WO2019066685A1 - Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк) - Google Patents
Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк) Download PDFInfo
- Publication number
- WO2019066685A1 WO2019066685A1 PCT/RU2018/000601 RU2018000601W WO2019066685A1 WO 2019066685 A1 WO2019066685 A1 WO 2019066685A1 RU 2018000601 W RU2018000601 W RU 2018000601W WO 2019066685 A1 WO2019066685 A1 WO 2019066685A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- plasma
- coagulation
- test
- hemostasis
- minutes
- Prior art date
Links
- 238000012360 testing method Methods 0.000 title claims abstract description 77
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 title claims abstract description 49
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 230000037361 pathway Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000012216 screening Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims abstract description 65
- 230000003027 hypercoagulation Effects 0.000 claims abstract description 19
- 206010020608 Hypercoagulation Diseases 0.000 claims abstract description 18
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 14
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 11
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 10
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 10
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims abstract description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 13
- 230000000023 hypocoagulative effect Effects 0.000 claims description 11
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims description 5
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 abstract description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 28
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 abstract description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 abstract description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 abstract 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 19
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 18
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 15
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 8
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 7
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 7
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 7
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 7
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 7
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 7
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 7
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 7
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 7
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 7
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 7
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 7
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 6
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 6
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 6
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 6
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 6
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 5
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 5
- 239000003154 D dimer Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 108010052295 fibrin fragment D Proteins 0.000 description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 3
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 3
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 3
- 238000013168 hemostasis test Methods 0.000 description 3
- UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N n-[(2s,3r,4r,5s,6r)-2-[(2r,3s,4r,5r,6s)-5-acetamido-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)-6-(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)oxyoxan-3-yl]oxy-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](NC(C)=O)[C@H](OC=2C=C3OC(=O)C=C(C)C3=CC=2)O[C@@H]1CO UPSFMJHZUCSEHU-JYGUBCOQSA-N 0.000 description 3
- 239000003805 procoagulant Substances 0.000 description 3
- 201000005665 thrombophilia Diseases 0.000 description 3
- 241000428352 Amma Species 0.000 description 2
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 description 2
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 2
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000011005 laboratory method Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 230000031915 positive regulation of coagulation Effects 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 238000009666 routine test Methods 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 206010005133 Bleeding tendencies Diseases 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010080865 Factor XII Proteins 0.000 description 1
- 102000000429 Factor XII Human genes 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 102100030951 Tissue factor pathway inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000001354 calcium citrate Substances 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 108010013555 lipoprotein-associated coagulation inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000008756 pathogenetic mechanism Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000014773 positive regulation of hemostasis Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 235000013337 tricalcium citrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors
Definitions
- the invention relates to laboratory diagnostics, in particular to methods for determining the coagulation contact pathway (CCP) of human blood plasma, based on recalcification of citrate blood plasma, and can be used in clinical laboratories of medical institutions for screening studies of the activity of the contact hemostasis activation pathway.
- CCP coagulation contact pathway
- thrombosis is the main pathogenetic mechanism of heart attacks, strokes and pulmonary thromboembolism.
- D-dimer is a product of the simultaneous operation of three systems: procoagulant and anticoagulant during the formation of a fibrin clot.
- Test hemostasis which are used in the laboratory at the present time, can be divided into two types.
- the first is the “local” tests, the results of which allow us to characterize the state of individual factors or links of the cascade reaction. These include routine tests such as APTTV, prothrombin time (PT), prothrombin index (PTI), international normalized ratio (MHO), fibrinogen, D-dimer, antithrombin III, protein C, factor VIII, concentration and activity of some other factors.
- routine tests such as APTTV, prothrombin time (PT), prothrombin index (PTI), international normalized ratio (MHO), fibrinogen, D-dimer, antithrombin III, protein C, factor VIII, concentration and activity of some other factors.
- PT prothrombin time
- PTI prothrombin index
- MHO international normalized ratio
- fibrinogen fibrinogen
- D-dimer antithrombin III
- protein C protein C
- factor VIII concentration and activity of some other factors.
- “Local” tests record changes in the activity / concentration of individual coagulation factors, but they cannot characterize how these local changes affected (or did not affect) the patient’s overall plasma ability to form a clot. "Global” tests can give the doctor a comprehensive picture of the cumulative changes that occurred with the patient's blood coagulation system, but are not able to characterize individual factors of the coagulation cascade.
- Thrombin generation test is one of the “global” tests developed in 2001 [Hemker N.S., Giesen P., Al Dieri R., Regnault V., de Smedt E., Wagenvoord R., Lecompte T., Beguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma // Pathophysiol. Haemost. Thromb. - 2003. -V.33. -P.4-15.] The principle of the method is to use a fluorogenic substrate specific to thrombin. After pre-incubation of platelet-rich blood plasma, a buffer containing ionized calcium and fluorogenic substrate is introduced into it.
- the resulting thrombin cleaves the substrate, resulting in the release of the fluorophore molecule, the radiation of which is automatically recorded by the fluorometer at regular intervals.
- the intensity of the glow is proportional to the concentration of the formed thrombin.
- a thrombin generation curve is plotted. During the study, the estimated time to delay the formation of thrombin (lag-period), the maximum rate of formation of thrombin (peak), the time to reach maximum speed (peak time), the amount of thrombin formed (area under the curve, endogenous thrombin potential) and some other parameters.
