EA011694B1 - Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы - Google Patents

Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы Download PDF

Info

Publication number
EA011694B1
EA011694B1 EA200801822A EA200801822A EA011694B1 EA 011694 B1 EA011694 B1 EA 011694B1 EA 200801822 A EA200801822 A EA 200801822A EA 200801822 A EA200801822 A EA 200801822A EA 011694 B1 EA011694 B1 EA 011694B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
hepsin
substrate
optical density
buffer
sample
Prior art date
Application number
EA200801822A
Other languages
English (en)
Other versions
EA200801822A1 (ru
Inventor
Евгений Сергеевич СЕВЕРИН
Сергей Евгеньевич СЕВЕРИН
Екатерина Михайловна КУЗНЕЦОВА
Мария Владимировна САВВАТЕЕВА
Евгений Сергеевич БУДОРАГИН
Original Assignee
Ано "Институт Молекулярной Диагностики"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ано "Институт Молекулярной Диагностики" filed Critical Ано "Институт Молекулярной Диагностики"
Priority to EA200801822A priority Critical patent/EA011694B1/ru
Publication of EA200801822A1 publication Critical patent/EA200801822A1/ru
Publication of EA011694B1 publication Critical patent/EA011694B1/ru
Priority to PCT/RU2009/000288 priority patent/WO2009154510A1/ru

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/59—Transmissivity

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности онкологии, и молекулярной биологии и может быть использовано для ранней диагностики патологий предстательной железы, включая рак предстательной железы, неинвазивным методом. Сущность изобретения: заключается в использовании в качестве вещества для проверки качества реакции в тест-системе рекомбинантного белка хепсин, продуцированного из штамма-продуцента pHPNTM№B-100978, с использованием при проверке и постановке реакции в качества реакционного буфера 0,1 М трис-имидазол, а в качестве субстрата - тетрапептида L-лизин PРL-аргинин, где P- L-аспарагин или L-лейцин или L-треонин, Р- L-лизин или L-глутамин, коньюгированного с хромогеном, и в суждении о наличии рака предстательной железы и его стадии по активности хепсина Ао в нмоль/л*ч , определяемой по среднему значению ΔЕо/мин скорости изменения в минуту оптической плотности обработанного образца мочи с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, при этом из результатов анализа, проведенного при помощи тест-системы, исключаются результаты, полученные в условиях, когда активность контрольного хепсина Ак, проверенная при помощи этой же тест-системы, отличалась от ее эталонных значений Аэ более чем на 10%.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для ранней диагностики патологий предстательной железы, включая рак предстательной железы.
На сегодняшний день рак предстательной железы (РПЖ) - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний у мужчин, по частоте встречаемости стоящее на 4-м месте после рака легких, желудка и толстой кишки. По данным 1ЛЯС Ргекк за 2004 год заболеваемость РПЖ в России составила 12,8 млн чел., смертность - 8,2 млн, при этом соотношение числа умерших от рака предстательной железы к числу заболевших составляет 64%. С возрастом частота заболеваемости РПЖ возрастает, а начиная с 45 лет растет в геометрической прогрессии. В результате к 70 годам заболевание, согласно гистологическим данным, встречается более чем у 60% мужчин, после 70 лет - у 83%.
Клиническая картина РПЖ не обладает ярко выраженной симптоматикой и часто протекает бессимптомно. Основные симптомы заболевания - эректильная дисфункция, изменение характера мочеиспускания - аналогичны таковым для доброкачественной опухоли предстательной железы, простатита, цистита и других заболеваний мочеполовой системы.
Из уровня техники известно несколько основных методов диагностики РПЖ, которые можно разделить на иназивные и неинвазивные и инвазивные. К первым относится биопсия предстательной железы, ко вторым - пальцевое ректальное исследование (ПРИ), трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ) и измерение уровня простатспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови.
При использовании методов первой группы возможны возникновения воспаления, метастазов, ускорения пролиферации опухолевых клеток, поэтому вторая группа предпочтительнее из-за менее травматичного характера. При этом анализ методами ТРУЗИ и ПРИ предъявляет высокие требования к уровню квалификации и опыта диагностов, при этом вероятность распознавания рака предстательной железы на ранней стадии близка к нулевой.
Наиболее близким к заявленному изобретению является способ диагностики рака предстательной железы на основе измерения ПСА иммуноферментным методом, как экологически более безопасный (по сравнению с радиоиммунными) и менее дорогостоящий (по сравнению с хемилюминисцентными). Для иммуноферментного анализа нужен комплект оборудования, так называемая ИФА-лаборатория, которая включает встряхивающее устройство - инкубатор, промывающее устройство и микропланшетный или кюветный фотометр.
ПСА представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 32000 Да, состоящий из одной полипептидной цепи. ПСА является сериновой протеазой, продуцируемой исключительно эпителием человеческой простаты. В норме ПСА секретируется в семенную жидкость в высоких концентрациях, где он является ферментативно активным, и напрямую вовлечен в разжижение семенного сгустка. В кровотоке ПСА присутствует в низких концентрациях. Увеличение концентрации ПСА в сыворотке крови свидетельствует о патологиях простаты, таких как доброкачественная гиперплазия и злокачественное перерождение ткани простаты. Определение ПСА широко используется для обнаружения и мониторинга пациентов с раком простаты.
Уровень общего ПСА у больных с простатитом крайне редко (всего в 4,5% случаев) превышает значение 4,0 нг/мл, причем эти значения не выходят за пределы «серой зоны» (4,0-19,9 нг/мл). При аденоме предстательной железы средний уровень общего ПСА составляет 4,1 нг/мл и частота «попадания» значений ПСА в «серую зону» увеличивается до 33%. У больных первичным раком предстательной железы среднее содержание общего ПСА в 100 раз превышает таковое у пациентов с аденомой и составляет 419,7 нг/мл, причем максимальные значения общего ПСА у отдельных больных могут превышать 7000,0 нг/мл. В целом, лишь у 12,8% пациентов с первичным раком предстательной железы уровень общего ПСА находится в пределах нормы, у 1/3 больных уровень ПСА располагается в «серой зоне», у большинства пациентов (53,3% случаев) значения ПСА превышают 30,0 нг/мл.
При дискриминационном уровне ПСА 4,0 нг/мл чувствительность (процент истинноположительных результатов, полученных с применением данного теста в группе онкологических больных) метода для диагностики рака предстательной железы, составляет 87,2%, специфичность (процент истинно-отрицательных результатов, полученных с применением данного теста в группе неонкологических пациентов) - 73,3%.
В то же время для дифференциальной диагностики при значениях маркера в «серой зоне» (4,0-19,9 нг/мл), недостаточно измерить содержание только общего ПСА, поскольку такое увеличение уровня белка может быть вызвано не только раком предстательной железы, но и воспалением, доброкачественной гиперплазией, ишемией или инфарктом предстательной железы. В этих случаях для дифференциальной диагностики дополнительно применяют клиническое, ультразвуковое, пункционное исследования.
При интерпретации результатов в обязательном порядке учитывают, что массаж, УЗИ и биопсия предстательной железы, а также цистоскопия могут вызывать существенное увеличение концентрации ПСА в крови. У некоторых пациентов пальцевое ректальное исследование сопровождается изменением процентного содержания свободного ПСА. Поэтому кровь из вены для определения ПСА берут перед этими манипуляциями или спустя одну неделю (после биопсии - через 6 недель). Кроме того, за 48 ч до
- 1 011694 сдачи крови с целью определения ПСА наступают ограничения по двигательной активности и иным аспектам физиологической жизнедеятельности пациента.
В качестве прототипа выбран способ диагностирования рака предстательной железы и используемая при этом тест-система, описанные в Инструкции по применению набора реагентов для имуноферментного определения общего простатспецифического антигена в сыворотке крови (ОнкоИФА-общий ПСА), рекомендованной Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического анализа Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол № 3 от 24 марта 2003 г.)
Набор реагентов «ОнкоИФА-общий ПСА» предназначен для количественного определения общего простатспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа.
Набор «ОнкоИФА-общий ПСА» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ (тетраметилбензидин) при использовании всех стрипов одновременно.
В наборе «ОнкоИФА-общий ПСА» использован «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ПСА. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ПСА-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация ПСА, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-ПСА-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации ПСА. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству ПСА в исследуемом образце.
Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству ПСА в исследуемом образце. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация ПСА в определяемых образцах.
Тест-система прототипа включает комплект из 12 восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок антителами к ПСА, калибровочные пробы на основе сыворотки крови, содержащие известные количества ПСА (указаны на этикетках флаконов), конъюгат антиПСА-пероксидаза, концентрированный буферный раствор (буфер Р) для промывки лунок, раствор тетраметилбензидина (раствор ТМБ), стоп-реагент (1н. раствор соляной кислоты), контрольная сыворотка с известным содержанием ПСА, спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм; одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей, восьмиканальная пипетка, прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание со скоростью 500-800 об/мин при температуре 37°С, мерные цилиндры, стаканы стеклянные, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, перчатки защитные медицинские.
Коэффициент вариации результатов определения ПСА в одном и том же образце с использованием набора «ОнкоИФА-общий ПСА» не превышает 8%.
Диапазон значений концентраций ПСА до 4 нг/мл был определен как нормальный, суждение о наличии незлокачественных урологических заболеваний выносится при концентрации ПСА от 4 до 10 нг/мл, при значениях ПСА выше 10 нг/мл выносится суждение о наличии злокачественных опухолей простаты. При использовании тест-системы рекомендуется уточнить значения концентраций ПСА, соответствующие нормальным.
Все реагенты перед проведением анализа перемешиваются и доводятся до комнатной температуры, лунки маркируются в соответствии с их назначением для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ, для калибровочных проб и для контрольной сыворотки. Во все лунки, кроме предназначенных для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ, вносится раствор конъюгата анти-ПСА-пероксидаза. В соответствующие лунки вносятся калибровочные пробы и контрольная сыворотка, в оставшиеся - исследуемая сыворотка крови. Стрипы инкубируются при встряхивании в термостатируемом шейкере при температуре 37°С со скоростью 500-800 об/мин. После декантирования содержимого лунок и их промывки во все лунки вносится раствор тетраметилбензидина. Затем стрипы инкубируются в темноте в течение времени, длительность которого зависит от степени развития окраски. После чего в лунки добавляется стоп-реагент для остановки ферментной реакции. На фотометре вертикального сканирования измеряется оптическая плотность в лунках при 450 нм. Из значений оптических плотностей остальных лунок вычитаются значения, полученные для лунок, предназначенных для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ, строится для калибровочных проб график зависимости оптической плотности от концентрации ПСА в калибровочных пробах и на его основе выносят суждение о наличии незлокачественных урологических заболеваний, опухолей простаты.
Недостатком метода диагностирования РПЖ на основе измерения уровня ПСА является его недостаточная эффективность, поскольку ПСА является прогностическим, но не предсказательным маркером
- 2 011694 из-за недостаточной его специфичности для диагностики РПЖ, особенно при диагностике на ранних стадиях заболевания. Так, например, в интервале ниже 10 нг/мл он может быть ложноотрицательным у 20% и ложноположительным у 70% больных. Повышение уровня ПСА помимо РПЖ может быть обусловлено доброкачественной гиперплазией, наличием воспаления, инфекции и ишемии в предстательной железе. Тест-система также имеет свои недостатки: необходимость использования одновременно конъюгата анти-ПСА-пероксидаза, раствора тетраметилбензидина и стоп-реагента. Анализ занимает длительное время - порядка 4,5 ч, к тому же прогноз развития обнаруженной патологии может быть дан только при проведении повторных анализов в течение длительного времени (порядка 18 месяцев).
Техническими результатами, на достижение которых направлено изобретение, являются повышение достоверности результатов анализа с одновременным упрощением и удешевлением используемой базы и сокращение сроков проведения диагностики.
Из уровня техники известно, что в качестве маркера для диагностики рака предстательной железы может быть использован хепсин. Хепсин представляет собой белок из группы трансмембранных сериновых протеаз II типа, который отсутствует на поверхности клеток предстательной железы в норме, но обнаруживается в различном количестве при доброкачественной гиперплазии и злокачественной опухоли и играет определенную роль в процессе онкогенеза опухоли предстательной железы. В норме данный белок обнаруживается в основном в гепатоцитах. Это свойство позволяет использовать хепсин для диагностики РПЖ с высокой степенью достоверности.
Преимущества данного маркера состоят, прежде всего, в том, что он обладает ферментативной активностью и локализован на поверхности клетки. Экспериментально было установлено, что при использовании моноклональных антител для связывания хепсина на поверхности клеток, значительно уменьшалась способность опухоли к метастазированию. Считается, что данное явление связано с активацией хепсином компонентов внеклеточного матрикса, которые, будучи в активной форме, способствуют усилению инвазивного роста опухоли. Следовательно, тест, основанный на определении именно ферментативной функции хепсина, наиболее полно характеризует стадию заболевания и развитие опухолевого процесса в отличие от методов стандартной полимеразной цепной реакции с использованием метода обратной транскрипции РНК (ОТ-ПЦР), при помощи которых определяется общее количество мРНК хепсина, и ИФА (иммуноферментный анализ), определяющего общее количество белка хепсина на поверхности клетки в активной и неактивной форме.
Сущность изобретения заключается в использовании в качестве вещества для проверки качества реакции в тест-системе рекомбинантного белка хепсин, продуцированного из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098), с использованием при проверке и постановке реакции в качества реакционного буфера 0,1 М трис-имидазола, а в качестве субстрата - тетрапептида Е-лизин Р2Р3 Е-аргинин. где Р2 Б-аспарагин. Е-лейцин или Б-треонин, Р3 - Е-лизин или ^-глутамин, конъюгированного с хромогеном, и в суждении о наличии рака предстательной железы и его стадии по активности хепсина А0 в нмоль/л-ч, определяемой по среднему значению скорости изменения в минуту оптической плотности смеси клеточного лизата с добавленными в него субстратом и реакционным буфером ДЕ0/мин, в соответствии со следующей зависимостью:
А0=(ДЕ0/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где ДЕо/мин - среднее изменение оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин;
V - общий объем реакционной смеси, т.е. объем обработанного образца мочи с добавленными в него субстратом и буфером, мл;
VI - объем обработанного образца мочи, мл;
К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;
106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;
Б - длина оптического пути планшета, см.
При этом осуществляется контроль достоверности значений активности контрольного хепсина в тест-системе, предназначенной для диагностирования, путем сравнения значения активности контрольного хепсина, пропорциональной ДЕк/мин средней скорости изменения оптической плотности Εκ контрольного хепсина с добавленными к нему субстратом и реакционным буфером, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина, при этом активность контрольного хепсина определяют в соответствии со следующей зависимостью:
Ак=(ДЕк/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси контрольного хепсина с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, мл;
V1 - объем контрольного хепсина, мл;
К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;
106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;
Б - длина оптического пути планшета, см;
ДЕк/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин.
- 3 011694
Для получения достоверных результатов анализа сравнивают активность Ак контрольного хепсина в тест-системе, предназначенной для диагностирования, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина, при значении Ак, отличающемся от Аэ более чем на 10% в сторону увеличения или уменьшения, исключают значения А0 из числа результатов анализов, на основе которых проводится диагностирование, в остальных случаях, когда значение Ак отличается от Аэ не более чем на 10% в сторону увеличения или уменьшения, суждение о наличии рака предстательной железы по полученному достоверному значению А0 производится в соответствии с приведенной выше зависимостью для А0.
При значении А0 меньше или равном 0,17 нмоль/л-мин выносится суждение об отсутствии патологии в предстательной железе.
При значениях А0, попадающих в интервал от 0,175 до 0,25 нмоль/л-мин, выносится суждение о начальной стадии процесса патологии в предстательной железе.
При значениях А0, попадающих в интервал от 0,25 до 0,9 нмоль/л-мин, выносится суждение о средней стадии процесса патологии в предстательной железе. При значении А0 больше или равном 0,9 нмоль/л-мин выносится суждение о наличии рака предстательной железы.
Для повышения числа клеток предстательной железы в отбираемом образце мочи, что обеспечивает преодоление предела чувствительности тест-системы, отбор образцов мочи осуществляют после ректального массажа предстательной железы, проводимого с перерывами длительностью 1-2 мин после каждого сеанса, с общей длительностью массажа от 3 до 15 мин.
Субстрат создавался с учетом того, что сериновая протеаза хепсин имеет узкую субстратную специфичность и гидролизует белковые связи по аргинину в положении Ь-лизин Р2Р3 Ь-аргинин Ψ, где Р2 и Р3 - аминокислоты с полярными, незаряженными радикальными группами. Субстрат представляет собой тетрапептид Ь-лизин Р2Р3 Ь-аргинин (где Р2 - Ь-аспарагин, Ь-лейцин или Ь-треонин, Р3 - Ь-лизин или Ь-глутамин), конъюгированный с хромогеном (в частном случае это могут быть паранитроанилид или аминометилкумарин), оптическая плотность которого лежит в пределах в рабочих диапазонов существующих спектрометров и колориметров и флюориметров. Так, для М1сгор1а1е Кеабег тобе1 680 производства фирмы Вю-Каб, Не/.Ю5 А1рйа производства фирмы Тйегто8рес1гопгс может использоваться в качестве хромогена паранитроанилид с диапазоном поглощения 405-415 нм.
Хепсин в активной форме обладает способностью гидролизовать связь между пептидной частью субстрата и хромогенной, в результате чего происходит высвобождение свободного хромогена в раствор и окрашивание раствора, с интенсивностью, пропорциональной величине активности фермента, что позволяет определять скорость реакции и на ее основе судить об активности хепсина.
При проведении эксперимента в качестве биоматериала для проведения анализа были использованы образцы мочи от мужчин с подозрением на рак предстательной железы, полученной сразу после проведения процедуры ректального массажа предстательной железы. Отбор образцов мочи осуществляли после ректального массажа предстательной железы, проводимого с перерывами длительностью 1-2 мин после каждого сеанса, с общей длительностью массажа от 3 до 15 мин. В результате проведенных экспериментов было показано, что при анализе ПСА у больных с нарушениями функций предстательной железы и здоровых доноров не существует достоверных различий между всеми подгруппами и группой контроля. При анализе активности хепсина в разных группах больных было показано, что активность хепсина в группе пациентов с РПЖ достоверно отличается от таковой в группе с аденомой простаты и хроническим простатитом и группе контроля. Значения активности хепсина, определяющие пределы различий между нормой и патологией, были получены на основе данных, приведенных в таблице. При статистической обработке результатов были исключены крайние значения во всех анализируемых группах. Результаты проведенных исследований подтверждают, что использование хепсина для диагностики патологий предстательной железы позволяет с высокой степенью достоверности отличить рак предстательной железы от аденомы предстательной железы и хронического простатита и случаев отсутствия патологии.
Полученные результаты исследований мочи пациентов с нарушениями функций предстательной железы, свидетельствующие о более высокой достоверности диагностики рака предстательной железы заявляемой тест-системой по определению активности хепсина по сравнению с ИФА диагностикой, основанной на определении ПСА, приведены в таблице.
Для обеспечения максимальной сохранности содержащегося в образце хепсина необходимо свести к минимуму манипуляции с образцом мочи, которые потенциально могут приводить к разрушению фермента или потере им активности. Так, образец мочи нельзя охлаждать, а обработку мочи следует осуществлять в день взятия материала.
Выделение клеточной фракции из образцов мочи включает следующие стадии: осаждение клеток, которое следует проводить в центрифуге с бакет-ротором, и двукратную промывку осадка фосфатносолевым буфером с физиологическим значением рН. При этом следует стараться избавиться от слизи, которая может в дальнейшем мешать проведению анализа, для этого следует четко визуально отделить плотный клеточный осадок от студенистого слизистого и аккуратно отделить последний без остатка пипеткой. К анализу не допускаются осадки мочи, содержащие эритроциты.
- 4 011694
Определение активности хепсина в полученном образце включает, в свою очередь, следующие стадии: обработку клеточной фракции лизирующим раствором; центрифугирование; буферизацию надосадочной жидкости буфером рН от 7,4 до 8,1; добавление субстрата; термостатирование; измерение оптической плотности смеси; расчет активности. В качестве буфера, с учетом способности хепсина в активной форме гидролизовать связь между пептидной и хромогенной частями субстрата, используется 0,1 М трис-имидазол.
При проведении анализа в качестве отрицательного контроля используется лизирующий раствор клеточной фракции образца мочи, в качестве положительного контроля - рекомбинантный белок хепсин, полученный из депонированного в Российской коллекции микроорганизмов штамм ρΗΡΝΤΜ-Α в следующих условиях:
культивируют микроорганизмы штамма ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098) в культуральной среде ЬВ ВгоЛ при температуре от 25 до 37°С и интенсивной аэрации до оптической плотности культуры 0,60-0,80 оптических единиц при длине волны 600 нм;
добавляют необходимое количество индуктора для запуска синтеза хепсина - ИНТГ (изопропил-βΌ-тиогалактопиранозид) и продолжают культивирование до получения необходимого количества клеток;
при получении достаточного количества клеток культуральную среду подвергают центрифугированию;
ресуспендируют клеточный осадок в трис-имидазольном буфере и лизируют клетки;
отделяют осадок клеточного дебриса центрифугированием;
супернатант, содержащий целевой белок, инкубируют с ионообменным хроматографическим носителем;
получают очищенный целевой белок согласно методикам, прилагаемым к данному конкретному хроматографическому носителю;
подвергают полученный неактивный зимоген протеолитической активации, для этого инкубируют его с необходимым количеством фермента тромбина в подходящих условиях при достаточном количестве времени. Условия определяются исходя из оптимальных рН, температуры и используемого буфера;
очищают активированный хепсин от следов присутствия тромбина на хроматографическом носителе согласно прилагаемой к нему методике;
проверяют количество и активность полученного белка.
Активность использованной при положительном контроле активной формы сериновой протеазы хепсин, продуцированной из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098) в тест-системе, предназначенной для диагностирования, определяют следующим образом: смешивают контрольный хепсин с субстратом и реакционным буфером; измеряют оптическую плотность Ек полученной смеси с интервалом не менее 10 мин на всем интервале измерения (экспериментальным путем было определено, что достаточным с точки зрения достоверности результатов является интервал измерения длительностью в 60 мин). Затем определяют разность измеренных значений Ек для каждых двух соседних точек интервала измерений; усредняют значения полученных разностей и относят их к временному интервалу измерения, получая АЕк/мин - среднюю скорость изменения оптической плотности Ек контрольного хепсина с добавленными к нему субстратом и реакционным буфером и определяя активность контрольного хепсина в соответствии со следующей зависимостью:
Ак=(ДЕк/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси контрольного хепсина с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, мл;
V1 - объем контрольного хепсина, мл;
К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;
106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;
Ь - длина оптического пути планшета, см;
ДЕк/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин.
Затем сравнивают полученное в тест-системе значение активности Ак с эталонным Аэ, нанесенным на флакон с контрольным образцом, содержащим контрольный хепсин, полученный из штаммапродуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098), и предназначенным для суждения о качестве постановки реакции.
Конкретный пример выполнения тест-системы содержит набор реагентов «Фото-Хепсин» и предназначен для количественного определения ферментативной активности белка-маркера рака предстательной железы сериновой протеазы хепсин в биологическом материале, полученном неинвазивным путем (в моче, полученной после ректального массажа предстательной железы).
Набор «Фото-Хепсин» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 45 неизвестных и 6 контрольных проб и одной пробы для определения оптической плотности буферного лизирующего раствора при использовании всех стрипов одновременно.
В наборе «Фото-хепсин» использован колориметрический метод определения кинетической активности фермента. Для реализации этого варианта использованы лизис-буфер для подготовки к исследованию образцов мочи, буферизующий раствор, субстрат хепсина. В лунках при смешивании исследуемого
- 5 011694 образца, буферного раствора и раствора субстрата во время инкубации происходит расщепление связи между Ь-аргинин субстрата и его хромогенной частью и в результате этого - окрашивание раствора, интенсивность которого пропорциональна активности фермента хепсина. После измерения оптической плотности раствора в лунках активность фермента (А) в определяемых образцах рассчитывается по приведенной выше формуле.
Тест-система включает в себя комплект из 12 восьмилуночных стрипов в рамке, контрольную пробу на основе рекомбинантного белка хепсин, полученного из штаммов-продуцентов, содержащую фермент с известной активностью (Аэ указана на этикетках флакона), лиофилизированный субстрат хепсина, лизис-буфер для обработки осадков мочи, трис-имидазольный буфер для буферизации исследуемых образцов, навеску фосфатно-солевого буфера для обработки осадков мочи, навеску ингибиторов протеаз для обработки осадков мочи, спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 405 нм, одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей, восьмиканальную пипетку, прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебаний 0,5 мм и частотой 9-18 Гц при комнатной температуре 18-25°С; термостат, поддерживающий температуру 37±1°С; холодильник бытовой с морозильной камерой на -20°С; центрифугу лабораторную с бакетротором, позволяющую центрифугировать пробы мочи объемом 50 мл с ускорением 500 д; центрифугу настольную, позволяющую центрифугировать пластиковые пробирки объемом 1,5 мл при скорости 1500 об/мин; встряхиватель пробирок типа Уойсх; мерные цилиндры; стаканы стеклянные; пластиковые пробирки; деионизированную воду; перчатки защитные медицинские.
Специфичность анализа составляет 100%, что обусловлено специфичностью расщепления хепсином связи пептид-хромоген в используемом искусственном субстрате.
Чувствительность набора: минимальная достоверно определяемая набором активность хепсина в лизате мочи человека не превышает 0,05 нмоль/л-мин.
Точность: данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие». Процент открытия составляет 90-110%.
Линейность: зависимость активности хепсина в лизатах мочи с учетом фактора разведения мочи имеет линейный характер в диапазоне активностей 0,11-5,5 нмоль/л-мин и составляет 90-110%.
Воспроизводимость: коэффициент вариации результатов определения хепсина в одном и том же образце лизата мочи с использованием набора не превышает 8%.
Диапазон значений активности хепсина 0-0,17 нмоль/л-мин был определен как нормальный, суждение о наличии процесса, обусловливающего раннее развитие патологии предстательной железы, выносится при значении активности хепсина 0,175-0,25 нмоль/л-мин; суждение о наличии средней степени развития патологии предстательной железы выносится при значении активности хепсина 0,25-0,9 нмоль/л-мин; суждение о наличии злокачественных опухолей простаты выносится при значениях активности хепсина 0,9-5,0 нмоль/л-мин и выше.
При использовании тест-системы рекомендуется уточнить значения активности хепсина, соответствующие нормальным, для популяции в данной конкретной местности.
Все реагенты перед проведением анализа подготавливаются согласно инструкции и доводятся до комнатной температуры, лунки маркируются в соответствии с их назначением - для измерения величины оптической плотности буферного раствора, для контрольных проб, для образцов. Во все лунки вносится буферный раствор. В лунки соответственно маркировке вносятся исследуемые пробы и контрольные образцы. Во все лунки, кроме предназначенных для измерения величины оптической плотности буферного раствора, вносится раствор субстрата. Пробы перемешивают на шейкере для планшетов и определяют на вертикальном спектрофотометре оптическую плотность при 405 нм (Е0), используя в качестве ячейки сравнения бланк. Если для какого-либо лизата мочи Е0 превышает оптическую плотность 1,0, образец следует развести в 10 раз. Пробы инкубируют в термостате при 37°С в течение 10 мин, измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 405 нм (Е10), вновь ставят в термостат на 10 мин и затем измеряют оптическую плотность (Е20). Из значений оптических плотностей остальных лунок вычитаются значения, полученные для лунок, предназначенных для измерения величины оптической плотности буферного раствора. Значение активности хепсина подсчитывается по приведенной выше формуле. На основании значения активности выносят суждение о наличии незлокачественных урологических заболеваний или опухоли простаты.
Пример осуществления способа диагностики рака предстательной железы с использованием тестсистемы.
Получают образцы мочи от мужчин с подозрением на рак предстательной железы.
Центрифугируют образцы мочи при 450-500 д в течение 15-20 мин при комнатной температуре; удаляют супернатант; промывают осадок фосфатно-солевым буфером физиологического рН (использовали ФСБ фирмы Пан-Эко); повторно центрифугируют образцы и повторяют процедуру отмывки; полностью удаляют надосадочную жидкость.
- 6 011694
К осадку, содержащему клетки предстательной железы, добавляют лизирующий раствор (использовали ΚΙΡΑ буфер фирмы Р1егсе) до объема 0,5 мл, интенсивно перемешивают (на встряхивателе типа Уойех) при комнатной температуре и оставляют в ледяной бане на 20 мин. Подготовленный лизат мочи замораживают при -20°С. Для проведения анализа лизаты мочи размораживают при комнатной температуре и центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для определения активности фермента хепсин.
Процедура определения активности состоит из следующих этапов.
Из полистирольного 96-луночного планшета извлекают необходимое количество стрипов для проведения анализа.
В лунки планшета вносят по 30 мкл трис-имидазольного буфера рН 8,3, затем по 250 мкл раствора контрольного рекомбинантного белка с известной активностью и исследуемых лизатов мочи в повторах. В качестве раствора сравнения используют 250 мкл лизирующего раствора. Затем вносят в каждую лунку раствор субстрата, пробы перемешивают на шейкере для планшетов и определяют на вертикальном спектрофотометре оптическую плотность Е0 при длине волны 405 нм, используя в качестве ячейки сравнения ячейку с раствором сравнения. Если для какого-либо лизата мочи оптическая плотность Е0 превышает 1,0, такой образец следует развести в 10 раз, а результат в последующем умножить на 10.
Пробы инкубируют в термостате при 37°С в течение 10 мин, измеряют оптическую плотность Е10 при тех же условиях, вновь ставят в термостат на 10 мин и затем измеряют оптическую плотность Е20.
Активность хепсина (А) в нмоль/л-ч рассчитывают по формуле А0=(ЛЕ0/минх Ух 106)/(Кх V1 хй), где ЛЕд/мин - среднее изменение оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин;
V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси клеточного лизата мочи с добавленными к нему субстратом и буфером, мл;
VI - объем клеточного лизата мочи, мл;
К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;
106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;
Ь - длина оптического пути планшета, см.
Значения измеренной активности хепсина в лизате делят на фактор концентрирования мочи (200) и получают конечную активность хепсина в исследуемом образце мочи.
Список источников
1. Н.С. Сергеева, И.Г. Русаков, М.П. Мишунина, Н.В. Маршутина и др. «Роль простатспецифического антигена в диагностике и мониторинге больных раком предстательной железы». Пособие для врачей. М., 2000.
2. Вапдша С.Н., Кгапке К., В1уепЬегд В.6. е! а1.//Иго1оду. - 1995, νοί. 46, р. 779-784.
3. Ыо1бик 1., 81ашеу Т.Л.//Е Иго1. - 1996, νοί. 155, № 2, р. 441-443.
4. ^1г1й М.Р., Егоксйегшайег 8.Е.//Иго1. Кек. - 1997, νοί. 25, кирр1. 2, р. 67-71.
5. ^ййегкрооп Ь.К., Ьареуго1епе Т.У./Е Иго1. - 1997, νοί. 157, р. 1322-1328.
- 7 011694
Сравнительное определение активности хепсина и концентрации ПСА в биологическом материале пациентов с нарушениями функций предстательной железы и здоровых доноров
Номер пациента Возраст Активность хепснна (нмоль/л*мнн) ПСА (нг/мл)
Здоровые доноры Пациенты с аденомой простаты и хроническим простатитом Пациенты с раком предстательной железы РПЖ/нормалъное значение
1 2 3 4 5 6 7
22 86 4484 ΰθ 75
7 76 0,19 73
45 64 0,69 65
34 70 0,138 18
23 69 137 4,7 раз 16,44
33 67 0,028 14,4
5 68 0,94 3,4 раз 14,1
29 64 1,174 4,3 раз 14,4
44 38 0,138 12
24 70 4007 11,51
36 64 0,207 11,2
43 54 0,276 10,8
52 66 0,207 9,5
51 62 0,967 9,3
48 58 0,345 8,1
50 57 0,622 7,9
1 60 0,3 7,09
46 61 0,415 6,8
8 72 0,25 6,8
9 63 0,44 1,6 раз 5,6
10 65 0,14 4,95
42 51 0,622 4,4
12 83 0,12 43
27 60 0,22 3,9
II 61 0,1 3,6
35 62 11,054 40,5 раз 3,6
21 48 0,21 3,5
37 69 2,27 8,3 раз 3,1
26 45 0,25 2,85
47 67 0,138 2,2
32 62 1313 4,8 раз 2,1
28 41 0,028 2,1
49 36 0,345 2,1
14 18 0,16 1,7
13 18 0,11 1,5
17 18 0,14 1,1
19 32 0,21 03
15 19 0,17 0,2
2 54 432 15,824 раз 0,05
Средние значения 0,181 0,273 2,848
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (11)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Тест-система для диагностики рака предстательной железы, характеризующаяся веществом для проверки качества реакции, буфером, планшетным фотометром с планшетами с постоянной длиной оптического пути Ь, холодильной установкой и центрифугой, отличающаяся тем, что в качестве вещества для проверки качества реакции используют рекомбинантный белок хепсин, в качестве субстрата используют вещество, выбираемое из группы веществ, обладающих способностью расщепляться активной формой сериновой протеазы хепсин.
2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве субстрата в ней используют тетрапептид Ь-лизин Р2Р3 Ь-аргинин, где Р2 - Ь-аспарагин, или Ь-лейцин, или Ь-треонин; Р3 - Ь-лизин или Ь-глутамин, коньюгированный с хромогеном.
3. Тест-система по п.2, отличающаяся тем, что в качестве хромогена в ней используют паранитроанилид или аминометилкумарин.
4. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве буфера в ней используют 0,1 М трисимидазол.
5. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве рекомбинантного белка хепсин в ней используют рекомбинантный белок хепсин, продуцированный из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α
6. Способ диагностики рака предстательной железы, включающий добавление к образцу биологического материала пациента буфер; измерение оптической плотности смеси образца биологического материала с буфером; измерение оптической плотности вещества для проверки качества реакции и сравнение ее с эталонной; отбраковку результатов измерений оптической плотности смеси образца биологического материала с буфером как недостоверных при отклонении результата измерения оптической плотности вещества для проверки качества реакции от эталонного вышедопустимых значений; суждение по достоверным результатам измерений оптической плотности смеси образца биологического материала с буфером о наличии патологии предстательной железы, отличающийся тем, что в качестве образца биологического материала используют образец мочи, в качестве вещества для проверки качества реакции используют рекомбинантный белок хепсин, а в качестве параметра, по которому судят о патологии предстательной железы, - активность рекомбинантного белка хепсин, пропорциональную скорости изменения его оптической плотности в смеси, содержащей обработанный образец мочи, субстрат и буфер, при этом проверку качества реакции осуществляют по результатам измерения активности контрольного хепсина, пропорциональной ДЕк/мин средней скорости изменения оптической плотности Ек контрольного хепсина с добавленными к нему субстратом и реакционным буфером, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина, определяя активность контрольного хепсина в соответствии со следующей зависимостью:
Ак=(ДЕк/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси контрольного хепсина с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, мл;
V1 - объем контрольного хепсина, мл;
К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;
106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;
Ь - длина оптического пути планшета, см;
ДЕк/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин; для чего смешивают контрольный хепсин с субстратом и реакционным буфером, измеряют оптическую плотность Ек полученной смеси с интервалом не менее 10 мин, определяют разность измеренных значений Ек для каждых двух соседних точек интервала измерений, усредняют значения полученных разностей и относят их к временному интервалу измерения, определяют среднюю скорость в единицу времени ДЕо/мин изменения оптической плотности смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером в тех же условиях и с той же частотой по времени, что и ДЕк/мин, на основании измерений оптической плотности Е0 смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером, определяют активность А0 смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером из следующей зависимости:
А0=(ДЕ0/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером, мл;
V1 - объем смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, мл;
К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;
106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;
Ь - длина оптического пути планшета, см;
ДЕ0/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин; сравнивают активность Ак контрольного хепсина в тест-системе, предназначенной для диагностирования, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина при значении Ак, отличающемся от Аэ более чем на 10% в сторону уменьшения или увеличения; исключают полученные значения А0 из числа результатов анализов, на основе которых проводится диагностирование, для значений А0, полученных при допустимых отклонениях Ак от Аэ; суждение о наличии рака предстательной железы по полученному достоверному значению А0 выносится при значениях А0, больших или равных 0,9 нмоль/л-мин.
7. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что при значениях А0, меньших или равных 0,17 нмоль/л-мин, выносится суждение об отсутствии патологии в предстательной железе.
8. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что при значениях А0, находяшихся в пределах значений 0,175-0,25 нмоль/л-мин, выносится суждение о начальной стадии процесса патологии в предстательной железе.
- 8 011694 (№ В-10098) при помощи химической индукции с последующей очисткой на аффинном хроматографическом носителе.
- 9 011694
9. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что при значениях А0, находящихся в пределах значений от 0,25 нмоль/л-мин и включая 0,9 нмоль/л-мин, выносится суждение о средней стадии процесса патологии в предстательной железе.
10. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что отбор образцов мочи осуществляют после ректального массажа предстательной железы, проводимого с перерывами длительностью 1-2 мин после каждого сеанса, с общей длительностью массажа от 3 до 15 мин.
11. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что активную форму сериновой протеазы хепсин получают из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098) в культуральной среде ЬВ Вго1й при значениях температуры от 25 до 37°С и интенсивной аэрации до достижения культурой оптической плотности 0,60-0,80 оптических единиц при длине волны 600 нм; с добавлением индуктора запуска синтеза хепсина - ИПТГ (изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид), до конечной концентрации от 0,04 до 1 ммоль, после получения достаточного количества клеток отделяют их центрифугированием от культуральной среды, затем ресуспендируют клеточный осадок, лизируют клетки, отделяют осадок клеточного дебриса, супернатант, содержащий целевой белок, инкубируют с ионообменным носителем в течение времени, достаточного для иммобилизации белка на носителе (от 1 до 12 ч), полученный из очищенного целевого белка неактивный зимоген подвергают протеолитической активации путем его инкубации с ферментом, тромбином, очищают активированный хепсин от следов присутствия фермента.
EA200801822A 2008-06-19 2008-06-19 Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы EA011694B1 (ru)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200801822A EA011694B1 (ru) 2008-06-19 2008-06-19 Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы
PCT/RU2009/000288 WO2009154510A1 (ru) 2008-06-19 2009-06-05 Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200801822A EA011694B1 (ru) 2008-06-19 2008-06-19 Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA200801822A1 EA200801822A1 (ru) 2009-04-28
EA011694B1 true EA011694B1 (ru) 2009-04-28

Family

ID=40852078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801822A EA011694B1 (ru) 2008-06-19 2008-06-19 Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA011694B1 (ru)
WO (1) WO2009154510A1 (ru)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL236125B1 (pl) * 2018-07-14 2020-12-14 Univ Gdanski Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, marker diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych
PL3431490T3 (pl) * 2017-07-17 2020-09-07 Uniwersytet Gdański Związki chemiczne mające zastosowanie jako markery diagnostyczne stanu zapalnego i nowotworów, sposób ich otrzymywania, zestaw diagnostyczny i metoda diagnozowania procesów zapalnych i nowotworów nabłonkowych

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049645A1 (en) * 2001-02-14 2003-03-13 David Mu Amplified cancer gene hepsin
AU2003225540A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-02 Irm, Llc Hepsin substrates and prodrugs

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100143247A1 (en) * 2004-11-24 2010-06-10 St. George's Enterprises Limited Diagnosis of prostate cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049645A1 (en) * 2001-02-14 2003-03-13 David Mu Amplified cancer gene hepsin
AU2003225540A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-02 Irm, Llc Hepsin substrates and prodrugs

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jian-Ai Xuan et al. Antibodies neutralizing hepsin protease activity do not impact cell growth but inhibit invasion of prostate and ovarian tumor cells in culture. Cancer Res. 2006; 66: (7). April 1, 2006, p. 3611-3612, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
EA200801822A1 (ru) 2009-04-28
WO2009154510A1 (ru) 2009-12-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7361474B2 (en) Serum macrophage migration inhibitory factor (MIF) as marker for prostate cancer
US20110306035A1 (en) Methods and Compositions for Detection of a Pathogen, Disease, Medical Condition, or Biomarker Thereof
US20070254317A1 (en) Method for Detecting the Activatable Free Form of Psa and the Use Thereof for Diagnosing Benign Pathologies of the Prostate and Adenocarcinoma of the Prostate
ES2366043T3 (es) Procedimiento para analizar inmunológicamente el producto de la degradación con plasmina de la fibrina estabilizada.
CN104111335A (zh) 胃蛋白酶原i／ii胶乳增强免疫比浊法测定试剂盒
EP1774327A2 (en) Methods and kits for measuring adamts13/fxi complexes
JP4814788B2 (ja) 間質性膀胱炎の検査方法
WO2007033469A2 (en) Liquid-phase galactose oxidase-schiff’s assay
CN110187111A (zh) 一种用于早期贲门癌筛查elisa试剂盒
EA011694B1 (ru) Тест-система для диагностики рака предстательной железы и способ диагностики рака предстательной железы
WO2012145399A2 (en) Methods of diagnosing cancer in a patient
CN107058558A (zh) 一种肿瘤细胞检测方法
US20080138837A1 (en) Methods and kits for detecting and measuring ADAMTS13/FXI complexes
Kocna et al. Arginase activity determination a marker of large bowel mucosa proliferation
CN111551545B (zh) 一种用于食管癌高危人群早期筛查的液体活检elisa试剂盒
CN111024941A (zh) 一种用于多种血栓标志物检测的蛋白芯片及其制备方法
JP2011509069A (ja) 癌を検出するための検査キット
JP2949474B2 (ja) ペプシノーゲンｉ／ｉｉ比の変化率を基礎としたヘリコバクター・ピロリ除菌判定方法
Joshi et al. Significance of detection of free/total PSA ratio and other biochemical parameters in patients with BPH, carcinoma prostate and its clinicopathologic correlation
US20130260391A1 (en) Method Of Determining The Protease Cathepsin B In A Biological Sample
CN111308090A (zh) 一种食管癌多联快速检测elisa试剂盒
Elgün et al. Evaluation of serum arginase activity in benign prostatic hypertrophy and prostatic cancer
WO2023100910A1 (ja) 糞便中エラスターゼ１を測定する方法
RU2772195C1 (ru) Способ определения функциональной активности антитромбина iii в плазме крови
Dawam Biomarkers of bladder cancer in urine: evaluation of diagnostic and prognostic significance of current and potential markers

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU