВ АВА т АгаЫ1Ворк1к диагВ се11к. Р1ап( РВукю1 2002, 130:2152-2163.
44. Υоипд II, МеВ(а 8., 1кгае1ккоп М., СоВокк1 1., СЙ11 Е., 8сВгоеВег II.: СО2 к1дпа1шд ш диагВ се11к: са1сшт кеηк^(^ν^(у гекропке тоВи1аВоп, а Са2+-тВерепВей рВаке, апВ СО2 пъепкйпйу оГ (Ве дса2 ти(ап(. Ргос №Й АсаВ 8с1 И8А 2006, 103:7506-7511.
45. ЙехсВепко У., КопгаВ К.В., О1е1г1сВ Р., Вое1Гкета М.В., НеВпсВ В.: СуЮкоНс аЫксыс ас1В асВхйек диагВ се11 ашоп сВаппе1к \хВВой ргесеВшд Са2+ к1дпа1к. Ргос Ха(1 АсаВ 8с1 И8А 2005, 102:4203-4208.
46. А11еп С.1, СВи 8.Р., Натпд1оп С.Ь., 8сВитасВег К., НоГГтапп Т., Тапд Υ.Υ., СгШ Е., 8сВгоеВег И.: А ВейпеВ гапде оГ диагВ се11 са1сшт оксШайоп рагатекгк епсоВек к(ота(а1 тоνетейк. №1(иге 2001, 411:1053-1057.
47. РапВеу 8., 2Вапд А., Акктапп 8.М.: Во1ек оГ юп сВаппе1к апВ (гапкрог(егк т диагВ се11 к1дпа1 (гапкВисВоп. ЕЕВ8 Ьей 2007, 581:2325-2336.
48. 8иВег Ιϋ., 81еЫеп С., Найе1 А., Е1кепасВ С., ТЫе1 С., В1ай М.В.: АЫкскк ас1В йгддегк (Ве епВосу1ок1к оГ АгаЫ1Ворк1к КАТ1 К+ сВаппе1 апВ йк гесусВпд (о 1Ве р1акта тетЫгапе. Сигг Вю1 2007, 17:1396-1402.
49. СоттеШ Е., Са1Ы1ай М., Уахаккеиг А., Сопи Ь., 8а1а Т., Упх1к(еке М., ЬеоиВагВ! К, Ре11арог(а 8Ь., ТопеШ С.: А диагВ-сеИ-кресШс МУВ йапксйрйоп Гас(ог гедл1а!ек к(ота(а1 тоνетейк апВ р1ап( ВгоидВ! (о1егапсе. Сигг Вю1 2005, 15:1196-1200.
50. Ыапд Υ.ΙΧ., РиЫок С., РоВВ 1.С., Но1гоуВ С.Н., Не(Веппд(оп А.М., СатрЫе11 М.М.: А1М¥В61, ап В2В3-М¥В ЛапксйрВоп Гас(ог сойгоШпд к(ота(а1 арейиге т АгаЫ1Ворк1к (ВаВапа. Сигг Вю1 2005, 15:12011206.
51. Еай А., Апдекук! В., Ьекк Н., ОВаВ I., игЫапсхук-АосВшак Е., Еегпк А.В., СаВВ С.: АаЫхВоркк кееВ Веνе1ортей апВ дегттайоп 1к аккос1а(еВ \хВВ (етрога11у В1кВпс1 те!аЫоВс к\\ЛсВек. Р1ап( РВукю1 2006, 142:839-854.
52. ХакаЫауакВ1 К., Окато(о М., КокВЫа Т., Кат1уа Υ., ХатЫага Е.: Сепоте-\х1Ве ргоВВпд оГ к(огеВ тВХА 1п АгаЫ1Ворк1к ЛаВапа кееВ дегт1пайоп: ер1депеВс апВ депейс гедл1аВоп оГ йапксйрйоп т кееВ. Р1ап( 1 2005, 41:697-709.
53. 8сВт1В М., Рахйоп Т.8., Ней/ 8.В., Раре ϋ.Ι, Ретаг М., Утдгоп М., 8сВо1корГ В., Ае1де1 Р., ЬоВтапп !И.: А депе ехргеккюп тар оГ АаЫхВоркк (ВаВапа Веνе1ортей. Ха! Сепе( 2005, 37:501-506.
54. ¥атапсВ| Υ., Одата М., Ки^аВага А., НапаВа А., Кат1уа Υ., ¥атадисВ| 8.: АсВу-Воп оГд1ЫЫеге1Вп Ы1окуп1Век1к апВ гекропке ра(В\хахк Ыу 1о\х (етрега(иге Вийпд 1тЫ1Ы1Воп оГ АгаЫхВоркк (ВаВапа кееВк. Р1ап1 Се11 2004, 16:367-378.
55. КисВйки К., АагВ !М., А11еп С.1, 8сВе11е I., 8сВгоеВег II.: ЬоаВтд асе(оххте(Вх1 ек(ег Йиогексей Вуек ВИо 1Ве су(ор1акт оГ АгаЫВоркк апВ СоттеНпа диагВ се11к. №\х РВх(о1ощк( 2002, 153:527-533.
56. Сгупк1е\\кх С., Роете М., Тк1еп ВА: А пе\х депегаВоп оГ Са2+ тВкакгк \хВВ дгеаЙу ппргохеВ Йиогексепсе ргорегВек. 1 Вю1 СВет 1985, 260:3440-3450.
57. Тапд В.Н., Нап 8., 2Вепд Н., Соок С.А., СВо1 С.8., Аоегпег Т.Е., 1асккоп В.В., Ре1 2.М.: СоирВпд Втта1 суЮкоНс Са2+ оксШайопз (о 1Ве СА84Р3 ра(В\хах т АгаЫВоркк. 8скпсе 2007,315:1423-1426.
58. 1оВпкоп С.Н., КйдЙ М.В., КопВо Т., Маккоп Р., 8еВЫгоок 1., На1еу А., Тге\хахак А.: СпсаВ1ап оксШайопк оГсуЮкоНс апВ сВ1огор1акйс Ггее са1стт т р1ап(к. 8скпсе 1995, 269:1863-1865.
59. РоВВ А.К, 1акоЫкеп М.К., Вакег А1, Текегоух А., Нои 8.А., Ьар1а/е Ь., Вагго( Ь., Рое(Вщ В8., Наке1оГГ 1., АеЫЫ А.А.: Т1те оГ Вау тоВи1а(ек 1оух-(етрега(иге Са к1дпа1к т АгаЫхВоркк. Р1ап( ί 2006, 48:962-973.
60. Βηαίζιιιηί Т., 8сВгоеВег II., Кау 8.А.: Ш 8Υ№: (Ве тк апВ ои(к оГ сВсаВ1ап оксШаВопз т са1стт. 8с1 8ТКЕ 2007, 2007(390):ре32.
61. кгаеккоп М., 81еде1 В.8., Υоипд 1., НакйтоЮ М., Да К., 8сВгоеВег II.: СиагВ се11 АВА апВ СО2 ыдпаВпд пе(ухогк ирВа(ек апВ Са2+ кепког рйттд Вуро(Век1к. Сигг Орт Р1ап( Вю1 2006, 9:654-663.
62. Нидоиупеих У., Мига(а Υ., Υоипд И, Ктеак М., Маскеку Ρ.Ζ., 8сВгоеВег II.: косаГОаиоп, юп сВаппе1 гедл1айоп апВ депейс Й1(егас(юпк Вийпд аЫкткт ас1В к1дпайпд оГ (Ве пис1еаг тВХА сар-ЫтВтд рго1ет, АВН1. Р1ай РВукю1 2002, 130:1276-1287.
63. МIΛМЕxр^екк, Ггот (Ве Еигореап ВЮпГогтайск ЬкйШе (ЕВЦ, а поп-ргой! асаВетк о^дап^ζайоп (Ва( Гогтк рай оГ(Ве Еигореап Мо1еси1аг Вк1оду ЬаЫогакгу, СатЫйВде, Сгеа( Впкпп.
64. уоп Апит А.С., Репд Х.А., 8(асеу М.С.: С1ошпд хес(огк Гог (Ве ехргеккюп оГ дгееп Г1иогексеп( ргокт Гикюп рго(еВ1к т йапкдешс р1ап(к. Сепе 1998, 221:35-43.
65. С1оидВ 8.к, Вей А.Е.: Е1ога1 В1р: а йтрНПеВ те(ВоВ Гог АдгоЫас1ег1ит-теВ1а1еВ йапкГогтайоп оГ АгаЫ1Ворк1к (Вайапа. Р1ай 1. 1998,16:735-743.
66. НогксВ В.В., Егу ЙЕ., Но£Гтапп КЬ., ЕкВВоГО Р., Водегк 8.С., Ега1еу В.Т.: А к1тр1е апВ депега1 те(ВоВ Гог (гапкГегппд депек 1йо р1айк. 8скпсе 1985, 227:1229-1231.
- 51 019514
67. Инаде ί.. Сеп(ге бе КесНегсНе РиЬИс Непп Тибог, ЬихетЬоигд.
Таблица Ι. Суммированные результаты кальций-визуализации в замыкающих клетках интактных трансгенных растений рСС1:УС3.60 АгаЫборык
Эксперименты растения анализированные ОС ОС со спонтанными транзиторными концентрациями Саг+ Процентное содержание, %
I 5 24 18 75
II 11 52 36 62.23
III 11 55 36 65.45
ГУ 9 54 24 44.44
Всего 36 185 114 61.78
В эксперименте Ι только корни погружали в воду. В экспериментах ΙΙ, ΙΙΙ и ГУ в воду погружали как листья, так и корни.
Пример 4. Характеристика рецепторов СО2, которые регулируют поглощение СО2 и эффективность использования воды растениями
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для понижающей регуляции или уменьшения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие И1(ег аИа применение полипептида, имеющего карбоангидразную (карбонатдегидратазную) активность или β-карбоангидразную активность, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид карбоангидразы; и экспрессию или сверхэкспрессию, экспрессирующей белок СО28еп (сенсор СО2) нуклеиновой кислоты и/или гена или транскрипта (мРНК) СО28еп, и/или карбоангидразы или β-карбоангидразы, в замыкающей клетке. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для повышающей регуляции или увеличения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие И1(ег аИа применение нуклеиновой кислоты, антисмысловой или иным образом ингибирующей в отношении нуклеиновой кислоты, кодирующей карбоангидразу (карбонатдегидрогеназу) растения или β-карбоангидразу растения; и экспрессию этой антисмысловой или ингибирующей нуклеиновой кислоты в замыкающей клетке растения.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции замыкающих клеток ш νί\Ό. в том числе их способности образовывать корректируемые устьичные щели в эпидермисе растения; таким образом, Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции вхождения СО2 для фотосинтеза и транспирационной потери воды из растений в атмосферу.
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции дневного повышения концентрации СО2 листа во время ночной фазы, так же как продолжающееся повышение атмосферной [СО2] вызывает закрывание устьичных щелей для газообмена; и, следовательно, изобретение может влиять на фиксацию углерода и эффективность использования воды растений. Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции механизмов трансдукции сигналов, которые регулируют СО2-индуцируемые устьичные движения, в том числе сенсоров СО2, которые регулируют эту реакцию.
С использованием микроматриц, специфических для замыкающих клеток и мезофильных клеток листа, авторы изобретения идентифицировали высоко экспрессируемые гены β-карбоангидразы, обозначаемые здесь СА1 и СА4, также называемые в этой заявке 8Εβ ΙΌ NО:3 (кодируемая, например, 8Εβ ΙΌ NО:1 или СА4 или СОКР2), или 8Εβ ΙΌ NО:9 (кодируемая, например, 8Εβ ГО NО:7 или СА1'' или СОКР1); также включающие в себя 8Εβ ГО NО:6 (кодируемую, например, 8Εβ ГО NО:4 или СА6).
Настоящее изобретение демонстрирует, что мутантные растения с двойным нокаутом (для нуклеиновых кислот этого изобретения СА1 и СА4) обнаруживают разительное уменьшение регуляции СО2 газообмена и устьичных движений растения. Двойной мутант са1са4 проявляет функциональные реакции на другие физиологические стимулы, в том числе на синий свет, переходы свет-темнота и на фитогормон абсцизовую кислоту. Кратковременное добавление ингибитора фермента карбоангидразы (СА) к эпидермисам листьев дикого типа имитирует СО2-нечувствительность са1са4, согласующуюся с демонстрируемой этим изобретением ролью карбоангидраз в передаче сигнала СО2.
Нацеленная на замыкающие клетки экспрессия любого гена СА этого изобретения комплементирует восприятие СО2 и передачу сигнала в мутантных растениях са1са4, демонстрируя, что эта реакция на СО2 происходит из замыкающих клеток. Анализы фотосинтеза интактных мутантных листьев показывают, что мутация са1са4 не влияет на флуоресценцию хлорофилла или на скорость ассимиляции СО2. Кроме того, обесцвеченные норфлуразоном листья дикого типа обнаруживают интактные СО2индуцированные устьичные движения, что предполагает вместе, что СА-опосредованный путь передачи сигнала, который регулирует газообмен, не является, в первую очередь, связанным с фотосинтезом.
Анализы эпистаза с мутантом киназы Н11 (см., например, НакНПиоЮ е( а1., 2006) дополнительно обеспечивают генетическое доказательство того, что СА1 и СА4 функционируют выше по ходу передачи сигнала в пути передачи сигнала СО2 замыкающих клеток.
- 52 019514
Нацеленная сверхэкспрессия либо СА1, либо СА4 в замыкающих клетках в сильной степени усиливает эффективность использования воды растений Α^аЬ^йοрк^к, что согласуется с жизненно важной ролью этих СА в регуляции СО2 газообмена растений. Вместе эти открытия демонстрируют впервые незаменимую функцию этих экспрессируемых замыкающими клетками карбоангидраз, в том числе полипептидов этого изобретения, в СО2-регуляции вхождения СО2 и эффективности использования воды растений, а также демонстрируют, что СА1 и СА4 функционируют в аппарате восприятия СО2 передачи сигнала СО2.
Композиции и способы этого изобретения могут быть использованы для ослабления непрерывного повышения атмосферной [СО2], которое, как предсказывается, влияет на природные и сельскохозяйственные экоситемы на глобальном уровне.
Результаты
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для сверхэкспрессии и недостаточной экспрессии генов β-карбоангидразы, например, генов этого изобретения, обозначаемых здесь СА1 и СА4, также называемых в этой заявке δΕΟ ΙΌ ΝО:3 (кодируемой, например, δΕΟ ΙΌ ΝО:1, или СА4 или СОКГ2 или ΑΤ1§70410), или δΕΟ ΙΌ ΝО:9 (кодируемой, например, δΕΟ ΙΌ ΝО:7, или СА1'' или СОКГ1 или Α!3§01500); а также включающих в себя δΕΟ ΙΌ ΝО:6 (кодируемую, например, δΕΟ ΙΌ ΝО:4, или СА6 или Α!1§58180).
Среди этих различных классов карбоангидраз (СА), которые катализируют обратимую гидратацию СО2, члены β-класса СА СА1 (Α!3§01500), СΑ4 (Α!1§70410) и СА6 (Α!1§58180) показали высокие уровни экспрессии в замыкающих клетках согласно анализам специфических для замыкающих клеток микроматриц, см. фиг. 22, как описано Ьеопйагй! е! а1., 2004; Уапд е! а1., 2008. Фиг. 22 иллюстрирует филогенетическое дерево карбоангидраз (СА) Α^аЬ^йοрк^к, см., например, ЕаЬге е! а1., 2007, и соответствующие данные экспрессии специфических для замыкающих клеток микроматриц в скобках; слева, данные микроматриц 8К из Ьеопйагй! е! а1., 2004; справа данные микроматриц 23К из Уапд е! а1., 2008. Как отмечается на фиг. 22, СА1, СА4 и СΑ6 (жирный шрифт), обнаруживают наивысшие величины экспрессии среди СА в замыкающих клетках.
Фиг. 9 иллюстрируют, что разрушения экспрессируемых в замыкающих клетках карбоангидраз СА1 и СА4 нарушают СО2-индуцируемые устьичные движения. Например, экспрессия в замыкающих клетках СА1, СА4 и СА6 была подтверждена ОТ-ПЦР вместе с высоко специфическим для замыкающих клеток маркерным геном ΚΑΤ1 ^!5д46240) и мезофилл-специфическим маркерным геном СВР ^!4д33050) (Мой е! а1., 2006), как показано на фиг. 9А.
ОТ-ПЦР использовали для подтверждения экспрессии СА1 и СА4 в замыкающих клетках и мезофильных клетках в сравнении с высокоэкспрессируемым маркером замыкающих клеток ΚΑΤ1 ^!5д46240) маркером СВР мезофильных клеток (Α!^33050); см., например, №-1капшга е! а1., 1995; Мой е! а1., 2006. Фиг. 9В и 9С иллюстрируют ОТ-ПЦР-анализ листьев двойного мутанта са1са4, эти данные показывают отсутствие транскриптов СА1 и Са4.
Фиг. 9С, 9Ό, 9Е и фиг. 23 иллюстрируют реакции устьичной проводимости на СО2, синий свет и переходы свет-темнота в νΤ, мутантных растениях са1са4 или са1са4са6 (й, е, п = 7; п = 5). Листья двойного мутанта са1са4 показывали сильную нечувствительность к индуцируемому высокой СО2 закрыванию (фиг. 9С, фиг. 9С, фиг. 9С) и в соответствии с этим фенотипом показывают повышенную устьичную проводимость при [СО2] окружающей среды (365-400 м.д.) (фиг. 9С, 9Е); тогда как растения мутанта са показывали сильные устьичные реакции на синий свет и переход свет-темнота (фиг. 23). Величины в й нормализовали относительно последней точки данных перед переходом на СО2 365-800 м.д.
Фиг. 10А иллюстрирует устьица в листьях двойного мутанта са1са4, которые закрываются в реакции на абсцизовую кислоту; п = 3 эксперимента, 30 устьиц на один эксперимент и на одно условие. Стержни ошибок изображают средние величины ± стандартная ошибка среднего (к.е.т). Фиг. 10В иллюстрирует СО2-индуцированные устьичные движения, которые нарушены в листьях двойного мутанта са1са4 и эпидермисе листьев дикого типа, обработанных ингибитором карбоангидразы 6-этокси-2бензотиазолсульфонамидом (ΕΖΑ) (п = 6, 30 устьиц на одну пробу); см., например, Βеске^ е! а1., 2007.
Инсертированный мутант Т-ДНК (транспортной ДНК) с индексом одной последовательности получали через ^аМ^рак Шоттайоп Кекоигсе (ΤΑΙΚ) сеп!ег для каждого из трех генов СА и обозначали их как са1 (δΑ^Κ_106570), са4 ^1ксОкЬох508О1 1) и са6 (δΑ^Κ044658). Поскольку первональные результаты показали, что все моносайтовые мутанты сохраняли нормальную СО2-чувствительность, двойные мутанты са1са4, са4са6, са1са6, а также тройной мутант са1са4са6 генерировали затем для оценки СО2чувствительности. Экспрессия СА1 и СА4 не детектировалась в листьях двойного мутанта са1са4, как показано на фиг. 9В, и дополнительное отсутствие транскрипта СА6 также подтверждали в са4са6, как показано на фиг. 24А. Фиг. 24А иллюстрирует данные, показывающие, что двойные мутанты са4са6 обнаруживают интактные СО2-реакции, тогда как са1са4 и са1са4са6 обнаруживают такое же ухудшение восприятия СО2. Фиг. 24В, 24С, 24Ό и 24Е графически иллюстрируют устьичные проводимости в моль -2 -1 воды м с .
Анализы устьичной проводимости в реакции на изменения [СО2] показали сильную СО2
- 53 019514 нечувствительность в двойном мутанте са1са4, как показано на фиг. 9С, 9Ό, 9Е; и тройном мутанте са1са4са6, как показано на фиг. 24В, 24С, 24Ό и 4Е, хотя растения са1са6 и са4са6 вели себя подобно дикому типу.
Фиг. 9С иллюстрирует, что мутантные растения са показывали более высокую устьичную проводимость при [СО2] окружающей среды (365-400 м.д.). В противоположность ухудшению СО2-реакций, показанных на фиг. 9С, 9Ό, 9Е и фиг. 24Ό, 24Е и 24Е, растения са1са4са6 показали сильные индуцируемые синим светом и переходами свет-темнота реакции несмотря на более высокую устьичную проводимость мутантных растений са, как показано на фиг. 23.
Для определения, связаны ли нарушенные СО2-реакции в интактных листьях (см. фиг. 9С, 9Ό, 9Е) с устьичными движениями, СО2-реакции анализировали в эпидермисе листьев. СО2-индуцированные движения были нарушенными в са1са4 в сравнении с диким типом, как показано на фиг. 10В. Кроме того, когда эпидермис листьев дикого типа обрабатывали в течение 30 мин проникаемым через мембрану ингибитором СА Е2А (см., например, Вескег е1 а1., 2007), СО2-индуцируемое раскрывание и закрывание устьиц было ингибированным, что коррелирует с ролью карбоангидраз в восприятии СО2, а не с долгосрочным эффектом развития разрушения гена СА в быстрой СО2-реакции, как показано на фиг. 10В. В отличие от этого индуцируемое абсцизовой кислотой (АВА) закрывание устьиц было полностью функциональным в эпидермисе листьев са1са4, как показано на фиг. 10А.
При введении геномных конструкций (приблизительно 4,5 т.п.н.), содержащих только ген СА1 или СА4 дикого типа и фланкирующие последовательности, в мутант са1са4, экспрессия СА1 или СА4 восстанавливалась в листьях нескольких независимых трансгенных линий, как показано на фиг. 11А и фиг. 11В. В отличие от са1са4, все трансгенные линии обнаруживали реакции, подобные реакциям дикого типа, на изменения [СО2], как показано на фиг. 11С и 11Ό и фиг. 25. Таким образом, эти данные демонстрируют, что разрушение СА1 и СА4 действительно является ответственным за фенотипы, наблюдаемые в растениях са1са4, и что экспрессия любого гена является достаточной для комплементации.
В целом, фиг. 11 иллюстрирует, что введение геномных копий дикого типа СА1 или СА4 комплементирует СО2-нечувствительные фенотипы са1са4. Фиг. 11А и 11В иллюстрируют данные ОТ-ПЦРанализов (29 циклов), подтверждающие восстановление экспрессии СА1 (фиг. 11А) и СА4 (фиг. 11В) в листьях двойного мутанта са1са4, трансформированных геномными конструкциями СА1 (фиг. 11А) или СА4 (фиг. 11В). Анализировали три независимые трансгенные линии на одну геномную конструкцию. Актин (А12д37620) использовали в качестве контроля. Фиг. 11С и 11Ό, в противоположность са1са4, показывает, что как комплементированная СА1#1 линия (фиг. 11С), так и комплементированная СА4#1 линия (фиг. 11Ό) проявляли восстановление [СО2]-регулируемых изменений устьичной проводимости (п = 8 листьев для са1са4, п = 10 для \УТ и п = 4 для любой из этих комплементированных линий). Стержни ошибок изображают средние величины ± в.е.т. См. также фиг. 25 в отношении результатов из других независимых трансгенных линий.
В целом, фиг. 25 иллюстрирует данные, демонстрирующие, что несколько независимых трансгенных линий са1са4, трансформированных копией дикого типа либо СА1, либо СА4, обнаруживают восстановление индуцируемых изменениями [СО2] реакций. Две дополнительные комплементированные линии с СА1, СА1#2 (фиг. 25А) и СА1#3 (фиг. 25В) или СА4, СА4#2 (фиг. 25С) и СА4#3 (фиг. 25Ό) показывают нормальное увеличение и уменьшение устьичной проводимости в реакции на изменения [СО2]. п = 4 листьям для каждой из комплементированных линий. Дикий тип (п = 10) и са1са4 (п = 8), показанные здесь, являются теми же самыми, что и изображенные на фиг. 11, обсуждаемой выше. Стержни ошибок обозначают средние величины ± к.е.т.
Для исследования субклеточной локализации СА1 и СА4 желтый флуоресцентный белок (УЕР), слитый с С-концом СА1 или СА4, транзиторно экспрессировали в протопластах табака, как показано на фиг. 26; которая иллюстрирует флуоресцентные картины (конфокальное изображение) клеток с различными картинами локализации СА1-УЕР и СА4-УЕР в протопластах табака. Как отмечается на фиг. 26, плазмиды, кодирующие УЕР, ЕЬ§2-УЕР, СА1-УЕР и СА4-УЕР, транзиторно экспрессировались в протопластах табака; фильтры указаны на верхней части этой фигуры, тогда как слияния указаны слева от этой фигуры; картины на крайней правой части фиг. 26 показывают совмещение изображений УЕР и хлорофилла. Аналогично локализованному в плазматической мембране слиянию ЕЬ82-УЕР, эти данные демонстрируют, что СА4-УЕР локализуется на периферии клеток, тогда как флуоресценция СА1-УЕР, повидимому, локализуется вместе с хлоропластами.
Конфокальная визуализация СА4-УЕР показала картину экспрессии на периферии клетки, идентичную картине слияния киназы трансмембранного рецептора с богатыми Ьеи повторами ЕЬ82-УЕР (ЕЬАСЕЬЬШ 8ΕΝ8ΙΤΐνΕ2) (см., например, ВоЬа1хек е1 а1, 2006), как иллюстрировано на фиг. 26. В противоположность этому флуоресценция из слияния СА1-УЕР, по-видимому, окружает аутофлуоресценцию хлорофилла, что позволяет предположить, что СА1 может быть локализована в хлоропластах, как показано на фиг. 26. Это дифференциальное распределение экспрессии слияний СА1-УЕР и СА4-УЕР находится в соответствии с другим исследованием локализации СА (см., например, ЕаЬге е1 а1., 2007).
Поскольку СА4, по-видимому, локализована в хлоропластах, авторы изобретения затем оценивали,
- 54 019514 зависит ли роль СА в восприятии СО2, зависимой от фотосинтеза, сравнением флуоресценции хлорофилла дикого типа и мутанта са1са4, в котором три основных экспрессируемых в замыкающих клетках гена СА (см. фиг. 22) разрушены нокаутом. На максимальную эффективность фотосистемы ΙΙ (Еу/Ет) в адаптированных к темноте листьях не действовала ошибочная экспрессия СА, как показано на фиг. 12А. Подобным образом, не было детектировано различие между квантовым выходом фотосистемы ΙΙ (Р8П, ФРзП) в листьях дикого типа и са1са4, предварительно адаптированных при низкой (50 мкмоль-м-2-с-1) или высокой (2000 мкмоль-м-2-с-1) фотосинтетически активной радиации, как показано на фиг. 12В и фиг. 12С. Если роль СА в восприятии СО2 опосредована фотосинтетическими активностями, должно было наблюдаться действие на возникновение фотосинтеза при переходе из темноты в условия иллюминации фотосинтетически активным красным светом. Анализ скорости ассимиляции СО2 в са1са4 и диком типе показал, что оба генотипа достигали их стационарного состояния фотосинтетической активности в одном и том же интервале времени после освещения 300 мкмоль м-2 с-1 красным светом, как показано на фиг. 12Ό.
Для дополнительного анализа, необходим ли интактный фотосинтез для СО2-регуляции устьичных движений, использовали другой подход. Активности фотосинтеза блокировали в новых возникающих листьях поливом 3-4-недельных растений АгаИйор^хк (НаНапа ингибитором биосинтеза каротиноидов Норфлуразоном (МЕ) с получением альбиносных хлоропластнедостаточных листьев дикого типа, лишенных функциональных хлоропластов, как показано на фиг. 13А (см., например, ЕоеШета е( а1., 2006). Отсутствие функциональных хлоропластов в этих N1обработнанных растениях подтверждали визуализацией, как показано на фиг. 13В, и количественным определением, как показано на фиг. 13С флуоресценции хлорофилла с использованием конфокальной микроскопии. Как показано на фиг. 13Ό, на СО2-реакцию устьиц как при высокой, так и при низкой [СО2] в интактных листьях не влияло отсутствие функциональных хлоропластов (альбинос 0 м.д. [СО2] в сравнении с альбиносом 800 м.д. [СО2], Р=8,9-21, п=6). Таким образом, данные авторов изобретения демонстрируют, что фотосинтетические активности не разрушались в мутантных растениях са, которые проявляли нарушенное восприятие СО2, и не были необходимы для функциональной устьичной СО2реакции в АгаЬИорык (как показано на фиг. 12 и 13), как сообщалось ранее для Ую1а ГаЬа (см., например, ЕоеШета е( а1., 2006). Однако, отмечая, что изобретение не ограничивается каким-либо конкретным механизмом действия, авторы считают, что эти открытия не исключают дополнительных СА-независимых механизмов, при помощи которых фотосинтез может быть связан с устьичными движениями (см., например, Мекыпдег е( а1., 2006).
В целом, на фиг. 12 и 13: связанные с фотосинтезом активности не связаны непосредственно с САопосредованной СО2-индуцированной устьичной реакцией. Фиг. 12А, 12В и 12С графически иллюстрируют анализ флуоресценции хлорофилла, который выявил отсутствие различий между растениями \УТ и мутантными растениями са1са4са6 в отношении максимальной эффективности фотоситемы ΙΙ (Р8П) Еу/Ет, в адаптированных к темноте листьях (п = 10) (фиг. 12А) или в отношении квантового выхода (Р8П, ФРзП) в листьях (п = 6), предварительно адаптированных при (50 мкмоль м-2 с-1) или (2000 мкмоль м-2 с-1) фотосинтетически активной радиации. Фиг. 12Ό иллюстрирует, что индуцированная красным светом фотосинтетическая активность не была нарушена в са1са4са6 (п = 6).
Фиг. 13А иллюстрирует изображение хлорофилл-недостаточных альбиносных листьев дикого типа, лишенных функциональных хлоропластов, которые были генерированы нанесением ингибитора синтеза каротиноидов норфлуразона. Отсутствие хлорофилла в замыкающих клетках альбиноса визуализировали конфокальной микроскопией (фиг. 13В графически иллюстрирует данные) и количественно определяли анализом изображения интенсивности флуоресценции хлорофилла (фиг. 13С графически иллюстрирует данные) (п = 3, 12 устьиц на одну пробу). Фиг. 13Ό графически иллюстрирует данные, показывающие СО2-индуцированные устьичные движения в альбиносе в сравнении с контрольными листьями растений (п = 7, 50 устьиц на одну пробу). Стержни ошибок изображают средние величины ± 5.е.т.
СА1 и СА4 экспрессируются как в замыкающих клетках, так и в мезофильных клетках (см. фиг. 9А), и мутантные растения с нокаутом обнаруживают нарушенные реакции на СО2. Затем авторы изобретения анализировали, является ли экспрессия СА1 и СА4, нацеленная на замыкающие клетки, достаточной для комплементации фенотипов СО2-реакции мутанта са1са4.
кДНК СА1 или СА4, запускаемые сильным промотором замыкающих клеток этого изобретения, описанные в примере 3, трансформировали в растения двойного мутанта са1са4 и их преимущественную для замыкающих клеток экспрессию подтверждали при помощи ОТ-ПЦР в нескольких независимых трансгенных линиях, как показано на фиг. 27А и 27В, с использованием специфического для замыкающих клеток маркера КАТ1 (см., например, №1катйа е( а1., 1998) и маркера СВР мезофильных клеток (см., например, Мой е( а1., 2006). Трансгенные растения са1са4, экспрессирующие СА1 или СА4 преимущественно в замыкающих клетках, обнаруживали более сильные изменения устьичной проводимости в реакции на смещения [СО2], как показано на фиг. 27С, 27Ό и 28; анализировали четыре полностью независимые трансгенные линии. Эти результаты демонстрируют, что генерирование экспрессии генов сенсоров СО2 этого изобретения, в том числе экспрессии СА1 или СА4, в замыкающих клетках является достаточ
- 55 019514 ным для комплементации нарушенной СО2-реакции двойного мутанта са1са4, и что эти карбоангидразы (СА) функционируют в восприятии СО2 первично в замыкающих клетках. Таким образом, эти результаты демонстрируют, что экспрессией генов сенсоров СО2 этого изобретения, в том числе экспрессией СА1 или СА4, можно манипулировать СО2-реакциями растений.
Самым ранним компонентом передачи сигнала СО2, идентифицированным до сих пор в замыкающих клетках, является киназа НТ1, отрицательный регулятор этого пути (см., например, НакИпоЮ е1 а1., 2006). Сильный аллель 111-2 обнаруживает конститутивную реакцию на высокую [СО2]. Для исследования, функционируют карбоангидразы (СА) выше или ниже НТ1 в процессе передачи сигнала, генерировали тройной мутант са1са4111-2 и его устьичную проводимость анализировали в реакции на изменения [СО2]. Как ясно изображено на фиг. 27Е, и в явном противоречии с двойным мутантом са1са4 или диким типом, растения са1са4111-2 проявляли фенотип, неотличимый от моносайтового мутанта 112. Эти данные обеспечивают генетическое доказательство, что СА1 и СА4 действуют выше по ходу передачи сигнала самого раннего компонента передачи сигнала СО2, известного к настоящему времени, что согласуется с функцией сенсора СО2 для этих карбоангидраз (СА).
В целом, фиг. 27А-С и фиг. 14С графически иллюстрируют данные, показывающие, что преимущественная запускаемая замыкающими клетками экспрессия кДНК СЛ1 или СА4 восстанавливает восприятие СО2 в са1са4, и сверхэкспрессирующие СА растения проявляют улучшенную эффективность использования воды. Фиг. 27А и 27В графически иллюстрируют ОТ-ПЦР-анализ экспрессии СА1 и СА4, в протопластах замыкающих клеток и мезофильных клетках комплементированных растений с СА1 или СА4, запускаемыми нацеленным на замыкающие клетки промотором этого изобретения рСС1 (см. пример 3 выше). СС, замыкающая клетка; МС, мезофильная клетка. СЛ1дс # п, комплементированная линия п с кДНК СА1, запускаемой промотором замыкающих клеток. КАТ1, Л15д46240, маркер замыкающих клеток (Яакатига е1 а1., 1998); СВР, Л14д33050, маркер мезофильных клеток (Моп е1 а1., 2006).
Фиг. 27С и 27Ό графически иллюстрируют СО2-индуцированное изменение устьичной проводимости нацеленных на замыкающие клетки линий, двойного мутанта са1са4 и растений дикого типа (^Т) в ответ на указанные смещения [СО2] (в м.д., п = 4, ± к.е.т.). Экспрессия СА1 или СА4 в замыкающих клетках является достаточной для восстановления СО2-реакции. Фиг. 27Е графически иллюстрирует устьичную проводимость листьев са1са4 (п = 4), дикого типа (п = 4), 111-2 (п - 7) и тройного мутанта са1са4111-2 (п = 7) в ответ на указанные изменения [СО2] (в м.д., ± к.е.т.). Фиг. 27Е и 27С графически иллюстрируют устьичную проводимость сверхэкспрессирующих СА линий и растений дикого типа (^Т) в ответ на указанные изменения [СО2] (в м.д., п = 4, ± к.е.т.).
Фиг. 14С графически иллюстрирует сверхэкспрессирующие СА1 и СА4 растения, которые обнаруживают улучшенную эффективность использования воды (^ИЕ, мкмоль С02 ммоль Н2О-1) (п = 5, ± к.е.т.). Фиг. 14С иллюстрирует фотографии растений дикого типа, са1са4 и СА-экспрессирующих линий, выращиваемых при стандартных условиях.
В целом, фиг. 28А-Е графически иллюстрируют специфическую для замыкающих клеток комплементацию либо СА1, либо СА4, которая восстанавливает реакции на СО2 в са1са4. Анализировали данные реакции на СО2 дополнительной линии, комплементированной нацеленной на замыкающие клетки экспрессией СЛ1 или СЛ4, как графически иллюстрировано на фиг. 28А и фиг. 28В (п = 4), и СО2реакцию относительной устьичной проводимости нацеленных на замыкающие клетки 4 независимых комплементированных линий (две на фиг. 27С и фиг. 27Ό; две на фиг. 28А и фиг. 28В). Фиг. 28С-Е графически иллюстрируют относительные величины устьичной проводимости, которые были нормализованы относительно последней точки данных перед переключением на 365-800 м.д. СО2. Стержни ошибок изображают средние величны ± к.е.т.
Авторы анализировали также, может ли сверхэкспрессия СА1 или СА4 в замыкающих клетках растений дикого типа быть хорошей стратегией для увеличения реакции растений на изменения атмосферной [СО2]. Трансгенные растения, сверхэкспрессирующие СЛ1 или СА4 под контролем сильного промотора замыкающих клеток этого изобретения (описанные в примере 3 выше), генерировали в фенотипе дикого типа и подтверждали ОТ-ПЦР, как показано на фиг. 14А и фиг. 14В. Четыре независимых сверхэкспрессирующих СА1 или СА4 линий проявляли уменьшенную устьичную проводимость при всех испытанных концентрациях, что согласуется с увеличенной реакцией на СО2, как показано на фиг. 27Е и фиг. 27С. Интересно, что постоянно наблюдали значимое различие в эффективности использования воды (^ИЕ) между двойным мутантом са1са4, сверхэкспрессирующими СА растениями и растениями дикого типа. Сверхэкспрессия либо гена СА1, либо гена СА4 в диком типе существенно улучшала эффективность использования воды на 50% при [СО2] окружающей среды, как показано на фиг. 14С, где р<0,01. При прилагаемом стандартном условии не наблюдали других фенотипических различий в росте между растениями дикого типа и сверхэкспрессирующими СА растениями, как иллюстрировано в фотографиях, показанных на фиг. 14Ό. Эти данные демонстрируют, что нацеленная на замыкающие клетки сверхэкспрессия карбоангидраз (СА), в том числе генов СА этого изобретения, обеспечивает рациональный и эффективный подход для улучшения эффективности использования воды растений. Эти данные демонстрируют, что композици и способы этого изобретения могут быть использованы для решения проблемы
- 56 019514 и ослабления увеличения атмосферных концентраций СО2.
В целом, фиг. 29 графически иллюстрирует данные, показывающие, что сверхэкспрессия СА1 или СА4 в замыкающих клетках дикого типа уменьшает общую устьичную проводимость и слегка увеличивает размер устьичной реакции на СО2. Фиг. 29С и 29Ό графически иллюстрируют ОТ-ПЦР-анализ СА1 или СА4 в листьях сверхэкспрессирующих линий, запускаемых предпочтительным для замыкающих клеток промотором рСС1. Измерения устьичной проводимости дополнительной линии, сверхэкспрессирующей ген СА1, показаны на фиг. 29А, а дополнительная линия, сверхэкспрессирующая ген СА4, иллюстрирована на фиг. 29В. Величины относительной устьичной проводимости, показанные на фиг. 29С, 29Ό, 29Е и 29Е, нормализовали относительно последней точки данных перед переключением на 365-800 м.д. СО2. Стержни ошибок изображают средние величины ± к.е.т. фиг. 29А, 29С, 29Ό и 29Е, п = 4; фиг. 29В, 29Е, п = 3.
