EA009405B1 - Планшеты и системы для крупномасштабной электропорации и способы их применения - Google Patents

Abstract

Приведено описание планшетов (2) электропорации, которые содержат множество снабжаемых энергией лунок (4) или камер электропорации, размещенных в определенном порядке в твердой подложке, причем по меньшей мере две из этих лунок (4) в планшете (2) могут быть снабжены энергией независимо. Каждая лунка (4) содержит по меньшей мере два расположенных в ней электрода (12, 14) электропорации и служит в качестве сосуда, в котором может проводиться индивидуальная реакция электропорации. Кроме того, приведены описания систем электропорации, которые используют планшеты (2) электропорации согласно изобретению, а также способов применения таких планшетов (2) и систем электропорации, например, для оптимизации условий электропорации.

Description

Родственные заявки

Заявка к настоящему изобретению испрашивает приоритет и преимущества предварительной заявки на патент США с регистрационным номером 60/430738, поданной 3 декабря 2002 г. согласно 35 И.8.С §119(с) и озаглавленной «Планшеты электропорации со множественными лунками».

Область техники

Настоящее изобретение относится к электропорации. Более конкретно, настоящее изобретение относится к планшетам для крупномасштабной электропорации (например, с большим объемом, с множеством лунок и т.п.), к системам для применения вместе с такими планшетами и к способам, относящимся к применению таких планшетов.

Уровень техники

1. Введение.

Следующее описание включает в себя информацию, которая может быть полезной для понимания настоящего изобретения. Это не является признанием того, что любая такая информация является уровнем техники или релевантной к заявляемым в настоящее время изобретениям или что любая публикация, на которую прямо или косвенно делается ссылка, является уровнем техники.

2. Уровень техники.

Электропорация является общепринятой методикой перемещения экзогенных молекул, в том числе нуклеиновых кислот, лекарственных средств и других соединений, через мембраны, в том числе клеточные мембраны и мембраны, которые образуют липосомы и другие инкапсулированные липидами везикулы. Она включает в себя приложение электрических полей подходящей напряженности к пробе, содержащей, например, клетки, чтобы сделать их компетентными для введения представляющих интерес молекул. Хотя механизм, по которому функционирует электропорация, не является полностью понятным, известно, что в контексте живой ткани электропорация подразумевает разрушение липидного бислоя клеточной мембраны, что приводит к образованию временных или постоянных пор в этой мембране, которые позволяют экзогенным молекулам входить в клетку посредством диффузии.

В контексте ех νίνο способов введения экзогенных молекул в клетки и другие заключенные в липиды везикулы электропорация предоставляет многочисленные преимущества и может быть использована для обработки всей популяции клеток (или везикул) одновременно;

для введения, по существу, любой макромолекулы в клетку (или везикулу);

с большим разнообразием первичных или установленных клеточных линий и является особенно эффективной с определенными клеточными линиями;

как на прокариотических, так и на эукариотических клетках без модификаций или адаптации к типу и происхождению клеток.

Кроме того, электропорация может быть использована на клетках в суспензии или в культуре, а также на клетках в тканях и органах. Клетки могут быть электропорированы перед воздействием на них молекулярных частиц, которые должны быть введены в клетку. Фактически, клетки могут быть сделаны высококомпетентными для трансфекции или трансформации посредством электропорации, после чего они могут храниться перед воздействием на них вводимых молекул (например, экспрессирующих векторов, кодирующих один или более представляющих интерес генов).

Обычно электропорацию ех νίνο проводят путем помещения одноканального устройства, которое включает в себя по меньшей мере пару электродов, т.е. катод и анод, в содержащую пробу камеру, такую как кювета одноразового использования. См., например, Ыеитапп е! а1., ВюрРуДса1 ίοιίΓπαΙ. 71, р.868-77 (1996). Электрический потенциал обычно подают с использованием генератора, который испускает импульсы электрического поля высокого напряжения в раствор или суспензию, содержащую клеточную популяцию, полученную из пациента, при этом обратимость или необратимость порообразования зависит от таких параметров снабжения энергией (возбуждения), как амплитуда и продолжительность импульсов, форма сигнала и частота повторения импульсов, наряду с типом и стадией развития клеток. Считается, что порообразование в мембране или придание проницаемости мембране происходят на полюсах клетки, т. е. тех участках на клеточных мембранах, которые непосредственно обращены к электродам и, следовательно, испытывают наивысший трансмембранный потенциал электрического поля. К сожалению, в одном конкретном эксперименте по электропорации степень придания проницаемости может варьироваться в зависимости от типа клеток и даже среди клеток в данной популяции. Варьирование часто наблюдают также от эксперимента к эксперименту при использовании одних и тех же условий электролита в пробе и при одном и том же типе клеток. Кроме того, поскольку эта процедура может выполняться в больших популяциях клеток, индивидуальные свойства которых варьируются, условия электропорации обычно могут быть выбраны только для работы со «средними» качествами конкретной популяции клеток.

Как упоминалось выше, электропорацию традиционно проводили в однокамерных кюветах одноразового использования, которые обычно имеют максимальный объем примерно 1 мл для целей электропорации. Однако такие способы являются утомительными, трудоемкими и требуют оптимизации. До настоящего времени попытки увеличения производительности процессов электропорации сосредоточивались вокруг многоканальных систем электродов, которые использовали для квазивысокопроизводи

- 1 009405 тельного введения экзогенных молекул в клетки в попытке ограничить необходимость переноса клеток из культуральных контейнеров в кюветы для электропорации. Обычное многоканальное устройство электропорации включает в себя множество пар электродов, которые могут быть вставлены в соответствующие камеры из того множества камер, которые содержат экзогенные материалы и клетки. Доступные в настоящее время многоканальные устройства электропорации содержат 8 или 96 пар коаксиальных электродов (Сепе1гошс5 1пс., г. Сан-Диего, шт. Калифорния, США). Эти устройства используют для электропорации в стандартных 96-луночных планшетах, которые состоят из 8 рядов и 12 столбцов лунок и имеют стандартный размер примерно 8,5 см (ширина) на примерно 12,7 см (длина) и стандартное расстояние между лунками от центра до центра примерно 9,0 мм. См. патент США № 6352853.

Хотя общепринятые квазивысокопроизводительные устройства электропорации, предназначенные для электропорации множественных проб или популяций клеток, нашли некоторое ограниченное применение, они имеют присущие им недостатки, которые ограничивают их более широкое использование. Эти недостатки заключаются в том, что в таких устройствах используются два отдельных конструктивных элемента, а именно многолуночный планшет и матрица (панель) электродов, которую вставляют в эти лунки после добавления различных реагентов (например, суспензии, содержащей клетки-хозяева в подходящем буфере, и экзогенные молекулы, которые должны быть электропорированы в эти клетки). В таких доступных в настоящее время системах, несмотря на то, что многолуночные планшеты могут быть одноразовыми, матрица электродов не может быть одноразовой и должна очищаться после каждого использования, что в значительной степени ограничивает фактическую производительность и автоматизацию таких систем. Другим основным недостатком в конструкции таких систем является то, что электроды таких матриц после их введения в лунки не могут быть оптимальным образом позиционированы в лунках, так как должен быть оставлен некоторый зазор для вставки электродов в лунки. Поскольку такой зазор уменьшает процент пробы, подвергаемой воздействию электрического поля, эффективность электропорации неизбежно уменьшается. Кроме того, в большинстве электродных матриц для таких систем используются множественные цилиндрические наружные электроды, каждый из которых позиционирован вокруг центрального штифтового электрода. Такая конфигурация неизбежно приводит к электрическим полям с варьирующимися напряженностями в различных местах в каждой лунке. Другим недостатком таких систем является то, что на любом одном планшете может быть исследован только один набор параметров снабжения энергией, так как пары электродов в матрицах, обычно используемых в таких системах, не способны снабжаться энергией независимо от одной или более других пар электродов в этой матрице. Таким образом, эксперименты по оптимизации требуют применения по меньшей мере одного многолуночного планшета для каждого набора выбранных параметров снабжения энергией. Другие недостатки также известны лицам, знакомым с такими устройствами, включая потерю пробы вследствие затекания пробы на электроды.

В дополнение к вышеупомянутым недостаткам, в том случае, когда должны электропорироваться большие объемы, традиционные методики обычно основаны на «проточных» системах, в которых часть всего подлежащего электропорации объема перемещают в камеру электропорации и подают электропорирующие импульсы. Затем эту камеру опустошают и вновь заполняют столько раз, сколько это необходимо для электропорации всех клеток во всем объеме подлежащих электропорации клеток. Существует несколько причин такого повторения приложения импульсов. Например, общепринятые генераторы импульсов электропорации высокого напряжения могут обычно доставлять энергию только к примерно четырем кюветам на 1 мл в конкретный момент времени. Дополнительным недостатком является то, что требование многократного приложения импульсов к пробе является вредным для клеток в этой пробе, часто приводящим к коэффициентам смерти клеток, неприемлемым в определенных видах применения, для которых известно, что частота случаев проявления молекулярного переноса в клетки пробы является низкой. См., например, патенты США № 6207488, 5676646 и 5545130 в отношении описаний проточных устройств электропорации и их применения.

Принимая во внимание ограничения общепринятых устройств электропорации, которые относятся к производительности и объему, явно существует необходимость в устройствах и системах, подходящих для высокопроизводительных и других крупномасштабных применений. Настоящее изобретение направлено на удовлетворение этих и других описанных ниже потребностей в области электропорации.

3. Определения.

Перед подробным описанием настоящего изобретения будут даны определения терминов, используемых в контексте настоящего изобретения. В дополнение к этим терминам другие термины определены в другом месте в описании по мере необходимости. Если явно не указаны другие значения, термины, используемые в этом описании, будут иметь общепризнанные в данной области техники значения.

В данном контексте термин «контактирование» относится к любому способу воздействия экзогенной молекулы на клетку-хозяина. Например, клетка-хозяин или популяция клеток-хозяев может быть погружена в буферный раствор электропорации, содержащий одну или более разновидностей экзогенных молекул, или залита таким раствором. Контакт между клеткой-хозяином и экзогенной молекулой может происходить либо до, либо после приложения электрического(их) импульса(ов) посредством электропорации. В ответ на такой контакт экзогенная молекула «вводится» в клетку-хозяина, когда эта

- 2 009405 экзогенная молекула входит в клетку-хозяина и проявляет временное или стабильное действие, например экспрессию гетерологичной молекулы нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине (например, продуцирование биологически «зеленого» флуоресцентного белка, кодируемого экспрессирующим вектором).