- the resulting hypercoagulable state of hemostasis is a consequence of the processes that simultaneously occur in two subsystems: procoagulant changes of any etiology in the work of the coagulation system and the unsatisfactory performance of anticoagulant systems
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) (antithrombin III, protein C, TFPI) in an attempt to level the former. Due to the need to simultaneously assess the amount of the contribution of all participants in this process, “local” tests are poorly applicable for solving this problem. In contrast, “global” coagological tests for the same reason cannot cope with this issue. That is why the optimal is the combined use of "global” and local “tests. “Global” tests allow to fix the phenomenon of hypercoagulation, and “local” - to understand some of the components of its etiology.
- spontaneous centers In the donor plasma in vitro after recalcification, even in the absence of activators, the process of coagulation begins after 10-20 minutes spontaneously in separate centers. Next, spontaneous clots increase in size, gradually filling the entire plasma volume. It was also shown that the number of spontaneous centers with a decrease in the number of platelets in the plasma decreases. After ultracentrifuging the plasma to remove all platelets and large phospholipid vesicles, spontaneous centers
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) practically not formed.
- the contact phase inhibitor an inhibitor derived from corn kernels significantly reduces the number of spontaneous clots, but does not reduce them completely [Karotina NG, Ovanesov MV, Plyushch OP, Kopylov KG, Lopatina E. G., Saenko E.L., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I. Study of spontaneous clots in normal plasma and plasma of patients with hemophilia // Gematol. and transfusiol. - 2002. - T. 47. - p. 26-30].
- thrombodynamics as a method for the study of plasma hemostasis was proposed in 1994 by a group of researchers led by F. Ataullakhanov. [Ataullakhanov F.I., Guria G.T., Safroshkina A.Yu. Spatial aspects of the dynamics of blood coagulation. Ii. Phenomenological model // Biophysics. - 1994. - V. 39, JSfe l. - pp. 97- 106]. The method is based on a clot proliferation model, starting from damage to the vascular wall deep into the vessel. Imitation of the damaged vascular wall is achieved by applying a thin (30-50 nm) layer of tissue factor on the surface of the activator insert, which starts the
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) process of clot formation in plasma.
- Tlag the parameters of the spatial growth of the bunch
- Vo the initial velocity of the bunch
- Vst the stationary velocity of the bunch
- CS the size of the bunch
- CD optical density of the bunch
- the disadvantage of the thrombodynamic method is low productivity (2 analyzes for 45 min), the need for additional sample preparation (plasma) by high-speed centrifugation, the need for a special instrument for recording thrombodynamics (or several to increase the performance of the test), a set of reagents and consumables and, accordingly , the high cost of a single analysis for routine research. Also, a disadvantage of the thrombodynamic method is the use of an inhibitor of the contact pathway for the activation of coagulation, an inhibitor of trypsin from maize, which reduces the information content of the test and evaluates only the activation of coagulation through tissue factor.
- the present invention is to develop a test to assess the contact path of activation of plasma hemostasis. This will greatly increase the test performance, reduce the cost of it by using an enzyme immunoassay photometer (ELISA) available for clinical diagnostic laboratories, a widely available 96-well flat-bottomed plate as a microcell ditch and the only reagent to trigger the contact pathway for the activation of plasma hemostasis, chloride solution calcium.
- ELISA enzyme immunoassay photometer
- the technical result of the proposed method is to increase the sensitivity of the test in the diagnosis of hypercoagulation due to the launch of the contact path of activation of plasma coagulation, a 48-fold increase
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) performance of the study of hemostasis compared with the prototype, as well as the rapid adaptation of the method for routine research in the conditions of clinical diagnostic laboratories.
- the method is as follows: a standard blood sample is taken in a solution of 3.8% sodium citrate in a ratio of 9: 1, platelet-depleted plasma is prepared by centrifuging at 3000 rpm for 10 minutes. Then, to start the contact path of plasma hemostasis activation, an optimal concentration of calcium chloride solution is added to citrate plasma diluted 1: 2 with Tris-imidase buffer, pH 7.4. Mix thoroughly on a shaker the samples prepared in flat-bottomed 96-well plates and measure the absorption in samples at 450 nm on an enzyme immunoassay photometer (1 measurement - 0 min), the samples are incubated for 30 minutes at 37 ° C. Measurement of the absorption of samples to control coagulation is carried out after 10 minutes (2 measurement) and subsequently every 5 minutes (the last measurement at 30 minutes of incubation).
- soybean trypsin inhibitor was used as an inhibitor of the coagulation contact pathway. Pre-determine the optimal concentration of SIT.
- the screening test for determining the contact pathway of coagulation turned out to be more sensitive to both hyper- and hypocoagulation compared with the modified APTT test (APTT (m).
- APTT modified APTT test
- the essence of the modification is limiting activator in the APTT test with the same concentrations of calcium chloride and citrate plasma as in the STPCK test.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) coagulation using soybean trypsin inhibitor (SIT) hypercoagulation in 5 samples was due to the high activity of the contact coagulation pathway. While, SIT completely suppressed the contact path of coagulation.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) cases reveals hypercoagulation, 25% normal, and 12.5% hypocoagulation. While routine hemostasis tests (APTT, PV, and MHO) do not reveal hypercoagulation in the investigated citrate plasma samples. Routine coagulation methods in a total of 51% of cases stated normal coagulation and 49% - hypocoagulation. In every fifth sample, hypercoagulation is revealed in the test of the SRT P, while according to the coagulogram data, signs of hypocoagulation are recorded. This fact may be directly related to the problem of restenosis after arterial stenting, when, against the background of anticoagulant therapy, blood clot formation is observed in patients.
- the STACK test is a new test for the evaluation of the contact pathway for the activation of hemostasis.
- Comparative studies of the proposed test with thrombodynamics for the diagnosis of hypercoagulation showed a high degree of coincidence (93%) and 100% - a match in the diagnosis of hypocoagulation.
- the obtained new data in comparative studies of the proposed STAKPK test and routine hemostasis tests may be useful for the prevention of thrombosis against the background of anti-coagulant therapy during surgical interventions.
- the proposed method is simple, reagents and consumables are available for diagnostic laboratories.
- a plasma for coagulation requires a thermostat for 96-well flat-bottomed plates and a photometer for immunoassay.
- Using a simple and informative test for determining the activation of the contact pathway of coagulation allows screening and identifying people prone to thrombosis both against the background of anti-coagulant therapy and practically healthy people, which will allow early prevention of thrombosis, stroke and heart attack before the cardiovascular stage begins. catastrophes.
- SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) The effect of concentration of a 0.25 M solution of calcium chloride on the coagulation of 25% of lymphocyte plasma plasma;
- N is the norm
- N is the norm; ots - absent; n / t - not tested
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Изобретение относится к лабораторной диагностике, в частности к способам определения контактного пути коагуляции платы кропи человека. Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции включает смешивание цитратной плазмы крови с хлоридом кальция и последующую фотометрическую регистрацию свертывания. При этом в качестве активатора контактного пути коагуляции используют 96-луночные плоскодонные планшеты, запускают реакцию добавлением 25 мкл 0,25 М раствора хлорида кальция к 75 мкл цитратной плазмы, разведенной 1:2 трис-имидазоловым буфером, и после инкубации при 37°С в течение 30 мин проводят фотометрическое определение коагуляции плазмы по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. Изобретение обеспечивает повышение чувствительности теста при диагностике гиперкоагуляции, увеличение производительности исследования гемостаза и быструю адаптацию метода для рутинных исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий.
Description
Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК)
Изобретение относится к лабораторной диагностике, в частности к способам определения контактного пути коагуляции (КПК) плазмы крови человека, основанным на рекальцификации цитратной плазмы крови, и может применяться в клинических лабораториях лечебных учреждений для скрининг-исследований активности контактного пути активации гемостаза.
В настоящее время среди заболеваний, приводящих к смерти, по данным Всемирной организации здравоохранения, лидируют сердечно- сосудистые заболевания. При всем разнообразии нозологических форм в данной группе непосредственной причиной смерти больных чаще всего является тромбоз. Именно тромбоз является основным патогенетическим механизмом инфарктов, инсультов и тромбоэмболии легочных артерий.
В последние годы интенсивно разрабатывается и внедряется множество разнообразных программ, направленных на улучшение лечебного процесса при сердечно-сосудистых заболеваниях: высокотехнологическое хирургическое пособие (стентирование, шунтирование), разработка ранних и активных реабилитационных мероприятий, создание новых фармацевтических препаратов. В ближайшей перспективе стоит задача развития профилактического направления - скрининг групп риска с целью выявления больных, которым требуется раннее начало терапии.
Несмотря на многолетние исследования, многие аспекты работы системы гемостаза до сих пор остаются до конца неизученными. Известно, что в работе системы участвуют более 300 реакций. Уже выделены и охарактеризованы все факторы плазменного гемостаза, созданы реагенты, позволяющие измерить концентрацию/активность этих факторов, и опубликовано множество научных работ о том, как те или иные факторы изменяют свою активность при различных патологиях. Однако весь этот
1
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
гигантский массив накопленных данных очень сложно использовать практическому врачу.
Одной из основных причин, определяющих сложность интерпретации результатов лабораторных коагулогических тестов, является отсутствие четкой взаимосвязи данных большинства тестов с регистрируемыми врачом клиническими симптомами (за исключением таких простых для интерпретации осложнений/заболеваний как массивная кровопотеря или гемофилии типа А и В).
Большинство случаев неверной трактовки результатов лабораторных исследований системы гемостаза обусловлены отсутствием понимания роли наблюдаемых изменений в патологических процессах организма. И дело часто не в том, что врач недостаточно информирован о принципах работы свертывающей системы крови, а в том, что данные, получаемые в результате исследования, не могут быть интерпретированы как те или иные патологические изменений в силу чисто технических особенностей теста. Классическим примером могут служить тесты АЧТВ (активированное частично тромбиновое время) и протромбиновое время, которые разработаны для диагностики гипокоагулянтных состояний и склонности к кровоточивости. Для выполнения этих задач, а также для укорочения времени проведения теста и лучшей воспроизводимости в ходе исследования к образцу плазмы добавляют активатор в концентрации, существенно превышающей физиологические. Такой подход не мешает диагностике геморрагических состояний, но делает эти тесты практически полностью нечувствительными к гиперкоагулянтным состояниям, т.к. на фоне такой сильной активации образца плазмы тонкие прокоагулянтные изменения нивелируются [Серебрийский И.И. «Глобальные» и «локальные тесты системы гемостаза в диагностике гиперкоагуляционного синдрома // Справочник заведующего КДЛ. - 2012. - N° 12. - С. 27-34].
2
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Несколько особое положение занимает такой тест как измерение уровня Д-димера. Его трактовка часто бывает не совсем однозначной. Причиной тому служит полиэтиологичность происхождения этого маркера. Д-димер является продуктом одновременной работы трех систем: прокоагулянтной и антикоагулянтной при образовании фибринового сгустка
- с одной стороны, и фибринолитической при разрушении этого сгустка - с другой. Повышенный уровень Д-димера свидетельствует постфактум о том, что отложение фибриновых нитей уже случилось и в данный момент идет процесс их фибринолиза, но этот тест не может ничего сказать о повышенной предрасположенной™ к тромбообразованию на момент выполнения анализа.