Ссылки
1. Вескег Н.М. & Оектег, IV. ΟηΓΕοηχ апЛубгаке ΙΙ тсгеакек !Ле асйуйу οί !Ле Литап е1ес!годешс Nа+/НСО3,-сο!^аηкрο^!е^. ίοιΐΓηη1 οί ВюЕд^б СЛеткЛу 282, 13508-13521 (2007).
2. Ое1нс1а Е.Н. е! а1. №1 рптагу р^οбисЛοη οί а кэгек! етокуйет теЛЛ ехрептеп!а1 СО2 еппсктепР 8с1епсе 284, 1177-1179 (1999).
3. ЕаЬге Ν., ВеЛег, Ι.Μ., Веситее-Ыпка, Ν., Сеп!у, В. & Витеаи, Ό. СЛа^асΐе^^ζаЛοη апб ехргеккюп апа1ук1к οί депек еп^бтё а1рЛа апб Ье!а са^Ьοη^с апЛубгакек т А^аЬ^бοрк^к. Р1ап! Се11 апб Епу1гоптеп! 30, 617-629 (2007).
4. НакЛ^тοΐο М. е! а1. А^аЬ^бοрк^к НТ1 ктаке кЮтаЫ тονетеηΐк т ю^пке Ю СО2. №1!иге
Се11 ВюЦду 8, 391-И52 (2006).
5. Не!11еппдЮп А.М. & Vοοбтеа^б. Ρ.Ι. ТЛе га1е οί 81»та1а ίη кепктд апб бгМпд е№1гоптеп1а1 сЛапде. Книге 424, 901-908 (2003).
6. Ни I е! а1. ^еΐесΐ^οη οί ηеа^-аΐтοкрЛе^^с сοηсеη!^а!^οηк οί СО2 Ьу ап ο1ί·κΙοΓν киЬкук!ет ίη !Ле тοике. 8с1епсе 317, 953-957 (2007).
7. Нипда!е В. А. е! а1. ТЛе ίаΐе οί са^п ίη дгакк1апбк ипбег са^п бюх1бе еппсЛтеп!. №1!иге 388, 576579 (1997).
8. .кпек ν.Ό., СауЛ1юд1и, Р., Κабοте, ЬС. & νο88Μ1, Ь.В. Т\\ц с11етοкеηкο^у гесерЮгк Юде!11ег теб1а!е са^п бюх1бе бе!ес!юп ίη Ото^рЬИа. №1!иге 445, 86-90 (2007).
9. КЛюкИНа Т. е! а1. рЛοΐ1 апб рЛοΐ2 теб1а!е Ь1ие ЛдЛ1 геди1а!юп οί кЮта1а1 οреη^ηд. Книге 414, 656660 (2001).
10. Ктеак 1.М. е! а1. ^οт^ηаηΐ ηедаЛνе диагб се11 К+ сЛаппе1 ти!ап!к гебисе 1птеагб-гес(1Гу1пд К+ сиггеп!к апб ЛдЛЛтбисеб кЮта!а1 οреη^ηд ίη А^аЬ^бοрк^к. Р1ап! РЛукюЦду 127, 473-485 (2001).
11. Ьабеаи 8. Ь. & С1агк, ί.8. В1ктд СО2 1ех-'е1к апб !Ле ^1116+- οί йгек! !геек. 8с1епсе 292, 9598(2001).
12. ^еοηЛа^бΐ Ν. е! а1. Мюгоаггау ехргеккюп апа1укек οί А^аЬ^бοрк^к диагб се11к апб ΕοΕ-Πίοη οί а гесеккВе аЬкакю ааб ЛурегкепкЛВе рго!ет рЛοкрЛаΐаке 2С ти!ап!. Р1ап! Се11 16,596-615(2004).
13. Меб1уп В. Е. е! а1. 8Юта1а1 οοηάϋΟίΗηοο οί йгек! крес1ек айег ЕпдЧегт еxрοки^е ίο е1ееа!еб СО2 ^ικχη!π·ι!ίοη: а куп!Нек1к. №те РЛуФ^дЩ 149, 247-264 (2001).
14. Мекктдег 8.М., Виск1еу, Т.К & ΜοЛ, К.А. ЕУбепсе ίοτ ίηνο1\Όΐικη! οί рЛοΐοкуηΐЛеΐ^с ргасеккек ίη !11е кЮта!а1 га^юике ίο СО2. Р1ап! РЛукюЦду 140, 771-778 (2006).
15. Μο^^ ЬС. е! а1. СЭРКк СРК6 апб СРК3 Επιαίοη ίη АВА геди1а!юп οί диагб се11 8-!уре апюп- апб Са2+-регтеаЬ1е сЛаппе1к апб кЮта!а1 сЦкиге. РЕк ВюЦду 4, 1749-1762 (2006).
16. №1катига В.Ь. & СаЬег, В.Е. 81ибутд ίοη сЛаппе1к иктд уеак! депеЛск. Ιοη СЛаппе1к, Р! В 293, 89104 (1998).
17. №1катига В.Ь. е! а1. Ехргеккюп οί ап А^аЬ^бοрк^к Ρο!акк^ит СЛаппе1 Сепе ίη Сиагб-СеЛк. Р1ап! РЛукю^ду 109, 371-374 (1995).
18. №д| I е! а1. СО2 гедЫаЮг 8ЛАС1 апб 11к Лοтο1οдиек аге еккепЕа1 ίοτ ηηίοη Лοтеοкΐак^к ίη р1ап! се11к. Книге 452, 483-И13 (2008).
19. ВοЬаΐζек 8., СЛ1псЛ111а, Ό. & Бο^1е^. Т. Ыдапб-тбисеб еηбοсу!οк^к οί !Ле раЛегп ^есοдη^!^οη гесерЮг ЕЬ82 ίη А^аЬ^бοрк^к. Сепек & ОеуеЕртеп! 20, 537-542 (2006).
20. Вοе1ίкета М.В.С. е! а1. Сиагб се11к ίη а1Ьню 1еак ра!сЛек 6ο ηοΐ гекю^ ίο рЛοΐοкуηΐЛеΐ^саЛу асНее габ1а!юп, Ьи! аге кепкЮхе ίο Ь1ие ЛдЛ1, СО2 апб аЬкакю ааб. Р1ап! Се11 апб Епу1гоптеп! 29, 1595-1605 (2006).
21. 8е11егк Р.1 е! а1. Μοбе1^ηд !Ле ехсЛапдек οί епегду, теа!ег, апб са^п Ье!теееп ^пипетк апб !Ле а!тοкрЛе^е. 8аепсе 275, 502-509 (1997).
22. УаЛ1ка1и Т. е! а1. 8ЛАС1 1к гес.|шгеб ίοτ р1ап! диагб се11 8-!уре апюп сЛаппе1 Г11пс!юп ίη кЮтаЫ к1дпа111пд. Ка!иге 452, 487-И15 (2008).
23. νοη Саеттегег 8. е! а1. 8ΐοтаίа1 сοηбисίаηсе бοек ηοΐ топ-еЩе теЛЛ рЛοΐοкуηΐЛеΐ^с сарасЛу ίη !гапкдетс !ο+·ιαο теЛЛ гебисеб атοиηΐк οί ВиНкот. ίοιΐΓηη1 οί Ехрептеп!а1 Βοΐаηу 55, 1157-1166 (2004).
24. ^№еЬЬ А.А.В. & НеШеппдЮп, А.М. Сопхегдепсе οί !Ле аЬкакю ааб, СО2, апб ех!гасе11и1аг са1сшт к1дпа1 !гапкбис!юп ра!Лтеаук ίη кΐοтаΐа1 диагб се11к. Р1ап! РЛукю^ду 114, 1557-1560 (1997).
- 57 019514
25. Уапд Υ., Сок!а А., Ьеопйатй! Ν., З1еде1 В.З. & Зсйтоейет Σ.Ι. !ко1а11оп оГ а к!гопд АтаЬИоркй диагй се11 ргото!ег апй йк ро!епйа1 го1е ак а гекеагсй 1оо1. Р1ап! Ме!йойк 4 (2008).
26. Υоипд И е! а1. СО2 ыдпаНпд т диагй се11к: Са1сшт кепкШуйу гекропке тойикШоп, а Са2+тйерепйеп! рйаке, апб СО2 ткепкйгуйу оГ Не дса2 ти!ап!. Ргосеейтдк оГ Не №1Ропа1 Асабету оГ Заепсек оГ Не Ипйей З1а1ек оГ Атепса 103, 7506-7511 (2006).
Пример 5. Примерные ферменты ФЕПК и Рубиско для регуляции поглощения СО2 и эффективности использования воды растениями
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для регуляции обмена диоксида углерода (СО2) и использования и поглощения СО2 в растении или части растения, например, листе, манипулированием экспрессией СО2-связывающего белка фосфоенолпируват(ФЕП)карбоксилазы (или ФЕПкарбоксилазы, или ФЕПК) и/или рибулозо-1,5-бисфосфаткарбоксилазы/оксигеназы, или фермента Рубиско; таким образом. Настоящее изобретение обеспечивает также композиции и способы для манипулирования трандукцией сигнала СО2 и регуляцией газообмена в растении или части растения, например органе, листе растения и т.п. Например, в одном аспекте изобретение обеспечивает композиции и способы для создания увеличенного количества ФЕПК (для облегчения раскрывания устьиц) и/или создания увеличенного количества фермента Рубиско.
В альтернативных аспектах этого изобретения нуклеиновые кислоты ФЕПК и Рубиско экспрессируют в клетках растения, например в замыкающих клетках и мезофильных клетках растения; и в одном аспекте их экспрессируют при высоких уровнях (более высоких, чем уровни дикого типа); или экспрессию ФЕПК и Рубиско ингибируют, уменьшают и/или репрессируют в клетках растений, например в замыкающих клетках и мезофильных клетках растения; и в одном аспекте их экспрессируют при более низких уровнях (более низких, чем уровни дикого типа). Клетки растений, сконструированные в этих альтернативных вариантах осуществления, включают в себя выделенные, культивируемые или трансгенные растения и клетки растений этого изобретения.
Следующие примерные нуклеиновые кислоты ФЕПК и Рубиско и их субпоследовательности, включающие в себя смысловые, кодирующие и антисмысловые последовательности (такие как аВИА, тВИА и т.п.), могут быть использованы для применения на практике композиций и способов этого изобретения.
Названиеактивность 8Е0 Ш ΝΟ: и ОепВапк Νο. Последовательность
РРС1 8Ε0ΙϋΝΟ:12 Αί1§53310 2йа18!а!с1с1§ааа1с1§аа1с1§ас!§асйсааа§8асаса2с!Шасйс1 а1эас!ёа£С£аа£са££1£аааааа!£2С£аа!с££аа£йа§а£аа£а!£ §са!с8ай§а!§йса1сйс81саас128йсс!§8сааа§иа§18аа§ас§а саа£си^зад1а1да18сШ§сйс1а8а1с£§Пгс1с£а1а1:сст.ссад£а1 И§сас§§1£аа8а!с1сс£{8ааас!еПсаа8а8сШа!§азсаПс!§са8 аа1ас£аае£2аа£са(£<ъасс1аадааЁсЬа£а££а£с!а§£§а§!ё(§с1: аасца^Иа£а!сса££айайссаИ)йТа1с2сГаааасШс1сТса1а1осй
- 58 019514
аасйа£ссааН1§§с1§ад§аа§Гдса§а11§сПа1с£сс£1ад§а(саа§ аадс1;даадаааед1даййдйда1дададс1с(дс1ас(ас(даа1с1:да1сх 1даадааасШсаадаадсйдйддада1с18аасаад1с1сс1даадада1с Ш§а1§с1с1саадаа(садас(:д1дда111дд11идас{дс1са1сс{ас1са§1 с1§1да§аа§а1сай§с1Хса£ааасаЦ££ад£а1аа§а§ас1£1с1§£с1:с аас1а1а1§с1аа§да1айас1сс1§а1£асаадсаада§сй:£а1£а§дс{с1 гса§адададайсаадс4дсайссдааса§а{§ааагсаааадаасассас с1ас{сскаа8а18ада{дададсдддаа1дад11аШсса1дааас1а1с1д даа১(айсс1аадШс1дсдссд(дйдасасддсШдаааааса1ад§д а1с§аа§аас£1§йсса(аТаа1дс1ссайдайсадйс1сйси£датдддХ д£Хда£сд1дасдд1аасссаадсдйасасс1£аад1:сасса§ада1д1й§с Й§йадс1адаа1да1ддс1дсСас1а1д1ас1йаассаааСсдаада1сйа1д1 Йдада1д(с1а1д1ддсдй£саа1дасда§с<дс£1дс§сдадс1да1даа£ йса1дсааайсдаддааада1дсс§саааасаПаса^адаайсТддаадСс аайсйасаайдадссайссд^дайсйддсдагдхаадддасаадсй Га1сасасасд{8аас2сдс1са1саасгдс1садсаа1ддасас1с18а1д1с сс(д1ададдс1ас1Йса(йшсйддааса§йсПддаасс1сй§адс1с1д1 1асс£а1сй:1:§1£йса1£(££1§ай:д1ссаа1а£са§а1£даадссйсй§а ШсйдаддсаадМсаассШдддсййсТсйд^адасйдаса^ааддса а8Шйй§асс§ссасас1§а1§ий£да{ёс1а1сассас8саШа§аШс дда1сс1асададад1д§1с1даадаасвсс§ссаа2аа1ддс1Ша1с1дад с{аад1ддсааасд1ссдсййсддйс1:дат.сйссГаааассдаадаааГад с(да1дйс(ддасас§й1са{д1са1аессдадс1ассадсада{адсЩ8дс §сйаса{1а1с(с(а1ддсаас1дсассйс{да1д(айадс1дй;дадсгй1ас адсдГдаа(дссдад1дааасадссй1дададЙдйссдс1сШдадаадс( адсада1駧аа£садскс1дс1£садйдстаддс1сййс1дйдайдд1 асааааассдаайаасддхаадсаададдйахдайддйайсддайсадд аааада1дс1ддасддйа1с1дс1дсйццсадйа1асааадс1саадаада §сйд1дааддйдс1ааадад1асдд1д1даадс(аасаа1дй(сасддсс§1 §дТддсасдд1сддаадад§адд(ддассаассса(сйдс(а(айд1с1са £сс1сс££а1ас1айаас88йссс1сс£гд1сасадйсаадд1йаа<йса1с дадсаа1сд1йдд(даададсасйа[дс1йадаасасйсадсдй(сасад с1дсТасаскдадсасдд1а1дс§1сс1ссаатсдсс{ааассадаа1ддс дсдс1йдс1ддагдааа1ддсддйдйдсаассдаддад(а1сдс1:садйдг §йссаадаасс1сддй1^сдад1асйссосс1с£с1асассддаас1дда §1а1ддасд1а1даа1аТсддаадсадассйсдаадсд1ааассаадсдд1д дсайдаа1с1с1ссд1дсаа11сса(дда1сйсдсйддас(сааасаадайс са1сйсс(£1а1ё£С駧айс§§а1са£сааНадаса1§1дай:дааааа§ асд(саддаасс1сса1а^с(ссаада1а1д1ассаасас1ддссШсШада ё(сассайда(с{аа1сдааа1д§(дйсес1ааадда2а1сс1£д(ай£с(дс Шд(асда1аадсис11дй1сададдаас(с{ддссййдд1дадаааск:а8 адс1аасйсдаадааассаадааас1са1сс(ссадассдс1ддасасааад а(сйсйдаа8д1да(ссйасйдааасададас12адасйсд1дайсйаса 11асаас1сСсаа1д1с(д1саадс11асаса11даададаа{сс§1да1ссда§1 Тасса1§1дас1с1дсдассасасашс1ааддада(:адсддаа{сдадсааа ссадсаааадаас(са1сдадсйаасссдас1адсдааТас§сдсса»дас Йдаа2а1асас1са1сйдасда1дааддд1айдс!2с1дд1с(:асаааасас сддйаадс1асааа§ада1дд11ааасааас1йдаа1с1с1сй1с1сЮсаа§ 1с1с1ссйШйаас1аса§ат§§аааа1ааддйддайс1§д1йаййа1§(а 1ссассд1саааа{дйдаййсд1д1асда§1асйсдадаТсайдаасасаг дс1с1§шййскаадй1аа1аааасадаасаададаа1сййсй2й1аййс йа(сг
- 59 019514
РРС2 I 8Εζ)ΙΟΝΟ:13 Αί2§42600 £!с!с»1йааайгйа1ааас(сса!ааййа1сйааа£1§аа!сййй1тйййй 2йсса§сШа1с§§а1а1ай(ссЙ§а1Шс!сс§ай§!§£1саа1с1:^аааа йай2а§аа!с!с!ссс!сасйаассаааа§с§да1аа1са§а!а§а§аёа§ аё£аааааёса!саассааасса1£ёс1£с§а£аааШ£ёаёаа£а1§£са с!аи£а!£с!са£с!са£§сйсйцс1сс!£ксаа££Гйс1£аа2ас£асаа есйа(с§а§£ас§а{§,с(с!§йас!§{2а!сдай!с1:с8а1айсйсаддай!д са1ёйсёа§§а(§1са§а§аайс§йсааёаа{§с1ас§аа§й§са§с!§а1: {ас£а!§£ааасс£саасас!£а£аа§сй8а££а£сй£§ааа!а!£с1£ас §а£Щ£§а1сса££§£айсаай£й£1сас!ааа1:сайс!ссааса1§с11а£ сй§ёс1аа1с!ё8с1§а§8аа£1сса§айёсйасс§ёс£1а£8а11аа§аа ас!саа§ааа£^§аШсес!£а1£а§§сс1с!§саасаас£§аа1:с1£аса( !^аа§а§ас!с!саа§а2ёсйй§са§сйаасаа§ас!сс!даа@১!сШ §а!§с!сйаа§аа!сацас!§й§ас駧ййаас1§с1са!сссас!саа1с! §йс§!сеё!сШ§с!ссаааа§й!§ёаа§еайс§1§ай§Ш§ас§са§йа 1а1§сааа§£асайас1сс!£а!§асааасаа£аас!с£а1£аа£с!с1ёсаа с£а£а£айсаазс(£спис£саса£а1§ааа(сс£аа£аас!сс{сс1аса сс8саа§а!£ааа£§а£а£са£££а1£а£с!асйсса!£а§асаа!с(£§аа ১а§йссааа@йсйаа§асё1§й§асаса§сшааа§аасайё§аа!с аас£а£с£1§йссйасаа!£с§сс(с(сайса8йс(:сйсй£'2к а1;’£>£с££ а£асс818а188ааассс8сёа21аас1сс1ёаа§йасаа£а^а!£1а{§сй айадсШ£аа!§а1£§с1§с(аа!сТсГасйс1ссса<’а1адаа£а!сйа!£!й £а£а1£!с!а!£1££сзй§сааг£ад£аасйс22дйс£!£са£аас£гсаа а£а(£!£с£аа§а§£§а(£саааасас!аййа§аайс1££ааасааа1ссс1 8с§аа1§а§сса!асс£а§с1айсй§£а§а1(т1ца§ц§асаа§с1:§!асаа сасас^£а§с^£сасё1са£йай£1сааёс£ёа§шс§ёас§йссс§а а§асзс£^йсасаа|ц^££ай'а^йа£2а£ссасй§а§с1й£йаса £екёс!с(£4£ай£с£^£аса£ассийдс1£а(деаа§сс1£сй§а!йс йас§ссаа§!§1саасай1§§ссй§с!сй§!£ааасй8а1а!сс£!саа§а а!с!оааа£асас!сг§а1£1сй§£а1£сса1сас£ас§сасйа§ек1ай££й сйасааа£аа1££1с££а££а1аааа£асаи.£аа1££с(£йа1с1£а£с1аа §с£££ааас8ссс!с1сщй£асс£§а1сйсссаааасс£аададдй£са §а1§1§П£§асасй!сааа£1сай!с!§а£сйссис§£а1а£йй§д1§сй агайагс1сааг££ссас1£с(сса1са£ас§(£с(с£с1й.и£а£сййе,саа с£с£аа!ёс§ё§а!сас12а1сс!с(§а§а§й£(ссс§й£йс£а£аа£с(а £с§ёай1а§аа!сс§сасс12с1§са§й£ссс§1с1сйс!сса!а§аа1§§(: аса§аааса8£а!саа!£8ааа£саа§аа§1са1§а(с§§§!ас1с!§ас(:с£ ё§сааа§а!дс1££(с(Дйа!са£с§£сйд£са£Иа!асаа£ас{саа2аа 8адс(с£Г§аа§£(££сааааеааГас££ае!саа£с(§асаа(£йссас§ £аа£а££1§§£асс5йё§ас§а§£а££1£§ас.с1ассса(сй£с1айй£1 с!са§сс!сс§§а(ассайса(о££саай§а§е£!аас££йсаа§£1£аа£ йай£ааса£(сШс§£а£аа£а£сасйа!£сШа£оас1сиса£С£й1са са§с!£саасасй§а£са1§£аа1£са!ссасс£2!йсссс(аа£сс1£а£[ ££с£(£1сс!са(££а1£ааа1£§с1а!аа11£ссас(£аадаа!ассдйс!£й §!сйсаа£.2адсссс£йидй£ае!асйсс2Гс1;£ссаасасса§адс1с£ а£!а1§§аа£§а!§ааса(а£§аа§сс£асса1саааас81ааассаа§с§§ а££аа!с£а£!с£с(£с£1£саа!ссс£1££а1сш£с§!ддас!садас£а д§йсасйассс£(£!§£с駧ст££а££а£саПсааасес£!са!аса£ аа§£аса£1аа£аа!с!сааса!£с!сааа£а£а(£1асаассаа1££ссаис йсс§1§1сасаай§а!с1а£1с£ааа1£§ййс§ссаа১а§а1ссс££аа й£с££с!с1£1а£д.асс£сс!сс!с£1с!с12аа£аасйсаассайс£а!£аа саасйс§а£йаас!ассаа§а§асса£ас£сс!сс!сс!сс১ɸса§§Х сасааа£асаПйа£аа££1£асссйасП£а£г£сааа££с!§са£сйс£1
