EA010158B1

EA010158B1 - Пептид, повышающий резистентность капилляров, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения

Info

Publication number: EA010158B1
Application number: EA200601579A
Authority: EA
Inventors: Владимир Хацкелевич Хавинсон; Евгений Иосифович ГРИГОРЬЕВ; Владимир Викторович МАЛИНИН; Галина Анатольевна Рыжак
Original assignee: Общество С Ограниченной Ответственностью "Сиа Пептайдс"
Priority date: 2006-05-23
Filing date: 2006-09-27
Publication date: 2008-06-30
Also published as: EP2024387B1; UA91137C2; IL194500A0; ATE446309T1; IL194500A; EA200601579A1; RU2295970C1; DE602006009976D1; DK2024387T3; US7851449B2; EP2024387A1; WO2007136294A1; KR20090009867A; US20090099098A1

Abstract

Изобретение относится к лекарственным средствам для коррекции метаболического сосудистого синдрома и заболеваний, сопровождающихся нарушением проницаемости сосудистой стенки и ломкостью капилляров, и может быть использовано как средство, повышающее резистентность капилляров. Предлагается пептид лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Lys-Glu-Asp-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], обладающий биологической активностью, проявляющейся в повышении резистентности капилляров. Предлагается фармацевтическая композиция, повышающая резистентность капилляров, содержащая в качестве активного начала эффективное количество пептида лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы H-Lys-Glu-Asp-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], и фармацевтически приемлемый носитель. При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения. Предлагается способ профилактики и/или лечения нарушения микроциркуляции в органах и тканях, заключающийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы H-Lys-Glu-Asp-OH последовательности 1 [SEQ ID NO:1], в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта. При этом введение осуществляют парентерально.

Description

Изобретение относится к лекарственным средствам для коррекции метаболического сосудистого синдрома и заболеваний, сопровождающихся нарушением проницаемости сосудистой стенки и ломкостью капилляров, и может быть использовано как средство, повышающее резистентность капилляров.

Нарушение микроциркуляции крови в различных органах и тканях является одним из важнейших звеньев патогенеза большого числа заболеваний и патологических состояний.

Известны средства, нормализующие проницаемость сосудов и улучшающие метаболические процессы в стенках сосудов.

Среди препаратов необходимо отметить продектин, дицинон, доксиум, гливенол, эскузан (Большая Российская Энциклопедия лекарственных средств, М.: Изд-во, Ремедиум, т. 2, 2002), применяемые для повышения устойчивости капилляров и нормализации их проницаемости при различных заболеваниях. Однако они характеризуются недостаточной эффективностью, наличием побочного действия и ограничением применения при нарушениях системы свертывания крови.

Это обусловливает необходимость разработки новых ангиопротекторных лекарственных препаратов.

Структурных аналогов, представленных в уровне техники, предлагаемый пептид не имеет.

Настоящим изобретением поставлена и решена задача получения нового пептида, который обладает биологической активностью, проявляющейся в повышении резистентности капилляров, и фармацевтической композиции, содержащей этот пептид.

Технический результат изобретения заключается в создании нового пептида, повышающего резистентность капилляров, а также фармацевтической композиции, содержащей этот пептид в качестве активного начала, использование которой повышает резистентность капилляров и прочность стенок сосудов за счет нормализующего влияния на метаболические процессы в клетках стенок сосудов.

Указанный технический результат в отношении указанных объектов достигается тем, что предлагается пептид лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Ьук-СЫ-Лкр-ОН последовательности 1 |8ЕО ΙΌ N0:1], обладающий биологической активностью, проявляющейся в повышении резистентности капилляров.

Предлагается применение пептида лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Ьук-СЫ-Лкр-ОН последовательности 1 |8Е0 ΙΌ N0:1] для приготовления лекарственного средства, повышающего резистентность капилляров.

Другой аспект настоящего изобретения касается фармацевтической композиции, повышающей резистентность капилляров, содержащей в качестве активного начала эффективное количество пептида лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Еу5-С1и-Л5р-ОН последовательности 1 |8Е0 ΙΌ N0:1] и фармацевтически приемлемый носитель.

При этом фармацевтическая композиция находится в форме, подходящей для парентерального введения.

Следующий аспект настоящего изобретения касается способа профилактики и лечения нарушения микроциркуляции в органах и тканях, заключающегося во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Ьук-бШ-Лкр-ОН последовательности 1 |8Е0 ΙΌ N0:1] в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела, по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

При этом введение осуществляют парентерально.

Пептид общей формулы Н-Ьук-СШ-Лкр-ОН получают классическим методом пептидного синтеза в растворе.

Регулирующее действие пептида Н-Ьук-СЫ-Лкр-ОН на сосудистую стенку, т.е. повышающее резистентность капилляров и прочность стенок сосудов, выявлено при его экспериментальном изучении.

Изучение биологической активности проводили на эксплантатах стенки сосудов при экспериментальном парадонтите у крыс и у пациентов с поражением сосудов различной этиологии.

Понятие «фармацевтическая композиция» подразумевает различные лекарственные формы, содержащие пептид, которые могут найти лечебное применение в медицине в качестве средства, повышающего резистентность капилляров.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, эффективное количество пептида Н-Еу5-С1и-Л5р-ОН как активное начало (действующее вещество) смешивают с фармацевтически приемлемым носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Понятие эффективное количество подразумевает использование такого количества активного начала, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм.

Для парентерального введения носитель обычно включает в себя физиологический раствор или стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности или сохранению стерильности.

- 1 010158

Сущность изобретения поясняется фигурой и таблицами.

В табл. 1 показано влияние пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН на морфологические и биохимические показатели периферической крови морских свинок при изучении токсичности.

На фигуре показано влияние пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН на развитие эксплантатов сосудистой стенки.

В табл. 2 показано влияние пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН на резистентность капилляров кожи пациентов с гиповитаминозом.

В табл. 3 показано влияние пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН на показатели гемостаза у больных сенильной пурпурой.

Изобретение иллюстрируется примером синтеза пептида лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН (пример 1), примерами испытания токсичности и биологической активности пептида (примеры 2-4), а также примерами результатов клинического применения пептида, демонстрирующими его фармакологические свойства и подтверждающими возможность достижения профилактического и/или лечебного эффекта (примеры 5, 6).

Пример 1. Синтез пептида Н-Ьук-ОЫ-Акр-ОН.

1. Название соединения: лизил-глутамил-аспарагиновая кислота.

2. Структурная формула: Н-Ьук-ОШ-Акр-ОН

3. Брутто-формула без противоиона: С1₅Н₂₆Ы₄О₈.

4. Молекулярный вес без противоиона: 390,39.

5. Противоион: ацетат.

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха.

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме

ВОС-О1и(ОВг1)-ОН

НО8и

ТЭСС

ВОС-О1и(ОВг1)-О8и

Н-Азр(ОВг1)-ОН

ВОС-С1и(ОВг1)-А₅р(ОВг1)-ОН

1) ТГА

2) Ζ-Ι.ν.5(Ζ)-Ο8ιι

Ζ-Εγ8(Ζ)-Ο1ιι(ΟΒζ1)-Α3ρ(ΟΒζ1)-ΟΗ

Η ₂/Ρί

Н-Ьуз-С1и-Лнр-ОН

ВОС - трет-бутилоксикарбонильная группа;

Ζ - бензилоксикарбонильная группа;

О8и - Ν-оксисукцинимидный эфир;

ОСС - Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид;

ОВ/1 - бензиловый эфир;

ТРА - трифторуксусная кислота.

6. Характеристики готового препарата:

содержание основного вещества: 98,15% (по ВЭЖХ, 220 нм);

ТСХ - индивидуален, К.(=0,65 (ацетонитрил-вода 1:3);

содержание влаги: 6%;

рН 0,01% раствора: 4,77;

удельное оптическое вращение: [а]_с ²²: -31° (с=1, Н₂О), Ро1аша1 А, Саг1 Ζοίδδ 1еиа.

- 2 010158

Пример синтеза.

1) ВОС-С1и(ОВ/1)-О8и. Ν-оксисукцинимидный эфир Ы-трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовой кислоты (I).

№трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовую кислоту ВОС-С1п(ОВх1)-ОН (33.7 г. 0.1 моль) растворяли в 50 мл Ν.Ν'-диметилформамида. охлаждали до температуры -10°С. добавляли при перемешивании охлажденные (4-6°С) растворы Ν.Ν'-дициклогексилкарбодиимида (23.0 г. 0.11 моль) в 30 мл Ν.Ν'-диметилформамида и Ν-гидроксисукцинимида (13.0 г. 0.11 моль) в 20 мл Ν.Ν'-диметилформамида. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч при охлаждении льдом и далее в течение 1 суток при комнатной температуре. Выпавшую Ν.Ν'-дициклогексилмочевину отфильтровывали и полученный раствор активированного эфира использовали без выделения на следующей стадии.

2) ВОС-С1п(ОВ/1)-А8р(ОВ/1)-ОН. №трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-ф-бензил)- аспартат (II).

(в-Бензил)аспарагиновую кислоту Н-Акр(ОВх1)-ОН (28.0 г. 0.12 моль) и 36 мл (0.12 моль) триэтиламина суспендировали в 50 мл Ν.Ν'-диметилформамида и перемешивали в течение 1 ч. Затем добавляли порциями раствор активированного эфира ВОС-С1и(ОВ/1)-О8и (I). полученный на предыдущей стадии. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Затем подкисляли 0.5н. серной кислотой до рН 2-3 и экстрагировали этилацетатом 4x50 мл. Вытяжки объединяли и последовательно промывали 0.5н. Н₂8О₄ 3x50 мл. водой 2x50 мл. 5% раствором NаΗСОз 2x50 мл. водой 2x50 мл. насыщенным раствором №С1 2x50 мл. Органический слой сушили над №ь8О₄. упаривали растворитель в вакууме. остаток кристаллизовали под гексаном.

Получено 50 г продукта (92%).

Кг =0.34 ( бензол-ацетон 2:1).

3) ТВАН-С1и(ОВ/1)-А8р(ОВ/1)-ОН (III). трифторацетат (у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартата.

№трет-бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартат (II) 5.68 г (»0.01 моль) растворяли в 20 мл смеси дихлорметан-трифторуксусная кислота (3:1). Через 2 ч растворитель упаривали в вакууме при температуре 40°С. упаривание повторяли с новой порцией дихлорметана (2x10 мл). остаток сушили в вакууме над №1ОН. Получено масло 5.80 г (»100%).

К(=0.63 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода. 15:10:3:12).

4) 2-Ву8(2)-С1и(ОВ/1)-Л8р(ОВх1)-ОН (IV). Н№-дибензилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-ф- бензил)аспартат.

Трифторацетат (у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартата (III) 5.65 г (0.01 моль) растворяли в 10 мл диметилформамида. добавляли триэтиламин 2.80 мл (0.02 моль) и Ν-оксисукцинимидный эфир ^№-дибензилоксикарбониллизина 6.64 г (0.013 моль). Смесь перемешивали в течение 24 ч при комнатной температуре.

Продукт высаживали 0.5н. раствором серной кислоты (150 мл). экстрагировали в этилацетат (3x30 мл). промывали 0.5н. раствором серной кислоты (2x20 мл). водой. 5% раствором бикарбоната натрия (1x20 мл). водой. 0.5н. раствором серной кислоты (2x20 мл). водой и сушили над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтровали. упаривали в вакууме при температуре 40°С. остаток закристаллизовывали в системе этилацетат/гексан. Продукт отфильтровывали и сушили в вакууме над Р₂О₅.

Выход 6.04 г (72%). Тпл=142°С.

К.(=0.60 (бензол-ацетон 1:1).

5) Н-Ьу5-61ц-Л5р-ОН (V). лизил-глутамил-аспартат.

Защищенный трипептид 2-Ву8(2)-С1и(ОВ/1)-Л8р(ОВх1)-ОН (IV) (0.90 г) растворяли в смеси метиловый спирт-вода (4:1) и гидрировали над катализатором Рб/С (5%) в течение 4 ч. Полноту прохождения реакции деблокирования контролировали по ТСХ в системе ацетонитрил-вода (1:3). Растворитель упаривали в вакууме. остаток сушили в вакууме над КОН.

Для очистки 300 мг препарата растворяли в 4 мл 0.01% трифторуксусной кислоты и подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии на колонке с обращенной фазой 50x250мм Б1акотЬ-130С16Т. 7 мкм. Хроматограф Весктап 8ук1ет Со1б. 126 8о1усп1 Моби1е. 168 Бюбе Аггау Бс1ссЮг Моби1е.

Условия хроматографирования: А - 0.1% ТРА; В - МеСШ).1% ТРА. градиент В 0^50% за 100 мин. Объем пробы 5 мл. детекция при 215 нм. сканирование 190-600 нм. скорость потока 10 мл/мин. Отбирали фракцию 42.0-47.0 мин. Растворитель упаривали в вакууме при температуре не выше 40°С. упаривание многократно (5 раз) повторяли с 10 мл 10% раствора уксусной кислоты.

Окончательно остаток растворяли в 20 мл деионизованной воды и лиофилизовывали. Получено 270 мг очищенного препарата в виде аморфного белого порошка без запаха.

6) Анализ готового препарата.

Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке Рйепотепех С 18 ΕυΝΑ 4.6x150 мм. А: 0.1% ТРА. В: МсС№; дгаб.В 0-100% через 10 мин.Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм. сканирование 190-600 нм. проба 20 мл. Содержание основного вещества 98.15%.

- 3 010158

ТСХ: индивидуален, ^,=0.65 (ацетонитрил-вода 1:3, пластинки ПТСХ-П-В-УФ 8огЬВ1, силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин).

Содержание влаги: 6% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С). рН 0,01% раствора: 4,77 (потенциометрически).

Удельное оптическое вращение: |α|ι.)²²: -31° (с=1, Н₂О), Ро1ата! А, Саг1 Ζθίδδ 1еиа.

Пример 2. Изучение токсичности пептида Н-Бук-С1и-Акр-ОН.

Общетоксическое действие пептида Н-Бук-С1и-Акр-ОН исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2000): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 66 белых беспородных мышах-самцах массой 20-23 г. Животные были рандомизированно разделены на 6 равных групп. Препарат вводили животным однократно внутримышечно в дозах 1, 2, 3, 4, 5 мг/кг в 0,25 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы в том же объеме вводили 0,9% раствор ИаС1.

Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 60 белых беспородных крысахсамцах массой 160-240 г. Ежедневно однократно животным подопытных групп вводили препарат внутримышечно в течение 90 дней в дозах 1 мкг/кг, 0,1, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. Животным контрольной группы вводили в том же объеме стерильный 0,9% раствор ИаС1. До введения препарата на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулологические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 96 морских свинках-самцах массой 300-340 г. Животные подопытных групп получали ежедневно однократно внутримышечно пептид в течение 6 мес. в дозах 1 мкг/кг, 0,1г, 1 мг/кг в 0,5 мл стерильного 0,9% раствора ИаС1. В контрольной группе животным вводили по аналогичной схеме стерильный 0,9% раствор ИаС1 в том же объеме. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании влияния пептида на морфологический состав крови морских свинок установлено увеличение количества лейкоцитов через 3 и 6 месяцев после начала введения препарата (табл. 1). Остальные показатели морфологического состава крови животных практически не изменялись. Не отмечено достоверного влияния препарата на СОЭ, резистентность эритроцитов и биохимические показатели сыворотки крови.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Отсутствие общетоксического действия позволяет рекомендовать фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-Бук-С1и-Акр-ОН, для проведения клинических испытаний.

Пример 3. Влияние пептида Н-Бук-С1и-Акр-ОН на развитие эксплантатов сосудистой стенки.

Эксперименты проведены на 32 фрагментах сосудистой стенки периферической артерии крыс линии «ХУМаг» массой тела 150-200 г. Питательная среда для культивирования эксплантатов состояла из 35% раствора Игла, 25% фетальной сыворотки теленка, 35% раствора Хенкса, 5% куриного эмбрионального экстракта, в среду добавляли глюкозу (0,6%), инсулин (0,5 ед./мл), пенициллин (100 ед./мл), глютамин (2 мМ). Фрагменты сосудистой стенки помещали в эту среду и культивировали в чашках Петри в термостате при 36,7°С в течение 2 суток. В экспериментальную среду добавляли пептид Н-Бук-С1и-Акр-ОН в концентрациях 1, 10, 100 и 200 нг/мл. Критерием биологической активности служил индекс площади (ИП) - соотношение площади всего эксплантата вместе с зоной роста к исходящей площади фрагмента сосудистой стенки. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принималось за 100%.

- 4 010158

Установлено, что через 1 сутки культивирования происходило распластывание эксплантатов на коллагеновой подложке и начиналось выселение пролиферирующих и мигрирующих клеток по периферии эксплантата. На 3-и сутки культивирования при концентрации пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН 100 нг/мл наблюдалось достоверное повышение ИП эксплантатов на 24% по сравнению с контрольными значениями ИП. При исследовании эксплантатов сосудистой стенки на более длительных сроках культивирования (7 дней) были выявлено аналогичное стимулирующее действие пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН в той же концентрации.

Таким образом, в отношении ткани сосудистой стенки пептид Н-Ьук-СЫ-Лкр-ОН оказывал тканеспецифическое действие, проявляющееся в стимуляции роста эксплантатов.

Пример 4. Влияние пептида Н-Ьук-СШ-Лкр-ОН на микроциркуляцию у крыс с экспериментальным пародонтитом.

Эксперименты проведены на 45 белых беспородных крысах обоего пола массой тела 180-200 г. Модель пародонтита легкой степени достигалась методикой дифференцированного кормления крыс с использованием стандартного гранулированного корма ПК-120 в течение 1,5 месяца. В ходе эксперимента животные были распределены на 3 группы по 15 крыс в каждой:

1- я группа животных с экспериментальным пародонтитом, предоставленным собственному течению;

2- я группа животных с экспериментальным пародонтитом, которым вводили 0,1 мл стерильного 0,9% раствора №1С1 в слизистую переходной складки десны (контроль);

3- я группа животных с экспериментальным пародонтитом, которым вводили пептид Н-Ьук-СЫ-Лкр-ОН в течение 10 дней путем ежедневной однократной инъекции в дозе 2 мкг в 0,1 мл стерильного 0,9% раствора №1С1 в слизистую переходной складки десны с одновременным втиранием раствора пептида.

Во всех сериях опытов под нембуталовым наркозом проводилась биомикроскопия слизистой оболочки десны у крыс с использованием контактных объективов, оценивалась скорость кровотока в капиллярах с помощью лазерного анализатора капиллярного кровотока ЛАКК-01. Исследования проводились в 3-х зонах десны: в свободной десне, в прикрепленной десне и переходной складке при увеличении 100. Клинические проявления пародонтита оценивали визуально.

При биомикроскопической оценке микроциркуляторного русла в тканях пародонта животных 1-й группы обнаружено преобладание воспалительных изменений в микрососудах, особенно ярко выраженных в свободной десне. В данной области капилляры резко расширены, кровоток в них заметно замедлен. В венулярной части капилляры перегружены кровью за счет нарушения венозного оттока. Периваскулярная ткань отечная, фон мутный. По ходу капилляров отмечались диффузные периваскулярные геморрагии, что свидетельствует о значительном повышении проницаемости их стенок.

В зоне прикрепленной десны указанные признаки нарушения микроциркуляции сохраняются, но выражены в меньшей степени. В переходной складке десны признаки расстройства микроциркуляции носят более разнообразный характер: в поверхностном слое слизистой оболочки полости рта наблюдаются гиперемированные капилляры с адгезией лейкоцитов и диапедезными геморрагиями, особенно выраженными в посткапиллярном звене микроциркуляторного русла. В глубоких слоях слизистой оболочки на фоне отека тканей выявляются гиперемированные артериолы с деформированными контурами, а также гиперемированные венулы с замедленным зернистым кровотоком. Наибольший показатель индекса микроциркуляции (ИМ), характеризующего суммарную балльную оценку нарушения микроциркуляции, был выявлен при гингивите в свободной десне - 0,54±0,01, что более чем в 2 раза выше, чем в нормальном пародонте (0,21±0,30). Этот показатель в прикрепленной десне составил 0,31±0,08, а в области переходной складки - 0,27±0,04. Морфометрическое исследование показало увеличение диаметров капилляров во всех зонах десны: в свободной десне - 9,7±0,21 мкм, в прикрепленной десне - 8,9±0,25 мкм и в переходной складке - 8,7±0,11 мкм. Во всех исследуемых зонах наблюдалось повышение плотности капилляров на единицу площади по сравнению со здоровыми тканями пародонта в среднем до 40±1,2 мм²(в норме 29,3±2,3мм²). Лазерная допплерография показала повышение скорости кровотока во всех зонах десны: в свободной десне - 29±1,2 усл. ед.; в прикрепленной десне - 27±0,5 усл. ед.; в переходной складке - 22±1,0 усл. ед. (в норме - 18±1,3 усл. ед.). Осмотр слизистой оболочки десны крыс 2-й группы (контроль) обнаружил распространенное изменение ее окраски от бледно-розового до ярко-красного с синюшным оттенком цвета. Биомикроскопия слизистой оболочки выявила дальнейшее ухудшение трофического обеспечения тканей пародонта в виде прогрессирующего расстройства микроциркуляции. Так, кровоток в капиллярах и мелких венулах свободной и прикрепленной десны приобретал зернистый и замедленный характер с локальной агрегацией эритроцитов. Контуры сосудов приобретали извитой характер и были деформированы. Заметно нарастала проницаемость гистогематического барьера, о чем свидетельствует отечность интерстиция в виде помутнения фона и диффузные периваскулярные геморрагии. Как компенсаторная реакция на нарушение микроциркуляции на развивающуюся гипоксию тка

- 5 010158 ней наблюдались признаки усиленной пролиферативной активности эндотелия, что выражается в нарастании извитости микрососудов и феномене дупликации капиллярных петель. Эти изменения наиболее отчетливо обнаруживались в прикрепленной десне и в поверхностных слоях переходной складки. В переходной складке на фоне заметного снижения скорости кровотока отмечалось уменьшение числа функционирующих капилляров, изменялась форма капиллярных петель в виде усиления их извитости, появления варикозных расширений и др. Капиллярный фон мутный, контуры капилляров нечеткие, что отражает нарушение барьерных возможностей их стенок с прогрессированием периваскулярных геморрагий. Следует подчеркнуть, что появлению признаков структурной перестройки микроциркуляторного русла предшествовала генерализация патологического процесса в тканях десны, что необходимо рассматривать как неблагоприятный прогностический признак. В данной группе экспериментов отмечалось дальнейшее увеличение степени нарушения микроциркуляции в тканях пародонта в виде роста ИМ: в свободной десне - до 0,75±0,03; в прикрепленной десне - до 0,63±0,04; в области переходной складки - до 0,39±0,02, Морфометрия диаметров микрососудов исследуемых зон слизистой оболочки десны в данной группе опытов показала их дальнейшее расширение (в свободной десне - 12,3±0,36; в прикрепленной десне 9,8±0,35; в переходной складке - 9,1±0,09) на фоне определенного снижения плотности капилляров на единицу площади в среднем до 30±1,5 мм². Лазерная допплерография выявила значительное снижение скорости капиллярного кровотока во всех зонах десны: в свободной десне - 15±1,5 усл.ед.; в прикрепленной десне - 17±0,7 усл.ед., в переходной складке - 19±1,2 усл.ед.

Осмотр слизистой оболочки десны крыс, получавших инъекции пептида Н-Ьук-ОШ-Акр-ОН, обнаружил изменение ее цвета на бледно-розовый и снижение отечно-воспалительной реакции, особенно в области переходной складки и прикрепленной десны. Биомикроскопия слизистой оболочки десны в целом выявила выраженную коррекцию признаков патологической перестройки микроциркуляторного русла и стихание признаков воспаления, отека тканей. Изменения микроциркуляции в большей мере сохраняются в свободной десне. Капилляры этой зоны несколько расширены, однако скорость кровотока в них резко возросла, кровоток стал гомогенным. Контуры капилляров относительно ровные, без признаков диапедеза эритроцитов, капилляроскопический фон вокруг них прозрачный, что свидетельствует о восстановлении нарушенной проницаемости гистогематического барьера. В зоне прикрепленной десны и переходной складки биомикроскопия слизистой оболочки десны показала полную коррекцию признаков нарушения микроциркуляции: заметно повысилось количество функционирующих капилляров, их контуры стали ровными, четкими, кровоток сохранял незначительную зернистость, нет признаков нарушения проницаемости и периваскуляркого отека тканей. В переходной складке, в глубоких слоях слизистой оболочки в единичных венулах сохранялся зернистый характер тока крови. Индекс ИМ в свободной десне снижался до уровня в нормальном пародонте - 0,29±0,15; а в прикрепленной десне и переходной складке, соответственно, 0,22±0,05 и 0,20±0,18. При морфометрии выявлено уменьшение диаметров капилляров во всех зонах десны (в свободной десне - 8,2±0,1; в прикрепленной десне - 7,8±0,20 и в переходной складке - 6,57±0,1) на фоне повышенной плотности их на единицу площади, которая в среднем составила 34±2,7 мм². Показатели лазерной допплерографии: сосудов заметно снизились почти до нормы (в свободной десне - 20±0,9 усл.ед.; в прикрепленной десне - 20±1,1 усл.ед.; в переходной складке 19±2,3 усл ед.).

Таким образом, в результате экспериментальных исследований установлено, что применение пептида Н-Бук-СШ-Акр-ОН оказывает нормализующее влияние на состояние стенок капилляров, повышая их резистентность и проницаемость, а также на состояние микроциркуляторного русла слизистой оболочки десны и пародонта.

Пример 5. Влияние пептида Н-Ьук-ОШ-Акр-ОН на резистентность капилляров кожи у пациентов с гиповитаминозом.

Исследование проведено на 25 пациентах в возрасте 19-35 лет с признаками гиповитаминоза в весенний период. Пациенты были рандомизированно разделены на две группы.

Основной группе больных фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-Ьук-ОШ-Акр-ОН, вводили в дозе 100 мкг в 1,0 мл физиологического раствора ежедневно однократно внутримышечно в течение 10 дней. Контрольная группа включала 18 пациентов, получавших инъекции физиологического раствора по аналогичной схеме. Пациенты обеих групп в этот период получали только сбалансированную витаминосодержащую диету.

Оценка влияния пептида Н-Ьук-ОШ-Акр-ОН на резистентность капилляров кожи проводилась с использованием манжеточной пробы Румпеля-Лееде-Кончаловского. Пациентам на верхнюю треть плеча накладывали манжету тонометра. В манжете создавали давление 200 мм рт.ст. в течение 3 мин. Резистентность капилляров кожи оценивали на участке дозированной нагрузки на капилляры кожи (под манжетой). Кровоизлияния подсчитывали с помощью лупы.

Резистентность капилляров кожи оценивали по пятибальной шкале:

I - до 5 мелких петехий,

II - от 6 до 15,

III - до 30,

- 6 010158

IV - более 30 кровоизлияний,

V - число кровоизлияний не поддается подсчету, сливная реакция.

В результате проведенного исследования было установлено, что применение пептида Н-Ьу8-С1и-Л8р-ОН способствует повышению резистентности капилляров кожи, выражавшемуся в достоверном уменьшении количества кровоизлияний в коже, с 30 до 47, выявлявшихся у больных обеих групп до лечения, до 6-8 у больных основной группы после лечения, в то время как у пациентов контрольной группы количество кровоизлияний не изменилось (табл. 2).

Таким образом, применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептида Н-Ту8-О1и-Л8р-ОН, целесообразно в комплексной терапии пациентов с гиповитаминозами с целью повышения резистентности капилляров и предотвращения ломкости сосудов.

Пример 6. Эффективность применения пептида Н-Ту8-О1и-Л8р-ОН у больных с сенильной пурпурой.

Исследование проведено на 23 больных сенильной пурпурой в возрасте 70-82 лет, которые предъявляли жалобы на частое спонтанное появление пятен кровоизлияний на лице, шее, предплечьях и кистях рук. У больных отмечалась прогрессирующая динамика развития заболевания.

Все больные ранее получали симптоматическую и патогенетическую терапию по поводу конкретных клинических проявлений сосудистой патологии.

Пациенты были рандомизированно разделены на 2 группы. Основную группу составили 12 больных, которым вводили фармацевтическую композицию, содержащую в качестве активного начала пептид Н-Ту8-О1и-Л8р-ОН, в дозе 100 мкг в 1,0 мл физиологического раствора ежедневно однократно внутримышечно в течение 10 дней. Контрольная группа включала 11 пациентов, получавших инъекции стерильного физиологического раствора по аналогичной схеме.

В динамике оценивали жалобы больных, проводили общеклиническое исследование крови и мочи, биохимическое изучение крови. С целью исследования гемостаза определяли коагулограмму крови и использовали пробу Гесса со жгутом.

В отличие от контрольной группы, у больных основной группы после применения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид Н-Ьук-ОШ-Лкр-ОН, наблюдалось более выраженное нормализующее воздействие пептида на изучаемые показатели гемостаза, которые практически приближались к показателям у здоровых лиц (время рекальцификации, протромбиновое время, активированное частичное тромбоплатиновое время, этаноловый тест); у пациентов контрольной группы отмечалось лишь небольшое недостоверное улучшение показателей гемостаза (табл. 3).

В результате проведенного исследования установлено, что у больных сенильной пурпурой после применения фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид Н-Ьук-ОЫЛкр-ОН, наблюдались улучшение состояния кожи и повышение прочности стенок капилляров, о чем свидетельствуют результаты пробы Гесса, показывающие уменьшение количества кровоизлияний.

Таким образом, применение фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного начала пептид Н-Ьук-ОШ-Лкр-ОН, целесообразно для лечения больных сенильной пурпурой для повышения резистентности и прочности стенок капилляров и нормализации микроциркуляции крови.

- 7 010158

Таблица 1

Показатель	Введение пептида Н-Еуз-СИи-Азр-ОН (1 мкг/кг)
3 месяца	6 месяцев
Контроль (п=24)	Пептид (п=24)	Контроль (п=24)	Пептид (п=24)
Эритроциты, х10^\|2/л	5,3±0,6	5,4+0,2	5,4+0,3	5,2±0,4
Гемоглобин, г/л	14,2±1,4	13,8±1,2	14,5±1,3	14,2±0,6
Ретикулоциты, %	1,3+0,07	1,2±0,07	1,1+0,05	1,3±0,08
Тромбоциты, х10⁹/л	143,7+7,9	143,6±8,4	144,5+8,6	144,9±9,8
Лейкоциты, х10⁹/л	9,4±0,5	11,2±0,8*	9,6±0,5	11,9±0,5*
Нейтрофилы палочкоядерные, %	0,31±0,04	0,27±0,07	0,33±0,04	0,36±0,05
Нейтрофилы сегментоядерные, %	45,8±2,1	44,9+2,5	46,2±3,5	43,4±3,2
Эозинофилы, %	0,69+0,05	0,64+0,04	0,72+0,04	0,75±0,08
Базофилы, %	0,61 ±0,04	0,69±0,05	0,72±0,03	0,71±0,05
Моноциты, %	2,5±0,02	2,4±0,03	2,6±0,06	2,5±0,05
Лимфоциты, %	48,9±2,5	50,7+2,4	51,3±2,7	52,7+2,2
СОЭ, мм/ч	1,69+0,05	1,87+0,07	2,01±0,05	2,05±0,04
Резистентность эритроцитов, % №С1 -максимальная -минимальная	0,41±0,02 0,32+0,05	0,43+0,04 0,33+0,02	0,42+0,04 0,34±0,04	0,44±0,04 0,35±0,05
Общий белок в сыворотке крови, г/л	72,9+3,1	72,6±3,3	73,1±3,4	73,1+3,6
Натрий в сыворотке крови, ммоль/л	153,9+5,7	154,8+6,8	155,5+6,2	154,6±6,9
Калий в сыворотке крови, ммоль/л	5,1±2,3	5,3±1,8	5,2+2,1	5,4±2,2

*Р<0,05 по сравнению с контролем.

Таблица 2

Группа пациентов	Показатель манжеточной пробы, баллы
До применения	После применения
Контроль	ιπ-ιν	ιπ-ιν
Пептид Н-Ьуз-СИи-Азр-ОН	πι-ιν	П*

*Р<0,05 по сравнению с показателями до применения.

- 8 010158

Таблица 3

Показатель	Здоровые люди	Больные сенильной пурпурой
Контроль	Пептид Н-Буз-СНи- Азр-ОН
Время рекальцификации, с	178,0±14,0	147,3±4,2*	1б4,2±2,4**
Протромбиновое время, с	12,5±0,1	12,4±0,4	13,3±О,1*
Активированное частичное тромбопластиновое время, с	32,3±2,1	48,0±1,3*	58,9±0,7**
Тромбиновое время, с	18,2±0,6	16,0±0,2*	17,1±0,2
Фибриноген, г/л	3,2±0,4	2,9±0,1	2,5±0,1
Этаноловый тест, % положительных случаев	0	43,8*	14 3**
Фибринолиз эуглобулиновый, мин	150,0±6,8	163,5±5,0	156,2±3,9

*Р<0,05 по сравнению с показателем у здоровых людей; **Р<0,05 по сравнению с показателем в контроле.

Перечень последовательностей <110> общество с ограниченной ответственностью СНА Пептайдс <120> пептид, повышающий резистентность капилляров, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения <130> 5ΙΑ/05/2006 <160> 1 <170> ратеппп νβΓείοη 3.3 <210> 1 <211> 3 <212> РИТ <213> Ατΐι Ή ста1 <220>

<223> пептидное соединение н-ьуз-сТи-Азр-он, повышающее резистентность капилляров за счет нормализующего влияния на метаболические процессы в клетках стенок сосудов.

<400> 1 ьуз С1и Азр

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пептид лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Буз-С1и-Азр-ОН последовательности 1 |8ЕЦ ΙΌ N0:1], обладающий биологической активностью, проявляющейся в повышении резистентности капилляров.
2. Применение пептида по п.1 для приготовления лекарственного средства, повышающего резистентность капилляров.
3. Фармацевтическая композиция, повышающая резистентность капилляров, характеризующаяся тем, что содержит в качестве активного начала эффективное количество пептида лизил-глутамиласпарагиновая кислота общей формулы Н-Буз-С1и-Азр-ОН последовательности 1 |8Е0 ΙΌ N0:1] и фармацевтически приемлемый носитель.
4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что она находится в форме, подходящей для парентерального введения.
5. Способ профилактики и лечения нарушения микроциркуляции в органах и тканях, заключаю

- 9 010158 щийся во введении пациенту фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество пептида лизил-глутамил-аспарагиновая кислота общей формулы Н-Ьук-С1и-Акр-0Н последовательности 1 |8ЕО ΙΌ N0:1], в дозе 0,01-100 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что введение осуществляют парентерально.

*Р<0,05 по сравнению с показателем в контроле, принятым за 100%