Тест системы гемостаза, которые используются в лаборатории в настоящее время, можно разделить на два вида. Первый - «локальные» тесты, результаты которых позволяют охарактеризовать состояние отдельных факторов или звеньев каскадной реакции. В их число входят рутинные тесты, такие как АЧТВ, протромбиновое время (ПВ), протромбиновый индекс (ПТИ), международное нормализованное отношение (MHO), фибриноген, Д-димер, антитромбин III, протеин С, фактор VIII, концентрация и активность некоторых других факторов. Второй
- «глобальные» коагулогические тесты, результаты которых позволяют оценивать систему гемостаза в целом - тромбоэластография/метрия, тест генерации тромбина и тромбодинамика.
«Локальные» тесты фиксируют изменения активности/концентрации отдельных факторов свертывания, но при этом не могут охарактеризовать, насколько эти локальные изменения повлияли (или не повлияли) на общую способность плазмы больного к образованию сгустка. «Глобальные» тесты могут дать в руки врача интегральную картину совокупных изменений, произошедших со свертывающей системой крови больного, но не способны охарактеризовать отдельные факторы коагуляционного каскада.
з
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Тест генерации тромбина является одним из «глобальных» тестов, разработанных в 2001 г. [Hemker Н.С., Giesen P., Al Dieri R., Regnault V., de Smedt E., Wagenvoord R., Lecompte Т., Beguin S. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma //Pathophysiol. Haemost. Thromb.- 2003. -V.33. -P.4-15.] Принцип метода заключается в использовании специфического к тромбину флуорогенного субстрата. После предварительной инкубации тромбоцит-богатой плазмы крови в нее вносят буфер, содержащий ионизированный кальций и флуорогенный субстрат. Образующийся тромбин расщепляет субстрат, в результате высвобождается молекула флуорофора, излучение которого автоматически регистрируется флуориметром через равные промежутки времени. Интенсивность свечения пропорциональна концентрации образовавшегося тромбина. На основании измерений с помощью программного обеспечения выстраивается кривая генерации тромбина. В ходе исследования оцениваются: время задержки образования тромбина (лаг-период), максимальная скорость образования тромбина (пик), время достижения максимальной скорости (время пик), количество образовавшегося тромбина (площадь под кривой, эндогенный тромбиновый потенциал) и некоторые другие параметры.
Недостатком данного теста является использование избыточного количества тканевого фактора в качестве активатора гемостаза, а также дорогостоящего научного оборудования и реагентов (флуориметра и флуорогенного субстрата). Данный тест также не отражает концентрацию и активность природного субстрата тромбина - фибриногена. Учитывая данные недостатки, тест генерации тромбина до сих пор не нашел широкого применения в рутинной практике.
Итоговое гиперкоагуляционное состояние гемостаза является следствием процессов, одновременно происходящих в двух подсистемах: прокоагулянтных изменений любой этиологии в работе свертывающей системы и неудовлетворительной работы антикоагулянтных систем
4
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
(антитромбин III, протеина С, TFPI) в попытке нивелировать первые. В силу необходимости одновременной оценки суммы вклада всех участников этого процесса «локальные» тесты слабо применимы для решения данной задачи. Напротив, «глобальные» коагулогические тесты по той же самой причине не могут справиться с этим вопросом. Именно поэтому оптимальным представляется комбинированное использование «глобальных» и локальных» тестов. «Глобальные» тесты позволяют зафиксировать сам феномен гиперкоагуляции, а «локальные» - разобраться в некоторых составляющих его этиологии.
Каждый из методов исследования гемостаза обладает своими выраженными специфическими особенностями в силу различных причин, в том числе технических особенностей реализации того или иного теста, чистоты и специфических свойств реагентов и, конечно, что не менее важно, модели свертывания крови, на основании которой создавался тот или иной тест. Этот список далеко не полон, но он дает представление о значительном количестве причин, обуславливающих уникальную чувствительность и специфичность каждого из тестов в диагностике того или иного нарушения в работе свертывающей системы крови.
У каждого из тестов, относящихся как к классу «глобальных», так и к классу «локальных», есть свои преимущества и недостатки, знание которых позволяет врачу правильно интерпретировать данные о больном, более точно устанавливать диагноз и подобрать максимально адекватное лечение.
В донорской плазме in vitro после рекальцификации, даже при отсутствии активаторов, процесс свертывания начинается через 10-20 мин спонтанно в отдельных центрах. Далее спонтанные сгустки увеличиваются в размере, постепенно заполняют весь объем плазмы. Показано также, что количество спонтанных центров с уменьшением числа тромбоцитов в плазме снижается. После ультрацентрифугирования плазмы для удаления всех тромбоцитов и крупных фосфолипидных везикул спонтанные центры
5
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
практически не образуются. Ингибитор контактной фазы (ингибитор, полученный из зерен кукурузы) значительно снижает число спонтанных сгустков, но не редуцирует их полностью [Каротина Н.Г., Ованесов М.В., Плющ О.П., Копылов К.Г., Лопатина Е.Г., Саенко Е.Л., Бутылин А.А., Атауллаханов Ф.И. Исследование спонтанных сгустков в нормально плазме и плазме больных гемофилией // Гематол. и трансфузиол. - 2002. - Т. 47. - С. 26-30].