- 60 019514
дассса1аса1сасдасайдаасд1д(д1саадсс(а1асас1еаадсада1;с сд1дасссаадсиссас°{сааадгссддссаса1с(с{с1ааддас(асагд §ад1с1ад1сса2сддс1дадс1сд1§ааас1даа1ссааада^дааШсдс ассдддас11даада[асд.диа1сс1сасса1даадддййсдс1дс1дд(а1 дсааааеассддпааддсадййтасдйсйд1асса11ссс1ааа1с(асд с(а1д1аа(д1айа1дйс(а1да1д1да1§ааа1с(ссссаас{сс{а1ссс§1:ас дс11ц(аа1дад1а1да1аай1сйд1дйайс1айдйдйа1дйасса1а1с(ад даааШаШс1дааадааасаадаааа§ааа1стсйПсдас1аа§а1дй
РРСЗ 8ΕΟ1ϋΝΟ:14 Αΐ3β14940 а!:ааа1асйсайс1дсй1сс{саагсаса1сса(сгс{даа1сТ§аиссаса(ст (ааасссйайссс1аааса1с§аа(йддйссйс1сссасаа{ссдсада§а{ йсйс1Шсадаадаад1аададдд1ддсдаадаада1йдайда1сддсда 1аа1§дсд§(Цс2дааса(ада§аадаСддса(сСай£а(дс{садсйсддс аас1с.дйссгдс(ааад1саехдаадасда1аа£сйдйдадтасда1дс1сй с1ссй2а1сдсШс1сдасайс1ссад§аШасасддсдадда1с1ссд1да аасддйсаада8йа1асдадсШс1дс(дад1а1даадддаадсд1дадсс (адсаадсйдаддадс1ад§еа^д1сс1аасда§Шдда1сс1д§1дас1с аайдйа(с(ссааддсШс(с1саса(дсйаасЙа§ссааШддсТдадда дд1§садайдс1сассд1сдсад§а1саадаадсТдаадааад§(дайГсд йда18ададйс(дсаас1ас!даагссда1айдаададасййаададдс(с дШсдда(сйдд1аад1с(сс{даадада1сШда1дссйдаадаа{сацас 1д{д§а(с1ддййдас(§с(:са1сс1асгсад1с1д18сд1ада1сайдсйсад аадса1дддадда1аадддас(д1сйдс(саас1с1а1дсааад§асайасТ сс1д.а1дасаа§саддадс(ада1дад1с1с1дсааадададайсаадс1:дс айссдаасада^дадайадаадаасассШсаассссасаадагдааа^а дадс1ддаа1дадйа(йссасдадасааййддааадд1д1ссссаадйсй дсдссд1д1ддасасадс1с1дааааасаПдддайдагдаасд1дйссйа саа1дссссайдайсаайс1сйсд1дда1дддсдд1да1сд1да1дд1аа1с сдаддд1сасасс1дадд(сас1адада(д18(дсйдйддс1адаа1да1дд с1дссаа1с1с1ас1агаассааа1сдадаа1с1дагеда:§адйа1с1а1д1ддс дйдсас1да1даайссдхд1дсдддсдда1даас1дсасаддаасгсааод ааада1дс(£саааасайаса1адаайсХддаадасаайсс1ссаас{дад сса{асс£1д(дайсНдд1§а1£1:дад£да1аадсйд1а1сасасас2(дадс дйссс£ссаай£с1да£1аа(д£аа1с1сдда1аисс1даадаа£с1ассйс ас1аа1дХддаасадйсйддадсс1сйдадс1с1£йасс£а{сас1а1дйса 1д1§д1дасадсссда1а§с1да1ддаадссйсйдай1сйдаддсаад1с1 с(ассШддас(сгсссйд1дадасйдаса(саддсаадад1с1даасдсса саса£аТд(сйдда(дсГа1сассаадсасйддаса(сддйсс(:сс1а(ада дасХдд1с1даадааддссдасаддаа/ддсПсП§с1даас1аадсддсаа асд1ссасЦЦсддасс1да1с11сссаааассдааоааай1с(да1д1:сс1дд асасаПсааад1са1а{с(8адс(дссйсадайд1й1ддадсЙа1а11а1с(с1 а(ддсаасйсасс1ад1§а1:д1дсйдсддйдадсййасадсдсдаа1дсс а1д1дааааа1ссасйададйдйссас1сШдадаадс1адс1да1с11даа дсадс1сс(дссдс1дйдсаадас(сШ1сха1адас{дд1асааааассд1а1 1аасдд1хааасаададдйа(даПддйас1садайсадддааада1дсадд дс8К(с(садс1дсйдддадс(а1асааадс{саадаададсйд1£ааддт (дсйшдааага1ддад1даадс1аас1а1дйсса1ддссд1дд1д.дсасад1 сддаададдадд1дд1ссис{са1сйдс1а1айд1с1садссассада1аса дйаа1§дс1с1сйедад{сасддйсаддд{даад{сайдадсаа(сай1дд ддаддсасасйа1дстйадаасасйсаасдгйсасадсадс1ас1с1адад сасддаа(даассс1ссдаШсассаааасссда§1ддсдГдсЙ1:дсйда1 дааа{ддсддйдйдсаас1даддаа1ассда1с1дгсдййссаадаасс1с да11сд1сдац1а1йссдсс1сдс(:ас1ссд§адс1:§§ад1а1ддасд1а1даа
- 61 019514
1ай8§аа§1а2ассйсаааёс8аааассаа§с§§1§§§а{с§аа1с1с(сс £1£саа1ссса1§£а1сШ§сй££ас§сааасаа£аПсса1сПсс1£1а1£8 (и&|2£ЙС£§а§са£сай1а£ё(а1£С£акаа8аа§£а181£а£ааассПс аса1£с1есаа£а1а1^(ааасаа1§£сссишсс£а§1сассахс£а1сха аи§ааа1§2.1ёйс§сса১,§а§асссс§ё§а1с§с1§сй181ас§асааа сйсйдк1са§аа{’аШа1§§£сШ1£§а§а£аааска§а§ссаасй1§а1 §ааассаа£аасс1с£1сскса£ас1:§с1£§аса{ааа§ассйсН£а১ а§аксйасй§аааса§а@ас(а১с1ас21^ас1сйасайас§ассс1с аас£йй£;ссаа£сс1асасайдаа£а£§а1сс£1§а1£сааас1асаа1]’Т(’ ас1с1ёсёассасаса1йс1аааёа§а1еа1§саассаа§сааа1са§сасаа §а8скщсаа£сйаассссас£а§1£аа1ас£сзсс1£дасйза§£'асас асйа1сйаасса1§аа8е^ай§с1§с১ай§саааасасс§§йаа§1§ а^са^§ааа§аааасаааасйс£аа1скк1йШакГасссйШаа1аа1 скШ1Шс(а§аа1ссаааагаайас§§й^§айасадХйасШа12Ха1сса сс2Н§аааТсйаа1сйссай£(акааас2(сас1§ас{с(§й1с(£§аа§1§ (ааасааяаасаяаяасаяЩаакйаакЙакйсШякЖкй
РРС4 8Εζ) ГО N0:15 Αί1β68750 асаа1§асе§асасааса5ас§аШс§саёа§§ааа1с1сайссааа§сй с5аа§а1§ай£сааайёс1с5§1а£1с1сйсса1§а1£(:§йасааа§£§аа §й§§саасссайса1§§ааааа^с§аас§сайс§§айсй§с(са§а§1д сзйаааШдс£Та{£2с1дй:ай£а££а1асс2сааассйй£яа£аа£;са ай£ас{а§1§ааашссаааа1:§ссас1а§аа§аа£ссйаасёй§ёс1;с51 асайсас1сайс1сйаасйаа18§8сай8са§асаска1саса8аа1§са сааа^сса1аас§йасасаасй§саа£а{сй51ёа1§аШайса§сса{’с 1айдсааая(2§аа(с1с1сса§ас§аасй1а1аааас1§Ш§сааас১;а §§к§ааай£йсйас1§ска1сс1асссааа1ааа1с§аа§аассй§са^ асаа§са1айа£аай£с1сакйс(а5аа1а1аасас1а£ака£а1с1аа£с 8й§аа§ак§с§ааасёс1сай§аа§ай1ё£йава8а£айасйсас1§18 £сааас1§а1£а£сйа£ас£1;са£ааасс1аскса£й8а1£аа£с1а§а§с 1ц(йс1аааса1а^§£а§саа1ссс1й§5ааа§са£йассасаа1асс1§с£ 1с£10са§саайсси§ааеаа£шс১£аа§ссасйссас1:ааса1:£с ас1сс1а18аааЙ1яе,йсй2!’а1;§£§а££1£а1а£а§а1££ааа(ссааа1ц касё8сааа£$сас£ааа£аа]йак1с1сй§к1а§а1§£а1§(’с1ай£а Ш£{аса1аа£а£а2£й2а1л2СНаа8аШ8ааНакШс£8ак£а(£са £1§а(а2£ййсаа§айа£с1£а1аааайсГ1§аааа£ёайа1£а1а§а§§а ааа1сааатссаааа§саасааа§йса:саГ§сй§ссаасасаасйсса2 с(а§а§скассйсс1§сй§сай§асШ§§(§аа1сас§аса1ассааай(ё ааай£с§ас§аса§айа1а1£;ссасссаай:1сса£аа§са§аа1£аасаа §асййс£§ааа§с£ас1££§а§аааай§асаа1:§§йс§с§§1сс8§кй асйс1с§а8§йсй1с1са1с1асйскаасйсйс1сса§а§аааас1ат§а цяаа1с(са2ёйя§яаа2асТацШссаааадс1ас1адаассасс1ссасй ааасёа£с1£§аа218с(ссйак§4ай§йсйё£а£аа§1аааа§аааа§с йЯ1§ааяасааяааяасйсй§аасйсйайе.১д1сйсс11я1ёаё1а1ц ассс1ааааас1сс1а1§аааса1са§а1са§сйсй§аассай§с1сск1§й ас£аа1с1с(ясаака(с£^цс1а8Ц8ксШ8С1даЕддасдасйкс(£ а(й8айсдга£а5й1с(ассй1§§аа1§яййедТдааас1с§асйас8сс а2£аа@,с1§саа§асайс1яааяс111ёёа^оаайасааса1ас駧а1а1 25ё1ас[Еаия{£аа1£§£а12.ааяа£;ааяаааЙаааагт1:§асаа£а£а ас{ааа১§ааас§асс1сЙ£йсскааТ£1аПаа§£й££1сс1§ас£1са аа£аа^ай§£асасай£с§а§1с§с1£с1§аасйё£аа§1даа(:сасй£ дсесйас§йашс1а(д§сйсааа1§саа^§а1^сс1сёс1§1§ёаасн;с Йсааааа§а1§с1с§асй§с1йаас1а§с§ааса1§2аааасса1§1сс1§§ ^2аас§с1асёа§Сё81асс1сйй1§ааас§е1§аа1§аШаа§аяссяс1
- 62 019514
§§1ссйсда1аад§аааи§с1с1саа1сдайдд1а1১§аасаса1ссааа адаассасаас§§1сассаададд(§а1§дйд§а1ас1с1§айс1§§аааа §а1§с1д§ас§ййас(дса§са1§§даас1с1асааа§с1саадаааа1§йё Й§с1дсй§1аа1§аай1§§аа1саааа1аасайай(са1ддас§ад§а§да а§сайд§1сд1д§1д§1§§1ссаасс1а1с1с§с1айсадТсссаассассад §сШ§1аа1§д§с1сМ§с§йсаас1§адса১1§а§а1§§йсаа§с1аа дШдд§а1ассасааасддс1§йаддсаас1а§адд1а1асасаассдсд§ Йс1ас1сдс1ассйааа@сскскадссасс1сдада§дааааа1ддс§аа ассиа1§§аа§ааа1с1с1ддаа1садй§ссаасас1аи§аа§саса§1§1 а1§аааасссада§й1с1а(:сйаййса1§а§дсаасассдсаадсадаасй §дШсс1саа1а1а§ёаа§ссдассаасасдаа§ааа§а§с1с1а§1§даа1 аддаса1с1сс§адс(а1сссйдд§1сй4§сй§дас1саааса১й1§йс{ 1сса§с駧сй§е1§1а8§§§с18§таа১ёа§тс1§а§ааё§§1са1 §с§§а1да1сйааа§ада1д1асааадаа1дёссаШШсад1ссасссй§а асйа1а§а§а1§§1дйа§с(ааа§садасайссаа1дассааасас1асда с§аасаасй§(§1с1§адаааадаацад§ас駧сас1дадс1аа§аааад аас1аа1дас(ас1§а§аа§1ас§йсйд1да1аа§1д§1сас§адааас1сй §с১асаа1аа§а§сй§аа§ааас1сай§а1ад1а§асйссд1а1с1саас §саа1§ааса(дйасаадидааайсйаадад§сиадас§1да1даада1а асаа1аа§с1аада§а1§с1Х1§сйа1сасаа(саа1д§1айдс1дсаддаа1§ а§ааа(асс§§йаа
КВС8- 1А 8Е(} Ю N0:16 АН §67090 1са§1сасасааада§1ааа§аа§аасаа1§дсйсс1с1а1§с1с1сйсс§й ас1а18дй§сс1с{ссддс1саддссас1а1д§1с§с1ссй1саасд§асйаа §1сс1ссдс1дссйсссадссасссдсаад§с1аасаас§асайасасса1 сасаа§саасддс§даададйаас1§са1§с১1§1§§сс1ссдайдда аадаа§аадй1да§асШс1сйассйсс1дассйасс§айсс§аайд§с1 аад§аадйдас1ассйа1ссдсаасаа§1§§айссй§(:§й§ааисдадй §§а§сас§даШ§1§1асс§1дадсас§ё1аас1сассс§§а1асШда1§ дас§д1ас1§§асаа1§1§даа§сйсссйдйсд§й§сасс§ас1сс§с1с аа§1§й§а১аа§(:§§аадад1дсаа§аа§дад1ассссаа1§ссйсай ১а1са1с§§айс§асаасассс§1саа§4сса@1§са1са§й1сай§сс1 асаадссассаадсйсассддйаа1йсссй1дсйй§1§(ааасс1саааас й(а1ссссса1с(йдаййа1сссйдйШс1дсйййсйстсйдддййаа1 Йсс§§асйаас§Ш§ийсс§§1и§с§а§аса1аШ;Ш1с§§аШ:1саас1 §1с1§а1дааа1аааШ§1аа1§йс1а1аа§1сШсаат§а1а1§са1а1саас ааааа§аааа1ад§асаа1дс§§с1асаааШ§ааай1асаа§1йаа§аас са1дад1сдс1ааадааа1сайаадаааайад(йсас
КВС81В 8Ε(2ΙΟΝΟ:17 Αί5§38430 а1Саддсаааадаадаадаа§аа§аа§1аа(§дсйсс1:с1а1§с1с1сс1с1§ сс§с1д1§§йасс1сссс§§с1саа§ссасса1§§1с§с1ссайсас1ддй1 даа§1са1сс§сйсШссс§§4сассс§са১ссаасаасдасайасйс са(сасаа§саа1дддддаададйадс1§са1§а১1§1д§ссассаа(с §§ааа8аадаад1й§а§ас1сШсиасс1ссс1§ассйас1§ас§1сдаай д§с1ааддаадй§ас1ассйс1ссдсаасааа(д§айссй§1дй§аайсд а§й§§а@сас§ §ай1§1 §1асс§1§а§сас§ §ааасас1 ссс д§а!ас1ас §а1§§асд§1ас1§§асаа1§1§§аа§сй:ссай§йс§8а1§сасс§ас1сс дс1саа§1дйдааддаадй§аадаа1дсаа§аад§а§(асссдддсдссй сай১а1са1сд§айс§асаасассс§1саа§1ссаа1дса1са§Шсай §сс1асаадсссссаадсйсас1оа(дсйааатссПйс12,даа(аПсаа1д1 1дас1а1сс§даасссааййд1а1ддГсаа1§1ааай1аа§1аайаййдсса аад1§аааааас1§а১т§Шйс1а1с§Шсс1с1а1ааааа1с(с1айса1 а1сасйсажс1§с1сйа1сасййаас1сйшайс§ййа1с1сййаас1аас айЙа§йссй(аааШс(с1сс1а
- 63 019514
квсз- 2В 8Ε()ΙϋΝΟ:18 А!5ё38420 саа§1аад1аа§а8ааааассаааадаадаада@ааасаасаа§аадаад( аа1ддс(1сс1сСа1д11с1сс1ссасс§с(£1§дПасс1сссс££с1сааосса сса1дд1сдс(сса((сассддсИдаад1са(сс8сИс1йссс8д{сасссд сааддссаасаасдасайасйсса!сасаадсаасддаддаа§адйадс1 §са!даадд1д1ддссассаа1сддааадаадаадй1да§ас1с!а1сйасс 1ссс!§ассйа£1§ас£й§ааП§§с!аа£ёаа£йдас!ассйс!сс§саас аад18§айссйд1дй§аайс§адйддадсасд§ай1д1д1асс§1§адса сддааасас!ссс£(’а!ас1а1§а1£§ас£а1ас1§§асаа1£(ддаа(’с!1с сайдйс§ёа1дсассдас!ссдс!саад1дй@ааддаадйдаадаа!§са ада১ад1ассс1:§дс§ссйсайад8а!са!сддайсдасаасасссд1с аа§!ссаа!8са1са§шсайдссгасаа£сссссаа£сйсассе:аае;сйа а(ссссЙСс1§£аа(аЦсадс§йдайайс1ддаасссай1с(а(д1д§Хсаа 1дсааай1аа§ааайаШвссдасйаасадПдаддаас1ай§тдааад1 даааа!§ДаНсс!а!садй1с!с(а!ааЙа(адПа!са1йсаШсаШидссс йааа1сш§ааа!сйайй!с§й(:адс1ссй!ааасаасайд!ддс1ссй1аа айа1сс!са1аайсйдс1
КВС8ЗВ 8ΕρΐϋΝΟ:19 А!5ё38410 ££8с!Мс§ссШа£§§££11с1сааа1а1ааа2а1§асаасассад!а§8а ааасаад1сад1аа§1ааасдадсаааадаа8аада§ааасаасаадаа§1 ад!аа1ддсйсс1с1а1дс1:с!сс1сс8ссдс!д1ёдйаса!ссссд8с!сад дссасса!дд!с§с1ссайсассддсйдаад!са1ссдс!дсайсссдд!с асссдсаадассаасааддаса1сасйсса!сдсаадсаасдд䧧аада дйадс1дса1даадд!д1§дссассаай§дааадаа§аадй1дадас!с!а 1сйасс!ссс1§ассйа§1£асд1с§аайддс1аа§даадй§ас!ассйс1 ссдсаасаад1ддайссйд1дйдаайс§адйада§сасддааасас1сс сдда!ас!асда!ддасдд(ас1д§асаа!§1ддаа§сйссайдйсдда(§ сассдас1ссдс1саад!дйдааддаадй§аадаа!дсаадаадда§1асс сдддсдссйсайаддаЮаЮддайсдасаасасссдЮаадГссаа^са (садй!сайдсс1асаа§сссссаа2,сйсассдаадсйааШсйКс!ааа асайсйа1даайа!с!с!§с!са!йсай1сс1айд1с1£1дйсйй(с(сйи1 дадасаа1йс{а1сддайд1сааа1д(с1дай1а1даа1а1д1аа1иаСа1а1сс §1£с8!сй£айййсс£а!§£йаас!а£й1£ааааи1сс£а(§а£а1аадас ааса1асаааааа!с§аа1ааай£1§!ааа!а!ада!аа1а§1даса1а1£§ай 1§1айса(:ай!д1ссайдййаада£8аааааадйасаааа1сйаййсйаа 1аа1аад1ааай1ас!й
Пример 6. Примерные карбоангидразные ферменты для регуляции поглощения СО2 и эффективности использования воды растениями
Настоящее изобретение обеспечивает композиции и способы для понижающей регуляции или уменьшения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающие т!ег а11а применение полипептида, имеющего карбоангидразную активность. Кодирующие карбангидразу нуклеиновые кислоты из любого гена карбоангидразы, например, генов растений или бактерий, могут быть использованы для применения на практике этого изобретения; например, может быть использована нуклеиновая кислота из любого гена карбоангидразы любого растения, в том числе любая кодирующая карбоангидразу последовательность нуклеиновой кислоты из семейства генов АгаЫборык, например, любая кодирующая карбоангидразу последовательность нуклеиновой кислоты из семейства АгаЫборык, например из АгаЫборык ШаНаиа, может быть использована для применения на практике композиций и способов этого изобретения, например, примерные кодирующие карбоангидразу последовательности нуклеиновых кислот:
- 64 019514
Названиеактивность 8Εζ) 10 N0: и СгепВапк Νο. Последовательность
СА2 Полноразмерная длина ΑΐβΟΑ2 кДНК 8ЕРГО N0:20 А15§14740 ааа1ададаадс1еисаа§1а1сс§а1дйтдшаа(саасаада§2с§2а§а1 ас88£а§аааа§са^§1аа1са1аааа1^а§а1£йа§сйс£1с[г1ййас1а1 а§Шадйс1сНс11сйспййсд1сайасаа1с1с1йсйааШасйсйсйда1а 81а1аайаадй§й1§1аа1аа1с1д1асааада1§и:д(:дйс1са1аааааайсаа 1Ш£1ааадаадс1с1аса1дЦссй£с(с1д1аааса1дд(ссссйпддас1аса §ШсТсдаааХддс1са(са§ас(сайадас^ас1с1ссаа1с1дс1(саааадсс асаааасад(а(ааа1а1ссЙс1снс§1ссс[с1са1сдсс1е.1с[сТсс1сйсс(с1 1сссдйссайСа1ссдсааасддадсй§ййсдд(8сасс1дсйсадссас11с ааас11£аас1:§а£а১а1:£§§;ааас§аа1са1а(даа§ас£сса(сдаа§<Лс 1саа£аадсйс1сайда£аа£за1оагст§аа£§а1:д(а§с1£с8£ссаа§д1£ аадаадагсасддсддадсйсаддсадссЕдКаиддасадсаааШШд аМссдЕдаасдаайааддааддсйсдйассйсаадааддадааагасда §ассаа1сс1§сй1£(а1§£1£адс1с2ссааа£]£1:сааадсссааа£1аса(£8 1£й1е.сй8йс£.§ас(сасдад1§г8ссса(сасас8тас(а£асйсса1сс1§д а§агдссис§4ддйс§1аа1а1:сдссаа1а1д§йсс1ссййдасаа§дгсааа1 а1£са§дадП£§адссдсса118ааТас§сТ£1с11дсассПаадд1дёаааас айд1§д(да1а8ддсасад(дса1д1д§188са1сааддддсиа(д(сатсс1с идасддааасаас1с1ас(дасйса1ададааНддд[саааа1с1д1иасса2.с ааад(саааадйиддеа£ааадфааа£ЦсадсаН1£аадассаа(«(.£дсс 2а1§с§ааа£§(>а£§са£18аа1£1£1сас1а£сааасс1а11:§аса1а1ссаЩд Тдададааддадйд^аааддаасасЙдсШдаацддаддсТас^афасШ дйааГддс1ссй1дадстдддадс1ссадШддаа1йсссссдйсайсГа1а( даасгаасаса(сасса1сасса1сдс1ассассасса1сасаааса1саТса1сд1 с§1са1са1са1да1садса1с11са(аШ1ааа1яййас1сйаШаайдс1асид1 аа1§дШасаШасЙёсда1§адс11сШ1ссисайа1ссадиа1аааа1ааа1а аа1ааа1са1дШасШсасада1а1сдййдс1£аадйасШ2ат
Полноразмерная длина А1«СА1 кДНК 5Е0Ю N0:21 А1СА1 (Αΐ3β52720) АТОСАОТААТСТОАТААААСССТССАСАОАОАТТТ ССААСААААСАООААСТААААСАСААОАТОААО АТТАТОАТОАТОАТТААОСТСТОСТТСТТСТССАТ ОТСССТСАТСТОСАТТОСАССТОСАОАТСгСТСАОА САОААСОАОТАОТОТТТООАТАТАААООСААААА ТООАССАААССААТООООАСАСТТАААСССТСАС ТТСАССАСАТ6С0С00ТС00ТАААТТ0СААТСТСС ААТТОАТАТТСАААООАООСАААТАТТТТАСААС САСАААТТОААТТСААТАСАССОТОААТАСТАСТТ САСАААС6СААСАСТА0Т6ААССАС0ТСТ0ТААТ 0ТТ6ССАТ0ТТСТТС0600А060А6СА00А6АТ6 ТОАТААТАОААААСААСААСТАТАССТТАСТОСА ААТОСАТТООСАСАСТССТТСТОААСАТСАССТСС АТООЛОТССААТАТОСАОСТОАОСТОСАСАТООТ АСАССААОСААААОАТООААОСТТТОСТОТООТО
- 65 019514
ОСААОТСТСТТСААААТСООСАСТСгААОАСтССТТТ ССТСТСТСАОАТОААООАОАААТТООТОААССТА ААООААОАОАОАСТСАААОООААССАСАСАОСА СААОТСОААОТАООААОААТСОАСАСААОАСАС АТТОААСОТААОАСТСОАААОТАСТАСАОАТАСА ТТООТТСАСТСАСТАСТССТССТГОСТССОАОААС ОТТТСТТООАССАТССТТООСААООТОАООТСААТ ОТСАААССААСААОТАОААСТАСТСАОАТСТССА ТТСОАСАСТТСТТТСААОААСААТТСААОАССОТО ТСААССССТСААСООССООАОАОТТОАОАТОТТС САСОАССАСОАОСОТОТСОАТААААААОАААССО ОТААСАААААОААААААСССААТТААААТАОТТТ ТАСАТтетСТАТТООТТТОТТТАОААСССТААТТА ОСТТТОТААААСТААТААТСТСТТАТОТАОТАСТО ТОТТСТТОТТТАСОАСТТОАТАТАСОАТТТССААА Т
Полноразмерная длина АШСА2 кДНК 8Еф ГО N0:22 А(аСА2 (А12§28210) АТООАТОААТАТОТАОАООАТОААСАСОААТТСА ОСТАСОААТСгОААССААСгАОААССЮОССАОСОА ААТООООАААОСТААОАССООААТСОААААТОТО СООАААА6ОАОАААТОСААТСОССТАТТОАТСТТ АТОААСААААОАОТТАОАСТТОТТАСТСАТСТТАА АААОСТТАСТАОАСАСТАСАААССТТОТААСОСС АСТСТСАААААТАОАССССАТОАТАТОАТОСТОА ААТТТООАОААОААОбОТСАОООАОТАТТАСООТ СААТООААСТОАОТАТАААСТСТТАСАОСТТСАТТ ООСАТТСТСССТСТОААСАТАСТАТОААТООААСА АООТТТОСТСТСОАОСТАСАСАТООТТСАСОАААА САТТААСООААОТТТСОСТОТАОТСАСАОТССТСТ АСААААТСООААООССАОАТТСТТТТСТСООАТТО СТСОААААТАААТТОТСООСААТТАСАОАТСААА АТОАООССОАОАААТАТ6ТАОАТОТОАТТОАССС ААОСОАТАТТААОАТТОООАОСАОААААТТТТАТ АСгАТАСАТТООАТСАСТТАСТАСТССТССТТОТАС ОСААААТОТТАТТТООАССОТСОТТАААААСЗОТА ААТАСТСАТСОТТАТТТТСТТСТСТТТТТТАСТТАА ТСАААСАТАОСАТТААГАОАТСАТТАСААООТАСТ ААТАСТОТОААТАТССАТАТССААААООТТТАТСС АТСТАСАТОТТА
Полноразмерная длина А1аСАЗ кДНК 8ЕЦ ГО N0:23 А1аСАЗ (А15о04180) ААААСАСАТТСТОАОААОААОААОААСААААТА АОААААААСААААОАТОААААССАТТАТССТТТТ ТСТААСАТТТСТТОСТСТТТСТТСТТСАТСТСТАОС СОАТОАОАСАОАОАСТОААТТТСАТТАСАААССС ООТОАОАТАОССОАТСССТСОАААТООАОСАОТА ТСААООСТОААТООААААТТТ6СОООАСАОООАА ОАООСААТСОССААТСААТСТТАСТССАААААТА ОСТСОСАТТОТТСАСААТТСТАСАОАОАТТСТТСА ОАСАТАТТАСАААССТОТАОАООСТАТТСТТААОА АСС0Т00АТТС0АСАТ0АА00ТТАА6Т000АА0А СОАТОСАОООААОАТСОТСАТСААТОАТАССОАС ТАТАААТТООТТСАААОССАСТОССАСОСАССТТС АОАОСАТТТТСТССАТ6САСАОАООТТОССААТО ОААСТТСАСАТООТАСАСААААОТОТАОААОСОС
- 66 019514
АСТТООСАОТОАТТ6ОАОТТСТСТТСАОАОАА6О АОААССАААТССТТТСАТТТСССООАТСАТООАСА АОАТССАТААОАТСОСАОАС6ТАСААОАТООАОА бСТСАССАТСССАААОАТАСгАТССААСАСААТТТ ООАТОООАТСТТАСАААОТТТТАТОААТАСАОАО ОТТСТСТСАСОАСТССТССТТССАСОСААСАТОТС АТОТООАССАТСАТСААСААООТООООАСТОТТТ САСОТСАОСАААТТОАТаТАТТСАСАОАТССТСОТ СОСООТООТТАТОАОААОААСОСОАОАССАОСТС ААССТСТОААССОАСОТСТООТТТАТТТАААСОАО САОТССАОТССААОТССААСТССАСООСТААОАА ТАССАСОАСТТООТССООТСТААОАСАОТСТТАТА ООАСААООСААСТССОАОСССТААТТТССАТАСА ААОААААТТСООААААОААТТГТОААОАТОТАТО ААААТТООСАСССАТААСТАТТТТТТТТТААСТАТ ТСТТТТОАТТААААОАТААААСТАСОСААТАТТАТ АТССАТАААОТТТТТСТТТТАТАСАТОТАТТССААТ АААСААОАТ6ТААТААТАТССААССАТААТОАОТ ТОТТТОАТТАТТТТАТААСАСААОАТСТСТСАС
Полноразмерная длина А1аСА4 кДНК БЕС) ГО N0:24 А1аСА4 (Αί4§20990) АТ6САТАССААСОСАААААСААТТТТСТТСАТООС ТАТОТОТТТСАТСТАТСТАТСТТТСССТААТАТТТС АСАСОСТСАТТСТОААОТСОАСОАСОАААСТССА ТТТАСТТАС0ААСААААААС00АААА600АССА0 АОООАТОСООСААААТАААТССОСАСТООАААОТ ТТОТААСАССССААСАТАТСААТСССС6АТССАТС ТТАСТААСОАААОАОТСАОТСТТАТТСАТОАТСАА ССАТССАСААОАСААТАТАААССАССТССО6СТС ТААТТАСАААСАОАООССАТОАСАТТАТООТАТС АТООАААООАОАТОСТОООААОАТОАСААТАСОС ААААСООАТТТТААТТТООТССААТОССАТТООСА ТТСАССТТСТОАСтСАТАСССтТТААССЮААСТАСгСтТ АС0АССТА0А0СТТСАСАТ66ТТСАСАС0А0ТСС АСОАООСАОААСТОСООТТАТСООАОТТСТТТАС АААТТАССССААССТААТОААТТССТСАССАА6С ТАСТАААТООААТААААОСАОТСООАААТАААОА ОАТАААТСТАОООАТОАТТОАТССАСОАОАОАТТ АООТТТСАААСААСААААТТСТАТАОАТАСАТТО ОСТСТСТСАСТОТТССТССТТ6САСТОААООСОТС АТТТСЮАСТОТСОТСААААОООТОААСАСААТАТ СААТООАССАААТТАСАОСТСТТАООСААОССОТ ТОАСОАТООАТТТОАСАСАААТТСААОАССООТТ СААОАСТСАААОООААОАТСАОТТТООТТСТАТО АТССАААТОТТТОА
Полноразмерная длина А1аСА5 кДНК 8Е0 ГО N0:25 АШСА5 (АН§08065) ОАТСААСАТСТССТТОААОТТОТТТСАТААОААТА АСАССТАТААААСАООАТААААССААААТТТСАА ТТТТТТТСТТСТАТСТСТСТССССААСгАТАТАТАОС АСААОААААТОААОАТАССАТСААТТООСТАТОТ СТТТТТССТТАТСТТСАТСТСТАТТАСААТТОТТТС ОАОТТСАССАОАТСАТООАОААОТТОАОСАСОАА АСОСАОТТТААСТАСОАОААОАААООАСАОААС СООССАОАОААСТООООААОАСТАААСССАОАО ТОООСААТСТСТСОААААСССААСАТОСАОТСТС
- 67 019514
С0АТТ0АТСТТАС00АСААААСА6ТСТТ0АТТ0АТ САТААТСТТООАТАССТТСОТАОССАОТАТТТАСС ТТСАААТОССАССАТТААОААСАОАООССАТСАТ АТСАТОАТОАААТТТОААООАООАААТОСАООТТ ТАООТАТСАСТАТТААТООТАСТСААТАТАААСТТ СААСАОАТТСАТТООСАСТСТССТТССОААСАСАС АСТСААТСОСААААСОТТТОТТСТТОАООААСАС АТООТТСАТСАОАОСАААСАТООАСОСААСОСТО ТТОТСОСТТТСТТТТАСАААТТОСгОААААССТОАС ТАТТТТСТССТСАССТТООАААОАТАСТТСгААОАО ОАТААСТОАТАСАСАСОААТСССАССААТТТОТС ОАОАТООТТСАТССТАСААСАТТССОТТТТОААТС ААААСАСТАТТАТАОАТТТАТССгСгАТСАСТТАСАА СТССАССОТОТТСТОААААТОТОАТТТСОАСОАТТ ТССАААОАОАТСАССАСТОТОАСАТТААААСААТ ТОАТСАТОСТТССтАОТСАСТОТАСЛСОАТСААТСТ ААСТСАААТОСТАОАССОСТТСАОСОТАААААТО АОСОТССООТОССАСТТТАСАТАССААСАТ6ОСАТ АСТАААСТАТАТТАААТАТТТААОТТТСОТТТАТА ТТСТТТСТАОТААТСТТТОАААТАТТОТААОАОАТ ААтеСТТСТААТАААТААСАТТСаАТТТАТТССАА ТТААТОТАТТОААААААСТАТОСАААТАСТАСАОТ ОТАТТТТООААСОАСС
Полноразмерная длина АйхСАб кДНК 8Еф ГО N0:26 А1аСА6 (Αΐ4§21000) АТООАТОССААСАСАААААСААТТТТАТТТТТТСТ АОТСТТСТТСАТСОАТТТАТТТТССССТААТАТТТТ АТГССТТТАТОСТСОТОАААТСООСААСАААССОС ТАТТТАСАТАСАААСААААААСАОАОАААООАСС АСССОААТССОССАААТТАСАСССТСААТССААА ОТТТОТАОСАССООАААААТТСААТСТССОАТТОА ТСТСАСТОАСОАААОАОТСАОТСТТАТТСАТ6АТС ААСССТТОАОТАААСАТТАСАААССАОСТТСООС ТОТААТТСАААСтТАСтАСГОАСАТНАСОТТАТСтСТА ТСОТООАААООАОАТООТОООААААТААСААТАС АТСАААСООАТТАТАААТТО6ТОСАОТОССАТТО ОСАТТСАССОТСТСАССАТАССАТТААСОСААСТА ССТАТОАССТАОАОСТТСАСАТООТТСАСАСОАОТ ОСТАСТОССААААССАСТОТООТТООАОТТСТТТА ТАААТТАООТОААССТОАТОААТТССТСАСАААО АТАСТАААТООААТААААООАОТАОСОАААААА ОА6АТАОАТСТАООААТСОТООАТССТСОАОАТА ТТАОАТТТСАААССААСААТТТСТАТАОАТАСАТТ ООСТСТСТСАСТАТТССТССАТОСАССОААОССОТ ТАТТТССАССОТССАОААААОСОТАТТАТАТТТТТ ТТТОТТТСТОТТАТАОАТТААТТАТСТТСОТТАСАС СТТАСАТАААСАТТТТТТООАТТТТТОТТТТТОТАТ ТТТООТСТАТОСТААТОТАА
Полноразмерная длина А1аСА7 кДНК 8Е0 ГО N0:27 А1аСА7 (АН §08080) АТООТСААСТАСТСАТСААТСАОТТОСАТСТТСТТ ТОТСОСТСТОТТТАОТАТТТТСАСААТТОТТТСОАТ ТТСОАОТОСТОСТТСААОТСАССОАОААОТТОАО ОАСОААСОСОАСТТТААСТАСААОААОААСОАТО АОААОСЮСгССАОАОАОАТООООАОААСТТАААС С6ОААТС6ОАААТСТСТССААААСОАСАОАТ6С
- 68 019514
ААТСТСССАТАОАТСТТАТОААС6АОАОАОГГАА САТТОТТТСТСАТСТТООААООСТТААТАОАОАСТ АТААТССТТСАААТССААСТСТТААОААСАОАОО ССАТОАСАТСАТОТТААААТТТОААОАТООАОСА ООААСТАТТААОАТСААТООТТТТОААТАТОААСТ ТСААСАОСТТСАСТООСАСТСТССОТСТОААСАТА СТАТТААТООААОААООТТТССАСТТОАОСТОСАТ АТООТТСАСОААООСАООААТАОААОААТОбСТО ТТ6ТОАСТОТ6ТТОТАСААОАТСООААСАОСАОА ТАСТТТТАТСАОАТСОТТООАОАААОААТТАОАО ООСАТТОСТОАААТООАОСгАООСТОАОАААААТСг ТАООААТОАТТОАТСССАССААААТТААОАТСОО ААОСАОААААТАТТАСАОАТАСАСТООТТСАСТТ АССАСТССТССТТССАСТСААААСОТТАСТТООАО СОТСОТТАОАААСОТТАООАССОТОАСААСАААА СААОТОААОСТССТССОСОТОССАОТОСАСОАТО АТОСТААТТСОААТОСОАОСССООТТСААССААС СААСААССССАТАОТССАСТТАТАСАСАССААТА СТТТААТАТАТОААСАТАСТСАААОСТТТТАСТАА ТС
Полноразмерная длина Λΐα€Α8 кДНК 8ЕЦ ГО N0:28 А1аСА8 (Αΐ5§56330) АТОААОАТАТСАТСАСТАООАТССОТСТТАОТССТ ТАТСТТСАТСТСТАТТАССАТТОТТТСОАОТОСАСС АОСАССТАААССТССТАААССТААОССТОСАССА ССАССТАСАССТССТАААССТААОСССАСАССАО САССТАСАССТССТАААССТААОСССАААССАОС АССТАСАССТССТАААССТААОССТОСАССАОСАС СТАСАССТССТАААССТААОСССОСАССА6САССТ АСАССТССТАААССТААОСССАААССАОСАССТА САССТССТААТССТААОСССАСАССАОСАССТАСА ССТССТАААССТААОССТОСАССАОСАССАОСАС СААСАССАССАССОАААССТАААССТОСАССТАА АССАОСАССАООТОСАОААОТТОАООАСОАААСС ОАОТТТАОСТАСОАОАСОАААООАААСААООООС САОСОАААТСЮООААСАСТАОАТОСАСгАОТООАА ААТОТОТООААТАООСААААТОСААТСТССТАТТ ОАТСТТСОООАСАААААТОТСОТАОТТАОТААТА ААТТТООАТТОСТТСОТАОССАОТАТСТ6ССТТСТ ААТАССАССАТТААОААСАОАООТСАТСАТАТСА ТОТТОАААТТСАААООАОСАААТАААООТАТТОО ТОТСАСТАТССОТООТАСТАОАТАТСААСТТСААС ААСТТСАТТООСАСТСТССТТСССААСАТАСААТС ААТООСААААООТТТОСОСТАОАООААСАСТТОО ТТСАТОАСАССААА6АТАААСССТАСОСТОТТСТ СОСАТТСТТАТАСААТСТСООАОСАТСТОАСССТТ ТТСТСТТТТСОТТООАААААСААТТОААОААОАТА АСТОАТАСАСАТОСОТССОАООААСАТАТТСОСА СТОТОТСААОТАААСААОТОААОСТТСТССОТОТО ОСТОТАСАСОАТОСТТСАОАТТСАААТОССАООСС ОСТТСААССАОТСААТААОСОСААООТАТАТТТАТ АСАААССАААООТТААОТТААТОААОАААТАСТО ТААТАТААОТТСТТАСТАО
