RU2772195C1 - Способ определения функциональной активности антитромбина iii в плазме крови - Google Patents
Способ определения функциональной активности антитромбина iii в плазме крови Download PDFInfo
- Publication number
- RU2772195C1 RU2772195C1 RU2021131361A RU2021131361A RU2772195C1 RU 2772195 C1 RU2772195 C1 RU 2772195C1 RU 2021131361 A RU2021131361 A RU 2021131361A RU 2021131361 A RU2021131361 A RU 2021131361A RU 2772195 C1 RU2772195 C1 RU 2772195C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- iii
- heparin
- activity
- plasma
- coagulation
- Prior art date
Links
- 210000002381 Plasma Anatomy 0.000 title claims abstract description 54
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 229960005348 Antithrombin III Drugs 0.000 title claims abstract description 18
- 102000004411 Antithrombin-III Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 108090000935 Antithrombin-III Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 claims abstract description 56
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N Heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 229960002897 Heparin Drugs 0.000 claims abstract description 53
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 claims abstract description 38
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims abstract description 38
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 33
- 230000037361 pathway Effects 0.000 claims abstract description 27
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims abstract description 19
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L cacl2 Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005429 turbidity Methods 0.000 claims description 4
- 101700057010 Cont Proteins 0.000 claims 1
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 3
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 abstract description 2
- 230000004301 light adaptation Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- NKCXQMYPWXSLIZ-PSRDDEIFSA-N (2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-5-amino-2-[[2-[[(2S)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-amino-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]propanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-3-m Chemical compound O=C([C@H](CCC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NKCXQMYPWXSLIZ-PSRDDEIFSA-N 0.000 description 17
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 17
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 17
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 8
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 2qpq Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 229920001690 polydopamine Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 5
- 229940088598 Enzyme Drugs 0.000 description 4
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 4
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 4
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 210000004369 Blood Anatomy 0.000 description 3
- 208000009190 Disseminated Intravascular Coagulation Diseases 0.000 description 3
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 3
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 3
- 229940012952 Fibrinogen Drugs 0.000 description 3
- 229940019698 Fibrinogen containing hemostatics Drugs 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 230000002429 anti-coagulation Effects 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 229950003499 FIBRIN Drugs 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002966 Serum Anatomy 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 108090001123 antibodies Proteins 0.000 description 2
- 102000004965 antibodies Human genes 0.000 description 2
- 201000005657 antithrombin III deficiency Diseases 0.000 description 2
- 230000005591 charge neutralization Effects 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000003203 everyday Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001264 neutralization Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological Effects 0.000 description 2
- 108091008117 polyclonal antibodies Proteins 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 2
- AWWLEBBAQLFDFA-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(ethenyl)benzene;3-phenylpropanoic acid;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.C=CC1=CC=C(C=C)C=C1.OC(=O)CCC1=CC=CC=C1 AWWLEBBAQLFDFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010047814 Antigen-Antibody Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 229940019700 Blood coagulation factors Drugs 0.000 description 1
- 101710010743 CSN1S1 Proteins 0.000 description 1
- 102000005911 Complement C1 Inhibitor Protein Human genes 0.000 description 1
- 108010005563 Complement C1 Inhibitor Protein Proteins 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N D-serine Chemical compound OC[C@@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UWTATZPHSA-N 0.000 description 1
- 108010079356 FIIa Proteins 0.000 description 1
- 206010020608 Hypercoagulation Diseases 0.000 description 1
- 206010022114 Injury Diseases 0.000 description 1
- 229920000126 Latex Polymers 0.000 description 1
- 210000004185 Liver Anatomy 0.000 description 1
- 206010067125 Liver injury Diseases 0.000 description 1
- 210000004080 Milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K Trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007374 clinical diagnostic method Methods 0.000 description 1
- 230000001112 coagulant Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 201000009910 diseases by infectious agent Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940079593 drugs Drugs 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 231100000234 hepatic damage Toxicity 0.000 description 1
- 230000000023 hypocoagulative Effects 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 238000003771 laboratory diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000000034 method Methods 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 238000004848 nephelometry Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing Effects 0.000 description 1
- 239000011778 trisodium citrate Substances 0.000 description 1
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 1
Abstract
Изобретение относится к области медицины. Предложен способ определения функциональной активности антитромбина III (AT III) в плазме крови, включающий взаимодействие AT III с гепарином. Функциональную активность антитромбина III в исследуемой плазме крови определяют как концентрацию гепарина, вызывающую 100% ингибирование контактного пути коагуляции. В качестве контроля используют пробу плазмы без гепарина. Параллельно определяют активность контактного пути коагуляции. Нормой содержания AT III считают концентрацию гепарина от 0,31 до 0,625 мкг/мл при нормальной активности контактного пути коагуляции. Изобретение обеспечивает удешевление, упрощение теста при диагностике нарушений гемостаза, многократное увеличение производительности исследования функциональной активности AT III по сравнению с прототипом, а также быструю адаптацию метода для рутинных исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий. 4 табл., 2 пр.
Description
Изобретение относится к клинической лабораторной диагностике, а именно к способу определения функциональной активности антитромбина III (AT III) в плазме крови, и может быть использовано для диагностики патологических состояний системы свертывания крови.
Антитромбин III (AT III) - серпин и основной ингибитор тромбина, ФХа и ФIХа. Он инактивирует также ФХIа и ФХIIа. AT III нейтрализует тромбин и другие сериновые протеазы посредством ковалентного связывания. В результате формируется неактивный 1:1 стехиометрический комплекс между ферментом и ингибитором путем образования связи аргинин-содержащего активного центра AT III и активного серинового центра тромбина. Скорость нейтрализации сериновых протеаз антитромбином III в отсутствие гепарина невелика и увеличивается в 1000-100000 раз при его присутствии.
AT III - α2-гликопротеин с молекулярной массой 580000 Да, синтезируется в печени. Его называют также гепариновым кофактором 1. Гепарин имеет два сайта связывания с AT III, тромбин - один. Гепарин связывается с лизиновыми остатками на AT III, что делает аргининовый активный центр доступным для активного серинового центра тромбина. Связывание гепарина с AT III ускоряет образование комплекса тромбин - AT III - гепарин. Ковалентная связь между активным сериновым центром тромбина и аргининовым сайтом комплекса AT III - гепарин вызывает инактивацию активной сериновой протеазы.
После образования комплекса между AT III и тромбином гепарин диссоциирует из комплекса и связывается с другой молекулой AT III, генерируя множественные циклы инактивации фермента. Нейтрализация активированных форм иных факторов свертывания крови посредством AT III происходит по аналогичному механизму, но при различных скоростях инактивации. Для катализа ингибирования ФХа достаточно, чтобы гепарин связался только с AT III. Однако для ингибирования тромбина гепарин должен связаться с AT III и тромбином (ФIIа). На долю AT III приходится более 80% всей противосвертывающей (антикоагулянтной) активности крови.
Дефицит AT III приводит к развитию различного вида тромбофилий и возникает вследствие снижения его синтеза при тяжелых заболеваниях и повреждениях печени, а также в результате его интенсивного потребления в процессе свертывания крови, например, при ДВС-синдроме, развивающемся при сепсисе, шоке, ожоговой болезни, сочетанных травмах, акушерской патологии, злокачественных новообразованиях, инфекционных заболеваниях, а также при длительном лечении фибринолитиками, гепарином. Уровень содержания AT III в крови в норме составляет 235±25 мкг/мл, у больных он снижается на 25-50%.
В клинико-лабораторной практике применяют, в основном, непрямые (косвенные) способы определения содержания AT III в плазме крови, основанные на оценке его активности, определяемой по остаточной активности стандартного препарата тромбина после его инактивации АТ-III-гепариновым комплексом.
Известен косвенный способ определения содержания AT III в плазме крови, в котором в качестве субстрата для тромбина используют фибриноген, об активности AT III судят по времени образования фибрина [Баркаган З.С., Макаров В.А., Лычов ВТ. Новые методы лабораторной диагностики диссеминированного внутрисосудистого свертывания (ДВС-синдрома). Методические рекомендации, М., 1989, с. 23]. Активность AT III выражают в процентах, за 100% принимают активность смеси плазмы здоровых доноров. У здоровых людей активность AT III, определяемая таким способом, колеблется в пределах 85-115%.
Прямые (непосредственные) способы количественного определения АТ-III в плазме крови обеспечивают высокую чувствительность, строгую специфичность и характеризуются высокой надежностью, однако, как правило, сложны в выполнении, требуют больших затрат труда и времени и использование специальной аппаратуры и реактивов.
Известен иммуноферментный способ прямого количественного определения АТ-III в плазме крови, осуществляемый как многостадийная последовательность проведения иммунологических и ферментативных реакций [Т. Andersson et al. Thrombos. Res., 1996, v. 82, p. 109]. АТ-III взаимодействует со специфичными к нему антителами, иммобилизованными на поверхности лунок полистироловых планшетов. Количественное определение AT III проводят спектрометрическим анализом образующихся окрашенных продуктов ферментативного гидролиза. Несмотря на высокую чувствительность и специфичность, способ не используют в повседневной лабораторной практике, т.к. он сложен в выполнении и требует дорогостоящего оборудования и реактивов.
Известен способ лазерной нефелометрии, в котором образование иммунных комплексов АТ-III со специфическими к нему антителами протекает в растворе и сопровождается увеличением светорассеяния [К. Akiyata et al. Thrombos. Res., 1993, v. 72, p. 193]. Способ обеспечивает быстрое получение результата, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, однако требует использования крайне дорогостоящего импортного оборудования, поэтому недоступен для применения в повседневной медицинской практике.
Известен способ определения содержания AT III в плазме крови методом радиальной иммунодифузии [Энциклопедия клинических лабораторных тестов./ Под ред. Н. Тица, пер. с англ. М., Из-во Лаб. Информ., 1997, с. 1137]. Способ основан на взаимодействии AT III со специфичными к нему поликлональными антителами, помещенными в 1%-ный агаровый гель. Образцы плазмы крови заливают в пробитые в геле лунки, а затем проводят инкубацию во влажной камере в течение 20 часов. Содержание AT III определяют на основании измерения диаметра визуально наблюдаемых кольцевых зон преципитации. Способ обеспечивает высокую чувствительность, не требует сложного оборудования, однако для получения результата требуется не менее 18-20 часов, что ограничивает его использование в клинико-лабораторной практике и делает непригодным для экспресс-анализа. В основном этот способ используют в научно-исследовательских целях.
Известен способ определения концентрации AT III в плазме крови. Сущность способа состоит в том, что используют суспензию сферических частиц карбоксилированного полистирольного латекса, на поверхности которых иммобилизованы специфические поликлональные антитела к AT III, а в качестве балластного белка добавлен α-казеин молока (AT 111-латгест), при этом для определения используют последовательные дробные разведения плазмы, и концентрацию AT III в исходном образце рассчитывают по формуле.
Способ обеспечивает быстрое получение результата, характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, однако способ не отражает функциональной активности АТ-III [Розенфельд М.А, Леонова В.Б., Костанова Е.А., Васильева M.B. Способ определения концентрации антитромбина III в плазме крови //Патент РФ №2262109. Опубл. 10.10.2005. Бюл. №28].
Прототипом предлагаемого способа определения функциональной активности антитромбина III является способ оценки активности АТ-III в плазме крови, основанный на применении строго специфичного тромбину низкомолекулярного хромогенного субстрата [J. Fareed et al. "Application of syntetic chromogenic peptid substrate in the evalution of coagulation enzymes and their inhibitors", 1979]. Обладая достаточной чувствительностью, этот способ, как косвенный, также может давать искаженный результат из-за влияния побочных факторов. Кроме того, применение этого способа ограничено необходимостью использования дорогостоящего специального оборудования и соответствующих наборов реагентов (тромбина и синтетического субстрата тромбина).
Способ доступен и прост в выполнении, но не может считаться достаточно надежным: являясь косвенным, он не обеспечивает строгую специфичность определения, так как на время образования фибрина, кроме остаточной активности тромбина, могут влиять побочные факторы, например медикаментозные средства, циркулирующие в крови, что приводит к искажению результатов определения. Кроме того, недостаточная чувствительность способа не позволяет регистрировать возникновение дефицита АТ-III на ранних стадиях заболеваний. Кроме того, для проведения теста требуются очищенные и дорогостоящие препараты белков, тромбина и фибриногена.
Задачей настоящего изобретения является разработка простого способа определения функциональной активности антитромбина III. Это позволит многократно увеличить производительность теста, удешевить его за счет использования доступного для клинико-диагностических лабораторий доступных реактивов для теста - препарата гепарина и хлорида кальция.
Техническим результатом предлагаемого способа является удешевление, упрощение теста при диагностике нарушений гемостаза, многократное увеличение производительности исследования функциональной активности AT III по сравнению с прототипом, а также быстрая адаптация метода для рутинных исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий.
Указанный результат достигается тем, что предварительно прогрессивно титруют раствор гепарина, добавляют цитратную плазму и проводят рекальцификацию путем добавления раствора хлорида кальция в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа, инкубируют пробы в течение 30 мин при 37°С. Определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности при инкубации проб при длине волны 450 нм. Функциональную активность антитромбина III в плазме крови определяют как концентрацию гепарина, вызвающую 100% ингибирование контактного пути коагуляции. В качестве контроля используют пробу плазмы без гепарина. Нормальным значением AT III считают концентрацию гепарина (эквивалент гепарина (ЭГ) от 0,31 до 0,625 мкг/мл при нормальной активности контактного пути коагуляции.
Способ осуществляют следующим образом: проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9:1, готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем предварительно прогрессивно титруют раствор гепарина от 2,5 мкг/мл до 0,078 мкг/мл, добавляют по 25 мкл трис-имидазолового буфера, исследуемой цитратной плазмы и 10% CaCl2, разведенного 1:31 (общий объем пробы составляет 100 мкл), в лунки 96-ти луночных плоскодонных иммунологических планшет для иммуноферментного анализа, тщательно перемешивают и инкубируют пробы в течение 30 мин при 37°С. Определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм. Функциональную активность антитромбина III в исследуемой плазме крови определяет концентрация гепарина, вызвающая 100% ингибирование контактного пути коагуляции. В качестве контроля используют пробу плазмы без гепарина.
Приготовление пулированной цитратной плазмы. Предварительно для отбора цитратных плазм для приготовления пулированной плазмы проводят тест определения активности контактного пути коагуляции, включающий смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция и последующую фотометрическую регистрацию свертывания, при этом в качестве активатора контактного пути коагуляции используют 96-луночные плоскодонные планшеты, запускают реакцию добавлением по 25 мкл 10% раствора хлорида кальция, разведенного 1:31, цитратной плазмы, 50 мкл трис-имидазолового буфера, и после инкубации при 37°С в течение 30 мин проводят фотометрическое определение коагуляции плазмы по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0, 5, 10, 15, 20, 25 и 30 мин [Драпкина О.М., Шойбонов Б.Б., Елиашевич С.О. и соавт. Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции // Патент РФ №2660706. Опубл. 09.07.2018. Бюл. №19. Полученные данные представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1, в 6 пробах цитратной плазмы определяется гипокоагуляция (время коагуляция плазмы более 20 минут). Для приготовления пулированной цитратной плазмы с нормальным временем коагуляции плазмы по контактному пути отобраны пробы, коагулирующие в течение 20 минут.
Определение оптимальной концентрации гепарина для ингибирования контактного пути коагуляции. Предварительно прогрессивно титруют раствор гепарина по 25 мкл (исходная концентрация 10 мг/мл) на 16 лунок (от 1,25 мг/мл до 0,038 мкг/мл) в плоскодонных 96-ти луночных иммунологических планшетах. Затем в лунки добавляют по 25 мкл буфера, пулированной цитратной плазмы и 10% раствор CaCl2, разведенный 1:31. Тщательно перемешивают и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для ИФА анализа с термостатируемым блоком (0 мин), далее проводят 30-минутную инкубацию при 37°С. Контроль пулированной цитратной плазмы не содержит гепарина. После инкубации измеряют степень коагуляции и рассчитывают процент ингибирования гепарином контактного пути коагуляции относительно контрольной пробы (плазма без гепарина). Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из таблицы 2, полное ингибирование пулированной нормальной цитратной плазмы наблюдается при концентрации гепарина в пробе, равной 0,155 мкг/мл или выше. Эффект ингибирования является дозо-зависимым. Данная концентрация гепарина отражает функциональную активность антитромбина III в тесте ингибирования гепарином контактного пути коагуляции. В дальнейших исследованиях нами использован диапазон концентрации гепарина в пробе от 0,039 до 2,5 мкг/мл по данным графика.
Примеры осуществления изобретения.
Пример 7. Определение функциональной активности АТ III в тесте полного ингибирования гепарином контактного пути коагуляции индивидуальных проб в тесте «СТОКПК» Предварительно готовят раствор гепарина с концентрацией 10 мкг/мл буфера. Затем прогрессивно титруют раствор гепарина по 25 мкл (исходная концентрация 10 мкг/мл) начиная со 2 лунки по 7 лунку плоскодонных 96-ти луночных иммунологических планшет. Затем добавляют по 25 мкл трис-имидазолового буфера, исследуемой цитратной плазмы и 10% CaCl2, разведенного 1:31 (общий объем пробы составляет 100 мкл). Тщательно перемешивают и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для ИФА анализа с термостатируемым блоком (0 мин), далее проводят 30-минутную инкубацию при 37°С. Для каждой исследуемой плазмы ставят контроль, который не содержит гепарин. После инкубации измеряют степень коагуляции и рассчитывают процент ингибирования гепарином контактного пути коагуляции относительно контрольной пробы.
Параллельно в этих же пробах цитратной плазмы определяют активность контактного пути коагуляции. Условия проведения эксперимента описаны выше. Полученные результаты представлены на таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице №3, для 100% ингибирования контактного пути коагуляции в индивидуальных пробах цитратной плазмы требуется от 0,078 до 2,5 мкг/мл гепарина. При очень низкой активности контактного пути даже в контроле плазмы мы не видим коагуляции при рекальцификации. В пяти пробах из шести (83%) максимальная концентрация гепарина, ингибирующая на 100% коагуляцию плазмы (2,5 мкг/мл), была четко связана с высокой активностью контактного пути коагуляции. Данный факт показывает, что низкая функциональная активность антитромбина III вызывает гиперкоагуляцию в скрининг-тесте определения активности контактного пути коагуляции. Из семи проб с высокой активностью контактного пути коагуляции в двух пробах (29%) концентрация гепарина, оказывающая 100% ингибирование КПК, была менее 2,5 мкг/мл.
Таким образом, полученные данные при сравнении результатов определения функциональной активности антитромбина III, которая характеризуется концентрацией гепарина, вызывающей 100% ингибирование контактного пути коагуляции, свидетельствуют о том, что высокая активность КПК в 83% обусловлена пониженной функциональной активностью антитромбина III.
Пример 2. Определение содержания АТ III в плазме крови относительно здоровых доноров. Определение концентрации гепарина для 100% ингибирования контактного пути коагуляции и активности КПК в тесте «СТОКПК» проводили как описано выше. Для сравнения в таблице представлены результаты определения функциональной активности AT III в тех же образцах, полученные с использованием коммерческого набора реагентов "Реахром - AT III" (НПО «РЕНАМ», Москва) (прототип) для определения активности AT III с хромогенным субстратом согласно инструкции производителя. Полученные результаты представлены в таблице 4.
Как видно из данных, представленных в таблице 4, из 9 проб с нормальной (15 мин) активностью контактного пути коагуляции (КПК) в 4 пробах (44,4%) для 100% ингибирования КПК требуется от 1,25 мкг/мл до 2,5 мкг/мл гепарина, в 3 пробах (33,3%) - от 0,31 до 0,625 мкг/мл, 2 пробах (22,2%), от 0,078 до 0,155 мкг/мл. В контрольной сыворотке с нормальной активностью КПК требуется 0,31 мкг/мл гепарина. В калибраторе присутствует только AT III, поэтому тест КПК не определялся.
Таким образом нормальная активность КПК обеспечивается функциональной активностью AT III в 33,3% эквивалентной гепарину (ЭГ) от 0,31 до 0,625 мкг/мл как и в контрольной сыворотке (0,31 мкг/мл) («Ренам», РФ). В то время в 44,4% случаев нормальная активность КПК обусловлена низкой функциональной активностью AT III (от 1,25 до 2,5 мкг/мл гепарина) и только в 22.2% случаев - высокой функциональной активностью AT III (0,078-0,155 мкг/мл гепарина).
Интересные данные получены в 12 пробах плазмы из 23 тестированных проб с высокой активностью КПК (10 мин). Нормальный уровень AT III (0,31-0,625 мкг/мл ЭГ) встречается в 7 пробах (58%), в 3 пробах (25%) (1,25-2,5 мкг/мл ЭГ) и только в 2 пробах (17%) (0,078-0,155 мкг/мл ЭГ).
Полученные результаты с пробами с высокой активностью КПК свидетельствуют с одной стороны о том, что в регуляции активности КПК играет большей степени С1 ингибитор системы комплемента. С другой стороны разработанный тест свидетельствует о том, что модификация AT III приводит к изменению функциональной активности, когда как низкие концентрации AT III (менее 0,155 мкг/мл ЭГ), так и высокие концентрации AT III не существенно влияют на активность КПК.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет надежно диагностировать патологические состояния системы свертывания крови, обусловленные модификацией AT III. Приведенные данные показывают, что в отличии от известных, используемых в настоящее время способов предлагаемый способ определения антитромбина III в плазме крови сочетает высокую чувствительность и надежность с доступностью, простотой выполнения. Для его осуществления не требуется специальное оборудование и реагенты, кроме гепарина и кальция.
Метод является наиболее физиологичным и тестирование концентрации AT III в комплексе с гепарином (при соотношении 1:1) проводится по естественному субстрату тромбина, фибриногену. Параллельно антикоагулянтный потенциал плазмы отражает тест определения активности контактного пути коагуляции. Для адекватной оценки функциональной активности AT III необходимо сопоставление этих двух показателей.
Claims (1)
- Способ определения функциональной активности антитромбина III (AT III) в плазме крови, включающий взаимодействие AT III с гепарином, отличающийся тем, что предварительно прогрессивно титруют раствор гепарина с 2,5 мкг/мл до 0,078 мкг/мл, добавляют по 25 мкл трис-имидазолового буфера, исследуемой нитратной плазмы и 10% CaCl2, разведенного 1:31, при общем объеме пробы 100 мкл в лунки 96-луночных плоскодонных иммунологических планшет, тщательно перемешивают и инкубируют пробы в течение 30 мин при 37°С, определяют коагуляцию плазмы фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм, функциональную активность антитромбина III в исследуемой плазме крови определяют как концентрацию гепарина, вызывающую 100% ингибирование контактного пути коагуляции, в качестве контроля используют пробу плазмы без гепарина, параллельно определяют активность контактного пути коагуляции и нормой содержания AT III считают концентрацию гепарина от 0,31 до 0,625 мкг/мл при нормальной активности контактного пути коагуляции.
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2772195C1 true RU2772195C1 (ru) | 2022-05-18 |
Family
ID=
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1461462A1 (ru) * | 1987-04-15 | 1989-02-28 | Алтайский государственный медицинский институт им.Ленинского комсомола | Способ определени гепарин-кофакторной активности антитромбина ш в плазме крови,содержащей гепарин |
| SU1464090A1 (ru) * | 1987-02-13 | 1989-03-07 | Алтайский государственный медицинский институт им.Ленинского комсомола | Способ определени активности антитромбина Ш в плазме крови |
| SU1522102A1 (ru) * | 1987-01-07 | 1989-11-15 | Московский медицинский стоматологический институт им.Н.А.Семашко | Способ определени активности антитромбина ш в плазме крови |
| EP0360871B1 (en) * | 1988-03-03 | 1994-01-19 | Nippon Shoji Kabushiki Kaisha | Method for measuring biological activity of antithrombin iii and reagents for the measurement |
| CN104714036A (zh) * | 2015-04-01 | 2015-06-17 | 成都协和生物技术有限责任公司 | 抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒的制备方法 |
| RU2660706C1 (ru) * | 2017-09-26 | 2018-07-09 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК) |
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SU1522102A1 (ru) * | 1987-01-07 | 1989-11-15 | Московский медицинский стоматологический институт им.Н.А.Семашко | Способ определени активности антитромбина ш в плазме крови |
| SU1464090A1 (ru) * | 1987-02-13 | 1989-03-07 | Алтайский государственный медицинский институт им.Ленинского комсомола | Способ определени активности антитромбина Ш в плазме крови |
| SU1461462A1 (ru) * | 1987-04-15 | 1989-02-28 | Алтайский государственный медицинский институт им.Ленинского комсомола | Способ определени гепарин-кофакторной активности антитромбина ш в плазме крови,содержащей гепарин |
| EP0360871B1 (en) * | 1988-03-03 | 1994-01-19 | Nippon Shoji Kabushiki Kaisha | Method for measuring biological activity of antithrombin iii and reagents for the measurement |
| CN104714036A (zh) * | 2015-04-01 | 2015-06-17 | 成都协和生物技术有限责任公司 | 抗凝血酶ⅲ活性测定试剂盒的制备方法 |
| RU2660706C1 (ru) * | 2017-09-26 | 2018-07-09 | федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр профилактической медицины" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ "НМИЦ ПМ" Минздрава России) | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК) |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| FAREED J. et al. Application of syntetic chromogenic peptid substrate in the evalution of coagulation enzymes and their inhibitors. 1979. * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5525477A (en) | Method for diagnosing blood clotting disorders | |
| Miesbach et al. | Comparison of the fibrinogen Clauss assay and the fibrinogen PT derived method in patients with dysfibrinogenemia | |
| ES2725426T3 (es) | Medios y procedimientos para calibración universal de pruebas anti-factor Xa | |
| JP3248621B2 (ja) | 血栓症リスクのテスト | |
| US5766869A (en) | Factor V ratio blood test for susceptibility to thromboembolism | |
| EP1774327B1 (en) | Methods and kits for measuring adamts13/fxi complexes | |
| US5716795A (en) | Thrombomodulin-based coagulometric assay of the protein C system | |
| Henderson et al. | Protease: serpin complexes to assess contact system and intrinsic pathway activation | |
| EP1962091B1 (en) | Methods and kits for detecting and measuring ADAMTS13/FX1 complexes | |
| RU2772195C1 (ru) | Способ определения функциональной активности антитромбина iii в плазме крови | |
| US5147805A (en) | Method and kit for determining the functional activity of protein s in human plasma | |
| RU2298189C2 (ru) | Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови | |
| Devani et al. | Kallikrein-kinin system activation in Crohn's disease: differences in intestinal and systemic markers | |
| US20160076078A1 (en) | Reagent for measuring total protein s activity | |
| KR20180100107A (ko) | 접촉 시스템 활성화의 평가를 위한 프로테아제 저해제를 함유하는 진공 채혈관 | |
| JP6864008B2 (ja) | 抗リン脂質抗体症候群に関連するループス抗凝固因子（ｌａ）を特定するための方法およびキット | |
| US5627038A (en) | Factor IX chromogenic assay | |
| WO2019066685A1 (ru) | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк) | |
| RU2262109C2 (ru) | Способ определения концентрации антитромбина iii в плазме крови | |
| Li et al. | Prothrombin fragment F 1+ 2 and oral anticoagulant therapy | |
| US20220380833A1 (en) | Universal Calibration Method for Assaying Enzymatic Inhibitors | |
| RU2717946C1 (ru) | Способ определения тромбинового пути активации системы комплемента | |
| Koroleva et al. | Standardization of the protein calibrators isolation methodology for thrombophilia markers detecting immunodiagnostic test systems | |
| Winkler | Measuring and monitoring of hemostasis | |
| Andresen et al. | Coagulation Inhibitor Potential: a study of assay variables |