EA015123B1 - ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРАЗОЛИЗОХИНОЛИНМОЧЕВИНЫ В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ p38 КИНАЗЫ - Google Patents

Abstract

Изобретение предлагает ингибиторы киназы формулы Iгде R, Rи X являются такими, как описано в данной заявке, или их фармацевтически приемлемую соль.

Description

Настоящее изобретение предлагает новые ингибиторы р38 киназы, полезные для лечения состояний, которые являются результатом чрезмерного продуцирования цитокинов.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает соединения формулы I

где X выбран из группы, которая включает

О и

(ί) (0)

К¹ представляет собой С₁-С₄ алкил, С₃-С₄ циклоалкил, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из группы, которая включает С₁-С₄ алкокси, метил и трифторметил; или С₁С4 алкилгалоген;

К² представляет собой фенил, необязательно замещенный С₁ -С₄ алкилом, или пиридинил, необязательно замещенный С1-С4 алкилом;

К³ представляет собой амино, С₁-С₄ алкил, С₁-С₄ алкокси, С₁-С₄ алкилгалоген, С₃-С₄ циклоалкил, необязательно замещенный заместителем, выбранным из метила, трифторметила или галогена; фенил или тиенил, каждый необязательно замещен первым заместителем, выбранным из группы, которая включает галоген, С₁-С₄ алкил и С₁-С₄ алкокси, и необязательно, кроме того, замещен вторым заместителем, выбранным из галогена; или их фармацевтически приемлемую соль.

Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования р38 киназы у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также предлагает способ подавления продуцирования фактора некроза опухолей α (ΤΝΡα) у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение также предлагает способ подавления продуцирования интерлейкина-1 β (1Ь1β) у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, эффективного количества соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли.

Настоящее изобретение, кроме того, предлагает способ лечения состояний, которые являются ре

- 1 015123 зультатом чрезмерного продуцирования цитокинов, у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, которое подавляет цитокины.

Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования роста чувствительного новообразования у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, которое ингибирует р38.

Настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования метастаза у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, которое ингибирует р38.

Настоящее изобретение также предлагает способ лечения ревматоидного артрита у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли в количестве, которое ингибирует р38.

Настоящее изобретение также предлагает фармацевтическую композицию, которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования р38 киназы. Кроме того, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для применения при ингибировании р38 киназы у млекопитающих. Кроме того, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, подходящую для ингибирования р38 киназы, которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для подавления продуцирования фактора некроза опухолей α (ΤΝΕ α). Дополнительно, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для применения при подавлении продуцирования фактора некроза опухолей α (ΤΝΕα) у млекопитающих. Настоящее изобретение предлагает также фармацевтическую композицию, подходящую для подавления продуцирования фактора некроза опухолей α (ΤΝΕα), которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для подавления продуцирования интерлейкина-ΐβ (ΓΕ-1β). Дополнительно, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для применения при подавлении продуцирования интерлейкина-ΐβ (ГС-1 β) у млекопитающего. К тому же, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, подходящую для подавления продуцирования интерлейкина-ΐβ (ΣΕ-Ιβ), которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения состояний, которые являются результатом чрезмерного продуцирования цитокинов. Дополнительно, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую с,оль для применения при лечении состояний, которые являются результатом чрезмерного продуцирования цитокинов у млекопитающих. К тому же, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, подходящую для лечения состояний, которые являются результатом чрезмерного продуцирования цитокинов, которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования роста чувствительного новообразования. Дополнительно, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для применения при ингибирования роста чувствительного новообразования у млекопитающих. К тому же, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, подходящую для ингибирования роста чувствительного новообразования, которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для ингибирования метастаза. Дополнительно, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для применения при ингибировании метастаза у млекопитающих. К тому же, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, подходящую для ингибирования метастаза, которая со

- 2 015123 держит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Настоящее изобретение также предлагает применение соединения формулы I или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения ревматоидного артрита. Дополнительно, настоящее изобретение предлагает соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль для применения при лечении ревматоидного артрита у млекопитающих. К тому же, настоящее изобретение предлагает фармацевтическую композицию, подходящую для лечения ревматоидного артрита, которая содержит соединение формулы I или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или больше фармацевтически приемлемыми наполнителями, носителями или разбавителями.

Подробное описание изобретения

Термин р38 киназа обозначает изоформы ρ38α и/или ρ38β киназы.

Термин подавление продуцирования ΤΝΕα (ГС-1 β, цитокинов) обозначает снижение избыточных уровней ΤΝΕα, ТС-1 β или другого цитокина ίη νίνο у млекопитающего до нормальных или субнормальных уровней. Такой эффект может быть достигнут с помощью ингибирования высвобождения ίη νίνο ΤΝΕα, [С-1 β или другого цитокина всеми клетками, включая макрофаги, с помощью понижающего регулирования, на геномном уровне, избыточных уровней ΤΝΕα, ТС-1 β или другого цитокина ίη νίνο у млекопитающего до нормальных или суб-нормальных уровней с помощью ингибирования синтеза ΤΝΕα, ^1β или другого цитокина как пост-трансляционного процесса или с помощью понижающего регулирования ΤΝΕα, ТС-1 β или другого цитокина на трансляционном уровне.

Специалисту в данной области будет понятно, что соединения согласно настоящему изобретению способны образовывать кислотно-аддитивные соли. Во всех случаях фармацевтически приемлемые соли всех соединений включены в их название. Соединения согласно настоящему изобретению представляют собой амины и соответственно будут реагировать с любой из многочисленных неорганических и органических кислот с образованием фармацевтически приемлемых кислотно-аддитивных солей. Термин фармацевтически приемлемая соль, как используется в данной заявке, относится к солям соединений формулы I, которые не являются существенно токсичными для живых организмов. Типичные фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные с помощью реакции соединений согласно настоящему изобретению с фармацевтически приемлемыми органическими или неорганическими кислотами. Такие соли включают фармацевтически приемлемые соли, приведенные в 1оита1 οί РйагтасеиБса1 Басисе. 66, 2-19 (1977), который известен специалисту в данной области техники. Наиболее предпочтительными являются мезилатные соли соединений формулы I.

Соединения формулы I являются ингибиторами р38 киназы. Таким образом, настоящее изобретение также предлагает способ ингибирования р38 киназы у млекопитающего, включающий введение млекопитающему, который нуждается в таком лечении, соединения формулы I в количестве, которое ингибирует р38 киназу. Предпочтительно млекопитающим, которое лечат введением соединений формулы I, является человек.

Как ингибиторы р38 киназы соединения согласно настоящему изобретению полезны для подавления продуцирования провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли α (ΤΝΕα) и интерлейкина1β (ТС-1 β), и, таким образом, для лечения расстройств, которые являются результатом избыточного продуцирования цитокинов. Таким образом, считают, что настоящие соединения будут полезными при печении воспалительных расстройств, включая экзему, атопический дерматит, ревматоидный артрит, остеоартрит, воспалительное заболевание кишечника и синдром токсического шока. Также считают, что соединения согласно настоящему изобретению будут полезными при лечении сердечно-сосудистых расстройств, таких как острый инфаркт миокарда, хроническая сердечная недостаточность, атеросклероз, вирусный миокардит, отторжение сердечного аллотрансплантата и сердечная дисфункция, связанная с сепсисом. К тому же, также считают, что соединения согласно настоящему изобретению будут полезными при лечении расстройств центральной нервной системы, таких как менингококковый менингит, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и рассеянный склероз - ХАО 99/32111, XVО 9923091, XVО 04004720, АО 03072569.

Увеличение массы твердых опухолей обусловлено пролиферацией злокачественных клеток и клеток стромы, включая эндотелиальные клетки. Для увеличения опухоли до размера, больше 2-3 мм в диаметре, она должна сформировать сосудистую сеть, этот процесс известен под названием ангиогенез. Было сообщено, что подавление вызванного опухолью ангиогенеза под воздействием ангиостатина и эндостатина приводит к противоопухолевому эффекту (О'КеШу, с1 а1., Се11, 88, 277-285 (1997)). Было показано, что селективный ингибитор р38 киназы БВ22025 ингибирует ангиогенез (ТК. .^Εκοη, с1 а1., 1. Рйагιη;·κο1. Ехр. Τйе^аρеиΐ^С8. 284, 687 (1998)). Поскольку ангиогенез является решающим фактором при увеличении массы большинства твердых опухолей, разработка новых ингибиторов р38 киназы для ингибирования этого процесса является перспективным подходом к противоопухолевой терапии. Этот подход к противоопухолевой терапии может быть лишен токсичных побочных эффектов или развития резистентности к лекарственным средствам, имеющего место при традиционной химиотерапии (1ибай Εο1ктаη,

- 3 015123

Εηάοβοηοιίδ 1пЫЬйогк о£ ЛпдюдспсхЬ. ТНс Нагуеу Еес!игек, 8епек 92, радек 65-82, ХУПеу-Мкк 1пс. (1998)).

Как ингибиторы р38 киназы соединения согласно настоящему изобретению, таким образом, также полезны при ингибировании роста чувствительных новообразований. 8011111/, К. М. Ро1епйа1 о£ р38 МАР кшаке 1пЫЬйогк ίη 111е 1геа1теп1 о£ сапсег. В: Е. 1искег (еб.), Ргодгекк ίη Эгид Векеагсй 60, 59-92, (2003). Чувствительное новообразование определено как новообразование, выживание, рост или метастаз которого зависят от р38 киназы. Чувствительные новообразования включают опухоли головного мозга, мочеполового тракта, лимфатической системы, желудка, гортани и легких (патент И8 5717100). Предпочтительно, термин чувствительные новообразования, как используется в данной заявке, включает раки у людей, включая немелкоклеточный рак легких (А. СтенЬег^, е! а1., Ат. 1. Кекрп. Се11 Мо1. Вю1., 26, 558 (2002)), карциному молочной железы (1. Сйсп, е! а1., 1, Вю1. Сйет., 276, 47901 (2001); В. 8а11, е! а1., Ιη!. 1. Сатег, 98, 148 (2002); и 8. Хюмд, е! а1., Сатег Кек., 61, 1727 (2001)), карциному желудка (Υ.Ό. Лтд, е! а1., Ргос. Ат. Аккос. Сатег Кек., 43, 9 (2002)), колоректальные карциномы (8. Хюмд, е! а1., С.’атег Кек., 61, 1727 (2001)) и злокачественную меланому (С. ^еηке^ι. е! а1. , С1т. Ехр. Ме1ак1ак1к, 19, 79 (2002)).

Также было сообщено, что ингибирование ангиогенеза путем подавлением ΤΝΕα является полезным при ингибировании или профилактике метастаза (патент И8 6414150; патент И8 6335336). К тому же подавление ΤΝΕα предписано при лечении и профилактике кахексии, изнурительного синдрома, от которого страдает приблизительно половина всех больных раком (Т. Υοηеба, е! а1., 1. С1ш. 1пуск!., 87, 977 (1991)).

К тому же ингибирование р38 киназы может быть эффективно при лечении некоторых вирусных состояний, таких как грипп (К. Кицте, е! а1., 1. 1ттит1оду., 164, 3222-3228 (2000)), риновирус (8. Следо, е! а1., 1. 1ттит1оду, 165, 5211-5220 (2000)) и ВИЧ (Ь. 8йар1го, е! а1., Ргос. №!1. Асаб. 8сг И8А, 95, 7422-7426, (1998)).

Как используется в данной заявке, термин С₁-С₄ алкил относится к линейной или разветвленной, моновалентной, насыщенной алифатической цепи, содержащей от одного до четырех атомов углерода, и включает, но не ограничивается этим, метил, этил, пропил, изопропил, бутил, изобутил и трет-бутил.

Как используется в данной заявке, термин С₁-С₄ алкокси относится к прямой или разветвленной алкильной цепи, содержащей от одного до четырех атомов углерода, присоединенных к атому кислорода. Типичные С₁-С₄ алкоксигруппы включают метокси, этокси, пропокси, изопропокси, бутокси, третбутокси и подобные. Термин С₁-С₄ алкокси включает в свое определение термин С₁-С₃ алкокси.

Как используется в данной заявке, термин галоген относится к атому хлора, брома, йода или фтора, если не указано другое.

Как используется в данной заявке, термин С₁-С₄ алкилгалоген относится к С₁-С₄ алкилу, замещенному до пяти атомами галогена. Типичные С1-С4 алкилгалогенгруппы включают метилгалоген, трифторметил, этилгалоген, бис-фторметилэтил, пропилгалоген, изопропилгалоген, бутилгалоген, третбутилгалоген и подобные. Термин С1-С4 алкилгалоген включает в свое определение термин С1-С3 алкилгалоген.

Как используется в данной заявке, термин С3-С4 циклоалкил обозначает неароматическое кольцо, содержащее атомы углерода и водорода, и включает циклопропил и циклобутил.

Как используется в данной заявке, термин 1-метил-1-циклопропил относится к следующему остатку:

Определенные классы соединений формулы I представляют собой предпочтительные ингибиторы р38 киназы. В следующих абзацах описаны такие предпочтительные классы:

а) X представляет собой

О

b) К¹ представляет собой С3-С4 циклоалкил, необязательно замещенный заместителем, выбранным из метила, трифторметила или галогена;

c) К¹ представляет собой 1-метил-1-циклопропил;

б) К¹ представляет собой 2-фтор-1,1-диметилэтил;

е) К¹ представляет собой 2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил;

I) К² представляет собой фенил, необязательно замещенный метилом, или пиридинил, необязательно замещенный метилом;

д) К² представляет собой 4-толил;

II) К³ представляет собой С₃-С₄ циклоалкил, необязательно замещенный С₁-С₄ алкилом; или тиенил, необязательно замещенный метилом; или фенил, необязательно замещенный первым заместителем, вы

- 4 015123 бранным из группы, которая включает галоген, С₁-С₄ алкил или С₁-С₄ алкокси, и необязательно, кроме того, замещен галогеном;

ί) соединение формулы I является свободным основанием;

_)) соединение формулы I является солью;

к) соединение формулы I является мезилатной солью.

Предпочтительные осуществления изобретения включают все комбинации абзацев а)-к).

Другие предпочтительные соединения формулы I представляют собой соединения формулы I, в которых X представляет собой

К¹ является таким, как описано в абзаце с); и К² является таким, как описано в абзаце д). Также предпочтительно, когда X представляет собой

К¹ является таким, как описано в абзаце с); и К² является таким, как описано в абзаце д); и К³ является таким, как описано в абзаце 11).

Особенно предпочтительно, когда X представляет собой

К² представляет собой фенил, замещенный в 4-положении С₁-С₄ алкилом. Наиболее предпочтительно, когда X представляет собой

Следующее соединение является также особенно предпочтительным:

1-{1-[1-(1-Метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил }-3-[5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевина.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть получены с помощью ряда методик, некоторые из которых проиллюстрированы на схемах ниже. Для специалиста в данной области техники будет понятно, что для получения соединений формулы I отдельные стадии на приведенных ниже схемах могут быть изменены. Конкретный порядок стадий, необходимый для получения соединений формулы I, зависит от конкретного соединения, которое синтезируют, исходного соединения и относительной лабильности замещенных компонентов. Ради ясности некоторые заместители были исключены на приведенных ниже схемах, и это обстоятельство не ограничивает информацию, представленную на схемах.

Соединения формулы I и промежуточные соединения могут быть получены, как проиллюстрировано на следующей схеме, где К¹, К² и X являются такими, как определено выше:

Схема 1

- 5 015123

Амин (а) подвергают реакции с подходящим изоцианатом или карбаматом, таким как пиразолил-

2,2,2-трихлорэтилкарбамат, с получением соединений формулы I. Например, нагревают раствор амина (1 эквивалент), трихлорэтилкарбамата (1 эквивалент) и подходящего основания, такого как диизопропилэтиламин (2 эквивалента) или карбонат калия, в подходящем растворителе, таком как ацетонитрил или диметилсульфоксид (ΌΜ8Θ). Желаемое соединение затем может быть выделено и, если необходимо и желательно, очищено с использованием способов, хорошо известных из уровня техники, таких как хроматография, с получением соединения формулы I.

Необходимые амины получают, как проиллюстрировано ниже на схеме 2, где X является таким, как определено выше:

Схема 2

Нитрокомпонент (Ь) восстанавливают в стандартных условиях восстановления, например, водоро дом в присутствии катализатора на основе палладия, в подходящем растворителе, таком как низшие алканолы или этилацетат, с получением соответствующего амина (а). Такие стадии восстановления хорошо известны и определены в данной области техники. См. Ьагоск, В., Сотргскспкй'с Огдашс ТгапкГогтаΐίοηκ, 412, УСН РиЬНкЫпд, 1пс., Νο\ν Уогк, 1989.

Необходимые нитросоединения получают, как проиллюстрировано на схеме 3 ниже, где В³ является таким, как описано выше, и X' представляет собой С(О)В³ или подходящую защитную группу РО:

1-хлор-4-нитроизохинолин (е) в подходящем органическом растворителе, таком как ТНЕ, подвергают реакции с Ν-защищенным (РС) гидроксипиперидином и гидридом натрия с получением соответствующего замещенного пиперидина Ь(1). Если необходимо или желательно, может быть использована подходящая амино-защитная группа Рд, такая как трет-бутоксикарбонильный (ВОС) фрагмент. Способы введения этих групп хорошо известны специалисту в данной области техники. Специалист в данной области техники примет во внимание, что азот-защитные группы могут быть удалены на любой подходящей стадии синтеза соединений согласно настоящему изобретению. Способы удаления аминозащитных групп хорошо известны из уровня техники; (см., например, Т.^. Сгеепе, Рго1есйуе Сгоирк ίη Огдашс 8упФекщ, боНп ХУбеу апб δοηκ, №\ν Уогк, Ν.Υ., 1999).

Альтернативно, 1-хлор-4-нитроизохинолин (е) подвергают реакции с Ν-ВОС защищенным пиперазином в карбонате калия в полярном растворителе, таком как ацетонитрил, с получением соответствующего замещенного пиперазина Ь(п).

Необходимые пиразолилкарбаматы могут быть получены, как описано на следующей схеме, где В¹ и В² являются такими, как определено выше:

Схема 4

	Η,Ν. 2 НН А2	“V «' о.	и С1
н о	к	К2		О ° Т К2 С1
ΐ		ш		О

- 6 015123

3-аминопиразолы (т) получают, используя условия, хорошо известные из уровня техники; Ьатоск, К., СотртекеибАе Отдашс ТгаибГогтакоиб, 79, УСН РиЬкбк1ид, 1пс., Νο\ν Уогк, 1989. Например, αцианокетон (]) и подходящий гидразин или соль гидразина (к) в подходящем органическом растворителе, таком как этанол, подвергают реакции при повышенной температуре, и полученный продукт может быть очищен с использованием стандартных способов, таких как хрома.тография на колонке с силикагелем.

2,2,2-Трихлорэтилхлорформиат (и) подвергают реакции с подходяще замещенным 3-аминопиразолом (т) и основанием, например карбонатом натрия, в подходящем растворителе, например, ТНЕ, с получением соответствующего 2,2,2-трихлорэтилкарбамата (о). Специалист в данной области техники примет во внимание, что соответствующий карбамат может быть получен с помощью реакции 3аминопиразола с другими активными карбонатами.

Соединения формулы 1(1) могут быть получены, как продемонстрировано на схеме 5 ниже, где К¹, К², К³ и РС являются такими, как определено выше.

Схема 5

удаление защитной Формула 1 (I)

О) толпы (в)

Из соединения формулы (1) удаляют защитную группу в условиях, хорошо известных из уровня техники. Например, когда защитная группа представляет собой трет-бутоксикарбонил, соединение формулы (1) растворяют в подходящем органическом растворителе, таком как дихлорметан, или смеси растворителей и обрабатывают кислотой, такой как соляная кислота в диоксане или трифторуксусная кислота. Снятием защитной группы с Ν-защищенной-пиперидин-замещенной мочевины (1) получают замещенный пиперидин (д), который подвергают реакции с замещенной карбоновой кислотой в стандартных условиях сочетания для органических кислот и органических аминов в присутствии агента сочетания, такого как гидрохлорид №(3-диметиламинопропил)-№-этилкарбодиимида (ЕЭС1). каталитического количества 4-диметиламинопиридина (ΌΜΑΡ) и 1-гидроксибензотриазола (НОВ1), с получением соединения формулы I (ί). Специалист в данной области техники примет во внимание, что примеры формулы I (ί) могут быть получены, исходя из других защищенных пиперидинов, включая различные Ν-защитные группы, такие как формил, для которых могут быть необходимы другие методики снятия защитных групп, с получением промежуточных соединений (д).

Специалист в данной области техники также примет во внимание, что не все заместители в соединениях формулы 1 будут толерантными в определенных условиях реакции, которые используются при синтезе соединений. Эти заместители могут быть введены на подходящей стадии синтеза или могут быть защищены, а затем защитная группа, при необходимости или желании, может быть удалена. Специалист в данной области техники примет во внимание, что защитные группы могут быть удалены на любой подходящей стадии синтеза соединений согласно настоящему изобретению. Способы введения и удаления азот- и кислородзащитных групп хорошо известны из уровня техники; смотрите, например, Сгееие апй ХУиК Рто1есНуе Сгоирз ίη Отдашс 8уи!кеб18, 1о11п \Уйеу апй 8оиз, №\ν Уогк, (1999). К тому же, специалист в данной области техники примет во внимание, что во многих случаях порядок, в котором вводят компоненты, не является критическим. Конкретный порядок стадий, необходимых для получения соединений формулы I, зависит от конкретного соединения, которое синтезируют, исходного соединения и относительной лабильности замещенных компонентов.

Сокращения, обозначения и условия, которые используются в примерах и исследованиях, имеют следующие значения: АсОН = уксусная кислота, ЭСС = дициклогексилкарбодиимид, ΌΙΕΑ = Ν,Νдиизопропилэтиламин, ЭМ8О = диметилсульфоксид, ΌΜΕ = Ν,Ν-диметилформамид, ч = час(ы), НОВ! = 1-гидроксибензотриазол, ЬЭА = диизопропиламид лития, ЕЭС1 = гидрохлорид 1-(3-диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида, ЕЮАс = этилацетат, ЕЮН = этанол, МеОН = метанол, NаВН(ОΑс)з триацетоксиборгидрид натрия, ТВАЕ = фторид тетрабутиламмония, Т1₂О = ангидрид трифторметансульфоновой кислоты, ТНЕ = тетрагидрофуран.

Пример получения 1. Метиловый эфир 1-трифторметилциклопропанкарбоновой кислоты

К раствору 1-трифторметилциклопропан-1-карбоновой кислоты (3,65 г, 23,7 ммоль) в метанолегексанах (2,5 мл-22,5 мл) добавляют 2 М раствор диазометана в гексанах (14,2 мл, 28,45 ммоль). Растворитель удаляют при пониженном давлении и остаток перегоняют, получая желтое масло (2,93 г, выход

- 7 015123

73%).

Пример получения 2. 3-(1-Метоксициклопропил)-3-оксопропионитрил

Раствор 2М ЬЭА в ТНР (29,1 мл, 58,3 ммоль) добавляют к охлажденному сухим льдом-ацетоном раствору метилового эфира 1-метоксициклопропанкарбоновой кислоты (\УО 2005/014577) (3,45 г, 26,5 ммоль) и ацетонитрила (2,17 г мл, 53,0 ммоль) в ТНР (30 мл). Реакционную смесь перемешивают при -78°С в течение 1 ч и затем при 22°С в течение 0,5 ч. Выпаривают растворитель, получая коричневое твердое вещество. Фильтруют и промывают гексанами. Добавляют 2 N соляную кислоту и три раза экстрагируют диэтиловым эфиром (50 мл каждого). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия. Растворитель удаляют, получая красное масло (3,55 г, выход 96%, Е8+(т/х) 140,1 [М+Н]).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения	Соединение
Пример получения 3	4,4, 5, 5, 5-Пентафтор-З-оксопентаннитрил
Пример получения 4	З-Оксо-З-(1 — трифторметилциклопропил)пропионитрил

Пример получения 5. Метиловый эфир 3-гидрокси-2-гидроксиметил-2-метилпропионовой кислоты

Н₂8О₄ (4,5 г) добавляют к суспензии 3-гидрокси-2-гидроксиметил-2-метилпропионовой кислоты (100 г) в МеОН (1 л, градиентный растворитель ВЭЖХ) и перемешивают при комнатной температуре в течение приблизительно 70 ч. Растворитель удаляют, и остаток разделяют между ЕЮАс (1л) и Н₂О (100 мл). Водный слой повторно экстрагируют ЕЮАс, и объединенные органические фракции сушат над Мд8О₄. Фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. Неочищенная смесь может быть использована без дополнительной очистки. ’Н ЯМР (СЭС1₃, 300 МГц): δ м.д. 3,9 (д, 2Н, 1=11,1 Гц), 3,76 (с, 3Н), 3,71 (д, 2Н, 1=11,1 Гц), 2,8 (ушир.с, 2Н), 1,1 (с, 3Н).

Следующее соединение получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения	Соединение
Пример	Этиловый эфир 3,3-Оис-
получения б	гидроксиметилпентановой кислоты

Пример получения 7. Бензиловый эфир 3-гидрокси-2,2-диметилпропионовой кислоты.

Гидроксид калия (486,7 ммоль, 32,1 г) добавляют к раствору 2,3-дигидрокси-2-метилпропионовой кислоты (423,2 ммоль, 50 г) в 300 мл ЭМЕ. Перемешивают в течение 1 ч при 100°С. Затем добавляют бензилбромид (58 4,04 ммоль, 69,46 мл) и перемешивают в течение ночи. Смесь охлаждают и разбавляют этилацетатом. Органический слой промывают водой. Водный слой несколько раз промывают этилацетатом. Органические слои объединяют и сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении. ’Н ЯМР (СОС1₃, 300 МГц): δ м.д.: 7,36-7,32 (м, 5Н), 5,1 (с, 2Н), 3,5 (с, 2Н), 1,21 (с, 6Н).

Пример получения 8. 5-Пентафторэтил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламин

Смесь 4,4,5,5,5-пентафтор-3-оксопентаннитрила (4 г, 21,4 ммоль) и р-толилгидразина (10 г, 64,1

- 8 015123 ммоль) в этаноле (20 мл) нагревают до 95°С в герметичной колбе в течение 15 ч. После охлаждения до комнатной температуры растворитель удаляют при пониженном давлении, получая коричневый остаток. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя этилацетатом и гексанами, получая указанное в заглавии соединение (3,24 г, выход 52%, Е8+(т/х) 292,1 [М+Н]).

Следующее соединение получают, используя методику, по существу, аналогичную методике, описанной выше:

Пример получения	Соединение	Данные МС (Е8+): ш/ζ
Пример получения 9	2-р-Толил-5-(1трифторметилциклопропил)-2Нпиразол-3-иламии	282,3 [М+Н]

Пример получения 10. 5-(1-Фторметилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламин.

АдЕ (4,5 эквивалентов, 4,56 г) добавляют к раствору этилового эфира 1-фторциклобутанкарбоновой кислоты (1,6 г, 8 ммоль) в ацетонитриле 22 мл, содержащему 274 мл воды. Смесь нагревают при 80°С в герметичной пробирке в течение 20 ч с энергичным перемешиванием. Смесь оставляют охлаждаться и фильтруют через целит. Растворитель удаляют при пониженном давлении, получая этиловый эфир 1-фторметилциклопропанкарбоновой кислоты в виде масла (0,81 г, выход 61%). Е8+(т/х) 147,1 [М+1].

ι-Ργ₂ΝΗ (1,7 мл, 2,2 эквивалента, 12,1 ммоль) и п-ВиЫ (1,6 М в гексанах, 7,5 мл, 2,2 эквивалента, 12,1 ммоль) в 12 мл ТНЕ перемешивают при -78°С в течение 30 мин под Ν₂, затем к раствору БЭЛ добавляют раствор этилового эфира 1-фторметилциклопропанкарбоновой кислоты (0,81 г, 5,5 ммоль) в 7 мл ТНЕ. Перемешивают и смесь оставляют нагреваться от -78°С до комнатной температуры, затем перемешивают при комнатной температуре в течение 5 ч. Добавляют 10 мл насыщенного водного раствора МН₄С1. Добавляют ЛсОЕ1, органический слой отделяют, промывают насыщенным водным раствором хлорида натрия, сушат над №ь8О₄ и растворитель удаляют, получая коричневое масло (0,42 г, выход 54%). Соединение растворяют в 10 мл Е1ОН и добавляют р-толилгидразин (0,47 г, 1 эквивалент, 3 ммоль). Смесь нагревают в герметичной пробирке при 90°С в течение ночи. Затем смесь оставляют охлаждаться и растворитель удаляют, получая остаток. Очищают с помощью хроматографии (гексан/ЛсОЕ1, 15-80%), получая указанное в заглавии соединение в виде масла (0,336 г, выход 45%). Ε5·(ιιι/ζ): 246,1 [М+1].

Пример получения 11. 5-(1-Метоксициклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламин

Смесь 3-(1-метоксициклопропил)-3-оксопропионитрила (пример получения 2, 3,55 г, 25,5 ммоль) и гидрохлорида-р-толилгидразина (12,15 г, 76,5 ммоль) в этаноле (50 мл) нагревают при 90°С в герметичной пробирке в течение 18 ч. Затем растворитель удаляют, остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя 0-5% метанола в дихлорметане, получая указанное в заглавии соединение в виде желтого твердого вещества (3,29 г, выход 53%, Е8+(т/х) 244,2 [М+Н]).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше:

Пример получения	Соединение	Данные МС (ЕЗ+): ш/ζ
Пример получения 12	2-(6-Метилпиридин-З-ил)-5(1трифторметилциклопропил)2Н-пиразол-3-иламин	283,2 [М+Н]

Пример получения 13. 2,2,2-Трихлорэтиловый эфир [5-(1-метоксициклопропил)-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]карбаминовой кислоты

- 9 015123

К охлажденному смесью льда с солью раствору 5-(1-метоксициклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3иламина (пример получения 11, 2,43 г, 10 ммоль) и пиридина (0,9 мл, 11 ммоль) в ТНЕ (30 мл) по каплям добавляют раствор 2,2,2-трихлорэтилхлорформиата (2,12 г, 10 ммоль) в ТНЕ (10 мл). Перемешивают при -15°С в течение 0,5 ч, затем при 22°С в течение 1 ч. Реакционную смесь разделяют между дихлорметаном (50 мл) и насыщенным водным бикарбонатом натрия (50 мл). Водную фазу отделяют и дважды экстрагируют дихлорметаном (25 мл каждого). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия и концентрируют. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя гексанами и этилацетатом, получая белое твердое вещество (3,73 г, выход 89%, Е8+(т/х) 418,1 [М+Н]).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения	Соединение	Данные МС (ЕЗ+): ш/ζ
Пример получения 14	2,2,2-трихлорэтиловый эфир [2р-толил-5-(1— трифторметилциклопропил)-2Нпиразол-3-ил]-карбаминовой кислоты	458,2 [М+Н]
Пример получения 15	2,2,2-трихлорэтиловый эфир [2(6-метилпиридин-З-ил)-5-(1трифторметилциклопропил)-2Нпиразол-3-ил]-карбаминовой кислоты	403,2 [М+Н]
Пример получения 16	2,2,2-трихлорэтиловый эфир {5пентафторметил-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил)-карбаминовой кислоты	466, 1 [М+Н]

Пример получения 17. 2,2,2-Трихлорэтиловый эфир 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)карбаминовой кислоты.

К раствору 5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламина (Кедап с1 а1. Т Меб. С1ет. 2002, 45, 29943008, 400 г, 1,74 моль) в ТНЕ (8 л) добавляют насыщенный раствор карбоната натрия (2,4 л) и смесь охлаждают до 0°С. Затем по каплям добавляют 2,2,2-трихлорэтилхлорформиат (406,77 г, 1,92 моль) и смесь перемешивают при 0°С в течение 2 ч. Реакционную смесь экстрагируют этилацетатом (3x6,5 л), сушат над безводным сульфатом магния и растворитель выпаривают. Твердое вещество растворяют в минимальном количестве этилацетата и добавляют избыток гексанов для осаждения твердого вещества. Твердое вещество собирают фильтрованием и сушат, получая указанное в заглавии соединение в виде не совсем белого твердого вещества (586 г, выход 83%). (Е8+): т/ζ 406,1 (М+Н).

Пример получения 18. 2,2,2-Трихлорэтиловый эфир [5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]-карбаминовой кислоты.

Ацетонитрил (87 мл, 1,6 моль) добавляют к суспензии гидрида натрия (66 г, 1,6 моль) в ТНЕ (700 мл) при комнатной температуре и перемешивают в течение 10 мин. Затем добавляют метиловый эфир 1метилциклопропанкарбоновой кислоты (90,0 г, 0,78 моль) и белую суспензию кипятят с обратным холо

- 10 015123 дильником в течение 3 ч. Смесь охлаждают, затем добавляют метанол (200 мл) и смесь выливают в воду (500 мл). Фазы разделяют и рН водной фазы доводят до рН 3-4 1,0 N НС1. Водную фазу экстрагируют диэтиловым эфиром (2x350 мл), органические слои объединяют и промывают водным хлоридом натрия. Сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая 3-(1метилциклопропил)-3-оксопропионитрил в виде желтого масла. ¹Н ЯМР (СЭС1₃): 3,59 (с, 2Н), 1,37 (с, 3Н), 1,30 (кв., 1=4 Гц, 2Н), 0,86 (кв., 1=4 Гц, 2Н).

Альтернативно в 5 л трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхней мешалкой, термопарой, обратным холодильником и капельной воронкой, помещают трет-бутоксид калия в ТНЕ (3,00 л, 3,00 моль). Этиловый эфир 1-метилциклопропанкарбоновой кислоты (264,00 г, 2,06 моль) смешивают с ацетонитрилом (123,00 г, 3,00 моль), затем эту смесь добавляют через капельную воронку в течение 0,5 ч к раствору бутоксида. Полученную смесь нагревают до кипения с обратным холодильником. Кипятят с обратным холодильником в течение 2 ч, затем охлаждают до <40°, добавляя метанол (96,00 г, 3,00 мл). Смесь перемешивают в течение 10 мин, затем помещают в 12 л делительную воронку, которая содержит энергично перемешанную смесь воды (3,96 л, 219,81 моль) и МТВЕ (3,96 л, 33,32 моль). Слои разделяют и водный слой экстрагируют МТВЕ (3,96 л, 33,32 моль). рН водного слоя корректируют от 12,5 до 3,5, используя 5Ν НС1 (610,00 мл, 3,05 моль). Водный слой экстрагируют МТВЕ (2x1,32 л, 11,11). Органические слои объединяют, сушат над сульфатом натрия (62,00 г, 436,49 моль) и фильтруют, получая 3-(1метилциклопропил)-3-оксопропионитрил.

Раствор 3-(1-метилциклопропил)-3-оксо-пропионитрила (60 г, 487,2 ммоль) и гидрохлорида ртолилгидразина (78 г, 478,2 ммоль) в этаноле (975 мл) нагревают до кипения с обратным холодильником в течение 4 ч. Растворитель выпаривают и оставшееся твердое вещество растворяют в воде. рН раствора увеличивают до рН 8, используя 1,0 Ν раствор гидроксида натрия. Осадок фильтруют, получая 5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламин в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (ЭМ8О): 7,39 (д, 1=8 Гц, 2Н), 7,22 (д, 1=8 Гц, 2Н), 5,12 (с, 2Н), 2,31 (с, 3Н), 1,30 (с, 3Н), 0,80 (кв., 1=4 Гц, 2Н), 0,61 (кв., 1=4 Гц, 2Н).

2.2.2- трихлорэтилхлорформиат (3,0 мл, 23 ммоль) по каплям добавляют к раствору 5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламина (4,75 г, 21 ммоль) в тетрагидрофуране (105 мл) и насыщенном водном карбонате натрия (32 мл) при 0°С.

Перемешивают при этой температуре в течение 2 ч. Смесь выливают в воду и фазы разделяют. Водную фазу экстрагируют этилацетатом.

Обработка А. Органические слои объединяют и промывают водным хлоридом натрия, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая желтое твердое вещество. Твердое вещество растворяют в минимальном количестве этилацетата и добавляют гексаны до помутнения при перемешивании. Указанное в заглавии соединение кристаллизуют и фильтруют в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (ΌΜ8Ο): 9,89 (ушир. с, 1Н), 7,31 (кв., 1=8 Гц, 2Н), 7,23 (кв., 1=8 Гц, 2Н), 6,12 (с, 1Н), 4,82 (с, 2Н), 2,31 (с, 3Н), 1,37 (с, 3Н), 0,89 (кв., 1=4 Гц, 2Н), 0,71 (кв., 1=4 Гц, 2Н).

Обработка В. Растворитель этилацетат заменяют на изопропиловый спирт (91,56 моль). Суспензию перемешивают при <0°С в течение 2 ч, фильтруют, промывают охлажденным изопропиловым спиртом (13,08 моль) и сушат при 40°С при пониженном давлении в течение ночи, получая указанное в заглавии соединение, в виде белого кристаллического твердого вещества.

Пример получения 19.

2.2.2- трихлорэтиловый эфир [5-(2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]карбаминовой кислоты.

Τ£₂Ο (80 мл) по каплям добавляют к охлажденному раствору (-78°С) метилового эфира 3-гидрокси2-гидроксиметил-2-метилпропионовой кислоты (пример получения 5, 32,5 г) в дихлорметане (400 мл) и 2,6-лутидине (80 мл). Реакционную смесь оставляют нагреваться до комнатной температуры и перемешивают в течение приблизительно 2 ч. Разбавляют дихлорметаном (400 мл) и промывают НС1 (3% водный раствор). Органический слой сушат над Мд§О₄, фильтруют и концентрируют. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексаны/этилацетат 5%, получая метиловый эфир 2метил-2,3-бис-трифторметансульфонилокси-пропионовой кислоты в виде бесцветного масла. ¹Н ЯМР (СОС1₃, 300 МГц): δ м.д. 4,7 (д, 2Н, 1=10,3 Гц), 4,5 (д, 2Н, 1=10,3 Гц), 3,8 (с, 3Н), 1,4 (с, 3Н).

ΤΒΑΕ 1 М (132 ммоль, 132 мл) добавляют к раствору метилового эфира 2-метил-2,3-бистрифторметансульфонилокси-пропионовой кислоты (65,9 ммоль, 26,3 г) в 500 мл безводного ΊΉΕ, охлажденного до 0°С. Перемешивают в течение ночи. Концентрируют при пониженном давлении и добавляют дихлорметан. Органический слой промывают насыщенным водным хлоридом натрия. Органические слои объединяют и сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая метиловый эфир 3-фтор-2-фторметил-2-метилпропионовой кислоты. ¹Н ЯМР (СЭС1₃, 300 МГц): δ м.д.: 4,7-4,4 (м, 4Н), 3,5 (с, 3Н). 0,98 (т, 3Н, 1=1,7 Гц).

ЬЭА 2,0 М (62,0 ммоль, 31 мл) добавляют к раствору метилового эфира 3-фтор-2-фторметил-2метилпропионовой кислоты (28,2 ммоль, 4,3 г) в 100 мл безводного ΊΉΕ, охлажденного до -78°С, затем добавляют безводный ацетонитрил (56,4 ммоль, 2,9 мл). Перемешивают в течение 2 ч при -78°С и затем

- 11 015123 раствор оставляют нагреваться до комнатной температуры в течение ночи. Концентрируют при пониженном давлении и добавляют дихлорметан. Органический слой промывают насыщенным водным хлоридом натрия и водной 10% НС1. Органические слои объединяют и сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая остаток.

Гидрохлорид р-толилгидразина (15,5 ммоль, 2,5 г) и остаток, полученный выше (15,5 ммоль, 2,5 г), в 31 мл этанола перемешивают при 90°С в течение ночи. Растворитель выпаривают, и остаток растворяют в воде. Добавляют 10% раствор гидроксида натрия и экстрагируют в этилацетате. Органические слои объединяют и сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая 5-(2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламин. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексаны/этилацетат в качестве элюента (от 15 до 50%). ЖХМС Е8+ (т/ζ) 266 [М+Н]).

2,2,2-трихлорэтилхлорформиат (8,1 ммоль, 1,1 мл) и водный раствор карбоната натрия (4,8 мл) добавляют к раствору 5-(2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламина (7,3 ммоль, 1,9 г) в 37 мл ТНЕ. Перемешивают в течение 24 ч. Раствор выливают в воду и экстрагируют в этилацетате. Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным хлоридом натрия. Сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая 2,2,2трихлорэтиловый эфир [5-(2-фтор-1-фторметил-1 -метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]-карбаминовой кислоты. ЖХМС Е8+ (т/ζ) 440 [М+Н].

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения	Соединение	Данные '
МС ϊη/ζ	(Е5+): [М+Н]
Пример получения 20	2,2,2-трихлорэтиловый эфир [5(1,1-бис-фторметилпропил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]карбаминовой кислоты	454
Пример получения 21	2,2,2-трихлорэтиловый эфир [5(2-фтор-1,1-диметилэтил)-2-рголил-2Н-пиразол-3-ил]карбаминовой кислоты	424

Пример получения 22. трет-Бутиловый эфир 4-(4-аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1карбоновой кислоты

Серную кислоту (900 мл) охлаждают до 5°С, используя баню лед/ацетон, затем добавляют 1аминоизохинолин (208,8 г, 1448 ммоль) в течение 45 мин, поддерживая внутреннюю температуру смеси <20°С. Темную смесь охлаждают до 0°С под азотом с механическим перемешиванием, затем обрабатывают ΚΝΟ₃ (149,4 г, 1477 ммоль) порциями в течение 45 мин, поддерживая температуру реакционной смеси <10°С. Смесь перемешивают в течение 2 ч, одновременно нагревая до 15°С. Смесь выливают в воду/лед (3 кг), затем разбавляют дополнительной водой (6 л). Суспензию перемешивают в течение 45 мин, затем фильтруют. Осадок промывают водой (6x1,5 л). Золотистое вещество частично сушат на воздухе в течение ночи, затем помещают в вакуумную печку (50-55°С, приблизительно 10 Торр, отвод азота, 24 ч), получая 1-амино-4-нитроизохинолин-Н₂8О₄ (256,8 г, выход 62%). (Е8+):тА 190(М⁺+Н).

Суспензию 1-амино-4-нитроизохинолина-Н₂8О₄ (120 г, 418 ммоль) в водной НС1 (6 Ν, 2 л) механически перемешивают под азотом при 35°С. Добавляют раствор ΝαΝΟ₂ (72,1 г, 1044 ммоль,) в воде (300 мл) в течение 1 ч, одновременно нагревая суспензию до 50°С. Смесь нагревают в течение дополнительных 30 мин, затем оставляют охлаждаться до комнатной температуры и перемешивают в течение ночи. Смесь нагревают до 50°С, затем добавляют раствор ΝαΝΟ₂ (36 г в 150 мл воды) в течение 30 мин. Смесь перемешивают в течение 2 ч, затем нагревают до 60°С, оставляют медленно охлаждаться до комнатной температуры на 3 ч. Полученную суспензию фильтруют и осадок промывают водой (3x600 мл). Частично сушат на воздухе (180 г). Влажное твердое вещество суспендируют в ί-РгОН (1л) и Е1ОН (1 л) при кипении с обратным холодильником, добавляют ТНЕ (350 мл), чтобы добиться полного растворения. К

- 12 015123 раствору добавляют воду (400 мл) и охлаждают до 10°С в течение 3 ч. Фильтруют и промывают Ε1ΟΗ (2x300 мл), затем диэтиловым эфиром (3x150 мл). Сушат на воздухе в течение ночи, получая 1-гидрокси4-нитроизохинолин (62,62 г, выход 79%) в виде светло-коричневого твердого вещества. (Ε8+): т/ζ 191 (Μ⁺+Η).

Суспензию 1-гидрокси-4-нитроизохинолина (62,2 г, 327 ммоль) в РОС1₃ (180 мл) механически перемешивают под азотом и нагревают до 100-105°С в течение 1 ч, получая гомогенный темно-коричневый раствор. Холодильник заменяют на насадку для молекулярной перегонки, и избыток РОС1₃ удаляют при пониженном давлении (приблизительно 10-30 Торр), что приводит к температуре реактора 55°С. К этой смеси добавляют 1,2-дихлорэтан (150 мл), и смесь нагревают до 70°С, получая гомогенный раствор. Раствор охлаждают до 15°С, затем добавляют ί-ΡτΟΗ (450 мл) в течение 5 мин, происходит выделение тепла до 33°С. Суспензию перемешивают в течение 3,5 ч при 15°С, затем фильтруют и промывают ί-ΡτΟΗ (3x100 мл). Полученное твердое вещество сушат на воздухе в течение ночи, получая 1-хлор-4нитроизохинолин (52,08, выход 76%) в виде желто-коричневого твердого вещества. (Ε8+): т/ζ 209/211 (Μ⁺+Η).

ΝαΗ (60% в минеральном масле, непромытый; 6,23 г, 156 ммоль) частями добавляют к раствору 1хлор-4-нитроизохинолина (26,0 г, 125 ммоль) и 1-трет-бутоксикарбонил-4-гидроксипиперидина (27,6 г, 137 ммоль) в ΤΗΕ (350 мл), перемешанному при комнатной температуре под потоком азота. Темнокрасноватую смесь перемешивают при 40°С в течение 1,5 ч, затем при 55°С в течение 1,5 ч. Добавляют дополнительный ΝαΗ (1,3 г), и полученную смесь перемешивают при 55°С в течение 2 ч, затем охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. Добавляют гексаны (75 мл), затем медленно добавляют воду (600 мл). ρΗ реакционной смеси корректируют до ρΗ 7 водной ИС1 (1 Ν), затем слои разделяют. Водный слой отбрасывают, и к органическому слою добавляют гексаны (200 мл). Смесь частично концентрируют при пониженном давлении до объема 50-100 мл. Добавляют диэтиловый эфир (150 мл) и гексаны (250 мл), затем полученную суспензию фильтруют. Осадок промывают смесью диэтиловый эфир/гексаны (1:1) и сушат на воздухе, получая трет-бутиловый эфир 4-(4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты (33,84 г, выход 73%) в виде желто-коричневого твердого вещества. (Ε8+): т/ζ 374 (Μ⁺+Η).

К суспензии трет-бутилового эфира 4-(4-нитроизохинолин-1-илокси)-пиперидин-1-карбоновой кислоты (33,5 г, 89,7 ммоль) в ΤΗΕ (300 мл) и этаноле (300 мл) добавляют 10% Ρά/С (1,80 г, 1,69 ммоль) в виде суспензии в этаноле (25 мл) . Смесь помещают на встряхивающий аппарат Парра в атмосферу водорода (25-40 фунт/дюйм²) при комнатной температуре на 8 ч. Смесь фильтруют через прокладку из диатомовой земли и промывают этанолом, пока фильтрат не станет бесцветным. Фильтрат концентрируют при пониженном давлении, получая темное масло. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя 1%, затем 2,5% смесью МсОИ/дихлорметан. получая указанное в заглавии соединение (30,3 г, выход 98%) в виде оранжевого стеклоподобного вещества. (Ε8+): т/ζ 344 (Μ⁺+Η).

Пример получения 23. [4-(4-Аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]-(1-метилциклопропил) метанон

Изохинолин (500,00 г, 3,75 моль) и этилацетат (7,60 л, 77,62 моль) помещают в 22 л трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхней мешалкой, термопарой, трубкой входа/выхода азота и капельной воронкой, на водяной бане. Перемешивают до растворения. При комнатной температуре по каплям добавляют надуксусную кислоту (1,25 л, 5,94 моль) в течение 0,5 ч. Перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Реакционную колбу охлаждают на водяной бане со льдом, затем реакционную смесь гасят, добавляя по каплям диметилсульфид (525,00 мл, 7,14 моль) в течение 45 мин. Перемешивают в течение ночи, одновременно нагревая до комнатной температуры. Реакционную смесь тестируют на пероксид.

Две партии реакционной смеси объединяют. Реакционную смесь переносят в 50 л делительную воронку и добавляют воду (2,00 л, 111,02 моль) и дихлорметан (12,00 л, 187,21 моль). Частями добавляют карбонат натрия (2,07 кг, 19,53 моль), затем слои разделяют. Водный слой экстрагируют дихлорметаном (3x4 л), органические слои объединяют и сушат над сульфатом натрия; фильтруют и растворитель удаляют при пониженном давлении, получая неочищенное темно-красное масло/жидкость.

К неочищенному темно-красному маслу/жидкости добавляют этилацетат (8,00 л, 81,76 моль), затем перемешивают при пониженном давлении, пока не удалятся 6,8 л этилацетата. Осажденное твердое вещество фильтруют, промывают холодным этилацетатом (750,00 мл, 7,66 моль), затем промывают гептаном (800,00 мл, 5,46 моль). Твердое вещество сушат, получая изохинолин-2-оксид, 714,20 г (64%) в виде мелкозернистого пескоподобного твердого вещества.

В качестве альтернативной обработки перед промыванием гептаном из фильтрата удаляют 1 л рас

- 13 015123 творителя. Фильтрат выдерживают в течение ночи. Твердое вещество фильтруют и промывают холодным этилацетатом (500,00 мл, 5,11 моль), затем промывают гептаном (500,00 мл, 3,41 моль). Твердое вещество сушат, получая изохинолин-2-оксид, 11.0,10 г (10%) в виде мелкозернистого пескоподобного твердого вещества - партия №2 (общий выход 74%).

Изохинолин 2-оксид (4,82 моль; 699,1 г) и ангидрид уксусной кислоты (73,95 моль; 6,99 л) помещают в 22 л колбу с трубкой входа Ν₂, с насадкой для перегонки и термопарой. Реакционную смесь нагревают до слабого кипения с обратным холодильником и летучие вещества удаляют с помощью перегонки. Нагревание продолжают и дистиллят собирают в течение 2 ч (удаляется приблизительно половина общего объема реакционной смеси). Реакционную смесь охлаждают до 50°С. По каплям добавляют метанол (2 л), и реакционную смесь оставляют нагреваться до 70°С. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Изохинолин-1-ол кристаллизуют из раствора, выделяют с помощью фильтрования и сушат при пониженном давлении при 50°С. Выход = 246,7 г (35%).

Изохинолин-1-ол (2,35 моль; 341,0 г) и 1705 мл смеси 1:4 воды и уксусной кислоты помещают в 5 л колбу. Реакционную смесь нагревают до 60°С. По каплям добавляют раствор азотной кислоты (7,04 моль; 443,0 мл) в 1705 мл смеси 1:4 воды и уксусной кислоты в течение 3 ч. При добавлении азотной кислоты температуру реакционной смеси поддерживают между 68 и 70°С. Через 3 ч реакционную смесь охлаждают до комнатной температуры. К реакционной смеси добавляют воду (5564 мл), затем фильтруют. Осадок промывают водой (1л) и сушат в вакууме при 50°С. Выход = 196,8 г (44%).

1-гидрокси-4-нитроизохинолин (880,3 ммоль; 167,4 г) и РОС1₃ (4,95 моль; 460 мл) помещают в 2 л колбу с трубкой входа Ν2, холодильником и термопарой. Полученную суспензию нагревают до 100°С в течение приблизительно 1 ч. Реакционную смесь концентрируют досуха, используя ротационный испаритель. Остаток суспендируют в 1,2-дихлорэтане (402 мл) и охлаждают до 15°С. По каплям добавляют ί-РгОН (1015 мл), поддерживая температуру резервуара ниже 30°С. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при 20°С и в течение 1 ч при 10°С. Реакционную смесь фильтруют, и осадок промывают изопропиловым спиртом (100 мл). Сушат при пониженном давлении при 50°С. Выход = 118,5 г (65%).

Этиловый эфир 1-метилциклопропанкарбоновой кислоты (405,0 г, 3,16 моль), 5Ν гидроксид натрия (1,0 л, 5,00 моль) и метанол (400,0 мл, 9,88 моль) помещают в 3 л трехгорлую круглодонную колбу. Реакционную смесь нагревают при температуре от 50°С до 60°С в течение 5 ч, затем оставляют охлаждаться до температуры окружающей среды в течение ночи. Органический растворитель удаляют и основной раствор экстрагируют МТВЕ (2x500 мл). рН водного раствора корректируют до рН 1, используя 600 мл концентрированной НС1 и экстрагируют МТВЕ (4x500 мл). Органические слои объединяют, промывают насыщенным водным хлоридом натрия, сушат над сульфатом магния, фильтруют и растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток оставляют затвердевать, затем добавляют 100 мл гептана и полученную суспензию перемешивают при 0-5°С. Суспензию фильтруют, затем полученное твердое вещество сушат при пониженном давлении. Фильтрат концентрируют и охлаждают на ледяной бане, получая дополнительное белое твердое вещество. Две партии вещества объединяют, восстанавливая 265 г (84%) 1-метилциклопропанкарбоновой кислоты в виде белого твердого вещества.

1-метилциклопропанкарбоновую кислоту (260,0 г, 2,60 моль), 2-бутанон (2,5 л, 27,92 моль) и Νметилморфолин (325,0 мл, 2,95 моль) помещают в 5 л трехгорлую круглодонную колбу, снабженную верхней мешалкой. Смесь перемешивают при 0°С и частями добавляют 2-хлор-4,6-диметокси-[1,3,5] триазин (510,0 г, 2,86 моль) в течение 30 мин. Перемешивание продолжают при 0°С в течение 15 мин, затем при температуре окружающей среды в течение 2 ч. Полученный гидрохлорид Ν-метилморфолина фильтруют и промывают 2x200 мл 2-бутанона. Фильтрат концентрируют и остаток растворяют в 1500 мл ТНЕ, получая раствор А.

Карбонат калия (550,0 г, 3,94 моль) в 2 л воды помещают в 5 л трехгорлую круглодонную колбу. Добавляют 4-гидроксипиперидин (275,0 г, 2,66 моль), получая раствор В.

Раствор В охлаждают на водяной бане со льдом и по каплям добавляют раствор А. Охлаждающую баню удаляют и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Органический растворитель удаляют при пониженном давлении. Оставшийся основной водный раствор экстрагируют 6x2 л дихлорметана. Органические слои объединяют, промывают смесью 1,5 л насыщенного водного хлорида натрия и 200 мл концентрированной НС1. Кислотный водный раствор экстрагируют 3x1 л дихлорметана. Органические слои объединяют и сушат над 500 г сульфата магния и 100 г карбоната калия в течение ночи. Сушильные реагенты отфильтровывают и растворитель удаляют, пока не останется приблизительно 500 мл растворителя. Добавляют 1 л гептана и растворитель удаляют, пока происходит кристаллизация. Твердое вещество фильтруют, сильно промывая гептаном и сушат при пониженном давлении, получая (4-гидроксипиперидин-1-ил)-(1-метилциклопропил)метанон, 330 г (69%) в виде белого кристаллического твердого вещества.

Гидрид натрия (38,40 г, 960,09 моль) и ТНЕ (1,54 л, 18,92 моль) помещают в 5 л колбу Мортона, снабженную верхней мешалкой, капельной воронкой и термопарой. Перемешивают в течение нескольких минут, затем добавляют (4-гидроксипиперидин-1-ил)-(1-метилциклопропил)метанон (149,00 г,

- 14 015123

813,09 моль). Перемешивают в течение 0,5 ч Добавляют 1-хлор-4-нитроизохинолин (154,00 г, 738,24 моль) в ТНЕ (1,54 л, 18,92 моль) в течение 1 ч. Реакционную смесь перемешивают в течение 2 ч при комнатной температуре, затем при 40°С в течение 6 ч, затем охлаждают до комнатной температуры в течение ночи. К реакционной смеси по каплям добавляют воду (500 мл, 27,78 моль). Реакционную смесь гасят, выливая в энергично перемешиваемую смесь воды (2,5 л, 138,89 моль) и МТВЕ (3,08 л, 25,92 моль). Слои разделяют, органический слой промывают водой (3,08 л, 170,97 моль) и сушат над сульфатом натрия (142,00 г, 999,70 моль). Сушильный реагент отфильтровывают, получая фильтрат №1.

Описанную выше процедуру повторяют, получая фильтрат №2. Фильтраты №1 и №2 объединяют. Растворитель удаляют при пониженном давлении (~150 мм) и собирают дистиллят с температурой выпаривания 20-28°С, пока не останется приблизительно 1,5 л. В перегонную колбу добавляют изопропиловый спирт (4,62 л, 60,43 моль) и перегонку продолжают при пониженном давлении (~120 мм), собирая, дистиллят с температурой выпаривания 35-44°С, пока не останется приблизительно 1 л. Оставшуюся суспензию охлаждают на льду в течение ночи. Твердое вещество фильтруют и промывают холодным изопропиловым спиртом (300,00 мл, 3,92 моль), затем 3x100 мл гептана (300,00 мл, 2,05 моль). Твердое вещество сушат при 40°С при пониженном давлении в течение ночи, получая (1-метилциклопропил)-[4(4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]метанон, 368 г (72% - вместе) в виде оранжевого твердого вещества.

В автоклав на три галлона помещают (1-метилциклопропил)-[4-(4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]метанон (368,0 г, 1,04 моль), ТНЕ (4,42 л, 54,32 моль) и 5% Рб на угле (сухой, 40,50 г, 19,03 моль). Автоклав герметизируют и вводят водород до 50 фунт/дюйм². Смесь перемешивают при 1000 об/мин при комнатной температуре под 50 фунт/дюйм² водорода в течение 4,5 ч. Фильтруют и промывают дополнительным ТНЕ (2,0 л, 24,58 моль). Фильтрат обрабатывают углем (20-40 меш, 42,00 г) и нагревают до 40°С в течение 1 ч. Добавляют дополнительный уголь (60 меш, 47,00 г) и нагревание продолжают в течение 1 ч. Уголь фильтруют через микроволокнистую бумагу и слой Нуйо 8ирет Се1® и промывают минимальным количеством ТНЕ. Растворитель удаляют, получая [4-(4-аминоизохинолин-1илокси)-пиперидин-1-ил]-(1-метилциклопропил)-метанон, 348 г (103%) в виде темно-оранжево-красного масла/пены. Ή ЯМР (500 МГц, СОС1₃): δ 0,59 (т, 1=6,0 Гц, 2Н), 0,96 (т, 1=6,0 Гц, 2Н), 1,34 (с, 3Н), 1,881,94 (м, 2Н), 2,06-2,10 (м, 2Н), 3,61-3,70 (м, 2Н), 3,93-4,00 (м, 2Н), 5,48-5,50 (м, 1Н), 7,52 (с, 1Н), 7,58 (т, 1=7,0 Гц, 1Н), 7,73 (т, 1=7,0 Гц, 1Н), 7,81 (д, 1=7,0 Гц, 1Н), 8,27 (д, 1=8,5 Гц, 1Н).

Пример получения 24. [4-(4-Аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]-(2-фторфенил)метанон.

о Г

К холодному раствору трет-бутилового эфира 4-(4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин-1карбоновой кислоты (9, 68 г, 25,9 ммоль, 0°С) в ΌΟΜ (100 мл) добавляют ТЕА (80 мл). Перемешивают при 22°С в течение 2 ч, затем растворитель удаляют при пониженном давлении. Остаток растворяют в ΌΟΜ и обрабатывают 1 N гидроксидом натрия до рН ~14. Водную фазу отделяют и дважды экстрагируют ΌΟΜ. Органические фазы объединяют и сушат безводным сульфатом натрия. Растворитель удаляют, получая (4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин (7,06 г, выход 99%, Е8+(ш/х) 274,3 [М+Н]).

Реакционную смесь 4-(4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидина (4,0 г, 14,6 ммоль), 2фторбензойной кислоты (2,45 г, 17,5 ммоль), ОСС (3,6 г, 17,5 ммоль) и НОВ! (2,37 г, 17,5 ммоль) в ТНЕ (100 мл) перемешивают при 22°С в течение ночи. Фильтруют, затем концентрируют. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя гексанами и этилацетатом, получая (2-фторфенил)-[4-(4нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]-метанон в виде желтого твердого вещества (6,82 г, выход 92%, Ε8·(ιιι/ζ) 396,3 [М+Н]).

Суспензию (2-фторфенил)-[4-(4-нитроизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]-метанона (5,85 г, 14,3 ммоль) и палладия на угле (10%, 2,9 г) в метаноле (250 мл) перемешивают под водородом в течение ночи. Катализатор удаляют фильтрованием. Фильтрат концентрируют, получая бледно-желтое твердое вещество (4,7 г, выход 87%, Ε8+(ιη/ζ) 366,3 [М+Н]).

Следующее соединение получают, используя методику, по существу, аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения	Соединение	Данные МС (Е5+): т/ζ [М+Н]
Пример получения 25	[4-(4-йминоизохинолин-1илокси)-пиперидин-1-ил]-(1ме тилциклопропил)ме та н он	326, 3

- 15 015123

Пример получения 26. 4-Нитро-1-пиперазин-1-ил-изохинолин

Суспензию 1-хлор-4-нитроизохинолина (2,5 г, 12 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) обрабатывают твердым пиперазином (5,2 г, 60 ммоль). Полученную желтую смесь нагревают в течение ночи при 60°С. После охлаждения до температуры окружающей среды реакционную смесь разделяют между этилацетатом и насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Добавляют МеОН, дихлорметан и этилацетат, и всю смесь фильтруют, получая блестящее желтое твердое вещество. (2,15 г, 69%; ЖХМС Е8+ (т/ζ) 259 [М+Н]).

Пример получения 27. Циклопропил-[4-(4-нитроизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]метанон

Раствор или суспензию 4-нитро-1-пиперазин-1-ил-изохинолина (пример получения 26, 517 мг, 2 ммоль), циклопропанкарбоновой кислоты (258 мг, 3 ммоль) и каталитического ОМАР (24 мг, 0,2 ммоль) в дихлорметане (20 мл) обрабатывают ЕЭСЧ (575 мг, 3 ммоль). Полученную смесь встряхивают при температуре окружающей среды в течение ночи, затем промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия. Органический слой сушат над сульфатом натрия и концентрируют при пониженном давлении. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, используя градиент 0-2% 2 М аммиак-метанол в дихлорметане и градиент 0-70% этилацетата в гексанах, получая желтое твердое вещество после двух очисток. (513 мг, выход 79%, ЖХМС Е8+ (т/ζ) 327 [М+Н]).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу, аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения 31. 1[4-(4-Аминоизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]циклопропилметанон

Пример получения	Соединение	Данные МС (Εδ+): т/ζ
Пример получения 28	(1-Метилциклопропил)- [4- (4нитроизохинолин-1-ил)-пиперазин1-ил]-метанон выход 76%	341 [М+Н]
Пример получения 29	(2,δ-Дифторфенил)-[4-(4нитроизохинолин-1-ил)-пиперазин1-ил]-метанон выход 50%	399,1 [М+Н]
Пример получения 30	2,2-Диметил-1-[4-(4нитроизохинолин-1-ил)-пиперазин1-ил]-пропан-1-он; выход 66%	343,2 [М+Н]

Суспензию циклопропил-[4-(4-нитроизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]метанона (пример получения 27; 513 мг, 1,57 ммоль) и 5% палладия на угле (91 мг) в этилацетате (50 мл) в встряхивающем аппарате Парра при температуре окружающей среды подвергают действию атмосферы водорода при 60 фунт/дюйм². Через 8 ч реакционную смесь фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая коричневую пену. (Количественный выход; ЖХМС Е8+(тА) 297 [М+Н]).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

- 16 015123

Пример получения	Соединение	Данные МС (ЕЗ+): ш/ζ
Пример получения 32	1-[4-(4-Амино-изохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]-2,2-диметилпропан1-он. (гхп время 24 часа}	313 [М+Н]
Пример получения 33	[4-(4-Аминоизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]-(2,6-дифторфенил)метанон, (гхп время 24 часа)	369 [М+Н]
Пример получения 34	[4-(4-Аминоизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]-(1метилциклопропил)-метанон	311 [М+Н]

Пример получения 35. [4-(4-Аминоизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]-(2-фторфенил)метанон

К раствору трет-бутилового эфира пиперазин-1-карбоновой кислоты (10 г, 53,7 ммоль) в дихлорметане (300 мл) добавляют триэтиламин (15,1 мл, 107,4 ммоль) и 2-фторбензоилхлорид (6,4 мл, 53,7 ммоль). Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Затем добавляют воду (200 мл) и органический слой отделяют, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают растворитель при пониженном давлении, получая 17,3 г трет-бутилового эфира 4-(2-фторбензоил)-пиперазин-1карбоновой кислоты. Е8+ (т/ζ) 309 [М+Н].

К раствору трет-бутилового эфира 4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-карбоновой кислоты (16,3 г, 53 ммоль) в дихлорметане (100 мл) добавляют раствор 4М НС1 в 1,4-диоксане (40 мл, 159 ммоль) и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. ЕьО добавляют к полученной белой суспензии и растворители выпаривают при пониженном давлении, получая 12,6 г гидрохлорида (2фторфенил)пиперазин-1-ил-метанона. Е8+ (т/ζ) 209 [М+Н]).

(2-фторфенил)пиперазин-1-ил-метанон (3,16 г, 12,9 ммоль) и К₂СО₃ (8,9 г, 64,5 ммоль) добавляют к 1-хлор-4-нитроизохинолину (2,85 г, 13,7 ммоль) в ацетонитриле (100 мл) и перемешивают в течение 24 ч. Нерастворимое твердое вещество фильтруют и осадок промывают ЛсОЕ1. Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая остаток. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексан: АсОЕ[ 20-90%, получая 3,72 г (2-фторфенил)-[4-(4-нитроизохинолин-1-ил)пиперазин-1ил]метанона в виде твердого вещества. ЖХМС Е8+ (т/ζ) 381,2 [М+Н].

№₂8₂О₄ (6,87 г, 39,4 ммоль) добавляют к (2-фторфенил)-[4-(4-нитроизохинолин-1-ил)пиперазин-1ил]метанону (3 г, 7,89 ммоль) в 170 мл смеси 1:1 1НЕ:Н₂О, затем добавляют NН₄ОН 32% (15 мл) и перемешивают в течение 90 мин. Разбавляют водой и экстрагируют ЛсОЕ1 несколько раз. Органические фазы объединяют и промывают насыщенным водным хлоридом натрия, сушат над №ь8О₄ и выпаривают при пониженном давлении, получая 1,8 г указанного в заглавии соединения в виде твердого вещества. ЖХМС ЕЗ+Οη/ζ) 351,2 [М+Н].

Пример получения 36. Дигидрохлорид 1-[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]-3[1-(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]мочевина

2,2,2-трихлорэтиловый эфир [5-( 1 -метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]карбаминовой кислоты (пример получения 18, 3,20 г, 7,94 ммоль и 2,0 эквивалента) и трет-бутиловый эфир 4-(4аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты (пример получения 22, 1,37 г, 3,97 ммоль, 1,0 эквивалент) растворяют в 7 мл безводного ПМ8О, добавляют диизопропилэтиламин (ПЕРЕА, 1,36 мл, 7,94 ммоль, 2,0 эквивалента) и нагревают в герметичной пробирке с перемешиванием в течение 20 ч при 80°С. Раствор выливают в смесь 1:1 об./об. дихлорметана и ледяной воды. Водную фазу экстрагируют дихлорметаном (2x50 мл), и объединенные органические слои промывают водой (2x50 мл) и водным хлоридом натрия (100 мл). Органический раствор сушат над сульфатом натрия и выпаривают при пони

- 17 015123 женном давлении. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом от 15% до 80% ЕЮАс в гексанах, получая 1,40 г трет-бутилового эфира 4-(4-{3-[5-(1-метилциклопропил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]уреидо}изохинолин-1-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты в виде чистого пенистого кремового твердого вещества, выход 59%. Е8+(т/х) 597,4 [М+Н].

4М НС1 в диоксане (2,4 мл, 9,36 ммоль) добавляют к трет-бутиловому эфиру 4-(4-{3-[5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]уреидо }изохинолин-1 -илокси)пиперидин-1 -карбоновой кислоты (1,4 г, 2,34 ммоль) в дихлорметане (20 мл) при комнатной температуре и перемешивают в течение ночи. Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая указанное в заглавии соединение (1,3 г) в виде белого твердого вещества (количественный). Е8+(т/х): 497,4 (М+Н).

Пример получения 37. Гидрохлорид 1-[5-(2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол3-ил]-3-[1-(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил] мочевины.

2,2,2-трихлорэтиловый эфир [5-(2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]карбаминовой кислоты (пример получения 27, 2,7 ммоль, 1,2 г) и Э1РЕА (2,9 ммоль, 0,5 мл) добавляют к раствору трет-бутилового эфира 4-(4-аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты (пример получения 22, 2,9 ммоль, 1,0 г) в 4 мл ЭМ8О и перемешивают при 85°С в течение ночи. Охлаждают, добавляют воду и экстрагируют дихлорметаном. Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным хлоридом натрия. Сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая остаток. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексаны/этилацетат с градиентом (от 15 до 70%), получая трет-бутиловый эфир 4-(4-{3-[5-(2фтор-1 -фторметил-1 -метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]уреидо }изохинолин-1 -илокси)пиперидин-1карбоновой кислоты. ЖХМС Е8+ (т/ζ) 635 [М+Н].

трет-Бутиловый эфир 4-(4-{ 3 -[5-(2-фтор-1 -фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]уреидо}изохинолин-1-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты (1,1 ммоль, 0,6 г) перемешивают и растворяют в 5 мл дихлорметана и 4,0 М соляной кислоте в диоксане (5,3 ммоль, 1,3 мл) при комнатной температуре в течение ночи. Концентрируют при пониженном давлении. Полученное белое твердое вещество растирают в порошок с диэтиловым эфиром.

ЖХМС Е8+ (т/ζ) 535 [М+Н].

Следующие соединения получают, используя методику, по существу, аналогичную методике, описанной выше.

Пример получения	Соединение	Данные МС
(Е5+): [М+Н]	т/ζ
Пример получения 38	Гидрохлорид 1- [ 5-(1,1-бисфторметилпропил)-2-р-толил2Н-пиразол-3-ил]-3-[1(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]-мочевины	549
Пример получения 39	Гидрохлорид 1-[5-(2-фтор-1,1диметилэтил)-2-р—толил-2Нпиразол-3-ил]-3-[1(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]-мочевины	517

Пример получения 40. 1-(5-трет-Бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-[1(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4 -ил] мочевина

Газообразный азот барботируют через раствор 2,2,2-трихлорэтилового эфира 1-(5-трет-бутил-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил)карбаминовой кислоты (пример получения 17, 589 мг, 1,456 ммоль) и третбутилового эфира 4-(4-аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-карбоновой кислоты (пример получения 22, 500 мг, 1,456 ммоль) в ЭМ8О (5 мл) в течение 5 мин. Затем добавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (507 мкл, 2,912 ммоль). Смесь перемешивают при 60°С в течение 6 ч, затем оставляют охлаждаться до

- 18 015123 комнатной температуры в течение ночи. Реакционную смесь разделяют между 200 мл СН₂С1₂ и 100 мл дистиллированной воды. Промывают водой (1x100 мл), затем водные слои объединяют и экстрагируют СН₂С1₂ (3x50 мл). Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным хлоридом натрия (2x100 мл). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия и концентрируют. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя гексанами и этилацетатом, получая трет-бутиловый эфир 4-{4-[3-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)уреидо]изохинолин-1-илокси}пиперидин-1-карбоновой кислоты в виде коричневого твердого вещества. ЖХМС Е8+ (т/ζ) 599,5 [М+Н].

К охлажденному раствору трет-бутилового эфира 4-{4-[3-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3ил)уреидо]изохинолин-1-илокси}пиперидин-1-карбоновой кислоты (820 мг, 1,37 ммоль) в дихлорметане (50 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (15 мл). Реакционную смесь перемешивают при 22°С в течение 1,5 ч. Затем растворитель удаляют, остаток обрабатывают 1 N гидроксидом натрия, насыщенным №1С1. (50 мл) и пять раз экстрагируют дихлорметаном (50 мл каждого). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия. Смесь фильтруют и остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя дихлорметаном и метанолом, получая белое твердое вещество (.515 мг, выход 75%, ЖХМС Ε8+(ιη/ζ) 499,5 [М+Н]).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

Таблица 3

Пример получения	Соединение	Данные МС (ЕЗ+>: ш/ζ
Пример получения 41	1- (5-Пентафторэтил-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил)-3[1-(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]-мочевина	561,3 [М+Н]
Пример получения 42	1- [1-(Пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]-3-2-ртолил-5-(1трифторметилциклопропил)~ 2Н-пиразол-3-ил]-мочевина	551,4 [М+Н]

Пример 1. 1 -[ 1 -(4-Циклопропанкарбонилпиперазин-1 -ил)изохинолин-4-ил]-3-[5-(1 -метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевина

Раствор [4-(4-аминоизохинолин-1-ил)-пиперазин-1-ил]-циклопропилметанона (пример получения 29, 214 мг, 0,722 ммоль). 2,2,2-трихлорэтилового эфира [5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол3-ил]карбаминовой кислоты (пример получения 18, 290 мг, 0,722 ммоль) и диизопропилэтиламина (0,2 64 мл) в 4 мл ЭМ8О нагревают при 60°С в течение 5 ч. Полученную смесь охлаждают до температуры окружающей среды и добавляют воду. Осадок фильтруют, промывают водой, затем пентаном и сушат в вакуумной печи при 60°С. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 2 М аммиак-метанол в дихлорметане (от 0 до 2%), получая 206 мг продукта (чистота 93% с помощью ЖХМС).

Полученный продукт растворяют в небольшом количестве дихлорметана и МеОН, обрабатывают 1 эквивалентом 2 М метансульфоновой кислоты в дихлорметане и концентрируют в потоке азота. Полученное твердое вещество растирают в порошок с несколькими миллилитрами смеси ЭМ8О/МеОН/вода и фильтруют, получая 145 мг свободного основания (ЖХМС Е8+ (т/ζ) 550 [М+Н]).

Следующее соединение получают после дополнительной очистки с помощью обратной фазы на колонке МС С18 Х1егга 30x75 мм 5 мкм, используя градиент: 10 мМ водный бикарбонат аммония в ацетонитриле, применяя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

- 19 015123

Пример	Соединение	Данные МС (ЕЗ+): т/ζ [М+Н]
Пример 2	1-{1-[4-(1Метилциклопропанкарбонил)-пиперазин1-ил]-изохинолин-4-ил)-3-[5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]-мочевина	564

Пример 3. 1-{ 1-[4-(2,6-Дифторбензоил)пиперазин-1-ил]изохинолин-4-ил}-3-[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевина.

Раствор [4-(4-аминоизохинолин-1-ил)пиперазин-1-ил]-(2,6-дифторфенил)метанона (пример получения 32, приблизительно 0,88 ммоль), 2,2,2-трихлорэтилового эфира [5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил2Н-пиразол-3-ил] карбаминовой кислоты (пример получения 18, 3 62 мг, 0,9 ммоль) и диизопропилэтиламина (0,314 мл) в 5 мл ЭМ8О нагревают при 60°С в течение ночи. Полученную смесь охлаждают до температуры окружающей среды и разделяют между водой и этилацетатом, используя насыщенный водный хлорид натрия, чтобы способствовать разделению фаз. Водный слой экстрагируют этилацетатом, и объединенные органические слои сушат над сульфатом натрия. Концентрируют при пониженном давлении. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя с градиентом 2М аммиак-метанол в дихлорметане (от 0 до 2%). Растворяют в небольшом количестве дихлорметана и МеОН, обрабатывают 1 эквивалентом 2М метансульфоновой кислоты в дихлорметане и концентрируют под потоком азота. Дополнительной очисткой с помощью обратной фазы на колонке МС С18 Х!егга 30x75 мм 5 мкм, используя градиент: 10 мМ водный бикарбонат аммония в ацетонитриле, получают 73 мг свободного основания. ЖХМС Е8+ (т/ζ) 622 [М+Н]).

Свободное основание следующего соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше. Затем растворяют 0,13 г в 1 мл ЭСМ и добавляют 1 N раствор метансульфоновой кислоты в ЭСМ (1 эквивалент). Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 0,15 г соединения, описанного ниже.

Пример	Соединение	Данные МС (ЕЗ+): т/ζ [М+Н]
Пример 4	Мезилат 1-{1-[4-(2-фторбензоил)пиперазин-1-ил]-изохинолин-4-ил}-3[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	604

Пример 5. 1-(5-трет-Бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-{1-[1-(1-метилциклопропанкарбонил) пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}мочевина.

Газообразный азот барботируют через раствор 2,2,2-трихлорэтилового эфира 1- (5-трет-бутил-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил)-карбаминовой кислоты (пример получения 17, 203 мг, 0,5 ммоль) и [4-(4аминоизохинолин-1-илокси)пиперидин-1-ил]-(1-метилциклопропил) метанона (163 мг, 0,5 ммоль) в ЭМ8О (2 мл) в течение 5 мин. Затем добавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (200 мкл, 1,1 ммоль). После перемешивания при 60°С в течение ночи реакционную смесь разделяют между дихлорметаном (15 мл) и насыщенным бикарбонатом натрия (50 мл). Водную фазу отделяют и дважды экстрагируют дихлорметаном (15 мл каждого). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия и концентрируют. Остаток очищают с помощью хроматографии на силикагеле, элюируя гексанами и этилацетатом, получая белое твердое вещество (226 мг, выход 78%, Е8+ (т/ζ) 581,3 [М+Н]).

Свободные основания следующих соединений получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше. Затем растворяют в 1 мл ЭСМ и добавляют раствор 1 N метансульфоновой кислоты в ЭСМ (1 эквивалент). Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая соединения, описанные ниже.

- 20 015123

ПРИМЕР	Соединение	МС (Е8+): т/ζ [М+Н]
Пример 6	Мезилат 1-{1-[4-(2,2диметилпропионил)-пиперазин-1-ил]изохинолин-4-ил)-3-[5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]-мочевины	566
Пример 7	Мезилат 1-[5-трет-бутил-2-(6метилпиридин-3~ил)-2Н-пиразол-3-ил]{1-[1-(1-метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил)мочевины	582,3
Пример 8	Мезилат 1-{1-[1-(2-фторбензоил)пипе ридин-4-ило кси]-изохинолин-4-ил}3-[5-(1-метоксициклопропил)-2-рто лил- 2 Н-пиразол-3-ил]-мочевины	635, 0
Пример 9	Мезилат 1-[5-(1-метоксициклопропил)2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]-3-(1-[1(1-метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил)мочевины	595,3
Пример 10	Мезилат 1-[2-(6-метилпиридин-З-ил)-5(1-трифторметилциклопропил)-2Нпиразол-3-ил}-3-(1-(1-(3-метилтиофен2-карбонил)-пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-мочевины	634,0

Пример 11. Мезилат 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-{1-[4-(2,2-диметилпропионил) пиперазин-1 -ил]изохинолин-4-ил}мочевины.

Перемешивают 1 -[4-(4-аминоизохинолин-1-ил)-пиперазин-1 -ил]-2,2-диметилпропан-1-он (пример получения 3, 0,9 ммоль, 0,3 г), растворенный в 18 мл ацетонитрила. Добавляют карбонат калия (0,99 ммоль, 0,1 г) и 2,2,2-трихлорэтиловый эфир 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-карбаминовой кислоты (пример получения 17, 0,9 ммоль, 0,4 г) и перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Затем добавляют 1 мл ΌΜΕ и перемешивают при 60°С в течение 24 ч. Охлаждают, добавляют воду и экстрагируют дихлорметаном. Органические слои объединяют и промывают насыщенным водным хлоридом натрия, сушат над сульфатом натрия, фильтруют и концентрируют при пониженном давлении, получая остаток. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексаны/этилацетат с градиентом (от 5 до 20%). К полученному маслу добавляют дихлорметан и образовавшийся осадок фильтруют, получая 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-{1-[4-(2,2-диметилпропионил)пиперазин-1-ил]изохинолин-4-ил}мочевину. Е3+(т/х) 568 [М+Н]).

1-(5-трет-Бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил)-3-{1-[4-(2,2-диметилпропионил)-пиперазин-1 -ил]изохинолин-4-ил}мочевину перемешивают при комнатной температуре. Добавляют 1 N раствор метансульфоновой кислоты в дихлорметане, получая указанное в заглавии соединение. ЖХМС Е8+ (т/ζ) 568 [М+Н].

Пример 12. Мезилат 1-{1-[1-(1-метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4ил}-3-[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевины

ΕΩΟΊ (0,147 г, 0,77 ммоль), НОВ! (0,10 г, 0,77 ммоль), дигидрохлорид 1-[5-(1-метилциклопропил)-2р-толил-2Н-пиразол-3-ил]-3-[1-(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]-мочевины (пример получения 3,

- 21 015123

0,16 г, 0,64 ммоль) и 1-метил-1-циклопропилкарбоновую кислоту (1,1 эквивалент) помещают в колбу под Ν₂. Добавляют дихлорметан (5 мл), затем добавляют ΌΙΡΕΑ (0,22 мл, 1,28 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Растворитель выпаривают, получая остаток. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексан:ΑсΟΕΐ 50-100%, получая 1-{1-[1-(1метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-3-[5-(1-метилциклопропил)-2-ртолил-2Η-пиразол-3-ил] мочевину в виде свободного основания. Ε§+(т/ζ) 579,3 (Μ+Η).

0,3 г 1-{1-[1-(1-метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-3-[5-(1-метилциклопропил)-2-ρ-толил-2Η-пиразол-3-ил]мочевины растворяют в дихлорметане 1 мл и добавляют 321 мкл 1 Ν раствора метансульфоновой кислоты в дихлорметане. Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 0,357 г указанного в заглавии соединения в виде белого твердого вещества (количественный). Ε§+(т/ζ) 579,3 (Μ+Η).

Следующие соединения получают, используя способ, по существу аналогичный способам примеров получения, описанных выше.

ПРИМЕР	Соединение	Данные МС (Е8+): т/ζ [М+Н]
Пример 13	Мезилат 1-{1-[1-(2-фторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил}3-[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	619, 3
Пример 14	Мезилат 1-(1-(1циклопропанкарбонилпиперидин-4илоксиизохинолин-4-ил]-3-[5-(1метилциклопропил) -2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]-мочевины	565, 3
Пример 15	Мезилат 1-(1-(1-(2,6-дифторбензоил}пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил}3-[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	637,3
Пример 16	Мезилат 1- {1- [1- (2-метилбен:зоил) пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил}3- [5- (1-метилциклопропил) -2--р-толил2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	615, 4
Пример 17	Мезилат 1-{1-[1-(2-хлор-бфторбензоил)-пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил)-3-[5-ίίметил цикл о пр о пи л) -2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]-мочевины	653, 3
Пример 18	Мезилат 1-{1-[1-(2-метокси-бензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил}3-(5-( 1-метилциклопропил)-2-р-толил2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	631, 3
Пример 19	Мезилат 1-[5-(1-метилциклопропил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]-3-{1-(1-(1трифторметилциклопропанкарбонил)пиперидии-4-илокси]-изохинолин-4-ил)мочевины	634,3

- 22 015123

Пример 20	Мезилат 1-(1-[1-(З-фтор-2фторметил-2-метилпропионил)пиперидин-4-илокси[-изохинолин-4ил}-3-[5-(1-метилциклопропил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	618,4
Пример 21	Мезилат 1-[5-(2-фтор-1-фторметил-1метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол~3ил]-3-(1-[1-(1метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4ил}-мочевины	617
Пример 22	Мезилат 1-[5-(2-фтор-1, 1диметилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол3-ил]-3-(1-[1-(1метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4ил)-мочевины	599

Пример 23. Амид 4-{4-[3-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)уреидо]изохинолин-1-илокси} пиперазин-1-карбоновой кислоты

Газообразный азот барботируют через раствор 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-[1(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]мочевины (пример получения 39, 100 мг, 0,2 ммоль) и фенилового эфира карбаминовой кислоты (32,9 мг, 0,24 ммоль) в ЭМ8О (1 мл) в течение 5 мин. Затем добавляют Ν,Ν-диизопропилэтиламин (200 мкл, 1,1 ммоль). После перемешивания при 85°С в течение ночи реакционную смесь разделяют между этилацетатом (15 мл) и насыщенным бикарбонатом натрия (50 мл). Водную фазу отделяют и дважды экстрагируют этилацетатом (15 мл каждого). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия и концентрируют. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя гексанами и этилацетатом, получая белое твердое вещество (40 мг, выход 37%, Е8+ (т/ζ) 542,3 [М+Н]).

Пример 24. Мезилат 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-{1-[1-(2-фторбензоил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}мочевины.

Реакционную смесь 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-3-[1-(пиперидин-4-илокси)изохинолин-4-ил]мочевины (пример получения 39, 110 мг, 0,221 ммоль), 2-фторбензойной кислоты (37,1 мг, 0,265 ммоль), НОВ! (35,8 мг, 0,265 ммоль) и ЭСС (54,6 мг, 0,265 ммоль) в ТНЕ (3 мл) перемешивают при 22°С в течение 18 ч. Смесь фильтруют и фильтрат выливают в делительную воронку, содержащую СН₂С1₂ (100 мл). Промывают 1 N №ОН (2x20 мл), водные слои объединяют и экстрагируют СН₂С1₂ (2x50 мл), затем объединенные органические слои промывают насыщенным водным хлоридом натрия (1x50 мл). Объединенные органические фазы сушат над сульфатом натрия, смесь фильтруют и остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя дихлорметаном и метанолом, получая белое твердое вещество (109,8 мг, выход 80%, Е8+ (т/ζ) 621,5 [М+Н]).

0,107 г 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил)-3-{3 -хлор-1-(2-фторбензоил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил)}мочевины растворяют в дихлорметане (2 мл) и метаноле (2 мл) и добавляют метансульфоновую кислоту (16,56 мг, 0,1723 ммоль). Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая указанное в заглавии соединение в виде белого твердого вещества (119,7 мг, 97%, Е8+ (т/ζ) 621,5 [М+Н-МкОН].

Следующие соединения получают, используя методику, по существу аналогичную методике, описанной выше.

- 23 015123

ПРИМЕР	Соединение	Данные МС (ЕЗ+): т/ζ [М+Н]
Пример 2 5	Мезилат 1-[5-трет-бутил-2-(6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]3-{1-[1-(3-метилтиофен-2-карбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил}мочевины	624, 0
Пример 2 б	Мезилат 1-[5-трет-бутил-2-(6метилпиридин-3-ил)-2Н-пиразол-3-ил]3-{1-[1-(2-хлорбензоил)-пиперидин-4илокси]-изохинолин-4-ил}-мочевины	638, 0
Пример 2 7	Мезилат 1-[5-трет-бутил-2-(6метилпиридин-3-ил)~2Н-пиразол-3-ил]3-{1-[1-(2-фторбензоил)-пиперидин-4илокси]-изохинолин-4-ил}-мочевины	622, 3
Пример 28	Мезилат 1-[5-трет-бутил-2-(6метилпиридин-3-ил]-2Н-пиразол-3-ил]3-{1-[1-(2,6-дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил)мочевины	640,3
Пример 2 9	Мезилат 1-[2-(б-метилпиридин-3-ил)-5{1-трифторметилциклопропил)-2Нпиразол-3-ил]-3-{1-[1-(3-метилтиофен2-карбонил)-пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил]-мочевины	676, 0
Пример 30	Мезилат 1-{1-[1-(2-хлорбенэоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил)3-[2-(б-метилпиридин-3-ил)-5-(1трифторметилциклопропил]-2Н-пиразол3-ил]-мочевины	690, 0

- 24 015123

Пример 31	Мезилат 1-{1-[1-(2-фторбензоил)пиперидин-4-илокси)-изохинолин-4-ил}3-[2-(6-метилпиридин-3-ил)-5-(1трифторметилциклопропил)-2Н-пиразол3-ил]-мочевины	674,0
Пример 32	Мезилат 1-(1-[1-(2,6-дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил]3-[2-(δ-метилпиридин-З-ил)-5-(1трифторметилциклопропил)-2Н-пиразол3-ил]-мочевины	692,0
Пример 3 3	Мезилат 1- (5-трет~бутил-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил)-3-(1-(1-(3-метилтиофен2-карбонил)-пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил)-мочевины	623,5
Пример 34	Мезилат 1-(5-трет-бутил-2-р-толил-2Нпиразол-3-ил)-3-[1-(1циклопропанкарбонилпиперидин-4илокси)-изохинолин-4-ил]-мочевины	567,5
Пример 35	Мезилат 1-(1-[1-(2-фторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил 3- (5-пентафторэтил2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)-мочевины	683,0
Пример 3 6	Мезилат 1-(1-(1-(1метилциклопропанкарбонил)-пиперидин4-илокси]-изохинолин-4-ил)-3-(5пентафторэтил-2-р-толил-2Н-пиразол-3ил)-мочевины	643,0
Пример 3 7	Мезилат 1-{1-[1-(2-фторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил)3-[2-р-толил-5-(1трифторметилциклопропил)-2Н-пиразол3-ил]-мочевины	673,0

Пример 38	Мезилат 1-{1-[1-(2,б-дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил)3-[2-р-толил-5-(1трифторметилциклопропил)-2Н-пиразол3-ил] мочевины	691, 0
Пример 3 9	Мезилат 1-(1-(1-(1метилциклопропанкарбонил)-пиперидин4-илокси]-изохинолин-4-ил)-3-[2-ртолил-5-(1-трифторметилциклопропил)2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	633, 3

Пример 40. 1-{ 1-[1-(2,6-Дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-3-[5-(2-фтор-1фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевина.

Г идрохлорид 1 - [5 -(2-фтор-1 -фторметил-1 -метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил] -3-[1 -(пиперидин4-илокси)изохинолин-4-ил]мочевины (пример получения 37, 0,6 ммоль, 0,3 г), 2,6-дифторбензоилхлорид (0,6 ммоль, 0,07 мл) и триэтиламин (1,7 ммоль, 0,2 мл) в 5 мл дихлорметана перемешивают при комнатной температуре в течение ночи. Добавляют немного воды и экстрагируют в дихлорметане. Органический слой промывают насыщенным водным хлоридом натрия; сушат над безводным сульфатом натрия и

- 25 015123 концентрируют при пониженном давлении. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью гексаны/этилацетат в качестве элюента (30%-70%). ЖХМС Е8+ (т/ζ) 675 [М+Н].

Следующие соединения получают, используя методику, по существу, аналогичную методике, описанной выше.

ПРИМЕР	Соединение	Данные МС (Е$+) : т/ζ [М+Н]
Пример 41	1-[5-(2-Фтор-1-фторметил-1метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3ил]-3-{1-[1-(1метилциклопропанкарбонил)пииеридин-4-ило кои]-и зохин олин-4ил)-мочевина	617
Пример 4 2	1-[5-(1,1-Вис-фторметилпропил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]-3-]1-[1(2,6-дифторбензоил)-пиперидин-4илокси]-изохинолин-4-ил)-мочевина	689
Пример 4 3	1- (1-[1-{2,6-Дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4ил)-3-[5-(2-фтор-1,1-диметилэтил)- 2- р-толил-2Н-пиразол-3-ил]-мочевина	657
Пример 4 4	1-[5-(2-Фтор-1,1-диметилэтил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]-3-{1-[1-(1метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4ил)-мочевина	599

Пример 45. Мезилат 1-{1-[1-(2,6-дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-3-[5-(2фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевины.

0,13 г (0,19 ммоль) 1-{1-[1-(2,6-дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин-4-ил}-3-[5-(2фтор-1-фторметил-1-метилэтил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевины растворяют в дихлорметане (2 мл) и добавляют 0,19 мл 1Ν раствора метансульфоновой кислоты в дихлорметане. Растворитель выпаривают при пониженном давлении, получая 0,09 г указанного в заглавии соединения в виде белого твердого вещества. Е8+ (т/ζ) 675 (М+Н).

Следующие соединения получают, используя методику, по существу, аналогичную методике, описанной выше.

ПРИМЕР	Соединение	Данине МС (ЕЗ+):; ш/ζ [М+Н]
Пример 4 6	Мезилат 1-[5-(1,1-бисфторметилпропил) -2-р-толил-2Нпиразол-3-ил]-3-(1-[1-(2,6дифторбензоил)-пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-мочевины	689
Пример 4 7	Мезилат 1-{1-[1-(2,6-дифторбензоил)пиперидин-4-илокси]-изохинолин 4-ил]3- [ 5-(2-фтор-1,1-диметилэтил)-2-ртолил-2Н-пиразол-3-ил]-мочевины	657

Пример 48. Мезилат 1-{1-[1-(1-метилциклопронанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4ил}-3-[5-( 1 -метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]мочевины.

[4-(4-Аминоизохинолин-1 -илокси)пиперидин-1-ил]-(1-метилциклопропил)метанон (пример полу

- 26 015123 чения 23, 331,00 г, 1,02 моль), ТНЕ (3,97 л, 48,79 моль), 2,2,2-трихлорэтиловый эфир [5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]карбаминовой кислоты (пример получения 18, 410,00 г, 1,02 моль) и ΌΙΡΕ (159,00 г, 1,22 моль) помещают в 12 л колбу Мортона, снабженную верхней мешалкой, термопарой и обратным холодильником. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 22 ч. Реакционную смесь охлаждают до <50°С и обрабатывают углем (Эагсо 6-60; 33,00 г, 2,75 моль). Суспензию перемешивают в течение 30 мин при 43-50°С, затем фильтруют через микроволокнистую бумагу и Нуйо 8ирег Се1® (27,00 г). Фильтрат затравливают и оставляют охлаждаться при температуре окружающей среды во время осаждения. Полученную суспензию помещают на лед и перемешивают в течение ночи. Твердые вещества фильтруют, промывают ТНЕ (300,00 мл, 3,69 моль) и сушат при пониженном давлении при 40°С. Остаток подвергают хроматографии на силикагеле, элюируя смесью 1:3 ацетон/ЭСМ. затем 30% ацетона в ЭСМ. получая 401 г (68%) 1-{1-[1-(1-метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-3-[5-(1-метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил)мочевины в виде белого твердого вещества. ¹Н ЯМР (300 МГц, ΌΜ8Ο-ά₆): δ 0,56 (т, 1=6,0 Гц, 2Н), 0,73 (т, 1=6,0 Гц, 2Н), 0,84 (т, 1=6,0 Гц, 2Н), 0,92 (т, 1=6,0 Гц, 2Н), 1,27 (с, 3Н), 1,41 (с, 3Н), 1,73-1,81 (м, 2Н), 1,992,08 (м, 2Н), 2,41 (с, 3Н), 3,52-3,65 (м, 2Н), 3,83-3,96 (м, 2Н), 5,47-5,58 (м, 1Н), 6,22 (с, 1Н), 7,37 (д, 1=8,1 Гц, 2Н), 7,44 (д, 1=8,1 Гц, 2Н), 7,65-7,71 (м, 1Н), 7,78-7,83 (м, 2Н), 8,12 (с, 1Н), 8,27 (д, 1=8,4 Гц, 1Н), 8,58 (с, 1Н), 8,69 (с, 1Н).

Свободное основание (400,00 г, 6,91 моль) и дихлорметан (3,00 л, 46,80 моль) помещают в 5 л колбу, снабженную верхней мешалкой. По каплям добавляют метансульфоновую кислоту (72,00 г, 7,49 моль) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч. Фильтруют и растворитель удаляют при пониженном давлении. Добавляют диэтиловый эфир (4 л) и перемешивают в течение ночи. Фильтруют и сушат при пониженном давлении, получая указанное в заглавии соединение, 467,8 г. Ή ЯМР (ΌΜ8Ο-4₆): δ 0,52 (т, 1=2,5 Гц, 2Н), 0,70 (т, 1=2,5 Гц, 2Н), 0,80 (т, 1=2,5 Гц, 2Н), 0,90 (т, 1=2,5 Гц, 2Н), 1,24 (с, 3Н), 1,38 (с, 3Н), 1,76 (ушир., 2Н), 2,02 (ушир., 2Н), 2,38 (с, 3Н), 2,40 (с, 3Н), 3,55 (ушир., 2Н), 3,85 (ушир., 2Н), 5,49 (м, 1Н), 6,20 (с, 1Н), 7,34 (д, 1=8,5 Гц, 2Н) , 7,42 (д, 1=8,5 Гц, 2Н, 7,64 (дд, 1=8,5 Гц, 1Н), 7,77 (с, 1Н), 7,79 (с, 1Н), 8,08 (с, 1Н), 8,24 (д, 1=8,5 Гц, 1Н), 8,62 (с, 1Н), 8,72 (с, 1Н).

Пример 49. Мезилат 1-[5-(1-фторметилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]-3-{1-[1-(1метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил]мочевины.

5-(1-фторметилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-иламин (160,00 мг; 652,26 мкмоль), растворенный в 1 мл ЭСМ, медленно добавляют к раствору 1,1'-карбонилдиимидазола (158,65 мг, 978,39 мкмоль) в ЭСМ. Смесь перемешивают при 40°С в течение 7 ч. Затем добавляют раствор [4-(4-аминоизохинолин-1-илокси)-пиперидин-1-ил]-(1-метилциклопропил)метанона (пример получения 23, 212,25 мг, 652,26 мкмоль, 1,00 эквивалент) в 1 мл ЭСМ. Смесь перемешивают в течение ночи. Растворитель выпаривают под Ν₂. Сначала очищают с помощью картриджа НЬВ (6 г), используя NН₄СΟз/ΜеΟН (от 100:0 до 0:100) и затем в конце с помощью ВЭЖХ (колонка КготакП С18 (100x21,2 мм, 5 мкм (Н1СЬгот). Мобильной фазой является вода (растворитель А) и ацетонитрил (растворитель В), оба содержат 0,05% трифторуксусной кислоты (ТЕА). Градиентный режим: 2 мин при 40% В, от 40 до 60% В через 6 мин., в конце, 2 мин при 95% В. Скорость потока: 25 мл/мин), получая 1-[5-(1-фторметилциклопропил)2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]-3-{1-[1-(1 -метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси] изохинолин-4ил}мочевину в виде твердого вещества (19 мг, выход 5%). Ε8+ (т/ζ): 597 [М+1].

1М метансульфоновую кислоту (30,17 мкмоль; 30,17 мкл) добавляют к раствору 1-[5-(1фторметилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3 -ил]-3-{1-[1-(1-метилциклопропанкарбонил)пиперидин4-илокси]изохинолин-4-ил}мочевины (18,00 мг, 30,17 мкмоль) в 0,5 мл дихлорметана. Смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель выпаривают под азотом, получая указанное в заглавии соединение в виде твердого вещества (20 мг, выход 96%). Ε8+(ιη/ζ): 597,4 [М+1].

Ингибирование р38 киназы

Приготовление стандартных растворов.

Буферный раствор киназы получают с помощью смешивания 2,5 мл 1 М Тгк-НС1 (рН 7,5), 0,1 мл 1 М дитиотреитола. 1,0 мл 1 М хлорида магния и 300 мкл 1% Тритона Х-100 и разбавления до 100 мл водой. 84 мл этого буферного раствора киназы смешивают с 16 мл ЭМ8О, получая 16% раствор ЭМ8О.

200 мкМ раствор АТФ получают с помощью добавления 102,6 мкл 10 мМ водного АТФ, 25 мкл ³³РАТФ и 163,5 мкл 4 мМ водного раствора пептида 661-681 эпидермального фактора роста (Вюто1, № кат. Р-121) в 5 мл буферного раствора киназы.

Раствор фермента р38 киназы получают с помощью растворения 9,5 мкл концентрированного рас

- 27 015123 твора фермента (250 нг р38 фермента/мкл буферного раствора киназы) в 1536 мкл буферного раствора киназы.

Подготовка проб мкМ раствор каждого тестируемого соединения и контрольного соединения получают с помощью растворения 2 мкл 10 мМ исходного раствора соответствующих соединений в диметилсульфоксиде в 248 мкл 16% раствора ЭМ8О в 96-луночном микротитровальном планшете Сок1аг. Планшет помещают на автоматизированный манипулятор для жидкостей Тесап Сепек1к для последовательных разведений 1:3.

Исследование мкл последовательно разведенного соединения помещают в 96-луночный исследовательский планшет автоматизированного манипулятора для жидкостей Весктап МиШтек. Добавляют 20 мкл 200 мкМ раствора АТФ с помощью 8-канального манипулятора для жидкостей Тйейек МиШбгор. 10 мкл раствора фермента р38 киназы помещают в исследовательский планшет, используя МиШтек. Смесь оставляют для прохождения реакции на 40 мин при 30°С и затем реакцию останавливают путем добавления 60 мкл свежеприготовленного 5% раствора ледяной АсОН с помощью МиШбгор. 80 мкл этого раствора переносят в планшет МАРН, используя МиШтек. Планшеты выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего промывают/отсасывают на экстракторе ТйеПек МАР свежеприготовленным 0,5% раствором ледяной АсОН (1x300 мкл, 2x200 мкл). Планшеты промокают фильтровальной бумагой и добавляют 100 мкл сцинтилляционной жидкости Мюго8ст1-20 (Раскагб Вюкаепсе) с помощью Ми1ббгор. Планшеты выдерживают в течение 30 мин и радиоактивность подсчитывают на сцинтилляционном счетчике РЕЛУа11ас МюгоЬе1а ТпШх для изотопа ³³Р.

Соединение, описанное в примере 12, изначально исследовали при 10 концентрациях (20 мкМ - 1 нМ, используя последовательные разведения 1:3). Соединения со значениями КА, меньше 25 нМ повторно исследовали при начальной концентрации от 2 мкМ до 0,1 нМ (последовательные разведения 1:3). Значения Κ\₀ рассчитывали (программное обеспечение ЮВ8 Асбуйу Ваке) для каждого соединения, используя нелинейную регрессию. Соединение, описанное в примере 12, исследовали, по существу, как описано выше, и было найдено, что оно ингибирует фермент р38 киназы при КА, 34 нМ.

Ингибирование р-МАРКАРК2 ΐη νϊίΐ'ο

Клетки КА^ 264.7 (линия моноцитов/макрофагов АТСС мышей) высевают с плотностью 50000 клеток/лунка в 96-луночные планшеты со средой КРМЫ640, дополненной 10% эмбриональной бычьей сывороткой (ЕВ8), и оставляют осаждаться и прилипать ко дну лунки на 48 ч. После достижения слияния клетки обрабатывают в течение 2 ч 10 последовательными разведениями разных соединений. Всегда включают контрольное соединение. Через 2 ч добавляют анизомицин (100 мкг/мл) и клетки инкубируют в течение 30 мин при 37°С в атмосфере 5% СО₂. Затем клетки фиксируют и обрабатывают пероксидом водорода, чтобы удалить эндогенную пероксидазу. В заключение, планшеты блокируют ЕВ8. промывают и проводят исследование ЕЫ8А, используя антифосфо- МАРКАРК2 антитело (Т1г 334, Се11 81дпа11тд, № кат. 3041) и аЬР-конъюгированное вторичное антитело. Эту реакцию определяют, используя ЕЕМТО (Р1егсе), который представляет собой усиленный хемолюминесцентный субстрат а1Р, который вызывает быструю кинетическую светоотдачу и высокую сигнальную интенсивность. Соединение, описанное в примере 12, исследовали, по существу, как описано выше, и было найдено, что оно ингибирует продуцирование фермента рМАРКАРК2 при Κ'\₀ 7 нМ.

Соединения, описанные в примерах, исследовали, по существу, как описано выше, и было найдено, что они имеют значения ТС₅₀, которые меньше чем или равняются 200 нМ. Следующие соединения были исследованы, по существу, как описано выше, и было найдено, что они имеют такую активность:

Мышиные брюшинные макрофаги мл тиогликолевого бульона (5,0 г экстракта дрожжей, 15,0 г казитона или триптиказы, 5,0 г глюкозы, 2,5 г хлорида натрия, 0,75 г Ь-цистина, 0,5 тиогликолята натрия, 1,0 мг резазурина и 0,75 г агара в 1,0 л дистиллированной воды) впрыскивают в брюшинную впадину самок мышей Ва1Ь/С. На 4-й или 5-й день после инъекции мышей умерщвляют и затем впрыскивают внутрибрюшинно 4 мл среды КРМЫ640 (Вю \У11Шакег) и брюшинные макрофаги отбирают с помощью шприца.

Продуцирование цитокинов

Мышиные брюшинные макрофаги подсчитывают с помощью гемоцитометра и их концентрацию доводят до 5х10⁵ клеток/лунка в 96-луночных планшетах в среде КРМЫ640 с помощью 10% эмбрио

- 28 015123 нальной бычьей сыворотки. 200 мкл/лунка высеивают в 96-луночные планшеты и клетки оставляют осаждаться и прилипать ко дну лунки, как минимум, на 3 ч. Исследуемое соединение или стандартный ингибитор р38 киназы предварительно обрабатывают, используя серии 8 концентраций, в течение 1 ч при 37°С (20 мкл/лунка). Клетки обрабатывают смесью 50 нг/мл липополисахарида (ЬР8) и 10 Ед/мл интерферона-γ в течение 18 ч при 37°С (20 мкл/лунка) . Кондиционированную среду собирают и исследуют на продуцирование ΤΝΡα, используя методику выявления Ьитшех.

Исследование ΤΝΡα с выявлением Ьитшех (набор Βΐο-Каб Βΐο-Ρ1βχ- № кат. 171-С12221)

Лиофилизированный предварительно смешанный стандарт ΤΝΡα (1 стандартная ампула/два 96луночных планшета) восстанавливают в 50 мкл стерильной воды (500000 пг/мл). Образцы взбалтывают в течение 5 с, инкубируют на льду в течение 30 мин и взбалтывают в течение 5 с перед использованием. Набор с двенадцатью пробирками объемом 1,5 мл нумеруют от №1 до №12 и затем в соответствующие пробирки добавляют указанные ниже клеточные среды (стандартные концентрации являются такими, как указано ниже: 50000; 25000; 12500; 6250; 3125; 1562,5; 781,3; 390,6; 195,3; 97,7; 48,8; и 24,4 пг/мл). Предварительно смешанные гранулы, связанные с цитокином, энергично взбалтывают (25Х) в течение 30 с. Гранулы, связанные с цитокином, разбавляют до IX концентрации, используя IX буфер исследования В1о-Р1ех. Для каждого планшета 240 мкл предварительно смешанных гранул добавляют к 5760 мкл буфера исследования Вю-Р1ех. 96-луночный фильтровальный планшет МтШроте блокируют добавлением 100 мкл/лунка блокирующего буфера. Блокирующий буфер фильтруют через лунки, используя систему фильтрования Мййроте и затем вытирают тканью насухо. Проводят два промывания на фильтровальном планшете, используя 100 мкл/лунка буфера исследования Вю-Р1ех, и вытирают тканью насухо. IX гранул, связанных с антицитокином, взбалтывают в течение 15 с и добавляют в каждую лунку по 50 мкл. Фильтруют и вытирают тканью насухо. Проводят два промывания на планшетах, используя 100 мкл/лунка буфера промывания Вю-Р1ех. Снова фильтруют и вытирают тканью насухо. 50 мкл образца или стандарта добавляют в каждую лунку. Пробы инкубируют в течение 60 с при комнатной температуре на встряхивающем аппарате, защищенном от света, при положении регулятора 6 и затем в течение 30 мин при положении регулятора 3, и затем помещают на ночь в холодильник. Проводят 3 промывания буфером промывания Вю-Р1ех. Фильтруют и вытирают тканью насухо. Приготавливают антитело для выявления цитокина (за ~10 мин до использования) для каждого планшета, и 60 мкл предварительно смешанного исходного раствора антитела для выявления цитокина добавляют к 5940 мкл разбавителя для выявления антитела Вю-Р1ех.

Добавляют 50 мкл антитела для выявления цитокина и инкубируют в течение 60 с при комнатной температуре на встряхивающем аппарате, защищенном от света, при положении регулятора 6 и затем в течение 30 мин при положении регулятора 3. Проводят 3 промывания буфером промывания Вю-Р1ех. Фильтруют и вытирают тканью насухо. Приготавливают стрептавидин-РЕ (за ~10 мин до использования) для каждого планшета и добавляют 60 мкл к 5940 мкл буфера исследования Вю-Р1ех. В каждую лунку добавляют 50 мкл стрептавидина-РЕ и инкубируют в течение 60 с при комнатной температуре на встряхивающем аппарате, защищенном от света, при положении регулятора 6 и затем в течение 10 мин при положении регулятора 3. Проводят 3 промывания буфером промывания Вю-Р1ех. Фильтруют. Гранулы повторно суспендируют в 100 мкл/лунка буфера исследования Вю-Р1ех. Стандарты и пробы считывают на устройстве Ьитшех. Считанные значения интенсивности затем переводят в единицы пикограмм/миллилитр, используя 12-точечную стандартную кривую, полученную по данным двух параллельных исследований с применением способа четырехпараметро'вой логистической регрессии (Вю-Р1ех Мападег 2.0, Вю-Ваб) и рассчитывают значения 1С₅₀.

Соединение, описанное в примере 12, исследовали, по существу, как описано выше, и выявили подавление ΤΝΡα ίη νίίτο при 1С₅₀ меньше, чем 9 нМ.

Ингибирование ΤΝΡα ΐη νίνο

Соединения вводят перорально (30, 10, 3 и 1 мг/кг) самкам мышей Ва1Ь/С (6 мышей/доза). Через 1 ч после введения соединения в 4 дозах (перорально в объеме 0,1 мл/мышь; основа: 1% №СМС70.25% Тетееп-80 в воде) мышам делают внутрибрюшинную инъекцию ЬР8 с дозой 400 мкг/кг. Через 1,5 ч после стимулирования ЬР8 мышей анестезируют изофлураном и обескровливают с помощью сердечной пункции. ΤΝΡα-уровни в плазме определяют, используя набор ЕЫ8А от систем Е°Ь и определяют зависимое от дозы ΕΌ₅₀.

Соединение, описанное в примере 12, исследовали, по существу, как описано выше, и выявили подавление ΤΝΡα ίη νίνο при ΤΜΕΌ50 1,0 мг/кг. Действующая минимальная доза (ΤΜΕΌ) 50 представляет собой дозу, при которой достигается ингибирование, большее чем или равное 50%, и которое является статистически отличимым от контроля/плацебо.

Влияние перорального введения

Соединения исследуют для определения влияния перорального введения на самцах крыс РЬсйег 344. Животные голодают в течение ночи и им вводят исследуемые соединения в виде суспензий в карбоксиметилцеллюлозе натрия (1% масс./об.), которая содержит Ьетееп 80 (0,25% об./об.) и антивспениватель (0,1% масс./об.). Дозы суспензий получают с концентрацией 1 мг/мл и вводят в дозе 1 мл/кг с по

- 29 015123 мощью кормления через желудочный зонд. Образцы крови берут в промежутке от 0,5 ч до 7 ч после введения дозы и плазму получают с помощью центрифугирования. Образцы плазмы анализируют, используя онлайновую твердофазную экстракцию и ЖХ/МС/МС.

Соединение, описанное в примере 12, исследуют, по существу, как описано выше, и С_тах составляет 9390 нг/мл с АИС(0-7 ч) 36800 нг-ч/мл.

Влияние на ΤΝΕα, вызванное внутрисуставным введением ЬР8

Внутрисуставная инъекция ЬР8 в голеностопные суставы крыс вызывает синтез ЮТа, который может быть количественно определен в синовиальной промывной жидкости. Высокие уровни Т№а могут быть обнаружены в пределах 2 ч. Так как сустав является местом развития артрита, эта модель дает возможность быстро определить присутствие или отсутствие влияния введенного перорально соединения на воспалительную реакцию в синовиальной оболочке.

Каждая исследуемая группа состояла из шести самок крыс Ье^18 (150-200 г). Животным перорально вводили основу (1% №-карбоксиметилцеллюлозы-0,25% Тетееи 80) или исследуемое соединение (1, 3, 10 и 30 мг/кг). Через один час 10 мкл ЬР8 (10 мкг) вводили внутрисуставно в правый голеностопный сустав каждой крысы, в то время как в левый голеностопный сустав вводили 10 мкл солевого раствора. Через два часа каждый голеностопный сустав промывали 100 мкл солевого раствора. Промывки собирали и сохраняли при -80°С.

Группа №1:основа (1% №1СМС-0.25%Т\тееп 80, 1 мл, ПО).

Группа №2: исследуемое соединение (1 мг/кг, 1 мл, ПО).

Группа №3: исследуемое соединение (3 мг/кг, 1 мл, ПО).

Группа №4: исследуемое соединение (10 мг/кг, 1 мл, ПО).

Группа №5: исследуемое соединение (30 мг/кг, 1 мл, ПО).

Т№а количественно определяли с помощью коммерчески доступного набора ЕЫ8А (Κ&Ό, К.ТА00). Введение соединения, описанного в примере 12, вызывает зависимое от дозы ингибирование синтеза Т№а, как количественно определено в синовиальной промывной жидкости при ТЕМЭ50=2,54 мг/кг.

Исследование фосфо-МАРКАРК2 ингибирования ех-νΐνθ у мышей, стимулированного анизомицином, с помощью проточной цитометрии

Самки мышей Ва1Ь/С в возрасте 8-10 недель были куплены у Тасошс 1пс., и им перорально вводили дозу объемом 0,2 мл соединений с концентрациями 30, 10, 3, 1 мг/кг. Через 2 ч или через другие указанные периоды времени мышей обескровливали с помощью сердечной пункции и кровь собирали в пробирки, содержащие ЕЭТА. 100 мкл крови инкубировали при 37°С в течение 10 мин. Всю кровь затем смешивали с Е1ТС-связанным крысиным анти-мышиным Ьу-6С тАЬ (1:250) и АРС-связанным крысиным антимышиным СЭ11Ь тАЬ (1:100) и стимулировали 10 мкг/мл анизомицина. Окрашивание клеточной поверхности антигена и стимулирование анизомицином проводили при 37°С в течение 15 мин и добавляли буфер Ьуке/Их (ВИ Вюкаепсек, № кат. 558049) в течение 10 мин при комнатной температуре. Лизированные образцы крови центрифугировали при 600хд в течение 8 мин, при комнатной температуре с дополнительным одноразовым промыванием 4 мл РВ8. 200 мкл разведенного анти-фосфо-МАРКАРК-2 (Тйт334) антитела (разведение 1:100) (Се11 81дпа1шд, № кат. 3041) и мышиного ВО Ес В1оск (разведение 1:100) (ВО Вюкаепсек, 553141) в проницаемой среде В (Са1!ад, № кат. СА80028-5) добавляли в клетки крови и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации добавляли 3 мл буфера окрашивания/промывания и клетки центрифугировали, как описано выше, с дополнительным промыванием 3 мл буфера окрашивания/промывания. Клетки затем подвергали исследованию с помощью проточной цитометрии, используя Весктап Сои1!ег Е500. Значение флуоресценции окрашивания фосфоно-МарКар-К2 измеряли на управляемых СО 11Ь+Ьу6С-клетках. Анализ данных выполняли с помощью программы 1МР. Введение соединения, описанного в примере 12, вызывает зависимое от дозы ингибирование синтеза р-МАРКАРК2 при ТМЕЭ50=2,20 мг/кг.

Модель эффективности при артрите крыс, вызванном коллагеном

Самок крыс Ье^18 (=190 г, Сйат1е8 Р|уег ЬаЬ§) иммунизируют бычьим коллагеном типа II (2 мг/мл), эмульгированным с равным объемом вспомогательного вещества (гидроксид алюминия). Крыс иммунизируют внутрикожным введением приблизительно 0,3 мг эмульсии в спину возле основы хвоста. Всех животных повторно иммунизируют через 7 дней в соответствии с такой же методикой. У крыс начинает развиваться артрит (характеризуется отеком или покраснением одного или обоих голеностопных суставов) через 12-14 дней после первой иммунизации. Крыс распределяют равномерно в пять исследуемых групп при первых признаках артрита и начинают лечение путем введения каждой крысе лекарственного средства дважды в день в течение 14 дней.

Исследуемые группы.

Группа 1 - основа (1% какаброксиметилцеллюлозы+0,25% Тетееп 80) 1 мл, ПО, дважды в день в течение 14 дней.

Группа 2 - исследуемое соединение, 5 мг/кг, 1 мл, ПО, дважды в день в течение 14 дней.

Группа 3 - исследуемое соединение, 15 мг/кг, 1 мл, ПО, дважды в день в течение 14 дней.

- 30 015123

Группа 4 - исследуемое соединение, 30 мг/кг, 1 мл, ПО, дважды в день в течение 14 дней.

Группа 5 - преднизолон 10 мг/кг, 1 мл, ПО, ежедневно в течение 14 дней.

Диаметр голеностопного сустава измеряют с помощью кронциркулей 5 дней в неделю и записывают. Данные выражают как область под кривой (АИС), построенной на основе результата комплекса явлений воспаления и проведенного статистического анализа.

Предпочтительным является пероральное введение соединения согласно настоящему изобретению. Однако пероральное введение не является единственным путем введения или даже единственным предпочтительным путем. Например, для пациентов, которые забывают принимать лекарства перорально или испытывают трудности при таком введении, может быть очень желательным трансдермальное введение, и, с точки зрения удобства или для избежания потенциальных осложнений, связанных с пероральным введением, предпочтительным может быть внутривенное введение. Соединения формулы I также в определенных условиях могут быть введены подкожным, внутримышечным, интраназальным или ректальным путем. Путь введения может быть изменен любым образом, ограниченным физическими свойствами лекарственных средств, удобством пациента и медика, и другими релевантными условиями (Кеттд1оп'8 Рйагтасеийса1 8с1епсе§, 18(Н Ебйюп, Маск РиЫщЫпд Со. (1990)).

Фармацевтические композиции получают способами, хорошо известными в фармацевтической области. Носитель или наполнитель может быть твердым, полутвердым или жидким веществом, которое может служить в качестве основы или среды для активного ингредиента. Подходящие носители или наполнители хорошо известны из уровня техники. Фармацевтическая композиция может быть приспособлена для перорального, ингаляционного, парентерального или местного использование и может быть введена пациенту в форме таблеток, капсул, аэрозолей, средств для ингаляции, суппозиториев, растворов, суспензий или подобных.

Соединения согласно настоящему изобретению могут быть введены перорально, например, с инертным разбавителем или в виде капсул или могут быть спрессованы в таблетки. Для перорального терапевтического введения соединения могут быть введены в наполнители и могут использоваться в форме таблеток, пастилок, капсул, эликсиров, суспензий, сиропов, облаток, жевательных резинок и т.п. Эти препараты должны содержать как активный ингредиент по меньшей мере 4% соединения согласно настоящему изобретению, но его количество может изменяться в зависимости от конкретной формы и обычно может составлять от 4% до приблизительно 70% массы единичной формы. Количество соединения в композициях должно обеспечивать соответствующую дозировку. Предпочтительные композиции и препараты согласно настоящему изобретению могут быть определены с помощью способов, хорошо известных специалисту в данной области техники.

Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и подобные формы также могут содержать одно или больше следующих вспомогательных веществ: связующие вещества, такие как повидон, гидроксипропилцеллюлоза, микрокристаллическая целлюлоза или желатин; наполнители или разбавители, такие как крахмал, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или фосфат дикальция, агенты дезинтеграции, такие как кроскармеллоза, кросповидон, натрия крахмала гликолят, кукурузный крахмал и подобные; смазывающие вещества, такие как стеарат магния, стеариновая кислота, тальк или гидрогенизированное растительное масло; вещества, способствующие скольжению, такие как коллоидный диоксид кремния; смачивающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и полисорбат 80; и могут быть добавлены подслащивающие вещества, такие как сахароза, аспартам или сахарин, или ароматизаторы, такие как перечная мята, метилсалицилат или ароматизатор с запахом апельсина. В тех случаях, когда форма единичного дозирования представляет собой капсулу, она может содержать, дополнительно к веществам упомянутого выше типа, жидкий носитель, такой как полиэтиленгликоль или жирное масло. Другие формы единичного дозирования могут содержать другие различные вещества, которые изменяют физическую форму единичного дозирования, например, в качестве оболочек. Таким образом, таблетки или пилюли могут быть покрыты сахаром, гидроксипропилметилцеллюлозой, полиметакрилатами или другими глазировочными средствами. Сиропы могут содержать, дополнительно к настоящим соединениям, сахарозу в качестве подслащивающего вещества и определенные консерванты, красители и красящие вещества и ароматизаторы. Вещества, которые используются при получении этих различных композиций, должны быть фармацевтически чистыми и нетоксичными в используемых количествах. Предпочтительный препарат получают добавлением 10% Ν-метилпирролидона к желаемой дозе соединения формулы I, затем добавляют раствор, который содержит 20% гидроксипропил-бета-циклодекстрина, 5% метилцеллюлозы, 0,5% антивспенивателя и НС1 0,01 Ν, мас./мас.%.

Соединения формулы I, как правило, эффективны в широком диапазоне доз. Например, суточные дозы обычно находятся в диапазоне от приблизительно 0,0001 до приблизительно 30 мг/кг массы тела. В некоторых случаях полностью адекватными могут быть уровни дозирования, которые меньше нижней границы указанного диапазона, тогда как в других случаях могут применяться еще большие дозы без возникновения какого-либо опасного побочного эффекта, и, таким образом, имеется в виду, что упомянутый выше диапазон дозирования не ограничивает объем изобретения каким-либо образом. Имеется в виду, что количество реально введенного соединения будет определено врачом, с учетом соответствующих обстоятельств, включая состояние, которое лечат, выбранный путь введения, фактическое введенное

- 31 015123 соединение или соединения, возраст, вес и реакцию конкретного пациента, и серьезность симптомов пациента.

Claims (9)

1. Соединение формулы I где X выбран из группы, включающей

Я¹ представляет собой С₁-С₄ алкил, С₃-С₄ циклоалкил, необязательно замещенный одним или двумя заместителями, выбранными из группы, включающей С₁-С₄ алкокси, метил и трифторметил; или С₁-С₄ алкилгалоген;

Я² представляет собой фенил, необязательно замещенный С1 -С₄ алкилом, или пиридинил, необязательно замещенный С₁-С₄ алкилом;

Я³ представляет собой амино, С₁-С₄ алкил, С₁-С₄ алкокси, С₁-С₄ алкилгалоген, С₃-С₄ циклоалкил, необязательно замещенный заместителем, выбранным из метила, трифторметила или галогена; фенил или тиенил, каждый необязательно замещенный первым заместителем, выбранным из группы, включающей галоген, С₁-С₄ алкил и С₁-С₄ алкокси, и необязательно, дополнительно замещенный вторым заместителем, выбранным из галогена;

или его фармацевтически приемлемая соль.

2. Соединение по п.1, где X представляет собой

3. Соединение по п.1 или 2, где Я² представляет собой 4-толил.

4. Соединение по любому из пп.1-3, где Я¹ представляет собой 1-метил-1-циклопропил, 2-фтор-1,1диметилэтил или 2-фтор-1-фторметил-1-метилэтил.

5. Соединение по любому из пп.1-4, где Я³ представляет собой 1-метил-1-циклопропил.

6. Соединение формулы I

1-{1-[1-(1-Метилциклопропанкарбонил)пиперидин-4-илокси]изохинолин-4-ил}-3-[5-(1метилциклопропил)-2-р-толил-2Н-пиразол-3-ил]мочевина или его фармацевтически приемлемая соль.

7. Фармацевтическая композиция, содержащая соединение по любому из пп.1-6 в комбинации с фармацевтически приемлемым наполнителем, носителем или разбавителем.

8. Применение соединения по любому из пп.1-6 или его фармацевтически приемлемой соли для лечения рака.

9. Применение соединения по любому из пп.1-6 или его фармацевтически приемлемой соли для получения лекарственного средства для лечения рака.