SU1464090A1 - Способ определени активности антитромбина Ш в плазме крови - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к лабораторной диагностике. Цель изобретени  - повышение точности способа в услови х гепаринотерапии. Рабочий раствор тромбина прогревают и добавл ют к нему исследуемую дефибриниро- ванную адсорбированную плазму, которую предварительно обрабатывают сульфатом бари . После инкубации смесь перенос т в пробирку с раствором фибриногена и регистрируют врем  сверты- ван-л . По калибровочной кривой наход т процентное содержание антитромбина III. 5 табл. (Л

Description

1

Изобретение относитс  к медицине, а именно к лабораторной диагностике нарушений свертываемости крови.

Цель изобретени  - повышение точ- ности способа в услови х гепарино- терагога.

Цель достигаетс  тем, что в способе определени  активности антитромбина (AT) III в плазме крови, вклю- . чающем св зывание AT III дефибрини- рованной плазмы экзогенного тромбина, где об активности AT III суд т по активности остаточного тромбина, удаление гепарина из плазмы осуществл етс  путем адсорбции сульфатом бари ,

Способ осуществл ют следующим образом .

Реактивы: 3,8%-ный раствор цитрата натри , буфер Михаэлиса, рН 7,4, рабочий раствор тромбина (Каунасское предпри тие бакпрепаратов) в буфере i

Михаэлиса, рабочий раствор фибриногена (Каунасское предпри тие бакпрепаратов ) в буфере Михаэлиса, сульфат бари .

Приготовление исследуемой плазмы. Из вены обследуемого силиконирован- ной иглой берут кровь и смешивают ее в силиконированной пробирке с 3,8%-ным раствором цитрата натри  в соотношении 9:1, затем центрифугируют 6 мин при 300 об/мин. Снимают бо- |Гатую тромбоцитами плазму и вновь центрифугируют ее в силиконированной пробирке при 1200 об/мин в течение 20 мин. В полученную бедную тромбоцитами плазму добавл ют суль- .фат бари  из расчета 900 мг/мп, затем в течение 5 мин тщательно перемешивают их стекл нной палочкой.

После этого центрифугируют при 300 об/мин 6 мин. Плазму снимают.

4аь

Ф О СО

роверки качества aAcop6LaiH прово тс  с помощью определени  протром- бинового времени по Квику, которое в хорошо адсорбированной плазме должно ,. превышать 3 мин при активности добавл емого тромбопластина (провер етс  на контрольной нормальной плазме ) 15-20 с. Адсорбированную бедную тромбоцитами плазму прогревают на10

вод ной бане при 56 С в 5 мин. Пссле тепловой дефибринации осаждают фибриноген центрифугированием (10 мин при 1200 об/мин), Надо- садочный слой снимают дл  проведени  15 исследовани .

Приготовление рабочего раствора тромбина. Развод т тромбин в небольшом количестве буфера Михаэлиса (маточный раствор). Часть маточного ра- 20 створа постепенно развод т буфером Михаэлиса, провер   его коагул цион- ную активность добавлением 0,2 мп раствора тромбина к 0,3 мп раствора фи бриногена. Свертьшание должно про- 25 исходить за 15-16 с. При избыточном разведении дл  повышени  коагул ци- онной активности добавл ют маточный раствор тромбина. Рабочий раствор тромбина готов т непосредственно пе- 30 ред исследованрЕем, так как он быстро тер ет свою активность.

Приготовление рабочего раствора фибриногена. Навеску сухого фибрино- гена раствор ют в буфере: Михаэлиса gg до концентрации 0,6% Затем по мето ду Рутберг определ ют содержание коагулирующего белка (с добавлением 15-секундного тромбина) и вновь до- бавл ют буфер.Михаэлиса, довод  кон- 40 центрацию коагулирующего белка до .0,4%,

Ход определени . В силиконирован- ную пробирку набирают 0,8 мл рабочего раствора тромбина, прогревают его 45 на вод ной бане при в течение 2 мин и добавл ют к 0,2 мл исследуемой дефибринированной адсорбированной плазмы и немедленно включа™ ют секундомер. Ровно через 3 мин н н- 50 кубации этой смеси на вод ной бане при 0,2 мл ее перенос т в пробирку с 0,3 мл рабочего раствора фибриногена, предварительно также прогретого в течение 1 мин при 37 С, 55 Немедленно включают второй секувдомер и регистрируют врем  свертьшани . По калибровочной кривой наход т процентное содержание AT-III,

Построение калибровочной кривой. Цитратнлпо плазму, полученную у 10 здоро вых людей, адсорбируют и дефиб- ринируют по указанной методике, после чего все образцы смешивают в равных объемах в одной пробирке. Эту смесь развод т буфером Михаэлиса в 2,4,8 и 16 раз, чем достигаетс  снижение концентрации AT III соответственно до 50-, 25, 12,5 и 6,25%.

По указанной методике опредаа ют активность AT III каждого разведени  в секундах (измерени  провод тс  трижды и при совпадении результатов беретс  их среднее арифметическое). На кривой разведени  по оси ординат откладываетс  дес тичный логарифм времени свертывани  в секундах, а по оси a6c jjicc - активность AT III в- процентах в соответствии с приготовленными разведени ми.

Выработка режимов адсорбции. Проводитс  исследование вли ни  концентрации сорбента на степень удалени  факторов свертывани  (по протромби- новому времени) и активность AT III (по кривой, построенной на адсорбированной плазме).

Данные приведены в табл. 1

УстаноБлено, что активность AT II стабилизируетс  при 5-I ин yтнoй адсорбции с сульфатом бари  в концентрации 400 мг/мл. Дальнейшее увапичение концентрации сорбента не вли ет на определ емую активность AT 111

Дл  исключени  возможного вли ни  факторов свертывани , удал емых сульфатом бариЯр на степень адсорбции гепарина используетс  адсорбированна  плазма, в которой: определ етс  тромбиновое , а затем после г паринизации проводитс  адсорбци .

В табл. 2 представхсена зависимост между степенью гепаринизации плазмы и концентрацией сорбента, достаточно дл  полного удалени  гепарина (при 5-минут:-1ой адсорбции),

Дл  определени  взаимодействи  гепарина и факторов свертывани  удал емых сульфатом бари S определ етс  активность AT III (по кривой, построенной на адсорбированной плазме) при разлнчшзгх степен х адсорбции в плазме с гепарином и без него (табл, 3).

Установлено (табл, 3), что концентраци  сульфата бари ,, рекомендуема  дл  адсорбции,  вл етс  достаточной

дл  удалени  факторов свертывани  и гепарина в концентрации 3 ед/мл плазмы и составл ет 900 мг/мл плазмы.

Пример 1. Больна  А., 32 года .Диагноз: сепсис, дйусторонн   септическа  пневмош  , ДВС-синдром.

В качестве базисной терапии ДВС- синдрома больной подкожно вводили гепарин в суточной дозе 20 тыс.ед.

Результаты лабораторного исследовани  системы гемостаза приведены в табл. 4.

Известным способом вы вилась ложно высока  активность AT III, что объ сн етс  вли нием гепарина.

Вьгавленное предлагаемым способом с.нижение активности AT III  вилось

показанием дл  проведени  коррекцией но-заместительной терапии свежезамо- роженной плазмой в дозе 600 мл.

Пример 2. Больна  С., 37 лет Диагноз: сепсис, ДВС-синдром.

В качестве базисной терапии ДВС- синдрома больной подкожно вводили ге парин в суточной дозе 25 тыс.-ед.

Результаты лабораторного исследовани  системы гемостаза приведены в табл. 5.

услови х гепариноте- обработку плазьты в количестве 900 мг

Таблица 1

ьна 

2275

5995

180, нет свер-100

тывани 

180, нет свер-100

тьшани 

1670

Таблица2

Концентраци  гепарина , ед/мл

Концентраци  сорбента , мг/мп

Таким образом, несмотр  на сниженне активности AT III, определ емое известным способом, данные цифры  вл ютс  завышенными, а действительное снижение активности AT III, определ емое предлагаемым способом,  вл етс  гораздо более глубоким.

Таким образом, при гепаринотера- пии известный способ дает завышение результатов, тогда как результаты, полученные с помощью предлагаемого способа, не завис т от присутстви  в плазме гепарина.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ определени  активности антитромбина III в плазме крови, включающий обработку дефибринированной плазмы экзогенным тромбином с последующей оценкой активности анти- ;тромбина III по активности остаточ- ного тромбина, отличающий- с   тем, что, с целью повышени  точТа блицаЗ

   Таблица4

   Тест I Нольна Контроль

   Активированное парциальное тромбопластиновое

   врем , с4048

   ЭтаноловыйПоложительныйОтрицательный

   ПротаминсульфатныйПоложительныйОтрицательный

   Количество тромбоцитов151 10 /л Активность AT III, %,по

   способу известному 140100

   предлагаемому5,5100

   Таблица5

   ТестВольна Контроль

   Активированное парциальное

   тромбопластиновое врем ,, с4955

   Этаноловый .ПоложительньйОтрицательный

   ПротаминсульфатныйПоложительныйОтрицательный Количество тромбоцитов . д .10 /

   Активность AT III, % по

   способу известному60100

   предлагаемому25100