«Параметры снабжения энергией» относятся к конкретным характеристикам снабжения энергией (возбуждения), выдаваемым парой электродов электропорации в конкретном эксперименте. Такие параметры включают в себя амплитуду и продолжительность импульсов, форму сигнала, частоту повторения (следования) импульсов и интервал между импульсами.

«Экзогенная молекула» обозначает любую молекулу, предназначенную для введения в клеткухозяина. Экзогенные молекулы включают в себя молекулы нуклеиновых кислот (например, экспрессирующие векторы, несущие один или более ген, или гетерологичные нуклеиновые кислоты, кодирующие белки или полипептиды, которые должны быть экспрессированы, антисмысловые молекулы, рибозимы, малые интерферирующие РНК и т.д.), низкомолекулярные лекарственные средства и другие химикалии, которые каким-либо образом изменяют, временным или постоянным образом, клетку или ее функцию(и), включая биологическую активность любого белка или фермента в клетке.

Термин «генетически модифицированный» относится к введению одной или более гетерологичных нуклеиновых кислот в одну или более клетку-хозяина.

Термин «гетерологичная нуклеиновая кислота» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая происходит из гетерологичных видов, или, если она происходит из того же самого вида, является, по существу, модифицированной относительно ее первоначального вида или будет приводить к увеличению копийности введенной нуклеиновой кислоты.

«Клетка-хозяин» является любой клеткой, в которую может быть введена экзогенная молекула. Клетки-хозяева включают в себя эукариотические и прокариотические клетки. Эукариотические клеткихозяева включают в себя клетки животных, растений и грибов. Предпочтительные клетки животных включают в себя клетки из млекопитающих (например, животных из семейства коровьих, собачьих, лошадиных, кошачьих, мышиных, овечьих и свиных), включая людей и приматов, рыб (например, зубатого карася, лосося, форели и других коммерчески важных видов), насекомых (например, дрозофилы, комаров, пчел), паукообразных насекомых, птиц, ракообразных и моллюсков, а также линии клеток, выведенные из клеток любого из предыдущих организмов. Предпочтительные клетки растений включают в себя клетки из сельскохозяйственных растений, таких как злаки, а также декоративных растений и деревьев, выращиваемых для производства пиломатериалов. Предпочтительными клетками грибов являются клетки дрожжей. Предпочтительными прокариотическими клетками являются бактериальные клетки, в частности виды, применимые в молекулярной биологии. Клетки-хозяева, в которые введена гетерологичная нуклеиновая кислота, называют «рекомбинантными клетками-хозяевами». Клетки-хозяева также включают в себя искусственные клетки, липосомы и любую другую инкапсулированную липидами везикулу, в которую может быть введена экзогенная молекула посредством электропорации. Для краткости, «клетки-хозяева» могут здесь также называться просто «клетками».

Выполнение способа «ίη νίΐτο» относится к выполнению способа вне организма и охватывает концепцию способов ех νίνο, в которых, например, пробу клеток удаляют из пациента и электропорируют с использованием устройств и способов согласно настоящему изобретению для введения одной или более разновидности экзогенных молекул в эти клетки, после чего эти обработанные клетки повторно вводят в пациента.

Термин «крупномасштабный» означает (причем один или оба варианта сразу), что планшеты электропорации согласно изобретению пригодны для высокопроизводительных видов применения и/или видов применения с большим объемом. Здесь термин «высокопроизводительный» относится к способности выполнять два или более, предпочтительно 4, 16, 32, 64, 96, 192, 288, 384, 576, 672, 768, 1536, 3072 или 6144, или более идентичных или различных экспериментов по электропорации на одном и том же планшете электропорации.

Применение «большого объема» обозначает объем, который превышает объем обычной кюветы электропорации или любого другого сосуда для проведения отдельного эксперимента по электропорации. Обычно, общепринятые кюветы или другие сосуды для электропорации представляют объем вплоть до примерно 1 мл, хотя известны сосуды, которые могут содержать вплоть примерно до 10 мл, в частности, в контексте проточных устройств электропорации. В контексте настоящего изобретения сосуд может содержать объем от столь малого объема, как 1 мкл, примерно до 10 мл или более. Предпочтительные виды применения с большими объемами делают возможной электропорацию содержащих клетки растворов, имеющих объем, составляющий по меньшей мере примерно 5 мл, предпочтительно по меньшей мере 10 мл и примерно до 100 мл или более.

Используемый здесь термин «нуклеиновая кислота» или «молекула нуклеиновой кислоты» относится к полимеру дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов (в любом случае «полинуклеотиду») в виде отдельного фрагмента или в виде компонента большей конструкции. Нуклеиновые кислоты могут быть либо одноцепочечными, либо двухцепочечными, и включают в себя не встречающиеся в природе основания или структуры скелета молекулы. Такие молекулы включают в себя ДНК, РНК, кДНК, антисмысловые молекулы, рибозимы и образующие триплекс молекулы. Нуклеиновые кислоты могут быть

- 3 009405 встречающимися в природе или синтетическими и включают в себя олигонуклеотиды. ДНК, кодирующая белки или полипептиды и используемая в способах согласно изобретению, может быть собрана, например, из фрагментов кДНК или из олигонуклеотидов, которые обеспечивают синтетический ген, который способен экспрессироваться в рекомбинантной транскрипционной единице. Полинуклеотидные последовательности или последовательности нуклеиновых кислот согласно изобретению включают в себя последовательности ДНК, РНК и кДНК.

«Патентоспособные» композиция, способ, устройство или промышленное изделие в соответствии с изобретением означают, что данный предмет изобретения удовлетворяет всем установленным законом требованиям к патентоспособности во время выполнения данного анализа. Например, что касается новизны, неочевидности или т.п., если более позднее исследование обнаружит, что один или более пунктов формулы изобретения охватывает один или более таких вариантов осуществления, которые не обладают новизной, неочевидностью и т.д., этот пункт или пункты формулы, будучи ограниченными по определению «патентоспособными» вариантами осуществления, специально исключают непатентоспособный(ые) вариант(ы) осуществления. Кроме того, пункты прилагаемой формулы изобретения должны интерпретироваться как направленные и на обеспечение наиболее широкого разумного объема охраны, и на сохранение их юридической действительности (силы). Кроме того, если с момента времени, когда по заявке на данное изобретение будет выдан патент, до момента времени, когда встанет вопрос о юридической действительности одного или более пунктов прилагаемой формулы изобретения, одно или более из установленных законом требований к патентоспособности будут изменены или если изменятся стандарты оценки того, выполнено ли какое-то конкретное установленное законом требование к патентоспособности, то пункты формулы должны интерпретироваться таким образом, который (1) сохраняет их юридическую действительность и (2) обеспечивает самую широкую разумную интерпретацию при данных обстоятельствах.

«Растение» относится либо к любому целому растению, части растения и клетке растения, либо к группе клеток растений, такой как, например, ткань растения. Классы растений, клетки которых могут быть использованы в сочетании с планшетами электропорации согласно настоящему изобретению, включают в себя любое высшее растение, независимо от того, является ли оно однодольным или двудольным растением, и любой уровень плоидности, в том числе полиплоидный, диплоидный и гаплоидный.

«Однодольные растения», или иначе говоря «однодолы» (от англ. «топосок»), включают в себя спаржу, кормовую или сахарную кукурузу, ячмень, пшеницу, рис, сорго, лук, просо американское, рожь и овсы. Примеры «двудольных растений», или иначе говоря «двудолов» (от англ. «Шсок»), включают в себя томат, табак, хлопчатник, рапс, кормовые бобы, сою, перцы, салат-латук, горох, люцерну, клевер, капусту листовую или ВтакЦса о1егасеа (например, капусту огородную кочанную, брокколи, цветную капусту, брюссельскую капусту), редис, морковь, свеклу, баклажан, шпинат, огурец, тыкву, дыни, канталупу (мускусную дыню), подсолнечники и различные декоративные растения.

Термин «клетка растения» обозначает интактную клетку любого растения, в том числе клетку из листа, каллуса, зародыша или семени, а также любую продуцирующую гаметы клетку и любую клетку, которая способна к регенерации в целое растение. Таким образом, семя, содержащее множественные клетки растения, способные к регенерации в целое растение, включено в определение клетки растения. В этом контексте термин «интактный» обозначает отдельную клетку или группу отдельных клеток, которые образуют ткань, причем эта(и) клетка(и) имеет(ют) неповрежденную(ые) или необработанную(ые) клеточную(ые) стенку(и), в противоположность протопластам.

Термин «множество» обозначает более одного.

Сущность изобретения

Целью настоящего изобретения является создание планшетов для крупномасштабной электропорации, а также систем и комплектов, в которых используются такие планшеты, для преодоления недостатков существующих в настоящее время подходов к введению экзогенных молекул в клетки, в частности, ίη νίΙΐΌ. Другой целью настоящего изобретения является создание способов применения таких планшетов электропорации, например, для введения экзогенной молекулы в клетку-хозяина ίη νίΙΐΌ.

Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения относится к планшетам электропорации, которые содержат множество снабжаемых энергией (запитываемых) лунок электропорации, размещенных в определенном порядке в твердой подложке, причем по меньшей мере две из этих лунок в планшете могут быть снабжены энергией независимо, т. е. когда энергия подается к электродам электропорации в одной из этих двух лунок, электроды в другой лунке не обязательно должны, хотя и могут, снабжаться энергией. Каждая лунка содержит по меньшей мере два расположенных в ней электрода электропорации (по меньшей мере один анод и по меньшей мере один катод) и служит в качестве сосуда, в котором может проводиться индивидуальная реакция электропорации.

В предпочтительных вариантах осуществления этого аспекта лунки планшета электропорации размещены в виде серии по меньшей мере из двух рядов и двух столбцов. В особенно предпочтительных вариантах осуществления количество рядов отличается от количества столбцов. Обычно, но не исключительно, отношение количества рядов к количеству столбцов составляет примерно 2:3. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления планшеты согласно изобретению содержат 96 лунок электропо

- 4 009405 рации, расположенных в 8 рядах и 12 столбцах. В других предпочтительных вариантах осуществления эти планшеты содержат 384 лунки электропорации, расположенные в 16 рядах и 24 столбцах. Планшеты других предпочтительных конфигураций содержат 192, 288, 576, 672, 768, 1536, 3072 или 6144 лунок. Для способствования автоматизированному манипулированию и совместимости с существующими высокопроизводительными системами на основе планшетов, используемыми в биологических науках, предпочтительно, чтобы габаритные размеры планшетов (длина, ширина и высота) были одинаковыми от планшета к планшету, независимо от количества рядов, столбцов и лунок электропорации, в сравнении с общепринятыми, неэлектрифицируемыми многолуночными планшетами (например, используемыми в настоящее время в автоматизированных системах высокопроизводительного скрининга соединений).

Во многих вариантах осуществления, в частности в планшетах, имеющих примерно менее 384 лунок электропорации, эти лунки являются, по существу, цилиндрическими или прямоугольными ячейками, в любом случае - с одной открытой стороной сверху планшета. В других вариантах осуществления, особенно в тех планшетах, которые имеют большое число лунок, эти лунки стремятся сделать, по существу, прямоугольными ячейками с одной открытой стороной (сверху), так что при рассматривании сверху их размеры по длине и ширине являются, по существу, одинаковыми (дающими квадратную форму), причем глубина обычно больше, чем длина и/или ширина. Конечно, в контексте настоящего изобретения могут быть использованы лунки, имеющие любую подходящую геометрическую форму, хотя в предпочтительных конфигурациях лунки имеют по меньшей мере две расположенные на некотором расстоянии одна от другой, по существу, параллельные стенки, на которых расположена одна или более пара электродов. В любом случае предпочтительно, чтобы лунки электропорации одного планшета имели, по существу, одинаковые размеры при сравнении лунки с лункой. Такая согласованность в отношении формы служит для обеспечения, по существу, однородного отклика (характеристик) электропорации от лунки к лунке, когда все остальное является одинаковым. Поскольку лунки электропорации обычно открыты наверху (отсутствует удаляемая крышка планшета, герметизация или т.п.), каждая лунка имеет только нижнюю стенку и по меньшей мере одну боковую стенку (одну - в случае лунки цилиндрической формы, четыре - в случае лунки прямоугольной или квадратной формы и т.д.). Как будет понятно, для облегчения изготовления, например, с помощью методов литья под давлением, при рассматривании сбоку лунка имеет тенденцию быть слегка скошенной, причем верхнее отверстие (раскрыв) имеет размеры (т. е. длину и ширину или диаметр), слегка большие, чем размеры в нижней части этой лунки, что облегчает удаление планшета из литейной формы.

Как будет понятно, для планшетов, имеющих стандартизованные наружные размеры, увеличение количества лунок электропорации обычно приводит к уменьшению объема индивидуальных лунок. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения планшет электропорации будет содержать относительно малое количество лунок (например, 96 или даже столь мало, как 2-12), что позволяет иметь объем каждой лунки примерно 1 мл в случае 96-луночного планшета и 10 мл - в случае 12 лунок. Предпочтительные объемы лунок находятся в диапазоне примерно от 10 мл до примерно 1 мкл, хотя возможны и меньшие объемы, в частности, если, например, для образования планшетов, содержащих лунки электропорации с объемами в масштабе микролитров и даже нанолитров, приспосабливают технологии фотолитографии из полупроводниковой промышленности.

Предпочтительно, в каждой лунке (или камере) электропорации планшета электропорации в соответствии с настоящим изобретением будет расположен или помещен один из электродов электропорации напротив другого электрода электропорации для данной лунки. Предпочтительно, электроды в данной конкретной лунке являются, по существу, параллельными друг другу для облегчения генерирования однородного электрического поля в лунке в том случае, когда ее электроды снабжают энергией в присутствии электропроводящего раствора. В этом контексте «по существу, параллельный» обозначает отклонение на ±10%, предпочтительно 5% и даже более предпочтительно 1% или менее. Электроды могут быть расположены в этих лунках в любом подходящем направлении, хотя предпочтительным образом электроды расположены горизонтально или вертикально, как можно видеть при помещении планшета на поверхность для приема пробы клеток. Электроды могут в любой данной лунке, например в лунках большого объема, также содержать множество индивидуальных электродов (предпочтительно размещенных в виде пар противоположных электродов, один из которых является анодом, а другой является катодом), которые могут быть снабжены энергией вместе или последовательно и в соответствии с конкретной схемой, способствующей, по существу, однородному распределению электрических полей по всей лунке.

Электроды электропорации предпочтительно интегрированы в боковую(ые) стенку(и) лунки (т.е. выполнены заодно с ней или ними) герметичным по текучей среде образом (для предотвращения утечки жидкости после ее введения в лунку), так что их проводящая поверхность подвергается воздействию помещаемой в лунку пробы. Альтернативно, для образования электрода электродный материал (например, золото) может быть нанесен, предпочтительно, в виде тонкой пленки или слоя или композита из тонких пленок, на боковую стенку лунки. Способы нанесения электродного материала включают в себя погружение, металлизацию (методом химического восстановления или электролитическим методом), распыление и осаждение из паровой фазы. Электроды (или их части, которые должны быть обращены к клет- 5 009405 кам-хозяевам) предпочтительным образом изготавливают из биосовместимых электропроводящих материалов. Примеры таких материалов включают в себя золото, алюминий, титан или неметаллический электропроводящий композит, такой как графит (или полимер, наполненный или достаточным образом легированный таким количеством проводящего материала, которое достаточно для того, чтобы такая композиция служила в качестве электрода, применимого при осуществлении настоящего изобретения на практике).

В некоторых вариантах осуществления электроды содержат композит из множества электродных материалов, например меди, никеля и золота, каждый из которых наносят на твердую подложку в различные моменты времени, посредством чего наращивают слои электродного материала. Предпочтительно в таких композитах самый верхний слой электропроводящего материала (т.е. слой, который должен быть обращен к клеткам) является биосовместимым. Электродный(ые) материал(ы) в слое(ях), лежащем(их) ниже самого верхнего слоя, также может(гут) быть биосовместимыми, хотя такие факторы, как, например, стоимость, совместимость с нижележащей подложкой или адгезионным слоем, если он имеется, легкость изготовления или нанесения и свойства этого материала как проводника, могут влиять на выбор такого материала квалифицированным специалистом в данной области техники для конкретного варианта применения.

При нанесении на боковую стенку электрод предпочтительно покрывает столь большую часть боковой стенки, насколько это требуется для генерирования, по существу, однородного электрического поля в лунке (или объеме между электродами) при снабжении энергией вместе с дополняющим(и) его электродом(ами). Как будет понятно, в крупномасштабных вариантах применения, в которых используют множество наборов электродов (например, пар), которые снабжают энергией в различные моменты времени, по существу, однородное электрическое поле генерируется в объеме содержащего клетки раствора между теми электродами, которые входят в состав конкретного набора электродов, который снабжается энергией, не обязательно во всей камере. Предпочтительно эти электроды покрывают как можно большую часть боковых стенок, так как это позволяет задействовать большой диапазон объемов раствора, вплоть до максимального объема для данной конкретной лунки, в дополнение к возможности максимизации однородности электрического поля, генерируемого между электродами.

Каждый электрод в планшете электропорации соединен с проводником (например, электропроводящей проволокой или контакт-деталью), который может переносить энергию к конкретному электроду из источника электропитания (например, генератора импульсов), который может быть присоединен к этому устройству. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления электроды для лунок электропорации в конкретном столбце (или в конкретном ряду) взаимно соединены последовательно или параллельно таким образом, что они могут быть снабжены энергией или адресованы одновременно, тогда как электроды для лунок электропорации в других столбцах (или рядах) этого планшета, не соединенные электрически с этими снабженными энергией (запитанными) лунками, не будут снабжены энергией. В других предпочтительных вариантах осуществления электроды для каждой лунки в планшете электропорации могут быть адресованы независимо, что позволяет снабжать энергией каждую лунку этого планшета независимо от всех других лунок в данном планшете. Конечно, в планшете, имеющем независимо адресуемые лунки, может оказаться желательным снабжать энергией схожим образом две или более лунки, например, для генерирования статистики, связанной с эффективностью преобразования при конкретных параметрах снабжения энергией.

Планшеты электропорации согласно настоящему изобретению изготавливают из любой подходящей твердой подложки. В определенном варианте осуществления твердую подложку выполняют из гомогенной композиции единственного материала, тогда как в некоторых других вариантах осуществления она может быть изготовлена из комбинаций различных материалов. Особенно предпочтительными подложками являются пластмассы (пластики), так как пластмассы являются недорогими, легко формуемыми до желаемых конфигураций (например, с помощью различных методов литья, таких как литье под давлением), устойчивыми к поломкам, имеют желаемые оптические свойства и легко механически обрабатываются, если это желательно. В предпочтительных вариантах осуществления вся твердая подложка или часть твердой подложки будет прозрачной для света с одной или более длинами волн (например, с длинами в видимой области спектра электромагнитных волн). В других вариантах осуществления вся твердая подложка или часть твердой подложки будет полупрозрачной (просвечивающейся), тогда как в прочих вариантах осуществления вся твердая подложка или часть твердой подложки будет непрозрачной.

Планшеты электропорации в соответствии с настоящим изобретением также включают в себя по меньшей мере одно электрическое соединение, которое позволяет доставлять энергию к электродам в планшете. Может быть использовано любое подходящее электрическое соединение, в том числе электрические соединения, в которых используются штекеры и розетки. В особенно предпочтительных вариантах осуществления предусмотрено множество электрических соединений типа контактной площадки, причем каждый электрод (или серия электродов, подлежащих снабжению энергией с одними и теми же параметрами) соединен с проводником, снабжаемым энергией через отдельную контактную площадку. Таким образом, каждая контактная площадка электрически соединена по меньшей мере с одним элек

- 6 009405 тродом, что позволяет снабжать этот электрод(ы) энергией, если это желательно и как это желательно. Точное число соединителей типа контактных площадок зависит от количества лунок электропорации (или полных или частичных рядов или столбцов лунок), которые должны быть снабжены энергией независимо, а также от того, предусмотрены ли или не предусмотрены другие электронные средства контроля (например, выключатели или переключатели) в конкретной цепи.

Электрическое(ие) соединение(я) на планшете электропорации позволяют подавать энергию к одному или более электродам, присутствующим в планшете, в соответствии с указанием контроллера, который указывает, какие из электродов (если это нужно) в планшете должны получать энергию от источника электропитания (например, генератора импульсов). Этот контроллер может быть встроен в источник электропитания или, альтернативно, он может быть отдельным устройством.

Планшеты электропорации в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать элемент отслеживания или инвентаризации, например ряд оптически считываемых штрих-кодов, которые обеспечивают уникальный идентификатор, так что конкретный планшет может быть отслежен в автоматизированной или полуавтоматизированной системе.

Родственный аспект настоящего изобретения относится к планшетам электропорации, выполненным с возможностью приема большого объема подлежащей электропорации клеточной суспензии.

В вариантах осуществления этого аспекта планшет обычно содержит от 1 до примерно 50, предпочтительно от 1 до примерно менее 12 отдельных камер. Каждая камера может быть открытой сверху, хотя это не является обязательным. Камера(ы) может также включать в себя одно или более отверстий для того, чтобы позволить жидкости втекать в каждую камеру и/или вытекать из них. Каждая камера может также содержать одну или более внутренних перегородок для ограничения или контроля движения жидкости внутри камеры. В некоторых вариантах осуществления электроды могут быть расположены на этих перегородках. В любом случае каждая камера содержит по меньшей мере один, а предпочтительно множество наборов электродов, расположенных на стенках этой камеры. Электроды, входящие в состав каждого набора электродов, расположены на противоположных сторонах камеры. Каждый набор электродов состоит из множества электродов, предпочтительно четного количества (например, 2, 4, 6, 8, 10, или более), причем имеется равное количество анодов и катодов, хотя настоящее изобретение охватывает наборы электродов, которые содержат нечетное количество электродов (например, 1, 3, 5, 7, 9, 11, или более). Фактически, набор электродов может содержать всего лишь один электрод, и в этом случае этот электрод будет использоваться в сочетании с другим набором электродов, выполненным соответственно. Особенно предпочтительными являются наборы электродов, которые содержат пару электродов (например, один анод и один катод). Каждый набор электродов может быть снабжен энергией независимо от других наборов электродов для данной конкретной камеры. Подобным же образом, в тех вариантах осуществления, в которых содержатся множественные камеры на одном планшете, наборы электродов в двух или более камерах могут быть снабжены энергией одновременно или в разные моменты времени.

Во время электропорации в конкретной камере, которая содержит множество наборов электродов, предпочтительно, чтобы эти наборы электродов снабжались энергией последовательно. В тех вариантах осуществления, в которых электропорация предусматривает серию импульсов между электродами в каждом наборе электродов, предпочтительно, чтобы эта серия импульсов, подаваемая между электродами конкретного набора электродов, была завершена до того, как будут снабжаться энергией электроды другого набора электродов в этой камере, предпочтительно с использованием тех же самых параметров, какие были использованы для снабжения энергией предшествующего(их) набора(ов) электродов. Под термином «последовательно» в данном контексте имеют в виду, что, например, соседние противолежащие пары электродов в пределах удлиненной лунки будут «последовательно» снабжаться энергией от одного конца удлиненной лунки к другому. Альтернативно, подача импульсов может происходить от центральной части лунки к наружным сторонам этой лунки.

Другой родственный аспект настоящего изобретения относится к комплектам, содержащим планшет электропорации в соответствии с изобретением, причем по меньшей мере одна, несколько или предпочтительно все лунки этого планшета содержат аликвоту электрически компетентных клеток-хозяев.

Термин «электрически компетентные» относится к таким клеткам-хозяевам, которые легко принимают экзогенные молекулы в присутствии или после приложения подходящего электрического поля. Обычно эти клетки будут суспендированы в буфере, который подходит для хранения и транспортировки и в котором эти клетки будут оставаться жизнеспособными в течение по меньшей мере 24 ч, предпочтительно в течение 1-3 дней и даже более предпочтительно по меньшей мере в течение 4-7 дней. Как будет понятно, различные клетки могут требовать буферов, содержащих различные компоненты. Кроме того, может оказаться желательной транспортировка клеток в замороженном состоянии, и в этом случае опять может потребоваться другой буфер. Таким образом, выбор комбинаций буфера и клеток оставлен на усмотрение квалифицированного специалиста. Для транспортировки содержащих клетки планшетов предпочтительным образом предусматривают также подходящие крышки планшетов (например, съемную фольгу или пластиковую крышку). Для предотвращения потери суспензии клеток (в жидкой или замороженной форме, в зависимости от конкретного случая) из индивидуальных лунок предпочтительно,

- 7 009405 чтобы эта крышка индивидуально герметизировала каждую лунку. Содержащие клетки планшеты могут быть упакованы индивидуально или в виде пакетов из двух или более содержащих клетки планшетов. В каждой упаковке обычно также предусматривают упаковочный вкладыш.

Другой аспект настоящего изобретения относится к системам электропорации, в которых используется планшет электропорации в соответствии с настоящим изобретением. Как минимум, такие системы будут содержать по меньшей мере один такой планшет электропорации и источник электропитания, выполненный с возможностью соединения с электрическим(и) соединителем(ями) планшета электропорации. Источник электропитания будет также включать в себя контроллер или, альтернативно, эта система будет включать в себя контроллер в виде отдельного устройства. Контроллер управляет снабжением энергией различных электродов планшета, предпочтительно в соответствии с предварительно установленной программой, которая может быть определена пользователем или обеспечена заводом (например, выбрана из меню, в котором перечислено множество предварительно запрограммированных наборов параметров снабжения энергией). Такая система также может необязательно включать в себя манипулятор планшета, выполненный с возможностью удерживания планшета электропорации во время работы системы электропорации. В предпочтительных вариантах осуществления манипулятор планшета содержит систему электрического соединения, совместимую с набором электродов и проводников в конкретном планшете, так что при помещении в него планшета производятся соответствующие электрические соединения, что позволяет подать желаемые параметры снабжения энергией к электродам в независимо адресуемые лунки в этом планшете или, в случае планшета с большим объемом, к каждой из групп электродов (например, противолежащим парам электродов), которые должны быть снабжены энергией одновременно (например, набору противолежащих пар). Как будет понятно, одно или более устройств из источника питания, контроллера и манипулятор планшета могут быть интегрированы в единое устройство или в набор устройств, число которых меньше, чем количество различных функций, обеспечиваемых независимыми (автономными) источником электропитания, контроллером или манипулятором планшета.

В других вариантах осуществления этого аспекта данная система дополнительно включает в себя одно или более устройств считывания планшета для сбора данных из лунок или камер(ы) электропорации данного планшета. В высокопроизводительных системах, в которых используются многолуночные планшеты, устройство(а) считывания обычно находится(ятся) в другом месте. К примеру, после прохождения электропорации, например, в манипуляторе планшета этот планшет может быть перемещен (например, с использованием робота или другого устройства) к станции, содержащей устройство считывания. Затем происходит сбор данных. В некоторых вариантах осуществления такая система может включать в себя также станцию инкубации, где планшет (и электропорированные клетки) инкубируют при желаемых условиях перед перемещением к станции считывания (или сбора данных).

Для сбора данных в устройстве считывания планшета используется считывающее устройство, совместимое с теми данными, которые будут генерироваться в ходе эксперимента(ов) электропорации, выполняемого(ых) в планшете электропорации. Например, если экзогенной молекулой, введенной в клеткухозяина, является молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая репортерный ген, продукт экспрессии которого является белком, способным давать флуоресценцию, то может быть использован люменометр для сбора данных о том, насколько много люминесцентного излучения испускается из конкретной лунки. Подобным же образом, могут быть помечены другие разновидности экзогенных молекул, по желанию, обычно - частью молекулы, совместимой с используемой системой обнаружения. Если в различных лунках используют различные условия электропорации, буферы, концентрации реагентов и т.д., то могут ожидаться различные результаты. Другие считывающие устройства включают в себя спектрофотометры (например, для измерения различий в поглощении на конкретной длине волны или в диапазоне конкретных длин волн света в суспензии клеток-хозяев, в которые была введена экзогенная молекула) и устройства машинного зрения (например, для оценки прикрепления клеток после опосредованного электропорацией введения экзогенной молекулы в клетки-хозяева в этой суспензии), хотя может быть использовано любое устройство обнаружения, способное обнаруживать воздействие на клетки, которое опосредовано экзогенной молекулой.

В этих экспериментах, в которых используется устройство считывания планшета, предпочтительно, чтобы система электропорации также включала в себя устройство хранения данных для сохранения информации, собранной устройством считывания планшета, для последующего просмотра и анализа. Может быть использовано любое устройство хранения данных.

Необязательно, система электропорации будет также включать в себя оборудование хранения планшетов для хранения планшетов электропорации в ходе или после завершения эксперимента электропорации, предпочтительно после сбора данных устройством считывания планшета.

В других вариантах осуществления этого аспекта система электропорации дополнительно содержит компьютер оптимизации, приспособленный для оптимизации условий электропорации, отдельно или в сочетании с другими экспериментальными условиями, с использованием данных электропорации, сохраненных в памяти.

Еще один аспект настоящего изобретения относится к способам введения экзогенной молекулы в клетку-хозяина, включающий в себя использование электропорации для введения экзогенной молекулы

- 8 009405 в клетку-хозяина, присутствующую в суспензии, содержащейся в лунке электропорации планшета электропорации в соответствии с настоящим изобретением. Здесь использование электропорации для «введения экзогенной молекулы в клетку-хозяина» означает придание клетке-хозяину способности поглощать эту экзогенную молекулу с использованием электропорации. В результате электропорации эта экзогенная молекула способна затем диффундировать в клетку-хозяина. Конечно, могут быть также использованы такие способы, как ионтофорез, для дополнительного усиления поглощения экзогенных молекул в клетки, которые были электропорированы. В некоторых вариантах осуществления такая экзогенная молекула представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты. В других вариантах осуществления она представляет собой низкомолекулярное лекарственное средство. Должно быть понятно, что при конкретной реакции электропорации может присутствовать более чем одна разновидность экзогенной молекулы.

В рассматриваемых способах клеткой-хозяином обычно является эукариотическая клетка или прокариотическая клетка. Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают в себя клетки животных и клетки растений. Особенно предпочтительные клетки животных включают в себя клетки млекопитающих (например, клетки человека или примата, а также клетки животных из семейства коровьих, собачьих, лошадиных, кошачьих, мышиных, овечьих и свиных), клетки насекомых, клетки рыб, клетки птиц, клетки паукообразных, клетки моллюсков и клетки ракообразных. Особенно предпочтительные клетки растений включают в себя клетки из однодольных и двудольных растений. Предпочтительными являются также клеточные линии, полученные (выведенные) из любого из предыдущих типов клеток.

Другие признаки и преимущества настоящего изобретения будут очевидными из следующих чертежей, подробного описания и прилагаемой формулы изобретения.

Краткое описание чертежей

Эти и другие аспекты и варианты осуществления настоящего изобретения станут очевидными при изучении следующего ниже подробного описания со ссылкой на прилагаемые чертежи, которые представляют определенные предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения и которые могут быть суммированы следующим образом.

Фиг. 1 является иллюстрацией многолуночного планшета электропорации в соответствии с настоящим изобретением. Изображен 96-луночный планшет (2). Лунки (4) организованы в восемь рядов (6) и двенадцать столбцов (8). Верхние поверхности (10) каждого ряда покрыты проводником для пропускания тока. В лунки простираются электроды (12 и 14), соединенные с этими проводниками. Проводники для анодов расположены на одной стороне ряда, а катоды и их проводники расположены на другой стороне. В этом варианте осуществления электрическое соединение с внешним источником энергии имеет место на краю планшетов, при этом электрические контакты с источником электропитания выполнены в дальних областях (16 и 18) соединителей для анодов и катодов.

Фиг. 2 изображает различные конструктивные элементы репрезентативной системы электропорации для многолуночных планшетов электропорации в соответствии с настоящим изобретением.

Фиг. 3 изображает различные репрезентативные варианты осуществления планшетов электропорации с большими объемами в соответствии с изобретением. Фиг. 3 а является иллюстрацией планшета (30) для крупномасштабной электропорации в соответствии с изобретением, причем этот планшет пригоден для вариантов применения с большими объемами и содержит три идентичных камеры (32) злектропорации, каждая из которых может содержать вплоть до примерно 15 мл клеточной суспензии. Как показано, каждая из камер (32) электропорации смонтирована на опорной плите (31). Каждая камера содержит входное отверстие (34) и выходное отверстие (38), а также вентиляционное отверстие (36) для облегчения заполнения и опустошения камеры. Кроме того, в изображенном варианте осуществления каждая камера имеет эргономическую часть (40) для облегчения манипулирования.

На иллюстрации, показанной на фиг. 3В, одна из камер планшета электропорации, изображенного на фиг. 3А, показана в разрезе для демонстрации репрезентативного размещения электродов. Здесь, представлены три электрода (39), размещенные на одной стенке внутри камеры (32), и при этом каждый электрод на этой стенке отделен от другого электрода изолирующей частью стенки (41). В камере каждый из этих электродов (39) будет спарен с электродом (39, не показан) на противолежащей стенке, и при этом каждая пара электродов будет снабжаться энергией независимо. Предпочтительно, электроды каждой пары электродов имеют одинаковый размер и расположены непосредственно один против другого. Электроды одной пары электродов также предпочтительно отделены друг от друга таким образом, что поверхность одного электрода является параллельной поверхности другого электрода для гарантирования генерирования электрических полей, по существу, равной напряженности между этими электродами, независимо от того положения между этими электродами, в котором измеряется напряженность поля. В варианте осуществления, показанном на фиг. 3В, пол (37), содержащей раствор части камеры (32), скошен в направлении выходного отверстия (38) для облегчения спуска клеточной суспензии из камеры.

Фиг. 3С показывает поперечный разрез альтернативного варианта осуществления камер (32) по фиг. 3А, в котором электроды (39) расположены горизонтально, а не вертикально. Как и в варианте по фиг. 3В, электроды (39), изображенные на одной из внутренних стенок камеры, отделены друг от друга небольшой изолирующей частью (41) стенки.

- 9 009405

Фиг. 3Ό и 3Е иллюстрируют варианты осуществления, в которых камера (32) имеет ряд внутренних перегородок (42 на фиг. 3Ό, 44 на фиг. 3Е), которые могут быть необязательно включены в это устройство. В случае их присутствия, эти перегородки служат для ограничения перемещения жидкости в содержащей пробу части (45) камеры (39). В изображенных вариантах осуществления каждая камера имеет также входное отверстие (34) для пробы и выходное отверстие (38) для пробы с тем, чтобы обеспечить односторонний поток пробы в камеру и из камеры. Фиг. 3Ό показывает поперечный разрез, сделанный через камеру (32), чтобы показать репрезентативную конфигурацию перегородок (42). Как изображено, каждая перегородка простирается вниз от верха камеры, оставляя отверстие (43) между нижней поверхностью (37) камеры (32) и нижним торцом (48) перегородки. Предпочтительно, когда в камеру вводится множество перегородок, таким образом, это отверстие под одной перегородкой имеет тот же самый размер, что и отверстия под другими перегородками, хотя настоящее изобретение также охватывает конфигурации, имеющие множественные перегородки с отверстиями различных размеров. Как должно быть понятно, эти перегородки могут также содержать одно или несколько дополнительных отверстий различной формы и различных размеров на протяжении их длины, и при этом перегородки могут быть присоединены к одной или более сторонам этой камеры в дополнение к их присоединению к вверху внутреннего пространства этой камеры.

Фиг. 3Е показывает родственный вариант осуществления, в котором камера (32) содержит несколько перегородок (44), простирающихся от боковых стенок внутреннего пространства камеры чередующимся образом, так что одна перегородка (44) оставляет отверстие (43) между тем своим торцом (47), который наиболее близко приближается к лицевой стороне противолежащей стенки (49). Как должно быть понятно, настоящим изобретением охватываются любые подходящие варианты осуществления, содержащие одну или несколько перегородок, независимо от конфигурации. Фактически, эти перегородки могут также содержать электроды (не показано).

Фиг. 3Е показывает другой репрезентативный вариант осуществления камеры (32) для планшета (30) крупномасштабной электропорации в соответствии с настоящим изобретением, который пригоден для вариантов применения с большими объемами. В частности, фиг. 3Е иллюстрирует вид сверху единственной камеры такого планшета, который содержит четыре пары электродов (48а-б), причем анод (52) каждой пары электродов расположен непосредственно напротив катода (50) этой пары. В изображенном варианте осуществления каждый электрод интегрирован в стенку и расположен вертикально в стенке этой камеры прямо напротив другого члена этой конкретной пары электродов. На каждой из стенок, которые вмещают в себя электроды, эти электроды отделены один от другого изолирующей частью (41) конкретной стенки. Планшет и камеры также содержат проводники (не показаны), которые соединяют каждый из анодов и катодов в конкретном наборе электродов с электрическими контактами, которые могут быть соединены с источником электропитания (не показан) для снабжения электродов энергией. В изображенном варианте осуществления каждый набор электродов (здесь - пара электродов) может быть снабжен энергией независимо от других наборов электродов.

Как будет понятно квалифицированным специалистам в данной области, варианты осуществления, представленные на прилагаемых чертежах, являются только репрезентативными и не соответствуют фактическому объему настоящего изобретения. Например, различные конструктивные элементы планшета электропорации согласно настоящему изобретению могут быть расположены отличающимся образом или могут включать в себя дополнительные и/или отличающиеся конструктивные элементы.

Подробное описание изобретения

Перед описанием настоящего изобретения следует отметить, что изобретение не ограничивается этими конкретными описанными планшетами, системами и методологиями электропорации, так как они могут варьироваться. Должно быть также понятно, что используемая здесь терминология служит только для цели описания конкретных вариантов осуществления и не предназначена для ограничения объема изобретения, определяемого прилагаемой формулой.

1. Введение.

В качестве своей центральной части настоящее изобретение относится к планшетам для крупномасштабной электропорации. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления эти планшеты имеют по меньшей мере две лунки и вплоть до 96, 192, 288, 384, 576, 672, 768, 1536, 3072 или 6144 или более идентичных лунок, которые содержат электроды электропорации, которые могут быть снабжены энергией или адресованы независимо. В других предпочтительных вариантах осуществления планшет электропорации в соответствии с настоящим изобретением содержит по меньшей мере одну и вплоть до 2-30 или более камер большого объема для электропорации содержащих клетки суспензий. В таких вариантах осуществления каждая камера содержит множество наборов электродов, которые могут быть снабжены энергией или адресованы независимо.

Понятно, что в контексте настоящего изобретения термины «снабжены энергией независимо», «независимо адресованы» или т.п. означают способность пары электродов электропорации (или большего числа электродов, составляющих набор электродов, например противолежащих пар электродов) получать энергию отдельно и порознь от любой другой пары электродов электропорации в планшете. Эта способность является функцией конструкции планшета и может достигаться различными путями. На

- 10 009405 пример, каждая пара электродов электропорации может быть смонтирована отдельно от других пар электродов, при этом каждая пара электродов является частью ее собственной отдельной цепи, состоящей из этих электродов и проводников, которые соединяют эти электроды с электрическими контактами для подсоединения к источнику электропитания. Альтернативно, множество электродов, предпочтительно пар электродов, могут быть организованы в виде элементов одной и той же цепи, причем каждая пара электродов имеет выключатель, связанный с ней. Таким образом, выключатель будет определять, снабжается ли энергией конкретная пара электродов при снабжении энергией этой цепи. Конечно, могут быть также изготовлены планшеты, имеющие комбинации таких цепей. Когда пара (или набор) электродов для единственной лунки (или камеры) может быть адресована независимо, говорят, что эта лунка (или ее электроды) является (являются) «независимо адресуемой». Подобным же образом в других вариантах осуществления, в которых планшет сконструирован таким образом, что несколько, но не все, пар электродов или наборы являются частью одной цепи и, следовательно, могут быть адресованы вместе (т.е. одновременно, без приведения в действие выключателя), говорят, что эти пары электродов (и соответствующие их лунки) являются адресуемыми независимо по отношению к другим электродам (и лункам) в этом планшете.

Кроме планшетов электропорации и комплектов, содержащих такие планшеты, загруженные электрически компетентными клетками-хозяевами, настоящее изобретение относится также к системам электропорации, которые используют такие планшеты. Как минимум, такая система электропорации будет содержать манипулятор планшета, который снабжает энергией цепь(и), присутствующую(ие) в планшете электропорации. Таким образом, манипулятор планшета будет содержать источник электропитания для обеспечения энергии, необходимой для снабжения энергией электродов планшета, а также контроллер, который указывает, когда и каким образом каждая цепь будет снабжена энергией (и, если присутствует выключатель, какой выключатель или какие выключатели будут включаться или выключаться). Контроллер и источник электропитания могут быть различными узлами, хотя предпочтительно эти функции выполняются в едином устройстве. Система электропорации может также включать в себя одно или несколько устройств считывания планшета, устройств хранения данных и/или компьютеров (например, для оптимизации параметров электропорации, управления перемещением планшетов и манипулированием ими и т. д.).

Предпочтительные варианты осуществления этих и других аспектов настоящего изобретения подробно описаны ниже.

2. Планшеты электропорации.

Настоящее изобретение относится к планшетам электропорации, т.е. промышленным изделиям, применимым при выполнении экспериментов электропорации. Что касается вариантов осуществления планшетов, пригодных для высокопроизводительных применений, каждый из этих планшетов содержит множество электрифицируемых лунок, по меньшей мере две из которых могут быть снабжены энергией независимо. Эти лунки расположены в твердой подложке и могут быть введены на разных стадиях изготовления. Для электрификации каждой лунки в нее постоянно помещены по меньшей мере два электрода (анод и катод). Как и в случае самих лунок, эти электроды могут быть введены на различных стадиях изготовления. Электроды снабжаются энергией с использованием внешнего источника электропитания (часто называемого в области электропорации «генератором импульсов»), который в рабочем состоянии может быть связан с планшетом. Подобным же образом, в тех вариантах осуществления, в которых планшеты содержат одну или более камер большого объема, каждая камера содержит множество наборов электродов, которые могут быть снабжены энергией независимо. Каждый из электродов в наборе электродов предпочтительно помещен в стенке камеры, которая обычно выполнена из твердой подложки. Как должно быть понятно, камеры могут быть изготовлены отдельно и затем присоединены к опорному (несущему) элементу на подходящей стадии. Таким образом, электрическая схема для соединения наборов электродов с источником электропитания может быть интегрирована исключительно в корпус самой камеры или, альтернативно, она может включать в себя конструктивные элементы, некоторые из которых находятся в камере, а некоторые находятся на опоре. В других вариантах осуществления, камеры и опорный элемент выполняют в виде интегрированного узла, и в каждом случае этот законченный узел будет содержать проводники и электрические соединения, необходимые для снабжения энергией электродов этого устройства посредством источника электропитания.

а. Конструкция.

Как описано здесь, планшет для высокопроизводительной электропорации в соответствии с настоящим изобретением содержит множество электрифицируемых лунок, по меньшей мере две из которых могут быть снабжены энергией независимо. Поскольку такие планшеты, вероятнее всего, будут использоваться в сочетании с автоматизированными, высокопроизводительными системами скрининга, предпочтительно, чтобы эти планшеты были сконструированы таким образом, чтобы работать в такой операционной среде, хотя такая совместимость не является обязательной. Разработчики аппаратного оборудования для большинства систем высокопроизводительного биомолекулярного скрининга основываются на стандартах, опубликованных Сообществом биомолекулярного скрининга («δοοίοΙν ίοτ Βίοто1еси1аг 8сгеешид», г. Дэнбери, шт. Коннектикут, США) и одобренных Американским национальным

- 11 009405 институтом стандартов (Лтепсаи Ναΐίοηαΐ §1аибагб8 ΙηκΙίΙυΙο. 1пс.). Среди прочих вещей, такие стандарты (независимо от того, являются ли они предварительными, временными или официально принятыми) определили набор общих размеров для планшетов, предназначенных для использования в этих системах. Обычно существуют стандарты для размеров опорной поверхности, размеров по высоте, размеров наружного нижнего фланца, положений лунок (например, для 96-, 384- и 1536-луночных планшетов) и жесткости боковых стенок. Планшетами этих размеров могут легко манипулировать робототехнические системы и автоматизированные аппаратные платформы при использовании во многих фармацевтических, биотехнологических корпорациях и сельскохозяйственных корпорациях биологических наук, а также в академических и других исследовательских институтах по всему миру. Для облегчения широкого принятия данных планшетов электропорации для высокопроизводительных применений желательно, чтобы эти планшеты соответствовали этим и позднее разработанным стандартам для поддержки автоматизации и межплатформенной совместимости.

Предпочтительные примеры таких вариантов осуществления включают в себя те, в которых планшет электропорации содержит множество лунок, организованных в столбцах и рядах. В некоторых из этих вариантов две или несколько лунок в конкретном столбце (или в ряду) (которые могут быть или не быть всеми лунками в этом столбце) снабжают энергией вместе, но независимо от лунок в других столбцах (или рядах) этого планшета. В других вариантах электроды всех лунок конкретного столбца или ряда будут снабжаться энергией вместе, но независимо от других электродов этого планшета. В таких вариантах осуществления предпочтительно, чтобы электроды конкретного столбца (или наборов столбцов или их частей) снабжались энергией вместе и чтобы в рабочем состоянии они были связаны таким образом, что при снабжении энергией одной пары электродов все из них снабжались энергией с одинаковыми параметрами снабжения энергией. «Часть» лунок (или электродов) столбца или ряда означает две или более, но меньше чем все, из лунок (или электродов) данного столбца или ряда.

В других вариантах осуществления планшеты электропорации согласно настоящему изобретению содержат одну или несколько камер большого объема для проведения крупномасштабной электропорации. В таких вариантах осуществления каждая камера содержит множество электрифицируемых наборов электродов, каждый из которых в минимальном случае содержит по меньшей мере два электрода. Каждый из этих наборов электродов может быть снабжен энергией независимо. Как должно быть понятно, такие планшеты могут быть сконструированы таким образом, что планшет и камера(ы) изготавливают в виде единой детали. Альтернативно, планшет может быть сконструирован таким образом, что он содержит две или более детали, которые могут быть собраны вместе по необходимости или по желанию. Например, планшет может содержать опорный элемент, изготовленный для приема одной или более камер большого объема. В таких вариантах осуществления эти камеры могут быть одинакового или разного размера, т.е. каждая камера может иметь емкость для удерживания одного и того же или отличающегося объема клеток. В сборках из множества деталей опорный элемент может содержать или не содержать электрические конструктивные элементы. В тех вариантах осуществления, в которых опорный элемент не имеет электрических конструктивных элементов, узлы камер содержат необходимые схемы и соединители для того, чтобы электроды могли снабжаться энергией после соединения с подходящим источником электропитания (т.е. генератором импульсов электропорации). В тех вариантах осуществления, в которых опорный элемент действительно содержит некоторые из конструктивных элементов, необходимых для снабжения энергией электродов, этот опорный элемент и камера(ы) содержат такие соединители или другие конструктивные элементы, которые необходимы для выполнения желаемых соединений между электродами и подходящим источником электропитания. Конечно, настоящее изобретение охватывает большое разнообразие потенциальных конфигураций планшетов согласно настоящему изобретению. Как таковая, точная конструкция планшета в соответствии с настоящим изобретением оставляется на усмотрение квалифицированного специалиста в данной области.

Ь. Твердые подложки.

Планшеты электропорации в соответствии с настоящим изобретением могут быть изготовлены из любой подходящей твердой подложки. Предпочтительными подложками являются те, которые могут быть изготовлены в соответствии с желаемыми спецификациями с помощью процессов литья и/или с использованием механической обработки. Особенно предпочтительными являются пластики или другие полимеры, которые могут быть сформованы до желаемой формы с помощью литья под давлением или сходных процессов. По этой причине особенно предпочтительными являются поликарбонат, сополимер акрилонитрила-бутадиена-стирола (АВ8) и полистирол, хотя может быть использован любой материал (или комбинации различных материалов), которые могут быть сформованы в планшет для крупномасштабной электропорации в соответствии с настоящим изобретением. Должно быть понятно, что в тех вариантах осуществления, в которых используются пластики, эти пластики могут быть пропитаны и/или армированы материалами, обеспечивающими желаемые характеристики, например улучшенные жесткость, рассеяние тепла, изоляцию по отношению к протеканию электрического тока и т. д.

Другим преимуществом пластиков является способность использовать различные цвета и различные степени прозрачности в различных частях планшета электропорации в соответствии с настоящим изобретением. Например, многие системы обнаружения основаны на обнаружении света специфических

- 12 009405 длин волн. По этой причине во многих вариантах осуществления дно планшета электропорации выполнено из прозрачного пластика, в то время как те части планшета, которые образуют боковые стороны лунок, выполнены из непрозрачного пластика.

Хотя пластики представляют предпочтительные примеры твердых подложек для образования планшета электропорации в соответствии с настоящим изобретением, в других вариантах используются керамика или металлы. Поскольку эти материалы и способы их получения хорошо известны в данной области, такие материалы могут быть легко приспособлены для применения настоящего изобретения на практике специалистами со средней квалификацией в данной области в свете данного описания.

с. Электроды.

Электроды могут быть изготовлены или сформованы из любого подходящего электропроводящего материала или комбинации материалов, в том числе композитов таких материалов. Предпочтительно, материал(ы), используемые в качестве электродов, будут биосовместимыми. При формировании электрода из множества материалов (например, электропроводящий материал, такой как золото, нанесенный поверх такого электропроводящего материала, как никель, нанесенный на такой электропроводящий материал, как медь, или носитель, легированный электропроводящим материалом) предпочтительно, чтобы, по меньшей мере, самый верхний слой, т.е. слой, который будет подвергаться воздействию клеточной суспензии, был биосовместимым.

Предпочтительные биосовместимые электродные материалы включают в себя золото и титан. Конечно, могут быть также использованы другие проводники (например, алюминий, различные нержавеющие стали и т. д.) и их выбор на основе конкретного применения оставлен на усмотрение квалифицированного специалиста.

Электроды и проводники могут быть включены в планшет электропорации посредством любого подходящего способа. Например, в некоторых вариантах осуществления электродные материалы наносят или другим образом помещают на твердую подложку в желаемых положениях. В других вариантах осуществления твердую подложку обрабатывают механически для принятия электродов для одной или нескольких предварительно отформованных лунок.

б. Изготовление.

Особенно предпочтительный вариант планшета для высокопроизводительной электропорации в соответствии с настоящим изобретением (см. фиг. 1) был изготовлен многостадийным способом следующим образом. Поликарбонатный каркас, обеспечивающий базовую конструкцию для 96-луночного планшета электропорации, был сформирован литьем под давлением. Эти 96 лунок были размещены в 8 рядах и 12 столбцах. Боковые стенки каждой лунки, расположенные в направлении ряда, а также верх ряда, смежный с каждой лункой, затем отливали с использованием такого материала, как ЛВ8 или смесь поликарбоната/ЛВ8-пластика (РС-ЛВ8), с получением планшета, имеющего такие свойства поверхности на некоторых из его поверхностей (здесь - на боковых стенках лунок ряда и верхах рядов), которые подходят для осаждения металлов или нанесения других материалов, применимых в качестве электродов и проводников. После отливки этих лунок планшет подвергали воздействию протравливающего раствора для получения поверхностей для нанесения (например, посредством электроосаждения) электродного состава.

В этом планшете электропорации три разных слоя металлов последовательно осаждали в виде относительно тонких пленок на определенные части твердой подложки (например, на лунки, образованные из ЛВ8 на поликарбонатном каркасе) с использованием таких способов электроосаждения (нанесения гальванического покрытия), в которых могли бы использоваться различия между поликарбонатом и ЛВ8-материалами. Первоначально относительно тонкую пленку меди с номинальной толщиной примерно 10 микродюймов (мкд) наносили на ЛВ8-части планшета с использованием способов нанесения покрытия методом химического восстановления. Медь выбрали в этом случае потому, что она хорошо прикрепляется к ЛВ8 и обеспечивает переходную связку между слоями пластика и металла. Затем относительно толстую пленку меди с номинальной толщиной примерно 1/1000 дюйма (1 мил), наносили на первоначальный слой меди с использованием способов электроосаждения. В таких планшетах эти слои меди обеспечивают основную часть пропускной способности по току. После нанесения меди на эту медь наносили тонкую пленку никеля, имеющую номинальную толщину примерно 100 мкд. Никель использовали вследствие его проводящих свойств и вследствие того, что он хорошо прикрепляется к медному слою и образует хорошую подложку для электроосаждения золота. Наконец, на никель наносили завершающий слой золота. Вследствие его относительно высокой стоимости золото наносили электроосаждением с использованием контролируемого метода электроосаждения. Этот слой золота имел номинальную толщину примерно 10 мкд. Как должно быть понятно, с учетом стоимости номинальная толщина слоев меди и никеля может варьироваться достаточно сильно, вплоть до 50% или более. Толщина слоя золота контролировалась более строго, и предпочтительно она варьируется на уровне менее примерно 5%. Электроды, применимые при использовании настоящего изобретения на практике, в том числе многослойные электроды, такие как описанные выше, предпочтительно обладают способностью для использования при большом разнообразии различных условий электропорации (включая приложение 400 В в течение 10 мс с использованием стандартного забуференного солевого раствора), что делает конкретный

- 13 009405 планшет применимым для разнообразных различных условий электропорации. Действительно, при условии, что некоторые или все эти лунки могут быть электрически адресованы (т.е. снабжены энергией) независимым образом по отношению к другим лункам на этом планшете, единственный планшет может быть использован для испытания множества различных условий электропорации.

Было рассчитано, что такие трехслойные электроды, как описанные выше, имеют номинальное сопротивление дорожки 0,18 Ом для слоя меди, 0,73 Ом - для слоя никеля и 2,5 Ом - для слоя золота, давая общее сопротивление примерно 0,136 Ом. Считается, что примерно 75% приложенного электрического тока (т. е. импульса электропорации) будет протекать через медь, хотя он будет мигрировать в никель и затем в слой золота для достижения пробы.

После введения электродных слоев с другими частями планшета связывали прозрачное изолирующее дно, изготовленное из пластика (например, сложного полиэфира или полистирола), с использованием клея, отверждаемого под действием ультрафиолетового излучения, таким образом, чтобы гарантировать, что дно каждой лунки будет полностью герметизировано для предотвращения утечки из лунки в лунку. Дно планшета может быть прозрачным, полупрозрачным или непрозрачным, как и другие детали планшетов. Было обнаружено, что, когда планшеты должны использоваться в анализах на основе люминесценции, предпочтительным является дно белого цвета. В любом случае, после того как к планшету было прикреплено подходящее дно, планшет затем предпочтительно герметизируют и стерилизуют.

В другом предпочтительном варианте осуществления планшета для высокопроизводительной электропорации в соответствии с настоящим изобретением изолирующий полимер отливают сверху на матрицу электропроводящих электродов, сформованных таким образом, чтобы в конечном счете обеспечить планшет, имеющий 96 лунок, расположенных в виде матрицы 8x12, так что каждая лунка содержит по меньшей мере пару электродов, причем электроды некоторых или всех из этих лунок могут быть снабжены энергией независимо от электродов других лунок в этом планшете.

3. Применения.

Поскольку планшеты для высокопроизводительной электропорации согласно настоящему изобретению предоставляют по меньшей мере две лунки, которые содержат электроды электропорации, которые могут быть снабжены энергией или адресованы независимо, в единственном планшете может быть выполнено множество экспериментов по электропорации. Подобным же образом, поскольку некоторые планшеты для крупномасштабной электропорации в соответствии с изобретением содержат одну или несколько камер электропорации большого объема, каждая из которых содержит два или более наборов электродов, которые могут быть снабжены энергией или адресованы независимо, большие объемы клеток могут быть эффективно электропорированы в одном сосуде. Кроме того, при использовании вместе с такими планшетами существующие источники электропитания для электропорации могут быть использованы более эффективно, так как теперь можно снабжать энергией различные области планшета или различные наборы электродов единственной камеры в различные моменты времени, что делает возможным подзарядку источника электропитания между отдельными интервалами подачи энергии. Таким образом, условия электропорации могут быть легко оптимизированы с использованием обычных генераторов импульсов.

Другой вариант применения настоящего изобретения включает в себя введение экзогенных химических веществ, таких как молекулы нуклеиновых кислот, в организмы-хозяева (такие как эукариотические и прокариотические клетки-хозяева), так как такие способы являются центральными для многих типов экспериментов, анализов и терапий. Например, при поиске на представляющий интерес ген в библиотеке ДНК, эта библиотека должна быть сначала введена в популяцию подходящих клеток-хозяев. Поскольку обычная библиотека ДНК (например, библиотека генома такого организма, как человек, мышь, кукуруза и т.д.) является очень сложной (т.е. содержит тысячи, десятки тысяч или более различных генов), количество независимых клонов, необходимых для полного представления каждого гена в этой библиотеке, является очень большим. Для создания библиотеки, которая, например, полностью представляет геном организма, эффективность, с которой ДНК может вводиться в клетки-хозяева, может стать ограничивающим фактором. Посредством оптимизации этого процесса облегчается возможность создания и скрининга библиотек ДНК.

Подобным же образом, многие другие экспериментальные анализы ограничены способностью введения ДНК в организм-хозяина. При клонировании больших сегментов ДНК для анализа целого генома (т.е. с использованием искусственной бактериальной хромосомы), при выполнении клонирования с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) или при проведении случайного (неспецифического) мутагенеза гена с последующим клонированием всех потенциальных измененных форм, успех часто зависит от размера первоначального пула трансформации. Опять-таки, развитие условий, которые улучшают способ введения нуклеиновых кислот в организм хозяина, увеличивает шансы того, что этот эксперимент будет успешным.

Кроме экспериментальных применений, электропорация может быть использована для терапевтических целей. В этом случае планшеты согласно настоящему изобретению могут быть использованы для введения экзогенных молекул, привносящих терапевтическую пользу в клетки пациента, в частности, в формате ех νΐνο. Примеры терапевтических экзогенных молекул включают в себя молекулы нуклеино

- 14 009405 вых кислот. Нуклеиновые кислоты могут быть доставлены для выполнения так называемой «генной терапии», т.е. введения в пациента одного или более генов, предназначенных для достижения терапевтической пользы. Альтернативно, планшеты для крупномасштабной электропорации согласно настоящему изобретению могут быть использованы в формате ех νίνο для введения в клетки лекарственных средств из других классов лекарственных средств (например, низкомолекулярных фармацевтических средств, терапевтических белков и т.д.). После обработки эти клетки могут быть затем введены в пациента. Часто эти клетки вводят опять в того же самого пациента, из которого они были извлечены.

С развитием и усовершенствованием методологии электропорации были установлены факторы, которые влияют на эффективность переноса экзогенных молекул, например нуклеиновых кислот. Эти факторы включают в себя напряженность электрического поля, длительность спада (заднего фронта) импульса, форму импульса, температуру реакции, тип клеток, состав буфера в суспензии и концентрацию и размер той разновидности (в том числе более одной разновидности) экзогенных молекул, например молекулы нуклеиновой кислоты, которая подлежит переносу. При наличии такого количества параметров, которые могут влиять на эффективность эксперимента электропорации, в исследовательских и коммерческих условиях часто важно определить те условия, которые будут приводить к высокоэффективному переносу желаемых молекул (например, рекомбинантных нуклеиновых кислот) в конкретную линию клеток-хозяев. Таким образом, важной будет оптимизация для увеличения применения и воспроизводимости электропорации в биомолекулярных исследованиях.

Для выполнения оптимизации система электропорации согласно настоящему изобретению обычно будет дополнительно включать в себя компьютер оптимизации, приспособленный для оптимизации условий электропорации, отдельно или в сочетании с другими экспериментальными условиями, с использованием данных электропорации, сохраненных в памяти. Поскольку планшет для высокопроизводительной электропорации в соответствии с настоящим изобретением содержит множество независимо адресуемых лунок, может выполняться множество экспериментов электропорации. В этом контексте «эксперимент электропорации» относится к конкретному набору параметров снабжения энергией, используемых для снабжения энергией электродов в данной лунке (предпочтительно нескольких лунках). Таким образом, на единственном планшете может быть выполнено множество различных экспериментов электропорации. Анализ полученных данных позволяет оптимизировать условия электропорации (т.е. параметры снабжения энергией и другие условия, например буфер, концентрацию клеток и т.д.) для конкретной клеточной линии или популяции клеток. Оптимизацию обычно выполняют с использованием статистических методов и способов, таких как многопараметрический анализ, таким образом, что могут быть определены оптимальные условия электропорации (или, по меньшей мере, параметры снабжения энергией для конкретных клетки-хозяина, буфера и экзогенной молекулы).

Все патенты и заявки на патент, публикации, научные статьи и другие ссылочные материалы, упоминаемые в этом описании, являются указаниями на уровень квалификации специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение, и каждый из этих документов включен в данное описание посредством ссылки в той же самой степени, как если бы каждый документ был включен отдельно посредством ссылки во всей своей полноте. Заявители оставляют за собой право физического включения в это описание любых и всех материалов и любой информации из любых таких патентов и заявок на патент, публикаций, научных статей, доступной в электронном виде информации и других ссылочных материалов и документов.

Конкретные планшеты, системы и способы электропорации, приведенные в данном описании, являются типичными образцами предпочтительных вариантов осуществления и поэтому являются примерными и не предназначены в качестве ограничений объема настоящего изобретения. Другие цели, аспекты и варианты осуществления будут приходить на ум квалифицированным специалистам в данной области после рассмотрения этого описания, и все они входят в объем настоящего изобретения, определенный объемом прилагаемой формулы изобретения. Квалифицированному специалисту в данной области будет вполне очевидно, что могут быть произведены варьирующие замены и модификации в отношении описанного здесь изобретения без выхода за пределы объема и существа настоящего изобретения. Настоящее изобретение, иллюстративно описанное здесь, может быть осуществлено на практике в отсутствие любого элемента или элементов, или ограничения или ограничений, которые не описаны здесь специально как существенные. Термины «содержащий», «включающий в себя», «вмещающий в себя» и т.д. должны пониматься как подразумевающие возможность расширения и без ограничения. Следует отметить, что в данном контексте и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают в себя формы во множественном числе, если контекст явным образом не диктует другое.

Приведенные термины и выражения используются как описательные, а не ограничивающие термины, и при их использовании не предполагается исключение любого существующего в настоящее время или позднее разработанного эквивалента тех признаков, которые показаны и описаны, или их частей, но признается, что возможны разнообразные модификации в пределах объема настоящего изобретения в том виде, как оно заявлено. Таким образом, должно быть понятно, что, хотя настоящее изобретение было описано конкретно посредством предпочтительных вариантов осуществления и необязательных признаков, квалифицированными специалистами в данной области может быть произведена модификация

- 15 009405 и/или вариация описанных элементов, и что такие модификации и вариации подпадают под объем заявленного изобретения.

Настоящее изобретение было описано здесь в широком и общем виде. Каждый из более узких видовых признаков и каждая из зависимых групп, попадающих в рамки такого общего раскрытия, также образуют часть настоящего изобретения. Настоящее изобретение включает в себя общее описание изобретения с условием или отрицательным ограничением, удаляющим любой предмет из данного рода, независимо от того, был или не был удаляемый предмет конкретно упомянут здесь.

Другие варианты осуществления находятся в пределах следующей далее формулы изобретения. Кроме того, в том случае, если признаки или аспекты настоящего изобретения описываются в виде групп Маркуша, специалистам в данной области будет понятно, что настоящее изобретение посредством этого описано в виде любого индивидуального члена или любой подгруппы членов группы Маркуша.

Claims (47)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Планшет электропорации, содержащий:

   a) множество снабжаемых энергией лунок электропорации, размещенных в определенном порядке в твердой подложке, причем каждая лунка электропорации содержит по меньшей мере два расположенных в ней электрода электропорации и при этом упомянутые по меньшей мере два электрода электропорации по меньшей мере в двух из этих лунок могут быть снабжены энергией независимо; и

   b) электрические соединения для подсоединения электродов электропорации к источнику электроэнергии.
2. 2. Планшет электропорации по п.1, который содержит примерно 2, 12, 24, 96, 192, 288, 384, 576, 672, 768, 1536, 3072 или 6144 лунки электропорации.
3. 3. Планшет электропорации по п.1, в котором лунки электропорации имеют, по существу, одинаковые размеры.
4. 4. Планшет электропорации по п.1, в котором лунки электропорации являются, по существу, цилиндрическими или прямоугольными.
5. 5. Планшет электропорации по п.1, в котором каждая лунка электропорации имеет объем примерно от 1 мкл до примерно 10 мл.
6. 6. Планшет электропорации по п.1, в котором лунки электропорации имеют объем примерно от 1 мкл до примерно 1 мл.
7. 7. Планшет электропорации по п.1, в котором лунки электропорации имеют объем примерно от 1 до примерно 10 мл.
8. 8. Планшет электропорации по п.1, в котором один из электродов электропорации в лунке электропорации расположен напротив другого электрода электропорации.
9. 9. Планшет электропорации по п.1, в котором каждая лунка электропорации содержит по меньшей мере одну боковую стенку и нижнюю стенку.
10. 10. Планшет электропорации по п.9, в котором электроды электропорации лунки электропорации интегрированы в боковую стенку.
11. 11. Планшет электропорации по п.1, в котором лунки электропорации размещены в виде множества рядов и столбцов.
12. 12. Планшет электропорации по п.11, в котором электроды электропорации в лунках электропорации одного ряда в рабочем состоянии соединены таким образом, чтобы снабжаться энергией одновременно.
13. 13. Планшет электропорации по п.12, в котором соединенные в рабочем состоянии электроды электропорации в лунках электропорации одного ряда могут быть снабжены энергией независимо от электродов электропорации в лунках электропорации в других рядах планшета электропорации.
14. 14. Планшет электропорации по п.13, в котором электроды электропорации в каждом ряду снабжаются энергией независимо от электродов электропорации в других рядах планшета электропорации.
15. 15. Планшет электропорации по п.1, в котором электроды в каждой лунке содержат множество электродов, каждый из которых снабжается энергией индивидуально.
16. 16. Планшет электропорации по п.15, в котором упомянутое множество электродов содержит от 2 до 12 пар электродов.
17. 17. Планшет электропорации по п.16, в котором электроды каждой пары электродов содержат катод и анод, расположенные в упомянутой лунке один напротив другого.
18. 18. Планшет электропорации по п.17, в котором по меньшей мере две соседние пары электродов снабжаются энергией одновременно в виде набора электродов.
19. 19. Планшет электропорации по п.1, в котором электроды электропорации в каждой лунке электропорации являются снабжаемыми энергией независимо.
20. 20. Планшет электропорации по п.1, в котором материал, составляющий твердую подложку, выбран из группы, состоящей из пластика, металла и керамики.
21. 21. Планшет электропорации по п.1, в котором твердая подложка является прозрачной.

    - 16 009405
22. 22. Планшет электропорации по п.1, в котором твердая подложка является полупрозрачной.
23. 23. Планшет электропорации по п.1, в котором твердая подложка является непрозрачной.
24. 24. Планшет электропорации по п.1, в котором электроды электропорации интегрированы в твердую подложку.
25. 25. Планшет электропорации по п.1, в котором электроды электропорации нанесены на поверхность твердой подложки.
26. 26. Планшет электропорации по п.1, в котором электроды электропорации нанесены осаждением из паровой фазы.
27. 27. Планшет электропорации по п.26, в котором электроды электропорации содержат электропроводящий материал или комбинацию электропроводящих материалов.
28. 28. Планшет электропорации по п.26, в котором электрическое соединение содержит контактные штыри и розетки.
29. 29. Планшет электропорации по п.26, в котором электрическое соединение содержит независимый электрический контакт для каждой пары электродов электропорации, которая снабжается энергией независимо.
30. 30. Система электропорации, содержащая:

    a) планшет электропорации по п.1; и

    b) источник электропитания, выполненный с возможностью соединения с электрическим соединителем планшета электропорации.
31. 31. Система электропорации по п.30, дополнительно содержащая манипулятор планшета, выполненный с возможностью удерживания планшета электропорации во время работы системы электропорации.
32. 32. Система электропорации по п.30, дополнительно содержащая устройство считывания планшета.
33. 33. Система электропорации по п.32, в которой в устройстве считывания планшета используется считывающий элемент, выбранный из группы, состоящей из устройства машинного зрения, спектрофотометра и люменометра, для сбора данных электропорации посредством изучения содержания одной или более лунок электропорации в планшете электропорации.
34. 34. Система электропорации по п.32, в которой устройство считывания планшета интегрировано в манипулятор планшета.
35. 35. Система электропорации по п.30, в которой манипулятор планшета представляет собой роботизированный манипулятор планшета.
36. 36. Система электропорации по п.35, дополнительно содержащая оборудование хранения планшетов электропорации, предназначенное для хранения планшетов электропорации в ходе или после завершения эксперимента электропорации.
37. 37. Система электропорации по п.36, в которой оборудование хранения планшетов представляет собой термостат, выполненный с возможностью удерживания множества планшетов электропорации.
38. 38. Система электропорации по п.33, дополнительно содержащая устройство хранения данных, предназначенное для сохранения данных, собранных устройством считывания планшета.
39. 39. Система электропорации по п.38, дополнительно содержащая компьютер оптимизации, приспособленный для оптимизации условий электропорации исходя из сохраненных в памяти данных электропорации.
40. 40. Способ введения экзогенной молекулы в клетку-хозяин, включающий в себя использование электропорации для введения экзогенной молекулы в клетку-хозяин в суспензии, содержащейся в лунке электропорации планшета электропорации по п.1.
41. 41. Способ по п.40, в котором экзогенная молекула представляет собой нуклеиновую кислоту.
42. 42. Способ по п.40, в котором клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из эукариотической и прокариотической клеток.
43. 43. Способ по п.42, в котором клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, выбранную из группы, состоящей из клеток животного и растения.
44. 44. Способ по п.43, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку животного, выбранную из группы, состоящей из клеток млекопитающего, насекомого, рыбы, птицы, паукообразного, моллюска и ракообразного.
45. 45. Способ по п.44, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку млекопитающего, выбранного из группы, состоящей из животных семейства коровьих, собачьих, лошадиных, кошачьих, мышиных, овечьих и свиных.
46. 46. Способ по п.43, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку из клеточной линии млекопитающего.
47. 47. Способ по п.43, в котором эукариотическая клетка представляет собой клетку растения из однодольного или двудольного растений.