Известны лабораторные способы исследования свертывания крови в условиях низкоконтактной активации, основанные на принципе рекальцификации цитратной крови [Исследование системы гемостаза в клинике. Под ред. Баркагана 3. С, Барнаул, 1975, с. 21 , 72-73; Иванов Е.П. Диагностика нарушений гемостаза. Минск, 1983, с. 120-124; Лабораторные методы исследования системы гемостаза. Под ред. Балуды В. П. и соавт. Томск, 1980, с. 55-56]. Указанные способы считаются одними из основных в гемостазиологии. Однако накопившийся опыт и расширение знаний в области механизмов свертывания крови показали, что эти способы по своей чувствительности перестали удовлетворять все возрастающим требованиям к выявлению гиперкоагуляции [Rohrer M.J. et al. Annls of Surgery.- 1988. -V. 208, N 5.-P. 554-557].
Наиболее близким техническим решением является тест тромбодинамики. Тромбодинамика как метод исследования плазменного гемостаза был предложен в 1994 г. группой исследователей под руководством Атауллаханова Ф.И. [Атауллаханов Ф.И., Гурия Г.Т., Сафрошкина А.Ю. Пространственные аспекты динамики свертывания крови. II. Феноменологическая модель // Биофизика. - 1994. - Т. 39, JSfe l . - С. 97- 106]. В основу метода положена модель распространения сгустка начиная от повреждения сосудистой стенки вглубь сосуда. Имитация поврежденной сосудистой стенки достигнута путем нанесения тонкого (30-50 нм) слоя тканевого фактора на поверхность вставки-активатора, которая и запускает б
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
процесс образования сгустка в плазме. В ходе исследования оцениваются параметры пространственного роста сгустка (лаг-период, Tlag), начальную скорость сгустка (Vo), стационарную скорость сгустка (Vst), размер сгустка (CS), оптическую плотность сгустка (CD). Таким образом, врач получает возможность характеризовать процессы активации свертывания с участием тканевого фактора. Также этот метод позволяет регистрировать феномен спонтанного образования сгустка.
Недостатком метода тромбодинамики является низкая производительность (2 анализа в течение 45 мин), необходимость дополнительной подготовки пробы (плазмы) путем высокоскоростного центрифугирования, необходимость специального прибора для регистрации тромбодинамики (или нескольких - для увеличения производительности теста), набора реагентов и расходных материалов и, соответственно, высокая стоимость одного анализа для рутинных исследований. Также недостатком метода тромбодинамики является использование ингибитора контактного пути активации коагуляции, ингибитора трипсина из кукурузы, который снижает информативность теста и оценивает только активацию свертывания через тканевой фактор.
Задачей настоящего изобретения является разработка теста для оценки контактного пути активации плазменного гемостаза. Это позволит многократно увеличить производительность теста, удешевить его за счет использования доступного для клинико-диагностических лабораторий фотометра для иммуноферментного анализа (ИФА), широко доступных 96-ти луночных плоскодонных планшет в качестве микрокювет и единственного реактива для запуска контактного пути активации плазменного гемостаза, раствора хлорида кальция.
Техническим результатом предлагаемого способа является повышение чувствительности теста при диагностике гиперкоагуляций за счет запуска контактного пути активации коагуляции плазмы, 48-кратное увеличение
7
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
производительности исследования гемостаза по сравнению с прототипом, а также быстрая адаптация метода для рутинных исследований в условиях клинико-диагностических лабораторий.
Указанный результат достигается тем, что проводят рекальцификацию цитратной плазме крови путем добавления раствора хлорида кальция в лунки 96-ти луночных плоскодонных планшет для иммуноферментного анализа в качестве кювет, инкубируют пробы в течение 30 мин при 37°С, а определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0, 10, 15, 20, 25 и 30 мин. Коагуляцию плазмы в течение 10 мин характеризуют как гиперкоагуляцию, 15 мин - повышенную коагуляцию, 20 мин - как нормальную коагуляцию плазмы крови и 25 и более мин как гипокоагуляцию.
Способ осуществляют следующим образом: проводят стандартный забор крови в раствор 3,8% цитрата натрия в соотношении 9: 1 , готовят тромбоцит-обедненную плазму путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение 10 мин. Затем для запуска контактного пути активации плазменного гемостаза добавляют оптимальную концентрацию раствора хлорида кальция к цитратной плазме, разведенной 1 :2 трис-имидазовым буфером, рН 7,4. Тщательно перемешивают на шейкере пробы, приготовленные в плоскодонных 96-ти луночных планшетах и измеряют поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа (1 измерение - 0 мин), пробы инкубируют в течение 30 мин при 37°С. Измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводят через 10 мин (2 измерение) и в последующем каждые 5 мин (последнее измерение на 30 минуте инкубации).
Определение оптимальной концентрации хлорида кальция для запуска контактного пути коагуляции. С этой целью предварительно в 96-ти луночных плоскодонных планшетах 50 мкл 0,25 М раствор хлорида кальция был прогрессивно раститрован начиная со второй лунки по седьмую лунку.
8
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
После добавляли по 25 мкл трис-имидазолового буфера, рН 7,4 и пулированной нитратной плазмы относительно здоровых доноров. Тщательно перемешивали и измеряли поглощение в пробах при 450 нм на фотометре для ИФА анализа (0 мин), ставили на 30-минутную инкубацию при 37°С. Измерение поглощения проб для контроля коагуляции проводили каждые 10 мин (10, 20 и 30 мин). Полученные данные представлены в таблице 1.
Как видно из данных, представленных в таблице 1 , максимальная коагуляция цитратной плазмы наблюдается при добавлении 50 мкл 0, 125 М СаС к 50% пулированной цитратной плазме крови здоровых доноров. После этого осуществляют рекальцификацию 25% плазмы 0,25 М раствором хлорида кальция в 96-ти луночных плоскодонных планшетах для ИФА. Затем проводят инкубацию при 37°С в течение 30 мин. Определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0, 10, 15, 20, 25 и 30 мин.
Для подтверждения избирательной активации контактного пути плазменного гемостаза использован соевый ингибитор трипсина (СИТ) в качестве ингибитора контактного пути коагуляции. Предварительно определяют оптимальную концентрацию СИТ.
Определение оптимальной концентрации соевого ингибитора трипсина (СИТ) для ингибирования контактного пути активации гемостаза. В 96-ти луночной плоскодонной планшете прогрессивно разводят соевый ингибитор трипсина ( 1 мг/мл) по 25 мкл, затем добавляют в лунки по 25 мкл буфера и 25 мкл пулированной цитратной плазмы крови здоровых доноров. Активацию контактного пути коагуляции запускают добавлением 25 мкл 0,25 М хлорида кальция, тщательно перемешивают, измеряют поглощение проб при 450 нм на фотометре для иммуноферментного анализа. Инкубируют в течение 20 мин при 37°С, измеряют изменению мутности проб каждые 10 мин для контроля коагуляции плазмы. В качестве контроля ставят:
9
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
контроль плазмы (без СИТ) и контроль бланка плазмы (без хлорида кальция и СИТ). Полученные результаты представлены в таблице 2.
Как видно из данных, представленных в таблице 2, СИТ дозо-зависимо ингибирует контактный путь активации плазменного гемостаза. При концентрации 0,25 мг/мл СИТ полностью подавляет контактный путь активации плазменного гемостаза.
Определение активаций плазменного гемостаза через тканевый фактор и контактный путь в присутствии соевого ингибитора трипсина (СИТ) и без СИТ
Для исследования влияния СИТ на контактную коагуляцию индивидуальных цитратных плазм были проведены сравнительные исследования:
1. Определяли коагуляцию предлагаемым способом (СТОКПК) в 14 пробах цитратных плазм как описано выше;
2. Тест СТОКПК проводили в этих же пробах в присутствии 0,25 мг/мл
СИТ;
3. Для оценки влияния СИТ на активацию коагуляции с помощью тканевого фактора предварительно адаптировали тест АЧТВ для ИФА плашек с таким же количеством плазмы и хлорида кальция. Данный тест АЧТВ нами принят за модифицированный АЧТВ-тест;
4. Тест АЧТВ(м) в присутствии 0,25 мг/мл СИТ. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Как видно из данных, представленных в таблице 3, скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК) оказался более чувствительным как к гипер-, так и к гипокоагуляции по сравнению с модифицированным АЧТВ-тестом (АЧТВ(м). Суть модификации заключается в лимитировании активатора в тесте АЧТВ при тех же концентрациях хлорида кальция и цитратной плазмы, что в тесте СТОКПК. Как видно из данных теста АЧТВ(м), при ингибировании контактного пути ю
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
коагуляции с помощью соевого ингибитора трипсина (СИТ) гиперкоагуляция в 5 пробах была обусловлена высокой активностью контактного пути коагуляции. В то время как, СИТ полностью подавлял контактный путь коагуляции.
Таким образом, эксперименты с использованием ингибитора контактного пути коагуляции плазмы позволяют утверждать, что при данных условиях в предлагаемом тесте идет специфическая активация контактной фазы коагуляции через фактор XII.
Пример 1.
Исследование плазменного гемостаза с использованием предлагаемого теста (скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК), прототипа, теста тромбодинамики, и рутинных методов оценки гемостаза (АЧТВ, протромбиновое время, MHO и фибриногена). Для оценки информативности СТОКПК для диагностики гиперкоагуляции были проведены сравнительные исследования. Были предварительно отобраны пробы цитратных плазм с гиперкоагуляцией (10 и 15 мин коагуляцией в предлагаемом тесте СТОКПК. Эти же пробы были исследованы в тесте тромбодинамики и в рутинных тестах оценки гемостаза (АЧТВ, протромбиновое время, MHO и фибриноген). Полученные результаты представлены в таблице 4. Как видно из данных, представленных в таблице 4, плазмы крови (п=14) с гиперкоагуляцией в тесте СТОКПК в 93% случаев совпали с гиперкоагуляцией, выявленной в тесте тромбодинамики и только в одном случае из 14, показатели тромбодинамики оказались в пределах нормальных величин. Гиперкоагуляция в тесте тромбодинамики в 93% случаев обусловлена высокой скоростью генерации фибринового сгустка на поверхности пластины-активатора, что свидетельствует о высокой скорости генерации тромбина. Только в 57% проб выявлено образование спонтанных сгустков и в 42% случаев гиперкоагуляций в тесте тромбодинамики были обусловлены большим размером фибринового сгустка (CS>1200 мкм).
11
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Интересные данные получены при исследовании гемостаза рутинными методами. Так в 3 случаях наблюдается уменьшение показателя АЧТВ, что свидетельствует о гиперкоагуляции (21%), в 4 случаях увеличение ПВ (гипокоагуляция, 29%) . Показатели MHO оказались во всех пробах в пределах нормальных величин и только в 3 случаях был определен повышенный уровень фибриногена.
Таким образом, данные СТОКПК и тромбодинамики в 93% однонаправленно выявляют гиперкоагуляцию, в то время как данные рутинных методов исследования гемостаза в 29% определяют гипокоагуляцию и только в 21 % - гиперкоагуляцию.
Пример 2.
Исследование плазменного гемостаза с использованием предлагаемого теста СТОКПК, прототипа, теста тромбодинамики, и рутинных методов оценки гемостаза (АЧТВ, протромбиновое время, MHO и фибриноген). Были предварительно отобраны пробы цитратных плазм с гипокоагуляцией (25 и 30 мин коагуляцией в предлагаемом тесте СТОКПК). Эти же пробы были исследованы в тесте тромбодинамики и в рутинных тестах оценки гемостаза (АЧТВ, протромбиновое время, MHO и фибриноген). Полученные результаты представлены в таблице 4. Как видно из данных, представленных в таблице 5, данные всех проведенных тестов в 100% совпали. Таким образом, чувствительность тестов СТОКПК, тромбодинамики и рутинных методов исследования гемостаза оказались одинаковыми для оценки состояний гипокоагуляции плазмы крови.
Пример 3.
Сравнительные исследования активности контактного пути коагуляции и показателей коагулограммы (АЧТВ, ПВ. MHO, ФГ). Проведены исследования 96 проб предлагаемым тестом СТОКПК и показатели коагулограммы. Полученные результаты представлены в таблице 6. Как видно из данных, представленных в таблице 6, предлагаемый тест в 62,5%
12
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
случаев выявляет гиперкоагуляцию, 25% нормо-, и 12,5% гипокоагуляцию. В то время как тесты рутинного гемостаза (АЧТВ, ПВ и MHO) не выявляют гиперкоагуляцию в исследованных пробах цитратной плазмы. Рутинные методы коагуляции суммарно в 51% случаев констатировали нормокоагуляцию и в 49% - гипокоагуляцию. В каждой пятой пробе выявляется гиперкоагуляция в тесте СТО П , в то время как по данным коагулограммы регистрируются признаки гипокоагуляции. Обнаруженный факт может иметь прямое отношение к проблеме рестенозов после стентирования артерий, когда на фоне антикоагулянтной терапии у больных наблюдается образование тромбов.
Таким образом, тест СТОКПК является новым тестом для оценки контактного пути активации гемостаза. Сравнительные исследования предлагаемого теста с тромбодинамикой по диагностике гиперкоагуляции показали высокую степень совпадения (93%) и 100% - совпадение при диагностике гипокоагуляции. Полученные новые данные при сравнительных исследованиях предлагаемого теста СТОКПК и рутинных тестов гемостаза (АЧТВ, ПФ и MHO) могут быть полезны для профилактики тромбозов на фоне анти-коагулянтной терапии при оперативных вмешательствах.
Предлагаемый способ отличается простотой, реагенты и расходные материалы являются доступными для диагностических лабораторий. Для регистрации коагуляции плазмы требуется термостат для 96-ти луночных плоскодонных планшетов и фотометр для иммуноферментного анализа. Использование простого и информативного теста определения активации контактного пути коагуляции позволяет проводить скрининг и выявлять людей склонных к тромбозу как на фоне анти-коагулянтной терапии, так и у практически здоровых людей, что позволит начать раннюю профилактику тромбозов, инсультов и инфарктов на этапе до сердечно-сосудистых катастроф.
Таблица 1
13
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Влияние концентрации 0,25 М раствора хлорида кальция на коагуляцию 25% п ли ованной цит атной плазмы оно ов
Таблица 2
Ингибирование контактного пути активации плазменного
гемостаза соевым ингибито ом т ипсина (СИТ
Таблица 3
Данные определения активаций плазменного гемостаза через тканевой фактор (АЧТВ(м) и контактный путь (СТОКПК) в присутствии соевого ингибитора трипсина
(СИТ) и без СИТ.
14
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Таблица 4
Сравнительные данные показателей гемостаза, полученные с использованием п едлагаемого теста СТО ПК . теста т омбодинамики и коаг лог аммы
N - норма; н/т - не тестировали
Таблица 5
Сравнительные данные показателей гемостаза, полученные с использованием п едлагаемого теста СТОКПК), теста т омбодинамики и коаг лограммы
N - норма; отс - отсутствуют; н/т - не тестировали
Таблица 6
Обобщенные данные теста СТОКПК и коаг лог аммы
15
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Claims
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК), включающий смешивание нитратной плазмы крови с хлоридом кальция с последующей фотометрической регистрацией свертывания, отличающийся тем, что, в качестве активатора контактного пути коагуляции используют 96- ти луночные плоскодонные планшеты, запускают реакцию добавлением 25 мкл 0,25 М раствора хлорида кальция к 75 мкл цитратной плазмы, разведенной 1 :2 трис-имидазоловым буфером, рН 7,4, затем инкубируют в течение 30 мин при 37°С, определение коагуляции плазмы проводят фотометрически по изменению мутности проб при длине волны 450 нм с интервалами измерения 0, 10, 15, 20, 25 и 30 мин, коагуляцию плазмы в течение 10 минут - оценивают как гиперкоагуляцию, 15 минут - как повышенную, 20 минут - нормальную коагуляцию плазмы крови и 25 и более минут как гипокоагуляцию
16
ЗАМЕНЯЮЩИЙ ЛИСТ (ПРАВИЛО 26)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EA201900323A EA037879B1 (ru) | 2017-09-26 | 2018-09-13 | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк) |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2017133476A RU2660706C1 (ru) | 2017-09-26 | 2017-09-26 | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (СТОКПК) |
| RU2017133476 | 2017-09-26 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| WO2019066685A1 true WO2019066685A1 (ru) | 2019-04-04 |
Family
ID=62816032
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/RU2018/000601 WO2019066685A1 (ru) | 2017-09-26 | 2018-09-13 | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк) |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EA (1) | EA037879B1 (ru) |
| RU (1) | RU2660706C1 (ru) |
| WO (1) | WO2019066685A1 (ru) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2816538C1 (ru) * | 2023-12-28 | 2024-04-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки плазменного гемостаза |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2767891C2 (ru) * | 2020-08-21 | 2022-03-22 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Северный государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ скринингового обследования для выявления групп риска развития гиперкоагуляционного состояния в условиях экспедиционной работы в Арктике |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1337858B1 (en) * | 2000-10-27 | 2011-03-16 | Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust | A reagent and kit for determining the global coagulability and the hemostatic potential |
| WO2015080629A1 (ru) * | 2013-11-28 | 2015-06-04 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация" | Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IS2809B (is) * | 2011-03-08 | 2012-10-15 | Haskoli Islands | Blóðstorkumæling |
-
2017
- 2017-09-26 RU RU2017133476A patent/RU2660706C1/ru active
-
2018
- 2018-09-13 EA EA201900323A patent/EA037879B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2018-09-13 WO PCT/RU2018/000601 patent/WO2019066685A1/ru active Application Filing
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1337858B1 (en) * | 2000-10-27 | 2011-03-16 | Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust | A reagent and kit for determining the global coagulability and the hemostatic potential |
| WO2015080629A1 (ru) * | 2013-11-28 | 2015-06-04 | Общество С Ограниченной Ответственностью "Гематологическая Корпорация" | Высокоселективный ингибитор контактной активации на основе инфестина 4 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHANG FENG-YU ET AL.: "Optical coherence tomography-guided laser microsurgery for blood coagulation with continuous-wave laser diode", SCIENTIFIC REPORTS, vol. 5, no. 1, 2015, pages 1 - 9, XP055586075 * |
| TILLEY DEREK ET AL.: "Development of a microplate coagulation assay for factor V in human plasma", THROMBOSIS JOURNAL, vol. 9, no. 1, 2011, pages 1 - 6, XP021105583 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2816538C1 (ru) * | 2023-12-28 | 2024-04-01 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Казанский Государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации | Способ оценки плазменного гемостаза |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EA037879B1 (ru) | 2021-05-31 |
| RU2660706C1 (ru) | 2018-07-09 |
| EA201900323A1 (ru) | 2019-11-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2006239202B2 (en) | Method and system for absolute platelet percent aggregation determination | |
| EP2235542B1 (en) | Diagnostic in vitro method for assessing von willebrand disease and increased bleeding risk associated with von willebrand disease and acquired or congenital disorders of platelet function | |
| JP3143694B2 (ja) | 血小板活性の測定 | |
| WO1991001383A1 (en) | Method for diagnosing blood clotting disorders | |
| KR20020042622A (ko) | 전혈내 응고 인자 활성을 측정하는 방법 | |
| Mijovski | Advances in monitoring anticoagulant therapy | |
| JP6461125B2 (ja) | 抗第Ｘａ因子試験のユニバーサル較正のための手段および方法 | |
| Rimsans et al. | Overview and practical application of coagulation assays in managing anticoagulation with direct oral anticoagulants (DOACs) | |
| Hoffmann et al. | Automated nephelometry of fibrinogen: analytical performance and observations during thrombolytic therapy. | |
| Sofi et al. | Role of haemorheological factors in patients with retinal vein occlusion | |
| Treliński et al. | Assessment of selected ROTEM parameters, kinetic of fibrinogen polymerization and plasmin amidolytic activity in patients with congenital fibrinogen defects | |
| WO2019066685A1 (ru) | Скрининг-тест определения контактного пути коагуляции (стокпк) | |
| RU2298189C2 (ru) | Способ определения окислительной модификации фибриногена плазмы крови | |
| RU2703541C1 (ru) | Способ определения фибриногена при рекальцификации цитратной плазмы и оценка его функциональности | |
| RU2379684C2 (ru) | Способ определения антитромботического эффекта ацетилсалициловой кислоты | |
| US5627038A (en) | Factor IX chromogenic assay | |
| RU2772195C1 (ru) | Способ определения функциональной активности антитромбина iii в плазме крови | |
| Li et al. | Prothrombin fragment F 1+ 2 and oral anticoagulant therapy | |
| Lambert et al. | The tri-F titer: a rapid test for estimation of plasma fibrinogen and detection of fibrinolysis, fibrin (ogen) split products, and heparin | |
| Giddings et al. | Laboratory support in the diagnosis of coagulation disorders | |
| Laffan et al. | 18 Laboratory control of anticoagulant, thrombolytic, and antiplatelet therapy | |
| US20220252624A1 (en) | Method for determining the risk of a thromboembolic event | |
| Kato et al. | Differences in the composition of activated partial thromboplastin time (APTT) reagents affect clot waveform analysis | |
| RU2732388C1 (ru) | Способ определения фибриногена и оценка его функциональности | |
| RU2262109C2 (ru) | Способ определения концентрации антитромбина iii в плазме крови |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| 121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 18862159 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
| NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
| 122 | Ep: pct application non-entry in european phase |
Ref document number: 18862159 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |