EA015910B1

EA015910B1 - Производные бензотиазинона и их применение в качестве антибактериальных средств

Info

Publication number: EA015910B1
Application number: EA200870564A
Authority: EA
Inventors: Вадим А. Макаров; Стюарт Т. Коул; Уте Мелльманн
Original assignee: Ляйбниц Инститьют Фор Нэчерал Продакт Ресерч Энд Инфекшн Байолоджи Э. Ф. Ханс-Кнелль-Институт (Хки)
Priority date: 2006-05-24
Filing date: 2006-05-24
Publication date: 2011-12-30
Also published as: NZ573833A; AU2006343832A1; US20090239851A1; DK2029583T3; DE602006014885D1; AP2444A; IL195453A0; TNSN08474A1; CA2652841A1; PT2029583E; BRPI0621693B8; BRPI0621693A2; CR10519A; AP2008004723A0; ES2345902T3; US20110160193A1; IL195453A; EA200870564A1; JP5068813B2; BRPI0621693B1

Abstract

Новые производные бензотиазина формулы (I) и их применение в качестве антибактериальных средств при инфекционных заболеваниях, вызванных бактериями, особенно туберкулеза (ТВ) и проказы, вызванных микобактериями, где Rи Rявляются независимо друг от друга NO, CN, трифторметилом, галогеном, CONRV, COOR, CHO, SONRRили OCF; Rи Rявляются независимо друг от друга Н или метильной группой; Rи Rявляются независимо друг от друга линейным или разветвленным алифатическим радикалом, имеющим 1-8 членов цепи, или Rи Rвместе представляют собой двухвалентный радикал -(CR)-, где m равно 1-4, или Rи Rвместе представляют собой двухвалентный радикал, указанный в формуле изобретения; R, Rи Rявляются независимо друг от друга Н или линейным, или разветвленным алифатическим радикалом, имеющим 1-7 членов цепи, или фенилом.

Description

Настоящее изобретение относится к новым производным бензотиазина и их применению в качестве антибактериальных средств при инфекционных заболеваниях млекопитающих (людей и животных), вызванных бактериями, особенно таких заболеваний как туберкулез (ТВ) и проказа, вызванные микобактериями.

Тиазиноны, их производные и их применение в качестве антибактериальных средств, особенно против микобактерий (ТВ), выложено для публики, например, в ЛК 242567 А1, ЛИ 3704400 А1, СА 1322551 С1 или ЕР 0245901 В1.

Как известно, наблюдается всемирный угрожающий рост инфекций туберкулеза микобактериями, развившими резистентность к доступным терапевтическим средствам (В.К.В1оот, 1.Ь.Миггау, ТиЬетси1о818: соттеШату оп а геетегдеи! кШег. 8с1еисе 257, 1992, 1055-1064). Исключительно опасным является развитие микобактерий с множественной лекарственной резистентностью (МОК). Это микобактерий, резистентные к двум или более из наиболее активных противотуберкулезных лекарственных средств, изониазиду и рифампицину, но также и к стрептомицину, пиразинамиду и этамбутолу. В некоторых странах доля МЭК-ТВ уже составляет более 20%. Вместе с увеличением общего числа заболеваний ТВ во всем мире это является причиной смерти приблизительно 3000000 человек в год.

Для лечения таких заболеваний как ТВ или проказа настоятельно требуются новые лекарственные средства с новыми механизмами действия, особенно для преодоления лекарственной резистентности и для преодоления известных тяжелых побочных эффектов доступных лекарственных средств.

Цель изобретения

Настоящее изобретение имеет целью создание новых соединений с активностью против микобактерий в качестве новых сильных противотуберкулезных лекарственных средств для преодоления проблем, связанных с резистентностью и непереносимостью лекарственных средств.

Решение технической проблемы

Эту цель достигают предоставлением соединений формулы I

или их соли, где К¹ и К² являются, независимо друг от друга, ΝΟ2, ΟΝ, трифторметилом, галогеном, ΟΟΝΚ⁷Β⁸, СООК⁹, СНО, §О2К1К⁷К⁸ или осг₃;

К³ и К⁴ являются, независимо друг от друга, Н или метильной группой;

К⁵ и К⁶ являются, независимо друг от друга, линейным или разветвленным алифатическим радикалом, имеющим 1-8 членов цепи, или К⁵ и К⁶ вместе представляют собой двухвалентный радикал -(СК⁹ ₂)_т-, где т равно 1-4, или К⁵ и К⁶ вместе представляют собой двухвалентный радикал:

К⁷, К⁸ и К⁹ являются, независимо друг от друга, Н или линейным или разветвленным алифатическим радикалом, имеющим 1-7 членов цепи, или фенилом.

