CN101296924A - 作为p38激酶抑制剂的吡唑异喹啉脲衍生物 - Google Patents

Abstract

本发明提供式I的激酶抑制剂或其可药用的盐：其中R¹、R²和X如本文所述。

Description

作为P38激酶抑制剂的吡唑异喹啉脲衍生物

发明背景

p38激酶是属于丝氨酸/苏氨酸激酶超家族的有丝分裂原活化的蛋白(MAP)激酶。这种激酶被细胞外应激如热、UV光和渗透应激以及炎性刺激如脂多糖所活化。当被活化时，p38激酶磷酸化调节促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素-1β(IL-1β)生物合成的细胞内蛋白底物。这些细胞因子参与众多慢性炎性障碍(Lee等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.，696，149-170(1993)；Muller-Ladner，Curr.Opin.Rheumatol.，8，210-220(1996))、心血管和中枢神经系统障碍(Salituro等人，Current Medicinal Chemistry，6，807-823(1999))以及自身免疫障碍(Pargellis等人，Nature Structural Biology，9(4)，268-272(2002))的病理学。此外，有丝分裂原活化的蛋白激酶-蛋白激酶2(或pMAPKAPK2)的磷酸化形式也是p38 MAPK途径中的激酶并且可以被p38 MAPK直接活化。MAPKAPK2的小鼠剔除研究表现出细胞因子产生减少，表明MAPKAPK2可能是炎性响应的关键调节剂并且也可能是抗炎治疗的潜在靶标(WO 2005120509)。

众多脲化合物(例如WO 9923091、WO 01012188、WO 04004720、WO 04037789、WO 99/32111、US 2004/0058961、EP 1609789、WO03072569和WO 0043384)已经被鉴定为p38激酶抑制剂或细胞因子抑制剂。P38激酶抑制剂或细胞因子抑制剂可能制备成本高，并且可能具有限制其体内作用和治疗应用的生物利用度和吸收问题。因此，需要新的小分子细胞因子抑制药，即能够抑制p38激酶并具有改善的效力和更高的生物利用度的化合物。

本发明提供可用于治疗由过量细胞因子产生导致的病症的新p38激酶抑制剂。

发明概述

本发明提供式I化合物或其可药用的盐：

其中：

X选自

R¹是C₁-C₄烷基、任选被一个或两个选自C₁-C₄烷氧基、甲基和三氟甲基的取代基取代的C₃-C₄环烷基；或C₁-C₄卤代烷基；

R²是任选被C₁-C₄烷基取代的苯基或任选被C₁-C₄烷基取代的吡啶基；

R³是氨基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄卤代烷基、任选被选自甲基、三氟甲基或卤素的取代基取代的C₃-C₄环烷基；苯基和噻吩基，其各自任选被选自卤素、C₁-C₄烷基和C₁-C₄烷氧基的第一取代基取代，且任选被选自卤素的第二取代基进一步取代。

本发明还提供抑制哺乳动物p38激酶的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用有效量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明还提供抑制哺乳动物肿瘤坏死因子α(TNFα)产生的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用有效量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明还提供抑制哺乳动物白介素-1β(IL-1β)产生的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用有效量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明进一步提供治疗哺乳动物由过量细胞因子产生导致病症的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用细胞因子抑制量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明还提供抑制哺乳动物易感肿瘤(neoplasm)生长的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用p38抑制量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明还提供在哺乳动物中抑制转移的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用p38抑制量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明还提供治疗哺乳动物类风湿性关节炎的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用p38抑制量的式I化合物或其可药用的盐。

本发明还提供药物制剂，其包含式I化合物或其可药用的盐和可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制p38激酶的药物中的用途。此外，本发明还提供用于抑制哺乳动物p38激酶的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明还提供适用于抑制p38激酶的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)产生的药物中的用途。此外，本发明提供用于抑制哺乳动物肿瘤坏死因子α(TNFα)产生的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明提供适用于抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)产生的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制白介素-1β(IL-1β)产生的药物中的用途。此外，本发明提供用于抑制哺乳动物白介素-1β(IL-1β)产生的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明提供适于抑制白介素-1β(IL-1β)产生的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗由过量细胞因子产生导致的病症的药物中的用途。此外，本发明提供用于治疗哺乳动物由过量细胞因子产生导致的病症的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明提供适用于治疗由过量细胞因子产生导致的病症的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制易感肿瘤生长的药物中的用途。此外，本发明提供用于抑制哺乳动物易感肿瘤生长的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明提供适用于抑制易感肿瘤生长的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于抑制转移的药物中的用途。此外，本发明提供用于抑制哺乳动物的转移的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明提供适用于抑制转移的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

本发明还提供式I化合物或其可药用盐在制备用于治疗类风湿性关节炎的药物中的用途。此外，本发明提供用于治疗哺乳动物类风湿性关节炎的式I化合物或其可药用的盐。此外，本发明提供适用于治疗类风湿性关节炎的药物组合物，其包含式I化合物或其可药用盐和一种或多种可药用的赋形剂、载体或稀释剂。

发明详述

术语“p38激酶”是指p38α和/或p38β激酶同工型。

术语“抑制TNFα(IL-1β、细胞因子)产生”是指将哺乳动物中过量的TNFα、IL-1β或另外的细胞因子的体内水平降低至正常或正常以下水平。这可以如下实现：抑制体内所有细胞释放TNFα、IL-1β或另外的细胞因子，包括巨噬细胞；通过在基因组水平将哺乳动物中过量的TNFα、IL-1β或另外的细胞因子的体内水平下调至正常或正常以下水平；抑制作为翻译后事件的TNFα、IL-1β或另外的细胞因子的合成；或者在翻译水平下调TNFα、IL-1β或另外的细胞因子。

本领域技术人员应当理解：本发明化合物能形成酸加成盐。在所有情况中，在化合物命名中包括所有化合物的可药用的盐。本发明的化合物是胺类化合物，因此可以与多种无机酸和有机酸中的任一种反应，形成可药用的酸加成盐。这里所用的术语“可药用的盐”指的是对活体基本无毒的式I化合物的盐。典型的可药用盐包括那些通过使本发明化合物与可药用的有机酸或无机酸反应制得的盐。该类盐包括Journal of Pharmaceutical Science，66，2-19(1977)中所列的可药用盐，其对于本领域技术人员而言是已知的。最优选式I化合物的甲磺酸盐。

式I化合物是p38激酶的抑制剂。因此，本发明还提供抑制哺乳动物p38激酶的方法，其包括给需要该类治疗的哺乳动物施用p38激酶抑制量的式I化合物。优选施用式I化合物所治疗的哺乳动物是人。

作为p38激酶的抑制剂，本发明的化合物可用于抑制促炎细胞因子肿瘤坏死因子α(TNFα)和白介素-1β(IL-1β)的产生，因此可用于治疗由过量细胞因子产生导致的障碍。因此，认为本发明的化合物可用于治疗炎性障碍，包括湿疹、特应性皮炎、类风湿性关节炎、骨关节炎、炎性肠病和中毒性休克综合征。还认为本发明的化合物可用于治疗心血管障碍，如急性心肌梗死、慢性心衰、动脉粥样硬化、病毒性心肌炎、心脏同种异体移植物排斥和与脓毒症有关的心脏机能障碍。此外，还认为本发明的化合物可用于治疗中枢神经系统障碍，如脑膜炎球菌性脑膜炎、阿耳茨海默病、帕金森病和多发性硬化。WO 99/32111、WO 9923091、WO 04004720、WO03072569。

大部分实体肿瘤通过恶性细胞和基质细胞、包括内皮细胞的增殖而增加质量。肿瘤为了在直径上长大2-3毫米，其必需形成脉管系统，这是一种被称为血管生成的过程。已经报道了通过用制管张素(angiostatin)和内皮他汀(endostatin)抑制肿瘤诱导的血管生成而产生抗肿瘤活性(O’Reilly等人，Cell，88，277-285(1997))。选择性p38激酶抑制剂SB22025已经显示抑制血管生成(J.R.Jackson等人，J.Pharmacol.Exp.Therapeutics，284，687(1998))。因为血管生成是大部分实体肿瘤质量扩张的关键组件，因此研制抑制这一过程的新p38激酶抑制剂代表了一种有前景的抗肿瘤疗法。这种抗肿瘤疗法可能缺乏常规化疗的毒副作用或药物耐受性诱导特性(JudahFolkman，血管生成的内源性抑制剂，The Harvey Lectures，Series 92，第65-82页，Wiley-Liss Inc.，(1998))。

因此，作为p38激酶的抑制剂，本发明的化合物还可以用来抑制易感肿瘤的生长。Schultz，R.M.p38 MAP激酶抑制剂在癌症治疗中的潜能。In：E.Jucker编辑，Progress in Drug Research，60，59-92，(2003)。易感肿瘤被定义为其存活、生长或转移依赖于p38激酶的肿瘤。易感肿瘤包括脑、泌尿生殖道、淋巴系统、胃、喉和肺的肿瘤(US专利号5,717,100)。优选地，本申请中所用的术语“易感肿瘤”包括人类癌症，包括非小细胞肺癌(A.Greenberg等人，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.，26，558(2002))、乳腺癌(J.Chen等人，J.Biol.Chem.，276，47901(2001)；B.Salh等人，Int.J.Cancer，98，148(2002)；和S.Xiong等人，Cancer Res.，61，1727(2001))、胃癌(Y.D.Jung等人，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.，43，9(2002))、结肠直肠癌(S.Xiong等人，Cancer Res.，61，1727(2001))和恶性黑素瘤(C.Denkert等人，Clin.Exp.Metastasis，19，79(2002))。

通过抑制TNFα来抑制血管生成也已被教导可用于抑制或预防转移(US专利号6,414,150；US专利号6,335,336)。此外，还表明抑制TNFα可用于治疗和预防恶病质，一种约半数癌症患者所经历的消耗综合征(T.Yoneda等人，J.Clin.Invest.，87，977(1991))。

此外，抑制p38激酶可有效治疗某些病毒性病症，如流感(K.Kujime，等人，J.Immunology.，164，3222-3228(2000))、鼻病毒(S.Griego等人，J. Immunology，165，5211-5220(2000))和HIV(L.Shapiro等人，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，95，7422-7426(1998))。

这里所用的术语“C₁-C₄烷基”指的是1至4个碳原子的直链或支链单价饱和脂族链，并且包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基和叔-丁基。

这里所用的术语“C₁-C₄烷氧基”指的是具有1至4个碳原子、连接于氧原子的直链或支链烷基链。典型的C₁-C₄烷氧基包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、叔-丁氧基等。术语“C₁-C₄烷氧基”在其定义内包括术语“C₁-C₃烷氧基”。

除非特别指出，否则这里所用的术语“卤素”指的是氯、溴、碘或氟原子。

这里所用的术语“C₁-C₄卤代烷基”指的是被至多5个卤素原子取代的C₁-C₄烷基。典型的C₁-C₄卤代烷基包括卤代甲基、三氟甲基、卤代乙基、二氟甲基乙基、卤代丙基、卤代异丙基、卤代丁基、卤代叔-丁基等。术语“C₁-C₄卤代烷基”在其定义内包括术语“C₁-C₃卤代烷基”。

这里所用的术语“C₃-C₄环烷基”是指包含碳和氢原子的非芳族环，并且包括环丙基和环丁基。

这里所用的术语“1-甲基-1-环丙基”指的是以下残基：

某些类式I化合物是优选的p38激酶抑制剂。以下段落描述这类优选类别：

a)X是

b)R¹是任选被选自甲基、三氟甲基或卤素的取代基取代的C₃-C₄环烷基；

c)R¹是1-甲基-1-环丙基；

d)R¹是2-氟-1，1-二甲基-乙基；

e)R¹是2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基；

f)R²是任选被甲基取代的苯基或任选被甲基取代的吡啶基；

g)R²是4-甲苯基；

h)R³是任选被C₁-C₄烷基取代的C₃-C₄环烷基；或任选被甲基取代的噻吩基；或任选被选自卤素、C₁-C₄烷基或C₁-C₄烷氧基的第一取代基取代、任选进一步被卤素取代基取代的苯基；

i)式I化合物是游离碱；

j)式I化合物是盐；

k)式I化合物是甲磺酸盐。

本发明优选的实施方案包括第a)-k)段的所有组合。其它优选的式I化合物是那些化合物，其中X是

R¹如c)段所述；且R²如g)段所述。

还优选X是

R¹如c)段所述；且R²如g)段所述；且R³如h)段所述。

特别优选X是

R²是在4-位被C₁-C₄烷基取代的苯基。

最优选X是

还最尤其优选以下化合物：

1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲

本发明的化合物可以通过各种方法制备，其中的一些在以下流程中阐释。本领域技术人员应当意识到，为了提供式I化合物，以下流程中的各步骤可以变化。制备式I化合物所需步骤的特定顺序取决于所合成的特定化合物、起始化合物和被取代部分的相对不稳定性。为了清楚，以下流程中剔除了一些取代基，其并不是要以任何方式限制该流程的教导。

式I化合物及其中间体可以如以下流程图中所述制备，其中R¹、R²和X如前所定义：

流程1

使胺(a)与适合的异氰酸酯或氨基甲酸酯如氨基甲酸吡唑基-2，2，2-三氯乙基酯反应，得到式I化合物。例如，将胺(1当量)、氨基甲酸三氯乙基酯(1当量)和适合的碱如二异丙基乙基胺(2当量)或碳酸钾在适合的溶剂如乙腈或二甲基亚砜(DMSO)中的溶液加热。然后，分离所需化合物，并且如果需要和希望的话，用现有技术中众所周知的技术如色谱法纯化，得到式I化合物。

必需的胺如下流程2所述制备，其中X如前定义：

流程2

将硝基部分(b)在标准还原条件下、例如用氢在钯催化剂存在下、在适合的溶剂如低级链烷醇或乙酸乙酯中还原，得到相应的胺(a)。该类还原步骤在现有技术中是众所周知和可领会的。见Larock，R.，Comprehensive Organic Transformations，412，VCH出版公司，纽约，1989。

必需的硝基化合物如下流程3中所述制备，其中R³如前所定义，且X’是C(O)R³或适合的保护基团PG：

流程3

使1-氯-4-硝基-异喹啉(e)在适合的有机溶剂如THF中与N-保护的(PG)羟基哌啶和氢化钠反应，得到相应的取代的哌啶b(i)。如果需要或希望的话，可以利用适合的氨基保护基团“Pg”，如叔-丁氧基羰基(BOC)部分。引入这些基团的技术对于本领域技术人员而言是众所周知的。本领域技术人员将意识到：可以在本发明化合物合成中任何方便的阶段除去氮-保护基团。除去氨基-保护基团的方法在现有技术中是众所周知的(例如参见T.W.Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，纽约，N.Y.，1999)。

作为替代选择，使1-氯-4-硝基-异喹啉(e)与N-BOC保护的哌嗪和碳酸钾在极性溶剂如乙腈中反应，得到相应的取代的哌嗪b(ii)。

所需的氨基甲酸吡唑基酯可如以下流程所示制备，其中R¹和R²如前所定义：

流程4

3-氨基吡唑(m)通过现有技术中众所周知的条件形成；Larock，R.，“Comprehensive Organic Transformations，”79，VCH出版公司，纽约，1989。例如，使α-氰基酮(j)和适合的肼或肼盐(k)在适合的有机溶剂如乙醇中在升高的温度反应，并且可以用标准技术如硅胶柱色谱纯化。

使氯甲酸2，2，2-三氯乙基酯(n)与适合取代的3-氨基吡唑(m)和碱、例如碳酸钠在适合的溶剂、例如THF中反应，得到相应的氨基甲酸2，2，2-三氯乙基酯(o)。本领域技术人员将意识到：相应的氨基甲酸酯可以通过使3-氨基吡唑与其它活性碳酸酯反应来制备。

式I(i)化合物可以如以下流程5所示制备，其中R¹、R²、R³和PG如前所定义：

流程5

在现有技术中众所周知的条件下将式(f)化合物脱保护。例如，当保护基团是叔-丁氧基羰基时，将式(f)化合物溶解于适合的有机溶剂或溶剂混合物如二氯甲烷中，用酸如含盐酸的二噁烷或三氟乙酸处理。将N-保护的-哌啶取代的脲(f)脱保护，得到取代的哌啶(g)，使其与取代的羧酸在有机酸和有机胺的标准偶联条件下、在偶联剂如N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、催化量4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和1-羟基苯并三唑(HOBt)存在下反应，得到式I(i)。本领域技术人员将意识到：式I(i)的实例可以通过用其它被保护的哌啶(包括不同的N-保护基团，如甲酰基)开始来制备，其可能需要其它脱保护操作来形成中间体(g)。

本领域技术人员还将意识到：不是式I化合物中所有取代基都能耐受合成该化合物所用的某些反应条件。可以在合成中方便的阶段引入这些部分，或者如果需要或希望的话，可以对这些部分进行保护，然后脱保护。本领域技术人员将意识到：可以在本发明化合物合成中任何方便的阶段除去保护基团。引入和除去氮和氧保护基团的方法在现有技术中是众所周知的；参见例如Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley和Sons，纽约(1999)。此外，本领域技术人员还将意识到，在许多情况下，这些部分被引入的顺序并不关键。制备式I化合物所需步骤的特定顺序取决于所合成的特定化合物、起始化合物以及被取代部分的相对不稳定性。

在实施例和试验中所用的缩写、符号和术语具有以下含义。AcOH＝乙酸，DCC＝二环己基碳二亚胺，DIEA＝N，N-二-异丙基乙基胺，DMSO＝二甲基亚砜，DMF＝N，N-二甲基甲酰胺，h＝小时，HOBt＝1-羟基苯并三唑，LDA＝二异丙基氨化锂，EDCI＝1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，EtOAc＝乙酸乙酯，EtOH＝乙醇，MeOH＝甲醇，NaBH(OAc)₃＝三乙酰氧基硼氢化钠，TBAF＝氟化四丁基铵，Tf₂O＝三氟甲磺酸酐，THF＝四氢呋喃。

制备1

1-三氟甲基-环丙烷甲酸甲酯

向1-三氟甲基环丙烷-1-甲酸(3.65g，23.7mmol)在甲醇-己烷(2.5mL-22.5mL)中的溶液加入2M重氮甲烷的己烷溶液(14.2mL，28.45mmol)。在减压下除去溶剂，对残余物进行蒸馏，得到黄色油状物(2.93g，收率为73％)。

制备2

3-(1-甲氧基-环丙基)-3-氧代-丙腈

将2M LDA在THF中的溶液(29.1mL，58.3mmol)加入到干冰-丙酮冷却的1-甲氧基-环丙烷甲酸甲酯(WO2005/014577)(3.45g，26.5mmol)和乙腈(2.17gmL，53.0mmol)在THF(30mL)中的溶液中。将该反应混合物在-78℃搅拌1小时，然后在22℃搅拌0.5小时。蒸发溶剂，得到褐色固体。过滤，用己烷洗涤。加入2N盐酸，用乙醚萃取3次(每次50mL)。用硫酸钠干燥合并的有机相。除去溶剂，得到红色油状物(3.55g，收率为96％，ES+(m/z)140.1[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物
		制备3	4，4，5，5，5-五氟-3-氧代-戊腈
制备4	3-氧代-3-(1-三氟甲基-环丙基)-丙腈

制备5

3-羟基-2-羟基甲基-2-甲基-丙酸甲酯

将H₂SO₄(4.5g)加入到3-羟基-2-羟基甲基-2-甲基-丙酸(100g)在MeOH(1L，HPLC级溶剂)中的混悬液中，在室温搅拌约70小时。除去溶剂，使残余物在EtOAc(1L)和H₂O(100mL)之间分配。将水层用EtOAc再提取，用MgSO₄干燥合并的有机级分。过滤，在减压下浓缩。粗混合物可以未经进一步纯化即使用。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δppm 3.9(d，2H，J＝11.1Hz)，3.76(s，3H)，3.71(d，2H，J＝11.1Hz)，2.8(bs，2H)，1.1(s，3H)。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物
		制备6	3，3-二-羟基甲基-戊酸乙酯

制备7

3-羟基-2，2-二甲基-丙酸苄酯

将氢氧化钾(486.7mmol，32.1g)加入到2，3-二羟基-2-甲基-丙酸(423.2mmol，50g)在300mL DMF中的溶液中。在100℃搅拌1小时。然后，加入苄基溴(584.04mmol，69.46mL)并搅拌过夜。冷却该混合物，用乙酸乙酯稀释。用水洗涤有机层。用乙酸乙酯洗涤水层若干次。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δppm：7.36-7.32(m，5H)，5.1(s，2H)，3.5(s，2H)，1.21(s，6H)。

制备8

5-五氟乙基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3基胺

将4，4，5，5，5-五氟-3-氧代-戊腈(4g，21.4mmol)和对-甲苯基-肼(10g，64.1mmol)在乙醇(20mL)中的混合物在密封管装置中加热至95℃达15小时。冷却至室温后，在减压下除去溶剂，得到褐色残余物。对残余物进行硅胶色谱，用乙酸乙酯和己烷洗脱，得到标题化合物(3.24g，收率为52％，ES+(m/z)292.1[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z
			制备9	2-对-甲苯基-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基胺	282.3[M+H]

制备10

5-(1-氟甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺

将AgF(4.5eq，4.56g)加入到1-氟-环丁烷甲酸乙酯(1.6g，8mmol)在含22mL乙腈的274mL水中的溶液中。将该混合物在80℃于密封管中在强烈搅拌下加热20小时。使该混合物冷却，用硅藻土过滤。在减压下除去溶剂，得到油状物形式的1-氟甲基-环丙烷甲酸乙酯化合物(0.81g，收率为61％)。ES+(m/z)147.1[M+1]。

将i-Pr₂NH(1.7mL，2.2eq，12.1mmol)和n-BuLi(1.6M己烷溶液，7.5mL，2.2eq，12.1mmol)在12mL THF中、在-78℃、N₂下搅拌30分钟，然后向该LDA溶液中加入1-氟甲基-环丙烷甲酸乙酯(0.81g，5.5mmol)在7mLTHF中的溶液。搅拌，使该混合物从-78℃温至室温，然后在室温搅拌5小时。加入10mL饱和NH₄Cl水溶液。加入AcOEt，分离有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥并除去溶剂，得到褐色油状物(0.42g，收率为54％)。将该化合物溶解于10mL EtOH，加入对-甲苯基肼(0.47g，1eq，3mmol)。将该混合物在密封管中在90℃加热过夜。然后，使该混合物冷却，除去溶剂，得到残余物。用色谱法纯化(己烷/AcOEt，15-80％)，得到油状物形式的标题化合物(0.336g，收率为45％)。ES+(m/z)：246.1[M+1]。

制备11

5-(1-甲氧基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺

将3-(1-甲氧基-环丙基)-3-氧代-丙腈(制备2，3.55g，25.5mmol)和对-甲苯基肼盐酸盐(12.15g，76.5mmol)在乙醇(50mL)中的混合物在90℃于密封管中加热18小时。除去溶剂后，对残余物进行硅胶色谱，用0-5％甲醇的二氯甲烷溶液洗脱，得到黄色固体形式的标题化合物(3.29g，收率为53％，ES+(m/z)244.2[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z
			制备12	2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基胺	283.2[M+H]

制备13

[5-(1-甲氧基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯

向冰-盐冷却的5-(1-甲氧基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(制 备11，2.43g，10mmol)和吡啶(0.9mL，11mmol)在THF(30mL)中的溶液中滴加氯甲酸2，2，2-三氯乙基酯(2.12g，10mmol)在THF(10mL)中的溶液。在-15℃搅拌0.5小时，然后在22℃搅拌1小时。使该反应混合物在二氯甲烷(50mL)和饱和碳酸氢钠水溶液(50mL)之间分配。分离水相，用二氯甲烷萃取两次(每次25mL)。用硫酸钠干燥合并的有机相，浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到白色固体(3.73g，收率为89％，ES+(m/z)418.1[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z
			制备14	[2-对-甲苯基-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯	458.2[M+H]
制备15	[2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯	403.2[M+H]
			制备16	(5-五氟甲基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯	466.1[M+H]

制备17

1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯

向5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(Regan等人，J.Med.Chem.2002，45，2994-3008，400g，1.74mol)在THF(8L)中的溶液中加入饱和碳酸钠溶液(2.4L)，将混合物冷却至0℃。然后，滴加氯甲酸2，2，2-三氯乙基酯(406.77g，1.92mol)，在0℃搅拌2小时。用乙酸乙酯萃取反应混合物(3×6.5L)，用无水硫酸镁干燥，蒸发溶剂。将固体溶解于最少量乙酸乙酯中，加入过量己烷，以使固体沉淀。过滤收集固体，干燥，得到米色固体形式的标题化合物(586g，收率为83％)。(ES+)：m/z 406.1(M+H)。

制备18

[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯

在室温将乙腈(87mL，1.6mol)加入到氢化钠(66g，1.6mol)在THF(700mL)中的混悬液中，搅拌10分钟。然后，加入1-甲基-环丙烷甲酸甲酯(90.0g，0.78mol)，将该白色浆液回流3小时。冷却混合物，然后加入甲醇(200mL)，将该混合物倾至水(500mL)上。分离各相，用1.0N HCl将水相pH降至pH 3-4。用乙醚萃取水相(2×350mL)，合并有机层，用氯化钠水溶液洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到黄色油状物形式的3-(1-甲基-环丙基)-3-氧代-丙腈。¹H NMR(CDCl₃)：3.59(s，2H)，1.37(s，3H)，1.30(q，J＝4Hz，2H)，0.86(q，J＝4Hz，2H)。

作为替代选择，向配有高架搅拌器、热电偶、回流冷凝器和加料漏斗的5L三颈圆顶烧瓶中加入含叔-丁醇钾的THF(3.00L，3.00摩尔)。混合1-甲基-环丙烷甲酸乙酯(264.00g，2.06摩尔)与乙腈(123.00g，3.00摩尔)，然后历经0.5小时通过加料漏斗加入到丁醇化物溶液中。加热所得混合物至回流。回流2小时，然后通过加入甲醇(96.00g，3.00mL)冷却至＜40℃。搅拌混合物10分钟，然后将该内含物转移到12 L分液漏斗中，该分液漏斗含有剧烈搅拌着的水(3.96L，219.81摩尔)和MTBE(3.96L，33.32摩尔)的混合物。分离各层，用MTBE(3.96L，33.32摩尔)萃取水层。用5NHCl(610.00mL，3.05摩尔)将水层pH由12.5调至3.5。用MTBE萃取水层(2×1.32L，11.11)。合并有机层，用硫酸钠干燥(62.00g，436.49摩尔)，过滤，得到3-(1-甲基-环丙基)-3-氧代-丙腈。

将3-(1-甲基-环丙基)-3-氧代-丙腈(60g，487.2mmol)和对-甲苯基-肼盐酸盐(78g，478.2mmol)在乙醇(975mL)中的溶液加热至回流达4小时。蒸发溶剂，将剩余的固体溶解于水中。用1.0N氢氧化钠溶液将该溶液的pH升至8。过滤沉淀，得到白色固体形式的5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺。¹H NMR(DMSO)：7.39(d，J＝8Hz，2H)，7.22(d，J＝8Hz，2H)，5.12(s，2H)，2.31(s，3H)，1.30(s，3H)，0.80(q，J＝4Hz，2H)，0.61(q，J＝4Hz，2H)。

在0℃，将氯甲酸2，2，2-三氯乙基酯(3.0mL，23mmol)滴加到5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(4.75g，21mmol)在四氢呋喃(105mL)和饱和碳酸钠水溶液(32mL)中的溶液中。在该温度搅拌2小时。将该混合物倾至水中，分离各相。用乙酸乙酯萃取水层。

后处理A：合并有机层，用氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到黄色固体。将该固体溶解于最少量乙酸乙酯中，并在搅拌下加入己烷，直至混浊。使标题化合物结晶，过滤，得到白色固体。¹HNMR(DMSO)：9.89(br s，1H)，7.31(d，J＝8Hz，2H)，7.23(d，J＝8Hz，2H)，6.12(s，1H)，4.82(s，2H)，2.31(s，3H)，1.37(s，3H)，0.89(q，J＝4Hz，2H)，0.71(q，J＝4Hz，2H)。

后处理B：将乙酸乙酯溶剂换成异丙醇(91.56摩尔)。将该浆液在＜0℃搅拌2小时，过滤，用冷异丙醇(13.08摩尔)洗涤，在40℃、减压下干燥过夜，得到白色结晶固体形式的标题化合物。

制备19

[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸 2，2，2-三氯-乙基酯

将Tf₂O(80mL)滴加到3-羟基-2-羟基甲基-2-甲基-丙酸甲酯(制备5，32.5g)在二氯甲烷(400mL)和2，6-二甲基吡啶(80mL)中的冷溶液(-78℃)中。使该反应物达到室温，搅拌约2小时。用二氯甲烷(400mL)稀释，用HCl(3％水溶液)洗涤。用MgSO₄干燥有机层，过滤，浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯5％洗脱，得到无色油状物形式的2-甲基-2，3-二-三氟甲磺酰氧基-丙酸甲酯。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δppm 4.7(d，2H，J＝10.3Hz)，4.5(d，2H，J＝10.3Hz)，3.8(s，3H)，1.4(s，3H)。

将TBAF 1M(132mmol，132mL)加入到冷却至0℃的2-甲基-2，3-二-三氟甲磺酰氧基-丙酸甲酯(65.9mmol，26.3g)在500mL无水THF中的溶液上。搅拌过夜。减压浓缩，加入二氯甲烷。用饱和氯化钠水溶液洗涤有机层。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酸甲酯。¹H NMR(CDCl₃，300MHz)：δppm：4.7-4.4(m，4H)，3.5(s，3H)，0.98(t，3H，J＝1.7Hz)。

将LDA 2.0M(62.0mmol，31mL)、然后将无水乙腈(56.4mmol，2.9mL)加入到冷却至-78℃的3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酸甲酯(28.2mmol，4.3g)在100mL无水THF中的溶液中。在-78℃搅拌2小时，使该溶液温至室温过夜。减压浓缩，加入二氯甲烷。用饱和氯化钠水溶液和10％HCl水溶液洗涤有机层。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。

将对-甲苯基肼盐酸盐(15.5mmol，2.5g)和以上获得的残余物(15.5mmol，2.5g)在31mL乙醇中于90℃搅拌过夜。蒸发溶剂，将残余物溶解于水中。加入10％氢氧化钠溶液，用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺。对残余物进行硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯(从15％至50％)作为洗脱剂洗脱。LCMS ES+(m/z)266[M+H])。

将氯甲酸2，2，2-三氯乙基酯(8.1mmol，1.1mL)和碳酸钠水溶液(4.8mL)加入到5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(7.3mmol，1.9g)在37mL THF中的溶液上。搅拌24小时。将该溶液倾至水上，用乙酸乙酯萃取。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯。LCMS ES+(m/z)440[M+H]。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			制备20	[5-(1，1-二-氟甲基-丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯	454
制备21	[5-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯	424

制备22

4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯

用冰/丙酮浴冷却硫酸(900mL)至5℃，然后历经45分钟加入1-氨基异喹啉(208.8g，1448mmol)，保持该混合物的内部温度＜20℃。在氮气下在机械搅拌下冷却该深色混合物至0℃，然后历经45分钟分批用KNO₃(149.4g，1477mmol)处理，保持该混合物的内部温度＜10℃。搅拌该混合物2小时，同时温至15℃。将该混合物倾至冰/水(3kg)中，然后用另外的水(6L)稀释。搅拌该浆液45分钟，然后过滤。用水洗涤滤饼(6×1.5L)。风干过夜将该金色材料部分干燥，然后置于真空烘箱(50-55℃，约10托，氮气流，24h)中，得到1-氨基-4-硝基异喹啉H₂SO₄(256.8g，收率为62％)。(ES+)：m/z190(M⁺+H)。

将1-氨基-4-硝基异喹啉H₂SO₄(120g，418mmol)在HCl水溶液(6N，2L)中的浆液在氮气、35℃机械搅拌。历经1小时加入NaNO₂(72.1g，1044mmol)在水(300mL)中的溶液，同时将该浆液温至50℃。将该混合物再加热30分钟，然后使其冷却至室温，搅拌过夜。加热该混合物至50℃，然后历经30分钟加入NaNO₂溶液(36g，于150mL水中)。将该混合物搅拌2小时，然后加热至60℃，使之历经3小时缓慢冷却至室温。过滤所得浆液，用水(3×600mL)洗涤滤饼。部分风干(180g)。在回流下将该湿固体调和到i-PrOH(1L)和EtOH(1L)中，加入THF(350mL)使其完全溶解。向该溶液加入水(400mL)，历经3小时冷却至10℃。过滤，用EtOH(2×300mL)、然后用乙醚(3×150mL)洗涤。风干过夜，得到淡褐色固体形式的1-羟基-4-硝基异喹啉(62.62g，收率为79％)。(ES+)：m/z 191(M⁺+H)。

将1-羟基-4-硝基异喹啉(62.2g，327mmol)在POCl₃(180mL)中的浆液在氮气下机械搅拌并加热至100-105℃达1小时，得到均匀的深褐色溶液。将冷凝器换成短径蒸馏头，在减压(约10-30托)下除去过量的POCl₃，使罐温为55℃。向该混合物加入1，2-二氯乙烷(150mL)，将该混合物温至70℃，得到均匀的溶液。冷却该溶液至15℃，然后历经5分钟加入i-PrOH(450mL)，从而放热至33℃。在15℃搅拌该浆液3.5小时，然后过滤，用i-PrOH洗涤(3×100mL)。风干所得固体过夜，得到褐色固体形式的1-氯-4-硝基异喹啉(52.08，收率为76％)。(ES+)：m/z 209/211(M⁺+H)。

将NaH(60％，于矿物油中，未洗涤；6.23g，156mmol)分批加入到在室温、氮气流下搅拌的1-氯-4-硝基异喹啉(26.0g，125mmol)和1-叔-丁氧基羰基-4-羟基哌啶(27.6g，137mmol)在THF(350mL)中的溶液中。将该深红色混合物在40℃搅拌1.5小时，然后在55℃搅拌1.5小时。再加入NaH(1.3g)，将所得混合物在55℃搅拌2小时，然后冷却至室温过夜。加入己烷(75mL)，然后缓慢加入水(600mL)。用HCl水溶液(1N)将该反应混合物的pH调至7，然后分离各层。弃去水层，向有机层中加入己烷(200mL)。在减压下部分浓缩该混合物至50-100mL的体积。加入乙醚(150mL)和己烷(250mL)，然后过滤所得浆液。用乙醚/己烷(1∶1)洗涤滤饼，风干，得到褐色固体形式的4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(33.84g，收率为73％)。(ES+)：m/z 374(M⁺+H)。

向4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(33.5g，89.7mmol)在THF(300mL)和乙醇(300mL)中的浆液中加入作为乙醇(25mL)中浆液的10％Pd/C(1.80g，1.69mmol)。将该混合物置于氢气氛(25-40psi)、室温的Parr振动器中达8小时。用硅藻土垫过滤该混合物，用乙醇洗涤至滤液无色。减压浓缩滤液，得到深色油状物。对残余物进行硅胶色谱，用1％、然后用2.5％MeOH/二氯甲烷洗涤，得到橙色玻璃状物形式的标题化合物(30.3g，收率为98％)。(ES+)：m/z 344(M⁺+H)。

制备23

[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(1-甲基-环丙基)-甲酮

将异喹啉(500.00g，3.75摩尔)和乙酸乙酯(7.60L，77.62摩尔)加入到配有高架搅拌器、热电偶、氮气入口/出口和加料漏斗的水浴中的22L三颈圆底烧瓶中。搅拌以溶解。在室温历经0.5小时滴加过乙酸(1.25L，5.94摩尔)。在室温搅拌过夜。将该反应烧瓶在冰-水浴中冷却，然后历经45分钟滴加二甲基硫醚(525.00mL，7.14摩尔)淬灭反应。搅拌过夜，同时温至室温。检测该反应混合物的过氧化物。

合并两批反应混合物。将该反应混合物转移到50L分液漏斗中，加入水(2.00L，111.02摩尔)和二氯甲烷(12.00L，187.21摩尔)。分批加入碳酸钠(2.07kg，19.53摩尔)，然后分离各层。用二氯甲烷(3×4L)萃取水层，合并有机层，用硫酸钠干燥。过滤，在减压下除去溶剂，得到深红色油状物/液体粗品。

向该深红色油状物/液体粗品中加入乙酸乙酯(8.00L，81.76摩尔)，然后减压下搅拌至除去6.8L乙酸乙酯。过滤沉淀出来的固体，用冷乙酸乙酯(750.00mL，7.66摩尔)洗涤，然后用庚烷(800.00mL，5.46摩尔)洗涤。干燥固体，得到细沙样固体形式的异喹啉-2-氧化物714.20 g(64％)。

作为备选的后处理，在用庚烷洗涤前，从滤液中除去1L溶剂。使该滤液静置过夜。过滤固体，用冷乙酸乙酯(500.00mL，5.11摩尔)、然后用庚烷(500.00mL，3.41摩尔)洗涤。将该固体干燥，得到细沙样固体形式的异喹啉-2-氧化物110.10g(10％)-产物#2(总收率为74％)。

将异喹啉2-氧化物(4.82mol；699.1g)和乙酸酐(73.95mol；6.99L)加入到具有N₂入口、蒸馏头和热电偶的22L烧瓶中。将该反应混合物加热至轻微回流，通过蒸馏除去挥发性物质。继续加热，收集2小时馏出液(除去总反应体积的约一半)。将该反应混合物冷却至50℃。滴加甲醇(2L)，使反应物温至70℃。将该反应混合物在室温搅拌过夜。从溶液中结晶出异喹啉-1-醇，过滤分离，在减压、50℃干燥。收率＝246.7克(35％)。

将异喹啉-1-醇(2.35mol；341.0g)和1705mL 1∶4的水和乙酸混合物加入到5L烧瓶中。将该反应混合物加热至60℃。历经3小时滴加硝酸(7.04mol；443.0mL)在1705mL 1∶4水和乙酸混合物中的溶液。在加入硝酸过程中，维持反应温度在68-70℃。3小时后，冷却反应物室温。向该反应混合物中加入水(5564mL)，然后过滤。用水(1L)洗涤滤饼，在50℃真空下干燥。收率＝196.8克(44％)。

将1-羟基-4-硝基异喹啉(880.3mmol；167.4克)和POCl₃(4.95mol；460mL)加入到具有N₂入口、冷凝器和热电偶的2L烧瓶中。将所得浆液加热至100℃达约1小时。用旋转蒸发器将该反应混合物浓缩至干燥。将残余物调和到1，2-二氯乙烷(402mL)中，冷却至15℃。滴加i-PrOH(1015mL)，同时维持罐温低于30℃。将该反应混合物在20℃搅拌2小时，在10℃搅拌1小时。过滤该反应混合物，用异丙醇(100mL)清洗滤饼。在50℃、减压下干燥。收率＝118.5克(65％)。

将1-甲基-环丙烷甲酸乙酯(405.0g，3.16摩尔)、5N氢氧化钠(1.0L，5.00摩尔)和甲醇(400.0mL，9.88摩尔)加入到3L三颈圆底烧瓶中。将该反应混合物在50℃至60℃之间加热5小时，然后冷却至环境温度过夜。除去有机溶剂，用MTBE(2×500mL)萃取该碱性溶液。用600mL浓HCl将该水溶液的pH调至1，用MTBE(4×500mL)萃取。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸镁干燥，过滤，在减压下除去溶剂。使残余物固化，然后加入100mL庚烷，在0-5℃搅拌所得浆液。过滤浆液，然后将所得固体减压干燥。浓缩滤液，在冰浴中冷却，得到另外一些白色固体物质。合并，回收265g(84％)白色固体形式的1-甲基-环丙烷甲酸。

将1-甲基-环丙烷甲酸(260.0g，2.60摩尔)、2-丁酮(2.5L，27.92摩尔)和N-甲基吗啉(325.0mL，2.95摩尔)加入到配有高架搅拌器的5L三颈圆底烧瓶中。在0℃搅拌该混合物，历经30分钟分批加入2-氯-4，6-二甲氧基-[1，3，5]三嗪(510.0g，2.86摩尔)。在0℃继续搅拌15分钟，然后在环境温度搅拌2小时。过滤所得N-甲基吗啉盐酸盐，用2×200mL 2-丁酮清洗。浓缩滤液，将残余物溶解于1500mL THF中，得到溶液A。

将含碳酸钾(550.0g，3.94摩尔)的2L水加入到5L三颈圆底烧瓶中。加入4-羟基哌啶(piperdine)(275.0g，2.66摩尔)，得到溶液B。

将溶液B在冰-水浴中冷却，滴加溶液A。除去冷却浴，将该反应混合物在室温搅拌2小时。在减压下除去有机溶剂。用二氯甲烷萃取剩余的碱性水溶液6×2L。合并有机层，用1.5L饱和氯化钠水溶液和200mL浓HCl的混合物洗涤。酸性水溶液用3×1L二氯甲烷萃取。合并有机层，用500g硫酸镁和100g碳酸钾干燥过夜。滤出干燥剂，除去溶剂直至剩余约500mL溶剂。加入1L庚烷，除去溶剂直至发生结晶。过滤固体，用庚烷充分洗涤，减压干燥，得到白色结晶固体形式的(4-羟基-哌啶-1-基)-(1-甲基-环丙基)-甲酮330g(69％)。

将氢化钠(38.40g，960.09摩尔)和THF(1.54L，18.92摩尔)加入到配有高架搅拌器、加料漏斗和热电偶的5L Morton烧瓶中。搅拌数分钟，然后加入(4-羟基-哌啶-1-基)-(1-甲基-环丙基)-甲酮(149.00g，813.09摩尔)。搅拌0.5小时。历经1小时加入在THF(1.54L，18.92摩尔)中的1-氯-4-硝基-异喹啉(154.00g，738.24摩尔)。将该反应混合物在室温搅拌2小时，然后在40℃搅拌6小时，然后冷却至室温过夜。向该反应混合物中滴加水(500mL，27.78摩尔)。通过倾至剧烈搅拌的水(2.5L，138.89摩尔)和MTBE(3.08L，25.92摩尔)混合物中，将该反应混合物淬灭。分离各层，将有机层用水(3.08L，170.97摩尔)洗涤，用硫酸钠干燥(142.00g，999.70摩尔)。滤出干燥剂，得到滤液#1。

重复以上操作，得到滤液#2。合并滤液#1和#2。在减压(～150mm)下除去溶剂，用20-28℃的蒸汽温度收集馏出液直至剩余约1.5L。向该蒸馏瓶加入异丙醇(4.62L，60.43摩尔)，在减压(～120mm)下恢复蒸馏，用35-44℃的蒸汽温度收集馏出液直至剩余约1L。将剩余的浆液在冰上冷却过夜。过滤固体，用冷异丙醇(300.00mL，3.92摩尔)、然后用3×100mL庚烷(300.00mL，2.05摩尔)洗涤。在40℃减压下干燥固体过夜，得到橙色固体形式的(1-甲基-环丙基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-甲酮368g(72％-联合收率)。

向3加仑的高压釜中加入(1-甲基-环丙基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-甲酮(368.0g，1.04摩尔)、THF(4.42L，54.32摩尔)和5％披钯碳(干燥，40.50g，19.03摩尔)。密封高压釜并引入氢气至50psi。将内含物以1000rpm在室温、50psi氢气下搅拌4.5小时。过滤，再用一些THF(2.0L，24.58摩尔)清洗。用碳(20-40目，42.00g)处理滤液，加热至40℃达1小时。再加入一些碳(60目，47.00g)，继续加热1小时。用微纤维滤纸和Hyflo Super

床将碳滤出，用最少量THF清洗。除去溶剂，获得深橙-红色油状物/泡沫形式的[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(1-甲基-环丙基)-甲酮，348g(103％)。¹H NMR(500MHz，CDCl₃)：δ0.59(t，J＝6.0Hz，2H)，0.96(t，J＝6.0Hz，2H)，1.34(s，3H)，1.88-1.94(m，2H)，2.06-2.10(m，2H)，3.61-3.70(m，2H)，3.93-4.00(m，2H)，5.48-5.50(m，1H)，7.52(s，1H)，7.58(t，J＝7.0Hz，1H)，7.73(t，J＝7.0Hz，1H)，7.81(d，J＝7.0Hz，1H)，8.27(d，J＝8.5Hz，1H)。

制备24

[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(2-氟-苯基)甲酮

向4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(9.68g，25.9mmol，0℃)在DCM(100mL)中的冷溶液中加入TFA(80mL)。在22℃搅拌2小时，然后在减压下除去溶剂。将残余物溶解于DCM中，用1N氢氧化钠处理至pH～14。分离水相，用DCM萃取两次。合并有机相，用无水硫酸钠干燥。除去溶剂，得到(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶(7.06g，99％收率，ES+(m/z)274.3[M+H])。

将4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶(4.0g，14.6mmol)、2-氟苯甲酸(2.45g，17.5mmol)、DCC(3.6g，17.5mmol)和HOBt(2.37g，17.5mmol)在THF(100mL)中的反应混合物在22℃搅拌过夜。过滤，然后浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到黄色固体形式的(2-氟-苯基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-甲酮(6.82g，收率为92％，ES+(m/z)396.3[M+H])。

将(2-氟-苯基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-甲酮(5.85g，14.8mmol)和披钯碳(10％，2.9g)在甲醇(250mL)中的混悬液在氢气下搅拌过夜。过滤除去催化剂。浓缩滤液，得到淡黄色固体(4.7g，收率为87％，ES+(m/z)366.3[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			制备25	[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(1-甲基-环丙基)甲酮	326.3

制备26

4-硝基-1-哌嗪-1-基-异喹啉

将1-氯-4-硝基-异喹啉(2.5g，12mmol)在乙腈(100mL)中的浆液用固体哌嗪(5.2g，60mmol)处理。将所得黄色混合物在60℃加热过夜。冷却至环境温度后，使该反应混合物在乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠水溶液之间分配。加入MeOH、二氯甲烷和乙酸乙酯，过滤整个混合物，得到亮黄色固体。(2.15g，69％；LCMS ES+(m/z)259[M+H])。

制备27

环丙基-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-甲酮

将4-硝基-1-哌嗪-1-基-异喹啉(制备26，517mg，2mmol)、环丙烷甲酸(258mg，3mmol)和催化剂DMAP(24mg，0.2mmol)在二氯甲烷(20mL)中的溶液或浆液用EDCI(575mg，3mmol)处理。将所得混合物在环境温度搅拌过夜，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤。用硫酸钠干燥有机层，减压浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用0-2％2M氨-甲醇的二氯甲烷溶液梯度和0-70％乙酸乙酯的己烷溶液梯度洗脱，在两次纯化后，得到黄色固体。(513mg，收率为79％，LCMS ES+(m/z)327[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z
			制备28	(1-甲基-环丙基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-甲酮收率为76％	341[M+H]
制备29	(2，6-二氟-苯基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-甲酮收率为50％	399.1[M+H]
			制备30	2，2-二甲基-1-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-丙-1-酮收率为66％	343.2[M+H]

制备3

1[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-环丙基-甲酮

将环丙基-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-甲酮(制备27；513mg，1.57mmol)和5％披钯碳(91mg)在乙酸乙酯(50mL)中的浆液在Parr振动器中、在环境温度用60psi的氢气气氛处理。8小时后，过滤该反应混合物，减压浓缩，得到褐色泡沫。(定量的收率；LCMS ES+(m/z)297[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z
			制备32	1-[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙-1-酮(rxn时间24小时)	313[M+H]
制备33	[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-(2，6-二氟-苯基)-甲酮(rxn时间24小时)	369[M+H]
			制备34	[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-(1-甲基-环丙基)-甲酮	311[M+H]

制备35

[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-(2-氟-苯基)-甲酮

向哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(10g，53.7mmol)在二氯甲烷(300mL)中的溶液中加入三乙胺(15.1mL，107.4mmol)和2-氟苯甲酰氯(6.4mL，53.7mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。然后，加入水(200mL)，分离有机层，用硫酸钠干燥，过滤，在减压下蒸发溶剂，得到17.3g 4-(2-氟-苯甲酰基)-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯。ES+(m/z)309[M+H]。

向4-(2-氟-苯甲酰基)-哌嗪-1-甲酸叔-丁酯(16.3g，53mmol)在二氯甲烷(100mL)中的溶液中加入4 M HCl在1，4-二噁烷(40mL，159mmol)中的溶液，将该反应混合物在室温搅拌过夜。将Et₂O加入到所得白色混悬液中，在减压下蒸发溶剂，得到12.6g(2-氟-苯基)-哌嗪-1-基-甲酮盐酸盐。ES+(m/z)209[M+H])。

将(2-氟-苯基)-哌嗪-1-基-甲酮(3.16g，12.9mmol)和K₂CO₃(8.9g，64.5mmol)加入到乙腈(100mL)中的1-氯-4-硝基异喹啉(2.85g，13.7mmol)中，搅拌24小时。过滤不溶固体，用AcOEt洗涤滤饼。在减压下蒸发溶剂，得到残余物。对残余物进行硅胶色谱，用己烷∶AcOEt 20-90％洗脱，得到3.72g固体形式的(2-氟-苯基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-甲酮。LCMS ES+(m/z)381.2[M+H]。

将Na₂S₂O₄(6.87g，39.4mmol)、然后将NH₄OH 32％(15mL)加入到170mL 1∶1 THF∶H₂O混合物中的(2-氟-苯基)-[4-(4-硝基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-甲酮(3g，7.89mmol)中，搅拌90分钟。用水稀释，用AcOEt萃取数次。合并有机物，用饱和氯化钠水溶液洗涤，用Na₂SO₄干燥，减压蒸发，得到1.8g固体形式的标题化合物。LCMS ES+(m/z)351.2[M+H]。

制备36

1-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-[1-(哌啶-4-基氧基)-异 喹啉-4-基]-脲二盐酸盐

将[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备18，3.20g，7.94mmol和2.0当量)和4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(制备22，1.37g，3.97mmol，1.0当量)溶解于7mL无水DMSO中，加入二异丙基乙基胺(DIPEA，1.36mL，7.94mmol，2.0当量)在80℃、搅拌下在密封管中加热20小时。将该溶液倾至1∶1 v/v的二氯甲烷和冰水混合物中。用二氯甲烷(2×50mL)萃取水相，用水(2×50mL)和氯化钠水溶液(100mL)洗涤合并的有机层。将有机溶液用硫酸钠干燥，减压蒸发。对残余物进行硅胶色谱，用15％至80％EtOAc的己烷溶液梯度洗脱，得到1.40g纯泡沫膏状固体形式的4-(4-{3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲基}-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯。收率为59％。ES+(m/z)597.4[M+H]。

在室温，将4M HCl的二噁烷溶液(2.4mL，9.36mmol)加入到二氯甲烷(20mL)中的4-(4-{3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲基}-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(1.4g，2.34mmol)中，搅拌过夜。在减压下蒸发溶剂，得到白色固体形式的标题化合物(1.3g)(定量)。ES+(m/z)：497.4(M+H)。

制备37

1-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-[1-(哌啶-4- 基氧基)-异喹啉-4-基]-脲盐酸盐

将[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备27，2.7mmol，1.2g)和DIPEA(2.9mmol，0.5mL)加入到4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(制备22，2.9mmol，1.0g)在4mL DMSO中的溶液中，在85℃搅拌过夜。冷却，加入水，用二氯甲烷萃取。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤。用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。对残余物进行硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯梯度(从15至70％)洗脱，得到4-(4-{3-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲基}-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯。LCMS ES+(m/z)635[M+H]。

在室温搅拌4-(4-{3-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲基}-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(1.1mmol，0.6g)并溶解于5mL二氯甲烷和4.0M氯化氢的二噁烷溶液(5.3mmol，1.3mL)中过夜。减压浓缩。用乙醚研磨形成的白色固体。LCMS ES+(m/z)535[M+H]。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			制备38	1-[5-(1，1-二-氟甲基-丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-[1-(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲盐酸盐	549
制备39	1-[5-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-[1-(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲盐酸盐	517

制备40

1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3基)-3-[1(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4- 基]-脲

将氮气鼓入1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备17，589mg，1.456mmol)和4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(制备22，500mg，1.456mmol)在DMSO(5mL)中的溶液达5分钟。然后加入N，N-二异丙基乙基胺(507μL，2.912mmol)。在60℃搅拌6小时，然后使其冷却至室温过夜。使该反应混合物在200mL CH₂Cl₂和100mL蒸馏水之间分配。用水(1×100mL)洗涤，然后合并水层，用CH₂Cl₂(3×50mL)萃取。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液(2×100mL)洗涤。将合并的有机相用硫酸钠干燥，浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到棕色固体形式的4-{4-[3-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-脲基]-异喹啉-1-基氧基}-哌啶-1-甲酸叔-丁酯。LCMS ES+(m/z)599.5[M+H]。

向4-{4-[3-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-脲基]-异喹啉-1-基氧基}-哌啶-1-甲酸叔-丁酯(820mg，1.37mmol)在二氯甲烷(50mL)中的冷溶液中加入三氟乙酸(15mL)。将该反应混合物在22℃搅拌1.5小时。除去溶剂后，将残余物用NaCl(50mL)饱和的1N氢氧化钠处理，用二氯甲烷萃取5次(每次50mL)。将合并的有机相用硫酸钠干燥。过滤混合物，对残余物进行硅胶色谱，用二氯甲烷和甲醇洗脱，得到白色固体(515mg，收率为75％，LCMS ES+(m/z)499.5[M+H])。

以基本上类似于上述的操作制备以下化合物。

表3

制备	化合物	数据MS(ES+)：m/z
			制备41	1-(5-五氟乙基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲	561.3[M+H]
制备42	1-[1-(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-3-2-对-甲苯基-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-脲	551.4[M+H]

实施例1

1-[1-(4-环丙烷羰基-哌嗪-1-基)-异喹啉-4-基]-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲 苯基-2H-吡唑-3-基]-脲

将[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-环丙基-甲酮(制备29，214mg，0.722mmol)、[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备18，290mg，0.722mmol)和二异丙基乙基胺(0.264mL)在4mL DMSO中的溶液在60℃加热5小时。将所得混合物冷却至环境温度，加入水。滤出沉淀，用水然后用戊烷清洗，在60℃真空烘箱中干燥。对残余物进行硅胶色谱，用2M氨-甲醇的二氯甲烷溶液(0至2％)梯度洗脱，得到206mg产物(LCMS表明其纯度为93％)。

将其溶解于少量二氯甲烷和MeOH中，用1当量2M甲磺酸的二氯甲烷溶液处理，在氮气流下浓缩。将所得固体用几mL DMSO/MeOH/水研磨，过滤，得到145mg游离碱(LCMS ES+(m/z)550[M+H])。

使用10mM碳酸氢铵水溶液/乙腈梯度、通过Xterra 30×75mm 5μmMS C18反相柱进一步纯化后，以与上述操作基本类似的方式制备以下化合物。

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例2	1-{1-[4-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌嗪-1-基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲	564

实施例3

1-{1-[4-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙 基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲

将[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-(2，6-二氟-苯基)-甲酮(制备32，约0.88mmol)、[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备18，362mg，0.9mmol)和二异丙基乙基胺(0.314mL)在5mL DMSO中的溶液在60℃搅拌过夜。将所得混合物冷却至环境温度，使用饱和氯化钠水溶液帮助相分离，使其在水和乙酸乙酯之间分配。用乙酸乙酯萃取水层，将合并的有机层用硫酸钠干燥。减压浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用2M氨-甲醇的二氯甲烷溶液(0至2％)梯度洗脱。将其溶解于少量二氯甲烷和MeOH中，用1当量2M甲磺酸的二氯甲烷溶液处理，在氮气流下浓缩。使用10mM碳酸氢铵水溶液/乙腈梯度、通过Xterra30×75mm 5μm MS C18反相柱进一步纯化后，得到73mg游离碱。LCMSES+(m/z)622[M+H])。

基本上类似于以上操作制备以下化合物的游离碱。然后将0.13g溶解于1mL DCM中，加入甲磺酸1N在DCM中的溶液(1当量)。在减压下蒸发溶剂，得到0.15g下述化合物。

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例4	1-{1-[4-(2-氟-苯甲酰基)-哌嗪-1-基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	604

实施例5

1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶 -4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲

将氮气鼓入1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备17，203mg，0.5mmol)和[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(1-甲基-环丙基)甲酮(163mg，0.5mmol)在DMSO(2mL)中的溶液中达5分钟。然后加入N，N-二异丙基乙基胺(200μL，1.1mmol)。在60℃搅拌过夜后，使该反应混合物在二氯甲烷(15mL)和饱和碳酸氢钠(50mL)之间分配。分离水相，用二氯甲烷萃取两次(每次15mL)。将合并有机相用硫酸钠干燥并浓缩。将残余物用硅胶色谱纯化，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到白色固体(226mg，收率为78％，ES+(m/z)581.3[M+H])。

以基本上类似于上述操作的方式制备以下化合物的游离碱。然后将其溶解于1mL DCM中，加入甲磺酸1N在DCM中的溶液(1当量)。在减压下蒸发溶剂，得到下述化合物。

实施例	化合物	MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例6	1-{1-[4-(2，2-二甲基-丙酰基)-哌嗪-1-基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	566
实施例7	1-[5-叔-丁基-2-(6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	582.3
			实施例8	1-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲氧基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	635.0
实施例9	1-[5-(1-甲氧基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	595.3
			实施例10	1-[2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(3-甲基-噻吩-2-羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	634.0

实施例11

1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{1-[4-(2，2-二甲基-丙酰基)-哌嗪 -1-基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐

搅拌溶解于18mL乙腈中的1-[4-(4-氨基-异喹啉-1-基)-哌嗪-1-基]-2，2-二甲基-丙-1-酮(制备3，0.9mmol，0.3g)。加入碳酸钾(0.99mmol，0.1g)和1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯( 制备17，0.9mmol，0.4g)，在室温搅拌过夜。然后，加入1mL DMF，在60℃搅拌24小时。冷却，加入水，用二氯甲烷萃取。合并有机层，用饱和氯化钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，过滤，减压浓缩，得到残余物。对残余物进行硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯(5％至20％)梯度洗脱。向所得油状物添加二氯甲烷，过滤所形成的沉淀，获得1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{1-[4-(2，2-二甲基-丙酰基)-哌嗪-1-基]-异喹啉-4-基}-脲。ES+(m/z)568[M+H])。

在室温搅拌1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{1-[4-(2，2-二甲基-丙酰基)-哌嗪-1-基]-异喹啉-4-基}-脲。加入1N甲磺酸的二氯甲烷溶液，形成标题化合物。LCMS ES+(m/z)568[M+H]。

实施例12

1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环 丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐

将EDCI(0.147g，0.77mmol)、HOBt(0.10g，0.77mmol)、1-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-[1-(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲二盐酸盐(制备3，0.16g，0.64mmol)和1-甲基-1-环丙基甲酸(1.1当量)置于N₂下的烧瓶中。加入二氯甲烷(5mL)，然后加入DIPEA(0.22mL，1.28mmol)，在室温搅拌过夜。蒸发溶剂，得到残余物。对残余物进行硅胶色谱，用己烷∶AcOEt 50-100％梯度洗脱，得到游离碱形式的1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲。ES+(m/z)579.3(M+H)。

将0.3g 1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲溶解于二氯甲烷1mL中，加入321μL甲磺酸1N在二氯甲烷中的溶液。在减压下蒸发溶剂，得到0.357g白色固体形式的标题化合物(定量)。ES+(m/z)579.3(M+H)。

以基本上类似于上述制备的方式制备以下化合物。

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例13	1-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	619.3
实施例14	1-[1-(1-环丙烷羰基-哌啶-4-基氧基-异喹啉-4-基]-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	565.3
			实施例15	1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	637.3
实施例16	1-{1-[1-(2-甲基-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	615.4
			实施例17	1-{1-[1-(2-氯-6-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	653.3
实施例18	1-{1-[1-(2-甲氧基-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	631.3
			实施例19	1-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-三氟甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	634.3

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例20	1-{1-[1-(3-氟-2-氟甲基-2-甲基-丙酰基)-哌啶-4-基氧基[-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	618.4
实施例21	1-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	617
			实施例22	1-[5-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	599

实施例23

4-{4-[3-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-脲基]-异喹啉-1-基氧基}-哌 嗪-1-甲酰胺

将氮气鼓入1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[1(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲(制备39，100mg，0.2mmol)和氨基甲酸苯基酯(32.9mg，0.24mmol)在DMSO(1mL)中的溶液中达5分钟。然后加入N，N-二异丙基乙基胺(200μL，1.1mmol)。在85℃搅拌过夜后，使该反应混合物在乙酸乙酯(15mL)和饱和碳酸氢钠(50mL)之间分配。分离水相，用乙酸乙酯萃取两次(每次15mL)。将合并的有机相用硫酸钠干燥并浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用己烷和乙酸乙酯洗脱，得到白色固体(40mg，收率为37％，ES+(m/z)542.3[M+H])。

实施例24

1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4- 基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐

将1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3yl)-3-[1(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲(制备39，110mg，0.221mmol)、2-氟苯甲酸(37.1mg，0.265mmol)、HOBt(35.8mg，0.265mmol)和DCC(54.6mg，0.265mmol)在THF(3mL)中的反应混合物在22℃搅拌18小时。将该混合物过滤，将滤液倾至含有CH₂Cl₂(100mL)的分液漏斗中。用1N NaOH洗涤(2×20mL)，合并水层，用CH₂Cl₂(2×50mL)萃取，然后将合并的有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤(1×50mL)。将合并的有机相用硫酸钠干燥，过滤该混合物，对残余物进行硅胶色谱，用二氯甲烷和甲醇洗脱，得到白色固体(109.8mg，收率为80％，ES+(m/z)621.5[M+H])。

将0.107g 1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{3-氯-1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基)}-脲溶解于二氯甲烷(2mL)和甲醇(2mL)中，加入甲磺酸(16.56mg，0.1723mmol)。在减压下蒸发溶剂，得到白色固体形式的标题化合物(119.7mg，97％，ES+(m/z)621.5[M+H-MsOH]。

以基本上类似于上述操作的方式制备以下化合物。

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例25	1-[5-叔-丁基-2-(6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(3-甲基-噻吩-2-羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	624.0

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例26	1-[5-叔-丁基-2-(6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(2-氯-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	638.0
实施例27	1-[5-叔-丁基-2-(6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	622.3
			实施例28	1-[5-叔-丁基-2-(6-甲基-吡啶-3-基)-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	640.3
实施例29	1-[2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(3-甲基-噻吩-2-羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	676.0
			实施例30	1-{1-[1-(2-氯-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	690.0
实施例31	1-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	674.0
			实施例32	1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[2-(6-甲基-吡啶-3-基)-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	692.0

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H](检测的游离碱MW)
			实施例33	1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-{1-[1-(3-甲基-噻吩-2-羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	623.5
实施例34	1-(5-叔-丁基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-3-[1-(1-环丙烷羰基-哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲甲磺酸盐	567.5
			实施例35	1-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-(5-五氟乙基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-脲甲磺酸盐	683.0
实施例36	1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-(5-五氟乙基-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基)-脲甲磺酸盐	643.0
			实施例37	1-{1-[1-(2-氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[2-对-甲苯基-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	673.0
实施例38	1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[2-对-甲苯基-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]脲甲磺酸盐	691.0
			实施例39	1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[2-对-甲苯基-5-(1-三氟甲基-环丙基)-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	633.3

实施例40

1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(2-氟-1-氟 甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲

将1-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-[1-(哌啶-4-基氧基)-异喹啉-4-基]-脲盐酸盐(制备37，0.6mmol，0.3g)、2，6-二氟苯甲酰氯(0.6mmol，0.07mL)和三乙胺(1.7mmol，0.2mL)在5mL二氯甲烷中、在室温搅拌过夜。加入一些水，用二氯甲烷萃取。将有机层用饱和氯化钠水溶液洗涤。用无水硫酸钠干燥，减压浓缩。对残余物进行硅胶色谱，用己烷/乙酸乙酯作为洗脱剂(30％-70％)洗脱。LCMS ES+(m/z)675[M+H]。

以基本上类似于上述操作的方式制备以下化合物。

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例41	1-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲	617
实施例42	1-[5-(1，1-二-氟甲基-丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲	689
			实施例43	1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲	657
实施例44	1-[5-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲	599

实施例45

1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(2-氟-1-氟 甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐

将0.13g(0.19mmol)1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲溶解于二氯甲烷(2mL)中，加入0.19mL甲磺酸1N在二氯甲烷中的溶液。

在减压下蒸发溶剂，得到0.09g白色固体形式的标题化合物。ES+(m/z)675(M+H)。

以基本上类似于上述操作的方式制备以下化合物。

实施例	化合物	数据MS(ES+)：m/z[M+H]
			实施例46	1-[5-(1，1-二-氟甲基-丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐	689
实施例47	1-{1-[1-(2，6-二氟-苯甲酰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(2-氟-1，1-二甲基-乙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐	657

实施例48

1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环 丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲甲磺酸盐

将[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(1-甲基-环丙基)-甲酮(制备 23，331.00g，1.02摩尔)、THF(3.97L，48.79摩尔)、[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-氨基甲酸2，2，2-三氯-乙基酯(制备18，410.00g，1.02摩尔)和DIPE(159.00g，1.22摩尔)加入到配有高架搅拌器、热电偶和回流冷凝器的12L Morton烧瓶中。将该混合物回流22小时。冷却反应物至＜50℃，用碳(Darco G-60；33.00g，2.75摩尔)处理。将该浆液在43-50℃搅拌30分钟，然后用微纤维滤纸和Hyflo Super

(27.00g)过滤。将滤液接种，在沉淀期间使其在环境温度冷却。将所得浆液置于冰中并搅拌过夜。将固体滤出，用THF(300.00mL，3.69摩尔)洗涤，在40℃减压下干燥。对残余物进行硅胶色谱，用1∶3丙酮/DCM、然后用30％丙酮的DCM溶液洗脱，获得401g(68％)白色固体形式的1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲。¹H NMR(300MHz，DMSO-d₆)：δ0.56(t，J＝6.0Hz，2H)，0.73(t，J＝6.0Hz，2H)，0.84(t，J＝6.0Hz，2H)，0.92(t，J＝6.0Hz，2H)，1.27(s，3H)，1.41(s，3H)，1.73-1.81(m，2H)，1.99-2.08(m，2H)，2.41(s，3H)，3.52-3.65(m，2H)，3.83-3.96(m，2H)，5.47-5.58(m，1H)，6.22(s，1H)，7.37(d，J＝8.1Hz，2H)，7.44(d，J＝8.1Hz，2H)，7.65-7.71(m，1H)，7.78-7.83(m，2H)，8.12(s，1H)，8.27(d，J＝8.4Hz，1H)，8.58(s，1H)，8.69(s，1H)。

将该游离碱(400.00g，6.91摩尔)和二氯甲烷(3.00L，46.80摩尔)加入到配有高架搅拌器的5L烧瓶中。在室温滴加甲磺酸(72.00g，7.49摩尔)。将该反应物搅拌1小时。过滤，在减压下除去溶剂。加入乙醚(4L)，搅拌过夜。过滤，减压干燥，获得标题化合物，467.8g。¹H NMR(DMSO-d₆)：δ0.52(t，J＝2.5Hz，2H)，0.70(t，J＝2.5Hz，2H)，0.80(t，J＝2.5Hz，2H)，0.90(t，J＝2.5Hz，2H)，1.24(s，3H)，1.38(s，3H)，1.76(br，2H)，2.02(br，2H)，2.38(s，3H)，2.40(s，3H)，3.55(br，2H)，3.85(br，2H)，5.49(m，1H)，6.20(s，1H)，7.34(d，J＝8.5Hz，2H)，7.42(d，J＝8.5Hz，2H)，7.64(dd，J＝8.5Hz，1H)，7.77(s，1H)，7.79(s，1H)，8.08(s，1H)，8.24(d，J＝8.5Hz，1H)，8.62(s，1H)，8.72(s，1H)。

实施例49

1-[5-(1-氟甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷 羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲甲磺酸盐

将溶解于1mL DCM的5-(1-氟甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基胺(160.00mg；652.26μmoles)缓慢加入到1，1′-羰基二咪唑(158.65mg，978.39μmoles)在DCM中的溶液中。将该混合物在40℃搅拌7小时。然后，加入[4-(4-氨基-异喹啉-1-基氧基)-哌啶-1-基]-(1-甲基-环丙基)-甲酮(制备 23，212.25mg，652.26μmoles，1.00当量)在1mL DCM中的溶液。将该混合物搅拌过夜。在N₂气下蒸发溶剂。首先用HLB柱(6g)、用NH₄CO₃/MeOH(100∶0至0∶100)洗脱纯化，然后通过HPLC(Kromasil C18柱(100×21.2mm，5μm(Hi-Chrom)纯化。流动相是水(溶剂A)和乙腈(溶剂B)，二者都包含0.05％三氟乙酸(TFA)。梯度方式：2分钟40％B，在6分钟内40至60％的B。最后，2分钟95％B。流速：25mL/min)，得到固体形式的1-[5-(1-氟甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲(19mg，收率为5％)。ES+(m/z)：597[M+1]。

将甲磺酸1M(30.17μmoles；30.17μL)加入到1-[5-(1-氟甲基-环丙基)-2-对-甲苯基-2H-吡唑-3-基]-3-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-脲(18.00mg，30.17μmoles)在0.5mL二氯甲烷中的溶液中。将该混合物在室温搅拌1小时。在氮气下蒸发溶剂，得到固体形式的标题化合物(20mg，96％收率)。ES+(m/z)：597.4.[M+1]。

p38激酶的抑制

标准溶液制备

激酶缓冲溶液是通过将2.5mL 1M Tris-HCl(pH 7.5)、0.1mL 1M二硫苏糖醇、1.0mL 1M氯化镁和300μL 1％Triton X-100合并并用水稀释至100mL而制备。将84mL该激酶缓冲溶液与16mL DMSO合并，制得16％DMSO溶液。

200μM ATP溶液是通过在5mL激酶缓冲溶液中加入102.6μL 10mMATP水溶液、25μL ³³P-ATP和163.5μL 4mM表皮生长因子肽661-681水溶液(Biomol，Catalog#P-121)而制备。

p38激酶溶液是通过将9.5μL浓缩酶溶液(250ng p38酶/μL激酶缓冲溶液)溶解于1536μL激酶缓冲溶液中而制备。

样品制备

80μM各试验化合物和对照化合物的溶液是通过在Costar 96-孔微量滴定板中将2μL 10mM各化合物在二甲基亚砜中的储备液溶解于248μL16％DMSO溶液中而制备。将该板置于Tecan Genesis自动液体处理器中进行1∶3系列稀释。

试验

用Beckman Multimek 96-孔自动液体处理器将10μL系列稀释的化合物置于试验板中。用Titertek Multidrop 8-通道液体处理器加入20μL 200μM ATP溶液。用Multimek将10μL p38激酶溶液转移到该试验板中。使该混合物在30℃反应40分钟，然后通过用Multidrop加入60μL新制备的5％冰AcOH来终止反应。用Multimek将80μL该溶液转移到“MAPH”板中。使该板在室温搁置30分钟，然后在Titertek MAP提取器上用新制备的5％冰AcOH(1×300μL，2×200μL)洗涤/抽吸。对板进行印记并用Multidrop加入100μL MicroScint-20闪烁液(Packard Bioscience)。将该板放置30分钟，在PE/Wallac Microbeta Trilux闪烁计数器上对其³³P-同位素进行计数。

最初以10种浓度(20μM-1nM，采用1∶3系列稀释)测定实施例12所例举的化合物。对IC₅₀值低于25nM的化合物以2μM至0.1nM(1∶3系列稀释)的起始浓度重新测定。用非线性回归计算各化合物的IC₅₀值(IDBSActivityBase软件)。基本如上所述对实施例12进行测定，发现其抑制p38激酶的IC₅₀为34nM。

p-MAPKAPK2的体外抑制

用加有10％胎牛血清(FBS)的RPMI-1640培养基将RAW 264.7细胞(鼠科单核细胞/巨噬细胞系ATCC)以50,000个细胞/孔的密度接种到96-孔板中，使其在孔底沉积和粘附48小时。在达到融合后，用不同化合物的10种系列稀释物将细胞处理2小时。总是包括对照化合物。2小时后，加入茴香霉素(100ug/ml)，将细胞在37℃、5％CO₂气氛下孵育30分钟。然后，将细胞固定并用过氧化氢处理以除去内源性过氧化物酶。最后，将这些板用FBS阻断，洗涤，使用抗磷酸-MAPKAPK2(Thr 334，Cell Signalling，Cat#3041)抗体和ahP-缀合的次级抗体进行ELISA试验。使用FEMTO(Pierce)检测反应，其中FEMTO是增强的化学发光底物ahP，该物质导致快速动态的光输出和高信号密度。基本如上所述测定了实施例12所例举的化合物，发现其以7nM的IC₅₀抑制pMAPKAPK2酶产生。

基本如上所述试验所例举的化合物，发现其具有低于或等于200nM的IC₅₀值。基本如上所述试验了以下化合物，发现其具有以下活性：

实施例	IC50(nM)
		1	44
3	25
		9	101
23	125

TNFα的体外抑制

小鼠腹膜巨噬细胞

将1mL巯基乙酸培养基(5.0g酵母提取物、15.0g酪胨或胰蛋白酶解酪蛋白、5.0g葡萄糖、2.5g氯化钠、0.75g L-胱氨酸、0.5g巯基乙酸钠、1.0mg刃天青和0.75g琼脂在1.0L蒸馏水中)注射到Balb/C雌性小鼠的腹膜腔中。在注射后第4或5天，将小鼠处死，然后用4mL RPMI-1640培养基(BioWhittaker)腹膜内注射，用注射器抽取腹腔巨噬细胞。

细胞因子产生

用血细胞计数器对小鼠腹腔巨噬细胞进行计数，并在96-孔板中用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基将其调节至5×10⁵个细胞/孔。将200μL/孔接种于96-孔板中，使细胞沉积和粘附到孔底达至少3小时。用8种浓度的系列将试验化合物或标准p38激酶抑制剂在37℃预处理1小时(20μL/孔)。将细胞用50ng/mL脂多糖(LPS)和10U/mL干扰素-γ的混合物在37℃处理18小时(20μL/孔)。收获该条件培养基，用Luminex检测方法分析TNFα的产生。

TNFα/Luminex检测试验(Bio-Rad Bio-Plex Kit-Catalog#171-G12221)

将冻干、预混的TNFα标准品(1标准管/两个96-孔板)用50μL无菌水复原(500,000pg/mL)。将样品涡旋5秒，在冰上孵育30分钟，在使用前涡旋5秒。用#1-#12对一套12个1.5mL管标记，然后向适合的管中加入下示一定量的细胞培养基(标准浓度如下：50,000；25,000；12,500；6,250；3,125；1,562.5；781.3；390.6；195.3；97.7；48.8和24.4pg/mL)。将预混的抗-细胞因子缀合的珠粒剧烈涡旋(25X)30秒。用1X Bio-Plex试验缓冲液将该抗-细胞因子缀合的珠粒稀释至1X浓度。对于各板而言，向5760μLBio-Plex试验缓冲液中加入240μL所述预混的珠粒。将微孔96-孔滤板用100μL/孔的阻断缓冲液阻断。使用微孔过滤系统过滤阻断缓冲液，然后将其吸干。在滤板上用100μl/孔的Bio-Plex试验缓冲液洗涤2次并吸干。将该1X抗-细胞因子缀合的珠粒涡旋15秒并向各孔加入50μL。将其过滤，吸干。用100μl/孔的Bio-Plex洗涤缓冲液在板上洗涤2次。再将其过滤，吸干。向各样品孔中加入50μL样品或标准品。将其在室温、在避光振动器上于标度6孵育60秒，然后在标度3孵育30分钟，然后置于冰箱过夜。用Bio-Plex洗涤缓冲液洗涤3次。过滤，吸干。对于每一板都制备细胞因子检测抗体(使用前～10分钟)，将60μL预混的细胞因子检测抗体储备液加入到5940μL Bio-Plex检测抗体稀释液中。

加入50μL细胞因子检测抗体，在室温、在避光振动器上于标度6孵育60秒，然后在标度3孵育30分钟。用Bio-Plex洗涤缓冲液洗涤3次。将其过滤，吸干。对于每一板都制备Strept-PE(使用前～10分钟)，加入60μL至5940μL Bio-Plex试验缓冲液中。向各孔中加入50μL链霉抗生物素蛋白-PE并将其在室温、在避光振动器上于标度6孵育60秒，然后在标度3孵育10分钟。用Bio-Plex洗涤缓冲液洗涤3次。将其过滤。将珠粒重新混悬于100μL/孔的Bio-Plex试验缓冲液中。在Luminex机上对标准品和样品读数。然后，使用四参数对数回归法(Bio-Plex Manager 2.0，Bio-Rad)一式两份生成12点标准曲线，基于该标准曲线将这些强度读数转化成皮克/毫升单位，并计算IC₅₀。

基本如上所述测定实施例12所例举的化合物，其在体外抑制TNFα，IC₅₀低于9nM。

TNFα的体内抑制

将化合物经口给药(30、10、3和1mg/kg)于雌性Balb/c小鼠(6只小鼠/每剂)。在4个剂量的化合物给药后1小时(经口，0.1mL/小鼠；基质：含1％ NaCMC/0.25％吐温-80的水)；给小鼠以400μg/kg LPS IP-注射。在LPS激发后1.5小时，将小鼠用异氟烷麻醉，通过心脏穿刺取血。用得自R&D Systems的ELISA试剂盒测定血浆中的TNFa-水平并测定剂量响应ED50。

基本如上所述测定实施例12中所例举的化合物，其在体内抑制TNFα，TMED50为1.0mg/kg。阈值最小有效剂量(TMED)50是获得高于或等于50％抑制并且与对照/安慰剂有统计学差异的剂量。

口服暴露

用Fischer 344大鼠筛选化合物的口服暴露。将动物禁食过夜并给予试验化合物，所述试验化合物被制成含有吐温80(0.25％v/v)和止泡剂(0.1％w/v)的羧甲基纤维素钠(1％w/v)中的混悬液。给药混悬液被制备为1mg/mL并通过管饲法以1mL/kg给药。在给药后0.5小时至7小时之间取血样，离心制备血浆。用在线固相萃取法和LC/MS/MS分析血浆样品。

基本如上所述测定实施例12中所例举的化合物，其Cmax为9390ng/mL，AUC(0-7h)为36800ng.h/mL。

对关节内LPS诱导的TNFα的影响

将LPS关节内注射到大鼠踝部，诱导TNFα的合成，其可以在滑膜灌洗液中测量。在2小时内可探测到高水平的TNFα。因为关节是形成关节炎的部位，因此，这种模型可以迅速地确定口服给药的化合物是否对滑膜中的炎症响应有影响。

在每个治疗组中放置六只雌性Lewis大鼠(150-200g)。口服给予动物基质(1％羧甲基纤维素钠-0.25％吐温80)或试验化合物(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg)。一小时后，将10μl LPS(10μg)关节内给予各大鼠的右踝部，同时左踝接受10μL盐水。2小时后，用100μL盐水对各踝部灌洗。收集灌洗液，储存在-80℃。

#1组：基质(1％NaCMC-0.25％吐温80，1mL，PO)

#2组：试验化合物(1mg/kg，1mL，PO)

#3组：试验化合物(3mg/kg，1mL，PO)

#4组：试验化合物(10mg/kg，1mL，PO)

#5组：试验化合物(30mg/kg，1mL，PO)

用商购可得的ELISA试剂盒(R&D，RTA00)测量TNFα。用实施例12中所例举的化合物处理，产生TNFα合成的剂量响应抑制，入在滑膜灌洗液种所测量，其TMED50＝2.54mg/kg。

用流式细胞计进行茴香霉素-刺激的小鼠离体磷酸-MAPKAPK2抑制试验

8-10周龄的雌性Balb/c小鼠购自Taconic Inc.，口服给予0.2mL体积的浓度为30、10、3、1mg/kg的化合物。2小时后或在其它所示时间由心脏穿刺获得血样，将其收集到含EDTA的试管中。将100μL血在37℃孵育10分钟。然后，将全血与FITC-缀合的大鼠抗-小鼠Ly-6G mAb(1∶250)和APC-缀合的大鼠抗-小鼠CD11b mAb(1∶100)混合，用10μg/ml茴香霉素刺激。细胞表面抗原染色和茴香霉素刺激均在37℃进行15分钟，然后用Lyse/Fix缓冲液(BD Biosciences，Cat#558049)在室温进行10分钟。将溶解的血样在室温以600×g离心8分钟，用4mL PBS再洗涤一次。将200μL用透化培养基B(Caltag，Cat#GAS002S-5)稀释的抗-磷酸-MAPKAPK-2(Thr334)抗体(1∶100稀释)(Cell Signaling，Cat#3041)和小鼠BD Fc Block(1∶100稀释)(BD Biosciences，553141)加入到血细胞中，在室温孵育30分钟。孵育后，加入3mL染剂/洗涤缓冲液，如上所述将细胞离心，再用3mL染剂/洗涤缓冲液洗涤。然后，用Beckman Coulter F500对细胞进行流式细胞计量试验。测量门控CD11b+Ly6G-细胞上磷酸-MapKap-K2染色的平均荧光。用JMP程序进行数据分析。用实施例12中所例举的化合物进行处理，产生了p-MAPKAPK2合成的剂量响应性抑制，TMED50＝2.20mg/kg。

大鼠胶原诱导的关节炎功效模型

将雌性Lewis大鼠(

190g，Charles River Labs)用使用等体积助剂(氢氧化铝)乳化的牛II型胶原(2mg/mL)免疫。将约0.3mg乳剂皮内注射到尾底部附近的背部对大鼠进行免疫。根据相同的方案，7天后对所有动物重新进行免疫。第一次免疫后第12-14天，大鼠开始形成关节炎(特征为一个或两个踝关节肿胀(swell-ling)和发红)。在第一次出现关节炎迹象时将大鼠等分成5个治疗组，开始对各大鼠每日两次给药治疗，治疗14天。

治疗组：

第1组基质(1％羧甲基纤维素钠+0.25％吐温80)1mL，PO，

一日两次x 14天

第2组试验化合物，5mg/kg，1mL，PO，一日两次x 14

第3组试验化合物，15mg/kg，1mL，PO，一日两次x 14

第4组试验化合物，30mg/kg，1mL，PO，一日两次x 14

第5组泼尼松龙10mg/kg，1mL，PO，每日(qd)x14

一周5天用卡钳测量踝关节直径并记录。将数据表示为由复合炎症得分产生的曲线下面积(AUC)并进行统计分析。

本发明化合物优选口服给药。但是，口服给药不是唯一途径或甚至不是唯一优选的途径。例如，对于健忘或难以口服药物的患者而言，经皮给药可能是十分可取的，并且为方便起见或者为了避免可能与口服给药有关的并发症，可能优选静脉内途径。在特定情况下，式I化合物还可以通过经皮、肌内、鼻内或直肠内途径给药。给药途径可以以任何方式变化，其受药物物理性质、患者和护理人员(caregiver)的便利性以及其它相关情况的限制(Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack出版公司(1990))。

药物组合物以药学领域众所周知的方式制备。载体或赋形剂可以是可作为活性成分的载体或基质的固体、半固体或液体物质。适合的载体或赋形剂在现有技术中是众所周知的。药物组合物可适于口服、吸入、胃肠外或局部应用并且可以以片剂、胶囊、气雾剂、吸入剂、栓剂、溶液、混悬液等形式给药于患者。

本发明的化合物可以口服给药，例如可以以惰性稀释剂或胶囊给药或者压缩成片剂给药。对于口服治疗给药的目的而言，可以将化合物与赋形剂混合并以片剂、糖锭剂、胶囊、酏剂、混悬液、糖浆、糯米纸囊剂、口香糖等形式使用。这些制剂应包含至少4％本发明的化合物化合物即活性成分，但是，也可以根据特定形式而变化，并且可以方便地为4％至约70％单元重量。组合物中存在的化合物的量为将获得适合剂量的量。可以用本领域技术人员众所周知的方法确定本发明优选的组合物和制剂。

片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂等还可以包含一种或多种以下助剂：粘合剂如聚维酮、羟丙基纤维素、微晶纤维素或明胶；赋形剂或稀释剂如：淀粉、乳糖、微晶纤维素或磷酸二钙；崩解剂如：交联羧甲基纤维素、交联聚维酮、羟乙酸淀粉钠、玉米淀粉等；润滑剂如：硬脂酸镁、硬脂酸、滑石粉或氢化植物油；助流剂如胶体二氧化硅；润湿剂如：月桂基硫酸钠和聚山梨醇酯80；和可以加入甜味剂如：蔗糖、阿司帕坦或糖精或矫味剂如：薄荷、水杨酸甲酯或橙子矫味剂。当该剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的物质外，其还可以包含液体载体如聚乙二醇或脂肪油。其它剂量单位形式可以包含改变剂量单位物理形式的其它各种物质，例如包衣。因此，可以用糖、羟丙基甲基纤维素、聚甲基丙烯酸酯或其它包衣剂对片剂或丸剂进行包衣。除本发明化合物外，糖浆还可以包含作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂以及矫味剂。在制备这些各种组合物中所用的物质应当是药学纯的且在所用量下无毒。一种优选的制剂是通过将10％N-甲基吡咯烷酮加入到所需剂量的式I化合物中、然后加入由20％羟基丙基-β-环糊精、5％甲基纤维素、0.5％止泡剂和HCl 0.01N，w/w％组成的溶液来制备。

式I化合物通常在宽剂量范围内有效。例如，每天的剂量通常位于约0.0001至约30mg/kg体重的范围内。在一些情况下，低于上述范围下限的剂量水平可能已经足够，而在另一些情况下，可能使用更大的剂量也不会造成任何有害的副作用，因此，上述剂量范围并不以任何方式限制本发明的范围。应当清楚的是，实际给药的化合物的量将由主治医师根据相关情况决定，包括被治疗的病症、所选择的给药途径、被给药的一种或多种实际化合物、个体患者的年龄、体重和响应以及患者症状的严重程度。

Claims (7)

1、式I化合物或其可药用的盐：

其中：

X选自

R¹是C₁-C₄烷基、任选被一个或两个选自C₁-C₄烷氧基、甲基和三氟甲基的取代基取代的C₃-C₄环烷基；或C₁-C₄卤代烷基；

R²是任选被C₁-C₄烷基取代的苯基或任选被C₁-C₄烷基取代的吡啶基；

R³是氨基、C₁-C₄烷基、C₁-C₄烷氧基、C₁-C₄卤代烷基、任选被选自甲基、三氟甲基或卤素的取代基取代的C₃-C₄环烷基；苯基或噻吩基，其各自任选被选自卤素、C₁-C₄烷基和C₁-C₄烷氧基的第一取代基取代，并且任选进一步被选自卤素的第二取代基取代。

2、权利要求1的化合物，其中X是

3、权利要求1或权利要求2的化合物，其中R²是4-甲苯基。

4、权利要求1至3中任一项的化合物，其中R¹是1-甲基-1-环丙基、2-氟-1，1-二甲基-乙基或2-氟-1-氟甲基-1-甲基-乙基。

5、权利要求1至4中任一项的化合物，其中R³是1-甲基-1-环丙基。

6、式I化合物1-{1-[1-(1-甲基-环丙烷羰基)-哌啶-4-基氧基]-异喹啉-4-基}-3-[5-(1-甲基-环丙基)-2-对甲苯基-2H-吡唑-3-基]-脲

或其可药用的盐。

7、包含权利要求1至6中任一项的化合物和可药用的赋形剂、载体或稀释剂的药物制剂。