RU1777089C - Способ исследовани свертывани крови - Google Patents

Abstract

Использование: медицинска  биохими , клинико-лабораторна  практика, тест дл  диагностики и лечени  заболеваний, св занных с патологией системы гемостаза, Целью изобретени   вл етс  ускорение и упрощение способа. Сущность изобретени : в плазму, разбавленную вероналовым буфером в соотношении 1:(10-80), ввод т коагул нт тромбин в соотношении к сгреп- токиназе (1.25-2,5):(1-25) при рН 7,4, ионной силе 0,1-0,15, температуре 22-37°С и регистрируют спектрофотометрически изменени  светорассеивани  при 350 нм, определ   скорость и врем  свертывани  плазмы, концентрацию фибриногена, скорость фибринолиза, врем  полулизиса и полного лизиса фибринового сгустка по полученному спектру. Фиг. 2, табл. 3. сл с XI XJ VI о 00 ю

Description

Изобретение относитс  к медицинской биохимии и может быть использовано в клинико-лабораторной практике в качестве теста дл 

заболеваний,

системы.

ДИЭГНОС1ИКИ

св занных с

и лечени  патологией

Дл  объективного исследовани  заболеваний системы гемостаза осуществл ют тестирование несколькими способами, определ   основные параметры свертывани  и фиб- ринолиза, например: скорость свертывани , содержание фибриногена в плазме и врем  лизиса сгустка.

Известны в клинико-лабораторной практике следующие способы определени :

-количественное определение содержани  фибриногена в плазме крови путем введени  в нее смеси монойодуксусной кислоты с фосфатным буфером, инкубировани  с тромбином, содержащим ионы кальци , растворение отмытого сгустка в 1,5%-ной уксусной кислоте в соотношении к плазме (20-25): 1, общее врем  - около 40-50 мин,

-определение времени лизиса сгустка в разведенной (1:10) крови без коагул нта в течение 7-8 ч,

-определение времени лизиса эуглобу- линового сгустка с добавлением во фракцию тромбина и раствора хлористого кальци  при температуре 37°С, общее врем  3-4 ч в норме,

-определение времени эуглобулиново- го лизиса на фибриновых пластинах, общее врем  18-24 ч,

-определение времени лизиса эуглобу- линового сгустка при введении во фракцию стрептокиназы.

Из числа известных аналогов прототипом за вл емого способа  вл етс  способ определени  времени лизиса эуглобулино- вого сгустка, который включает осуществление следующих операций:

-получение эуглобулиновой фракции путем введени  0,016% уксусной кислоты в плазму, выдерживание в течение 20 мин, в холодильнике, центрифугирование, отделение и высушивание осадка,

-введение фосфатного буфера, тщательное перемешивание,

-добавление смеси стрептокиназы (фирма Стрептаза, Швейцари  и 0,277% раствора хлористого кальци  при легком покачивании;

-после образовани  сгустка след т с помощью секундомера за временем лизиса, норма которого составл ет 10±0,5 мин.

Обща  продолжительность способа - 40-60 мин.

Однако все известные способы обладают существенными недостатками: они требуют значительного времени и определ ют только один параметр сложной системы гемостаза , причем, в основном, визуально полуколичественно.

Целью изобретени   вл етс  ускорение и упрощение сюсоба.

Цель достигаетс  тем, что в способе определени  параметров свертывани  и фиб- ринолиза крови, включающем последовательное введение коагул нта и

стрептокиназы во фракцию крови, перемешивание смеси определение параметров путем регистрации изменени  светорассе ни , о качестве сырь  используют плазму, разбавленную в вероналовом буфере в соотношении 1:(10-80), в которую ввод т коагул нт тромбин в соотношении к стрептокиназе (1,25-2,5):(1-25) при рН 7,4, ионной силе 0,1-0,15 и температуре 22- 37°С и регистрируют спектрофотометрически изменени  светорассе ни  при 350 нм, определ   скорость и врем  свертывани  плазмы, концентра цию фибриногена, скорость фибринолиза врем  полулизиса и полного лизиса фибри

нового сгустка

Благодар  указанному диапазону соотношений тромбина к стрептокиназе (1,25- 2,5):(1-25), определенным показани м, характеризующим кислотно-щелочное состо ние , ионную силу температуру, достигаетс  сначала свертывание фибриногена под действием тромбина, а затем лизис ф ибри- нового сгустка под действием стрептокиназы во вре мени, достаточном дл 

одновременного спектрофотометрического определени  шести параметров свертывани  и фибринолиза на одном образце плазмы .

Обща  продолжительность способа - не

более 10 мин в норме, что значительно меньше времени, которое затрачивают при осуществлении известных аналогов.

На фиг,1 представлена стандартна  крива  изменени  светорассе ни  при

свертывании и лизисе фибрина в разбавленной плазме крови; на фиг.2 - калибровочна  крива  дл  определени  концентрации фиб- риногеиа в донорской плазме по максимальному светорассе нию.

Лева  часть кривой на фиг.1 характеризует процесс свертывани  фибриногена, сопровождающийс  увеличением поглощени  вплоть, до максимального значени  (Емакс.- Ш). Эта величина пр мо пропорциональна

концентрации свертываемого фибриногена плазмы, что позвол ет определить его точную концентрацию по калибровочной кривой , приведенной на фиг.2. Скорость увеличени  светорассе ни , определ ема 

по тангенсу угла наклона касательной, проведенной к точке максимального увеличени  светорассе ни  (tg а на фиг.1), характеризует скорость образовани  фибрина в плазме (1). Така  характеристика общеприн та при изучении полимеризации фибрина.

Врем  достижени  максимального светорассе ни  (ti) представл ет собой врем  свертывани  плазмы (11). После этого, как весь фибриноген плазмы превратитс  в фибрин и формируетс  сгусток, начинаетс  его лизис под действием стрептокиназы, сопровождающийс  уменьшением светорассе ни  до исходного уровн . Скорость уменьшени  светорассе ни  (tg /3) характеризует скорость фибринолиза (IV). Врем , за которое максимальное светорассе ние уменьшаетс  в 2 раза (ti/2) представл ет собой врем  полулизиса сгустка (V), а врем , за которое ЕЗБО возвращаетс  к исходному нулевому уровню (t2) - врем  полного лизиса - (VI). Эти параметры (врем  полулизиса и врем  полного лизиса сгустка) характеризуют фибринолитический потенциал плаз- мы и используютс  дл  оценки фибринолитической активности (7). Уменьшение времени полулизиса/лизиса сгустка свидетельствует об ускорении, а увеличение - об угнетении фибринолиза. Определе- ние оптимальных условий способа, за вленных в формуле изобретени , провод т эксперимейтально. При концентрации тромбина до 1,0 N1H ед/мл скорость свертывани  растет, а затем остаетс  посто н- ной. Скорость и врем  лизиса не завис т от концентрации тромбина в диапазоне 0-5 N1H ед/мл.

При увеличении концентрации стрептокиназы до 0-25 ед/мл параметры свертыва- ни  не измен ютс , в то врем  как скорость лизиса растет, а врем  лизиса уменьшаетс  в интервале концентрации стрептокиназы 0-4 ед/мл, а затем эти параметры не мен ютс  в пределах от 4-25 ед/мл,

Оптимальными концентраци ми тромбина и стрептокиназы дл  обеспечени  высокойвоспроизводимостии стандартизации  вл ютс  концентрации тромбина (1,25-2,5) N1H ед/мл и стреп- токинагы 1-25 ед/мл,

Степень разбавлени  плазмы веронало- вым буфером лимитируетс  чувствительностью спектрофотометра (СФ-46).

