EA011694B1 - Test-system for diagnosis of prostate cancer and method for diagnosis thereof - Google Patents

Test-system for diagnosis of prostate cancer and method for diagnosis thereof Download PDF

Info

Publication number
EA011694B1
EA011694B1 EA200801822A EA200801822A EA011694B1 EA 011694 B1 EA011694 B1 EA 011694B1 EA 200801822 A EA200801822 A EA 200801822A EA 200801822 A EA200801822 A EA 200801822A EA 011694 B1 EA011694 B1 EA 011694B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
hepsin
substrate
optical density
buffer
sample
Prior art date
Application number
EA200801822A
Other languages
Russian (ru)
Other versions
EA200801822A1 (en
Inventor
Евгений Сергеевич СЕВЕРИН
Сергей Евгеньевич СЕВЕРИН
Екатерина Михайловна КУЗНЕЦОВА
Мария Владимировна САВВАТЕЕВА
Евгений Сергеевич БУДОРАГИН
Original Assignee
Ано "Институт Молекулярной Диагностики"
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ано "Институт Молекулярной Диагностики" filed Critical Ано "Институт Молекулярной Диагностики"
Priority to EA200801822A priority Critical patent/EA200801822A1/en
Publication of EA011694B1 publication Critical patent/EA011694B1/en
Publication of EA200801822A1 publication Critical patent/EA200801822A1/en
Priority to PCT/RU2009/000288 priority patent/WO2009154510A1/en

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57434—Specifically defined cancers of prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/59—Transmissivity

Abstract

The present invention relates to medicine, in particular to oncology and molecular biology and can be used for early diagnostics of prostate pathologies, including prostate cancer by a noninvasive method. The invention is aimed at using a recombinant hepsin protein produced from strain producer pHPNTMNos B-100978 as a substance for checking reaction quality in the test system using 0.1M tris-imidazole as a reaction buffer and as a substrate - PPL-arginine L-lysine tetrapeptide, where Pis L-asparagine or L-leucine or L-threonine, Pis L-lysine or L-glutamine conjugated with chromogen and in judging about prostate cancer occurrence and its stage by hepsin Ao activity in nmol/lhr, determined by the ΔEo/min mean value of the rate change in minute of optical density of the tested urine samplea adding the substrate thereto and the reaction buffer, wherein there excluded the test results obtained under conditions when the activity of the control hepsin Ac tested using said test system differs from Ar by more than 10%.

Description

Изобретение относится к области медицины, в частности онкологии и молекулярной биологии, и может быть использовано для ранней диагностики патологий предстательной железы, включая рак предстательной железы.The invention relates to medicine, in particular oncology and molecular biology, and can be used for early diagnosis of prostate pathologies, including prostate cancer.

На сегодняшний день рак предстательной железы (РПЖ) - одно из наиболее распространенных опухолевых заболеваний у мужчин, по частоте встречаемости стоящее на 4-м месте после рака легких, желудка и толстой кишки. По данным 1ЛЯС Ргекк за 2004 год заболеваемость РПЖ в России составила 12,8 млн чел., смертность - 8,2 млн, при этом соотношение числа умерших от рака предстательной железы к числу заболевших составляет 64%. С возрастом частота заболеваемости РПЖ возрастает, а начиная с 45 лет растет в геометрической прогрессии. В результате к 70 годам заболевание, согласно гистологическим данным, встречается более чем у 60% мужчин, после 70 лет - у 83%.To date, prostate cancer (PCa) is one of the most common tumor diseases in men, with a frequency of occurrence in 4th place after cancer of the lungs, stomach and colon. According to 1LAS Rgekk, in 2004 the incidence of prostate cancer in Russia amounted to 12.8 million people, mortality - 8.2 million, while the ratio of the number of deaths from prostate cancer to the number of cases is 64%. With age, the incidence of prostate cancer increases, and from the age of 45 it grows exponentially. As a result, by the age of 70, the disease, according to histological data, occurs in more than 60% of men, after 70 years - in 83%.

Клиническая картина РПЖ не обладает ярко выраженной симптоматикой и часто протекает бессимптомно. Основные симптомы заболевания - эректильная дисфункция, изменение характера мочеиспускания - аналогичны таковым для доброкачественной опухоли предстательной железы, простатита, цистита и других заболеваний мочеполовой системы.The clinical picture of prostate cancer does not have pronounced symptoms and is often asymptomatic. The main symptoms of the disease - erectile dysfunction, a change in the nature of urination - are similar to those for a benign tumor of the prostate gland, prostatitis, cystitis and other diseases of the genitourinary system.

Из уровня техники известно несколько основных методов диагностики РПЖ, которые можно разделить на иназивные и неинвазивные и инвазивные. К первым относится биопсия предстательной железы, ко вторым - пальцевое ректальное исследование (ПРИ), трансректальное ультразвуковое исследование (ТРУЗИ) и измерение уровня простатспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови.The prior art knows several basic diagnostic methods for prostate cancer, which can be divided into invasive and non-invasive and invasive. The first include a biopsy of the prostate gland, the second - digital rectal examination (PRI), transrectal ultrasound (TRUS) and measurement of the level of prostate-specific antigen (PSA) in blood serum.

При использовании методов первой группы возможны возникновения воспаления, метастазов, ускорения пролиферации опухолевых клеток, поэтому вторая группа предпочтительнее из-за менее травматичного характера. При этом анализ методами ТРУЗИ и ПРИ предъявляет высокие требования к уровню квалификации и опыта диагностов, при этом вероятность распознавания рака предстательной железы на ранней стадии близка к нулевой.When using the methods of the first group, inflammation, metastases, and acceleration of the proliferation of tumor cells are possible; therefore, the second group is preferable because of the less traumatic nature. Moreover, analysis by TRUS and PRI methods places high demands on the level of qualification and experience of diagnosticians, while the probability of recognition of prostate cancer at an early stage is close to zero.

Наиболее близким к заявленному изобретению является способ диагностики рака предстательной железы на основе измерения ПСА иммуноферментным методом, как экологически более безопасный (по сравнению с радиоиммунными) и менее дорогостоящий (по сравнению с хемилюминисцентными). Для иммуноферментного анализа нужен комплект оборудования, так называемая ИФА-лаборатория, которая включает встряхивающее устройство - инкубатор, промывающее устройство и микропланшетный или кюветный фотометр.Closest to the claimed invention is a method for diagnosing prostate cancer based on the measurement of PSA by the enzyme-linked immunosorbent assay as environmentally safer (compared to radioimmune) and less expensive (compared to chemiluminescent). An enzyme-linked immunosorbent assay requires a set of equipment, the so-called ELISA, which includes a shaking device - an incubator, a washing device and a microplate or cuvette photometer.

ПСА представляет собой гликопротеин с молекулярной массой около 32000 Да, состоящий из одной полипептидной цепи. ПСА является сериновой протеазой, продуцируемой исключительно эпителием человеческой простаты. В норме ПСА секретируется в семенную жидкость в высоких концентрациях, где он является ферментативно активным, и напрямую вовлечен в разжижение семенного сгустка. В кровотоке ПСА присутствует в низких концентрациях. Увеличение концентрации ПСА в сыворотке крови свидетельствует о патологиях простаты, таких как доброкачественная гиперплазия и злокачественное перерождение ткани простаты. Определение ПСА широко используется для обнаружения и мониторинга пациентов с раком простаты.PSA is a glycoprotein with a molecular weight of about 32,000 Da, consisting of one polypeptide chain. PSA is a serine protease produced exclusively by the epithelium of the human prostate. Normally, PSA is secreted into the seminal fluid in high concentrations, where it is enzymatically active, and is directly involved in the liquefaction of the seminal clot. PSA is present in the bloodstream in low concentrations. An increase in the concentration of PSA in serum indicates pathologies of the prostate, such as benign hyperplasia and malignant degeneration of prostate tissue. The definition of PSA is widely used to detect and monitor patients with prostate cancer.

Уровень общего ПСА у больных с простатитом крайне редко (всего в 4,5% случаев) превышает значение 4,0 нг/мл, причем эти значения не выходят за пределы «серой зоны» (4,0-19,9 нг/мл). При аденоме предстательной железы средний уровень общего ПСА составляет 4,1 нг/мл и частота «попадания» значений ПСА в «серую зону» увеличивается до 33%. У больных первичным раком предстательной железы среднее содержание общего ПСА в 100 раз превышает таковое у пациентов с аденомой и составляет 419,7 нг/мл, причем максимальные значения общего ПСА у отдельных больных могут превышать 7000,0 нг/мл. В целом, лишь у 12,8% пациентов с первичным раком предстательной железы уровень общего ПСА находится в пределах нормы, у 1/3 больных уровень ПСА располагается в «серой зоне», у большинства пациентов (53,3% случаев) значения ПСА превышают 30,0 нг/мл.The level of total PSA in patients with prostatitis is extremely rare (only 4.5% of cases) exceeds 4.0 ng / ml, and these values do not go beyond the "gray zone" (4.0-19.9 ng / ml) . With prostate adenoma, the average level of total PSA is 4.1 ng / ml and the frequency of "getting" PSA values into the "gray zone" increases to 33%. In patients with primary prostate cancer, the average content of total PSA is 100 times higher than that of patients with adenoma and amounts to 419.7 ng / ml, and the maximum values of total PSA in individual patients can exceed 7000.0 ng / ml. In general, only 12.8% of patients with primary prostate cancer have a PSA level within the normal range, in 1/3 of the patients the PSA level is in the gray zone, in most patients (53.3% of cases) PSA values are higher 30.0 ng / ml.

При дискриминационном уровне ПСА 4,0 нг/мл чувствительность (процент истинноположительных результатов, полученных с применением данного теста в группе онкологических больных) метода для диагностики рака предстательной железы, составляет 87,2%, специфичность (процент истинно-отрицательных результатов, полученных с применением данного теста в группе неонкологических пациентов) - 73,3%.With a PSA discriminatory level of 4.0 ng / ml, the sensitivity (percentage of true positive results obtained using this test in the group of cancer patients) of the method for diagnosing prostate cancer is 87.2%, specificity (percentage of true negative results obtained using this test in the group of non-cancer patients) - 73.3%.

В то же время для дифференциальной диагностики при значениях маркера в «серой зоне» (4,0-19,9 нг/мл), недостаточно измерить содержание только общего ПСА, поскольку такое увеличение уровня белка может быть вызвано не только раком предстательной железы, но и воспалением, доброкачественной гиперплазией, ишемией или инфарктом предстательной железы. В этих случаях для дифференциальной диагностики дополнительно применяют клиническое, ультразвуковое, пункционное исследования.At the same time, for differential diagnosis with marker values in the gray zone (4.0-19.9 ng / ml), it is not enough to measure the content of total PSA alone, since such an increase in protein levels can be caused not only by prostate cancer, but and inflammation, benign hyperplasia, ischemia, or prostate infarction. In these cases, for differential diagnosis, clinical, ultrasound, and puncture studies are additionally used.

При интерпретации результатов в обязательном порядке учитывают, что массаж, УЗИ и биопсия предстательной железы, а также цистоскопия могут вызывать существенное увеличение концентрации ПСА в крови. У некоторых пациентов пальцевое ректальное исследование сопровождается изменением процентного содержания свободного ПСА. Поэтому кровь из вены для определения ПСА берут перед этими манипуляциями или спустя одну неделю (после биопсии - через 6 недель). Кроме того, за 48 ч доWhen interpreting the results, it is mandatory to take into account that massage, ultrasound and prostate biopsy, as well as cystoscopy, can cause a significant increase in the concentration of PSA in the blood. In some patients, digital rectal examination is accompanied by a change in the percentage of free PSA. Therefore, blood from a vein is taken to determine PSA before these manipulations or after one week (after a biopsy - after 6 weeks). Also 48 hours before

- 1 011694 сдачи крови с целью определения ПСА наступают ограничения по двигательной активности и иным аспектам физиологической жизнедеятельности пациента.- 1 011694 blood donation in order to determine PSA, there are restrictions on motor activity and other aspects of the physiological activity of the patient.

В качестве прототипа выбран способ диагностирования рака предстательной железы и используемая при этом тест-система, описанные в Инструкции по применению набора реагентов для имуноферментного определения общего простатспецифического антигена в сыворотке крови (ОнкоИФА-общий ПСА), рекомендованной Комиссией по наборам реагентов для иммуноферментного (неинфекционные), радиоиммунологического и других видов иммунохимического анализа Комитета по новой медицинской технике МЗ РФ (протокол № 3 от 24 марта 2003 г.)As a prototype, a method for diagnosing prostate cancer and the test system used for this are described in the Instructions for the use of a reagent kit for enzyme-linked immunosorbent assay for the determination of total prostate-specific antigen in blood serum (Onco IFA-total PSA) recommended by the Commission on reagent kits for immuno-enzymic (non-infectious) , radioimmunological and other types of immunochemical analysis of the Committee on new medical equipment of the Ministry of Health of the Russian Federation (protocol No. 3 of March 24, 2003)

Набор реагентов «ОнкоИФА-общий ПСА» предназначен для количественного определения общего простатспецифического антигена (ПСА) в сыворотке крови методом твердофазного иммуноферментного анализа.The OncoIFA-total PSA reagent kit is intended for the quantitative determination of total prostate-specific antigen (PSA) in blood serum by enzyme-linked immunosorbent assay.

Набор «ОнкоИФА-общий ПСА» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40 неизвестных, 6 калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ (тетраметилбензидин) при использовании всех стрипов одновременно.The OncoIFA-General PSA kit is designed for analysis in duplicates of 40 unknowns, 6 calibration samples, one control serum sample and one sample to determine the optical density of the TMB solution (tetramethylbenzidine) using all strips simultaneously.

В наборе «ОнкоИФА-общий ПСА» использован «сэндвич» - вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ПСА. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ПСА-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация ПСА, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-ПСА-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации ПСА. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству ПСА в исследуемом образце.The “OncoIFA-General PSA” kit uses a “sandwich” - a variant of enzyme-linked immunosorbent assay. To implement this option, two monoclonal antibodies with different epitope specificity for PSA were used. One of them is immobilized on the solid phase (the inner surface of the holes), the second is conjugated to horseradish peroxidase. In the wells, when the test sample and the anti-PSA-peroxidase conjugate are added, during the incubation, the PSA contained in the test sample is simultaneously immobilized and bound to the conjugate. When the contents are removed from the wells and washed, excess anti-PSA peroxidase conjugate, which was not bound to PSA immobilized during incubation, is removed. The amount of conjugate bound is directly proportional to the amount of PSA in the test sample.

Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна количеству ПСА в исследуемом образце. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация ПСА в определяемых образцах.During incubation with the TMB solution, the solution stains in the wells. The degree of color is directly proportional to the amount of PSA in the test sample. After measuring the optical density of the solution in the wells, the concentration of PSA in the determined samples is calculated based on the calibration graph.

Тест-система прототипа включает комплект из 12 восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок антителами к ПСА, калибровочные пробы на основе сыворотки крови, содержащие известные количества ПСА (указаны на этикетках флаконов), конъюгат антиПСА-пероксидаза, концентрированный буферный раствор (буфер Р) для промывки лунок, раствор тетраметилбензидина (раствор ТМБ), стоп-реагент (1н. раствор соляной кислоты), контрольная сыворотка с известным содержанием ПСА, спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм; одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей, восьмиканальная пипетка, прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание со скоростью 500-800 об/мин при температуре 37°С, мерные цилиндры, стаканы стеклянные, дистиллированная вода, фильтровальная бумага, перчатки защитные медицинские.The prototype test system includes a set of 12 eight-well strips in a frame with anti-PSA antibodies immobilized on the inner surface of the wells, calibration samples based on blood serum containing known amounts of PSA (indicated on the labels of the vials), anti-PSA peroxidase conjugate, concentrated buffer solution (buffer P) for washing the wells, tetramethylbenzidine solution (TMB solution), stop reagent (1N hydrochloric acid solution), control serum with known PSA content, vertical scanning spectrophotometer, p allows one to measure the absorbance of the solution in the mixer strips at a wavelength of 450 nm; single-channel pipettes with a variable volume of fluid withdrawal, an eight-channel pipette, a device for shaking frames with strips (thermostatic shaker), which allows shaking at a speed of 500-800 rpm at a temperature of 37 ° C, measuring cylinders, glass glasses, distilled water, filter paper protective medical gloves.

Коэффициент вариации результатов определения ПСА в одном и том же образце с использованием набора «ОнкоИФА-общий ПСА» не превышает 8%.The coefficient of variation in the results of determining PSA in the same sample using the OncoIFA-total PSA kit does not exceed 8%.

Диапазон значений концентраций ПСА до 4 нг/мл был определен как нормальный, суждение о наличии незлокачественных урологических заболеваний выносится при концентрации ПСА от 4 до 10 нг/мл, при значениях ПСА выше 10 нг/мл выносится суждение о наличии злокачественных опухолей простаты. При использовании тест-системы рекомендуется уточнить значения концентраций ПСА, соответствующие нормальным.The range of PSA concentrations up to 4 ng / ml was determined as normal, the judgment of the presence of non-malignant urological diseases is made at a PSA concentration of 4 to 10 ng / ml, and with PSA values above 10 ng / ml, the presence of malignant prostate tumors is judged. When using the test system, it is recommended to clarify the values of PSA concentrations corresponding to normal.

Все реагенты перед проведением анализа перемешиваются и доводятся до комнатной температуры, лунки маркируются в соответствии с их назначением для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ, для калибровочных проб и для контрольной сыворотки. Во все лунки, кроме предназначенных для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ, вносится раствор конъюгата анти-ПСА-пероксидаза. В соответствующие лунки вносятся калибровочные пробы и контрольная сыворотка, в оставшиеся - исследуемая сыворотка крови. Стрипы инкубируются при встряхивании в термостатируемом шейкере при температуре 37°С со скоростью 500-800 об/мин. После декантирования содержимого лунок и их промывки во все лунки вносится раствор тетраметилбензидина. Затем стрипы инкубируются в темноте в течение времени, длительность которого зависит от степени развития окраски. После чего в лунки добавляется стоп-реагент для остановки ферментной реакции. На фотометре вертикального сканирования измеряется оптическая плотность в лунках при 450 нм. Из значений оптических плотностей остальных лунок вычитаются значения, полученные для лунок, предназначенных для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ, строится для калибровочных проб график зависимости оптической плотности от концентрации ПСА в калибровочных пробах и на его основе выносят суждение о наличии незлокачественных урологических заболеваний, опухолей простаты.Before analysis, all reagents are mixed and brought to room temperature, the wells are labeled according to their purpose for measuring the optical density of the TMB solution, for calibration samples and for control serum. In all wells, except for those intended for measuring the optical density of the TMB solution, an anti-PSA peroxidase conjugate solution is added. Calibration samples and control serum are added to the corresponding wells, and the test blood serum to the remaining ones. Strips are incubated with shaking in a thermostatically controlled shaker at a temperature of 37 ° C at a speed of 500-800 rpm. After decanting the contents of the wells and washing them, a solution of tetramethylbenzidine is introduced into all wells. Then the strips are incubated in the dark for a period of time, the duration of which depends on the degree of color development. Then a stop reagent is added to the wells to stop the enzymatic reaction. The vertical scanning photometer measures the optical density in the wells at 450 nm. From the values of the optical densities of the remaining wells, the values obtained for the wells designed to measure the optical density of the TMB solution are subtracted, a plot of the optical density versus PSA concentration in calibration samples is constructed for calibration samples, and it is used to make judgments about the presence of non-malignant urological diseases and prostate tumors .

Недостатком метода диагностирования РПЖ на основе измерения уровня ПСА является его недостаточная эффективность, поскольку ПСА является прогностическим, но не предсказательным маркеромThe disadvantage of the method for diagnosing prostate cancer based on the measurement of PSA is its lack of effectiveness, since PSA is a predictive, but not predictive marker

- 2 011694 из-за недостаточной его специфичности для диагностики РПЖ, особенно при диагностике на ранних стадиях заболевания. Так, например, в интервале ниже 10 нг/мл он может быть ложноотрицательным у 20% и ложноположительным у 70% больных. Повышение уровня ПСА помимо РПЖ может быть обусловлено доброкачественной гиперплазией, наличием воспаления, инфекции и ишемии в предстательной железе. Тест-система также имеет свои недостатки: необходимость использования одновременно конъюгата анти-ПСА-пероксидаза, раствора тетраметилбензидина и стоп-реагента. Анализ занимает длительное время - порядка 4,5 ч, к тому же прогноз развития обнаруженной патологии может быть дан только при проведении повторных анализов в течение длительного времени (порядка 18 месяцев).- 2 011694 due to its insufficient specificity for the diagnosis of prostate cancer, especially when diagnosed in the early stages of the disease. So, for example, in the range below 10 ng / ml it can be false negative in 20% and false positive in 70% of patients. An increase in PSA levels in addition to prostate cancer may be due to benign hyperplasia, the presence of inflammation, infection and ischemia in the prostate gland. The test system also has its drawbacks: the need to use simultaneously an anti-PSA peroxidase conjugate, a solution of tetramethylbenzidine and a stop reagent. The analysis takes a long time - about 4.5 hours, in addition, the prognosis of the development of the detected pathology can be given only when repeated analyzes are performed for a long time (about 18 months).

Техническими результатами, на достижение которых направлено изобретение, являются повышение достоверности результатов анализа с одновременным упрощением и удешевлением используемой базы и сокращение сроков проведения диагностики.The technical results to which the invention is directed are to increase the reliability of the analysis results while simplifying and reducing the cost of the used database and reducing the time needed for diagnostics.

Из уровня техники известно, что в качестве маркера для диагностики рака предстательной железы может быть использован хепсин. Хепсин представляет собой белок из группы трансмембранных сериновых протеаз II типа, который отсутствует на поверхности клеток предстательной железы в норме, но обнаруживается в различном количестве при доброкачественной гиперплазии и злокачественной опухоли и играет определенную роль в процессе онкогенеза опухоли предстательной железы. В норме данный белок обнаруживается в основном в гепатоцитах. Это свойство позволяет использовать хепсин для диагностики РПЖ с высокой степенью достоверности.It is known from the prior art that hepsin can be used as a marker for diagnosing prostate cancer. Hepsin is a protein from the group of transmembrane serine proteases of type II, which is normally absent on the surface of prostate cells, but is found in varying amounts in benign hyperplasia and a malignant tumor and plays a role in the process of oncogenesis of a prostate tumor. Normally, this protein is found mainly in hepatocytes. This property allows the use of hepsin for the diagnosis of prostate cancer with a high degree of reliability.

Преимущества данного маркера состоят, прежде всего, в том, что он обладает ферментативной активностью и локализован на поверхности клетки. Экспериментально было установлено, что при использовании моноклональных антител для связывания хепсина на поверхности клеток, значительно уменьшалась способность опухоли к метастазированию. Считается, что данное явление связано с активацией хепсином компонентов внеклеточного матрикса, которые, будучи в активной форме, способствуют усилению инвазивного роста опухоли. Следовательно, тест, основанный на определении именно ферментативной функции хепсина, наиболее полно характеризует стадию заболевания и развитие опухолевого процесса в отличие от методов стандартной полимеразной цепной реакции с использованием метода обратной транскрипции РНК (ОТ-ПЦР), при помощи которых определяется общее количество мРНК хепсина, и ИФА (иммуноферментный анализ), определяющего общее количество белка хепсина на поверхности клетки в активной и неактивной форме.The advantages of this marker are, first of all, in that it has enzymatic activity and is localized on the cell surface. It was experimentally found that when using monoclonal antibodies to bind hepsin on the cell surface, the tumor's ability to metastasize was significantly reduced. It is believed that this phenomenon is associated with the activation of extracellular matrix components by hepsin, which, when in active form, contribute to the enhancement of invasive tumor growth. Therefore, a test based on the determination of the enzymatic function of hepsin most fully characterizes the stage of the disease and the development of the tumor process, in contrast to the standard polymerase chain reaction methods using the RNA reverse transcription method (RT-PCR), which determines the total amount of hepsin mRNA, and ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), which determines the total amount of hepsin protein on the cell surface in active and inactive form.

Сущность изобретения заключается в использовании в качестве вещества для проверки качества реакции в тест-системе рекомбинантного белка хепсин, продуцированного из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098), с использованием при проверке и постановке реакции в качества реакционного буфера 0,1 М трис-имидазола, а в качестве субстрата - тетрапептида Е-лизин Р2Р3 Е-аргинин. где Р2 Б-аспарагин. Е-лейцин или Б-треонин, Р3 - Е-лизин или ^-глутамин, конъюгированного с хромогеном, и в суждении о наличии рака предстательной железы и его стадии по активности хепсина А0 в нмоль/л-ч, определяемой по среднему значению скорости изменения в минуту оптической плотности смеси клеточного лизата с добавленными в него субстратом и реакционным буфером ДЕ0/мин, в соответствии со следующей зависимостью:The essence of the invention is to use as a substance to test the quality of the reaction in the test system of the recombinant protein hepsin produced from the producer strain ρΗΡΝΤΜ -Α (No. B-10098), using 0.1 M to check and set the reaction as the reaction buffer Tris-imidazole, and as a substrate - tetrapeptide E-lysine P 2 P 3 E-arginine. where P 2 is B-asparagine. E-leucine or B-threonine, P 3 - E-lysine or β-glutamine conjugated to a chromogen, and in judging the presence of prostate cancer and its stage by hepsin A 0 activity in nmol / l-h, determined by the average value the rate of change per minute of the optical density of the mixture of cell lysate with the substrate and reaction buffer DE 0 / min added to it, in accordance with the following dependence:

А0=(ДЕ0/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где ДЕо/мин - среднее изменение оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин;A 0 = (DE 0 / minx Yx 10 6 ) / (Kx V 1 xb), where DEo / min is the average change in optical density over 1 min, optical units / min;

V - общий объем реакционной смеси, т.е. объем обработанного образца мочи с добавленными в него субстратом и буфером, мл;V is the total volume of the reaction mixture, i.e. the volume of the treated urine sample with the substrate and buffer added to it, ml;

VI - объем обработанного образца мочи, мл;V I - the volume of the treated urine sample, ml;

К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;K is the millimolar substrate extinction coefficient;

106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;10 6 - conversion factor from mmol to nmol;

Б - длина оптического пути планшета, см.B - the length of the optical path of the tablet, see

При этом осуществляется контроль достоверности значений активности контрольного хепсина в тест-системе, предназначенной для диагностирования, путем сравнения значения активности контрольного хепсина, пропорциональной ДЕк/мин средней скорости изменения оптической плотности Εκ контрольного хепсина с добавленными к нему субстратом и реакционным буфером, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина, при этом активность контрольного хепсина определяют в соответствии со следующей зависимостью:At the same time, the reliability of the control hepsin activity values in the test system intended for diagnosis is checked by comparing the control hepsin activity value proportional to DE k / min of the average rate of change of optical density Εκ of the control hepsin with the substrate and reaction buffer added to it with the reference activity a control hepsin e, the control hepsin activity is determined according to the following relationship:

Ак=(ДЕк/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси контрольного хепсина с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, мл;And k = (DE k / minh Yx 10 6 ) / (Kx V 1 xb), where V is the total volume of the reaction mixture, i.e. mixtures of control hepsin with substrate and reaction buffer added to it, ml;

V1 - объем контрольного хепсина, мл;V 1 - the volume of control hepsin, ml;

К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;K is the millimolar substrate extinction coefficient;

106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;10 6 - conversion factor from mmol to nmol;

Б - длина оптического пути планшета, см;B - the length of the optical path of the tablet, cm;

ДЕк/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин.DE k / min - the average rate of change in optical density in 1 min, optical units / min.

- 3 011694- 3 011694

Для получения достоверных результатов анализа сравнивают активность Ак контрольного хепсина в тест-системе, предназначенной для диагностирования, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина, при значении Ак, отличающемся от Аэ более чем на 10% в сторону увеличения или уменьшения, исключают значения А0 из числа результатов анализов, на основе которых проводится диагностирование, в остальных случаях, когда значение Ак отличается от Аэ не более чем на 10% в сторону увеличения или уменьшения, суждение о наличии рака предстательной железы по полученному достоверному значению А0 производится в соответствии с приведенной выше зависимостью для А0.To obtain reliable results of the analysis, the activity of A to the control hepsin in the test system intended for diagnosis is compared with the reference activity A e of the control hepsin, with a value of A k different from A e by more than 10% in the direction of increase or decrease, exclude values 0 a number of test results on which the diagnosis is carried out, in other cases where the value of Ak is different from Ae not more than 10% decrease or increase, a judgment about the presence of prostate cancer jelly s for obtaining reliable value A 0 is made in accordance with the above dependency of A 0.

При значении А0 меньше или равном 0,17 нмоль/л-мин выносится суждение об отсутствии патологии в предстательной железе.When the value of A 0 is less than or equal to 0.17 nmol / l-min, a judgment is made about the absence of pathology in the prostate gland.

При значениях А0, попадающих в интервал от 0,175 до 0,25 нмоль/л-мин, выносится суждение о начальной стадии процесса патологии в предстательной железе.With values of A 0 falling in the range from 0.175 to 0.25 nmol / l-min, a judgment is made about the initial stage of the pathology process in the prostate gland.

При значениях А0, попадающих в интервал от 0,25 до 0,9 нмоль/л-мин, выносится суждение о средней стадии процесса патологии в предстательной железе. При значении А0 больше или равном 0,9 нмоль/л-мин выносится суждение о наличии рака предстательной железы.With values of A 0 falling in the range from 0.25 to 0.9 nmol / l-min, a judgment is made about the middle stage of the pathology process in the prostate gland. When the value of A0 is greater than or equal to 0.9 nmol / l-min, a judgment is made about the presence of prostate cancer.

Для повышения числа клеток предстательной железы в отбираемом образце мочи, что обеспечивает преодоление предела чувствительности тест-системы, отбор образцов мочи осуществляют после ректального массажа предстательной железы, проводимого с перерывами длительностью 1-2 мин после каждого сеанса, с общей длительностью массажа от 3 до 15 мин.To increase the number of prostate cells in the selected urine sample, which overcomes the sensitivity limit of the test system, urine samples are taken after rectal massage of the prostate gland, carried out with interruptions of 1-2 minutes after each session, with a total massage duration of 3 to 15 min

Субстрат создавался с учетом того, что сериновая протеаза хепсин имеет узкую субстратную специфичность и гидролизует белковые связи по аргинину в положении Ь-лизин Р2Р3 Ь-аргинин Ψ, где Р2 и Р3 - аминокислоты с полярными, незаряженными радикальными группами. Субстрат представляет собой тетрапептид Ь-лизин Р2Р3 Ь-аргинин (где Р2 - Ь-аспарагин, Ь-лейцин или Ь-треонин, Р3 - Ь-лизин или Ь-глутамин), конъюгированный с хромогеном (в частном случае это могут быть паранитроанилид или аминометилкумарин), оптическая плотность которого лежит в пределах в рабочих диапазонов существующих спектрометров и колориметров и флюориметров. Так, для М1сгор1а1е Кеабег тобе1 680 производства фирмы Вю-Каб, Не/.Ю5 А1рйа производства фирмы Тйегто8рес1гопгс может использоваться в качестве хромогена паранитроанилид с диапазоном поглощения 405-415 нм.The substrate was created taking into account the fact that the serine protease hepsin has narrow substrate specificity and hydrolyzes protein bonds with arginine in the L-lysine position Р 2 Р 3 L-arginine Ψ, where Р 2 and Р 3 are amino acids with polar, uncharged radical groups. The substrate is the tetrapeptide L-lysine P 2 P 3 L-arginine (where P 2 is L-asparagine, L-leucine or L-threonine, P 3 is L-lysine or L-glutamine) conjugated to a chromogen (in the particular case it can be paranitroanilide or aminomethylcoumarin), the optical density of which lies within the operating ranges of existing spectrometers and colorimeters and fluorimeters. So, for М1сгор1а1е Кеабег тобе1 680 manufactured by Vyu-Kab, He / .Yu5 A1prya produced by Tyegto8res1gopgs can be used as chromogen paranitroanilide with an absorption range of 405-415 nm.

Хепсин в активной форме обладает способностью гидролизовать связь между пептидной частью субстрата и хромогенной, в результате чего происходит высвобождение свободного хромогена в раствор и окрашивание раствора, с интенсивностью, пропорциональной величине активности фермента, что позволяет определять скорость реакции и на ее основе судить об активности хепсина.Hepsin in the active form has the ability to hydrolyze the bond between the peptide part of the substrate and the chromogenic, resulting in the release of free chromogen into the solution and staining of the solution, with an intensity proportional to the activity of the enzyme, which allows you to determine the reaction rate and on its basis to judge the activity of hepsin.

При проведении эксперимента в качестве биоматериала для проведения анализа были использованы образцы мочи от мужчин с подозрением на рак предстательной железы, полученной сразу после проведения процедуры ректального массажа предстательной железы. Отбор образцов мочи осуществляли после ректального массажа предстательной железы, проводимого с перерывами длительностью 1-2 мин после каждого сеанса, с общей длительностью массажа от 3 до 15 мин. В результате проведенных экспериментов было показано, что при анализе ПСА у больных с нарушениями функций предстательной железы и здоровых доноров не существует достоверных различий между всеми подгруппами и группой контроля. При анализе активности хепсина в разных группах больных было показано, что активность хепсина в группе пациентов с РПЖ достоверно отличается от таковой в группе с аденомой простаты и хроническим простатитом и группе контроля. Значения активности хепсина, определяющие пределы различий между нормой и патологией, были получены на основе данных, приведенных в таблице. При статистической обработке результатов были исключены крайние значения во всех анализируемых группах. Результаты проведенных исследований подтверждают, что использование хепсина для диагностики патологий предстательной железы позволяет с высокой степенью достоверности отличить рак предстательной железы от аденомы предстательной железы и хронического простатита и случаев отсутствия патологии.During the experiment, urine samples from men with suspected prostate cancer obtained immediately after the procedure of rectal massage of the prostate were used as biomaterial for the analysis. Urine samples were taken after rectal massage of the prostate gland, carried out with interruptions of 1-2 minutes after each session, with a total massage duration of 3 to 15 minutes. As a result of the experiments, it was shown that in the analysis of PSA in patients with impaired prostate function and healthy donors, there are no significant differences between all subgroups and the control group. When analyzing hepsin activity in different groups of patients, it was shown that hepsin activity in the group of patients with prostate cancer is significantly different from that in the group with prostate adenoma and chronic prostatitis and the control group. Hepsin activity values, which determine the limits of differences between the norm and pathology, were obtained on the basis of the data given in the table. During statistical processing of the results, extreme values in all analyzed groups were excluded. The results of the studies confirm that the use of hepsin for the diagnosis of prostate pathologies makes it possible to distinguish prostate cancer from prostate adenoma and chronic prostatitis and cases of absence of pathology with a high degree of certainty.

Полученные результаты исследований мочи пациентов с нарушениями функций предстательной железы, свидетельствующие о более высокой достоверности диагностики рака предстательной железы заявляемой тест-системой по определению активности хепсина по сравнению с ИФА диагностикой, основанной на определении ПСА, приведены в таблице.The obtained results of urine tests of patients with impaired prostate function, indicating a higher reliability of prostate cancer diagnosis by the claimed test system for determining hepsin activity compared to ELISA based on PSA determination, are given in the table.

Для обеспечения максимальной сохранности содержащегося в образце хепсина необходимо свести к минимуму манипуляции с образцом мочи, которые потенциально могут приводить к разрушению фермента или потере им активности. Так, образец мочи нельзя охлаждать, а обработку мочи следует осуществлять в день взятия материала.To ensure maximum preservation of hepsin contained in the sample, it is necessary to minimize manipulations with the urine sample, which can potentially lead to destruction of the enzyme or loss of activity. So, a urine sample cannot be cooled, and urine should be treated on the day the material is taken.

Выделение клеточной фракции из образцов мочи включает следующие стадии: осаждение клеток, которое следует проводить в центрифуге с бакет-ротором, и двукратную промывку осадка фосфатносолевым буфером с физиологическим значением рН. При этом следует стараться избавиться от слизи, которая может в дальнейшем мешать проведению анализа, для этого следует четко визуально отделить плотный клеточный осадок от студенистого слизистого и аккуратно отделить последний без остатка пипеткой. К анализу не допускаются осадки мочи, содержащие эритроциты.Isolation of the cell fraction from urine samples includes the following stages: sedimentation of the cells, which should be carried out in a centrifuge with a bucket rotor, and twice washing the precipitate with phosphate-buffered saline buffer with physiological pH value. At the same time, you should try to get rid of the mucus, which may interfere with the analysis, for this purpose, you should clearly visually separate the dense cellular sediment from the gelatinous mucosa and carefully separate the latter without a pipette. Urine sediment containing red blood cells is not allowed for analysis.

- 4 011694- 4 011694

Определение активности хепсина в полученном образце включает, в свою очередь, следующие стадии: обработку клеточной фракции лизирующим раствором; центрифугирование; буферизацию надосадочной жидкости буфером рН от 7,4 до 8,1; добавление субстрата; термостатирование; измерение оптической плотности смеси; расчет активности. В качестве буфера, с учетом способности хепсина в активной форме гидролизовать связь между пептидной и хромогенной частями субстрата, используется 0,1 М трис-имидазол.The determination of hepsin activity in the obtained sample includes, in turn, the following stages: treatment of the cell fraction with a lysis solution; centrifugation; buffering the supernatant with a pH buffer of 7.4 to 8.1; addition of substrate; temperature control; measuring the optical density of the mixture; activity calculation. As a buffer, taking into account the ability of hepsin in active form to hydrolyze the bond between the peptide and chromogenic parts of the substrate, 0.1 M Tris-imidazole is used.

При проведении анализа в качестве отрицательного контроля используется лизирующий раствор клеточной фракции образца мочи, в качестве положительного контроля - рекомбинантный белок хепсин, полученный из депонированного в Российской коллекции микроорганизмов штамм ρΗΡΝΤΜ-Α в следующих условиях:During the analysis, a lysing solution of the cell fraction of the urine sample is used as a negative control, and the recombinant hepsin protein obtained from the ρΗΡΝΤΜ -Α strain deposited in the Russian collection of microorganisms is used as a positive control under the following conditions:

культивируют микроорганизмы штамма ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098) в культуральной среде ЬВ ВгоЛ при температуре от 25 до 37°С и интенсивной аэрации до оптической плотности культуры 0,60-0,80 оптических единиц при длине волны 600 нм;microorganisms of strain ρΗΡΝΤΜ- Α (No. B-10098) are cultured in the culture medium LB VgOL at a temperature of 25 to 37 ° C and intensive aeration to an optical density of the culture of 0.60-0.80 optical units at a wavelength of 600 nm;

добавляют необходимое количество индуктора для запуска синтеза хепсина - ИНТГ (изопропил-βΌ-тиогалактопиранозид) и продолжают культивирование до получения необходимого количества клеток;add the required amount of inducer to start the synthesis of hepsin - INTG (isopropyl-βΌ-thiogalactopyranoside) and continue cultivation until the required number of cells is obtained;

при получении достаточного количества клеток культуральную среду подвергают центрифугированию;upon receipt of a sufficient number of cells, the culture medium is subjected to centrifugation;

ресуспендируют клеточный осадок в трис-имидазольном буфере и лизируют клетки;resuspending the cell pellet in Tris-imidazole buffer and lysing the cells;

отделяют осадок клеточного дебриса центрифугированием;the cell debris precipitate is separated by centrifugation;

супернатант, содержащий целевой белок, инкубируют с ионообменным хроматографическим носителем;the supernatant containing the target protein is incubated with an ion exchange chromatographic carrier;

получают очищенный целевой белок согласно методикам, прилагаемым к данному конкретному хроматографическому носителю;get purified target protein according to the methods attached to this particular chromatographic carrier;

подвергают полученный неактивный зимоген протеолитической активации, для этого инкубируют его с необходимым количеством фермента тромбина в подходящих условиях при достаточном количестве времени. Условия определяются исходя из оптимальных рН, температуры и используемого буфера;subjected to the resulting inactive zymogen proteolytic activation, for this it is incubated with the necessary amount of the thrombin enzyme under suitable conditions with a sufficient amount of time. Conditions are determined based on the optimal pH, temperature, and buffer used;

очищают активированный хепсин от следов присутствия тромбина на хроматографическом носителе согласно прилагаемой к нему методике;purifying activated hepsin from traces of the presence of thrombin on a chromatographic medium according to the procedure attached to it;

проверяют количество и активность полученного белка.check the amount and activity of the obtained protein.

Активность использованной при положительном контроле активной формы сериновой протеазы хепсин, продуцированной из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098) в тест-системе, предназначенной для диагностирования, определяют следующим образом: смешивают контрольный хепсин с субстратом и реакционным буфером; измеряют оптическую плотность Ек полученной смеси с интервалом не менее 10 мин на всем интервале измерения (экспериментальным путем было определено, что достаточным с точки зрения достоверности результатов является интервал измерения длительностью в 60 мин). Затем определяют разность измеренных значений Ек для каждых двух соседних точек интервала измерений; усредняют значения полученных разностей и относят их к временному интервалу измерения, получая АЕк/мин - среднюю скорость изменения оптической плотности Ек контрольного хепсина с добавленными к нему субстратом и реакционным буфером и определяя активность контрольного хепсина в соответствии со следующей зависимостью:The activity of the active form of hepsin serine protease produced from the producer strain ρΗΡΝΤΜ- ΗΡΝΤΜ (No. B-10098) in the test system intended for diagnosis is used for positive control in the test system as follows: control hepsin is mixed with the substrate and reaction buffer; measure the optical density E of the resulting mixture with an interval of at least 10 minutes over the entire measurement interval (it was experimentally determined that a measurement interval of 60 minutes is sufficient from the point of view of reliability of the results). Then determine the difference between the measured values of E to for every two adjacent points of the measurement interval; average the values of the obtained differences and relate them to the time interval of the measurement, obtaining AE k / min — the average rate of change in optical density E of the control hepsin with the substrate and reaction buffer added to it and determining the activity of the control hepsin in accordance with the following dependence:

Ак=(ДЕк/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси контрольного хепсина с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, мл;And k = (DE k / minh Yx 10 6 ) / (Kx V 1 xb), where V is the total volume of the reaction mixture, i.e. mixtures of control hepsin with substrate and reaction buffer added to it, ml;

V1 - объем контрольного хепсина, мл;V 1 - the volume of control hepsin, ml;

К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;K is the millimolar substrate extinction coefficient;

106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;10 6 - conversion factor from mmol to nmol;

Ь - длина оптического пути планшета, см;B is the length of the optical path of the tablet, cm;

ДЕк/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин.DE k / min - the average rate of change in optical density in 1 min, optical units / min.

Затем сравнивают полученное в тест-системе значение активности Ак с эталонным Аэ, нанесенным на флакон с контрольным образцом, содержащим контрольный хепсин, полученный из штаммапродуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098), и предназначенным для суждения о качестве постановки реакции.Then, the activity value A k obtained in the test system is compared with a reference A e deposited on a bottle with a control sample containing control hepsin obtained from the producer strain ρΗΡΝΤΜ -Α (No. B-10098) and intended to judge the quality of the reaction.

Конкретный пример выполнения тест-системы содержит набор реагентов «Фото-Хепсин» и предназначен для количественного определения ферментативной активности белка-маркера рака предстательной железы сериновой протеазы хепсин в биологическом материале, полученном неинвазивным путем (в моче, полученной после ректального массажа предстательной железы).A specific example of the test system contains a set of reagents "Photo-Hepsin" and is intended for the quantitative determination of the enzymatic activity of the marker protein of prostate cancer of the serine protease hepsin in biological material obtained non-invasively (in urine obtained after rectal massage of the prostate gland).

Набор «Фото-Хепсин» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 45 неизвестных и 6 контрольных проб и одной пробы для определения оптической плотности буферного лизирующего раствора при использовании всех стрипов одновременно.The “Photo-Hepsin” kit is designed for analysis in duplicates of 45 unknown and 6 control samples and one sample to determine the optical density of the buffer lyse solution using all strips simultaneously.

В наборе «Фото-хепсин» использован колориметрический метод определения кинетической активности фермента. Для реализации этого варианта использованы лизис-буфер для подготовки к исследованию образцов мочи, буферизующий раствор, субстрат хепсина. В лунках при смешивании исследуемогоThe Color Hepsin kit uses a colorimetric method for determining the kinetic activity of the enzyme. To implement this option, lysis buffer was used to prepare urine samples, a buffering solution, and hepsin substrate for the study. In the wells when mixing the test

- 5 011694 образца, буферного раствора и раствора субстрата во время инкубации происходит расщепление связи между Ь-аргинин субстрата и его хромогенной частью и в результате этого - окрашивание раствора, интенсивность которого пропорциональна активности фермента хепсина. После измерения оптической плотности раствора в лунках активность фермента (А) в определяемых образцах рассчитывается по приведенной выше формуле.- 5 011694 of the sample, buffer solution and substrate solution during incubation, the bond between the b-arginine of the substrate and its chromogenic part is cleaved and, as a result, the solution is stained, the intensity of which is proportional to the activity of the hepsin enzyme. After measuring the optical density of the solution in the wells, the activity of the enzyme (A) in the determined samples is calculated according to the above formula.

Тест-система включает в себя комплект из 12 восьмилуночных стрипов в рамке, контрольную пробу на основе рекомбинантного белка хепсин, полученного из штаммов-продуцентов, содержащую фермент с известной активностью (Аэ указана на этикетках флакона), лиофилизированный субстрат хепсина, лизис-буфер для обработки осадков мочи, трис-имидазольный буфер для буферизации исследуемых образцов, навеску фосфатно-солевого буфера для обработки осадков мочи, навеску ингибиторов протеаз для обработки осадков мочи, спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 405 нм, одноканальные пипетки с изменяемым объемом отбора жидкостей, восьмиканальную пипетку, прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание с амплитудой колебаний 0,5 мм и частотой 9-18 Гц при комнатной температуре 18-25°С; термостат, поддерживающий температуру 37±1°С; холодильник бытовой с морозильной камерой на -20°С; центрифугу лабораторную с бакетротором, позволяющую центрифугировать пробы мочи объемом 50 мл с ускорением 500 д; центрифугу настольную, позволяющую центрифугировать пластиковые пробирки объемом 1,5 мл при скорости 1500 об/мин; встряхиватель пробирок типа Уойсх; мерные цилиндры; стаканы стеклянные; пластиковые пробирки; деионизированную воду; перчатки защитные медицинские.The test system includes a set of 12 vosmilunochnyh strips in frame, a control sample based on a recombinant protein hepsin obtained from producer strains containing the enzyme with known activity (A e on the label), the lyophilized substrate hepsin, lysis buffer treatment of urine sediment, Tris-imidazole buffer for buffering test samples, a sample of phosphate-saline buffer for processing urine sediment, a sample of protease inhibitors for processing urine sediment, a vertical scan spectrophotometer This allows measuring the optical density of a solution in strips at a wavelength of 405 nm, single-channel pipettes with a variable volume of liquid withdrawal, an eight-channel pipette, a device for shaking a frame with strips (a thermostatically controlled shaker), which allows shaking with a vibration amplitude of 0.5 mm and a frequency of 9 -18 Hz at room temperature 18-25 ° C; a thermostat maintaining a temperature of 37 ± 1 ° C; household refrigerator with a freezer at -20 ° C; laboratory centrifuge with a bucket rotor, which allows centrifuging urine samples of 50 ml with an acceleration of 500 d; desktop centrifuge, allowing centrifugation of plastic tubes with a volume of 1.5 ml at a speed of 1500 rpm; Woysh type tube shaker; measuring cylinders; glass glasses; plastic test tubes; deionized water; medical protective gloves.

Специфичность анализа составляет 100%, что обусловлено специфичностью расщепления хепсином связи пептид-хромоген в используемом искусственном субстрате.The specificity of the analysis is 100%, which is due to the specificity of hepsin cleavage of the peptide-chromogen bond in the used artificial substrate.

Чувствительность набора: минимальная достоверно определяемая набором активность хепсина в лизате мочи человека не превышает 0,05 нмоль/л-мин.Set sensitivity: the minimum activity of hepsin in the urine lysate of a person reliably determined by the set does not exceed 0.05 nmol / l-min.

Точность: данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие». Процент открытия составляет 90-110%.Accuracy: This analytical parameter is checked by the “discovery” test. The opening percentage is 90-110%.

Линейность: зависимость активности хепсина в лизатах мочи с учетом фактора разведения мочи имеет линейный характер в диапазоне активностей 0,11-5,5 нмоль/л-мин и составляет 90-110%.Linearity: the dependence of hepsin activity in urine lysates, taking into account the urine dilution factor, is linear in the range of activities 0.11-5.5 nmol / l-min and is 90-110%.

Воспроизводимость: коэффициент вариации результатов определения хепсина в одном и том же образце лизата мочи с использованием набора не превышает 8%.Reproducibility: the coefficient of variation of the results of the determination of hepsin in the same urine lysate sample using the kit does not exceed 8%.

Диапазон значений активности хепсина 0-0,17 нмоль/л-мин был определен как нормальный, суждение о наличии процесса, обусловливающего раннее развитие патологии предстательной железы, выносится при значении активности хепсина 0,175-0,25 нмоль/л-мин; суждение о наличии средней степени развития патологии предстательной железы выносится при значении активности хепсина 0,25-0,9 нмоль/л-мин; суждение о наличии злокачественных опухолей простаты выносится при значениях активности хепсина 0,9-5,0 нмоль/л-мин и выше.The range of hepsin activity values of 0-0.17 nmol / l-min was determined as normal, the judgment about the presence of a process that determines the early development of prostate pathology is made when the value of hepsin activity is 0.175-0.25 nmol / l-min; a judgment on the presence of an average degree of development of prostate pathology is made with a hepsin activity value of 0.25-0.9 nmol / l-min; Judgment of the presence of malignant tumors of the prostate is made with values of hepsin activity of 0.9-5.0 nmol / l-min and higher.

При использовании тест-системы рекомендуется уточнить значения активности хепсина, соответствующие нормальным, для популяции в данной конкретной местности.When using the test system, it is recommended to clarify the values of hepsin activity that are normal for the population in this particular area.

Все реагенты перед проведением анализа подготавливаются согласно инструкции и доводятся до комнатной температуры, лунки маркируются в соответствии с их назначением - для измерения величины оптической плотности буферного раствора, для контрольных проб, для образцов. Во все лунки вносится буферный раствор. В лунки соответственно маркировке вносятся исследуемые пробы и контрольные образцы. Во все лунки, кроме предназначенных для измерения величины оптической плотности буферного раствора, вносится раствор субстрата. Пробы перемешивают на шейкере для планшетов и определяют на вертикальном спектрофотометре оптическую плотность при 405 нм (Е0), используя в качестве ячейки сравнения бланк. Если для какого-либо лизата мочи Е0 превышает оптическую плотность 1,0, образец следует развести в 10 раз. Пробы инкубируют в термостате при 37°С в течение 10 мин, измеряют оптическую плотность на спектрофотометре при 405 нм (Е10), вновь ставят в термостат на 10 мин и затем измеряют оптическую плотность (Е20). Из значений оптических плотностей остальных лунок вычитаются значения, полученные для лунок, предназначенных для измерения величины оптической плотности буферного раствора. Значение активности хепсина подсчитывается по приведенной выше формуле. На основании значения активности выносят суждение о наличии незлокачественных урологических заболеваний или опухоли простаты.All reagents before analysis are prepared according to the instructions and brought to room temperature, the wells are labeled in accordance with their purpose - to measure the optical density of the buffer solution, for control samples, for samples. Buffer solution is added to all wells. Test wells and control samples are introduced into the wells according to the marking. In all wells, except for those designed to measure the optical density of the buffer solution, a substrate solution is introduced. The samples are mixed on a shaker for tablets and the optical density is determined on a vertical spectrophotometer at 405 nm (E 0 ) using a blank as a comparison cell. If for any urinary lysate E 0 exceeds the optical density of 1.0, the sample should be diluted 10 times. Samples are incubated in a thermostat at 37 ° C for 10 min, the optical density is measured on a spectrophotometer at 405 nm (E 10 ), re-placed in a thermostat for 10 min, and then the optical density (E 20 ) is measured. From the optical densities of the remaining wells, the values obtained for the wells designed to measure the optical density of the buffer solution are subtracted. The value of hepsin activity is calculated according to the above formula. Based on the value of the activity, a judgment is made about the presence of non-malignant urological diseases or prostate tumors.

Пример осуществления способа диагностики рака предстательной железы с использованием тестсистемы.An example implementation of a method for diagnosing prostate cancer using a test system.

Получают образцы мочи от мужчин с подозрением на рак предстательной железы.Urine samples are obtained from men with suspected prostate cancer.

Центрифугируют образцы мочи при 450-500 д в течение 15-20 мин при комнатной температуре; удаляют супернатант; промывают осадок фосфатно-солевым буфером физиологического рН (использовали ФСБ фирмы Пан-Эко); повторно центрифугируют образцы и повторяют процедуру отмывки; полностью удаляют надосадочную жидкость.Urine samples are centrifuged at 450-500 d for 15-20 minutes at room temperature; remove the supernatant; wash the precipitate with phosphate-saline buffer of physiological pH (used FSB company Pan-Eco); re-centrifuge the samples and repeat the washing procedure; completely remove the supernatant.

- 6 011694- 6 011694

К осадку, содержащему клетки предстательной железы, добавляют лизирующий раствор (использовали ΚΙΡΑ буфер фирмы Р1егсе) до объема 0,5 мл, интенсивно перемешивают (на встряхивателе типа Уойех) при комнатной температуре и оставляют в ледяной бане на 20 мин. Подготовленный лизат мочи замораживают при -20°С. Для проведения анализа лизаты мочи размораживают при комнатной температуре и центрифугируют. Надосадочную жидкость используют для определения активности фермента хепсин.A lysing solution (used P1egse buffer) was added to the sediment containing prostate cells to a volume of 0.5 ml, stirred vigorously (on a Wueheh shaker) at room temperature and left in an ice bath for 20 minutes. The prepared urine lysate is frozen at -20 ° C. For analysis, urine lysates are thawed at room temperature and centrifuged. The supernatant is used to determine the activity of the hepsin enzyme.

Процедура определения активности состоит из следующих этапов.The activity determination procedure consists of the following steps.

Из полистирольного 96-луночного планшета извлекают необходимое количество стрипов для проведения анализа.From the polystyrene 96-well plate, the required number of strips is removed for analysis.

В лунки планшета вносят по 30 мкл трис-имидазольного буфера рН 8,3, затем по 250 мкл раствора контрольного рекомбинантного белка с известной активностью и исследуемых лизатов мочи в повторах. В качестве раствора сравнения используют 250 мкл лизирующего раствора. Затем вносят в каждую лунку раствор субстрата, пробы перемешивают на шейкере для планшетов и определяют на вертикальном спектрофотометре оптическую плотность Е0 при длине волны 405 нм, используя в качестве ячейки сравнения ячейку с раствором сравнения. Если для какого-либо лизата мочи оптическая плотность Е0 превышает 1,0, такой образец следует развести в 10 раз, а результат в последующем умножить на 10.30 μl of Tris-imidazole buffer pH 8.3 are added to the wells of the tablet, then 250 μl of a solution of the control recombinant protein with known activity and the urine lysates tested are repeated. As a comparison solution, 250 μl of lysis solution is used. Then, a substrate solution is introduced into each well, the samples are mixed on a plate shaker and the optical density E 0 is determined on a vertical spectrophotometer at a wavelength of 405 nm using a cell with a comparison solution as a comparison cell. If for any urine lysate the optical density E 0 exceeds 1.0, such a sample should be diluted 10 times, and the result subsequently multiplied by 10.

Пробы инкубируют в термостате при 37°С в течение 10 мин, измеряют оптическую плотность Е10 при тех же условиях, вновь ставят в термостат на 10 мин и затем измеряют оптическую плотность Е20.Samples are incubated in a thermostat at 37 ° C for 10 min, the absorbance E 10 is measured under the same conditions, put back into the thermostat for 10 min, and then the absorbance E20 is measured.

Активность хепсина (А) в нмоль/л-ч рассчитывают по формуле А0=(ЛЕ0/минх Ух 106)/(Кх V1 хй), где ЛЕд/мин - среднее изменение оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин;The activity of hepsin (A) in nmol / l-h is calculated by the formula A 0 = (LU 0 / minx Ux 10 6 ) / (Kx V 1 xy), where Led / min is the average change in optical density over 1 min, optical units / min;

V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси клеточного лизата мочи с добавленными к нему субстратом и буфером, мл;V is the total volume of the reaction mixture, i.e. a mixture of urine cell lysate with a substrate and buffer added to it, ml;

VI - объем клеточного лизата мочи, мл;V I - the volume of the cell lysate of urine, ml;

К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;K is the millimolar substrate extinction coefficient;

106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;10 6 - conversion factor from mmol to nmol;

Ь - длина оптического пути планшета, см.B is the length of the optical path of the tablet, see

Значения измеренной активности хепсина в лизате делят на фактор концентрирования мочи (200) и получают конечную активность хепсина в исследуемом образце мочи.The values of the measured hepsin activity in the lysate are divided by the urine concentration factor (200) and the final hepsin activity in the test urine sample is obtained.

Список источниковList of sources

1. Н.С. Сергеева, И.Г. Русаков, М.П. Мишунина, Н.В. Маршутина и др. «Роль простатспецифического антигена в диагностике и мониторинге больных раком предстательной железы». Пособие для врачей. М., 2000.1. N.S. Sergeeva I.G. Rusakov, M.P. Mishunina, N.V. Marshutina et al. “The role of prostate-specific antigen in the diagnosis and monitoring of patients with prostate cancer.” Manual for doctors. M., 2000.

2. Вапдша С.Н., Кгапке К., В1уепЬегд В.6. е! а1.//Иго1оду. - 1995, νοί. 46, р. 779-784.2. Vapdsha S.N., Kgapke K., Bljepbegd B. 6. e! A1 .// Igo1odu. - 1995, νοί. 46, p. 779-784.

3. Ыо1бик 1., 81ашеу Т.Л.//Е Иго1. - 1996, νοί. 155, № 2, р. 441-443.3. Yo1bik 1., 81acheu T.L.// E Igo1. - 1996, νοί. 155, No. 2, p. 441-443.

4. ^1г1й М.Р., Егоксйегшайег 8.Е.//Иго1. Кек. - 1997, νοί. 25, кирр1. 2, р. 67-71.4. ^ 1g1y M.R., Egoksjegszayeg 8.E.// Igo1. Kek. - 1997, νοί. 25, kirr 1. 2, p. 67-71.

5. ^ййегкрооп Ь.К., Ьареуго1епе Т.У./Е Иго1. - 1997, νοί. 157, р. 1322-1328.5. ^ yyegkroop L.K., Lareugue P.E.U./E Igo1. - 1997, νοί. 157, p. 1322-1328.

- 7 011694- 7 011694

Сравнительное определение активности хепсина и концентрации ПСА в биологическом материале пациентов с нарушениями функций предстательной железы и здоровых доноровComparative determination of hepsin activity and PSA concentration in the biological material of patients with impaired prostate function and healthy donors

Номер пациента Patient Number Возраст Age Активность хепснна (нмоль/л*мнн) Hepsn activity (nmol / l * mnn) ПСА (нг/мл) PSA (ng / ml) Здоровые доноры Healthy donors Пациенты с аденомой простаты и хроническим простатитом Patients with Prostate Adenoma and Chronic Prostatitis Пациенты с раком предстательной железы Prostate cancer patients РПЖ/нормалъное значение PCa / normal value 1 one 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 7 7 22 22 86 86 4484 4484 ΰθ ΰθ 75 75 7 7 76 76 0,19 0.19 73 73 45 45 64 64 0,69 0.69 65 65 34 34 70 70 0,138 0.138 18 eighteen 23 23 69 69 137 137 4,7 раз 4.7 times 16,44 16,44 33 33 67 67 0,028 0,028 14,4 14,4 5 5 68 68 0,94 0.94 3,4 раз 3.4 times 14,1 14.1 29 29th 64 64 1,174 1,174 4,3 раз 4.3 times 14,4 14,4 44 44 38 38 0,138 0.138 12 12 24 24 70 70 4007 4007 11,51 11.51 36 36 64 64 0,207 0,207 11,2 11.2 43 43 54 54 0,276 0.276 10,8 10.8 52 52 66 66 0,207 0,207 9,5 9.5 51 51 62 62 0,967 0.967 9,3 9.3 48 48 58 58 0,345 0.345 8,1 8.1 50 fifty 57 57 0,622 0.622 7,9 7.9 1 one 60 60 0,3 0.3 7,09 7.09 46 46 61 61 0,415 0.415 6,8 6.8 8 8 72 72 0,25 0.25 6,8 6.8 9 nine 63 63 0,44 0.44 1,6 раз 1.6 times 5,6 5,6 10 10 65 65 0,14 0.14 4,95 4.95 42 42 51 51 0,622 0.622 4,4 4.4 12 12 83 83 0,12 0.12 43 43 27 27 60 60 0,22 0.22 3,9 3.9 II II 61 61 0,1 0.1 3,6 3.6 35 35 62 62 11,054 11,054 40,5 раз 40.5 times 3,6 3.6 21 21 48 48 0,21 0.21 3,5 3,5 37 37 69 69 2,27 2.27 8,3 раз 8.3 times 3,1 3,1 26 26 45 45 0,25 0.25 2,85 2.85 47 47 67 67 0,138 0.138 2,2 2.2 32 32 62 62 1313 1313 4,8 раз 4.8 times 2,1 2.1 28 28 41 41 0,028 0,028 2,1 2.1 49 49 36 36 0,345 0.345 2,1 2.1 14 14 18 eighteen 0,16 0.16 1,7 1.7 13 thirteen 18 eighteen 0,11 0.11 1,5 1,5 17 17 18 eighteen 0,14 0.14 1,1 1,1 19 nineteen 32 32 0,21 0.21 03 03 15 fifteen 19 nineteen 0,17 0.17 0,2 0.2 2 2 54 54 432 432 15,824 раз 15,824 times 0,05 0.05 Средние значения Averages 0,181 0.181 0,273 0.273 2,848 2,848

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM

Claims (11)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯCLAIM 1. Тест-система для диагностики рака предстательной железы, характеризующаяся веществом для проверки качества реакции, буфером, планшетным фотометром с планшетами с постоянной длиной оптического пути Ь, холодильной установкой и центрифугой, отличающаяся тем, что в качестве вещества для проверки качества реакции используют рекомбинантный белок хепсин, в качестве субстрата используют вещество, выбираемое из группы веществ, обладающих способностью расщепляться активной формой сериновой протеазы хепсин.1. Test system for the diagnosis of prostate cancer, characterized by a substance for testing the quality of the reaction, a buffer, a tablet photometer with tablets with a constant optical path length b, a refrigeration unit and a centrifuge, characterized in that a recombinant protein is used as a substance for testing the quality of the reaction Hepsin; a substance selected from the group of substances with the ability to be broken down by the active form of the serine protease hepsin is used as a substrate. 2. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве субстрата в ней используют тетрапептид Ь-лизин Р2Р3 Ь-аргинин, где Р2 - Ь-аспарагин, или Ь-лейцин, или Ь-треонин; Р3 - Ь-лизин или Ь-глутамин, коньюгированный с хромогеном.2. The test system according to claim 1, characterized in that as a substrate it uses tetrapeptide L-lysine P 2 P 3 L-arginine, where P 2 is L-asparagine, or L-leucine, or L-threonine; P 3 - L-lysine or L-glutamine conjugated to the chromogen. 3. Тест-система по п.2, отличающаяся тем, что в качестве хромогена в ней используют паранитроанилид или аминометилкумарин.3. The test system according to claim 2, characterized in that paranitroanilide or aminomethylcoumarin is used as the chromogen in it. 4. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве буфера в ней используют 0,1 М трисимидазол.4. The test system according to claim 1, characterized in that it uses 0.1 M trisimidazole as a buffer. 5. Тест-система по п.1, отличающаяся тем, что в качестве рекомбинантного белка хепсин в ней используют рекомбинантный белок хепсин, продуцированный из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α 5. The test system according to claim 1, characterized in that recombinant hepsin protein produced from the producer strain ρΗΡΝΤΜ -Α is used as a recombinant hepsin protein . 6. Способ диагностики рака предстательной железы, включающий добавление к образцу биологического материала пациента буфер; измерение оптической плотности смеси образца биологического материала с буфером; измерение оптической плотности вещества для проверки качества реакции и сравнение ее с эталонной; отбраковку результатов измерений оптической плотности смеси образца биологического материала с буфером как недостоверных при отклонении результата измерения оптической плотности вещества для проверки качества реакции от эталонного вышедопустимых значений; суждение по достоверным результатам измерений оптической плотности смеси образца биологического материала с буфером о наличии патологии предстательной железы, отличающийся тем, что в качестве образца биологического материала используют образец мочи, в качестве вещества для проверки качества реакции используют рекомбинантный белок хепсин, а в качестве параметра, по которому судят о патологии предстательной железы, - активность рекомбинантного белка хепсин, пропорциональную скорости изменения его оптической плотности в смеси, содержащей обработанный образец мочи, субстрат и буфер, при этом проверку качества реакции осуществляют по результатам измерения активности контрольного хепсина, пропорциональной ДЕк/мин средней скорости изменения оптической плотности Ек контрольного хепсина с добавленными к нему субстратом и реакционным буфером, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина, определяя активность контрольного хепсина в соответствии со следующей зависимостью:6. A method for diagnosing prostate cancer, comprising adding buffer to a patient’s sample of biological material; measurement of the optical density of the mixture of a sample of biological material with a buffer; measurement of the optical density of the substance to test the quality of the reaction and comparing it with the reference; rejection of measurements of the optical density of a mixture of a sample of a biological material with a buffer as unreliable when the result of measurement of the optical density of a substance is rejected to check the quality of the reaction from the reference acceptable values Judging by reliable results of measuring the optical density of a mixture of a sample of a biological material with a buffer on the presence of prostate gland pathology, characterized in that a sample of urine is used as a sample of biological material, recombinant hepsin protein is used as a substance to check the quality of the reaction, and which is judged on the pathology of the prostate gland, the activity of recombinant hepsin protein, proportional to the rate of change of its optical density in a mixture, contains boiling the treated urine sample, substrate and buffer, wherein by the reaction of quality is carried out by measuring the control hepsin activity proportional DE K / min average absorbance change rate E to a control hepsin with added thereto a substrate, and reaction buffer, to a reference activity A e control hepsin, determining the activity of the control hepsin in accordance with the following dependency: Ак=(ДЕк/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси контрольного хепсина с добавленными в него субстратом и реакционным буфером, мл;A k = (DE k / min x Yx 10 6 ) / (Kx V 1 xb), where V is the total volume of the reaction mixture, i.e. mixtures of control hepsin with substrate and reaction buffer added to it, ml; V1 - объем контрольного хепсина, мл;V 1 - the volume of control hepsin, ml; К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;K - millimolar extinction coefficient of the substrate; 106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;10 6 - conversion factor from mmol to nmol; Ь - длина оптического пути планшета, см;B is the length of the optical path of the tablet, cm; ДЕк/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин; для чего смешивают контрольный хепсин с субстратом и реакционным буфером, измеряют оптическую плотность Ек полученной смеси с интервалом не менее 10 мин, определяют разность измеренных значений Ек для каждых двух соседних точек интервала измерений, усредняют значения полученных разностей и относят их к временному интервалу измерения, определяют среднюю скорость в единицу времени ДЕо/мин изменения оптической плотности смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером в тех же условиях и с той же частотой по времени, что и ДЕк/мин, на основании измерений оптической плотности Е0 смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером, определяют активность А0 смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером из следующей зависимости:DE K / min - average rate of optical density change per 1 minute, optical units / minute; why mix control heppsin with the substrate and the reaction buffer, measure the optical density Ek of the resulting mixture with an interval of at least 10 minutes, determine the difference between the measured values of E k for every two adjacent points of the measurement interval, average the values of the differences obtained and relate them to the time interval of measurement, determine the average rate per unit time of the DEO / min change in the optical density of the mixture of cell lysate obtained from a urine sample, with the substrate and the reaction buffer under the same conditions and with the same time totoy time that DE K / min based on the measurements of the optical density E 0 mixture of cell lysate prepared from a sample of urine, with a substrate, and reaction buffer, determine Activity A 0 mixture of cell lysate prepared from a sample of urine, with a substrate and the reaction buffer from the following dependency: А0=(ДЕ0/минх Ух 106)/(Кх V1 хЬ), где V - общий объем реакционной смеси, т.е. смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, с субстратом и реакционным буфером, мл;A 0 = (DE 0 / min x Yx 10 6 ) / (Kx V 1 xb), where V is the total volume of the reaction mixture, i.e. a mixture of cell lysate obtained from a urine sample, with a substrate and reaction buffer, ml; V1 - объем смеси клеточного лизата, полученного из образца мочи, мл;V 1 - the volume of the mixture of cell lysate obtained from a sample of urine, ml; К - миллимолярный коэффициент экстинкции субстрата;K - millimolar extinction coefficient of the substrate; 106 - коэффициент пересчета из ммоль в нмоль;10 6 - conversion factor from mmol to nmol; Ь - длина оптического пути планшета, см;B is the length of the optical path of the tablet, cm; ДЕ0/мин - средняя скорость изменения оптической плотности за 1 мин, оптические единицы/мин; сравнивают активность Ак контрольного хепсина в тест-системе, предназначенной для диагностирования, с эталонной активностью Аэ контрольного хепсина при значении Ак, отличающемся от Аэ более чем на 10% в сторону уменьшения или увеличения; исключают полученные значения А0 из числа результатов анализов, на основе которых проводится диагностирование, для значений А0, полученных при допустимых отклонениях Ак от Аэ; суждение о наличии рака предстательной железы по полученному достоверному значению А0 выносится при значениях А0, больших или равных 0,9 нмоль/л-мин.DE0 / min - the average rate of change in optical density for 1 min, optical units / min; compare the activity of AK control hepsin in the test system intended for diagnosis, with the reference activity of the Ae control hepsin when the value of AK, different from Ae by more than 10% in the direction of decrease or increase; exclude the obtained values of A 0 from the number of test results, on the basis of which the diagnosis is carried out, for the values of A 0 obtained with permissible deviations A k from A e ; A judgment on the presence of prostate cancer based on the obtained reliable value of A 0 is made at A 0 values greater than or equal to 0.9 nmol / l-min. 7. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что при значениях А0, меньших или равных 0,17 нмоль/л-мин, выносится суждение об отсутствии патологии в предстательной железе.7. A method for diagnosing prostate cancer according to claim 6, characterized in that for values of A 0 less than or equal to 0.17 nmol / l-min, a judgment is made that there is no pathology in the prostate gland. 8. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что при значениях А0, находяшихся в пределах значений 0,175-0,25 нмоль/л-мин, выносится суждение о начальной стадии процесса патологии в предстательной железе.8. A method for diagnosing prostate cancer according to claim 6, characterized in that when the values of A 0 are in the range of values of 0.175-0.25 nmol / l-min, a judgment is made about the initial stage of the process of pathology in the prostate gland. - 8 011694 (№ В-10098) при помощи химической индукции с последующей очисткой на аффинном хроматографическом носителе.- 8 011694 (№ В-10098) using chemical induction followed by purification on affinity chromatographic carrier. - 9 011694- 9 011694 9. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что при значениях А0, находящихся в пределах значений от 0,25 нмоль/л-мин и включая 0,9 нмоль/л-мин, выносится суждение о средней стадии процесса патологии в предстательной железе.9. A method for diagnosing prostate cancer according to claim 6, characterized in that when values of A0 are in the range of values from 0.25 nmol / l-min and including 0.9 nmol / l-min, a judgment is made about the average stage of the process pathology in the prostate gland. 10. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что отбор образцов мочи осуществляют после ректального массажа предстательной железы, проводимого с перерывами длительностью 1-2 мин после каждого сеанса, с общей длительностью массажа от 3 до 15 мин.10. A method for diagnosing prostate cancer according to claim 6, characterized in that the sampling of urine is carried out after rectal massage of the prostate gland, held at intervals of 1-2 minutes after each session, with a total duration of massage from 3 to 15 minutes 11. Способ диагностирования рака предстательной железы по п.6, отличающийся тем, что активную форму сериновой протеазы хепсин получают из штамма-продуцента ρΗΡΝΤΜ-Α (№ В-10098) в культуральной среде ЬВ Вго1й при значениях температуры от 25 до 37°С и интенсивной аэрации до достижения культурой оптической плотности 0,60-0,80 оптических единиц при длине волны 600 нм; с добавлением индуктора запуска синтеза хепсина - ИПТГ (изопропил-в-Э-тиогалактопиранозид), до конечной концентрации от 0,04 до 1 ммоль, после получения достаточного количества клеток отделяют их центрифугированием от культуральной среды, затем ресуспендируют клеточный осадок, лизируют клетки, отделяют осадок клеточного дебриса, супернатант, содержащий целевой белок, инкубируют с ионообменным носителем в течение времени, достаточного для иммобилизации белка на носителе (от 1 до 12 ч), полученный из очищенного целевого белка неактивный зимоген подвергают протеолитической активации путем его инкубации с ферментом, тромбином, очищают активированный хепсин от следов присутствия фермента.11. A method for diagnosing prostate cancer according to claim 6, characterized in that the active form of the serine protease hepsin is obtained from the producer strain ρΗΡΝΤΜ -Α (No. B-10098) in the culture medium bB Bgoy at temperatures between 25 and 37 ° C and intensive aeration until the culture reaches an optical density of 0.60-0.80 optical units at a wavelength of 600 nm; with the addition of the inducer of the hepsin synthesis initiation - IPTG (isopropyl-in-E-thiogalactopyranoside), to a final concentration of 0.04 to 1 mmol, after obtaining a sufficient number of cells, they are separated by centrifugation from the culture medium, then the cells are resuspended, the cells are lysed, separated Cellular debris pellet, the supernatant containing the target protein, is incubated with an ion exchange carrier for a time sufficient to immobilize the protein on the carrier (1 to 12 hours), obtained from the purified target protein inactive zymog The ene is subjected to proteolytic activation by incubating it with the enzyme, thrombin, and the activated hepsin is purified from traces of the presence of the enzyme.
EA200801822A 2008-06-19 2008-06-19 TEST SYSTEM FOR DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER AND METHOD OF DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER EA200801822A1 (en)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200801822A EA200801822A1 (en) 2008-06-19 2008-06-19 TEST SYSTEM FOR DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER AND METHOD OF DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER
PCT/RU2009/000288 WO2009154510A1 (en) 2008-06-19 2009-06-05 Test-system for diagnosing prostate cancer and a prostate cancer diagnosis method

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EA200801822A EA200801822A1 (en) 2008-06-19 2008-06-19 TEST SYSTEM FOR DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER AND METHOD OF DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA011694B1 true EA011694B1 (en) 2009-04-28
EA200801822A1 EA200801822A1 (en) 2009-04-28

Family

ID=40852078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA200801822A EA200801822A1 (en) 2008-06-19 2008-06-19 TEST SYSTEM FOR DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER AND METHOD OF DIAGNOSTIC PROSTATE CANCER

Country Status (2)

Country Link
EA (1) EA200801822A1 (en)
WO (1) WO2009154510A1 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3431490B1 (en) * 2017-07-17 2020-03-11 Uniwersytet Gdanski Chemical compounds for use as diagnostic markers of inflammation and neoplams, the method for synthesis of the chemical compounds, diagnostic kit for use in diagnosis of inflammatory processes and epithelial neoplasms and in vitro diagnostic method of inflammatory processes and epithelial neoplasms
PL236125B1 (en) * 2018-07-14 2020-12-14 Univ Gdanski Chemical compounds used as diagnostic markers of inflammation and cancer, method of their preparation, diagnostic kit and method of diagnosing inflammatory processes and epithelial cancers

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049645A1 (en) * 2001-02-14 2003-03-13 David Mu Amplified cancer gene hepsin
AU2003225540A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-02 Irm, Llc Hepsin substrates and prodrugs

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2005308594A1 (en) * 2004-11-24 2006-06-01 St George's Enterprises Limited Diagnosis of prostate cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030049645A1 (en) * 2001-02-14 2003-03-13 David Mu Amplified cancer gene hepsin
AU2003225540A1 (en) * 2002-01-31 2003-09-02 Irm, Llc Hepsin substrates and prodrugs

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Jian-Ai Xuan et al. Antibodies neutralizing hepsin protease activity do not impact cell growth but inhibit invasion of prostate and ovarian tumor cells in culture. Cancer Res. 2006; 66: (7). April 1, 2006, p. 3611-3612, abstract *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2009154510A1 (en) 2009-12-23
EA200801822A1 (en) 2009-04-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US7361474B2 (en) Serum macrophage migration inhibitory factor (MIF) as marker for prostate cancer
US20110306035A1 (en) Methods and Compositions for Detection of a Pathogen, Disease, Medical Condition, or Biomarker Thereof
US20070254317A1 (en) Method for Detecting the Activatable Free Form of Psa and the Use Thereof for Diagnosing Benign Pathologies of the Prostate and Adenocarcinoma of the Prostate
ES2366043T3 (en) PROCEDURE FOR IMMUNOLOGALLY ANALYZING THE PRODUCT OF THE PLASMINE DEGRADATION OF THE STABILIZED FIBRINE.
CN104111335A (en) Latex enhanced immunoturbidimetry assay kit for pepsinogen I/II
EP1774327A2 (en) Methods and kits for measuring adamts13/fxi complexes
US20070065893A1 (en) Liquid-phase galactose oxidase-schiff's assay
JP4814788B2 (en) Test method for interstitial cystitis
EA011694B1 (en) Test-system for diagnosis of prostate cancer and method for diagnosis thereof
WO2012145399A2 (en) Methods of diagnosing cancer in a patient
Kocna et al. Arginase activity determination a marker of large bowel mucosa proliferation
CN111551545B (en) Liquid biopsy ELISA kit for early screening of high risk group of esophageal cancer
JP2011509069A (en) Test kit for detecting cancer
JP2949474B2 (en) Helicobacter pylori eradication determination method based on change rate of pepsinogen I / II ratio
Joshi et al. Significance of detection of free/total PSA ratio and other biochemical parameters in patients with BPH, carcinoma prostate and its clinicopathologic correlation
US20130260391A1 (en) Method Of Determining The Protease Cathepsin B In A Biological Sample
Elgün et al. Evaluation of serum arginase activity in benign prostatic hypertrophy and prostatic cancer
CN113406328B (en) Application of CST1, CEA and SCC-Ag in preparation of esophageal squamous cell carcinoma early diagnosis kit
WO2023100910A1 (en) Method for measuring elastase 1 in feces
RU2772195C1 (en) Method for determining the functional activity of antithrombin iii in blood plasma
CN107058558A (en) A kind of tumour cell detection method
Han et al. Tumor markers for the early detection of bladder cancer
Bourika et al. Paraoxonase (PON)-1 activity in septic neonates: One more arrow in the quiver of biomarkers of neonatal sepsis?
Dawam Biomarkers of bladder cancer in urine: evaluation of diagnostic and prognostic significance of current and potential markers
RU2262109C2 (en) Method for determination of blood plasma antithrombin iii concentration

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KG MD TJ TM

MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): BY KZ RU