EA008541B1

EA008541B1 - Тетрапептид, регулирующий уровень глюкозы в крови при сахарном диабете

Info

Publication number: EA008541B1
Application number: EA200600757A
Authority: EA
Inventors: Владимир Хацкелевич Хавинсон; Владимир Викторович МАЛИНИН; Евгений Иосифович ГРИГОРЬЕВ; Галина Анатольевна Рыжак
Priority date: 2003-12-10
Filing date: 2004-08-09
Publication date: 2007-06-29
Also published as: RU2242241C1; KR101106609B1; JP2007537140A; DK1697401T3; WO2005056580A1; EP1697401B1; KR20070022199A; US20070142298A1; DE602004025040D1; EP1697401A1; LT5421B; EA200600757A1; LT2006024A; AU2004296269A1; CA2547873A1; ATE454397T1; AU2004296269B2; US7491703B2; LV13462B; CA2547873C

Abstract

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано как средство, регулирующее уровень глюкозы для профилактики и лечения сахарного диабета. Технический результат изобретения заключается в создании нового тетрапептида: лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы Lys-Glu-Asp-Trp-NH, обладающего биологической активностью, проявляющейся в регуляции уровня глюкозы. Предлагается фармакологическое средство, содержащее в качестве активного пептидного агента эффективное количество тетрапептида лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы: Lys-Glu-Asp-Trp-NH. Предлагается способ профилактики и/или лечения сахарного диабета, включающий введение пациенту фармакологического средства, содержащего в качестве активного пептидного агента эффективное количество тетрапептида общей формулы: Lys-Glu-Asp-Trp-NHв дозах 0,1-30 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Description

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для лечения сахарного диабета как средство, регулирующее уровень глюкозы.

Наиболее близкими аналогами такого же назначения, которыми осуществляется медикаментозная терапия сахарного диабета типа 1, являются препараты инсулина. Препаратом выбора являются рекомбинантные или генно-инженерные препараты инсулина человека короткого действия: актрапид, хумулин Р, инсуман Р, биосулин Р, а также препараты инсулина человека продленного действия: протофан, хумулин Н, инсуман-базаль и биосулин Н - аналоги инсулина человека - короткого и пролонгированного действия. К препаратам инсулина ультракороткого действия относится хумалог и новорапид, которые отличаются более быстрым началом действия после их введения и укороченным периодом максимального действия по сравнению с инсулинами короткого действия; они эффективны в отношении снижения постпрандиального уровня глюкозы. Однако инсулинотерапия является заместительной, при которой возможны осложнения: аллергические реакции, гипогликемические состояния, инсулинорезистентность и постинсулиновые липодистрофии. Медикаментозная терапия сахарного диабета типа 2 также претерпела изменения, в связи с внедрением в клиническую практику препаратов короткого действия, таких как новонорм или репаглинид и старликс. Традиционно применяются сульфонилмочевинные препараты: группа глибенкламида, глипизида, группа гликлазида, гликвидона и амарил (глимепирид), который является препаратом пролонгированного действия и имеет ряд значительных преимуществ перед другими препаратами этой группы. Диабетон МВ и глибенез-ретард являются препаратами продленного действия. Следует отметить, что часто у больных сахарным диабетом развивается так называемая вторичная резистентность к сульфонилмочевинным препаратам, связанная с повышением остаточной секреции инсулина. При применении препаратов сульфонилмочевины наблюдаются побочные эффекты: диспепсические расстройства, аллергические реакции, угнетение функции костного мозга, токсическое воздействие на печень и почки, возникновение гипогликемии. Применяются также бигуаниды - метформин (глюкофаж, сиофор и др), глитазоны или сенситайзеры инсулина: актос и авандия и ингибиторы альфаглюкозидаз: акарбоза и меглитол. Эти пероральные препараты повышают чувствительность тканей к инсулину и оказывают положительное нормализующее влияние на углеводный обмен. Вместе с тем их применение может быть ограничено из-за низкой эффективности или побочных эффектов (Балаболкин М.И. Диабетология. - М: Медицина, 2000. - 672 с; Регистр лекарственных средств России. Энциклопедия лекарств. 10 вып. - М.: РЛС-2003. -2003.-1438 с.).

Известен декапептидный фрагмент инсулина (Патент РФ №2078769 «Пептидный фрагмент, обладающий биологической активностью инсулина», МПК А61К38/28, 1997), обладающий биологической активностью, сравнимой с активностью инсулина.

Известны аналоги пептида р277 - эпитопа человеческого белка теплового шока (йвр 60) (Патент РФ №2159250 «Аналоги пептида р277 и содержащие их фармацевтические композиции для лечения и диагностики диабета», МПК А61К39/00, 38/00, 2000).

Однако биологическая активность, указанная в перечисленных выше патентах, проявляется в инсулиноподобном действии этих пептидов и может использоваться с целью создания пептидных препаратов для лечения сахарного диабета типа 1.

Известны короткие инсулинпотенцирующие пептиды, описанные в патенте (ЕР № 1268518 «1п5и1ш ро!епйайпд рерйбев», МПК С07К5/10; А61К38/07; А61К38/08, 2001), принятом за прототип по отношению к фармакологическому средству (фармацевтической композиции) и способу профилактики и/или лечения сахарного диабета. Эти короткие пептиды могут служить пептидными фармацевтическими агентами, которые могут использоваться для лечения сахарного диабета.

Следует отметить, что заявляемое пептидное соединение - тетрапептид, не имеющий структурных аналогов.

Заявляемое изобретение направлено на получение нового биологически активного соединения пептидной природы, регулирующего уровень глюкозы у пациентов с сахарным диабетом типа 1 и типа 2.

Настоящее изобретение относится к новому тетрапептиду лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы Еу5-О1и-А5р-Тгр-НН₂ последовательности 1 |ЗЕО Ш N0:1].

Тетрапептид получают классическим методом пептидного синтеза в растворе (Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985. - 456 с).

Настоящее изобретение относится к новому тетрапептиду лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы: Еу5-О1и-А5р-Тгр^Н₂ последовательности 1 |ЗЕО Ш N0:1], обладающему биологической активностью, проявляющейся в регуляции уровня глюкозы.

Регуляторное действие тетрапептида Еу5-О1и-А5р-Тгр^Н₂ на уровень глюкозы при сахарном диабете выявлено при его изучении в эксперименте при аллоксановом диабете. Предполагается, что аллоксановый диабет характеризуется поражением β-клеток поджелудочной железы и сопровождается выраженной гипергликемией, вследствие дефицита инсулина и активации глюконеогенеза.

В результате экспериментального изучения установлено, что тетрапептид Еу5-С1и-А5р-Тгр^Н₂ не обладает токсичностью.

Настоящее изобретение также относится к фармакологическому средству (фармацевтической композиции), содержащему в качестве активного пептидного агента эффективное количество тетрапептида

- 1 008541 лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы Εν5-Ο1ιι-Α5ρ-ΤΓρ-ΝΗ_; последовательности 1[8Еф ГО N0:1], регулирующему уровень глюкозы при сахарном диабете.

Понятие «фармакологическое средство», используемое в данной заявке, подразумевает использование такой лекарственной формы, содержащей эффективное количество тетрапептида общей формулы Ьук-СЫ-Акр-Тгр-ЛНг, которая может найти профилактическое и/или лечебное применение в медицине в качестве средства для регуляции уровня глюкозы при сахарном диабете.

Понятие эффективное количество, используемое в данной заявке, подразумевает использование того количества активного пептидного агента, которое в соответствии с его количественными показателями активности и токсичности, а также на основании знаний специалиста должно быть эффективным в данной лекарственной форме.

Для получения фармацевтических композиций, отвечающих изобретению, предлагаемый тетрапептид смешиваются как активный ингредиент с фармацевтическим носителем согласно принятым в фармацевтике способам компаундирования.

Носитель может иметь различные формы, которые зависят от лекарственной формы препарата, желаемой для введения в организм, например парентерального или перорального.

При изготовлении композиций в предпочтительной дозированной форме для перорального применения могут использоваться известные фармацевтические компоненты.

Для парентерального введения носитель обычно включает стерильную воду, хотя могут быть включены другие ингредиенты, способствующие стабильности, или для сохранения стерильности.

В соответствии с настоящим изобретением фармакологическое средство назначается предпочтительно для парентерального и/или перорального применения.

Настоящее изобретение также относится к способу профилактики и/или лечения сахарного диабета, который состоит во введении пациенту фармакологического средства, содержащего в качестве активного пептидного агента эффективное количество тетрапептида общей формулы ΕΛΈ-ΟΙιι-Αφ-ΤΓρ-ΝΗ дозах 0,1-30 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.

Метод профилактики и/или лечения сахарного диабета состоит в профилактическом или лечебном парентеральном или пероральном введении фармакологического средства пациенту.

Согласно изобретению тетрапептид Ьук-СШ-Акр-Тгр-ЛНг активен при введении его в дозах 0,1-30 мкг/кг массы тела, хотя могут быть использованы и более низкие (высокие) дозы в зависимости от характера и степени тяжести патологического процесса.

Технический результат, достигаемый при использовании изобретения, заключается в регуляции уровня глюкозы за счет увеличения секреции инсулина и повышения чувствительности тканей к инсулину.

Возможность достижения объективного технического результата при использовании изобретения подтверждена достоверными экспериментальными и клиническими данными, полученными методами, общепринятыми в данной области знаний.

Сущность изобретения поясняется таблицами.

В табл. 1 показано влияние тетрапептида ^у8-С1и-Α8р-Τ^р-NН₂ на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом (вариант лечения).

В табл. 2 показано влияние тетрапептида Εγδ-ΟΙιι-Αδρ-ΤΓρ-ΝΗ на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом (вариант профилактики и лечения).

В табл. 3 показано влияние тетрапептида ΕΛ'5-Ο1ιι-Α5ρ-ΤΓρ-ΝΗ₂ в разных дозах на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом.

В табл. 4 показано влияние тетрапептида Εγδ-ΟΙιι-Αφ-ΤΓρ-ΝΗ на содержание инсулина в крови крыс с аллоксановым диабетом.

В табл. 5 показаны результаты теста на толерантность к глюкозе крыс с аллоксановым диабетом (44 сутки после завершения курса тетрапептида ΕΛ·5-Ο1ιι-Α5ρ-Τη}-ΝΗ₂).

В табл. 6 показано влияние инсулина на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом (28 сутки после завершения курса тетрапептида Ε\'5-Ο1υ-Α5ρ-ΤΓρ-ΝΗ₂).

В табл. 7 представлено распределение больных сахарным диабетом при проведении исследования.

В табл. 8 показана эффективность парентерального введения тетрапептида ΕΛ'5-Ο1ιι-Α5ρ-ΤΓρ-ΝΗ₂больным сахарным диабетом типа 1 и типа 2, получавшим инсулин.

Настоящее изобретение иллюстрируется примером синтеза тетрапептида формулы лизил-глутамиласпартил-триптофан амид (ΕΛ'5-Ο1ιι-Α5ρ-ΤΓρ-ΝΗ₂) (пример 1), примерами испытания биологической активности тетрапептида (^у8-С1и-Α8р-Τ^р-NН₂) (примеры 2, 3, 4, 5, 6, 7), а также примером результатов клинического применения тетрапептида (^у8-С1и-Α8р-Τ^р-NН₂), демонстрирующим его фармакологические свойства и подтверждающим возможность достижения профилактического и/или лечебного эффекта (пример 8).

Пример 1. Синтез тетрапептида ΕΛ'5-Ο1ιι-Α5ρ-ΤΓρ-ΝΗ₂

1. Название соединения: лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид

- 2 008541

2. Структурная формула

Н-Ьуз-С1и-А8р-Тгр-МЦ

ГЦ

3. Брутто-формула без противоиона: СЧНз-Ν-Οχ

4. Молекулярный вес без противоиона: 575,62

5. Противоион: отсутствует

6. Внешний вид: белый аморфный порошок без запаха

7. Способ синтеза: пептид получен классическим методом синтеза в растворе по схеме

Ζ-бензилоксикарбонильная группа

ВОС-трет.бутилоксикарбонильная группа

О8и - Ν-оксисукцинимидный эфир

ΟΒζΙ - бензиловый эфир

ОСС -Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид

НОВТ - Ν-оксибензотриазол.

В качестве растворителя использовали Ν,Ν'-диметилформамид. При введении аспарагиновой кислоты использовали защиту α-СООН группы солеобразованием с триэтиламином. Деблокирование ВОСзащитной группы проводили раствором трифторуксусной кислоты (ТРА). Ζ-защитных групп каталитическим гидрогенолизом. Препарат был изолирован и очищен методом препаративной хроматографии на колонке с нормальной фазой (силикагель).

Характеристики готового препарата:

• аминокислотный анализ Ьук С1и Акр Тгр

0,95 1,00 1,06 0,90 • содержание пептида: 97,48 % (по ВЭЖХ, 220 нм) • ТСХ - индивидуален, В(=0,64 (пластинки ПТСХ-П-В-УФ 8огЬП1.

силикагель СТХ-1ВЭ 8-12 мкм, ацетонитрил : вода 3:1) • содержание влаги: 7 % • рН 0,01% раствора: 4,05 • УФ-спектр: пик при 280 нм - индольное кольцо триптофана • удельное оптическое вращение: [а]_с ²³: - 26,53° (с=1,0; Н₂О),

Ро1аша( А, Саг1 Ζείκκ 1еиа.

Пример синтеза:

1) ВОС-С1и(ОВ/1)-А8р(ОВ/1)-ОН (I), М-трет.бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-ф-бензил)аспартат.

Ν-оксисукцинимидный эфир №трет.бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутаминовой кислоты ВОСС1и(ОВг1)-О8и 4,34 г (0,0100 моль) растворяют в 20 мл диметилформамцда, добавляют триэтиламин 1,72 мл (0,0125 моль) и β-бензиласпартат 2,80 г (0,0125 моль). Перемешивают при комнатной температуре 24 ч. Про

-3 008541 дукт высаживают 0,5н раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3x30 мл), промывают 0,5н раствором серной кислоты (2x20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1x20 мл), водой, 0,5н раствором серной кислоты (2x20 мл), водой. Продукт сушат над безводным сульфатом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40°С, остаток сушат в вакууме над Р₂О₅. Получают масло 5,68 г (»100%). Кг = 0,42 (бензол-ацетон 2:1, пластинки 8отЬй1, силикагель 8-12 мкм, проявление УФ и хлор/бензидин).

2) ΤΕΑ·Η-Ο1π(ΟΒζΙ)-Α8ρ(ΟΒζ1)-ΟΗ (II), трифторацетат (у-бензил)-глутамил-(в-бензил)аспартата.

Ы-трет.бутилоксикарбонил-(у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартат (I) 5,68 г (» 0,01 моль) растворяют в 20 мл смеси дихлорметан-трифторуксусная кислота (3:1). Через 2 ч растворитель упаривают в вакууме при 40°С. Упаривание повторяют с новой порцией дихлорметана (2x10 мл), остаток сушат в вакууме над ΝαΟΗ. Получают масло 5,80 г (»100%). К_г = 0,63 (н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:12).

3) Ζ-^у8(Ζ)-С1и(ΟΒζ1)-Α8ρ(ΟΒζ1)-ΟΗ (III), 838,92 И,№-дибензилоксикарбониллизил-(у-бензил) глутамил-(в-бензил)аспартат.

Трифторацетат (у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартата (II) 5,65 г (0,01 моль) растворяют в 10 мл диметилформамида, добавляют триэтиламин 2,80 мл (0,02 моль) и Ν-оксисукцинимидный эфир Ν,Ν^εдибензилоксикарбониллизина 6,64 г (0,013 моль). Реакционную смесь перемешивают 24 ч при комнатной температуре. Продукт высаживают 0,5н раствором серной кислоты (150 мл), экстрагируют в этилацетат (3x30 мл), промывают 0,5н раствором серной кислоты (2x20 мл), водой, 5% раствором бикарбоната натрия (1x20 мл), водой, 0,5н раствором серной кислоты (2x20 мл), водой и сушат над безводным сульфитом натрия. Этилацетат фильтруют, упаривают в вакууме при 40°С, остаток закристаллизовывают в системе этилацетат/гексан. Продукт отфильтровывают и сушат в вакууме над Р₂О₅. Выход 6,04 г (72%). Температура плавления Т.пл.=142°С. К_г = 0,60 (бензол-ацетон, 1:1).

4) Ζ-^у8(Ζ)-С1и(ΟΒζ1)-Α8ρ(ΟΒζ1)-Τ^ρ-NΗ₂ (IV), 1024,15 И,№-дибензилоксикарбониллизил-(у- бензил)глутамил-(в-бензил)аспартил-триптофан амид.

ΗΟ1·Η-Ττρ-ΝΗ₂, гидрохлорид амида триптофана 1,8 г (7,2 ммоль) суспендируют в 15 мл тетрагидрофурана и при перемешивании добавляют триэтиламин 1,0 мл (7,2 ммоль). Через 5 мин Ν,Ν^εдибензилоксикарбониллизил-(у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартат (III) 4,0 г (4,8 ммоль), Νоксибензотриазол 0,8 г (5,8 ммоль). Смесь охлаждают до 0°С. Затем добавляют охлажденный до 0°С раствор Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимида 1,2 г (5,8 ммоль) в 5 мл тетрагидрофурана. Смесь перемешивают при этой температуре 2 ч и оставляют на ночь перемешиваться при комнатной температуре. Реакционную смесь выливают в ледяную воду (150 мл), осадок растирают и отфильтровывают. Осадок суспендируют в этилацетате (200 мл) и промывают образовавшийся гель последовательно 1Ν Η₂8Ο₄ (2x100мл), водой (2x100 мл), 5% ΝαΗί.Ό₃ (2x100 мл), 1Ν Η₂8Ο₄ (2x100мл), водой (2x100 мл), насыщенным раствором №С1. Растворитель упаривают в вакууме, и продукт дважды перекристаллизовывают в изопропиловом спирте. Выход 4,9 г (95%), К_г = 0, 67 (бензол-ацетон, 2:1).

5) Η-^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ (V), лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид, 575,62 Ν,Ν^ε- дикарбобензоксиллизил-(у-бензил)глутамил-(в-бензил)аспартил-триптофан амид (IV) 4,7 г гидрировали в системе метанол-вода (5:1) над катализатором Ρά/С. Контроль за полнотой деблокирования осуществлялся в ТСХ системах бензол-ацетон (2:1) и ацетонитрил-вода (1:3). По окончании реакции катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали в вакууме и остаток закристаллизовывали в системе вода/метанол. Продукт сушили в вакууме над КОН. Выход 2,6 г ( 95 %). К_г = 0, 64 (ацетонитрил-вода, 1:1).

Для очистки продукта 2,6 мг вещества растворяли в 5 мл смеси ацетонитрил-вода (1:3) и наносили на колонку 21x4,5 см с силикагелем Зфта. 230-400 меш (40-63 μ). Элюирование системой ацетонитрил-вода (1:3). Получено 1 г хроматографически однородного вещества.

6) Анализ готового препарата.

• Содержание основного вещества определяли методом ВЭЖХ на колонке №.1с1еой1 С18 4,6x250 тт. Α: 0,1% ΤΡΑ; В: МеСИ; дгаб. В 0^30% за 30 мин. Скорость потока 1 мл/мин. Детекция при 220 нм, сканирование 190-600 нм, проба 20 μ1. Содержание пептида 97,48%.

Аминокислотный анализ проводили на анализаторе АААТ-339 Ргадие.

Бук С1и Ακρ Тгр

0,95 1,00 1,06 0,90 • ТСХ: индивидуален, К_г = 0,64 (ацетонитрил-вода 3:1, пластинки 8отЬй1, силикагель 8-12 мкм, проявление хлор/бензидин и УФ).

• Содержание влаги: 7% (гравиметрически по потере массы при сушке 20 мг при 100°С).

• рН 0,01% раствора: 4,05 (потенциометрически).

• Удельное оптическое вращение: [а]_с ²³: -26,53° (с=1,0 Н₂О), Ро1ата1 Α, Саг1 Ζе^55 1еиа.

• УФ-спектр: пик при 280 нм - индольное кольцо триптофана, Весктап ЭБ 650, 0,001% раствор в воде.

- 4 008541

Пример 2. Влияние тетрапептида Ьу5-С1и-Л5р-Тгр-НН₂ на течение аллоксанового диабета у крыс (вариант лечения)

Эксперимент проведен на 21 белых беспородных крысах-самцах со средней массой тела 375±35 г. После определения концентрации глюкозы в крови все животные рандомизированно были разделены на 2 группы. Затем всем животным однократно внутривенно ввели по 1 мл раствора аллоксана («8ро£а») в дозе 35 мг/кг. Через 15 суток животным контрольной группы начали вводить внутрибрюшинно ежедневно однократно по 0,3 мл 0,9% раствора №1С1. а крысам основной группы - тетрапептид Ьук-бШ-Лкр-ТтрΝΗ₂ в дозе 3 мкг (в 0,3 мл 0,9% раствора ЫаС1) на крысу в течение 11 суток.

Результаты эксперимента приведены в табл. 1, из которой следует, что введение тетрапептида Ьу§Ο1ιι-Α5ρ-Τη3-ΝΗ₂ способствовало достоверному снижению уровня глюкозы в крови у животных во все сроки исследования на 38,4% (30-47,7%). Снижение уровня глюкозы при введении тетрапептида Ьу§Ο1π-Αδρ-Ττρ-ΝΗ₂ коррелировало со снижением летальности среди животных основной группы. Так, в контрольной группе животных к завершению эксперимента (84 сутки от момента введения аллоксана) летальность составила 70%, в то время как в группе крыс, получавших тетрапептид Ьу8-С1и-А8р-ТгрΝΗ₂, - 36,4%. Таким образом, применение тетрапептида Ьу8-61и-А8р-Тгр-Ж₂ позволило уменьшить летальность у животных с аллоксановым диабетом почти в 2 раза.

Пример 3. Влияние тетрапептида Ьук-СЫ-Акр-Тгр-ИЩ на течение аллоксанового диабета у крыс (вариант профилактики и лечения)

Эксперимент проведен на 15 белых беспородных крысах-самцах со средней массой тела 375±35 г. Животные рандомизированно были разделены на 2 группы. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно ежедневно однократно по 0,3 мл 0,9% раствора №С1, а крысам основной группы - тетрапептид Ьу5-С1и-А5р-Тгр^Н₂ в дозе 3 мкг (в 0,3 мл 0,9% раствора №1С1) на крысу в течение 7 суток. Затем всем животным однократно внутривенно вводили по 1 мл раствора аллоксана («8ро£а») в дозе 35 мг/кг. Тетрапептид ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ продолжали вводить еще в течение 3 суток после введения аллоксана. Затем крысам основной группы провели 2-й курс тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ с 18 по 28 сутки (всего 11 суток) в той же дозе.

Результаты эксперимента приведены в табл. 2. Прежде всего, необходимо отметить, что введение тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ здоровым животным не приводило к снижению концентрации глюкозы в крови. У животных контрольной группы во все сроки эксперимента после введения аллоксана отмечено развитие диабета с увеличением уровня глюкозы в крови в 1,9-4,9 раза по сравнению с исходным уровнем. У крыс, получивших 1 курс тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂, отмечено снижение уровня глюкозы на 22-30% по сравнению с контролем. После проведения 2-го курса тетрапептида Ьу8-С1и-А8рТгр^Н₂ у животных отмечена полная нормализация концентрации глюкозы в крови во все исследованные сроки (28, 33, 40 суток), в то время как у контрольных животных в эти же сроки содержание глюкозы в крови было выше соответственно в 2; 4,2; 3,8 раза.

Следует отметить, что тяжелая форма диабета развилась только у 2 из 8 крыс, получивших тетрапептид ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂, в то время как в контрольной группе - у 5 из 7 крыс, т.е. этот показатель у контрольных животных был в 2,9 раза выше.

К завершению опыта (40 сут от момента введения аллоксана) в контроле сохранилось 57,1% животных, а при введении тетрапептида Ьу8-61и-А8р-Тгр-Ж₂ - 75%.

Результаты эксперимента дают основание сделать вывод, что применение тетрапептида Ьу8-С1иАхр-Тгр^Щ способствует полной нормализации уровня глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом, что сопровождается снижением летальности.

Пример 4. Влияние тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ в разных дозах на течение аллоксанового диабета у крыс

Эксперимент проведен на 23 белых беспородных крысах-самцах со средней массой тела 375±35 г. Всем животным однократно внутривенно ввели по 1 мл раствора аллоксана («8ро£а») в дозе 35 мг/кг.

Затем животные рандомизированно были разделены на 3 группы. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно ежедневно однократно по 0,3 мл 0,9% раствора №С1, крысам 2 и 3 группы - тетрапептид Ьу₅-61и-А₅р-Тгр-Ж₂ в дозах 1 мкг (в 0,1 мл 0,9% раствора №1С1) и 10 мкг (в 1,0 мл 0,9% раствора №С1) на крысу в течение 7 суток.

Результаты эксперимента приведены в табл. 3. Введение тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ крысам в дозе 1 мкг способствовало достоверному снижению показателя уровня глюкозы в крови в 1 и 4 сутки после завершения курса препарата соответственно на 17,3 и 12,3% по сравнению с контролем. Введение же тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ крысам в дозе 10 мкг привело к более существенному достоверному снижению концентрации глюкозы в 1, 4, 7, 17 сутки соответственно на 30; 23,8; 26; 12,7%. Из этих данных следует, что увеличение дозы тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ приводит к более выраженному действию на содержание глюкозы в крови у животных.

Пример 5. Влияние тетрапептида ^у8-С1и-Α8ρ-Τ^ρ-NΗ₂ на содержание инсулина в крови крыс с аллоксановым диабетом

Эксперимент проведен на 18 белых беспородных крысах-самцах со средней массой тела 375±35 г.

- 5 008541

После определения концентрации глюкозы в крови все животные рандомизированно были разделены на 2 группы. Затем всем животным однократно внутривенно ввели по 1 мл раствора аллоксана («8роГа») в дозе 35 мг/кг. Через 15 суток контрольным животным начали вводить внутрибрюшинно ежедневно однократно по 0,3 мл 0,9% раствора №1С1. а крысам основной группы - тетрапептид Ьу8-61и-А8р-Тгр-ЫН₂ в дозе 3 мкг (в 0,3 мл 0,9% раствора №1С1) на крысу в течение 11 суток.

Результаты эксперимента приведены в таблице 4, из которой следует, что у животных на 15 сутки после введения аллоксана развился диабет. У крыс, получивших тетрапептид Ьу8-С1и-А8р-Тгр-ПН₂, содержание инсулина в крови после введения препарата в течение 8 суток было в 3,9 раза выше, чем у животных контрольной группы. Во все последующие сроки эксперимента отмечено сохранение некоторого количества инсулина в крови крыс (13-18% от исходного уровня), в то время как у контрольных животных инсулин в крови полностью отсутствовал. К завершению опыта (на 70 сутки от момента введения аллоксана) в контроле сохранилось 62,5% животных, а при введении тетрапептида Ьу8-С1и-А8р-Тгр-ПН₂ - 70%.

Анализ результатов эксперимента показал, что введение тетрапептида Ьу8-С1и-А8р-Тгр-ПН₂ животным с аллоксановым диабетом способствует сохранению некоторого уровня инсулина в крови, что связано, возможно, с частичным восстановлением структуры и функции клеток, вырабатывающих инсулин.

Пример 6. Влияние тетрапептида Ьу8-С1и-А8р-Тгр-ПН₂ на показатели сахарной кривой у крыс с аллоксановым диабетом

Эксперимент проведен на 13 крысах-самцах, которые были ранее в опыте (вариант лечения - 44 сут после окончания введения тетрапептида Ьув-СЫ-Авр-Тгр-ЫНД. Отдельную группу составили 7 здоровых крыс с аналогичной массой тела. Всем животным внутривенно ввели по 1 мл 2% раствора глюкозы и затем определяли ее концентрацию в крови.

Результаты эксперимента представлены в таблице 5, из которой следует, что у здоровых крыс после введения глюкозы ее концентрация в крови составила через 5, 30, 60, 120 мин соответственно 203,9; 156,3; 124,6; 114,5% по сравнению с исходным уровнем, принятым за 100%. Эти данные указывают на резкое подавление функции поджелудочной железы после поражения аллоксаном. У контрольных животных аналогичный показатель составил соответственно 129,8; 127,5; 123,5; 121,1%. Этот же показатель у крыс, получивших тетрапептид Ьу8-61и-А8р-Тгр-ПН₂, составил 142,9; 97,3; 95,6; 77,9%. Результаты этого эксперимента указывают на способность тетрапептида Ьу8-О1и-А8р-Тгр-ПН₂ стимулировать функцию поджелудочной железы у крыс с аллоксановым диабетом.

Пример 7. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом после применения тетрапептида Ьу8-61и-А8р-Тгр-ПН₂

Эксперимент проведен на 13 крысах-самцах, которые были ранее в опыте (вариант лечения - 28 суток после окончания введения тетрапептида Ьу8-О1и-А8р-Тгр-ПН₂). Отдельную группу составили 8 здоровых крыс с аналогичной массой тела. Всем животным внутривенно вводили инсулин (0,3 МЕ) и затем определяли концентрацию глюкозы в крови.

Результаты эксперимента приведены в табл. 6. У здоровых животных отмечено физиологическое резкое снижение уровня глюкозы, в то время как в контроле (аллоксановый диабет) этот показатель был в 2,8 раза ниже. У животных с аллоксановым диабетом, получивших тетрапептид Еу8-С1и-А8р-Тгр-ПН₂, отмечено после введения инсулина достоверное снижение уровня глюкозы почти в 2 раза по сравнению с контролем. Эти данные указывают на способность тетрапептида Еу8-О1и-А8р-Тгр-ЫН₂ в значительной степени сохранять чувствительность тканей к инсулину.

Выявленные в результате экспериментального исследования свойства тетрапептида Ьуз-СЫ-АзрТгр-ИН₂ позволяют рекомендовать его профилактическое и/или лечебное применение в качестве средства, регулирующего уровень глюкозы, для лечения сахарного диабета.

Приведенные ниже результаты клинического изучения заявляемого тетрапептида демонстрируют его фармакологические свойства и подтверждают возможность осуществления изобретения.

Пример 8. Эффективность применения тетрапептида Бу5-С1и-А5р-Тгр-НН₂ у больных сахарным диабетом

Исследование проведено у 36 больных в возрасте от 16 до 83 лет (7 мужчин, 29 женщин). У 23 больных выявлен диабет типа 1, у 13 - типа 2. Длительность заболевания колебалась от 1 года до 30 лет. 32 больных получали инсулин. Большинство больных с сахарным диабетом поступали в стационар в стадии декомпенсации. Содержание глюкозы в крови натощак колебалось от 9,5 до 27 мкмоль/л; уровень гликозилированного гемоглобина - от 7,8 до 12,7%. Всем больным была назначена строгая диета. Методом стратификационной рандомизации все больные были разделены на 2 группы по возрасту, полу, длительности и тяжести заболевания (табл. 7). Дополнительно к стандартному лечению 16 больным сахарным диабетом был назначен тетрапептид Бу5-С1и-А5р-Тгр-НН₂ в дозе 10 мкг (в 1 мл 0,9% раствора ЫаС1) внутримышечно ежедневно однократно в течение 10 суток. 4 больным сахарным диабетом типа 2 дополнительно к стандартному лечению был назначен тетрапептид Бу5-С1и-А5р-Тгр-НН₂ в дозе 100 мкг (1 таблетка) 2 раза в день перед едой ежедневно в течение 10 суток. Пациенты контрольной группы получали в качестве плацебо по 1 мл 0,9% раствора №1С1 по аналогичной схеме.

Результаты изучения эффективности тетрапептида Еу8-С1и-А8р-Тгр-ЫН₂ приведены в табл. 8. У 8 больных (из 16 получавших инсулин) после завершения курса тетрапептида Бу5-С1и-А5р-Тгр-НН2 еже

- 6 008541 дневная доза инсулина была снижена в среднем на 8 ЕД, и при этом достигнута компенсация.

У 6 больных доза инсулина осталась прежней, и при этом достигнута компенсация. И только у 2 больных для достижения компенсации доза инсулина была увеличена: у одного на 4 ЕД, у второго - на 14 ЕД. В то же время в контрольной группе (из 16 получавших инсулин) только у 2 пациентов доза инсулина для достижения компенсации осталась прежней, а у 14 больных для достижения компенсации доза инсулина была увеличена на 4-8 ЕД.

У больных сахарным диабетом типа 2 (1 больной) и типа 1 (3 больных) основной группы, ежедневно получавших тетрапептид Ьу5-С1ц-А5р-Тгр-МН₂ в таблетированной форме, отмечено снижение дозы инсулина на 25 ЕД, а у больных, получавших пероральные антидиабетические препараты, удалось достичь полной компенсации с уменьшением дозы препаратов практически в 2 раза.

Таким образом, применение тетрапептида Еу5-С1и-А5р-Тгр^Н₂ у больных сахарным диабетом способствовало повышению чувствительности тканей к инсулину и некоторому восстановлению функции поджелудочной железы. Необходимо отметить достаточно высокую эффективность тетрапептида ЬувС1и-А5р-Тгэ^Н₂. что проявлялось в снижении дозы инсулина у 50% обследуемых пациентов, в то время как в контрольной группе подобного эффекта ни у одного больного достичь не удалось.

В качестве примеров приводим 3 краткие выписки из историй болезни.

Выписка из истории болезни № 1.

Больная К., 69 лет, инвалид 2-й группы. Больна сахарным диабетом в течение 17 лет. С 1986 г. получала таблетированные антидиабетические препараты, с 1996 г. переведена на инсулин. При обследовании выявлены поздние диабетические осложнения.

Диагноз: сахарный диабет типа 2, вторичная инсулинорезистентность, диабетическая ретинопатия, полинейропатия, диабетическая нефропатия, симптоматическая гипертензия.

При поступлении в стационар: содержание глюкозы в крови натощак - 10 мкмоль/л, через 2 ч после еды - 14 мкмоль/л. Клинический анализ крови - норма, в моче белок - до 0,66 г/л, на ЭКГ отмечена гипертрофия левого желудочка. Ежедневная доза инсулина - 82 ЕД.

Терапия: диета, витамины группы В, берлитион, парентеральная форма фармацевтической композиции, включающая тетрапептид ^у5-^1и-А5р-Т^р-NН₂, по 10 мкг внутримышечно ежедневно в течение 10 суток.

При выписке на 18 сутки - содержание глюкозы в крови натощак - 5,9 мкмоль/л.

Ежедневная доза инсулина - 56 ЕД (снижение на 26 ЕД по сравнению с исходным уровнем). У больной отмечено значительное улучшение показателей коагулограммы.

Выписка из истории болезни № 2.

Больной М., 40 лет, инвалид 2-й группы. Болен сахарным диабетом в течение 13 лет и со времени начала заболевания постоянно получает инсулин.

Диагноз: Сахарный диабет типа 1 средней степени тяжести, диабетическая ретинопатия, полинейропатия, энцефалопатия.

При поступлении в стационар: содержание глюкозы в крови натощак - 17,8 мкмоль/л. Клинический анализ крови и мочи - норма. Ежедневная доза инсулина - 40 ЕД.

Терапия: диета, витамины группы В, парентеральная форма фармацевтической композиции, включающая тетрапептид ^у5-^1и-А5р-Т^р-NН₂, по 10 мкг внутримышечно ежедневно в течение 10 суток.

При выписке на 15 сутки - содержание глюкозы в крови натощак - 3,4 мкмоль/л. Ежедневная доза инсулина - 32 ЕД (снижение на 8 ЕД по сравнению с исходным уровнем).

Выписка из истории болезни № 3.

Больная Л., 83 года. Больна сахарным диабетом в течение 25 лет, получала различные антидиабетические таблетированные препараты. Строго соблюдает диету, чувствует себя удовлетворительно.

Диагноз: сахарный диабет типа 2, диабетическая ретинопатия.

При поступлении в стационар: содержание глюкозы в крови натощак - 11 мкмоль/л. Клинический анализ крови и мочи - норма. Принимает ежедневно по 2 таблетки диабетона. В связи с развившейся резистентностью к таблетированным антидиабетическим препаратам рекомендовано введение инсулина. Однако больная отказалась от инсулина, после чего ей был назначена пероральная форма фармацевтической композиции, включающая тетрапептид ^у5-^1и-А5р-Т^р-NН₂, по 100 мкг (1 таблетка) 2 раза в день до еды ежедневно в течение 10 суток на фоне применения 2 таблеток диабетона. На 2-й день содержание глюкозы в крови натощак - 6 мкмоль/л. Далее доза диабетона была уменьшена в 2 раза.

- 7 008541

Таблица 1

Группа животных	Концентрация глюкозы в крови (мг %)
Исходный уровень	Через 15 сут после введения аллоксана.	Через В сут от начала введения тетра-пептида Ьуз-бШ-АзрТгр-ИН₂	После окончания введения тетрапептида Ьу£-С1и-А5р-Тгр-КН₂ (сут)
1	9	18	28	44	58
Контроль ^и (№С1)	84.0*5.7	345.0* 15.4	360.0* 12.3	342.5* 17.3	351.4* 11.2	368.3*8.1	375.7* 11.2	347.2* 12.8	332.1 * 13.7
η	10	10	9	8	7	6	5	5	3
Тетрапептид Ьуз-СЛи-АзрΤφ-ΝΗ₂	81.1 ±3.8	333.6* 12.4	254.516.2	222.510.3	183.910.5	236.7* 0.3*	221.5* 11.2*	210.89.3	198.9* 11.5*
η	11	11	11	10	9	9	8	8	7

* - Р<0.001 по сравнению с контролем.

Таблица 2

Группа ЖИВОТНЫХ	Концентрация глюкозы а крови (мг %)
Исходный уровень	7 сут от начала введения тетрапептида Еуа-С1и-АзрТф-мн₂(1 курс)	После введения аллоксана (сут)
5	14	21 \| 28	33	40
2-й курс введения тетрапептида Ьу8-С1и-А8р-Тгр-ЫН₂(с 18 по 28 сут)
Контроль (ЫаС1)	82.7*0.9	96.4* 1.0	351.719.4	333.7 * 55.8*	345.657.8	156.4 * 26.4*	383.089.3	405.0* 89.8*
п	7	7	7	6	5	5	4	4
Тетрапептид Ьу5-С1и-А8р- Тгр-ΝΗι	76.8* 1.1	94.0 * 0.8	247.317.2'	261. ±39.5*'	159.032.6'	77.3* 1.3'	90.7*5.2'	107.7*6.4'
η	8	8	8	8	6	6	6	6

* - Р<0.001 по сравнению с контролем;

^# - Р<0.02 по сравнению с контролем.

-8008541

Таблица 3

Группа животных	Концентрация глюкозы в крови (мг %)
Исходный уровень	После введения аллоксана (сут)	После введения тетрапептида Еуз-СОи-Азр-Тгр-ЫНг (сут)
7	14	1	4	7	14	21
Контроль (№С1)	78.6 ±4.2	276.4 ±0.9	272.1 ±9.8	275.7 ±9.7	278.6 ±9.8	277.9 ± 11.1	275.0 ±10.5	285,0 ±12.9
η	7	7	7	7	7	7	6	6
Тетрапептид Ьуз-СНи-Азр* Τψ-ΝΗ₂(1 мкг)	80.6 ±2.8	245.6 ± 12.3	261.7 ± 12.3	228.3 ± 10.7*	244.4 ±12.2*	269.4 ± 8.6	268.8 ±12.4	272.5 ± 9.9
η	9	9	9	9	8	8	8	8
Тетрапелтид Ьу5-61и-АзрΤφ·ΝΗ₂(10 мкг)	83.9 ± 3.4	247.2 ± 14.0	252.2 ± 7.9	193.3 ±6.7*	212.2 ±7.3*	205.6 ±8.4*	240.0 ±7.9*	248.3 ± 13.5
η	7	7	7	7	7	7	6	6

* - Р<0.05 по сравнению с контролем.

Таблица 4

Группа животных	Содержание инсулина в крови (мкМЕ/мл)
Исходный уровень	Через 15 сут после введения аллоксана	Через 8 сут от начала введения тетрапептида Ьуз-СИи-АзрΤιρ-ΝΗ₂	После окончания введения тетрапептида Ъу5-С1и-А5р-Тгр-МН₂ (сут)
1	9	18	28	44
Контроль (N301)	24.3 ±2.1	2.0 ±0.7	0.8 ± 0.25	0	0	0	0	0
п	8	8	8	7	6	5	5	5
Тетрапептид Ьуз- С1и-Азр-Т гр-Ν Н ₂	23.8 ± 2.8	1.5 ± 0.4	3.1 ± 1.1*	3.6 ±0.7'	3.2 ±0.5'	4,3 ±0.5	4.1 ±0.6'	3.9± 1.1
η	10	10	10	8	7	7	7	7

• - Р<0.05 по сравнению с контролем;

• Р<0.001 по сравнению с контролем.

-9008541

Таблица 5

Г руппа животных	Исходный уровень	Время после введения глюкозы (мин)
5	30	60	120
Здоровые	84.5 ±4.2	172.3 ±8.1	132.1 ±9.1	105.3 ±6.2	96.8 ± 5.3
η	7	7	7	7	7
Контроль (№С1)	347.2 ± 12.8*	450.5 ±15.2»	442.7 ± 14.3*	428.9 ± 14.1*	420.5 ± 16.5»
η	5	5	5	5	5
Тетрапептид Ьу5-61и- Азр-Т гр-ΝΗζ	210.8 ±9.3*	301.2 ± 10.5*	205.1 ±11.8*	201.5 ± 13.2*	164.2 ±12.8*
И	8	8	8	8	8

* - Р0.001 по сравнению со здоровыми животными; ^#-Р<0.05 по сравнению с контролем.

Таблица 6

Г руппа животных	Концентрация глюкозы в крови (мг %)	Снижение уровня глюкозы относительно исходного уровня (%)
Исходный уровень	Через 30 мин после введения инсулина
Здоровые	83.5 ± 3.2	29.4 ±2.2	64.8
П	8	8
Контроль (ΝβΟΙ)	375.7 ± 11.2*	287.8 ±12.5*	23.4
п	5	5
Тетрапептид Ьуз-СИи-Авр-Тгр-МНг	221.5 ± 11.2*	123.6 ±8.3*	44.2
п	8	8

* - Р<0.001 по сравнению со здоровыми животными;

^# - Р<0.05 по сравнению с контролем.

Таблица 7

Показатель	Группа больных
Контрольная (плацебо)	Основная (тетрапептид Ьуз-61и-Азр-ТгрΝΗ₂)
Количество больных	16	20
Мужчины	3	4
Женщины	13	16
Количество больных сахарным диабетом типа 1	И	12
Количество больных сахарным диабетом типа 2	5	8

-10008541

Таблица 8

Показатель	Г руппа больных
Контрольная (плацебо)	Основная (тетрапептид Ьуз-СПи-Азр-ТгрΝΗ₂)
Количество больных	16	16
Снижение дозы инсулина для достижения компенсации	0	8
Сохранение дозы инсулина для достижения компенсации	2	6
Увеличение дозы инсулина для достижения компенсации	14	2

5η20060407_1.ΐχΐ

БЕЦиЕЫСЕ Ι_Ι5ΤΙΝ6 <110> САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ОБЩЕСТВЕННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ИНСТИТУТ БИОРЕГУЛЯЦИИ И ГЕРОНТОЛОГИИ СЗО

РАМН <120> Тетрапептид, регулирующий уровень глюкозы в крови при сахарном

	диабете
<130>	1ВС/09/04
<150> <151>	КЦ 2003135605 2003-12-10
<160>	1
<170>	Ра1епС1п уегзтоп 3.3
<210> <211> <212> <213>	1 4 РЯТ АгИЛспа! зеяиепсе
<220> <223> в	Тетрапептид 1_у5-С1и-А5р-Тгр-МН2	регулирует уровень глюкозы
организме при сахарном диабете	за счет увеличения секреции
	инсулина и повышения чувствительности к нему тканей.
<400>	1

Цуз С1и Азр Тгр

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы Еу8-О1и-А§р-Тгр-№₂[8Е(^ ΙΌΝΟ:1],
2. Тетрапептид лизил-глутамил-аспартил-триптофан амид общей формулы Ιλ8-6 Ιιι-Λ8ρ-ΤΓρ-ΝΗ₂[8Е(^ ΙΌ N0:1], обладающий биологической активностью, проявляющейся в регуляции уровня глюкозы.
3. Фармакологическое средство пептидной природы, способное регулировать уровень глюкозы, содержащее активный пептидный агент и фармацевтически приемлемый носитель, отличающееся тем, что в качестве активного пептидного агента содержит эффективное количество тетрапептида Буз-СИи-АзрТгр-ΝΗ, [8Е(^ ΙΌΝΟ:1],
4. Средство по п.З, представленное в форме, предназначенной для парентерального введения.
5. Средство по п.З, представленное в форме, предназначенной для перорального введения.
6. Способ профилактики и/или лечения сахарного диабета, заключающийся во введении пациенту фармакологического средства, содержащего в качестве активного пептидного агента эффективное количество тетрапептида Еуз-С1и-Азр-Тгр^Н₂ в дозах 0,1- 30 мкг/кг массы тела по крайней мере один раз в день в течение периода, необходимого для достижения терапевтического эффекта.
7. Способ по п.6, отличающийся тем, что фармакологическое средство вводят парентерально.
8. Способ по и.6, отличающийся тем, что фармакологическое средство применяют перорально.
9. Способ по и.7, отличающийся тем, что фармакологическое средство по пи.3-5 активно при введении его в дозах 0,1-30 мкг/кг массы тела.