- 69 019514
Полноразмерная длина АфСА1 кДНК 8Е<2 ГО N0:7 А1рСА1 (Αΐ3§01500) АТОААОАТАТСАТСАСТАООАТОООТСТТАОТССТ ТАТСТТСАТСТСТАТТАССАТТ6ТТТСОАОТОСАСС АОСАССТАААССТССТАААССТААОССТОСАССА ОСАССТАСАССТССТАААССТААОСССАСАССАО САССТАСАССТССТАААССТААОСССАААССАОС АССТАСАССТССТАААССТААОССТОСАССАОСАС СТАСАССТССТАААССТААОСССОСАССАОСАССТ АСАССТССТАААССТААОСССАААССАОСАССТА САССТССТААТССТААССССАСАССАОСАССТАСА ССТССТАААССТАА0ССТССАССА6САССАССАС СААСАССАССАСССАААССТАААССТОСАССТАА АССАОСАССАООТООАОААОТТОАООАСОАААСС ОАОТТТАОСТАСОАбАСОАЛАОбЛААСАЛООООС САОСОАААТООООААСАСТАОАТОСАОАОТООАА ААТОТОТООААТАООСААААТОСААТСТССТАТТ ОАТСТТСОООАСАААААТОТООТАОТТАОТААТА ААТТТСОАТТОСТТСОТАОССАОТАТСТОССТТСТ ААТАССАССАТТААОААСАОАООТСАТОАТАТСА ТОТТОАААТТСАААООАООАААТАААООТАТТСО ТОТСАСТАТССОТОСТАСТАОАТАТСААСТТСААС ААСТТСАТТООСАСТСТССТТССОААСАТАСААТС ААТООСААААООТТТОСОСТАОАООААСАСТТОО ТТСАТОАОАОСАААОАТАААСОСТАСОСТОТТОТ СССАТТСТТАТАСААТСТСООАОСАТСТСАСССТТ ТГСТСТТТТСОТТООАААААСААТТОААОААОАТА АСТОАТАСАСАТОСОТССОАООААСАТАТТСССА СТОТОТСААОТАААСААОТОААОСТТСТССОТОТО ОСТОТАСАСОАТОСТТСАОАТТСАААТОССАООСС ОСТТСАА6САОТСААТААОСОСААООТАТАТТТАТ АСАААССАААООТТААОТТААТОААОАААТАСТС ТААТАТААОТТСТТАСТАО
Полноразмерная длина АфСАЗ кДНК 8Ер ГО N0:29 АфСАЗ (Αί 1^23730) СТАОАОАССАТСТТСТТАТАТСААСТАААСТТТОТ АТТСАТТТССААОТАТСАСТСТАААТСАТСТТТТТС ОААТТССЗССТСССААОАТАТСТСОАСАОАОТСОТ АСОААОАСОССАТТААААОАСТСООАОА6СТТСТ САСТАА6АААТСООАТСТСОООААСОТООСАОСС ОСАААОАТСААОААОТТААСООАТОАОТТАОАОО ААСТТОАТТССААСААОТТАОАТОССОТАОААСО ААТСАААТССООАТТТСТССАТТТСААОАСТААТА АТТАТОАОААОААТССТАСТТТОТАСААТТСАСТТ ОССААСАСССАОАСССССААОТТТТТООТОТТТОС ТТОТОСООАТТСАССАОТТАОТССАТСТСАСАТСТ ТОААТТТССААСТТООООААОССТТСАТСОТТАОА ААСАТТОСАААСАТООТОССАССТТАТОАСААОА СААА6САСТСТААТОТТООТОСООСССТТОААТАТ ССААТТАСАОТССТСААСОТООАОААСАТТСТТОТ ТАТТООАСАСАССТСТТОТОСТОСААТАААОООА СТСАТООССАТТОААОАТААТАСАОСТСССАСТАА ОАССОАОТТСАТАОААААСТООАТССАОАТСТОТ ОСАССООССААОААСАСОАТСААОСАООАТТОТА ААОАССТААОСТТТОААСАТСАОТОСАССААСТО ТОАОААООААОССОТСААСОТОТССТТОСССААТ
- 70 019514
СтттТОТСТТАСССАТТСОТОАОАОАААбАОТООТ ОААОААСААОСТТОССАТААОАаОАОСТСАСТАТ ОАТТТССТААААОСгААСОТТТОАТСТТТОООААСТ ТОАСТТСААОАСТАССССТОССТТТОССТТОТСТТ ААААОАТТССТССТАСТСАААТАТТТТСТСТАТОТ ТСТТТСТААТТАТОТТСТТАТААТСТТСТТСТОТТО СТТСТОТААТОТСАТСТТТСтСТАСТТСТАТТССААТ А0АААТСААТААА0СТТТААА0А6С
Полноразмерная длина АфСА5 кДНК 8Ер ГО N0:30 АфСА5 (Л14д33580) ТТСТТ0Т6ТААААСТСТТ0ТТССТСТТССТСТТСАА ССТСААСАСТТСТАТТТСТСАОАОААСАТТСАССТ АТАТОТСТТТСТТСАА6ОАОААОТСТТССТСТТТСС АОАТТГАОАТОААСАСТСТТСАОАТСССТТОТОСС ТТАТТОАТССАОАТТСОААОТАСССААСТТТАСТС ТСТАОАССТТТТТСАТООСАСССАСТСССАСАСАС ТТСТСТОТСТСССАТОАТССТТТТТСГТССАСОТСТ СТССТТААТСТССАААСТСААОСОАТСТТТООТСС СААТСАСАОТТТААА6АСААСССАОТТОА6ААТТ ССАОСТТСТТТСАСгААСгААААОСТАСАААСТТОС ААОТОАТООСТТСАСОАААОАСАССТООАСТОАС ТСАОСААОСТААТООСОТТОСААТТОАТАОАСАА ААСААСАСТОАТСТАТТТОАСОАСАТОАААСАСС СОТТССТСОССТТСААОААОСТТААаТАСАТСАОО ОАТОАСТТТОААСАСТАСАААААТСТООСАОАТб СТСААОСТССАААОТТТСТООТОАТТОСТГОТОСА САСТСТАОАОТТТОТССТТСТОСТОТССТСЗСОАТТ ССААССОООТСАСОСАТТСАСТСТТСОТААСАТТО САААТТТАОТАССТССАТАТОАОТСТОСАССТАСТ ОАААССАААОСТ<ЗСТСТАОАОТТСТСТ(ЗТСААТАС ТСТТААТСТСОААААСАТСТТАОТСАТТСОТСАТА ОССООТОТООАООААТТСААССТТТААТОААААТ ООААОАСОААООАОАТТССАОААОТТТСАТАСАС ААСТОООТАОТТОТОООАААОААСОСАААСЮАА АССАСААААОСТОТТОСТТСАААССТССАТТТТОА тсатсаотоссаасаттотоааааоосатсоата ААТСАТТСАТТАОАААООСТОСТТОООТАСССОТО сатасааоаоааастосоосааосттсастотст СТССАТОаТСОАТАСТАТААТТТгаТТОАТТСТАС ОТТСОАОАААТООАСАОТООАТТАТОСАОСААОС АОАСЮТААСААОААООААСОСАОТООААТСОСТ ОТТААА6АССООТСА6ТТТОСТСТТОАСТТАСОАС ТАТСТСААТСТТСАТАОАОТТТТТТТТСАТААТТТА ТАОАОАААСАТСАААССССТТТТООТТОбОАТТАТ САТОТОТТТОТТССАСТТОТОТОТТОААОТСАТПТ ССТТСТТСТСТСТТАТТОАООСАОООАСТААТОТТ ТОТТТТАТСТТТСАОТТОТТТСОТТТАААТТССАСА ТТТОТОСААТОААСТСОТТООТОТТТСТТТААОАТ АТААТСАТТТТОССАСТОТАОТОАОАТСООАООСА ТОСАТ
Полноразмерная длина Αίγ€Α1 кДНК 8Еф ГО N0:31 ΑΐγΟΑΙ (АН§19580) АТАТТАААССАСТ6ТААСТ0ТААТТТАТТ0ТТТС0 ССОТСССООААТОТТССТатТОАААТССАТТТТСО СТСАТТТТТТТТСТТССОТСТСТТСТТСАОСТТСОА ССАТТТТСОТСТТСТТСАТТСАОТСТТОАОТССТСО
- 71 019514
ТТТАССТСТСАОСТССААОАААОТОАССАТСААТ ОООААСССТАООСАОАСгСАТТТТАСТСООТСООТТ ТТТООАТССОТОАОАСТООТСААОСТСТТОАТСОС СТСООТТОТСОССТТСААСОСАААААТТАСТТССО АОААСААСТОТСААООСАТСООАСАСТОАТОААТ ОТАТТТОАТААООСТССОАТТОТООАСААООААО СТТТТОТСССАССААОСОССТСАОТГАТТОССОАС ОТТСАСАТТООААОАСОАТСОТССАТТТООТАТОО АТОСОТАТТАСОАООСОАТСТОААСАССОТААОТ ОТТСООТСАООААСТААТАТТСАОСтАСААСТСАС ТТОТОСАТОТООСААААТСАААСТТААОСОООАА ООТОСАСССААССАТААТТСОАОАСААТОТААСС АТТООТСАТАОТОСТСТГТТАСАТООАТОТАСТОТ ТСАООАТОАОАССТТТАТТОООАТСООТССОАСА СТТСТТОАТООООТСОТТОТТОААААОСАТОООАТ ООТТОСТОСТООТОСАСТТОТАСОАСААААСАСС АОААТТССТТСТОСАОАООТАТООООАООАААСС САОСААООТТССТСАООААОСТСАСТОАТОАООА ААТТОСТТТТАТСТСТСАОТСАОСААСАААСТАСТ САААССТСОСАСАООСТСАСОСТОСАОАОААТОС АААОССАТТАААТОТОАТТОАОТТСОАОАА6ОТТ СТАСОСААОАА6САТОСТСТАААООАСОАООАОТ АТОАСТСААТОСТСООААТАОТСАОАОАААСТСС АССАОАОСТТААССТСССТААСААСАТАСТОССТО АТАААОАААССААОСОТССТТСТААТСТСААСте ЛТТТТТСАОООСТАТОТТТТСТООССОААОСССТА САОбОТОАОАТАСТСААбООСАТГАТОТТГСООТ СТСТООТТТОААТАТООСАОаТАОАОТАСАТТАОО ОТАОАСООАТТТАСАОСТТТТОААОААОСТАТСТТ СААСАТТТТТТСАТСгОТТТСТТАОООАОТАТТАТТ ОТСТААТСАААСТТТОТАТОТТАТСАСТТСООТСТТ ТТОААСОТААОААТСААОТТСАТОАААСАТОАОТ ОААТАТТАОТСТОАТОСАТОТОСОТАТОСАААААТ ССАТОТОСОССТАТСТГОСТАООСААОСАТСААО ААТАААОАТССАААСТСОАТАТАТСАТАТАТТТАТ СТТПТАТААТТАСТОС
Полноразмерная длина Л(уСЛ2 кДНК 8Е(} Ш N0:32 А1уСА2 (АН §47260) СОААСТСАСТСОАОТТАААААААААААТССТССС АТСААТАСОССТССАТАААССТСТСТСТАТСТООТ ООАОСОАСАССАААААСААСАААОССТТСТСАТТ ТТСАСАСТТТОООТААТСООАОААТСАСАААААА АТОООААСССТАООАСОАОСААТТТАСАСТОТОО ОТААСТООАТТССгТСтСтААСТСтСтТСААСтСТСТТОАТ СОСОТТООТТСТСТТСТТСААООААОТСАССОТАТ СОАООААСАТСТОТСОАООСАТСООАСОТТОАТО аатототттоатааатсассаттоотсоатааао АТОтеТТТОТООСТССОАбТОСТТСТОТТАТТООТ ОАТОТТСАОАТСООААААООСТСОТСОАТТГСОТ АТОССТОТОТТСТТСОАООТОАТОТОААТААСАТС АОТОТТООАТСТОООАСОААТАТССААОАТААТА СОСТТОТАСАТОТТОСАААОАССААСАТААОТОО СААООТТСТАССТАСТСТОАТТОСКЗОАСААТОТАА САОТАООТСАСАОТОСТСТСАТТСАТОООТОТАСТ
- 72 019514
ОТТОАООАТОАТОСТТТТОТТСОТАТОООАОСААС АСТАСТТОАТООТОТООТООТТОАОАААСАТОСС АТООТТССТОСТСОТТСТСТТОТСАААСАОААСАС ОСОААТСССТТСТООАОАООТОТООООАООАААТ ССАОСАААОТТСАТОАОАААОТТААСАОАТОААО А6АТАСТАТАСАТСТСАСАОТСАОСАААОААТТА САТСААТСТС6САСАОАТТСАС6ССТСАОАОААТТ САААОТСАТТТОАОСАОАТССАООТТОАОАОАОС ОСТТАООААОААОТАТОСАСОСААСОАСОАООАТ ТАССАТТСААТОСТТСООАТТАСССОТОАААСТСС АССООАОТТОАТТСТТСССОАСААТОТСТТАССАО ОТООТАААСССОТСОССААООТТССОТСТАСТСАО ТАСТТСТААТТССААТСТСАООТТОТТТТТОТСТОТ ТОАААТСАТТТСААОАСАСОАТТОАТТСТСТООАА ООТСААОАОАОАТАТТАТТТТООТТТТААСТТТТС ТТССОАОСААОСАООАОАТТТАТСАТССТТОСТСА АТААТОТАТООТТОСАТТАТ6ААОТСАТТТСТТСО АООААСААТТТОСАОАААОАОАААСАААОТТООА ТТААТСТТТС
Полноразмерная длина ΑΐγΟΑ3 кДНК ЗЕО ГО N0:33 А1уСАЗ (Αΐ5§66510) САААОАСТОСАСТСТСТССТСТТССТСТООСТССО ОСОАААААССССТТТТСОАТТТСАТГОАТААААСО САААТСОАТСТСТСОТОТООААОАА6ААОААОАА САСОАТОООААСААТСООТАААОСАТТСТАСАОС ОТАООАТТСТООАТССОТОАААСТООТСААОСАС ТТОАТСООСТСООТТОТСОССТССААОООАААААТ САТТТССОАОААСАОСТАТСААООСАССОСАСАС ТСАТОААТСТТТТТОАСААААССССТААТОТООАТ ААОООООСТТТТОТОССТССТААСОСТТСТСТСТС ТОСТОАТОТССАТОТСЮОААОАООТТСТТССА'ПТ ООТАТООАТОТОТСТТОАОАОАСАТАСССТТТОАТ ТТААТОАСССАСТСТОСАООАОАТОСТААСАОСА ТТАОТОТТООАОСТОООАССААТАТТСАООАСАА СОСТСТТОТССАСОТТОСТААСАССААСТТААОТС ООААООТСТТАССТАСТОТСАТТОСгАОАСААТОТС АССАТТСОТСАТАОТОСТОТТТТАСАТОССТССАС ТОТСОАООАТОА6СССТАТАТТООТАСААОТОСА АСТОТСТТООАТООАОСТСАТаТТОАААААСАТОС САТООТТОСТТСАООАОСТСТТОТТАООСАОААСА СТАОААТТСССТСТООСОАООТТТООООАООСАА СССАОСТАААТТТСТОАОСААООТОАСАОААОАА ОАААОАОТСТТСТТСТССАОТТССССТОТООАОТА СТССААСТТАОСТСААОСТСАСОССАСАОА6ААС ОСАААОААСТТООАСОАООСТОАОТТСААОААОС ТТСТАААСААОААОААСОСТСОСОАТАСАСААТА ТОАТТСАОТАСТСОАТОАТСТСАСОСТСССТСАОА АТОТАССААААОСА6СТТОАООСОТТТААССТОТ ОССОССТТССОААТСТТбАТТТОТТТООАТТТОАА ААОТАААААСАААОААСТТОАТТТССТОСТТСТСС ААТАААОТТТТСТТОООСОТААААТССАТТООССА ОТОСТСАСТОООАААОТТТТСОССТТАААОССАТТ САТТТСТСТОТТАААОАТТОТОАОСООТТТТОТТС ТСТТ6ТААСТТОАОАААОААААОТТОТААССТТТТ
- 73 019514
СТТССТТТТТАТОТСОТСТААТАААТТОТТСАТСАО АСАОАСАТТТАООТТСАССТТТОСССАТАААААО АТАОСТСТОСТТСААТАА
Полноразмерная длина ΑΐγΟΑΙΛ кДНК 8Ер Ю N0:34 Л(уСАЫ (Αί5§63510) АСТСТСТСТСТТТТССТСТТТОСАААТССТТОААОА ААТССААААТССАТАОСААТСОСОАСТТСОАТАО СТСОАГГОТСТСООАОАООАаТСАСТТСТААССТО АТССОТСОТТОСТТСОСТОСООААОСООСОТТООС ОАООААОАСАОАОТТАССТАААССОСААТТСАСО ОТОТСОССОТСОАССЗОАТСОТОТОАААТОООАСТ АСАОАООССААСОАСАОАТСАТТССТТТОООАСА ОТООСТТССОААООТАОССОТТОАТОСТТАСОТСО САСССААСОТТОТОСТООСТООТСАООТСАСАСТС ТОООАСООСТСОТСТОТТтеОААСООТОССОТТТТ ОСОСООСОАТСТСААСААААТСАСТОТТООАГГСТ ОСТСОААТОТАСАООААСООТОТОТТОТТСАТОСС ОССТС6ТСТТССССААСА6САТТАССА6САОСОА СААТААТС6АСАССТАТ6Т6АСА0ТАСЮТ6ССТА САОТСТТСТОАОАТСАТОТАССАТСОААССАОАОТ ОСАТСАТСООТСААСАСТСААТАСТААТОСААОО СТСАСТООТТОАОАСССООТСААТСТТООААОСО ООТТСАОТТОТОССОССАООААОААООАТСССАТ САООТОААСТАТСОООАООСААТССАОСААОАТТ САТТАОААСССТААССААСОААОАААСССТАОАО АТСССААААСТСОСТОТАОССАТСААССАСТТААО СООАОАТТАСТТСТСТОАОТТССТАССТТАСТСАА СТСТСТАСТТАСгАССТАОАОААСгТТСААОААОТС ССТТОООАТСОССОТТТАОААОСТТСАТСТТТТТС ОТОАТТСАСТТТСАТОТОТТТАТСТАТСАТАТСАО ОТСТТТСТСТСТОСАТАТТОСААТААОТАОСТОАТ ОААСАТСААААСААОТССООСТСТСТТТТТТООТТ СТААААСОТТТОТСАТТТСОТТТТТТОООТТСТТТО ТААААТТССАТТГААААСТСАТТГТООСТСААТАТ ТОТСТОААТОАТААТаОСОАСОАСТТСТООТТТТО ТТ
Полноразмерная длина ΑΙγΟΑίΣ кДНК 8Е<? П) N0:35 А1уСАЬ2 (А13§48680) СТСССОАСОАСТССТСТСТОТСТССТССТССОООА АОСТТТСТОТСТСТСТСТСТСТСТСТСТАСАСААОА ССТТОААОААТССОАТТССАТААСААТООСОАСТТ СОТТАОСАСОААТСТСТААААОААОСАТААСАТС ООСТОТТТСАТСОААТСТОАТТСООСОТТАСТТСО ССОСООААОСАОТАССООТООСОАСОАСООАААС АССТАААССОАААТСОСАООТОАСОССОТСОССО ОАТСОООТААААТОООАСТАСАОАООССАОАОАС АОАТААТТССТСТОООАСАОТООСТАССОААООТ АОСТСТАОАТОСТТАСОТООСАССТААСОТТОТОТ ТООСТООТСАООТСАССОТСТССЮАСОССТСОТСТ ОТАТСОААСОСТОССОТТТТОАОАООАОАТСТТА АТААОАТСАСССТТООАТТСТОСТСАААТОТССАО 0ААС06ТСТ0ТТ0ТТСАТ0СТ0С0Т00ТС0ТС0СС ТАСАСОАТТАССАОСАСАААСАТТОАТСОАТАОО ТАСОТаАСАОТТОСТССАТАСАОТСТТТТААОАТС АТОСАСТАТСОААССАОААТОСАТСАТСОООСАА САСТСААТССТААТООААООТТСАСТООТССгААА
ССС6СТСААТССТАОААОСТООТТСТ6ТТТТАССА ССТООСАОААОААТСССАТСТООТОААСТАТОСО ОАООСААТССАОСААООТТТАТТСОААСАСТСАС СААТСААОАААССТТАОАОАТСССОАААСТТОСТ ОТТОССАТТААССАССТААОТООАОАТТАСТТСТС АОАОТТСТТОССТТАСТСААСТАТСТАТСТАОАОО ТТОАОААОТТСААОАААТСССТТООААТСОССАТС ТАОАААОСТТСТТССАООТТТСТООСТАСТТСССТ САТТААОАААССТТСТТСОТТТТСООААТТТОАТС ТОААТААОТАОСТОСООААСААОАААААОАОСА ОАОСТОТОТТТСАААТОТТОТСТТСТСТОТТТОТТТ ТОТТТААСТТСАТАТССТТОТСгТТСАААСТТТСТАТ ОААОАТОАТААТООТОААААСТООАААОТОТААА АСГГСТТТСОТСТССССТСАСААТТООААААОСТА АТААТСТСОТАОТОТТАТАОАА
Был описан ряд аспектов этого изобретения. Несмотря на это, будет понятно, что могут быть произведены различные модификации без отхода от сущности и объема этого изобретения. Таким образом, другие аспекты находятся в объеме следующей формулы изобретения.