Вли ние содержани  фибриногена в плазме .на параметры свертывани  и фиб- ринолиэа изучают следующим образом: к 0,1 мл донорской плазмы с известным содержанием фибриногена добавл ют возрастающие количества фибриногена или используют различные разбавлени  плазмы . Тромбин (2,5 М1Н/мл) ввод т при посто нном количестве стрептокиназы (1 или 5 ед/мл). Как видно, на фиг.2 увеличение концентрации фибриногена сопровождаетс  возрастанием величины Емакс (I И), причем зависимость ее от концентрации фибриногена носит линейный характер. Увеличение количества вносимой в пробу плазмы в 2 раза также приводит к 2-кратному увеличению Емакс, поэтому дл  построени  калибровочной кривой можно использовать различные разведени  донорской плазмы. Полученна  линейна  коррел ци  Емакс. и концентрации фибриногена дает возможность быстро определ ть концентрацию фибриногена в плазме.

Все исследовани  следует проводить в определенном диапазоне температур 22- 37°С. Понижение температуры снижает скорость свертывани  и фибринолиза.

Дл  ускорени  этих процессов при температуре 22°С следует увеличить количество стрептокиназы (пример 5). Повышение ионной силы выше 0,15 тормозит свертывание фиб риногена плазмы, а при понижении ионной силы менее 0,1 увеличиваетс  Емакс. светорассе ни .

Способ провод т при строгом соблюдении физиологического значени  рН - 7,4,т.к. при подкислении среды до рН 5,4 скорость свертывани  (tg 2-1) уменьшаетс  в 3 раза, скорость фибринолиза (tg Д-IV) - в 2 раза. При подщелачивании до рН 8,0 увеличиваетс  активность плазмина, что вызывает быструю деградацию фибриногена.

Пример 1. В термостатированную кювету спектрофотометра с автоматической регистрацией светорассе ни  (А 350 нм) внос т последовательно 0,1 мл бедной тромбоцитами цитратной плазмы крови человека (здорового донора), 1,84 мл 0,02 М вероналового буфера, содержащего 0,13 М NaC и 0,001 М CaCIa, т.е. соотношение плазмы к вероналовому буферу 1:20 (при рН 7.4 ионной силе 0,15) 0,01 мл раствора стрептокиназы (1000 ед/мл) до конечной концентра ции 5 ед/мл и 0,05 мл раствора тромбина (100 N1H ед/мл) до конечной концентрации 2,5 N1Н ед/мл в том же буфере. Смесь тщательно перемешивают, фотометрируют при температуре 37°С и провод т анализ кривой изменени  светорассе ни , полученной с помощью самописца (фиг. 1) дл  определени  времени свертывани  (ti, мин.), скорости свертывани  фибриногена (tga), величины максимального светорассе ни  (Емакс), по которой .наход т концентрацию фибриногена в плазме (фиг.2), скорость фибринолиза (tg Д), врем  полулизиса (ti/2, мин) и врем  полного лизиса (т.2, мин) фибриново- го сгустка. Результаты расчета приведены в табл.1,

Примеры 2-5.

Все операции, проводимые с донорской плазмой, регистрацию светорассе ни  и определение шести параметров свертывани  и фибринолиза осуществл ют согласно описанию примера 1.

Услови , режимы и результаты дл  каждого примера представлены в табл.1,

Пример 6.

Все операции, проводимые с плазмой крови больного гастроэнтероколитом (ГЭК), регистрацию светорассе ни , а затем определение шести параметров свертывани  и фибрииолиза осуществл ют согласно описанию примера 1.

Услови , режимы и результаты представлены в табл,1

Пример 7.

Все операции, проводимые с плазмой крови больного ишемической болезнью сердца (ИБС) перед операцией (артериокоро- нарное шунтирование), регистрацию светорассе ни  и определение шести параметров свертывани  и фибринолиза осуществл ют согласно описанию примера 1.

Услови , режимы и результаты представлены в табл,1,

Доказательство точности нового способа провод т по двум схемам сравнени ,

1. Сопоставл ют результаты определени  параметров свертывани  и фибринолиза на плазме 10 здоровых доноров при посто нной t 37°C, ионной силе 0,15 рН 7,4 разбавлении плазмы о вероналовом буфере 1:20, концентрации тромбина 2,5 N1H ед/мл, стрептокиназы 5 ед/мл.

Результаты, представленные в ,2, покасыпают тождественность параметров.

И, Сопоставл ют результаты определени  чОицентрацш. фибриногена по новому способуиспособу-анало у. Новый мет од позвол ет получить те же самые результаты в пределах ошибки сравниваемых методов,

Способ по точности не ус, упает известным аналогам.

Полученные результаты по способу полностью совпадают с результатами общеприн тых коагулологических методов оценки состо ни  (емосгаэа, в частности, определение времени свертывани  количества тромбоцитов, содержани  продуктов расщеплени  фибриногена (фибрина-ПРФ) и растворимых комплексов фибрина - РКФ

антитромбина III, протромбинового индекса .

Преимущества нового способа в сравнении с известными аналогами заключают- с  в следующем:

-сокращение времени до 10 мин в отличие от известных способов: 40-60 мин или 3-24 ч,

-многоаспектность диагностических исследований за счет расширени  диапазона определ емых параметров: вместо одного параметра одновременно определ ют 6 параметров свертывани  и фибринолиза

-упрощение методологических при- емов за счет исключени  сложного получени  эуглобулиновой фракции;

-услови  и схема проведени  нового способа позвол ют осуществить компьютеризацию процесса диагностических исследований плазмы крови.

Claims (1)

1. Формула изобретени 

   Способ исследовани  свертывани  крови , включающий определение показателей свертывающей и фибринолитической систем крови, отличающийс  тем, что, с целью ускорени  и упрощени  способа, в кювету спектрофотометра ввод т бедную

   тромбоцитами плазму и вероналсвый буфер в соотношении V/V1:10-80 при ионной силе 0,1 -0,15 рН - 7,4, затем добавл ют растворы сгрептокиназы и тромбина в соотношении (,,5):(1-15) и регистрируют кинзтику

   светорассе ни  при 350 нм, а показатели систем крови рэссчитывают из характеристик полученной кривой соответствующих калибровочных кривых, приэтом о соде ржании фибриногена суд т по максимальному

   светорассе нию, о скорости свертывани  фибриногена - по тангенсу угла, образуемого касательной к точке максимального увеличени  светорассе ни , о времени свертывани  фибриногена - по времени достижени  максимального светорассе ни , о

   скорости фибринолиза - по тангенсу угла

   наклона касательной к точке максимального

   уменьшени  светорассе ни , а о времени

   полулпзиса и полного лизиса - соответстпенно по времени уменьшени  максимальное светорассе ни  в два раза и по времени возвращени  светорассе ни  к исходному уровню.

   Пример 1 (донорска  плазма) 0,15

   Пример 2 (донорска  плазма) 0,15

   Пример 3 (донорска  плазма) 0,15

   Пример 4 (донорска  плазма) 0,15

   Пример 5 (донорска  плазма) 0,1

   Пример 6

   (плазма

   больного

   ГЭК)0,15

   Пример 7

   (плазма

   больного

   ИБС)0,15

   7,4370,11:201,02,50,51 2,8 0,020/0,7 0,062k

   7,4370,11:205,02,5111,25 0,082/2,7 4,23,04,0

   7,4370,2 1:10 5,02,5241,1 0,164/5,4 4,43,34,3

   7,4370,025 1:60 5,02,50,8 2,3 0,020/0,7 0,574,55,2

   7,4370,11:20 1,02,55,6 1,9 0,082/2,7 1,73,77,0

   7,4220,11:20 251,254,3 2,0 0,082/2,7 2,04,05,1

   60

   1 370,11:20 5,02,5281,2 0,232/6,6 6,22,83,3

   Таблица2

   Таблица 3

   Определение концентрации фибриногена в плазме крови человека

   0.1

   0.05

   макс

   345

   Врем , мин. Фиг.1