В предпочтительном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), выбранным из группы, состоящей из

2-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(4,4-диэтоксипиперидин-1 -ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она,

7- метил-2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(2,3-диметил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(1,5-диокса-9-азаспиро[5.5]ундец-9-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(1,5-диокса-9-азаспиро[5.5]ундец-9-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрила, 2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрила,

8- амино-2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрила и 8-амино-2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро [4.5] дец-8-ил)-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она. Для синтеза соединений, являющихся целью настоящего изобретения, авторы разработали оригинальный способ синтеза 1,3-бензотиазин-4-она с применением дитиокарбаматных производных в качестве промежуточного соединения (способ А). Можно также применять классический способ синтеза 1,3бензотиазин-4-она с применением тиоцианатных солей (способ В). Оба способа представлены на схеме,

- 1 015910 приведенной ниже.

Неожиданно, соединения согласно изобретению проявляют сильную антибактериальную активность, особенно против микобактерий с минимальными концентрациями ингибирования (М1С) в диапазоне от 0,23 пг/мл до >10 мкг/мл для быстро растущих микобактерий, 0,195-1,56 мкг/мл для М. 1иЬегси1о818, включая штаммы с множественной резистентностью, определенными классическим способом, и 0,030 мкг/мл для М. 1иЬегси1о818 Η37Κν, определенной способом и использованием А1атаг В1ие. Неожиданно соединения согласно настоящему изобретению демонстрируют высокий уровень селективности только для микобактерий, что очень сильно уменьшает вероятность неблагоприятных побочных эффектов.

В 808-хромотесте было установлено, что соединения согласно настоящему изобретению являются немутагенными при 5 мг/мл.

В модели туберкулезной инфекции у мышей ίη νίνο соединения согласно настоящему изобретению были более терапевтически активными, чем главное противотуберкулезное лекарственное средство изониазид, примененный в качестве положительного контроля. Выжило 100% мышей. Все контрольные животные умерли до 33-го дня.

Соединение согласно настоящему изобретению (особенно соединение № 2 - пример 1 в описании вариантов осуществления), нетоксично после введения рег 08 в дозах до 2000 мг/кг; оно хорошо переносилось животными в первые часы после введения и в течение последующих 24 ч. В течение 7 дней исследования соединение 2 не вызывало изменений в общем состоянии и поведении мышей, оно не влияло на двигательную и рефлекторную активность, циклы активности и покоя, груминг, потребление пищи, не было случаев смерти животных. Для соединения 2 величина ЬЭ₅₀ составляет более 2000 мг/кг.

Таким образом, соединения согласно настоящему изобретению можно применять для лечения туберкулезной инфекции и других микобактериальных инфекций у людей и животных.

Соответственно, настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим соединение формулы I.

Кроме того, настоящее изобретение относится к соединению формулы I для применения в способе лечения бактериальных инфекций у животных. Предпочтительными соединениями формулы I для применения в таком способе являются соединения, конкретно названные выше.

Соединения настоящего изобретения получают в применяемых лекарственных формах, приготавливая разбавленный раствор или суспензию в фармацевтически приемлемой водной, органической или водно-органической среде для местного или парентерального введения внутривенной, подкожной или внутримышечной инъекцией; или получают в форме таблетки, капсулы или водной суспензии с традиционными эксципиентами для перорального введения или в качестве суппозитория.

Соединения можно применять в дозах от 0,001 до 1000 мг на кг массы тела.

Примеры, которые следуют ниже в экспериментальной части, служат для иллюстрирования настоящего изобретения, но их не следует рассматривать как его ограничение.

Структуры соединений согласно настоящему изобретению были установлены с помощью синтеза и элементного анализа, ядерного магнитного резонанса и/или масс-спектров, а также с помощью рентгеноструктурного анализа.

- 2 015910

Варианты осуществления Исходные материалы

Химические реагенты и растворители приобретали у Ьапсайег 8уп1йе5Й (ЬаисакЫге, Англия) или у Л1бпс11 (81дта-А1бт1сй Сотрапу, §1-Ьош8, США) и использовали в синтезе без дополнительной очистки. Температуры плавления не скорректированы, их определяли согласно процедуре Британской фармакопеи (Е1ес1го111егта1 9001, Великобритания). Если в результатах анализов указаны только символы элементов, то такие результаты анализа находятся в пределах ±0,3% теоретических значений (Сат1о-ЕтЬа 5500, Италия). Спектры ЯМР определяли с помощью прибора Уапап Иийу Р1и§ 400 (И8А). Сдвиги для ¹Н-ЯМР приведены в ч./млн, по полю от ТМ8 (δ). Масс-спектры получали с использованием прибора Ешшдап 880-700 (И8А) с прямым впрыском. Реакции и чистоту соединений контролировали с помощью ТСХ с использованием алюминиевых пластинок 8Шсаде1 60 Г₂₅₄ (Мегск Со, Германия).

Пример 1. 2-( 1,4-Диокса-8-азаспиро [4.5] дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-он, (соединение 1)

Способ А.

К перемешиваемым 50 мл раствора 25% водного аммиака по каплям добавляли раствор 5 г 2-хлор3-нитро-5-трифторметилбензоилхлорида (И.Е.^е1сй, К.К.Ватоп, В.А.Вийоп, 1. Меб. Сйет. 12; 2; 1969; 299-303) в ацетонитриле (10 мл) при -20°С. Спустя 10 мин добавляли 50 мл этилацетата. Органическую фазу отделяли, дважды промывали водой, сушили над Иа₂8О₄, обрабатывали активированным углем, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали кристаллизацией из этанола. Выход 2-хлор-3-нитро-5-(трифторметил)бензамида составлял 92%. Т.пл. 195-197°С (метанол).

Анализ: Рассчитано для С₈Н₄С1ГзИ₂Оз: С, 35,78; Н, 1,50; Ν, 10,43

Найдено: С, 36,01; Н, 1,53; Ν, 10,39

0,5 г 2-хлор-3-нитро-5-(трифторметил)бензамида растворяли в 25 мл этанола. Реакционную смесь обрабатывали 0,5 г дигидрата натриевой соли 1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8-карбодитионовой кислоты (Ζ. Ое, В. Ь1, Т. Сйепд, 8уп111. Соттип., 29, 18, 1999, 3191-3196) и хранили в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем ее выливали в 50 мл холодной воды и отфильтровывали образовавшийся желтый осадок. Чистый конечный продукт получали после двукратной перекристаллизации из этанола. 2(Аминокарбонил)-6-нитро-4-(трифторметил)фенил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8-карбодитиоат является желтым кристаллическим твердым веществом. Выход 0,47 г-%. Т.пл. 138-140°С.

Анализ: Рассчитано для С_ПН₁₂И₄О₂8₂: С, 42,57; Н, 3,57; Ν, 9,31; 8, 14,21

Найдено: С, 42,61; Н, 3,67; Ν, 9,22; 8, 14,30

0,4 г 2-(аминокарбонил)-6-нитро-4-(трифторметил)фенил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]декан-8карбодитиоата растворяли в 25 мл этанола. Реакционную смесь обрабатывали 0,32 г №₂НРО₄/ 12Н₂О и кипятили с обратным холодильником в течение 6 ч. Затем ее охлаждали и светло-желтый осадок отфильтровывали и промывали 30 мл метанола. Чистый конечный продукт получали после двукратной перекристаллизации из этанола. 2-(1,4-Диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-трифторметил)-1,3бензотиазин-4-он является светло-желтым кристаллическим твердым веществом. Выход 0,47 г-%. Т.пл. 211-212°С.

Р_г (гексан-ацетон; 2/1) - 0,35

МС т/ζ 417 (М+).

^!Н ЯМР (ИМ8О-б₆) δ 8,83 и 8,77 (два 1Н, два с, 2СН), 3,80 (8Н, широкий с, ^СН₂СН₂)₂С), 2,02 (4Н, широкий с, ОСН₂СН₂О) ч./млн.

Анализ: Рассчитано для С1бН1₄Е₃^О58: С, 4 6,04; Н, 3,38; Ν, 10,07; 8, 7,68

Найдено: С, 45,94; Н, 3,37; Ν, 10,09; 8, 7,76

Способ В.

Процедура в деталях была такой же, как описано в 1. 1тпсй, Р. КпШап, Со11. Сζесй. Сйет. Соттип., 47, 1982, 3268-3282; Ό. Коксчк, Р. КпШап, 1. Оопба, Е. Иапбагоуа, Со11. Сζесй. Сйет. Соттип., 48, 1983, 3315-3328; Ό. Коксчк, Р. КпШап, О. Еог§ас, Со11. Сζесй. Сйет. Соттип., 48, 1983, 3427-3432; Т. Н. Стоит, Н.-1.Е. Не55. Патент США 3522247. Выход 2-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она составлял 0,21%. По спектроскопическим данным это соединение было идентичным соединению, синтезированному способом А.

Пример 2. 2-(2-Метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3бензотиазин-4-он (соединение 2)

Следуя процедуре примера 1. Светло-желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 54%. Т.пл. 192-3°С.

Р_г (гексан-ацетон; 2/1) - 0,30.

МС т/ζ 431 (М+) .

^!Н ЯМР (ИМ8О-б₆) δ 8,81 и 8,77 (два 1Н, два с, 2СН), 4,24 (1Н, м, СН), 4,11 (1Н, м, СН), 4,06 (4Н, широкий с, ЖСН₂)₂), 3,47 (1Н, т, СН), 3,27 (1Н, с, СН), 1,80 (4Н, широкий д, С(СН₂)₂), 1,23 (3Н, д, СН₃) ч/млн.

Анализ: Рассчитано для С17Н1_&Н₃О₅8: С, 47,33; Н, 3,74; Ν, 9,74; 8, 7,43

- 3 015910

Найдено: С, 47,36; Н, 3,80; Ν, 9,87; 8, 7,51

Пример 3. 2-(1,4-Диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-он (соединение 3)

Следуя процедуре примера 1 с использованием 2-гидрокси-3,5-динитробензойной кислоты в качестве исходного материала. Светло-желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 43%. Т.пл. 271-3°С (ΕΐΟΗ/ΩΜΡ).

К_£ (гексан-ацетон; 2/1) - 0,25.

МС т/ζ 394 (М⁺) .

¹Η ЯМР (ΌΜ8Ο-ά₆) δ 9,15 и 9,12 (два 1Н, два с, 2СН), 3,86 (8Н, широкий с, N (СН₂СН₂)₂С), 2,97 (4Н, широкий с, ОСН₂СН₂О) ч./млн.

Анализ: Рассчитано для Ο₁₅Η₁₄Ν₄Ο₇8: С, 45,68; Н, 3,58; Ν, 14,21; 8, 8,13

Найдено: С, 45,34; Н, 3,56; Ν, 14,30; 8, 7,98

Пример 4. 2-(2-Метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]децил-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-он (соединение 4)

Следуя процедуре примера 1 с использованием 2-гидрокси-3,5-динитробензойной кислоты в качестве исходного материала. Желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 57%. Т.пл. 139-142°С (ΕΐΟΗ/ΩΜΕ).

К_£ (гексан-ацетон; 2/1) - 0,50.

МС т/ζ 408 (М⁺).

¹Н ЯМР (ΌΜ8Ο-ά₆) δ 9,08 и 9,11 (два 1Н, два с, 2СН), 4,23 (1Н, м, СН), 4,10 (1Н, м, СН), 4,06 (4Н, широкий с, Ν(ΟΗ₂)₂), 3,43 (1Н, т, СН), 3,27 (1Н, с, СН), 1,80 (4Н, широкий д, С(СН₂)₂), 1,20 (3Н, д, СН₃) ч./млн.

Анализ: Рассчитано для Ο₁₆Η₁₆Ν₄Ο₇8: С, 47,06; Н, 3,95; Ν, 13,72; 8, 7,85

Найдено: С, 46,87; Н, 3,91; Ν, 13,57; 8, 7,83

Пример 5. 2-(2,3-Диметил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3бензотиазин-4-он (соединение 5)

Следуя процедуре примера 1 с использованием 2-гидрокси-3,5-динитробензойной кислоты в качестве исходного материала. Светло-желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 58%. Т.пл. 205207°С (ΕΐΟΗ/ΏΜΡ).

К_£ (гексан-ацетон; 2/1) - 0,55.

МС т/ζ 44522 (М*) .

¹Н ЯМР (ΌΜ8Ο-ά₆) δ 8,82 и 8,77 (два 1Н, два с, 2СН), 3,86 (4Н, широкий с, Ν(ΟΗ₂)₂), 3,45-3,53 (2Н, м, 2СН), 2,41 (4Н, широкий д, С(СН₂)₂), 1,13-1,17 (6Н, м, 2СН₃) ч./млн.

Анализ: Рассчитано для Ο₁₈Η₁₈Ρ₃Ν₃Ο₅8: С, 48,54; Н, 4,07; Ν, 9,43; 8, 7,20

Найдено: С, 48,66; Н, 4,12; Ν, 9,32; 8, 7,46

Пример 6. 2-(4,4-Диэтоксипиперидин-1-ил)-6,8-динитро-1, 3-бензотиазин-4-он (соединение 6)

Следуя процедуре примера 1 с использованием 2-гидрокси-3,5-динитробензойной кислоты в качестве исходного материала. Желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 32%. Т.пл. 179-181°С (изоΡγΟΗ).

К_£ (гексан-ацетон; 2/1) - 0,30.

МС т/ζ 424 (М*) .

¹Η ЯМР (ΌΜ8Ο-ά₆) δ 9,08 и 9,11 (два 1Н, два с, 2СН), 3,60-3,67 (4Н, м, Ν(ΟΗ₂)₂), 2,11-2,08 (4Н, м, С(СН₂)₂), 3,47 и 3,57 (два 2Н, кв., 2ОСН₂), 1,16 (6Н, т, 2СН₃), ч./млн.

Анализ: Рассчитано для Ο₁₇Η₂₀Ν₄Ο₇8: С, 48,11; Н, 4,75; Ν, 13,20; 8, 7,56

Найдено: С, 48,12; Н, 4,73; Ν, 13,41; 8, 7,67

Пример 7. 2-(7,12-Диокса-3-азаспиро[5,6]додец-3-ил)-6,8-динитро-1, 3-бензотиазин-4-он (соединение 7)

Следуя процедуре примера 1 с использованием 2-гидрокси-3,5-динитробензойной кислоты в качестве исходного материала. Желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 51%. Т.пл. 193-195°С (изоΡγΟΗ/ΏΜΡ).

К_£ (гексан-ацетон; 2/1) - 0,45.

МС т/ζ 422 (М*).

¹Η ЯМР (ΌΜ8Ο-ά₆) δ 8,97 и 9,16 (два 1Н, два с, 2СН), 3,57-3,74 (8Н, м, 4СН₂), 1,93-2,35 (8Н, м, 4СН2) ч/млн.

Анализ: Рассчитано для Ο₁₇Η₁₈Ν₄Ο₇8: С, 48,34; Н, 4,30; Ν, 13,2 6; 8, 7,56

Найдено: С, 48,21; Н, 4,43; Ν, 13,30; 8, 7,66

Пример 8. 2-(1,4-Диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-7-метил-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-он (соединение 8)

Следуя процедуре примера 1 с использованием 2-гидрокси-3,5-динитробензойной кислоты в качестве исходного материала. Желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 51%. Т.пл. 207-210°С (изоΡγΟΗ/ΏΜΡ).

К_£ (гексан-ацетон; 2/1) - 0,30.

- 4 015910

МС т/ζ 408 (М⁺) .

Ή ЯМР (ΌΜδΘ-ά₆) δ 8,77 (1Н, с, СН), 3,86 (8Н, широкий с, ^СН₂СН₂)₂С), 2,97 (4Н, широкий с, ОСН₂СН₂О) , 2,79 (3Н, с, СН₃) ч/млн.

Анализ: Рассчитано, для С₁₆Н₁₆Н₄О₇8: С, 47,06; Н, 3,95; Ν, 13,72; 8, 7,85

Найдено: С, 47,12; Н, 4,01; Ν, 13,69; 8, 7,94

Пример 9. 2-(1,4-Диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрил (соединение 9)

К перемешиваемому раствору 5 г (19 ммоль) 2-гидрокси-5-иодбензойной кислоты в 50 мл ΌΜΡ небольшими порциями добавляли 5 г (22 ммоль) сухого ^ΟΝ (I) . Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником в течение 5 ч и добавляли 100 мл воды и 50 мл этилацетата. После этого очень осторожно, в условиях хорошей вентиляции, добавляли концентрированную хлористо-водородную кислоту до рН~3. Органическую фазу отделяли, дважды промывали в воде, сушили над №1₂8О₄. обрабатывали активированным углем, фильтровали и концентрировали в вакууме. Неочищенный продукт очищали кристаллизацией из воды. Выход 5-циано-2-гидроксибензойной кислоты составлял 71%. Затем следовала процедура примера 1. Выход 44%. Т.пл. 217-220°С (ЕЮН/ΌΜΡ).

И (гексан-ацетон; 2/1) - 0,50.

МС т/ζ 374 (М*) .

Ή ЯМР (1)\18О-б₆) δ 8,74 и 8,67 (два 1Н, два с, 2СН), 3,41 (8Н, широкий с, ^СН₂СН₂)₂С), 2,93 (4Н, широкий с, ОСН₂СН₂О) ч./млн.

Анализ: Рассчитано для С₁₆Н₁₄^О₅8: С, 51,33; Н, 3,77; Ν, 14,97; 8, 8,57

Найдено: С, 51,30; Н, 3,84; Ν, 14,89; 8, 8,62

Пример 10. 2-(2-Метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6карбонитрил (соединение 10)

Следуя процедуре примера 9. Желтое кристаллическое твердое вещество. Выход 34%. Т.пл. 251253°С (ЕЮН/ΌΜΡ).

И (гексан-ацетон; 2/1) - 0,40.

МС т/ζ 388 (М*).

Ή ЯМР (1)\18О-б₆) δ 8,73 и 8,61 (два 1Н, два с, 2СН) , 4,23 (1Н, м, СН), 4,11 (1Н, м, СН), 4,07 (4Н, широкий с, ЖСН₂)₂), 3,51 (1Н, т, СН), 3,27 (1Н, с, СН), 1,81 (4Н, широкий д, С(СН₂)₂), 1,22 (3Н, д, СН₃) ч/млн.

Анализ: Рассчитано для С1₇Н₁₆^О₅8: С, 52,57; Н, 4,15; Ν, 14,43; 8, 8,26

Найдено: С, 52,42; Н, 4,08; Ν, 14,50; 8, 8,27

Пример 11. 2-(1,5-диокса-9-азаспиро[5.5]ундец-9-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6карбонитрил (соединение 11)

Следуя процедуре примера 9. Желтое кристаллическое твердое вещество.

Выход 40%. Т.пл. 230-232°С (ЕЮН/ΌΜΡ).

И (гексан-ацетон; 2/1) - 0,15.

МС т/ζ 388 (М*) .

Ή ЯМР (1)\18О-б₆) δ 8,74 и 8,61 (два 1Н, два с, 2СН), 3,29-3,65 (6Н, м, 3СН₂), 2,38 (4Н, широкий с, 2СН₂) , 1,82-1,93 (4Н, м, 2СН₂) ч./млн.

Анализ: Рассчитано для С₁₇Н₁^4О₅8: С, 52,57; Н, 4,15; Ν, 14,43; 8, 8,26

Найдено: С, 52,52; Н, 4,11; Ν, 14,59; 8, 8,13

Пример 12. Определение ингибиторной активности ίη νίΐτο против микобактерий у соединений согласно настоящему изобретению

Антибактериальную активность соединений против ΜусοЬасΐе^^иш ктедтайк 80 987, М. аигеит 8В66, М. νассае ΙΜΕΤ 1010670 и М, ГойшШт В испытывали посредством определения минимальных ингибирующих концентраций (ΜΙΕ) способом микроразведений среды в среде Μие11е^-Н^ηΐοη (ΌίΓοο) согласно рекомендациям Νί.’ί.’Ε8 |№Шопа1 СоштШее Гог Сйшса1 ЬаЬота1огу 81апбатбк: Μеΐйοбк Гог ббиΐίοη ап1шисгоЫа1 киксербЬййу 1ек1к Гог Ьас1епа ΐΐιηΐ βΐυ\ν аегоЬ1са11у; 5'¹¹ Еб.; V^11аηονа, Еб.; Арргспеб к1апбагб Ооситеп1 Μ7-Α5. ^СЬ8, (2000)].

Активность против М. ШЬегси1о818 Н37Р\^г испытывали следующим способом определения минимальных ингибирующих концентраций (ΜΙΕ) и минимальных бактерицидных концентраций (МВС).

Штаммы высевали на твердую среду Ьотеепк1е1п-1епкеп. Спустя 21 день выросшие культуры применяли для получения суспензии инокулята (посевного материала), соответствующей 5х 10⁸ микробиальных клеток в мл. 0,2 мл этой суспензии инокулировали в пробирки с 2 мл жидкой среды Школьниковой, содержащей соответствующие концентрации испытуемых соединений, от 100,0 до 0,195 мг/мл. После 14 дней инкубации при 37°С пробирки с жидкой средой центрифугировали в течение 15 мин при 3000 об/мин. После отбрасывания супернатанта осадок ресуспендировали в 0,8 мл стерильного 0,9% №С1. 0,1 мл суспензии использовали для получения мазков, которые затем окрашивали способом Циля-Нильсена. Оставшийся осадок высевали в 0,2-мл объемы в три пробирки с твердой средой ЬотепКеш-.Тепкеп, свободной от лекарственных средств для определения минимальных бактерицидных концентраций (МВС).

- 5 015910

Результаты регистрировали после 21-28 дней культивирования при 37°С. Контрольными были пробирки, культивированные с тестовыми штаммами, не обработанными испытуемыми агентами.

Минимальными бактерицидными концентрациями лекарственных средств (МВС) считали концентрации лекарственных средств, полностью ингибирующие рост микобактерий на твердой среде. Бактериостатический эффект (М1С) характеризовался присутствием только отдельных микобактерий в мазке и сильным снижением числа колоний, выросших на твердых средах, по сравнению с контролем.

Результаты представлены в табл. 1 и 2.

Таблица 1. Антимикробная активность соединений формулы I, определенная по минимальным ингибирующим концентрациям М1С [мкг/мл]

Соединение	М. зтедтаМз	М. 7ассае	М. ГогОиЮит.
1	12,5 нг/мл	3,12 нг/мл	12,5 нг/мл
2	1,56 нг/мл	0,76 пг/мл	0,023 пг/мл
3	0, 2 мкг/мл	0,0015 мкг/мл	0,006 мкг/мл
4	0,2 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0,003 мкг/мл
5	6,25 нг/мл	0,078 нг/мл	0,078 нг/мл
6	>10 мкг/мл	0,04 мкг/мл	0,08 п г/мл
7	0,78 мкг/мл	0,003 мкг/мл	0,003 мкг/мл
8	0,4 мкг/мл	0,025 мкг/мл	0,025 мкг/мл
9	0,05 мкг/мл	3,12 нг/мл	25 нг/мл
10	25 нг/мл	3,12 нг/мл	12,5 нг/мл
11	0,05 мкг/мл	6,25 нг/мл	25 нг/мл

Таблица 2. Антимикробная активность соединений формулы I против МусоЬас1егшш 1иЬегси1о818 Η37Βν и клинических изолятов 6341 и 6374, определенная по минимальным ингибирующим концентрациям (М1С) и минимальным бактерицидным концентрациям (МВС)

Штамм.	Соединение	МВС (мкг/мл)	М1С (мкг/мп)	МВС (мкг/мл)	М1С (мкг/мл) среднее
Η37Κν	10	0,58	0,39	0, 71	0, 45
6341	0,76	0 ., 58
6374		0,78	0,39
Η37Κν		0,29	0, 195	0,75	0, 52
6341	9	1,17	0,78
6374		0,78	0,58
Η37Ην		0, 58	0, 39	0, 45	0,29
6341	2	0, 39	0,29
6374		0, 39	0,195
Η37Ην		0, 58	0,39	0, 45	0,39
6341	5	0, 39	<0,39
6374		0, 39	<0,39
Η37Κν		0, 58	0, 39	1,75	1,17
6341	1	2, 34	1,56
6374		2, 34	1,56
Η37Κν	Изониазид	1,15	0, 97	1,15	0,97
6341	(ΙΝΗ)	>100	>100	неактивно, >100
6374	>100	>100	неактивно, >100

Пример 13. Определение ингибиторной активности ίη νίνο против МусоЬас1егшш 1иЬетси1о818 у соединений согласно настоящему изобретению в модели ТВ у мышей

Для определения химиотерапевтической эффективности авторы настоящего изобретения использовали мышей линии ВАЬВ/с с экспериментальным гематогенно диссеминированным туберкулезом. Мышей получали в Центральном Зоологическом Питомнике Российской Академии Медицинских Наук. В настоящее исследовании авторы включали только самцов мышей, стандартизованных по массе тела (2025 г) и прошедших карантин. Мышей инфицировали 2-недельной вирулентной культурой МусоЬас1егшш 1иЬегси1о818 Η37Βν внутривенной инъекцией (в хвостовую вену) суспензии микобактерий в дозе 5х10⁶СБИ (Со1опу Богшшд υηίΐ, колониеобразующих единиц) в 0,5 мл физиологического раствора соли. Всех экспериментальных животных разделяли на две группы в зависимости от примененного режима лечения (табл. 3). Дозы испытуемых лекарственных средств выбирали, основываясь на данных из литературы и на результатах предшествующих исследований.

- 6 015910

Таблица 3

Ν' группы	Соединение	Доза (мг/кг)	Количество животных в группе
3	2	12	10
4	2	25	10
5	Изониазид (ΙΝΗ)	25	10
6	Без лечения		10

Лечение начинали на следующий день после инфицирования. Лекарственные средства вводили перорально в форме суспензии с карбоксиметилцеллюлозой в воде с небольшим количеством РЕС-400.

Химиотерапию применяли ежедневно 6 раз в неделю (кроме воскресенья).

Животных забивали под эфирным наркозом. Для определения эффективности каждого режима лечения авторы регистрировали макроскопические изменения в паренхиматозных органах мышей, рост микобактерий из патологического материала на твердых средах, а также бактериоскопический индекс поражения органа. Авторы проводили качественный и количественный анализ макроскопических изменений в печени, селезенке и легких и рассчитывали индекс поражения (применяя четырехбалльную шкалу).

Макроскопическую оценку эффективности каждого режима лечения выражали индексом эффективности, рассчитанным по формуле

Индекс эффективности=100%-[(Индекс поражения в исследуемой группе)/(Индекс поражения в контрольной группе) ]х 100

Микробиологическое исследование включало культуру для определения СЕИ в паренхиматозных органах. Для этой цели авторы гомогенизировали правое легкое и отдельно селезенку с 6%-ной серной кислотой, центрифугировали, промывали водой и физиологическим раствором соли. Полученный материал (примерно 0,5 мл) разбавляли 1 мл физиологического раствора соли и гомогенизировали. Эту суспензию (0,5 мл) исследуемых органов разбавляли в 100 и 1000 раз физиологическим раствором соли и распределяли на твердой среде Είηη-2. Культуры инкубировали при 37°С в течение 1 месяца при еженедельной регистрации, начиная с десятого дня. Колониеобразующие единицы (СЕИ'к) подсчитывали после 28 дней.

Данные макроскопических и микробиологических исследований паренхиматозных органов мышей, умерших во время эксперимента, также учитывали в общей оценке экспериментальных результатов, представленных в табл. 4-6.

Таблица 4. Индексы поражения органов у мышей и эффективность лечения

Группа	Лекарственное средство	Доза (мг/кг)	Индекс поражения	Индекс эффективности (%)
3	Соединение 2	12	2,1	44,7
4	Соединение 2	25	1,0	78
5	ΙΝΗ, изониазид	25	1,2	70,5
6	Контроль	-	3,8	-

- 7 015910

Таблица 5. Результаты микробиологического исследования правого легкого и селезенки экспериментальных мышей

Группа	Соединение	Доза (ыг/кг)	правое легкое Культура, без разбавления	селезенка Культура, без разбавления .
3	2	12	-60	-60
4	2	25	-35	-3 5
5	ΙΝΗ, изониазид	25	-40	-40
б	Контроль	-	>120 (общий рост)	>120 (общий рост)

Таблица 6. Выживаемость животных

День лечения	Группа 3 Соединение 2	Группа 4 Соединение 2	Группа 5 ΙΝΗ	Группа 6 Контроль
1	10	10	10	10
2	10	10	10	10
3	10	10	10	10
4	10	10	10	10
5	10	10	10	10
6	10	10	10	10
7	10	10	10	10
8	10	10	10	10
9	10	10	10	10
10	10	10	10	10
11	10	10	10	10
12	10	10	10	10
13	10	10	10	9
14	10	10	10	9 ,
15	10	10	10	9
16	10	10	10	9
17	10	10	10	9
18	10	10	10	9
19	10	10	10	9
20	10	10	10	8
21	10	10	10	8
22	10	10	10	8
23	10	10	10	8
24	10	10	10	8
25	10	10	10	5

26	10	10	I¹⁰	4
27	100%	100%	[100%	40%

Все контрольные животные умерли до 33-го дня.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I) к* о (I) или его соль, где К¹ и К² являются, независимо друг от друга, ΝΟ₂, ΟΝ, трифторметилом, галогеном, ΟΟΝΚ’Κ⁸,

СООК⁹, СНО, 8Ο2ΝΚ⁷Κ⁸ или ОСЕ3;

К³ и К⁴ являются независимо друг от друга Н или метильной группой;

К⁵ и К⁶ являются, независимо друг от друга, линейным или разветвленным алифатическим радикалом, имеющим 1-8 членов цепи, или К⁵ и К⁶ вместе представляют собой двухвалентный радикал - 8 015910 (СК⁹ ₂)_т-, где т равно 1-4, или К⁵ и К⁶ вместе представляют собой двухвалентный радикал

Я⁷, К⁸ и К⁹ являются независимо друг от друга Н или линейным или разветвленным алифатическим радикалом, имеющим 1-7 членов цепи, или фенилом.
2. Соединение формулы (I) по п.1, где К¹ представляет собой ΝΟ2, К² является СЕ3. К³ и К⁴ являются Н, и К⁵ и К⁶ имеют значения, данные в п.1.
3. Соединение формулы (I) по п.1, где К¹ представляет собой ΝΟ₂, К² является ΟΝ, К³ и К⁴ являются Н, и К⁵ и К⁶ имеют значения, данные в п.1.
4. Соединение формулы (I) по п.1, где К¹ и К² представляют собой ΝΟ₂, К³ и К⁴ являются Н, и К⁵ и К⁶ имеют значения, данные в п.1.
5. Соединение формулы (I) по п.1, где К⁵ и К⁶ являются независимо С1_-8алкильными группами.
6. Соединение формулы (I) по п.1, выбранное из группы, состоящей из 2-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(7,12-диокса-3 -азаспиро [5,6] додец-3-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-7-метил-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрила, 2-(1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-6, 8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(4,4-диэтоксипиперидин-1 -ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 7-метил-2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро [4.5]дец-8-ил)-6,8-динитро-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(2,3-диметил-1,4-диокса-8-азаспиро [4.5] дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(1,5-диокса-9-азаспиро[5.5]ундец-9-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-она, 2-(1,5-диокса-9-азаспиро[5.5]ундец-9-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрила, 2-(2-метил-1,4-диокса-8-азаспиро [4.5] дец-8-ил)-8-нитро-4-оксо-1,3-бензотиазин-6-карбонитрила.
7. 2-(2-Метил-1,4-диокса-8-азаспиро[4.5]дец-8-ил)-8-нитро-6-(трифторметил)-1,3-бензотиазин-4-он.
8. Применение соединения формулы I или его соли по любому из предшествующих пунктов для получения фармацевтической композиции.
9. Применение соединения по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для терапевтического или профилактического лечения туберкулезной инфекции или инфекции проказы у млекопитающих.
10. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-7 и традиционный эксципиент.
11. Применение соединения по любому из пп.1-7 в способе терапевтического или профилактического лечения туберкулезной инфекции или инфекции проказы у млекопитающих.
12. Способ получения соединения формулы (I), включающий следующую стадию взаимодействия соединения формулы где заместители К¹, К², К⁵ и К⁶ имеют значения, определенные в п.1, и К³ и К⁴ являются атомами водорода, с Н₂О/ЕЮН.