Claims (17)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ понижающей регуляции или уменьшения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке растения, клетке растения, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающий:
    (a) обеспечение:
    (ί) нуклеиновой кислотой, экспрессирующей С028еп (С02 сенсор), и/или геном, или транскриптом (мРНК) С028еп; или (ίί) полипептидом, обладающим активностью карбоангидразы (СА), или активностью βкарбоангидразы, или нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид СА; и (b) экспрессию или сверхэспрессию нуклеиновой кислоты или гена из (а), или нуклеиновой кислоты, экспрессирующей белок С028еп (С02 сенсор), и/или ген, или транскрипт (мРНК) С028еп, и/или карбоангидразу, или β-карбоангидразу или нуклеиновой кислоты, экспрессирующей карбоангидразу в замыкающей клетке, растении, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения, посредством чего понижающе регулируется или уменьшается обмен диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке.
  2. 2. Способ по п.1, в котором нуклеиновая кислота гена или транскрипта (мРНК) С028еп содержит последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), имеющую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или большую или полную идентичность последовательности с 8ЕО ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8ЕО ΙΌ N0:4, 8ЕО ΙΌ N0:5, 8ЕО ΙΌ N0:7, 8ЕО ΙΌ N0:8, 8ЕО ΙΌ N0:20, 8ЕО ΙΌ N0:21, 8ЕО ΙΌ N0:22, 8ЕО ΙΌ N0:23, 8ЕО ΙΌ N0:24, 8ЕО ΙΌ N0:25, 8ЕО ΙΌ N0:26, 8ЕО ΙΌ N0:27, 8ЕО ΙΌ N0:28, 8ЕО ΙΌ N0:29, 8ЕО ΙΌ N0:30, 8ЕО ΙΌ N0:31, 8ЕО ΙΌ N0:32, 8ЕО ΙΌ N0:33, 8ЕО ΙΌ N0:34 и/или 8ЕО ΙΌ N0:35, или последовательность нуклеиновой кислоты (полинуклеотида), которая гибридизуется при строгих условиях с нуклеиновой кислотой, содержащей 8Е0 ΙΌ N0:1, 8Е0 ΙΌ N0:2, 8Е0 ΙΌ N0:4, 8Е0 ΙΌ N0:5, 8ЕО ΙΌ N0:7, 8ЕО ΙΌ N0:8, 8ЕО ΙΌ N0:20, 8ЕО ΙΌ N0:21, 8ЕО ΙΌ N0:22, 8ЕО ΙΌ N0:23, 8ЕО ΙΌ N0:24, 8ЕО ΙΌ N0:25, 8ЕО ΙΌ N0:26, 8ЕО ΙΌ N0:27, 8ЕО ΙΌ N0:28, 8ЕО ΙΌ N0:29, 8ЕО ΙΌ N0:30, 8ЕО ΙΌ N0:31, 8ЕО ΙΌ N0:32, 8ЕО ΙΌ N0:33, 8ЕО ΙΌ N0:34 и/или 8ЕО ΙΌ N0:35, где строгие условия включают в себя стадию промывки, включающую в себя промывку в 0,2Х 88С при температуре приблизительно 65°С в течение приблизительно 15 мин.
  3. 3. Способ по п.1, в котором нуклеиновая кислота гена или транскрипта (мРНК) С028еп кодирует аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере приблизительно 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99% или более или полную идентичность аминокислотной последовательности с 8Е0 ΙΌ N0:3, 8Е0 ΙΌ N0:6 и/или 8Е0 ΙΌ N0:9.
  4. 4. Способ закрывания устьичной щели на замыкающей клетке в эпидермисе растения, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения, или способ получения замыкающей клетки растения, растительной клетки, листа растения, органа растения или части растения с повышенной эффективностью использования воды (^ИЕ) или засухоустойчивостью, включающий сверхэкспрессию или повышенную экспрессию:
    (a) белка С028еп и/или гена или транскрипта (мРНК) С028еп, где ген или транскрипт (мРНК) С028еп содержат последовательность, определенную в п.2, и/или белок С028еп содержит аминокислотную последовательность, определенную в п.3, или (b) полипептида, обладающего активностью карбоангидразы, или активностью β-карбоангидразы, или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид, в замыкающей клетке, растении, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения, посредством чего закрывается устьичная щель на замыкающей клетке в эпидермисе растения, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения, или посредством чего получают замыкающую клетку растения, растительную клетку, лист растения, орган растения или часть растения с повышенной эффективностью использования воды (^ИЕ) или засухоустойчивостью.
  5. 5. Способ раскрывания устьичной щели на замыкающей клетке в эпидермисе растения, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения или способ получения замыкающей клетки растения, растительной клетки, листа растения, органа растения или части растения с теплоустойчивостью, включающий недостаточную экспрессию белка С028еп, и/или гена, или транскрипта (мРНК) С028еп, или карбоангидразы в замыкающей клетке, растении, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения, предусматривающий:
    (а) обеспечение:
    (ί) нуклеиновой кислотой, антисмысловой относительно гена или транскрипта (мРНК) С028еп или иным образом ингибирующей экспрессию гена или транскрипта (мРНК) С028еп, где этот ген или транскрипт (мРНК) С028еп содержит последовательность по п.2 и/или последовательность, кодирующую белок С028еп по п.3; или
    - 75 019514 (ίί) нуклеиновой кислотой, антисмысловой относительно нуклеиновой кислоты, кодирующей карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения, или иным образом ингибирующей нуклеиновую кислоту, кодирующую карбоангидразу растения (СА) или β-карбоангидразу растения; и (Ь) экспрессию антисмысловой или ингибирующей СО28еп и/или СА нуклеиновой кислоты в замыкающей клетке, растении, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения, с вызыванием посредством этого раскрывания устьичной щели на замыкающей клетке эпидермиса растения, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения или с получением замыкающей клетки растения, растительной клетки, листа растения, органа растения или части растения с термоустойчивостью посредством повышающей регуляции или увеличения обмена диоксида углерода (СО2) и/или воды в замыкающей клетке, растении, растительной клетке, листе растения, органе растения или части растения.
  6. 6. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором замыкающая клетка, растение, растительная клетка, лист растения, орган растения или часть растения являются трансгенными замыкающей клеткой, растением, растительной клеткой, листом растения, органом растения или частью растения, или получена из них, или является их частью.
  7. 7. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нуклеиновая кислота, и/или ген, или транскрипт (мРНК) функционально связаны с растительным промотором замыкающей клетки.
  8. 8. Способ по п.7, в котором растительный промотор замыкающей клетки содержит последовательность, изложенную в 8ЕЦ ΙΌ NО: 10 или 8ЕЦ ΙΌ NО: 11, или содержит ее функциональную (транскрипционно регулируемую) подпоследовательность.
  9. 9. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором нуклеиновая кислота, и/или ген, или транскрипт (мРНК) функционально вставлен в экспрессионную кассету, плазмиду, рекомбинантный вирус, вектор, космиду или искусственную хромосому.
  10. 10. Способ по любому из предшествующих пунктов, в котором замыкающая клетка, растение, растительная клетка, лист растения, орган растения или часть растения являются замыкающей клеткой, растением, клеткой, листом, органом или частью двудольного или однодольного растения или получены из них.
  11. 11. Способ по п.10, в котором двудольное или однодольное растение является пшеницей, овсом, рожью, ячменем, рисом, сорго, маисом (кукурузой), табаком, бобовым растением, люпином, картофелем, сахарной свеклой, горохом, фасолью, соей, крестоцветным растением, цветной капустой, рапсом (или турнепсом, или канолой), тростником (сахарным тростником), льном, хлопчатником, пальмой, сахарной свеклой, арахисом, деревом, тополем, люпином, хлопковым деревом (капокой), пустынной ивой, креозотным кустарником, терескеном шерстистым, бальзой, рами, кенафа, коноплей, розеллой, джутом или абакой (бананом текстильным); или видом из родов Аиасагйшт, АгасВ1к, Акрагадик, Айора, Ауепа, Вгаккюа, Сйгик, СИтНик, Саркюит, СайВатик, Сосок, Сойеа, Сисит1к, СисигЬйа, Оаисик, Е1ае1к, Егадапа, С1усте, Соккуршт, НеВакВик, Не1егосаШк, Ногйеит, Нуоксуатик, ЬасТиса, Ыпит, ЬоВит, Ьиртик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МашВоЕ Ма)огапа, МеФсадо, МсоВапа, О1еа, Огула, Рашеит, РапшкеТит, Регкеа, РВакео1ик, РЫасЫа, Р1кит, Ругик, Ргипик, КарВапик, Кютик, 8еса1е, 8епесю, 8тар1к, 8о1апит, 8огдВит, ТВеоЬготик, ТпдопеПа, ТпНсит, νί^ι, νίΒ^ Ыдпа или 2еа.
  12. 12. Способ по любому из пп.4 или 5, где нуклеиновая кислота, и/или ген, или транскрипт (мРНК) функционально связаны с растительным клеткоспецифическим промотором, где указанный промотор необязательно содержит последовательность, изложенную в 8ЕЦ ΙΌ NО: 10 или 8ЕЦ ΙΌ NО: 11, или содержит их функциональные (транскрипционно регулируемые) подпоследовательности.
  13. 13. Способ по п.12, в котором замыкающая клетка, растение, растительная клетка, лист растения, орган растения или часть растения являются замыкающей клеткой, растением, клеткой, листом, органом или частью двудольного или однодольного растения или получены из них.
  14. 14. Способ по п.13, в котором двудольное или однодольное растение является пшеницей, овсом, рожью, ячменем, рисом, сорго, маисом (кукурузой), табаком, бобовым растением, люпином, картофелем, сахарной свеклой, горохом, фасолью, соей, крестоцветным растением, цветной капустой, рапсом (или турнепсом, или канолой), тростником (сахарным тростником), льном, хлопчатником, пальмой, сахарной свеклой, арахисом, деревом, тополем, люпином, хлопковым деревом (капокой), пустынной ивой, креозотным кустарником, терескеном шерстистым, бальзой, рами, кенафа, коноплей, розеллой, джутом или абакой (бананом текстильным); или видом из родов Аиасагйшт, АгасВ1к, Акрагадик, Айора, Ауепа, Вгаккюа, С11гик, Сйги11ик, Саркюит, СайВатик, Сосок, Сойеа, Сисит1к, СисигЬйа, Оаисик, Е1ае1к, Егадапа, С1усте, Соккуршт, НеВакВик, Не1егосаШк, Ногйеит, Нуоксуатик, ЬасТиса, Ыпит, Ьо1тт, Ьиртик, Ьусорегкюоп, Ма1ик, МашВоЕ Ма.)огапа, МеШсадо, МсоВапа, О1еа, Огула, Рашеит, РапшкеШт, Регкеа, РВакео1ик, Р1к1асВ1а, Р1кит, Ругик, Ргипик, КарВапик, Кютик, 8еса1е, 8епесю, 8шар1к, 8о1апит, 8огдВит, ТВеоЬготик, Тпдопе11а, ТпНсит, νί^ι, νίΒ^ Ыдпа или 2еа.
  15. 15. Молекула нуклеиновой кислоты, содержащая специфичный для замыкающих клеток промотор с 8ЕЦ ΙΌ NО: 10 или 8ЕЦ ΙΌ NО: 11, функционально связанная с нуклеиновой кислотой, экспрессирующей белок СО28еп (СО2 сенсор), или ген, или транскрипт
    - 76 019514 (мРНК) С028еп; или нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид карбоангидразы (СА);
    где в необязательном порядке указанный ген или транскрипт С028еп содержит последовательность, определенную в п.2, или кодирует белок С028еп, который содержит аминокислотную последовательность, определенную в п.3.
  16. 16. Трансгенное растение с повышенной эффективностью использования воды (^ИЕ), засухоустойчивостью и теплоустойчивостью, содержащее молекулу нуклеиновой кислоты по п.15.
  17. 17. Семена трансгенного растения по п.16, содержащие молекулу нуклеиновой кислоты по п.15.
EA200901457A 2007-04-27 2008-04-25 Сенсоры coрастений, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, способы их получения и применение EA019514B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US91464007P 2007-04-27 2007-04-27
PCT/US2008/061654 WO2008134571A1 (en) 2007-04-27 2008-04-25 Plant co2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200901457A1 EA200901457A1 (ru) 2010-04-30
EA019514B1 true EA019514B1 (ru) 2014-04-30

Family

ID=39926097

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200901457A EA019514B1 (ru) 2007-04-27 2008-04-25 Сенсоры coрастений, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, способы их получения и применение
EA201300790A EA029920B1 (ru) 2007-04-27 2008-04-25 Кассета для экспрессии гетерологичных последовательностей в замыкающих клетках листьев и стеблей и ее применение

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201300790A EA029920B1 (ru) 2007-04-27 2008-04-25 Кассета для экспрессии гетерологичных последовательностей в замыкающих клетках листьев и стеблей и ее применение

Country Status (13)

Country Link
US (3) US8916745B2 (ru)
EP (2) EP3196310B1 (ru)
CN (2) CN103555735B (ru)
AR (1) AR069032A1 (ru)
AU (1) AU2008245611B2 (ru)
BR (1) BRPI0811023B1 (ru)
CA (2) CA2685425C (ru)
CL (2) CL2008003155A1 (ru)
EA (2) EA019514B1 (ru)
MX (2) MX2009011591A (ru)
UA (1) UA101156C2 (ru)
WO (1) WO2008134571A1 (ru)
ZA (2) ZA200907498B (ru)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008134571A1 (en) * 2007-04-27 2008-11-06 University Of California Plant co2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
US20110191894A1 (en) * 2009-08-04 2011-08-04 The Penn State Research Foundation Methods and compositions relating to conrolled induction of plant senescence
US20130145495A1 (en) * 2010-04-25 2013-06-06 Donald Danforth Plant Science Center Enhanced carbon fixation in photosynthetic hosts
US20130326734A1 (en) * 2011-02-01 2013-12-05 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for controlling carbon dioxide- (co2-) regulated stomatal apertures, water transpiration and water use efficiency in plants
WO2012125737A2 (en) * 2011-03-14 2012-09-20 Donald Danforth Plant Science Center Methods for increasing carbon fixation
WO2012166954A2 (en) * 2011-05-31 2012-12-06 Li-Cor, Inc. Systems and methods for estimating photosynthetic carbon assimilation
US20140215655A1 (en) * 2011-08-12 2014-07-31 Bayer Cropscience Nv Guard cell-specific expression of transgenes in cotton
UA116097C2 (uk) * 2011-12-11 2018-02-12 Зе Стейт Оф Ізраел, Міністрі Оф Агрікалче Енд Руерал Девелопмент, Агрікалчерал Рісьоч Організейшн, (А.Р.О.), Волкані Сентре Спосіб модуляції провідності устячка рослини
CN102559677B (zh) * 2011-12-23 2013-12-18 北京大北农科技集团股份有限公司 组织特异性启动子及其用途
AU2013278070B2 (en) 2012-06-22 2019-07-11 The Regents Of The University Of California Compositions and methods for mediating plant stomatal development in response to carbon dioxide and applications for engineering drought tolerance in plants
CA2887571A1 (en) * 2012-10-11 2014-04-17 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Guard cell promoters and uses thereof
RU2015144106A (ru) * 2013-03-15 2017-04-21 Зингента Партисипейшнс Аг Композиции экспрессионных кассет замыкающих клеток и способы их применения
CA2951480A1 (en) * 2014-06-06 2015-12-10 Boyce Thompson Institute For Plant Research, Inc. Compositions and methods useful for the regulation of abiotic stress responses in higher plants
US20190338302A1 (en) 2016-02-04 2019-11-07 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising a putative transporter protein of an edible eukaryotic algae
US20200055908A1 (en) 2017-02-22 2020-02-20 Yield10 Bioscience, Inc. Transgenic land plants comprising enhanced levels of mitochondrial transporter protein
CN108251426B (zh) * 2018-03-23 2021-07-13 南京林业大学 一种受植物激素诱导的杨树启动子pPsTMM及其应用
CN111484142B (zh) * 2020-03-24 2022-04-12 浙江省海洋水产养殖研究所 一种富营养化水体的生物修复技术
CN114836427A (zh) * 2022-05-13 2022-08-02 杭州师范大学 一种培育apoaequorin转基因番茄的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1111051B1 (en) * 1999-12-21 2005-02-23 Korea Kumho Petrochemical Co. Ltd. Promoter for guard cell-specific gene expression in plants
WO2005085449A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-15 Universita' Degli Studi Di Milano Stomatal guard cell specific promoter

Family Cites Families (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4943674A (en) 1987-05-26 1990-07-24 Calgene, Inc. Fruit specific transcriptional factors
US5750871A (en) 1986-05-29 1998-05-12 Calgene, Inc. Transformation and foreign gene expression in Brassica species
US5597945A (en) 1986-07-25 1997-01-28 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Plants genetically enhanced for disease resistance
US5015580A (en) 1987-07-29 1991-05-14 Agracetus Particle-mediated transformation of soybean plants and lines
US6054270A (en) 1988-05-03 2000-04-25 Oxford Gene Technology Limited Analying polynucleotide sequences
US5700637A (en) 1988-05-03 1997-12-23 Isis Innovation Limited Apparatus and method for analyzing polynucleotide sequences and method of generating oligonucleotide arrays
US5268526A (en) 1988-07-29 1993-12-07 E. I. Du Pont De Nemours And Company Overexpression of phytochrome in transgenic plants
US5589615A (en) 1988-10-14 1996-12-31 Plant Genetic Systems N.V. Process for the production of transgenic plants with increased nutritional value via the expression of modified 2S storage albumins
US5217879A (en) 1989-01-12 1993-06-08 Washington University Infectious Sindbis virus vectors
US5143854A (en) 1989-06-07 1992-09-01 Affymax Technologies N.V. Large scale photolithographic solid phase synthesis of polypeptides and receptor binding screening thereof
US5800992A (en) 1989-06-07 1998-09-01 Fodor; Stephen P.A. Method of detecting nucleic acids
US5744101A (en) 1989-06-07 1998-04-28 Affymax Technologies N.V. Photolabile nucleoside protecting groups
US5527681A (en) 1989-06-07 1996-06-18 Affymax Technologies N.V. Immobilized molecular synthesis of systematically substituted compounds
US5689041A (en) 1989-08-10 1997-11-18 Plant Gentic Systems N.V. Plants modified with barstar for fertility restoration
US5589583A (en) 1990-01-11 1996-12-31 Monsanto Company Plant promoter
US5484956A (en) 1990-01-22 1996-01-16 Dekalb Genetics Corporation Fertile transgenic Zea mays plant comprising heterologous DNA encoding Bacillus thuringiensis endotoxin
JP3209744B2 (ja) 1990-01-22 2001-09-17 デカルブ・ジェネティクス・コーポレーション 結実能力のある遺伝子変換コーン
US5618988A (en) 1990-03-02 1997-04-08 Amoco Corporation Enhanced carotenoid accumulation in storage organs of genetically engineered plants
US5837848A (en) 1990-03-16 1998-11-17 Zeneca Limited Root-specific promoter
FR2673643B1 (fr) 1991-03-05 1993-05-21 Rhone Poulenc Agrochimie Peptide de transit pour l'insertion d'un gene etranger dans un gene vegetal et plantes transformees en utilisant ce peptide.
IL101508A0 (en) 1991-04-08 1992-12-30 Rhone Poulenc Agrochimie Chimeric plant genes based on upstream regulatory elements of helianthinin
CA2075135A1 (en) 1991-08-02 1993-02-03 David E. Ellis Particle-mediated transformation of gymnosperms
PT100930B (pt) 1991-10-04 2004-02-27 Univ North Carolina State Plantas transgenicas resistentes aos agentes patogenicos e metodo para a sua producao
US5632957A (en) 1993-11-01 1997-05-27 Nanogen Molecular biological diagnostic systems including electrodes
JPH05236997A (ja) 1992-02-28 1993-09-17 Hitachi Ltd ポリヌクレオチド捕捉用チップ
AU5676394A (en) 1992-11-20 1994-06-22 Agracetus, Inc. Transgenic cotton plants producing heterologous bioplastic
EP0670670A4 (en) 1993-09-30 1996-04-24 Agracetus HETEROLOGICAL PEROXIDASE PROCESSING TRANSGENIC COTTON PLANTS.
US6045996A (en) 1993-10-26 2000-04-04 Affymetrix, Inc. Hybridization assays on oligonucleotide arrays
US5965452A (en) 1996-07-09 1999-10-12 Nanogen, Inc. Multiplexed active biologic array
US6468742B2 (en) 1993-11-01 2002-10-22 Nanogen, Inc. Methods for determination of single nucleic acid polymorphisms using bioelectronic microchip
US5571706A (en) 1994-06-17 1996-11-05 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Plant virus resistance gene and methods
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5736369A (en) 1994-07-29 1998-04-07 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Method for producing transgenic cereal plants
US5556752A (en) 1994-10-24 1996-09-17 Affymetrix, Inc. Surface-bound, unimolecular, double-stranded DNA
US5830645A (en) 1994-12-09 1998-11-03 The Regents Of The University Of California Comparative fluorescence hybridization to nucleic acid arrays
US5959098A (en) 1996-04-17 1999-09-28 Affymetrix, Inc. Substrate preparation process
JPH10510433A (ja) 1995-06-06 1998-10-13 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド 高いキラル純度のホスホロチオエート結合を有するオリゴヌクレオチド
US5856174A (en) 1995-06-29 1999-01-05 Affymetrix, Inc. Integrated nucleic acid diagnostic device
US5985662A (en) 1995-07-13 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of hepatitis B virus replication
US5619042A (en) 1995-07-20 1997-04-08 Siemens Medical Systems, Inc. System and method for regulating delivered radiation in a radiation-emitting device
CA2234557C (en) 1995-10-13 2007-01-09 Purdue Research Foundation Method for the production of hybrid plants
WO1997016533A1 (en) 1995-10-31 1997-05-09 The Regents Of The University Of California Mammalian artificial chromosomes and methods of using same
US6022963A (en) 1995-12-15 2000-02-08 Affymetrix, Inc. Synthesis of oligonucleotide arrays using photocleavable protecting groups
US5783393A (en) 1996-01-29 1998-07-21 Agritope, Inc. Plant tissue/stage specific promoters for regulated expression of transgenes in plants
US6013440A (en) 1996-03-11 2000-01-11 Affymetrix, Inc. Nucleic acid affinity columns
US6025155A (en) 1996-04-10 2000-02-15 Chromos Molecular Systems, Inc. Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes
US5773697A (en) 1996-04-23 1998-06-30 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Genetic constructs and methods for producing fruits with very little or diminished seed
US6057100A (en) 1996-06-07 2000-05-02 Eos Biotechnology, Inc. Oligonucleotide arrays
US5773269A (en) 1996-07-26 1998-06-30 Regents Of The University Of Minnesota Fertile transgenic oat plants
US6826296B2 (en) 1997-07-25 2004-11-30 Affymetrix, Inc. Method and system for providing a probe array chip design database
AU8908198A (en) 1997-08-15 1999-03-08 Hyseq, Inc. Methods and compositions for detection or quantification of nucleic acid species
PT1012564E (pt) 1997-09-11 2003-08-29 Bioventures Inc Metodo de producao de arranjos de alta densidade
US6465178B2 (en) 1997-09-30 2002-10-15 Surmodics, Inc. Target molecule attachment to surfaces
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
JP2002510505A (ja) 1998-04-03 2002-04-09 フィロス インク． 位置特定可能な蛋白質アレイ
US6048695A (en) 1998-05-04 2000-04-11 Baylor College Of Medicine Chemically modified nucleic acids and methods for coupling nucleic acids to solid support
US6277628B1 (en) 1998-10-02 2001-08-21 Incyte Genomics, Inc. Linear microarrays
US6277489B1 (en) 1998-12-04 2001-08-21 The Regents Of The University Of California Support for high performance affinity chromatography and other uses
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
US6221653B1 (en) 1999-04-27 2001-04-24 Agilent Technologies, Inc. Method of performing array-based hybridization assays using thermal inkjet deposition of sample fluids
US6653151B2 (en) 1999-07-30 2003-11-25 Large Scale Proteomics Corporation Dry deposition of materials for microarrays using matrix displacement
US20010008765A1 (en) 1999-12-06 2001-07-19 Fuji Photo Film Co., Ltd. DNA chip and reactive solid carrier
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
AU2002211665B2 (en) 2000-10-12 2005-10-20 Exelixis, Inc. Human Ect2 and methods of use
US6309872B1 (en) 2000-11-01 2001-10-30 Novozymes Biotech, Inc Polypeptides having glucoamylase activity and nucleic acids encoding same
US20060019913A1 (en) 2001-05-18 2006-01-26 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibtion of protein tyrosine phosphatase-1B (PTP-1B) gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20060143729A1 (en) * 2004-06-30 2006-06-29 Ceres, Inc. Nucleotide sequences and polypeptides encoded thereby useful for modifying plant characteristics
US20060030003A1 (en) 2004-05-12 2006-02-09 Simon Michael R Composition and method for introduction of RNA interference sequences into targeted cells and tissues
CA2569664C (en) 2004-06-07 2013-07-16 Protiva Biotherapeutics, Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US7635563B2 (en) 2004-06-30 2009-12-22 Massachusetts Institute Of Technology High throughput methods relating to microRNA expression analysis
US20060019258A1 (en) 2004-07-20 2006-01-26 Illumina, Inc. Methods and compositions for detection of small interfering RNA and micro-RNA
DE602005027160D1 (de) * 2004-11-25 2011-05-12 Sungene Gmbh Expressionskassetten zur bevorzugten Expression in pflanzlichen Schliesszellen
EP2163631B1 (en) * 2004-11-25 2013-05-22 SunGene GmbH Expression cassettes for guard cell-preferential expression in plants
WO2006066168A2 (en) 2004-12-16 2006-06-22 Ceres, Inc. Drought responsive promoters and uses thereof
EP1688413A1 (en) 2005-02-03 2006-08-09 Hikma Pharmaceuticals Co. Ltd. Benzoxazole derivatives for the prophylaxis and treatment of inflammatory bowel diseases
US7993926B2 (en) 2006-05-15 2011-08-09 University Of Maryland, College Park Guard cell-specific tool for molecular manipulation of drought avoidance/water loss in plants
WO2008062049A1 (en) * 2006-11-24 2008-05-29 Cropdesign N.V. Transgenic plants comprising as transgene a class i tcp or clavata 1 (clv1) or cah3 polypeptide having increased seed yield and a method for making the same
WO2008134571A1 (en) * 2007-04-27 2008-11-06 University Of California Plant co2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1111051B1 (en) * 1999-12-21 2005-02-23 Korea Kumho Petrochemical Co. Ltd. Promoter for guard cell-specific gene expression in plants
WO2005085449A2 (en) * 2004-02-27 2005-09-15 Universita' Degli Studi Di Milano Stomatal guard cell specific promoter

Non-Patent Citations (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAL16116, 10.10,2001, A thaliana carbonic anhydrase, putative 347 AAs *
AAM65380, 27.01.2006, A thaliana carbonic anhydrase, putative 258 AAs AAG50705, 19.01.2001, A thaliana carbonic anhydrase, putative 290 AAs *
AC003979, 05.01.2001, A thaliana chromosome 1 ВАС T22J18 sequence *
Alain Vavasseur and Agepati S. Raghavendra "Guard cell metabolism and CO2 sensing", New Phytologist, 2005, vol. 165, pages 665-682 - See whole document *
Asaph В. Cousins et al.: "A Transgenic Approach to Understanding the Influence of Carbonic Anhydrase on C18OO Discrimination during C4 Photosynthesis", Plant Physiology, October 2006, vol. 142, pages 662-672 - See whole document *
AY074346, 23.09.2002, A thaliana At2g42600 mRNA sequence *
Christine A Raines et al.: "Arabidopsis thaliana carbonic anhydrase cDNA sequence and effect of CO2 on mRNA levels", Plant Molecular Biology, 1992, vol. 20, pages 1143-1148 - See whole document *
Jiao Demao et al.: "Physiological characteristics of the primitive CO2 concentrating mechanism in PEPC transgenic rice", Science in China, August 2003, vol. 4, pages 438-446 - See abstract and results at page 438, 441 and 442 *
M. Jeanneau et al.: "Manipulating PEPC levels in plants", journal of Experimental Botany, September 2002, vol. 53, pages 1837-1845 - See abstract and "Transgenic plants" at page 1841-1843 *
Nathalie Majeau et al.: "Modification of carbonic anhydrase activity by antisense and over-expression constructs in transgenic tobacco", Plant Molecular Biology, 1994, vol. 25, pages 377-385 - See abstract, fig. 1, materials and methods, tabl. 2 and results for 'gas exchage analysis' *
NM001036102, 09.06.2006, A thaliana PEPC (ATPPC1) mRNA sequence *
NM105379, 09.06.2006, A thaliana RuBisCO, coding sequence *
NM105548, 16.09.2003, A thaliana PEPC-related (Atlg68750), coding sequence *
NM112356, 20.04.2007, A thaliana PEPC (ATPPC3) mRNA sequence *
NM123202, 09.06.2006, A thaliana RuBisCO (AT5G38410), coding sequence *
NM123203, 20.04.2007, A thaliana RuBisCO small subunit 2B (RBCS-2B) (ATS2B) (AT5G38420), coding sequence *
NM123204, 23.02.2005, A thaliana RuBisCO small subunit 1B (At5g38430), coding sequence *
Robert T., Furbank and William С., Taylor, "Regulation of Photosynthesis in C3 and C4 Plants A Molecular Approach", The Plant Cell, July 1995, vol. 7, pages 797-807 - See whole document *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3196310A1 (en) 2017-07-26
AU2008245611B2 (en) 2014-09-18
US20100299782A1 (en) 2010-11-25
US20170067074A1 (en) 2017-03-09
AR069032A1 (es) 2009-12-23
UA101156C2 (ru) 2013-03-11
CA3017478A1 (en) 2008-11-06
EP2147100A1 (en) 2010-01-27
EP2147100A4 (en) 2010-09-22
CA2685425C (en) 2018-10-30
CL2012000197A1 (es) 2012-08-03
US9505811B2 (en) 2016-11-29
EA200901457A1 (ru) 2010-04-30
CA2685425A1 (en) 2008-11-06
EA201300790A1 (ru) 2013-11-29
MX347887B (es) 2017-05-16
MX2009011591A (es) 2010-04-01
US8916745B2 (en) 2014-12-23
EA029920B1 (ru) 2018-05-31
CN101688201A (zh) 2010-03-31
US10378021B2 (en) 2019-08-13
EP2147100B1 (en) 2017-06-07
AU2008245611A1 (en) 2008-11-06
CN103555735B (zh) 2016-03-09
CN103555735A (zh) 2014-02-05
BRPI0811023A2 (pt) 2014-10-07
CL2008003155A1 (es) 2008-12-19
CN101688201B (zh) 2013-08-21
BRPI0811023B1 (pt) 2019-01-02
ZA200907498B (en) 2014-10-29
ZA201405521B (en) 2018-05-30
EP3196310B1 (en) 2020-07-08
US20140298543A1 (en) 2014-10-02
WO2008134571A1 (en) 2008-11-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EA019514B1 (ru) Сенсоры coрастений, нуклеиновые кислоты, кодирующие их, способы их получения и применение
US9567601B2 (en) Photosynthetic resource use efficiency in plants expressing regulatory proteins
US8785616B2 (en) Constitutive photomorphogenesis 1 (COP1) nucleic acid sequence from Zea mays and its use thereof
US10597667B2 (en) Stress tolerance in plants
BRPI0715161B1 (pt) Plants with growth and size increased.
EA029904B1 (ru) Уменьшение содержания насыщенных жирных кислот в семенах растений
BRPI0809163A2 (pt) Célula de planta trangeênica ou uma planta transgênica, polinucleotídeo isolado, polipeptídeo isolado, e, métodos de produzir uma planta transgênica, e de aumentar um crescimento e/ou rendimento da planta sob condições normais ou limitidas em água e/ou aumentar uma tolerância da planta a um estresse ambiental
CN110408650A (zh) NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实产量中的应用
CN115161339A (zh) 一种高温诱导SlWRKY3基因增强番茄耐热性的方法
US10344294B2 (en) Resource use efficiency improvement in plants
CN110612022B (zh) 产生碳水化合物的植物材料
CN104945492B (zh) 植物耐逆性相关蛋白TaAREB3及其编码基因与应用
CN101679968A (zh) 增强植物耐缺铁性的多肽及其应用
CN110373425A (zh) NOR-like1基因及其编码的蛋白质在调控番茄果实采后失水中的应用
AU2014218400B2 (en) Plant CO2 sensors, nucleic acids encoding them, and methods for making and using them
BRPI0116305B1 (pt) moléculas de dna associadas com proliferação e desenvolvimento de células de plantas e métodos de produzir plantas com tamanho de órgão aumentado.
US9944943B2 (en) Method of producing stress tolerant plants overexpressing CaSUN1
WO2014093614A2 (en) Photosynthetic resource use efficiency in plants expressing regulatory proteins ii

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU