EA005774B1

EA005774B1 - 3'-ПРОЛЕКАРСТВА 2'-ДЕЗОКСИ-β-L-НУКЛЕОЗИДОВ

Info

Publication number: EA005774B1
Application number: EA200300023A
Authority: EA
Inventors: Мартин Л. Брайант; Жилль Госселэн; Жан-Луи Эмбаш
Original assignee: Айденикс (Кайман) Лимитед; Л'Юниверсите Монпелье Ii
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2005-06-30
Also published as: MXPA02012443A; KR20070048277A; NO20026001D0; KR20030032967A; ATE411332T1; WO2001096353A3; CN1900104A; PE20020216A1; CA2413163A1; IL178864A0; DE60136181D1; CN101012259A; PL360404A1; YU94802A; NZ535246A; CA2413163C; NO20026001L; AP2003002713A0; IL153379A; EP1296995B1

Abstract

Настоящее изобретение относится к соединениям, композициям и способам лечения хозяина, зараженного вирусом гепатита В. В частности, раскрываются соединения и композиции 3'-сложных эфиров 2'-дезокси-β-L-нуклеозидов, которые можно вводить одни или в комбинации с другими агентами против вируса гепатита В. Также раскрываются соединения и композиции 3',5'-сложных эфиров 2'-дезокси-β-L-нуклеозидов, которые можно вводить одни или в комбинации с другими агентами против вирусного гепатита В.

Description

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к З'-пролекарствам 2'-дезоксн-в-Ь-нуклеозндов для лечения вирусного гепатита В.

В данной заявке заявляется приоритет согласно предварительной заявке № 60/212100, поданной 15 июня 2000 г.

Предпосылки изобретения

Вирус гепатита В («НВУ») является вторым по отношению к тобакковирусам, вызывающим рак у человека. Механизм, с помощью которого НВУ индуцирует рак, неизвестен, хотя постулируется, что он может непосредственно запускать развитие опухолей или опосредованно запускать развитие опухолей через хроническое воспаление, цирроз и регенерацию клеток, связанную с инфекцией.

Распространение вируса гепатита В во всем мире достигло уровня эпидемий. Через 2-6 месяцев инкубационного периода, во время которого хозяин не знает об инфицировании, заражение НВУ может привести к острому гепатиту и повреждению печени, что вызывает боль в брюшной области, желтуху и повышение уровня некоторых ферментов в крови. НВУ может вызвать скоротечный гепатит, быстро прогрессирующую, часто приводящую к смерти форму заболевания, при которой повреждаются большие участки печени. Пациенты обычно выздоравливают от острого вирусного гепатита. Однако у некоторых пациентов высокие уровни вирусного антигена находятся в крови в течение длительного или неопределенного периода времени, вызывая хроническую инфекцию. Хронические инфекции могут привести к хроническому персистирующему гепатиту. Пациенты, зараженные хроническим персистирующим НВУ, наиболее часто встречаются в развивающихся странах. Хронический персистирующий гепатит может приводить к утомлению, вызывать цирроз печени и гепатоцеллюлярную карциному, первичный рак печени. В западных промышленных странах группы высокого риска заражения НВУ включают таковых, которые контактируют с носителями НВУ и пробами их крови. Эпидемиология НВУ фактически очень сходна с таковой для синдрома приобретенного иммунодефицита, что является причиной того, что инфекция, вызываемая НВУ, распространена среди пациентов со СПИДом или связанными с вирусом иммунодефицита человека инфекциями. Однако НВУ является более контагиозным, чем Н1У.

Было показано, что обещающими при лечении являются ежедневные введения α-интерферона, генетически сконструированного белка. Разработана вакцина из человеческой сыворотки для иммунизации пациентов против НВУ. Вакцины получали путем генной инженерии. Несмотря на то, что было установлено, что вакцина является эффективной, производство вакцины представляет серьезную проблему, поскольку поставка человеческой сыворотки от хронических носителей ограничена, и процедура очистки является длительной и дорогостоящей. Кроме того, каждую партию вакцины, полученной из различных сывороток, необходимо тестировать на шимпанзе для гарантии безопасности. Кроме того, вакцина не помогает уже зараженным вирусом пациентам.

Важной стадией в механизме действия пуриновых и пиримидиновых нуклеозидов при вирусных заболеваниях и, в частности, НВУ и Н1У, является их метаболическая активация под воздействием клеточных и вирусных киназ с образованием моно-, ди- и трифосфатных производных. Биологически активным видом многих нуклеозидов является трифосфатная форма, которая ингибирует ДНК-полимеразу или обратную транскриптазу, или вызывает обрыв цепи.

Был установлен ряд синтетических нуклеозидов, которые проявляют активность в отношении НВУ. Заявленный в патенте США 5539116, Ьюйа е! а1., (-)-энантиомер ВСН-189 (2',3'-дидезокси-3'тиацитидин), известный как 3ТС, в настоящее время проходит клинические испытания при лечении гепатита В. См. также заявку на выдачу европейского патента 04 94119 А1, поданную ВюСйет Рйатша, 1пс.

в-2-Гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан («ЕТС»), заявленный в патентах США № 5814639 и 5914331, Ьюйа е! а1., проявляет активность против НВУ. См. Еигтап е! а1., «Тйе АпйНераШй В Уйщ АсйуШек, СуФФхюШек, апй АпаЬойс Ргой1е§ о£ 111е (-) апй (+) Епапйотетк о£ сй-5Е1иого-1-{2-(Нуйгохуте1йу1)-1,3-оха1Ыо1апе-5-у1}-Су1О81пе» Апйт1стоЫа1 Адепй апй СйетоШегару/ ЭесетЬег 1992, раде 2686-2692; апй Сйепд. е! а1., 1оитпа1 о£ Вю1од1са1 СйетШту, Уо1ите 267(20), 1393813942 (1992).

В патентах США № 5565438, 5567688 и 5587362 (С11и. е! а1.) раскрывается применение 2'-фтор-5метил-в-Е-арабинофуранолилуридина (Ь-ЕМАИ) для лечения гепатита В и инфекции, вызываемой вирусом Эпштейна-Барра.

Установлена эффективность пенцикловира (РСУ; 2-амино-1,9-дигидро-9-{4-гидрокси-3-(гидроксиметил)бутил}-6Н-пурин-6-она) при гепатите В. См. патенты США № 5075445 и 5684153.

Также была установлена активность адефовира 9-{2-(фосфонометокси)этил}аденина, также называемого как РМЕА или {{2-(6-амино-9Н-пурин-9-ил)этокси}метилфосфорная кислота} против гепатита В. См., например, патент США № 5641763 и 5142051.

Уа1е ишуегШу и Тйе Ишуегайу о£ Оеотд1а Векеатсй Еоипйайоп, 1пс. раскрывают применение ЬЕОЭС (5-фтор-3'-тиа-2',3'-дидезоксицитидина) для лечения гепатита В в \УО 92/18517.

- 1 005774

Другие лекарства, исследованные для лечения НВУ, включают арабинозид аденозина, тимозин, ацикловир, фосфоноформиат, зидовудин, (+)-цианиданол, хинакрин и 2'-фторарабинозил-5-иодурацил.

В патентах США № 5444063 и 5684010, Университет Эмори, раскрывается применение энантиомерно чистых Р-О-1,3-диоксолановых пуриновых нуклеозидов для лечения гепатита В.

В заявке \СО 96/40164, поданной Университетом Эмори, и АВ Ксзсатсй Еоиибайои апб 111с СсгИгс Ναΐίοηαΐ бе 1а Кссйсгсйс 8с1еи1|Пдпс (СИК8), раскрывается ряд Р-Ь-2',3'-дидезоксинуклеозидов для лечения гепатита В.

В заявке \СО 95/07287, также поданной Университетом Эмори и !йс Ссийс №йюпа1 бс 1а Кссйсгсйс ίίΑηΙίίκιικ (ΟΝΚδ), раскрываются 2'- или З'-дезокси и 2',3'-дидезоксиф-Е-пентофуранозилнуклеозиды для лечения инфекции, вызываемой Н1У.

В заявке \СО 96/13512, поданной Ссисисог 1и!ста!юиа1, 1ис. и Ыркск, 1ис., раскрывается получение Ь-рибофуранозилнуклеозидов в качестве противоопухолевых агентов и противовирусных агентов.

В заявке XVО 95/32984 раскрываются липидные эфиры монофосфатов нуклеозидов в качестве иммуносупрессоров.

В ΌΕ 4224737 раскрываются нуклеозиды цитозина и их фармацевтические применения.

ТА с1 а1. в Вюсйст. Рйагтасо1. 1994, 48(7), 1477-81, раскрывают действие аналогов агента против Н1У 2'ф-О-Е-2',3'-дидезоксинуклеозида на содержание в клетках митохондриальной ДНК и продуцирование лактата.

Са1усх. 1. Сйст. 1иТ Сотри!. 8ск 1994, 35(5), 1198-203, описывает молекулярный расчет β-Ό-3'азидо-2',3'-дидезокси-5-фторцитидина.

Майтоиб1аи, Рйагт. Ксзсатсй 1991, 8(1), 43-6, раскрывает анализ количественной взаимосвязи структура-активность агентов против Н1У, таких как в-О-3'-азидо-2',3'-дидезокси-5-фторцитидин.

В патенте США № 5703058 раскрываются (5-карбоксимидо или 5-фтор)-(2',3'-ненасыщенные или 3'модифицированные) пиримидиновые нуклеозиды для лечения Н1У или НВУ.

Ьш с! а1. раскрывают синтез и противовирусную активность различных 3'-азидо-аналогов β-Όнуклеозидов в 1. Мсб. Сйст. 31(2), 336-340 (1988).

В заявке VО 00/3998, поданной №\зпо Рйагтассийса18, Ь!б., раскрываются способы получения замещенных 6-бензил-4-оксопиримидинов и применение таких пиримидинов для лечения Н1У.

№ото Рйагтассийсак, Ь!б. также были первыми в раскрытии 2'-дезоксиф-Ьэритропентофуранонуклеозидов и их применении для лечения НВУ в заявке VО 00/09531. Раскрывается способ лечения гепатита В у людей и у животных-хозяев, который включает введение эффективного количества биологически активного 2'-дезокси-в-Е-эритропентофуранонуклеозида (альтернативно называемого β-Ε-6Ν или β-Ε-2'-6Ν) или его фармацевтически приемлемой соли или пролекарства, включая βЬ-дезоксириботимидин фЬ-бТ), β-Ь-дезоксирибоцитидин (β-Ь-бС), β-Ь-дезоксирибоуридин (β-Ь-би), βЬ-дезоксирибогуанозин (β-Ь-бС), β-Ь-дезоксирибоаденозин (β-Ь-бА) и β-Ь-дезоксирибоинозин ф-Ь-б1), вводимые по отдельности или в комбинации, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. Также раскрыты 5'- и ^(цитидин) или Ц⁵(аденозин)ацилированные или алкилированные производные активного соединения, или 5'-фосфолипиды или 5'-эфирные липиды.

Имелись попытки создать различные пролекарства противовирусных препаратов. Наиболее примечательно в патенте США № 4957924, Всаисйатр, раскрываются различные лечебные сложные эфиры ацикловира.

В свете того, что распространение вирусного гепатита В во всем мире достигло уровня эпидемий, и он имеет тяжелые и часто трагические воздействия на зараженного пациента, остается настоятельная потребность в обеспечении новых эффективных фармацевтических агентов для лечения людей, зараженных вирусом, которые обладают низкой токсичностью для хозяина.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечение соединений, композиций и способов лечения людей или других хозяев, зараженных НВУ.

Краткое описание изобретения

3'-Пролекарства 2'-дезоксиф-Ь-нуклеозидов или их фармацевтически приемлемые соли, или фармацевтически приемлемые композиции, содержащие данные соединения, пригодны для профилактики и лечения гепатита В и других связанных состояний, таких как состояния, при которых имеется положительная реакция на наличие анти-НВУ-антител и положительная на НВУ, хроническое воспаление печени, вызванное НВУ, цирроз, острый гепатит, фульминантный гепатит, хронический персистирующий гепатит и желтуха. Данные соединения или композиции также можно использовать в профилактических целях для предупреждения или замедления прогрессирования клинического течения заболевания у индивидуумов, которые дают положительную реакцию на анти-НВУ-антитела или НВУ-антиген или которые подвергались воздействию НВУ.

Также раскрывается способ лечения вирусного гепатита В у хозяина, включая человека, включающий введение эффективного количества 3'-пролекарства биологически активного 2'-дезоксиф-Ьнуклеозида или его фармацевтически приемлемой соли, назначаемого отдельно или в комбинации или чередовании с другим агентом против вируса гепатита В, необязательно в фармацевтически приемлемом

- 2 005774 носителе. Термин 2'-дезокси, в том смысле, в котором он используется в данном описании, относится к нуклеозиду, который не имеет заместителя в 2'-положении. Термин З'-пролекарство, в том смысле, в котором он здесь используется, относится к 2'-дезокси-в-Ь-нуклеозиду, который включает биологически отщепляемую группу в З'-положении, включая, но не ограничиваясь им, ацил, и в одном воплощении Ьаминокислоту.

В одном воплощении З'-пролекарство 2'-дезокси-в-Ь-нуклеозида включает биологически отщепляемые группы в 3'- и/или 5'-положениях. Предпочтительными группами являются сложные эфиры аминокислот, включая валил, и сложные алкиловые эфиры, включая ацетил. Следовательно, данное изобретение, в частности, включает эфир З'-Ь-аминокислоты и эфир 3',5'-Ь-диаминокислоты 2'-дезокси-р-Ьнуклеозидов с любым желаемым пуриновым или пиримидиновым основанием, где исходное лекарство имеет ЕС₅о ниже 15 мкмоль и предпочтительно ниже 10 мкмоль в клетках 2.2.15; 3'-(алкиловый или ариловый эфир)- или 3',5'-Ь-ди(алкиловый или ариловый эфир)-2'-дезокси-в-Ь-нуклеозиды с любым желаемым пуриновым или пиримидиновым основанием, где исходное лекарство имеет ЕС5₀ ниже 10 или 15 мкмоль в клетках 2.2.15; и пролекарства 3',5'-диэфиров 2'-дезокси-в-Ь-нуклеозидов, в которых: (1) 3'-эфир представляет эфир аминокислоты и 5'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир; (и) оба эфира представляют эфиры аминокислоты; (ίίί) оба эфира независимо представляют алкиловые или ариловые эфиры; и (ίν) 3'-эфир независимо представляет алкиловый или ариловый эфир, и 5'-эфир представляет эфир аминокислоты, где исходное лекарство имеет ЕС5₀ ниже 10 или 15 мкмоль в клетках 2.2.15.

Примерами пролекарств, попадающих в объем изобретения, являются 3'-Ь-валиновый эфир 2'дезокси-в-Ь-цитидина; 3'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-в-Ь-тимина; 3'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-в-Ьаденозина; 3'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-в-Е-гуанозина; 3'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-в-Ь-5фторцитидина; 3'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-в-Е-уридина; 3'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Ьцитидина; 3'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Ь-тимина; 3'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Ь-аденозина; 3'ацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Ь-гуанозина; 3'-ацетиловый эфир 2'-дезокеи-в-Е-5-фторцитидина и 3'эфиры 2'-дезокси-в-Е-(цитидина, 5-фторцитидина, гуанозина, уридина, аденозина или тимина), в которых (ί) 3'-эфир представляет эфир аминокислоты или (и) 3'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир.

Дополнительные примеры пролекарств, попадающих в объем изобретения, представляют 3',5'-Ьдивалиновый эфир 2'-дезокси-в-Е-цитидина (дивал-Ь-бС); 3',5'-Ь-дивалиновый эфир 2'-дезокси-в-Ьтимина; 3',5'-Ь-дивалиновый эфир 2'-дезокси-в-Ь-аденозина; 3',5'-Ь-дивалиновый эфир 2'-дезокси-в-Ьгуанозина; 3',5'-Ь-дивалиновый эфир 2'-дезокси-в-Е-5-фторцитидина; 3',5'-Ь-дивалиновый эфир 2'дезокси-в-Ь-уридина; 3',5'-диацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Ь-цитидина; 3',5'-диацетиловый эфир 2'дезокси-в-Ь-тимина; 3',5'-диацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Ь-аденозина; 3',5'-диацетиловый эфир 2'дезокси-в-Ь-гуанозина; 3',5'-диацетиловый эфир 2'-дезокси-в-Е-5-фторцитидина и 3',5'-диэфиры 2'дезокси-в-ЬДцитидина, 5-фторцитидина, гуанозина, уридина, аденозина или тимина), в которых (1) 3'эфир представляет эфир аминокислоты и 5'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир; (ίί) оба эфира представляют эфиры аминокислоты; (ίίί) оба эфира независимо представляют алкиловые или ариловые эфиры; или (ίν) 3'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир и 5'-эфир представляет эфир аминокислоты.

Во втором воплощении изобретение обеспечивает 3'-пролекарство β-В-нуклеозида, определенное формулой (I) к’о.

ВАЙЕ

СО или его фармацевтически приемлемую соль, в которой

Я¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

Я² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата;

X представляет О, 8, 8О₂ или СН₂; и

ВА8Е представляет пуриновое или пиримидиновое основание, которое необязательно может быть замещенным.

В предпочтительном воплощении X представляет О.

- 3 005774

В одном воплощении К¹ и/или К² представляют остаток аминокислоты.

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(К⁸)(К⁹)(ИК¹⁰К¹¹), в которой

К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры; или альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая низший алкил) или арил; и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).

В другом воплощении настоящего изобретения З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет β-Ь2'-дезоксипурин формулы

или его фармацевтически приемлемую соль, в которой

К¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

К² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата;

Υ представляет ОК³, ИК³К⁴ или §К³; и

X¹ и X² независимо выбраны из группы, состоящей из Н, нормального, разветвленного или циклического алкила, СО-алкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, галогена, ОК⁵, ИК⁵К⁶ или §К⁵; и

К³, К⁴, К⁵ и К⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СОарил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В другом воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(К⁸)(К⁹)(ИК¹⁰К¹¹), в которой

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное-, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).

В конкретном воплощении З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет в-Ь-2'-дезоксиаденозин формулы

К² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата; и

К³ и К⁴ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СОалкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В предпочтительном воплощении К¹ представляет Н.

- 4 005774

Я⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, Я⁸ необязательно может быть соединен с Я¹⁰ с образованием кольцевой структуры; или альтернативно, Я⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

Я⁹ представляет водород, алкил (включая низший алкил) или арил; и

Я¹⁰ и Я¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с Я⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).

В другом предпочтительном воплощении Я² представляет остаток аминокислоты, и в частности, Ьвалинил.

В одном воплощении Я³ представляет водород и Я⁴ представляет диметиламинометилен.

В другом воплощении Я³ представляет водород и Я⁴ представляет ацетил.

В другом воплощении Я³ представляет водород и Я⁴ представляет Ь-валинил.

В другом конкретном воплощении З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет β-Π-2'дезоксигуанозин формулы

Я² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата.

Я⁵ и Я⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СОалкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В предпочтительном воплощении Я¹ представляет Н.

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(Я⁸)(Я⁹)(ИЯ¹⁰Я¹¹), в которой

В предпочтительном воплощении Я² представляет остаток аминокислоты, и в частности, Ь-валинил. В одном воплощении Я⁵ представляет водород и Я⁶ представляет диметиламинометилен.

В другом воплощении Я⁵ представляет водород и Я⁶ представляет ацетил.

В другом воплощении Я⁵ представляет водород и Я⁶ представляет Ь-валинил.

В другом конкретном воплощении З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет в-Ь-2'-дезоксиинозин формулы

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(Я⁸)(Я⁹)(ХЯ¹⁰Я¹¹), в которой

- 5 005774

В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры; или альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая низший алкил) или арил; и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).

В другом предпочтительном воплощении В² представляет остаток аминокислоты, и в частности, Ьвалинил.

В другом воплощении настоящего изобретения З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет β-Ь2'-дезоксипиримидин формулы

В¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

В² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата;

Υ представляет ОВ³, ЯВ³В⁴ или 8В³;

X¹ выбран из группы, состоящей из Н, нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, галогена, ОВ⁵, ХВ⁵В⁶ или 8В⁵; и

В³, В⁴, В⁵ и В⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СОарил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(В⁸) (В⁹) (ХВ¹⁰В¹¹) , в которой

В одном конкретном дезоксицитидин формулы воплощении З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет β-Ε-2'-

В² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата.

В³, В⁴, В⁵ и В⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО- 6 005774 арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В одном воплощении X¹ представляет водород.

В другом воплощении X¹ представляет галоген, а именно фтор, хлор, бром или иод.

В предпочтительном воплощении В¹ представляет Н.

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу Ο(Ο)Ο(Β⁸)(Β⁹)(ΝΒ¹⁰Β¹¹), в которой

В одном воплощении В³ представляет водород и В⁴ представляет диметиламинометилен.

В другом воплощении В³ представляет водород и В⁴ представляет ацетил.

В другом воплощении В³ представляет водород и В⁴ представляет Ь-валинил.

В другом воплощении З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет в-Ь-2'-дезоксиуридин формулы

В¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата; и

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(Ο)С(Β⁸)(Β⁹)(NΒ¹⁰Β¹¹), в которой

В другом воплощении З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет β-Ь-тимидин формулы или его фармацевтически приемлемую соль, в которой

- 7 005774

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу Ο(Θ)Ο(Β⁸)(Β⁹)(ΝΚ¹⁰Κ¹¹), в которой

Изобретение также обеспечивает комбинации по меньшей мере двух описанных здесь пролекарств.

Изобретение дополнительно обеспечивает по меньшей мере одно из описанных З'-пролекарств в комбинации или при чередовании со вторым нуклеозидом, который проявляет активность против гепатита В, включая, но не ограничиваясь им, исходное лекарство любого из определенных здесь пролекарств, т.е. 2'-дезокси-Р-Ь-нуклеозидов, включая 2'-дезокси-Р-Ь-цитидин; 2'-дезокси-Р-Ь-тимин; 2'дезокси-Р-Ь-аденозин; 2'-дезокси-Р-Ь-гуанин; 2'-дезокси-Р-Ь-5-фторцитидин. Альтернативно, З'-пролекарства можно вводить в комбинации или при чередовании с другими агентами против вируса гепатита В, такими как (-)-цис-2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин; цис-2',3'-дидезокси-3'-тиа-5-фторцитидин; Ь-РМАИ; адефовир; фамцикловир и энтецивир, или любым другим соединением, имеющим значение ЕС₅₀ ниже 10 или 15 мкмоль в клетках 2.2.15; или их пролекарствами или фармацевтически приемлемыми солями.

Изобретение дополнительно включает введение пролекарства в комбинации или при чередовании с иммуномодулятором или другим фармацевтически активным модификатором репликации вируса, включая биологическое вещество, такое как белок, пептид, олигонуклеотид или гамма-глобулин, включая, но не ограничиваясь ими, интерферон, интерлейкин или антисмысловые олигонуклеотиды для генов, которые экспрессируют или регулируют репликацию вируса гепатита В.

Эффективность исходных соединений против ИВУ можно определить по концентрации соединения, необходимой для уменьшения скорости репликации вируса в условиях ίη νίίτο, в соответствии со способами, приведенными подробнее ниже, на 50% (т.е. ЕС₅₀ соединения). В предпочтительных воплощениях исходное соединение пролекарства показывает значение ЕС₅₀ ниже 15 или предпочтительно ниже 10 мкмоль в условиях ίη νίίτο при тестировании на клетках 2.2.15, трансфектированных вирионом гепатита.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1а и 1Ь представляют неограничивающие иллюстративные примеры по настоящему изобретению синтеза соответственно 3'- и 5'-валиниловых эфиров 2'-дезокси-р-Ь-цитидина (β-Ь-бС) из 2'-дезоксиβ-Ь-цитидина;

фиг. 2 - неограничивающий иллюстративный пример по настоящему изобретению синтеза Ν⁴ацетил-2'-дезокси-в-Ь-цитидина из 2'-дезокси-в-Ь-цитидина;

фиг. 3 - неограничивающий иллюстративный пример по настоящему изобретению синтеза Ν⁴[(диметиламино)метилен]-2'-дезокси-в-Ь-цитидина из 2'-дезокси-в-Ь-цитидина;

фиг. 4 - неограничивающий иллюстративный пример по настоящему изобретению синтеза 3',5'-диО-ацетил-2'-дезокси-в-Ь-цитидина из 2'-дезокси-в-Ь-цитидина;

фиг. 5 - неограничивающий иллюстративный пример по настоящему изобретению синтеза 3',5'-диО-валинилового эфира 2'-дезокси-в-Ь-цитидина из 2'-дезокси-в-Ь-цитидина;

фиг. 6 - неограничивающий иллюстративный пример по настоящему изобретению синтеза У-(Восвалинилового) эфира 2'-дезокси-в-Ь-цитидина из 2'-дезокси-в-Ь-цитидина;

фиг. 7 - неограничивающий иллюстративный пример по настоящему изобретению синтеза 3',5',Ν⁴три-(Е-валинил)-2'-дезокси-в-Ь-цитидина из 3'.5'.Н⁴-три-(Вос-Н-валинил)-2'-дезокси-в-Р-цитидина;

фиг. 8 - линейный график, отражающий стандартную калибровочную кривую, пригодную для определения растворимости различных нуклеозидов;

фиг. 8а - калибровочную кривую, полученную для природного β-Ό-дезоксирибоцитозина;

фиг. 8Ь - калибровочную кривую, полученную для 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина;

фиг. 9а - неограничивающий пример хроматограммы, полученной при проведении ВЭЖХ, используемой для оценки стабильности 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина при рН 7,42. ВЭЖХ-хроматограмма указывает на присутствие 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина наряду с 3 активными метаболитами, 3'-валиниловым эфиром β-Ь-дезоксирибоцитозина, 5'-валиниловым эфиром β-Ь-дезоксирибоцитозина и Ь-бС;

фиг. 9Ь - линейный график, отражающий относительные концентрации 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина и его метаболитов по отношению ко времени;

аналогично, фиг. 10а и 11а представляют неограничивающие примеры хроматограмм, полученных при проведении ВЭЖХ, используемой для оценки стабильности 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь

- 8 005774 дезоксирибоцитозина, соответственно, при рН 7,20 и 4,51. При данных значениях рН ВЭЖХ-хроматограммы указывают на присутствие 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина наряду с 3 активными метаболитами, З'-валиниловым эфиром β-Ь-дезоксирибоцитозина, 5'-валиниловым эфиром β-Ьдезоксирибоцитозина и Ь-бС;

фиг. 10Ь и 11Ь - линейные графики, отражающие относительные концентрации 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина и его метаболитов по отношению ко времени;

фиг. 12 - неограничивающий пример хроматограммы, полученной при проведении ВЭЖХ, используемой для оценки стабильности 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина при рН 1,23. При данном значении рН ВЭЖХ-хроматограмма указывает только на присутствие 3',5'-дивалинилового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина без какого-либо превращения в любой из его 3 активных метаболитов;

фиг. 13 - линейный график, отражающий метаболизм 3',5'-дивалинйлового эфира β-Ь-дезоксирибоцитозина в условиях ίη νίΐΓΟ в плазме человека;

фиг. 14 - линейный график, отражающий внутриклеточный метаболизм β-Ь-дезоксирибоцитозина (Ь-бС) в клетках Нер62;

фиг. 15 - линейный график, отражающий внутриклеточное накопление Ь-бС в первичных гепатоцитах человека;

фиг. 16 - столбчатый график, отражающий ответную противовирусную реакцию в зависимости от дозы Ь-бС при лечении хронического вирусного гепатита В в течение 28 суток на модели хронического вирусного гепатита В на лесных сурках;

фиг. 17 - линейный график, отражающий противовирусную активность Ь-бС на модели хронического вирусного гепатита В на лесных сурках;

фиг. 18 линейные графики, показывающие массу тела отдельных лесных сурков, обработанных в течение 28 суток Ь-бС (0,01-10 мг/кг/день) перорально;

фиг. 19 - линейные графики, показывающие массу тела отдельных лесных сурков, обработанных в течение 12 недель Ь-бС (1 мг/кг/день) перорально.

Подробное описание изобретения

Раскрываемое изобретение представляет соединение, способ и композицию для лечения вирусного гепатита В у людей и других хозяев-животных. Способ включает введение эффективного для лечения НВУ количества описываемого в данном описании 3'-пролекарства β-Ь-нуклеозида или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно в фармацевтически приемлемом носителе. Соединение по данному изобретению обладает либо противовирусной (т.е. анти-НВУ) активностью, либо метаболизируется в соединение, которое проявляет данную активность.

Суммируя кратко, настоящее изобретение включает следующие признаки:

(a) 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксинуклеозида, как описано, и их фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры и композиции;

(b) 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксинуклеозида, как описано, и. их фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры и композиции для применения при лечении или профилактике гепатита В, особенно у индивидуумов с установленным диагнозом гепатита В или при риске заражения вирусом гепатита В;

(c) применение данных 3'-пролекарств β-^-2'-дезоксинуклеозида, как описано, и их фармацевтически приемлемых солей, сложных эфиров и композиций при производстве лекарственного средства для лечения гепатита В;

(б) фармацевтические композиции, содержащие 3'-пролекарства β-^-2^/-дезоксинуклеозида или их фармацевтически приемлемые соли, вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем;

(е) 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксинуклеозида или их фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры и композиции, как описано, по существу, в отсутствие противоположных энантиомеров описанного нуклеозида или, по существу, отделенные от других химических соединений;

(ί) способы получения 3'-пролекарств β-^-2'-дезоксинуклеозида, как описано подробнее ниже;

(д) способы получения 3'-пролекарств β-^-2'-дезоксинуклеозида, по существу, в отсутствие энантиомеров описанного нуклеозида или, по существу, отделенного от других химических соединений;

(11) лечение хозяина, зараженного гепатитом В, которое включает введение эффективного количества 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксинуклеозида, его фармацевтически приемлемой соли, сложного эфира или композиции со вторым агентом против гепатита В;

(ί) лечение хозяина, зараженного гепатитом В, которое включает введение эффективного количества 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксинуклеозида, его фармацевтически приемлемой соли, сложного эфира или композиции с исходным соединением другого β-^-2'-дезоксинуклеозида;

(ί) лечение хозяина, зараженного гепатитом В, которое включает введение эффективного количества 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксицитидина, его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира с исходным соединением второго агента против гепатита В;

- 9 005774 (k) лечение хозяина, зараженного гепатитом В, которое включает введение эффективного количества 3',5'-дивалилового или диацетилового эфира в-Ь-2'-дезоксицитидина или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира со вторым агентом против гепатита В; и (l) лечение хозяина, зараженного гепатитом В, которое включает введение эффективного количества 3',5'-дивалилового или диацетилового эфира в-Ь-2'-дезоксицитидина или его фармацевтически приемлемой соли или сложного эфира с в-Ь-2'-дезокситимидином или его фармацевтически приемлемой солью.

Особенно предпочтительной комбинацией является 3',5'-пролекарство β-Ε-άΟ (также называется как Ь-άΟ) с исходным β-ί-άΤ (также называется как Ь-άΤ) и, в частности, 3',5'-дивалиловый или 3',5'диацетиловый эфир β-Ε-άΟ в комбинации с β-Ε-άΤ. Биодоступность Ь-άΟ при пероральном введении в виде нейтрального основания и гидрохлорида является низкой у грызунов и приматов, не относящихся к человеку. Было установлено, что имеется существенная конкуренция Ь-άΟ с другими нуклеозидами или аналогами нуклеозидов по всасыванию или транспорту из желудочно-кишечного тракта и конкуренция других нуклеозидов или аналогов нуклеозидов с Ь-άΟ по всасыванию. Для того чтобы повысить биодоступность при пероральном введении и снизить возможность взаимодействия лекарство-лекарство, был проведен фармакокинетический скрининг на обезьянах. В результате этого скрининга было обнаружено, что 3'-пролекарства Ь-άΟ обладают более высокой биодоступностью по сравнению с исходной молекулой и уменьшенным воздействием на биодоступность других нуклеозидов и аналогов нуклеозидов, используемых в комбинации. Примерами таких нуклеозидов или аналогов нуклеозидов, используемых в комбинации с пролекарствами Ь-άΟ, являются Ь-άΤ, Ь-άΆ, ламивудин или БТС.

С использованием данного подхода было установлено, что 3',5'-дивалиновый эфир Ь-άΟ обладает более высокой биодоступностью при пероральном введении, чем исходный Ь-άΟ, и уменьшенным взаимодействием с другими нуклеозидами и аналогами нуклеозидов, когда применяются в комбинации, по сравнению с Ь-άΟ. Фармакокинетические исследования также показали, что 3',5'-дивалиновый эфир Ь-άΟ превращается в исходный Ь-άΟ путем деэтерификации в слизистой желудочно-кишечного тракта, крови или печени.

Вероятно, 3',5'-дивалиновый эфир Ь-άΟ активно переносится из желудочно-кишечного тракта после перорального введения в кровяное русло транспортером аминокислот, находящимся в слизистой желудочно-кишечного тракта. Это является причиной повышения биодоступности при пероральном введении по сравнению с исходным Ь-άΟ, который переносится в основном транспортером нуклеозидов. Это также объясняет уменьшенную конкуренцию 3',5'-дивалинового эфира Ь-άΟ в отношении поглощения с другими нуклеозидами или аналогами нуклеозидов, которые переносятся транспортером нуклеозидов, а не транспортером аминокислот. Поскольку частичная деэтерификация дивалинового эфира Ь-άΟ происходит раньше полного всасывания, моновалиновый эфир продолжает всасываться с использованием транспортера аминокислот. Следовательно, сохраняется желаемый выход лучшего всасывания или биодоступности и уменьшенная конкуренция с другими нуклеозидами или аналогами нуклеозидов по проникновению в кровяное русло.

I. Соединения, определенные данными изобретениями

В первом воплощении 3'-пролекарство 2'-дезокси-β-^-нуклеозида включает биологически отщепляемые группы в 3'- и 5'-положениях. Предпочтительными группами являются эфиры Ь-аминокислот, такие как Ь-валил, и алкиловые эфиры, такие как ацетил. Данное изобретение, в частности, включает 3',5'-^-аминокислота-β-^-2'-дезоксинуклеозиды с любым желаемым пуриновым или пиримидиновым основанием, где исходное лекарство имеет ΕΟ5₀ ниже 15 мкмоль и предпочтительно ниже 10 мкмоль в клетках 2.2.15; 3',5'-(алкил или арил)-β-^-2'-дезоксинуклеозиды с любым желаемым пуриновым или пиримидиновым основанием, где исходное лекарство имеет ΕΟ5₀ ниже 15 и предпочтительно ниже 10 мкмоль в клетках 2.2.15; и пролекарства 3',5'-диэфиров 2'-дезокси-β-^-нуклеозидов, в которых (ί) 3'-эфир представляет эфир аминокислоты и 5'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир; (и) оба эфира представляют эфиры аминокислоты; (ίίί) оба эфира независимо представляют алкиловые или ариловые эфиры; и (ίν) 3'-эфир независимо представляет алкиловый или ариловый эфир, и 5'-эфир представляет эфир аминокислоты, где исходное лекарство имеет ΕΟ5₀ ниже 15 мкмоль в клетках 2.2.15.

Примерами 3'-пролекарств, попадающих в объем изобретения, являются 3',5'-Ь-валиновый эфир 2'дезокси-β-^-цитидина; 3',5'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-β-^-тимина; 3',5'-Ь-валиновый эфир 2'-дезоксиβ-Ь-аденозина; 3',5'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-β-^-гуанозина; 3',5'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-β-^5-фторцитидина; 3',5'-Ь-валиновый эфир 2'-дезокси-β-^-уридина; 3',5'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-β-^цитидина; 3',5'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-β-^-тимина; 3',5'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-β-^-аденозина; 3',5'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-β-^-гуанозина; 3',5'-ацетиловый эфир 2'-дезокси-β-^-5-фторцигидина и 3',5'-диэфиры 2'-дезокси-β-^-(цитидина, 5-фторцитидина, гуанозина, уридина, аденозина или тимина), в которых (ί) 3'-эфир представляет эфир аминокислоты и 5'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир; (ίί) оба эфира представляют эфиры аминокислоты; (ίίί) оба эфира независимо представляют алкиловые или ариловые эфиры; или (ίν) 3'-эфир представляет алкиловый или ариловый эфир и 5'-эфир представляет эфир аминокислоты.

- 10 005774

В одном воплощении изобретение обеспечивает З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида, определенное формулой (I)

0) или его фармацевтически приемлемую соль, в которой

X представляет О, 8, 8О₂ или СН₂; и

ΒΆ8Ε представляет пуриновое или пиримидиновое основание, которое необязательно может быть замещенным.

В первом варианте воплощения В² представляет С(О)-алкил (включая низший алкил) или арил и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

Во втором варианте воплощения В² представляет С(О)-низший алкил и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В третьем варианте воплощения В² представляет С(О)-метил и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В четвертом варианте воплощения В² представляет С(О)С(Β⁸)(Η)(NΒ¹⁰Β¹¹) и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В пятом варианте воплощения В представляет С(О)С(В )(Н)^В ^ОВ ), В является изопропилом, по меньшей мере один из В¹⁰ и В¹¹ представляет водород и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В шестом варианте воплощения В представляет С(О)С(В )(Н)^В ^ОВ ), В является боковой аминокислотной цепью и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В седьмом варианте воплощения В² представляет С(О)С(В⁸)(Н)^В¹⁰В^П), В⁸ является неполярной аминокислотной боковой цепью и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

Неограничивающие примеры вариантов воплощений можно определить формулой (I), в которой (1) В² представляет С(О)-метил и ΒΑ8Ε представляет аденин.

(2) В² представляет С(О)-метил и ΒΑ8Ε представляет защищенный аденин.

(3) В² представляет С(О)-метил и ΒΑ8Ε представляет цитозин.

(4) В² представляет С(О)-метил и ΒΑ8Ε представляет защищенный цитозин.

(5) В² представляет С(О)-метил и ΒΑ8Ε представляет тимин.

(6) В² представляет С(Ο)С(Β⁸)(Н)(NН₂); В⁸ представляет изопропил и ΒΑ8Ε представляет аденин.

(7) В² представляет С(Ο)С(Β⁸)(Н)(NН₂); В⁸ представляет изопропил и ΒΑ8Ε представляет защищенный аденин.

(8) В² представляет С(Ο)С(Β⁸)(Н)(NН₂); В⁸ представляет изопропил и ΒΑ8Ε представляет цитозин.

(9) В² представляет С(Ο)С(Β⁸)(Н)(NН₂); В⁸ представляет изопропил и ΒΑ8Ε представляет защищенный цитозин.

(10) В² представляет С(О)С(В⁸)(Н)^Н₂); В⁸ представляет изопропил и ΒΑ8Ε представляет тимин.

В восьмом варианте воплощения X представляет О, В² представляет С(О)-алкил (включая низший алкил) или арил и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В девятом варианте воплощения X представляет О, В² представляет С(О)-низший алкил и ΒΑ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

- 11 005774

В десятом варианте воплощения X представляет О, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В одиннадцатом варианте воплощения X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НК¹⁰К¹¹) и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двенадцатом варианте воплощения X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НК¹⁰К¹¹), К⁸является изопропилом, по меньшей мере один из К¹⁰ и К¹¹ представляет водород и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В тринадцатом варианте воплощения X представляет О, К представляет С(О)С(К )(Н)(НК К ), К является аминокислотной боковой цепью и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В четырнадцатом варианте воплощения X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НК¹⁰К¹¹), К⁸ является неполярной аминокислотной боковой цепью, по меньшей мере один из К⁵ и К⁶ представляет водород и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

Неограничивающие примеры вариантов воплощений можно определить формулой (I), в которой (1) X представляет О, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет аденин.

(2) X представляет О, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет защищенный аденин.

(3) X представляет О, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет цитозин.

(4) X представляет О, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет защищенный цитозин.

(5) X представляет О, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет тимин.

(6) X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НН₂); К⁸ представляет изопропил и ΒΆ8Ε представляет аденин.

(7) X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НН₂); К⁸ представляет изопропил и ΒΆ8Ε представляет защищенный аденин.

(8) X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(МН₂); К⁸ представляет изопропил и ΒΆ8Ε представляет цитозин.

(9) X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НН₂); К⁸ представляет изопропил и ΒΆ8Ε представляет защищенный цитозин.

(10) X представляет О, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НН₂); К⁸ представляет изопропил и ΒΆ8Ε представляет тимин.

В пятнадцатом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-алкил (включая низший алкил) или арил и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В шестнадцатом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-низший алкил и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В семнадцатом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В восемнадцатом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НК¹⁰К¹¹) и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В девятнадцатом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н⁹)(НК¹⁰К¹¹), К⁸ представляет изопропил, по меньшей мере один из К¹⁰ и К¹¹ представляет водород и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцатом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(НК¹⁰К¹¹), К⁸ представляет аминокислотную боковую цепь и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать первом варианте воплощения X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н⁹)(НК¹⁰К¹¹), К⁸ представляет неполярную боковую цепь, по меньшей мере один из К⁵ и К⁶ представляет водород и ΒΆ8Ε представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

Неограничивающие примеры вариантов воплощений можно определить формулой (I), в которой (1) X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет аденин.

(2) X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет защищенный аденин.

(3) X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет цитозин.

(4) X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет защищенный цитозин.

(5) X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)-метил и ΒΆ8Ε представляет тимин.

- 12 005774 (6) X представляет О, К¹ представляет водород, К² представляет С(О)С(К⁸)(Н)(ХН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет аденин.

(7) X представляет О, Я¹ представляет водород, Я² представляет С(О)С(Я⁸)(Н)(ХН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет защищенный аденин.

(8) X представляет О, Я¹ представляет водород, Я² представляет С(О)С(Я⁸)(Н)(ХН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет цитозин.

(9) X представляет О, Я¹ представляет водород, Я² представляет С(О)С(Я⁸)(Н)(ХН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет защищенный цитозин.

(10) X представляет О, Я¹ представляет водород, Я² представляет С(О)С(Я⁸)(Н)(ХН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет тимин.

В двадцать втором варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)алкил (включая низший алкил) или арил и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать третьем варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-низший алкил и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать четвертом варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-метил и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать пятом варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(ХЯ¹⁰Я¹¹) и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать шестом варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(ХЯ¹⁰Я¹¹), Я⁸ представляет изопропил, по меньшей мере один из Я¹⁰ и Я¹¹ представляет водород и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать седьмом варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(ХЯ¹⁰Я¹¹), Я⁸ представляет аминокислотную боковую цепь и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

В двадцать восьмом варианте воплощения X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(ХЯ¹⁰Я¹¹), Я⁸ представляет неполярную аминокислотную боковую цепь, по меньшей мере один из Я⁵ и Я⁶ представляет водород и ВЛ8Е представляет аденин, защищенный аденин, цитозин, защищенный цитозин или тимин.

Неограничивающие примеры вариантов воплощений можно определить формулой (I), в которой (1) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-метил и ВЛ8Е представляет аденин.

(2) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-метил и ВЛ8Е представляет защищенный аденин.

(3) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-метил и ВЛ8Е представляет цитозин.

(4) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-метил и ВЛ8Е представляет защищенный цитозин.

(5) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)-метил и ВЛ8Е представляет тимин.

(6) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(ЫН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет аденин.

(7) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(ЫН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет защищенный аденин.

(8) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸) (Н) (ΝΉ₂) ; Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет цитозин.

(9) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(NН₂); Я⁸ представляют изопропил и ВЛ8Е представляет защищенный цитозин.

(10) X представляет О, Я¹ и Я² независимо представляют С(О)С(Я⁸)(Н)(NН₂); Я⁸ представляет изопропил и ВЛ8Е представляет тимин.

- 13 005774

Υ представляет ОК³, ИК³К⁴ или §К³; и

В конкретном воплощении 3'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет в-Ь-2'-дезоксиаденозин формулы

В другом предпочтительном воплощении К² представляет остаток аминокислоты, и в частности, Ьвалинил.

В одном воплощении К³ представляет водород и К⁴ представляет диметиламинометилен.

В другом воплощении К³ представляет водород и К⁴ представляет ацетил.

В другом воплощении К³ представляет водород и К⁴ представляет Ь-валинил.

В другом конкретном воплощении 3'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет |1-Ь-2'дезоксигуанозин формулы

- 14 005774

В² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата; и

В⁵ и В⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СОалкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(В⁸)(В⁹)(ХК¹⁰В¹¹), в которой

В⁹ представляет, водород, алкил (включая низший алкил) или арил; и

В одном воплощении В⁵ представляет водород и В⁶ представляет диметиламинометилен.

В другом воплощении В⁵ представляет водород и В⁶ представляет ацетил.

В другом воплощении В⁵ представляет водород и В⁶ представляет Ь-валинил.

В другом конкретном воплощении 3'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет |1-Ь-2'дезоксиинозин формулы

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(В⁸)(В⁹)(ХК¹⁰В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры; или альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

- 15 005774

Υ представляет ОЯ³, ΝΚ.³Κ.⁴ или 8Я³;

X¹ выбран из группы, состоящей из Н, нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, галогена, ОЯ⁵, ΝΚ⁵Κ⁶ или 8Я⁵; и

Я³, Я⁴, Я⁵ и Я⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СОарил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В одном конкретном воплощении 3'-пролекарство β-Ь-нуклеозида представляет |1-Ь-2'дезоксицитидин формулы

Я² выбран из группы, состоящей из нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата; и

Я³ и Я⁴ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил (особенно циклопропил), диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СОалкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу С(О)С(Я⁸)(Я⁹)(ХЯ¹⁰Я¹¹), в которой Я⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, Я⁸ необязательно может быть соединен с Я¹⁰ с образованием кольцевой структуры; или альтернативно, Я⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

- 16 005774

В одном воплощении остаток аминокислоты имеет формулу ^Ο^^^^χΝΗ¹^¹), в которой

II. Определения и использование терминов

Термин «алкил», в том смысле, в котором он используется в данном описании, если не указано иначе, относится к насыщенному, нормальному, разветвленному или циклическому, первичному, вторично

- 17 005774 му или третичному углеводороду С1-Сю и, в частности, включает метил, трифторметил, этил, пропил, изопропил, циклопропил, бутил, изобутил, трет-бутил, пентил, циклопентил, изопентил, неопентил, гексил, изогексил, циклогексил, циклогексилметил, 3-метилпентил, 2,2-диметилбутил и 2,3-диметилбутил. Термин включает как замещенные, так и незамещенные алкильные группы. Группы, которыми алкил может быть замещен, выбраны из группы, состоящей из гидроксила, амино, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфата, фосфорной кислоты, фосфата или фосфоната, либо незащищенных, либо защищенных при необходимости, что, очевидно, понятно специалистам в данной области как, например, представлено у Сгеепе, с1 а1., Рго1ссйус Сгоирк ίη Огдаше 8упФек1к, .Гойи \УПеу апб 8опк, 8ееопб Εάίΐίοη, 1991, включенного в данное описание посредством ссылки.

Термин «низший алкил», в том смысле, в котором он используется, и если не указано иначе, относится к С₁ -С₄ насыщенной нормальной, разветвленной или, если подходит, циклической (например, циклопропил) алкильной группе, включая как замещенные, так и незамещенные формы. Если не указано иначе в данной заявке, когда алкил представляет подходящую группу, низший алкил является предпочтигельным. Аналогично, когда алкил или низший алкил представляет подходящую группу, незамещенный алкил или низший алкил является предпочтительным.

Термин «защитная», в том смысле, в котором он используется, и если не указано иначе, относится к группе, которая добавляется к атому кислорода, азота или фосфора для предупреждения его дальнейшего взаимодействия или для других целей. Специалистам в области органического синтеза известен широкий ряд защитных групп для кислорода и азота. Неограничивающие примеры защитных групп приведены у Сгеепе, е1 а1., Рго1ес1й'е Сгоирк ίη Огдаше 8уп1йек1к, 1ойп \УПеу апб 8опк, 8ееопб Ебйюп, 1991.

Термин «арил», в том смысле, в котором он используется, и если не указано иначе, относится к фенилу, бифенилу или нафтилу и предпочтительно к фенилу. Термин включает как замещенные, так и незамещенные группы. Арильная группа может быть замещена одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из гидроксила, амино, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфата, фосфорной кислоты, фосфата или фосфоната, либо незащищенных, либо защищенных при необходимости, что, очевидно, понятно специалистам в данной области как, например, представлено у Сгеепе, е1 а1., РгоЮсйуе Сгоирк ш Огдаше 8уп1йек1к,1ойп \УПеу апб 8опк, 8ееопб Εάίйоп, 1991.

Термин пуриновое или пиримидиновое основание включает, но не ограничивается ими, аденин, Ν⁶алкилпурины, С-ацилпурины (где ацил представляет С(О) (алкил, арил, алкиларил или арилалкил), Ν⁶бензилпурин, С⁶-галогенпурин, С⁶-винилпурин, С⁶-ацетиленпурин, С⁶-ацилпурины, С⁶-гидроксиалкилпурины, С⁶-тиоалкилпурин, Х-алкилпурин, С²-алкил-6-тиопурин, тимин, цитозин, 5-фторцитозин, 5метилцитозин, 6-азапиримидин, включая 6-азацитозин, 2- и/или 4-меркаптопиримидин, урацил, 5галогенурацил, включая 5-фторурацил, С⁵-алкилпиримидины, С⁵-бензилпиримидины, С⁵-галогенпиримидины, С⁵-винилпиримидин, С⁵-ацетиленпиримидин, С⁵-ацилпиримидин, С⁵-гидроксиалкилпурин, С⁵-амидопиримидин, С⁵-цианопиримидин, С⁵-нитропиримидин, С⁵-аминопиримидин, №-алкилпуриньг С²-алкил-6-тиопурины, 5-азацитидинил, 5-азаурацилил, триазолопиридинил, имидазолопиридинил, пирролопиримидинил и пиразолопиримидинил. Пуриновые основания включают, но не ограничиваются ими, гуанин, аденин, гипоксантин, 2,6-диаминопурин и 6-хлорпурин.

Функциональные кислородные и азотные группы в основании могут быть защищены при необходимости или желании. Подходящие защитные группы хорошо известны специалистам в данной области, и они включают триметилсилил, диметилгексилсилил, трет-бутилдиметилсилил и трет-бутилдифенилсилил, тритил, алкильные группы и ацильные группы, такие как ацетил и пропионил, метансульфонил и п-толуолсульфонил.

Термин ацил относится к эфиру карбоновой кислоты, в котором некарбонильная группа эфира выбрана из нормального, разветвленного или циклического алкила, или низшего алкила, алкоксиалкила, включая метоксиметил, аралкила, включая бензил, арилоксиалкила, такого как феноксиметил, арила, включая фенил, необязательно замещенный галогеном, С1-С₄алкила или С1-С₄алкокси, сульфонатных эфиров, таких как алкил- или аралкилсульфонил, включая метансульфонил, моно-, ди- или трифосфатного эфира, тритила или монометокситритила, замещенного бензила, триалкилсилила (например, диметилтрет-бутилсилила) или дифенилметилсилила. Арильные группы в эфирах оптимально включают фенильную группу. Термин «низший ацил» относится к ацильной группе, в которой некарбонильная группа представляет низший алкил.

Термин аминокислота включает природные и синтетические α, β, γ или δ аминокислоты и включает, но не ограничивается ими, аминокислоты, имеющиеся в белках, например глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин и гистидин. В предпочтительном воплощении аминокислота находится в Ь-конфигурации. Альтернативно, аминокислота может быть производным аланила, валинила, лейцинила, изолейцинила, пролинила, фенилаланинила, триптофанила, метионила, глицинила, серинила, треонинила, цистеинила, тирозинила, аспарагинила, глутаминила, аспартоила, глутароила, лизинила, аргининила, гистидинила, β-аланина, β-валинила, β-лейцинила, β-изолейцинила, β

- 18 005774 пролинила, β-фенилаланинила, β-триптофанила, β-метионинила, β-глицинила, β-серинила, βтреонинила, β-цистеинила, β-тирозинила, β-аспарагинила, β-глутаминила, β-аспартоила, β-глутароила, βлизинила, β-аргининила или β-гистидинила.

Термин гетероарил или гетероароматический, в том смысле, в котором он используется, относится к ароматической группе, которая включает по меньшей мере один атом серы, азота или фосфора в ароматическом кольце. Термин гетероциклический относится к неароматической циклической группе, в которой имеется по меньшей мере один гетероатом, такой как кислород, сера, азот или фосфор, в кольце. Неограничивающие примеры гетероарильных и гетероциклических групп включают фурил, фуранил, пиридил, пиримидил, тиенил, изотиазолил, имидазолил, тетразолил, пиразинил, бензофуранил, бензотиофенил, хинолил, изохинолил, бензотиенил, изобензофурил, пиразолил, индолил, изоиндолил, бензимидазолил, пуринил, карбазолил, оксазолил, тиазолил, изотиазолил, 1,2,4-тиадиазолил, изоксазолил, пирролил, хиназолинил, циннолинил, фталазинил, ксантинил, гипоксантинил, тиофен, фуран, пиррол, изопиррол, пиразол, имидазол, 1,2,3-триазол, 1,2,4-триазол, оксазол, изоксазол, тиазол, изотиазол, пиримидин или пиридазин и птеридинил, азиридины, тиазол, изотиазол, 1,2,3-оксадиазол, тиазин, пиридин, пиразин, пиперизин, пирролидин, оксазираны, феназин, фенотиазин, морфолинил, пиразолил, пиридазинил, пиразинил, хиноксалинил, ксантинил, гипоксантинил, птеридинил, 5-азацитидинил, 5-азаурацилил, триазолопиридинил, имидазолопиридинил, пирролопиримидинил, пиразолопиримидинил, аденин, Ν⁶алкилпурины, Х-бензилпурин. Х-галогенпурин. Х-винипурин. Х-ацетиленпурин. Х-ацилпурин. Ν⁶гидроксиалкилпурин, Х-тиоалкилпурин. тимин, цитозин, 6-азапиримидин, 2-меркаптопиримидин, урацил, ^-алкилпиримидины, ^-бензилпиримидины, М⁵-галогенпиримидины. У⁵-винилпиримидин. Ν⁵ацетиленпиримидин, У⁵-ацилпиримидин. ^-гидроксиалкилпурин и Х-тиоалкилпурин и изоксазолил. Гетероароматические и гетероциклические группы могут быть необязательно замещены, как описано выше для арила, включая замещенные одним или более заместителями, выбранными из галогена, галогеналкила, алкила, алкокси, гидрокси, карбоксильных производных, амидо, амино, алкиламино, диалкиламино. Гетероароматическая группа по желанию может быть частично или полностью гидрирована. В качестве неограничивающего примера можно использовать дигидропиридин вместо пиридина. Функциональные кислородные и азотные группы в гетероарильной группе могут быть защищены при необходимости и желании. Подходящие защитные группы хорошо известны специалистам в данной области и включают триметилсилил, диметилгексилсилил, трет-бутилдиметилсилил и трет-бутилдифенилсилил, тритил или замещенный тритил, алкильные группы, ацильные группы, такие как ацетил и пропионил, метансульфонил и п-толуолсульфонил.

В том смысле, в котором он используется, термин «по существу свободный от энантиомера» или «по существу в отсутствие энантиомера» относится к нуклеозиду, который включает по меньшей мере от 95 до 98 мас.% и еще более предпочтительно от 99 до 100 мас.% определенного энантиомера такого нуклеозида. В предпочтительном воплощении в способах и соединениях по данному изобретению соединения, по существу, свободны от энантиомеров.

Аналогично термин «отделенный» относится к нуклеозиду, который включает по меньшей мере 85 или 90 мас.%, предпочтительно от 95 до 98 мас.% и еще более предпочтительно от 99 до 100 мас.% нук леозида, причем остаток выключает другие химические соединения или энантиомеры.

Термин «независимо» используется в данном описании для обозначения того, что переменная, которая независимо используется, варьирует независимо от применения к применению. Так, в соединении, таком как ВXΥΚ, в котором В представляет «независимо углерод или азот», оба В могут быть углеродом, оба В могут быть азотом, или один В может быть углеродом, а другой В азотом.

Термин хозяин в том смысле, в котором он здесь используется, относится к одноклеточному или многоклеточному организму, в котором вирус может реплицироваться, включая клеточные линии и животных, и предпочтительно человека. Альтернативно, хозяин может включать часть генома вируса гепатита В, чья репликация или функция может изменяться под воздействием соединений по настоящему изобретению. Термин хозяин, в частности, относится к зараженным клеткам, клеткам, трансфектированным всем или частью генома НВУ, и животным, в частности, приматам (включая шимпанзе) и человеку. В большинстве применений на животных по настоящему изобретению хозяином является человек. Однако по некоторым показаниям четко предвидятся применения в ветеринарии по настоящему изобрете нию.

Термины «фармацевтически приемлемые соли» и «фармацевтически приемлемые комплексы» используются в описании для обозначения любой фармацевтически приемлемой формы нуклеозида, которая при введении пациенту обеспечивает нуклеозид и проявляет минимальное, если проявляет какиелибо, нежелательное токсикологическое действие. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, полученные из фармацевтически приемлемых неорганических или органических оснований и кислот. Неограничивающими примерами таких солей являются (а) аддитивные соли кислоты, образованные неорганическими кислотами (например, хлористо-водородной кислотой, бромисто-водородной кислотой, серной кислотой, фосфорной кислотой, азотной кислотой и тому подобное) и соли, образованные орга ническими кислотами, такими как уксусная кислота, щавелевая кислота, винная кислота, янтарная ки

- 19 005774 слота, яблочная кислота, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, дубильная кислота, памовая кислота, альгиновая кислота, полиглутаминовая кислота, нафталинсульфоновые кислоты, нафталиндисульфоновые кислоты и полигалактуроновая кислота; (Ь) аддитивные соли основания, образованные катионами, такие как полученные из щелочных металлов, такие как полученные из щелочно-земельных металлов, натрия, калия, цинка, кальция, висмута, бария, магния, алюминия, меди, кобальта, никеля, кадмия и тому подобное, или с органическим катионом, полученные из Ν,Ν-дибензилэтилендиамина, аммония или этилендиамина; или (с) комбинации (а) и (Ь); например, таннат цинка или тому подобное.

Фармацевтически приемлемые пролекарства относятся к соединению, которое метаболизирует, например, гидролизуется или окисляется, у хозяина с образованием соединения по настоящему изобретению. Типичные примеры пролекарств включают соединения, которые обладают биологически лабильными защитными группами в функциональной группе активного соединения. Пролекарства включают соединения, которые могут быть окислены, восстановлены, аминированы, деаминированы, гидроксилированы, дегидроксилированы, гидролизованы, дегидролизованы, алкилированы, деалкилированы, ацилированы, деацилированы, фосфорилированы, дефосфорилированы с образованием активного соединения. Соединения по данному изобретению обладают противовирусной активностью в отношении НВУ или метаболизируются в соединение, которое проявляет такую активность.

III. Соль нуклеотидов или композиции с пролекарствами

В случаях, когда соединения являются достаточно основными или кислыми для получения стабильных нетоксичных кислых или основных солей, может быть подходящим введение соединения в виде фармацевтически приемлемой соли. Примерами фармацевтически приемлемых солей являются аддитивные соли органической кислоты, полученные с кислотами, которые образуют физиологически приемлемый анион, например тозилат, метансульфонат, ацетат, цитрат, малонат, тартрат, сукцинат, бензоат, аскорбат, α-кетоглутарат и α-глицерофосфат. Могут также быть получены подходящие неорганические соли, включая сульфат, нитрат, бикарбонат и карбонат.

Фармацевтически приемлемые соли можно получить с использованием обычных способов, хорошо известных в данной области, например, взаимодействием достаточно основного соединения, такого как амин, с подходящей кислотой с получением физиологически приемлемого аниона. Также можно получить соли щелочного металла (например, натрия, калия или лития) или щелочно-земельного металла (например, кальция) карбоновых кислот.

Любой из описываемых нуклеозидов можно вводить в виде пролекарства нуклеотида для повышения активности, биодоступности, стабильности или прочего, что изменяет свойства нуклеозида. Известен ряд лигандов пролекарств нуклеотидов. Как правило, алкилирование, ацилирование или другая липофильная модификация моно-, ди- или трифосфата нуклеозида будет повышать стабильность нуклеотида. Примерами заместителей, которые могут замещать один или более водородов в фосфатной группе, являются алкил, арил, стероиды, углеводы, включая сахара, 1,2-диацилглицерин и спирты. Многие описаны у Вбопек апб КВщсйоГЬегдег, Λπΐίνίπιΐ Векеагсй, 27 (1995) 1-17. Любой из них можно использовать в сочетании с описанными нуклеозидами для достижения желаемого эффекта.

Активное З'-пролекарство β-Ь-нуклеозида можно также обеспечить в виде простого 5'фосфоэфирного липида или простого 5'-эфирного липида, как раскрыто в последующих источниках, которые включены в данное описание для сведения: Кисега, Ь.8., Ν. 1уег, Е.Ьеаке, А.ВаЬеп, Мобек! Е.К., Ό.Ε.ν., апб С. Р1ап!абок1. 1990. «Νο\ό1 тетЬгапе-ш!егасйуе е!йег 1ίρί6 апа1одк 1Па( шЫЬй шГесЕоик Н1У-1 ргобисйоп апб шбисе беГесбуе У1гик Гогтабоп». АГО8 Век. Нит. Ве!го Уиикек. 6:491-501; Р1ап!абок1, С, ТМагаксо С.Т, 8.Е.Мотк-№!ксНке, К.Ь. Меуег, Е. Ситик, ТВ. 8иг1ек, К.8. Гкйад, Ь.8. Кисега, Шуег, С.А. ^а11еп, 8. Р1ап!абок1, апб ЕЛ. Мобек! 1991. «8уп(Нек1к апб еуа1ийоп оГ поуе1 е!йег йр1б пис1еок1бе сопщда!ек Гог апй-НГУ асбуйу». I. Меб. СНет. 34:1408-1414; Нок!е11ег К.У., Ό.Ό. ВюЬтап, Ό.Α. Сагкоп, Ь.М. 8!иНтй1ег, С.М.Т. уап ^ук, апб Н. уап беп ВоксН. 1992. «Сгеа!1у епНапсеб ибпЬбюп оГ Нитап 1ттипобейаепсу У1гик 1уре 1 герйсайоп ш СЕМ апб НТ4-6С се11к Ьу 3'-беоху1йут1бше б1рйокрйа!е бипупкЮуЩусего1, а йр1б ргобгид оГ 3'-беоху!Нут1бше». АпйтюгоЬ. Адеп!к СНето1Нег. 36:2025-2029; Ноке!1ег К.У., Ь.М. 8!иНтй1ег, Н.В. Еепйпд, Н. уап беп ВоксН, апб Ό.Ό. ВюНтап, 1990. «8уп1Нек1к апб апНге!гоу1га1 асНуНу оГ рНокрНоПр1бк апа1одк оГ а/|бо1Нут1бше апб о!Нег апйу1га1 пис1еок1бек». I. Вю1. СНет. 265:61127.

Неограничивающие примеры патентов США, в которых раскрываются подходящие липофильные заместители, которые могут быть ковалентно присоединены к нуклеозиду, предпочтительно в 5положении нуклеозида, или липофильные препараты включают патенты США № 5149794 (22 сентября 1992 г., Уа!уш е! а1.); 5194654 (16 марта 1993 г., Нок!е!1ег е! а1.); 5223263 (29 июня 1993 г., Нок!е!1ег е! а1.); 5256641 (26 октября 1993 г., Уа!уш е! а1.); 5411947 (2 мая 1995 г., Нок!е!1ег е! а1.); 5463092 (31 октября 1995 г., Нок!еНег е! а1.); 5543389 (6 августа 1996 г., УаМп е! а1.); 5543390 (6 августа 1996 г., Уайт е! а1.), 5543391 (6 августа 1996 г., УаМп е! а1.) и 5554728 (10 сентября 1996 г., Вакауа е! а1.), все они включены в данное описание посредством ссылки. Зарубежные заявки на выдачу патента, в которых раскрываются липофильные заместители, которые могут быть присоединены к нуклеозидам по настоящему изобретению, или липофильные препараты включают заявки XVО 89/02733, XVО 90/00555, XVО 91/16920, XVО

- 20 005774

91/18914, ХАО 93/00910, XVО 94/26273, XVО 96/15132, европейский патент 0350287, европейский патент 93917054.4 и АО 91/19721.

3'-Пролекарство можно вводить как какое-либо производное, которое при введении реципиенту способно обеспечить прямо или опосредованно исходное соединение 3'-пролекарства, или которое проявляет активность само по себе. Неограничивающими примерами являются фармацевтически приемлемые соли (альтернативно называемые как «физиологически приемлемые соли») и ^-пиримидиновые или Ν²- и/или Х-пуриновые алкилированные (в частности, диметиламинометиленом) или ацилированные (в частности, ацетилом или аминоацетилом) производные активного соединения. В одном неограничивающем воплощении ацильная группа представляет эфир карбоновой кислоты, в котором некарбонильная группа сложноэфирной группы выбрана из нормального, разветвленного или циклического алкила или низшего алкила, алкоксиалкила, включая метоксиметил, аралкила, включая бензил, арилоксиалкила, такого как феноксиметил, арила, включая фенил, необязательно замещенный галогеном, С₁С₄алкилом или С₁-С₄алкокси, сульфонатных эфиров, таких как алкил- или аралкилсульфонил, включая метансульфонил, фосфата, включая, но не ограничиваясь ими, моно-, ди- или трифосфатный эфир, тритила или монометокситритила, замещенного бензила, триалкилсилила (например, диметил-5бутилсилила) или дифенилметилсилила. Арильные группы в сложных эфирах необязательно включают фенильную группу.

Модификации 3'-пролекарства или исходного соединения и особенно по Ν'-положению пиримидинила или по Ν²- и/или Х^-положению пурина могут оказывать влияние на биодоступность и скорость метаболизма активных соединений, обеспечивая, таким образом, регуляцию доставки активных соединений. Кроме того, модификации могут оказывать влияние на противовирусную активность соединения, в некоторых случаях повышая активность по сравнению с исходным соединением. Это можно легко оценить при получении производного и тестировании его противовирусной активности методами, описанными ниже, или другим методом, известным специалистам в данной области.

IV. Стереохимия

Поскольку 1' и 4' углероды сахара (называемые в общем как группа сахара) в нуклеозидах являются хиральными, их неводородные заместители (СН₂ОВ и соответственно пиримидиновое или пуриновое основание) могут находиться либо в цис- (с одной стороны) или транс- (с противоположных сторон) положениях по отношению к кольцевой системе сахара. Следовательно, четыре оптических изомера представлены следующими конфигурациями (при ориентации группы сахара в горизонтальной плоскости так, что «первичный» кислород, который между С1' и С4' атомами находится сзади): «β» или «цис» (с обеими группами «вверх», что соответствует конфигурации природных нуклеозидов, т.е. Όконфигурации), «β» или «цис» (с обеими группами «вниз», что является неприродной конфигурацией, т.е. Ь-конфигурацией), «α» или «транс» (с заместителем в С2 «вверх» и заместителем в С5 «вниз») и «α» или «транс» (с заместителем в С2 «вниз» и заместителем в С5 «вверх»).

Нуклеозиды по настоящему изобретению имеют β-Ь-конфигурацию. В предпочтительном воплощении 2'-дезокси-в-Ь-нуклеозид вводят по существу в виде одного изомера, т.е. по меньшей мере примерно 95% его находится в определенной стереоконфигурации.

V. Комбинированная и чередующаяся терапия

При комбинированной терапии эффективные дозы двух или более агентов вводят вместе, в то время как при чередующейся терапии эффективную дозу каждого агента вводят периодически. Дозы будут зависеть от скорости всасывания, инактивации и выведения лекарственного препарата, а также других факторов, известных специалистам в данной области. Следует отметить, что дозы будут также варьировать в зависимости от тяжести состояния у пациента, который подвергается лечению. Кроме того, следует понимать, что для любого определенного субъекта, конкретные дозировки и схемы должны корректироваться в течение времени по необходимости для индивидуума и согласно мнению профессионала, назначающего или наблюдающего за введением композиций.

Например, в любом из воплощений, описанных в данном описании, если 3'-пролекарство β-Ε-2'дезоксинуклеозида по настоящему изобретению вводят в комбинации или при чередовании со вторым нуклеозидным или ненуклеозидным ингибитором обратной транскриптазы, который фосфорилируется в активную форму, то в одном воплощении, второе соединение представляет соединение, которое может быть фосфорилировано под действием фермента, который отличается от фермента, который фосфорилирует выбранный' β-^-2^/-нуклеозид по настоящему изобретению ίη νίνο. Примерами киназ являются тимидинкиназа, цитозинкиназа, гуанозинкиназа, аденозиыкиназа, дезоксицитидинкиназа, 5'-нуклеотидаза и дезоксигуанозинкиназа.

Таким образом, в одном воплощении изобретение обеспечивает комбинацию двух или более пролекарств нуклеозидов настоящего изобретения, предпочтительно нуклеозидов, которые фосфорилируются под воздействием различных ферментов, или действие которых опосредуется через различные биологические пути. В другом воплощении изобретение обеспечивает по меньшей мере одно пролекарство в комбинации или при чередовании с нуклеозидом, который проявляет активность против гепатита В, включая, но не ограничиваясь им, исходное лекарство любого из пролекарств, определенных в данном

- 21 005774 описании, т.е. 2'-дезокси-в-Ь-нуклеозидов, включая 2'-дезокси-в-Ь-цитидин, 2'-дезокси-в-Ь-тимин, 2'дезокси-в-Ь-аденозин, 2'-дезокси-в-Ь-гуанин, 2'-дезокси-в-Ь-5-фторцитидин, 2',3'-дидезокси-3'-тиацитидин, 2',3'-дидезокси-3'-тиа-5-фторцитидин. Альтернативно, соединения по настоящему изобретению также можно вводить в комбинации или при чередовании с любым другим известным агентом против вируса гепатита В, таким как энтецивир, цис-2-гидроксиметил-5-(5-фторцитозин-1-ил)-1,3-оксатиолан, предпочтительно, по существу, в виде (-)-оптического изомера («ЕТС» см. \УО 92/14743); (-)-энантиомер цис2-гидроксиметил-5-(цитозин-1-ил)-1,3-оксатиолана (3ТС); в-Э-1,3-диоксалановые пуриновые нуклеозиды, описанные в патентах США № 5444063 и 5684010; β-Ό-диоксолановые нуклеозиды, такие как β-Όдиоксаланилгуанин (ΌΧΟ), β-^-диоксоланил-2,6-диаминопурин (ΌΑΡΌ) и β-Ό-диоксоланил-бхлорпурин (АССР), Б-ЕЭЭС (5-фтор-3'-тиа-2',3'-дидезоксицитидин), Б-энантиомеры 3'-фтормодифицированных β-2'-дезоксирибонуклеотид-5'-трифосфатов, карбовир, интерферон, пенцикловир и фамцикловир, Б-ЕМАИ, фамцикловир, пенцикловир, ВМ8-200475, бис-пом-РМЕА (адефовир, дипивоксил); лобукавир, ганцикловир или рибаварин; или с любым другим соединением, которое показывает ЕС₅₀ ниже 15 мкмоль в клетках 2.2.15; или их пролекарствами или фармацевтически приемлемыми солями.

Комбинированную или чередующуюся терапию можно также проводить для преодоления резистенткости к лекарственным препаратам. Было установлено, что резистентные к лекарствам варианты вирусов могут появляться вновь после продолжительного лечения противовирусным агентом. Резистентность к лекарственным препаратам обычно появляется в результате мутации гена, который кодирует фермент, используемый при репликации вируса. Эффективность лекарства против гепатита В можно пролонгировать, усилить или восстановить назначением соединения в комбинации или при чередовании со вторым и, возможно, третьим противовирусным соединением, которое индуцирует другую мутацию, чем та, которая была вызвана основным лекарством. Альтернативно, подобной комбинированной или чередующейся терапией могут быть изменены фармакокинетические параметры, биораспределение или другой параметр лекарства. Как правило, комбинированная терапия обычно является предпочтительной по сравнению с чередующейся терапией, поскольку она вызывает множественные одновременные стрессы на вирус.

В другом воплощении пролекарство вводят в комбинации или при чередовании с иммуномодулятором или другим фармацевтически активным модификатором репликации вируса, включая биологическое вещество, такое как белок, пептид, олигонуклеотид или гамма-глобулин, включая, но не ограничиваясь ими, интерферон, интерлейкин или антисмысловые олигонуклеотиды для генов, которые экспрессируют или регулируют репликацию вируса гепатита В.

Можно применять любой способ чередования, который обеспечивает лечение пациента. Неограничивающие примеры чередования включают 1-6-недельное введение эффективного количества одного агента с последующим введением в течение 1-6 недель эффективного количества второго агента против ИВУ. Схема чередования может включать периоды без лечения. Обычно комбинированная терапия включает одновременное введение эффективного соотношения доз двух или более агентов против НВУ.

Ввиду того факта, что НВУ часто обнаруживают у пациентов, которые также дают положительную реакцию на анти-Н1У-антитела или Н1У-антиген, или которые подвергались воздействию Н1У, соединения, активные против НВУ, раскрытые в данном описании, или их производные или пролекарства можно вводить в соответствующих обстоятельствах в комбинации или при чередовании с препаратами против Н1У.

Вторым противовирусным агентом для лечения Н1У в одном воплощении может быть ингибитор обратной транскриптазы («ВТ1»), который может быть или синтетическим нуклеозидом (<^ВТБ>), или ненуклеозидным соединением («ΝΝΚΤΊ»). В альтернативном воплощении, в случае Н1У, второй (или третий) противовирусный агент может быть ингибитором протеазы. В других, воплощениях второе (или третье) соединение может быть аналогом пирофосфата или слитым ингибитором связывания. Перечень данных по резистентности, собранных в условиях ίη νίίτο и ίη νίνο, для ряда противовирусных соединений имеется в IηίοΓηηίίοηαΙ Αηίίνίταΐ №\\ъ. Уо1ите 1(4), 1п1сгпа11опа1 Меб1са1 Ргезз 1 996.

Активные агенты против НВУ также можно вводить в комбинации с антибиотиками, другими противовирусными соединениями, противогрибковыми агентами или другими фармацевтическими агентами, назначаемыми для лечения вторичных инфекций.

VI. Фармацевтические композиции

Людей, страдающих любым из описываемых заболеваний, включая гепатит В, можно лечить введением пациенту эффективного количества 3'-пролекарства β-^-2'-дезоксинуклеозида по настоящему изобретению или его фармацевтически приемлемой соли в присутствии фармацевтически приемлемого носителя или разбавителя. Активные вещества можно вводить соответствующим путем, например, перорально, парентерально, внутривенно, внутрикожно, подкожно или местно в жидкой или твердой форме.

Активное соединение включают в фармацевтически приемлемый носитель или разбавитель в количестве, достаточном для доставки пациенту терапевтически эффективного количества соединения для подавления репликации вируса ίη νίνο, не вызывая серьезного токсического действия у пациента, который подвергается лечению. «Ингибирующее количество» означает количество активного ингредиента,

- 22 005774 достаточное для проявления ингибирующего действия, что определяется, например, методом, таким как описано в данном описании.

Предпочтительная доза соединения для всех указанных выше состояний будет находиться в пределах примерно от 1 до 50 мг/кг, предпочтительно от 1 до 20 мг/кг массы тела в день, обычно от 0,1 до примерно 100 мг на кг массы тела реципиента в день. Диапазон эффективных доз фармацевтически приемлемого пролекарства можно высчитать, основываясь на массе исходного нуклеозида, который вводится. Если пролекарство проявляет активность само по себе, эффективную дозу можно установить, как указано выше, с использованием массы пролекарства или другими способами, известными специалистам в данной области.

Обычно соединение вводят в любой разовой подходящей дозированной форме, включая, но не ограничиваясь таковой, содержащей от 7 до 3000 мг, предпочтительно от 70 до 1400 мг активного ингредиента на разовую дозированную форму. Подходящей является дозированная форма для перорального введения, содержащая 50-1000 мг активного ингредиента.

В идеале активный ингредиент следует вводить для достижения максимальных концентраций активного соединения примерно от 0,2 до 70 мкМ, предпочтительно примерно от 1,0 до 10 мкМ. Этого можно достичь, например, при внутривенной инъекции 0,1-5% раствора активного ингредиента, необязательно в физиологическом растворе, или при введении в виде болюса активного ингредиента.

Концентрация активного соединения в лекарственной композиции будет зависеть от скорости всасывания, инактивации и выведения лекарства, а также других факторов, известных специалистам в данной области. Следует отметить, что дозы будут также варьировать в зависимости от тяжести состояния у пациента, который подвергается лечению. Кроме того, следует понимать, что для любого определенного субъекта конкретные дозировки и схемы должны корректироваться в течение времени по необходимости для индивидуума и согласно мнению профессионала, назначающего или наблюдающего за введением композиций, и приведенные в данном описании пределы концентраций являются только примерными и не предназначены для ограничения объема или применения заявляемой композиции. Активный ингредиент можно вводить один раз или можно разделить на ряд меньших доз, которые следует вводить с различными интервалами времени.

Предпочтительным путем введения активного соединения является пероральный. Композиции для перорального введения, как правило, будут включать инертный разбавитель или пищевой носитель. Они могут быть включены в желатиновые капсулы или спрессованы в таблетки. Для перорального лечебного введения активное соединение может быть включено с эксципиентами и использовано в виде таблеток, пастилок или капсул. В качестве части композиции могут быть включены фармацевтически совместимые связывающие вещества и/или адъюванты.

Таблетки, пилюли, капсулы, пастилки и тому подобное могут включать любой из следующих ингредиентов или соединения подобной природы: связывающее вещество, такое как микрокристаллическая целлюлоза, трагакантовая камедь или желатин; эксципиент, такой как крахмал или лактоза, дезинтегратор, такой как альгиновая кислота, примогель или кукурузный крахмал; смазывающее вещество, такое как стеарат магния или стеротес; глидант, такой как коллоидный диоксид кремния; подсластитель, такой как сахароза или сахарин; или ароматизатор, такой как перечная мята, метилсалицилат или апельсиновый ароматизатор. Когда единичная дозированная форма представляет капсулу, она может содержать в дополнение к веществам указанного выше типа жидкий носитель, такой как жирное масло. Кроме того, единичные дозированные формы могут включать различные другие вещества, которые модифицируют физическую форму дозированной формы, например, оболочки из сахара, шеллака и других агентов для кишечных оболочек.

Соединение можно вводить в виде компонента эликсира, суспензии, сиропа, воды, жвачки и тому подобное. Сироп может включать в дополнение к активным соединениям сахарозу в качестве подсластителя и некоторые консерванты, красители и окрашивающие вещества и ароматизаторы.

Соединение или его фармацевтически приемлемое производное или соли можно также смешать с другими активными веществами, которые не оказывают отрицательного влияния на желаемое действие, или с веществами, которые дополняют желаемое действие, такими как антибиотики, противогрибковые препараты, противовоспалительные препараты, ингибиторы протеазы или другие нуклеозидные и ненуклеозидные противовирусные агенты. Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного, подкожного или местного применения, могут включать следующие компоненты: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, жирные масла, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабены; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; образующие комплексы агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для поддержания тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препарат для парентерального введения может быть помещен в ампулы, одноразовые шприцы или емкости с множественными дозами, изготовленные из стекла или пластмассы.

При внутривенном введении предпочтительными носителями являются физиологический раствор или забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8).

- 23 005774

В предпочтительном воплощении активные соединения готовят с носителями, которые будут защищать соединения от быстрого выделения из организма, такими как композиция для контролируемого высвобождения, включая имплантаты и микрокапсулированные системы доставки. Можно использовать биодеградируемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, коллаген, полиортоэфиры и полиуксусная кислота. Способы получения таких композиций, очевидно, понятны специалистам в данной области. Вещества можно также получить от Αίζα Согрогайоп.

Также в качестве фармацевтически приемлемых носителей предпочтительными являются липосомные суспензии (включая липосомы, направленные к зараженным клеткам с моноклональными антителами к антигенам вируса). Их можно приготовить способами, известными специалистам в данной области, например, описанными в патенте США № 4522811. Например, липосомные композиции можно получить растворением соответствующего липида(ов) (таких как стеароилфосфатидилэтаноламин, стеароилфосфатидилхолин, арахадоилфосфатидилхолин и холестерин) в неорганическом растворителе, который затем выпаривают, оставляя тонкую пленку сухого липида на поверхности емкости. Затем в емкость вносят водный раствор активного соединения или его монофосфат, дифосфат и/или трифосфат. Затем емкость вращают вручную для отделения липида от стенок емкости и диспергирования липидных агрега тов, получая тем самым липосомальную суспензию.

VII. Способы получения активных соединений

А. Способ получения β-^-3'-производных β-Ь-нуклеозидов.

β-^-3'-Производные 2'-дезоксинуклеозида можно получить любыми способами, известными в данной области, в частности, известными способами защиты вторичных спиртов ацильными группами, т. е. с помощью ангидрида или с помощью агента сочетания. В качестве неограничивающего примера 3'производные можно получить в результате следующей последовательности реакций:

где В представляет

а) аденин

или защищенный аденин

Ь) цитозин

или защищенный цитозин

с) тимин

Я представляет алкильную или арильную группу,

Я' и Я представляют обычно используемые защитные группы.

Альтернативно, 3'-производное получают из аминоацильной группы. Ключевым исходным соединением для данного способа является подходящий замещенный β-Ь-нуклеозид. β-Ь-Нуклеозид можно купить или можно получить известными способами, включая обычные реакции сочетания с группой Ьсахара.

Данные аминоацильные производные можно получить, сначала защищая 5'-гидроксил подходящей кислородзащитной группой, такой как ацильная или силильная защитная группа, и необязательно защищая любой свободный амин в гетероциклическом или гетероароматическом основании. Затем свободный 3'-гидроксил можно сочетать с Ν-защищенной α- или β-аминокислотой.

Затем β-Ь-нуклеозид сочетают с аминоацилом, используя обычные реагенты сочетания, которые способствуют сочетанию. Некоторыми неограничивающими примерами реагентов сочетания являются реагенты типа Митсунобу (например, диалкилазодикарбоксилаты, такие как диизопропилазодикарбоксилат и диэтилазодикарбоксилат) с трифенилфосфином или различные типы карбодиимидов.

Реакцию сочетания можно проводить при любой температуре, когда достигаются желаемые результаты, т.е. подходящей для протекания реакции с приемлемой скоростью без разложения или избыточного образования побочных продуктов.

Можно выбрать любой растворитель для реакции, при котором можно достичь необходимой температуры и который может солюбилизировать компоненты реакции. Неограничивающими примерами являются любые апротонные растворители, включая, но не ограничиваясь ими, алкильные или галогенал кильные растворители, такие как гексан, циклогексан, дихлорметан или дихлорэтан, толуол, ацетон, этилацетат, дитианы, ТГФ, диоксан, ацетонитрил, диэтиловый эфир, пиридин, диметилформамид (ДМФ), диметилсульфоксид (ДМСО), диметилацетамид или любая их комбинация.

- 24 005774

Схема 1 представляет неограничивающий пример получения β-^-3'-аминоацилнуклеозида из Ьдезоксирибонуклеозида.

Схема 1

В. Способ получения β-^-5'-производных β-Ь-нуклеозидов.

β-^-5'-Производные β-Ь-нуклеозида можно получить любыми способами, известными в данной области, в частности, известными способами защиты первичных спиртов ацильными группами, т.е. с помощью ангидрида или с помощью агента сочетания. В качестве неограничивающего примера β-Τ-5'производные можно получить в результате следующей последовательности реакций:

где В представляет

а) аденин

или защищенный аденин

Ь) цитозин

или защищенный цитозин

с) тимин

Я' представляет обычно используемую защитную группу.

В предпочтительном воплощении 5'-производное получают из аминоацильной группы. Ключевым исходным соединением для данного способа является подходящий замещенный β-Ь-нуклеозид. β-ЬНуклеозид можно купить или можно получить известными способами, включая обычные реакции сочетания с группой Ь-сахара, такого как дезоксирибоза. Аминоацильные производные можно получить избирательным сочетанием аминокислоты с β-Ь-нуклеозидом, предпочтительно без какой-либо дополнительной защиты нуклеозида. Реакцию сочетания можно проводить с использованием подходящих реагентов сочетания, которые способствуют сочетанию. Некоторыми неограничивающими примерами реагентов сочетания являются реагенты типа Митсунобу (например, диалкилазодикарбоксилаты, такие как диизопропилазодикарбоксилат и диэтилазодикарбоксилат) с трифенилфосфином или различные типы карбодиимидов.

Реакцию сочетания можно проводить при любой температуре, когда достигаются желаемые результаты, т. е. подходящей для протекания реакции с приемлемой скоростью без разложения или избыточного образования побочных продуктов.

Можно выбрать любой растворитель для реакции, при котором можно достичь необходимой температуры и который может солюбилизировать компоненты реакции. Неограничивающими примерами являются любые апротонные растворители, включая, но не ограничиваясь ими, алкильные или галогеналкильные растворители, такие как гексан, циклогексан, дихлорметан или дихлорэтан, толуол, ацетон, этилацетат, дитианы, ТГФ, диоксан, ацетонитрил, диэтиловый эфир, пиридин, диметилформамид (ДМФ), диметилсульфоксид (ДМСО), диметилацетамид или любая их комбинация.

Схема 2 представляет неограничивающий пример получения β-^-5'-аминоацилнуклеозида из Ьдезоксирибонуклеозида.

Схема 2

- 25 005774

С. Способ получения Р-Б-3'. 5'-бис-О-производных в-Е-нуклеозидов. в-Ь-3',5'-бис-О-Производные в-Е-нуклеозида можно получить любыми способами, известными в данной области, в частности, известными способами защиты первичных и вторичных спиртов ацильными группами, т. е. с помощью ангидрида или с помощью агента сочетания. В качестве неограничивающего примера 3',5'-бис-О-производные можно получить в результате следующей последовательности реакций:

где В представляет

а) аденин

Ь) цитозин

с) тимин

Я представляет алкильную или арильную группу.

В предпочтительном воплощении 3',5'-бис-О-производное получают из аминоацильной группы.

Ключевым исходным соединением для данного способа является подходящий замещенный в-Енуклеозид. 3',5'-бис-О-Производные в-Е-нуклеозидов можно купить или можно получить известными способами, включая обычные реакции сочетания с группой Ь-сахара, такого как дезоксирибоза. Затем свободные 3'- и 5'-гидроксильные группы можно сочетать с Ν-защищенной α-или в-аминокислотой. Реакцию сочетания можно проводить с использованием подходящих реагентов сочетания, которые способствуют сочетанию. Некоторыми неограничивающими примерами реагентов сочетания являются реагенты типа Митсунобу (например, диалкилазодикарбоксилаты, такие как диизопропилазодикарбоксилат и диэтилазодикарбоксилат) с трифенилфосфином или различные типы карбодиимидов.

Схема 3 представляет неограничивающий пример получения в-Е-3',5'-диаминоацилнуклеозида из Ь-дезоксирибонуклеозида.

Схема 3

Ό. Необязательный способ удлинения аминоацильной группы.

Указанные в заголовке соединения можно получить взаимодействием 3'- и 5'-гидроксильных групп с подходящим производным, таким как ацил, и, в частности, аминоацильной группой. Если нуклеозид превращают в его производное с помощью аминоацильной группы, желательно затем сочетать свободный амин с Ν-защищенной α- или в-аминокислотой. Реакцию сочетания можно проводить с использованием подходящих реагентов сочетания, которые способствуют сочетанию. Некоторыми неограничивающими примерами реагентов сочетания являются реагенты типа Митсунобу (например, диалкилазодикарбоксилаты, такие как диизопропилазодикарбоксилат и диэтилазодикарбоксилат) с трифенилфосфином или различные типы карбодиимидов.

- 26 005774

Е. Необязательный способ получения производных гетероароматического или гетероциклического основания.

Указанные в заголовке соединения можно получить необязательной защитой свободной аминогруппы в гетероциклическом или гетероароматическом основании, например, Ν'''-цитозине. Х-аденине или Ы²-гуанине. Например, амин можно защитить ацильной группой или диалкиламинометиленовой группой по следующей общей схеме:

Защиту можно проводить при любой температуре, когда достигаются желаемые результаты, т.е. подходящей для протекания реакции с приемлемой скоростью без разложения или избыточного образования побочных продуктов.

Затем свободную 3'-гидроксильную группу можно сочетать с Ν-защищенной α- или β-аминокислотой. Реакцию сочетания можно проводить с использованием соответствующих реагентов сочетания, которые способствуют сочетанию. Некоторыми неограничивающими примерами реагентов сочетания являются реагенты типа Митсунобу (например, диалкилазодикарбоксилаты, такие как диизопропилазодикарбоксилат и диэтилазодикарбоксилат) с трифенилфосфином или различные типы карбодиимидов.

В альтернативном воплощении Ν⁴- или Ц-ацильное производное получают из аминоацильной группы, и его можно получить в результате следующей последовательности реакций при необязательной защите свободных гидроксильных групп, с последующей реакцией конденсации с соответствующим образом защищенным аминоэфиром и удалением гидроксилзащитных групп, если необходимо.

Примеры Пример 1. А-тМТг-2'-дезоксиф-Е-цитидин (1, фиг. 1). β-Ь-бС (1 г, 4,40 ммоль) растворяли в сухом пиридине (44 мл). После временной защиты триметилсилильной группой (ТМ8С1, 3,34 мл, 26,4 ммоль), с последующим добавлением тМТгС1 (3,38 мг, 11 ммоль) и 4-диметиламинопиридина (ОМАР, 540 мг, 4,40 ммоль), реакционную смесь перемешивали в течение 3 суток при комнатной температуре {А. ΝνίΓκ С. С1стагсс; 1. Сйайорабйуауа; Тсйайсбгои Ьсй.

- 27 005774

1990, 46, 2149-2164}. После экстракции бикарбонатом натрия органический слой промывали водой, упаривали и растворяли в диоксане (40 мл). Добавляли по каплям водный аммиак (8,5 мл) и реакционную смесь перемешивали в течение ночи. После отгонки летучих веществ твердый остаток очищали на колонке с силикагелем {элюент: ступенчатый градиент МеОН (0-10%) в СН₂С1₂} с получением желаемого соединения 1 (1,02 г, 46,5%) в виде пены.

¹Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 8,39 (шир.с, 1Н, ΝΉ, 1ГО обмениваемый), 7,70 (д, 1Н, Н-6, 1=7,3 Гц), 7,46,8 (м, 14Н, (С₆Н₅)₂С(С₆Н₄)ОСН₃), 6,23 (д, 1Н, Н-5, 1=7,3 Гц), 6,02 (т, 1Н, Н-1', 1=6,5 Гц), 5,16 (д, 1Н, ОН3', 1=3,8 Гц, Э₂О заменяемый), 4,9 (шир.с, 1Н, ОН-5', Э₂О заменяемый), 4,1 (м, 1Н, Н-3'), 3,7 (м, 4Н, Н-4', ОСН₃), 3,5 (м, 2Н, Н-5', Н-5), 2,1-1,8 (2м, 2Н, Н-2', Н-2);

ГАВ (бомбардировка быстрыми атомами) <0, (СТ) т/е 498 (М-Н)^-, 382 (В)^-; 226 (М-тМТг)^-; ЕАВ>0 (СТ) 500 (М+Н)⁺, 273 (тМТг)⁺; УФ (Е ЛО! 195)/...., = 279 нм; λ^_η = 250 нм.

Пример 2. 5'-Ь-№(трет-Бутоксикарбонил)валиновый эфир ⁴№тМТг-2'-дезокси-в-Ь-цитидина (2, фиг. 1).

К раствору соединения 1 (1 г, 2,00 ммоль) в сухом ДМФ (34 мл) последовательно добавляли 4диметиламинопиридин (ΌΜΑΡ, 37 мг, 0,3 ммоль), №(трет-бутоксикарбонил)-Ь-валин (Вос-Уа1-ОН, 587 мг, 2,7 ммоль) и Ν,Ν'-дициклогексилкарбодиимид (ЭСС, 660 мг, 3,2 ммоль) {Ь.М. Веаисйатр; С.Г. Огг; Р.Эе Мпапба; Т. Вигпейе; Т.А. Кгепйкку; Ап1Мга1 Сйет. Сйето1йег. 1992, 3, 157-164}. Раствор перемешивали при комнатной температуре. Через 40 ч в реакционную смесь вносили еще ОМАР (37 мг, 0,3 ммоль), Вос-Уа1-ОН (587 мг, 2,7 ммоль) и ОСС (660 мг, 3,2 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 40 ч. Смесь фильтровали и ДМФ удаляли из фильтрата при пониженном давлении и остаток хроматографировали на колонке с силикагелем {элюент: ступенчатый градиент МеОН (0-10%) в СН₂С1₂} с получением желаемого соединения 2 (515 мг, 37%) в виде пены.

¹Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 8,44 (шир.с, 1Н, N4, О₂О заменяемый), 7,7-6,8 (м, 15Н, Н-6 и (С₆Н₅)₂С(С₆Н₄)ОСН₃), 6,26 (д, 1Н, Н-5, 1=7,3 Гц), 6,06 (т, 1Н, Н-1', 1=6,6 Гц), 5,7 (шир.с, 1Н, ОН-3, 1)₃О заменяемый), 4,2-4,0 (м, 3Н, Н-3', Н-4' и СН), 3,8-3,9 (м, 2Н, Н-5', Н-5), 3,7 (с, 3Н, ОСН₃), 2,0-1,9 (м, 3Н, Н-2', Н-2, СН), 1,36 (с, 9Н, (СН₃)₃С), 0,86 (м, 6Н, (СН₃)₂СН);

ГАВ<0, (СТ) т/е 1395 (2М-Н)^-, 697 (М-Н)^-, 425 (М-тМТг)^-; 382 (В)^-; 216 (Вос-Уа1-Н)^-; ГАВ>0 (СТ) 384 (В+2Н)⁺, 273 (тМТг)⁺; 57 (СН₃)₃С)⁺; УФ (Е1ОН95) λ^ = 279 нм; λ^ = 249 нм.

Пример 3. Гидрохлорид 5'-Ь-валинового эфира 2'-дезокси-в-Ь-цитидина (3, фиг. 1).

Соединение 2 (500 мг, 0,715 ммоль) растворяли в 20% растворе трифторуксусной кислоты в СН₂С1₂(25 мл) и добавляли триизопропилсилан (1,47 мл, 71,5 ммоль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и валиновый эфир осаждали в Е1₂О в виде трифторацетата. После нескольких совместных выпариваний с водой осадок растворяли в воде (2 мл), обрабатывали насыщенным раствором НС1 в диоксане (20 мл) и выпаривали при пониженном давлении. Данную обработку повторяли три раза и в конце желаемое вещество 3 осаждали в эфире (207 мг, 73%) в виде гидрохлорида.

¹Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 9,7 (шир.с, 1Н, 1/2Ν4₂, Э₂О заменяемый), 8,6 (шир.с, 4Н, 1/2Ν4₂, Ν4₃, 1УО заменяемый), 7,98 (д, 1Н, Н-6, 1=7,8 Гц), 6,17 (д, 1Н, Н-5, 1=7,8 Гц), 6,11 (пт, 1Н, Н-2'), 5,5 (шир.с, <1Н, ОН-3', 1ГО заменяемый), 4,4 (м, 2Н, Н-5', Н-5), 4,3 (м, 1Н, Н-3'), 4,2-4,0 (м, 2Н, Н-4', СН), 3,8-3,9, 3,7 (с, 3Н, ОСН₃), 2,3-2,1 (м, 3Н, Н-2', Н-2, СН), 0,94 (дд, 6Н, (СН₃)₂СН, 1=3,7 и 6, 6 Гц);

ГАВ<0, (СТ) т/е 361 (М+С1)^-; 325 (М-Н)^-, 116 (Уа1-Н)^-, 110 (В)^-; 216 (Вос-Уа1-Н)^-; ГАВ>0 (СТ) 653 (2М+Н)⁺, 327 (М+Н)⁺; 112 (В+2Н)⁺; {а}с²⁰ -28,57 (с=0,49 в ДМСО); УФ (Е1ОН95) λ^ = 272 нм (ε 8700); λ,,,,,.· = 255 нм (ε 7600); ВЭЖХвремя удерживания = 8,37 мин (градиент от 0 до 50% ί.Ή₃Ν в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере в течение 30 мин со скоростью потока 1 мл/мин).

Пример 4. У-ацетил-2'-дезокси-в-Ь-цитидин (4, фиг. 2).

К суспензии нуклеозида, β-Ь-бС (415 мг, 1,83 ммоль) в Ν,Ν-диметилформамиде (9,2 мл) добавляли уксусный ангидрид (207 мкл, 2,20 ммоль) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 24 ч [У.Вйа!; В.С. Идагкаг; У.А. 8ауееб, К. Сптт; Ν. Кокога; Р.А. Эотешсо; Е. 81оскег, М.1с1ео51Йе5 & Шс1еоНбе5. 1989, 8(2), 179-183]. После удаления ДМФ при пониженном давлении полученный остаток очищали колоночной хроматографией [элюент: 15% МеОН в СН₂С1₂] с получением желаемого соединения (310 мг, 63%), которое кристаллизовали из этанола; т.пл. 128-170°С;

Ή-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 10,86 (с, 1Н, ΝΉ, 1ГО заменяемый), 8,31 (д, 1Н, Н-6, 1=7,5 Гц), 7,18 (д, 1Н, Н-5, 1=7,5 Гц), 6,09 (т, 1Н, Н-1', 1=6,3 Гц), 5,25 (д, 1Н, ОН-3', 1)₃О заменяемый, 1=4,2 Гц), 5,03 (т, 1Н, ОН-5', 1)₃О заменяемый, 1=5,0 Гц), 4,1-4,2 (м, 1Н, Н-3'), 3,8 (м, 1Н, Н-4'), 3,4-3,6 (м, 2Н, 2Н, Н-5', Н-5), 2,2-2,3 (м, 1Н, Н-2'), 2,08 (с, 3Н, СН₃), 2,0-1,9 (м, 1Н, Н-2);

ГАВ<0, (СТ) т/е 806 (3М-Н)^-, 537 (2М-Н)^-, 360 (М+С-Н)^-, 268 (М-Н)^-, 152 (В)^-; ГАВ>0 (СТ) 808 (3М+Н)⁺, 539 (2М+Н)⁺, 362 (М+С+Н)⁺, 270 (М+Н)⁺, 154 (В+2Н)⁺, 117 (8)⁺; УФ (НД^ = 297 нм (ε 8300); λ™, = 270 нм (ε 3500); Α,χ = 245 нм (ε 14400); λ™, = 226 нм (ε 5800); |α.| ² -81,31 (с=1,07 в ДМСО).

Пример 5. У[(Диметиламино)метилен]-2'-дезокси-в-Ь-цитидин (5, фиг. 3).

Указанное в заголовке соединение получали опубликованным способом, разработанным для получения соответствующего Ό-энантиомера [8.С. Кегг апй Т.1. Ка1тап, 1. РНагт. 8с! 1994, 83, 582-585]. Рас- 28 005774 твор Ь-бС (500 мг, 2,20 ммоль) в ДМФ (4,8 мл) обрабатывали диметилацеталем диметилформамида (2,8 мл, 21,08 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Раствор упаривали при пониженном давлении и совместно выпаривали с этанолом. Кристаллизация из смеси этанол/эфир давала указанное в заголовке соединение (501,2 мг, 81%) в виде светло-желтых кристаллов. Т.пл. 174-176°С (по литературным данным: 188-190°С для Ό-энантиомера);

^!Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 8,60 (с, 1Н, №СН), 8,00 (д, 1Н, Н-6), 6,15 (т, 1=6,6 Гц, 1Н, Н-1'), 5,96 (д, 1=7,2 Гц, 1Н, Н-5), 5,22 (д, 1=4,2 Гц, 1Н, ОН-3'), 5,01 (т, 1=5,2 Гц, 1Н, ОН-5'), 4,20 (м, 1Н, Н-4'), 3,80 (м, 1Н, Н-3'), 3,56 (м, 2Н, Н-5' и Н-5), 3,15 и 3,02 (2с, 3Н и 3Н, Ν(№₃)₂), 2,22-1,90 (2м, 1Н и 1Н, Н-2' и Н-2);

РАВ>0, (СТ) 847 (3М+Н)⁺, 565 (2М+Н)⁺, 283 (М+Н); РАВ<0, (СТ) т/ζ 599 (2М+С1)^-, 317 (М+С1)^-, 165 (В)^-.

Пример 6. 3',5'-ди-О-ацетил-2'-дез,окси-Р-Г-цитидин (6, фиг. 4).

Указанное в заголовке соединение синтезировали в одну стадию, исходя из Ь-бС и следуя способу, разработанному Вгетег с1 а1. [В.С. Вгетег; V. Воке; ГА. Όιιηη; ГЕ. Мае Όί;·ιπηί6 апб 1. Вагбок; 1. Меб. С’йст. 1990, 33, 2596-2603] для получения Ό-энантиомера. Раствор Ь-бС (765 мг, 3,37 ммоль) и ацетилхлорид (960 мкл, 13,48 ммоль) в ледяной уксусной кислоте (4,8 мл) перемешивали при комнатной температуре в течение 10 мин, затем добавляли сухой хлороформ (3,5 мл) и перемешивание продолжали в течение 24 ч. Раствор упаривали при пониженном давлении и совместно выпаривали с этанолом. Кристаллизация из этанола давала 78% желаемого соединения, т.пл. 192-193°С (по литературным данным: 187189°С для Ό-энантиомера [Вгетег еί а1. 1. Меб. Сйет. 1990, 33, 2596-2603]);

^!Н-ЯМР (ДМСО-б6) δ м.д. 9,8 и 8,7 (2 шир.с, <3Н, ΝΗ3⁺, Ό2Ο заменяемый), 8,0 (д, 1Н, Н-6 1=7,8 Гц), 6,18 (д, 1Н, Н-5, 1=7,8 Гц), 6,08 (т, 1Н, Н-1', 1=6,7 Гц), 5,2 (м, 1Н, Н-3'), 4,3-4,1 (м, 3Н, Н-4', Н-5', Н-5), 2,4-2,5 (м, 2Н, Н-2', Н-2), 2,06 и 2,03 (2с, 6Н, 2 СН₃);

РАВ<0, (СТ) т/е 968 (3М+С1)^-, 657 (2М+С1)^-, 438 (М+С+С1)^-, 346 (М+С1)^-, 310 (М-Н)^-, 110 (В)^-; 59 (СН3СОО)^-; РАВ>0 (СТ) 623 (2М+Н)⁺, 312 (М+Н)⁺, 201 (8)⁺, 112 (В+2Н)⁺, 43 (СН3СО)⁺; |(/.| ² 36,27 (с=1,02 в ДМСО); УФ (МеОН)ф_тах = 277 нм (ε 9900); М_т = 246 нм (ε 5000).

Пример 7. 3',5'-Г-Ы-(трет-бутоксикарбонил)валиновый диэфир 2'-дезокси-Р-Г-цитидина (9, фиг. 5).

Раствор У-|(диметиламино)метилен|-2'-дезокси-р-Г-цитидина (7,500 мг, 1,77 моль) в ДМФ (35 мл) обрабатывали Вос-Уа1-ОН (1,31 г, 6,03 ммоль), ОМАР (86,5 мг, 0,71 ммоль), гидрохлоридом 1-(3диметиламинопропил)-3-этилкарбодиимида (ЕОС) (1,36 г, 7,09 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 40 мин. Добавляли дополнительные количества Вос-Уа1-ОН (655 мг, 3,01 ммоль), ОМАР (43,2 мг, 0,35 ммоль), ЕОС (680 мг, 3,55 ммоль) и раствор перемешивали еще в течение 20 ч. После упаривания при пониженном давлении остаток растворяли в СН2С12 и экстрагировали несколько раз водой. Органический слой промывали насыщенным раствором соли (100 мл), сушили (№₂8О₄) и упаривали при пониженном давлении с получением 8 в виде сырого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Остаток растворяли в диоксане (18 мл), обрабатывали 26% водным раствором NΗ₄ΟΗ и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Раствор упаривали при пониженном давлении и остаток очищали хроматографией на силикагеле с использованием ступенчатого градиента МеОН (0-5%) в СН₂С1₂ с получением указанного в заголовке соединения (698,7 мг, 58% из 9).

^!Н-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 7,58 (д, 1Н, Н-6), 7,29-7,18 (м, 4Н, ΝΗ-Вос и ЫН₂), 6,20 (т, 1=6,6 Гц, 1Н, Н-1'), 5,75 (д, 1=7,3 Гц, 1Н, Н-5), 5,20 (шир.с, 1Н, Н-3'), 4,29 (м, 2Н, Н-5' и Н-5), 4,14 (шир.с, 1Н, Н-4'), 3,86 (м, 2Н, СН-ЫН-Вос), 2,31-2,21 (м, 2Н, Н-2' и Н-2), 2,13-1,98 (м, 2Н, СН(1Рг)), 1,38 и 1,36 (2с, 18Н, Фи), 0,88 и 0,85 (2д, 1=6, 8 Гц, 12Н, СН(СН₃)₂);

¹³С-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 172,67 и 172,46, 166,41, 156,64 и 155,70, 141,39, 95,43, 85,78, 82,03, 79,14, 75,57, 64,90, 60,37 и 60,11, 37,40, 30,33, 29,00, 19,83-19,12;

РАВ>0 (СТ) 626 (М+Н)⁺, 112 (В+2Н)⁺, 255 (М-Вос)⁺; РАВ<0, (СТ) т/ζ 1249 (2М-Н)^-, 624 (М-Н)^-.

Пример 8. Гидрохлорид 3,5'-Ь-валинового эфира 2'-дезокси-Р-Г-цитидина (10, фиг. 5).

Раствор 9 (675 мг, 1,08 ммоль) в диоксане (30 мл) обрабатывали раствором 26% НС1 в диоксане (30 мл) и перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч 55 мин. Полученную белую суспензию упаривали при пониженном давлении. Белый твердый остаток растворяли в минимальном количестве МеОН и осаждали в эфире с получением указанного в заголовке соединения 10) в виде белого твердого вещества. Т.пл. 187°С (с разложением);

^!Н-ЯМР (ДМСО-бе) δ м.д. 9,79 (шир.с, 1Н, 1/2NΗ2), 8,72 (шир.с, 7Н, 1/21ЧН2 и 1ЧН3⁺), 8,04 (д, 1Н, Н6), 6,21 (д, 1=7,8 Гц, 1Н, Н-5), 6,16 (т, 1=6,9 Гц, 1Н, Н-1'), 5,39 (м, 1Н, Н-3'), 4,50-4,40 (м, 3Н, Н-4', Н-5' и Н-5), 3,90 (2 шир.д, 2Н, СН-БН3⁺), 2,63-2,50 (2м, 2Н, Н-2' и Н-2), 2,21 (м, 2Н, СН(1Рг)), 1,02-0,94 (м, 12Н, СН(СН₃)₂);

¹³С-ЯМР (ДМСО-б₆) δ м.д. 169,50 и 168,94, 161,02, 148,50, 145,26, 95,18, 87,19, 82,15, 76,14, 65,77 и 65,59, 58,12 и 58,07, 37,00, 30,16, 19,26-18,51;

РАВ>0 (СТ) 426 (М+Н)⁺, 112 (В+2Н)⁺; РАВ<0, (СТ) т/ζ 885 (2М+С1)^-, 460 (М+С1); УФ (Н₂О)Х_тах = 270 нм (ε 7600).

Пример 9. М-Вос-валиниловый эфир 2'-дезокси-р-Г-цитидина (13, фиг. 6).

- 29 005774

Смесь Ь-йС (1,80 г, 7,92 ммоль) и триэтиламина (8,8 мл, 63,14 ммоль) в безводном ТГФ (80 мл) обрабатывали хлортриметилсиланом (6 мл, 47,28 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение ночи. Реакцию гасили добавлением водного насыщенного раствора ЫН₄С1 (26 мл) и воды (10 мл). Водный слой экстрагировали три раза Е!ОАс. Органнческне слои объединяли, промывали насыщенным раствором соли, сушили (Ыа₂8О₄) и упаривали при пониженном давлении с получением сырой светло-желтой маслянистой пены, содержащей 11, которую использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Данный остаток растворяли в СН₂С1₂ (104 мл), обрабатывали Ы-(третбутоксикарбонил)-Ь-валином (Вос-Уа1-ОН, 1,72 г, 7,90 ммоль), гексафторфосфатом бензотриазол-1илокси-трис(диметиламино)фосфония (ВОР, 4,20 г, 9,50 ммоль), триэтиламином (2,2 мл, 15,78 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток. Раствор разбавляли Е!ОАс и дважды экстрагировали насыщенным раствором ЫаНСО₃. Органический слой сушили (Ыа₂8О₄) и упаривали при пониженном давлении с получением 12 в виде сырого вещества, которое использовали на следующей стадии без дополнительной очистки. Данный остаток растворяли в диоксане (80 мл), обрабатывали 26% водным раствором ЫН₄ОН и перемешивали при комнатной температуре в течение 6 ч 45 мин. Раствор упаривали при пониженном давлении, совместно выпаривали с абсолютным Е!ОН и остаток очищали хроматографией на силикагеле с использованием ступенчатого градиента МеОН (5-10%) в СН₂С1₂, получая указанное в заголовке соединение 13 в виде пены (1,64 г, выход в целом 48,5%).

Ή-ЯМР (ДМСО-й₆) δ м.д. 10,88 (с, 1Н, ЫН-4), 8,40 (д, 1Н, Н-6), 7,26 (д, 1=7,4 Гц, 1Н, Н-5), 7,06 (д, 1=8,2 Гц, 1Н, СН-ЫН-Вос), 6,15 (т, 1=6,3 Гц, 1Н, Н-1'), 5,32 (д, 1=4,2 Гц, 1Н, ОН-3'), 5,09 (т, 1=5,2 Гц, 1Н, ОН-5' ), 4,27 (м, 1Н, Н-3'), 4,06 (пт, 1=7,5 Гц, 1Н, СН-ЫН-Вос), 3,91 (м, 1Н, Н-4'), 3,63 (м, 2Н, Н-5' и Н-5), 2,35 (м, 1Н, Н-2), 2,06 (м, 2Н, Н-2' и СН(СН₃)₂), 1,43 (с, 9Н, !Ви), 0,92 (пт, 1=6, 6 Гц, 6Н, СН(СН₃)₂);

¹³С-ЯМР (ДМСО-й6) δ м.д. 174,41, 162,94, 156,47, 155,24, 146,10, 96,06, 88,79, 87,10, 79,09, 70,75, 61,78, 61,55, 41,74, 30,63, 29,02, 19,91 и 19,10;

ЕАВ >0 (СТ) 853 (2М+Н)⁺, 427 (М+Н)⁺, 311 (В+2Н)⁺, 255 (М-Вос)⁺; ЕАВ<0, (СТ) т/ζ 851 (2М-Н)^-, 425 (М-Н)^-, 309 (В)^-.

Пример 10. 3',5'-Ы⁴-Тривалил-2'-дезоксицитидин (14, фиг. 7).

Исходное соединение, 3',5'-Ы⁴-три(Вос-валил)-2'-дезоксицитидин растворяли в СН₂С1₂, но поскольку имелось нерастворимое вещество, пробу профильтровывали через перлит. Это приводило к увеличению объема используемого СН₂С1₂. При перемешивании добавляли реагент НС1/диоксан. В течение нескольких секунд можно было наблюдать некоторое выделение пузырьков в растворе, и затем смесь становилась мутной. Смесь перемешивали при комнатной температуре примерно в течение 1 ч. В течение этого времени осадок становился более кристаллическим. Смесь быстро фильтровали, остаток на фильтре промывали СН₂С1₂ и затем его сушили с использованием насоса, получая 0,16 мг (69%) кремовобелых кристаллов. Реагенты и условия более детально описаны ниже в табл. 1.

____________ ___ __Таблица 1

Реагент	моя единица	масс/об рассч.	Моль/части	масс/об ИСПОЛБЗ.	моль/части	ЭКВ.
3’,5’Х-триВос-Уа1-2’- <1С (Су Уа12а-2а)	825,0 Е1¥	0,30 г	0,00036	0,3 г	0,00036	1,00
СН₂С1₂	5,0 част.	1,5 мл	5	3,0 мл	10	10,0
НС1, 3,9 М в диоксане	256,0 мл/моль	0,47 г	0,00182	0,5 г	0,00195	5,37
3,5'.Х'-триУак-2’-<1С. неочищенный	634,0 ЕТУ	0,23 г	вьгч.-получ.	0,16 г	69,4%

Пример 11. Метод анализа ВЭЖХ для ди-Вос-валил-2'-йС и ди-Вос-валил-2'-йи.

Готовили пробу с концентрацией 1,0 мг/мл растворением желаемого соединения в абсолютном этаноле. Затем раствор разбавляли раствором, который содержал 50% метанола и 50% КН₂РО₄ (0,015 М, рН=3,30-3,50), пока не получали концентрацию 0,16 мг/мл. (Примечание: все используемые растворители дегазировали перед применением.) 20 мкл раствора сразу же наносили на колонку ВЭЖХ производства \УАТЕК,8 (ЫОУАРАК С18 - 4 пм - 3,9x150 мм). Скорость потока устанавливали на 1 мл/мин при температуре колонки 35°С. Для детектирования соединений длину волны устанавливали на 275 нм для диВос2'йС, 260 нм для ди-Вос2'йи и 204 нм для примесей через 15 мин. Колонку элюировали КН₂РО₄(0,015 М, рН 3,30-3,50, доведенным 10% Н₃РО₄ об./об.) в насосе А и чистым ацетонитрилом для ВЭЖХ в насосе В. Градиент представлен в табл. 2.

- 30 005774

Таблица 2 № Время Объемный % из насоса в (мл)

1	0,01	1
2	0,01	45
3	12,00	45
4	20,00	70
5	28,00	70
6	28,00	45
7	32,00	45
8	32,01	0

VIII. Эффективность активных соединений против ИВУ

В условиях ίη νίΐτο Ь-бс не оказывал влияния на человеческие ДНК-полимеразы и функцию митохондрий. Ь-бС не был цитотоксичным для одноядерных клеток периферической крови человека (РВМС), клеток-предшественников костного мозга и многочисленных клеточных линий человека и других клеток млекопитающих, не относящихся к клеткам человека.

Противовирусную активность и безопасность Ь-бС исследовали в двух опытах с использованием модели хронического гепатита В на лесных сурках. В первоначальном исследовании лесных сурков с хронической инфекцией \УНУ (>10¹¹ геномных эквивалентов/мл сыворотки) обрабатывали жидкой композицией Ь-бС перорально один раз в сутки в течение 28 суток. Контрольные животные получали ламивудин или жидкую композицию без препарата. В группах, обработанных Ь-бС, вирусная нагрузка снижалась в зависимости от дозы. При наиболее высокой тестированной дозе (10 мг/кг/день) вирусная нагрузка снижалась на 6 1од по сравнению с контролем в количественном анализе полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Восстановление вируса после лечения обнаруживали через 2 недели. Все животные прибавляли в массе, и не наблюдалось связанной с препаратом токсичности в течение 4-недельного периода лечения или 8-недельного периода после лечения.

В условиях ίη νίΐτο 50% эффективная концентрация (ЕС₅₀) в отношении снижения содержания внеклеточной вирусной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) для Ь-бС составляла 0,24 мкМ против НБУ и 0,87 мкМ против ЭНБУ. Кроме того, Ь-бС снижал уровень внутриклеточных промежуточных соединений, имеющих место при репликации ДНК (К1), при ΕΟ₅₀, равной 0,51 мкМ. 90% эффективная концентрация (БСдо) Ь-бС в отношении репликации НБУ составляла 1,07 мкМ. Анализ взаимосвязи структура-активность (БАК) показывает, что замещение гидроксильной группы в 3'-положении (3'-ОН) расширяет спектр противовирусной активности от гепаднавирусов до других вирусов, включая вирус иммунодефицита человека (Н1У) и некоторые герпес-вирусы. Замена основания снижает противовирусную эффективность и избирательность.

Во втором опыте с использованием модели хронического вирусного гепатита В на лесных сурках тестировали противовирусную эффективность и безопасность Ь-бС в комбинации с другим исследуемым нуклеозидом [в-Ь-2'-дезокситимидином (Ь-бТ)]. В данный опыт входила группа животных, на которых применяли Ь-бС в качестве одного агента (1 мг/кг/день). Не наблюдали связанной с препаратом токсичности для одного Ь-бС или в комбинации с Ь-бТ во время 12-недельного периода лечения или 12недельного периода после лечения. Отсутствовали изменения массы тела или биохимических показателей сыворотки крови и гематологических параметров по сравнению с контрольными животными. При проведении в конце лечения исследования биопсийного материала печени не было установлено наличия гистоморфологических признаков жировых изменений (микровезикулярный стеатоз). Комбинация Ь-бС (1 мг/кг/день) плюс Ь-бТ (1 мг/кг/день) была синергетической и снижала вирусную нагрузку на 8 1од по сравнению с контролем.

Противовирусные нуклеозиды и аналоги нуклеозидов оказывают их противовирусное действие в виде внутриклеточных трифосфатных производных на уровне вирусной полимеразы во время репликации вируса. Как и природные нуклеозиды (Ό-дезоксицитидин и Ό-тимидин) и противовирусные аналоги нуклеозидов (например, ламивудин и зидовудин), Ь-бС активируется внутриклеточно фосфорилированием. В гепатоцитах человека дезоксицитидинкиназа (бСК) ответственна за зависимое от дозы превращение Ь-бС в производные 5'-монофосфата (МР). Затем Ь-бС-МР превращается в 5'-дифосфат (ЭР), который затем превращается в преобладающий 5'-трифосфатный метаболит (ТР). Концентрация Ь-бС-ТР достигала 72,4 мкМ в клетках НсрС2. подвергнутых воздействию 10 мкМ Ь-бС (90,1 мкМ в первичных гепатоцитах человека) за 24 ч, и он имел период полураспада внутри клеток, равный 15,5 ч. В тестах на эндогенную полимеразу Ь-бС-ТР ингибировал связанную с вирионом ДНК-полимеразу ^НУ при 50% ингибирующей концентрации (1С₅₀), равной 1,82 мкМ. Детальный механизм ингибирования ДНКполимеразы НЬУ под воздействием Ь-бС изучается. Воздействие на клетки НерС2 или человеческие гепатоциты в первичной культуре Ь-бС также приводило к образованию второго ТР-производного, β-Ь2'-дезоксиуридин-5'-трифосфата (Ь-бИ-ТР). Уровень Ь-бИ-ТР достигал 18,2 мкМ в клетках Нер62, подвергнутых воздействию 10 мкМ Ь-бС (43,5 мкМ в первичных гепатоцитах человека) за 24 ч. В тестах на

- 31 005774 эндогенную полимеразу Ь-бИ-ТР ингибировал связанные с вирионом ДНК-полимеразы \УНУ при значении 1С₅₀, равном 5,26 мкМ.

В первичной культуре гепатоцитов человека и в клеточной линии гепатомы человека (НерС2) основным метаболитом Ь-бС был Ь-бИ-ТР. Воздействие на данные клетки Ь-бС приводило к образованию Ь-бИ-ТР. В фармакологических тестах ίη νίίΓΟ было показано, что Ь-бИ-ТР ингибировал синтез ДНК в гепаднавирусах при значении 1С₅₀, равном 1,82 мкМ, по сравнению со связанной с вирионами ДНКполимеразой. Ь-бИ-ТР ингибировал синтез ДНК гепаднавирусов при значении 1С₅₀, равном 5,26 мкМ. ЬбС-ТР и Ь-бИ-ТР не ингибировали ДНК-полимеразы человека α, β и γ вплоть до концентрации 100 мкМ, наиболее высокой испытанной концентрации.

Способность активных соединений ингибировать рост вируса в культуре клеток 2.2.15 (клетки НерС2. трансформированные вирионом гепатита) можно оценить, как подробно описано ниже.

Дано краткое заключение и описание анализа противовирусного действия в данной культуральной системе и анализ ДНК НВУ (КогЬа апб Мйтап, 1991, Αηΐίνίπιΐ Яе8., 15:217). Оценку противовирусной эффективности проводили на двух раздельных пассажах клеток. Посев во всех лунках во всех планшетах проводили с одинаковой плотностью и в одно и то же время.

В результате свойственных различий в концентрации внутриклеточной и внеклеточной ДНК НВУ, статистически достоверными (р<0,05) считались снижения только более чем в 3,5 раза (для ДНК вириона НВУ) или в 3,0 раза (для промежуточных соединений репликации ДНК НВУ) по сравнению со средними концентрациями для данных форм ДНК НВУ в необработанных клетках. Использовали концентрации интегрированной ДНК в каждом клеточном препарате ДНК (который оставался постоянным по клеточной основе в данных опытах) для расчета концентраций внутриклеточной ДНК НВУ, тем самым с гарантией того, что равные количества клеточной ДНК сравнивались между отдельными пробами.

Обычные значения внеклеточной ДНК вирионов НВУ в необработанных клетках находились в пределах от 50 до 150 пг/мл культуральной среды (в среднем, примерно 76 пг/мл). Внутриклеточные промежуточные соединения репликации ДНК НВУ в необработанных клетках колебались на уровне от 50 до 100 мкг/пг клеточной ДНК (в среднем, примерно 74 пг/мкг клеточной ДНК). В основном, снижение концентрации внутриклеточной ДНК НВУ в результате обработки противовирусными соединениями было менее выраженным и проявлялось медленнее, чем падение концентраций ДНК вирионов НВУ (КогЬа апб Мйтап, 1991, Αηΐίνίπιΐ Яе§., 15:217).

Характер анализов гибридизации привел к эквивалентности примерно 1,0 пг внутриклеточной ДНК НВУ 2-3 геномным копиям на клетку и эквивалентности 1,0 пг/мл внеклеточной ДНК НВУ 3х10⁵ вирусным частицам/мл.

Примеры

Пример 12. Изучение растворимости.

Сравнивали растворимость природного дезоксирибоцитозина (Ό-бС), 3'-валинилового эфира Ь-бС и 3',5'-дивалинилового эфира Ь-бС в воде. Вначале растворимость Ь-бС оценивали по данным ВЭЖХ (т.е. площади под кривой) при последовательном введении различных хорошо известных концентраций β-ЬбС, как представлено в табл. 3. ВЭЖХ проводили на колонке Nоνа-Раск С18 (3,9x150 мм) в градиенте 025% СН₃С№ в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1 мл в минуту. Зависимость концентрации раствора от площади под кривой имела линейный характер как у = 4150049477 х -4334,46845 (фиг. 8а).

_________Таблица 3

Концентрация (моль/л)	10’³	5 х 10’⁴	ΙΟ’⁴	. 10’*
Площадь	4175916	2031950	440122	55264

Исходя из этих данных, готовили насыщенный раствор с природным дезоксирибоцитозином (ΌбС); отбирали 3 пробы и вводили в хроматограф для ВЭЖХ. Определенная концентрация данного насыщенного раствора равнялась 1,07, 1,08 и 0,96 моль/л; следовательно, насыщенный раствор имел среднюю насыщенную концентрацию, равную 1,03 моль/л или 272 г/л. Результаты представлены в табл. 4.

____ ____ ______________ ______ ___ Таблица 4

Результаты	Площадь	Концентрация (моль/л)
1-ая проба	4420674000	1,07
2-ая проба	4475191000	1,08
3-я проба	3983845000	0, 96

Аналогично оценивали растворимость гидрохлорида 3'-валинилозого эфира β-Ь-бС в воде. Калибровочную кривую строили при последовательных введениях различных концентраций гидрохлорида 3валинилового эфира β-Ь-бС в хроматограф для ВЭЖХ и определяли площадь под кривой, как представлено в табл. 5. ВЭЖХ также проводили на колонке Nоνа-Раск С18 (3,9x150 мм) в градиенте 0-25% ΟΠΉΝ в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1

- 32 005774 мл в мин. Зависимость концентрации раствора от площади под кривой имела линейный характер как у = 3176423963 х -33051,63.

_________ _________________ __________________ Таблица 5

Концентрация (моль/л)	10	5 х 10	ΙΟ'	5 х 10	10
Площадь	3166842	1514479	254296	119668	19269

Исходя из этих результатов, была предпринята попытка приготовить насыщенный раствор гидрохлорида 3'-валинилового эфира β-Ε-άΟ; однако, она не была достигнута. Следовательно, растворяли в воде имеющееся в лаборатории максимальное количество гидрохлорида 3'-валинилового эфира β-Ε-άΟ. Отбирали 3 пробы и определяли концентрацию, исходя из площади под кривой по ВЭЖХ, они имели среднюю концентрацию 1,013, 0,996 и 1,059 моль/л. Результаты приведены в табл. 6.

_____ __ _____ _____ Таблица 6

Результаты	Площадь	Концентрация (моль/л)
1-ая проба	3218013000	1,013
2-ая проба	3162471000	0,996
3-я проба	3362725000	1,059

Все три результата попадали в предполагаемые пределы, рассчитанные по калибровочной кривой, что указывает на полную растворимость соединения при данных высоких концентрациях, показывая, что насыщенный раствор данного образца имеет более высокую концентрацию, чем среднее из трех проб, т.е. выше, чем 1,023 моль/л или 408 г/л.

Определяли растворимость гидрохлорида 3',5'-дивалинилового эфира β-Ε-άΟ в воде. Калибровочную кривую строили при последовательных введениях различных концентраций гидрохлорида 3',5'дивалинилового эфира β-Ε-άΟ в хроматограф для ВЭЖХ и определении площади под кривой, как представлено в табл. 7. ВЭЖХ проводили на колонке Nονа-Ρаск Ο18 (3,9x150 мм) в градиенте 0-25% ΟΗ₃ΟΝ в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1 мл в минуту. Зависимость концентрации раствора от площади под кривой носила линейный характер как у = 3176423963 х -33051,63 (фиг. 8Ь).

________________________________________________________________________Таблица 7

Концентрация (моль/л)	10	5 х 10	ιό	5 х 10	Л 1 О ,—1
Площадь	2863372	1466574	211046	115678	14435

Исходя из этих результатов, была предпринята попытка приготовить насыщенный раствор гидрохлорида 3',5'-дивалинилового эфира β-Ε-άΟ; однако, она не была достигнута. Следовательно, растворяли в воде имеющееся в лаборатории максимальное количество гидрохлорида 3',5'-дивалинилового эфира βΕ-άΟ. Отбирали 3 пробы и определяли концентрацию, исходя из площади под кривой по ВЭЖХ, они имели среднюю концентрацию 2,8, 2,4 и 2,4 моль/л. Результаты приведены в табл. 8.

___ ___ _________ Таблица 8

Результаты	Площадь .	Концентрация (моль/л)
1-ая проба	9336188000	2,8
2-ая проба	7054012000	2,4
3-я проба	6970838000	2,4

Все три результата попадали в предполагаемые пределы, рассчитанные по калибровочной кривой, что указывает на полную растворимость соединения при данных высоких концентрациях, показывая, что насыщенный раствор данного образца имеет более высокую концентрацию, чем среднее из трех проб, т.е. выше чем 2,5 моль/л или 1337 г/л.

Аналогичные исследования проводили по растворимости гидрохлорида 5'-валинилового эфира β-ΕάΟ (выше чем 5,1 моль/л или 1664 г/л) и гидрохлорида 3',5'-диацетилового эфира β-Ε-άΟ (3,3 моль/л или 1148 г/л). Обобщенные данные приведены в табл. 9.

Таблица 9

Пример 13. Ьод Р исследование - фосфатный буфер.

Примерно 1,5 мг Ό-άΟ растворяли в 2,2 мл 0,02 М раствора фосфатного буфера (А, 100 мл, рН 7,2), приготовленного из смеси раствора моноосновного фосфата калия (28,5 мл) и раствора двухосновного

- 33 005774 фосфата калия (71,5 мл), насыщенного октанолом-1 (В). К 1 мл данного раствора добавляли 1 мл октанола-1 (В), насыщенного 0,02 М раствором фосфатного буфера (А). Полученную смесь встряхивали и центрифугировали; отбирали три пробы из каждой фазы и анализировали ВЭЖХ, как представлено в табл. 10. ВЭЖХ проводили на колонке Ыоуа-Раск С18 (3,9x150 мм) в градиенте 0-25% СН₃СЫ в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1 мл в минуту. Было установлено, что 1од Р Ό-бС равен 1,41, следовательно, для Ό-бС предпочтительна вода октанолу.

________ Таблица 10

	А¹	А¹	Опыт А¹	1 в¹	В¹	в¹	А¹	Олы А¹ ] А³	Ώ— В¹	в² \| в³
Плким»	1948481	2130720	2197377	79838	82172	80159	2380141	2326654 1 233905?	93123	90275 89651
среднем	2092193	80723	2348618	91016
Р(В/А)	0,039	0,039
	-1,41	-1,41

Аналогично, примерно 1,5 мг гидрохлорида. Ь-бС-3'-валинового эфира растворяли в 2,5 мл 0,02 М раствора фосфатного буфера (А, 100 мл, рН 7,2), приготовленного из смеси раствора моноосновного фосфата калия (28,5 мл) и раствора двухосновного фосфата калия (71,5 мл). Затем раствор насыщали октанолом-1 (В). К 1 мл данного раствора добавляли 1 мл октанола-1 (В), насыщенного 0,02 М раствором фосфатного буфера (А). Полученную смесь встряхивали и центрифугировали; отбирали три пробы из каждой фазы и анализировали ВЭЖХ, как представлено в табл. 11. ВЭЖХ проводили на колонке ΝοναРаск С18 (3,9x150 мм) в градиенте 0-25% СН₃С№ в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1 мл в минуту.

Таблица 11

Опыт 1	Опыт 2
А¹	А¹	А³	в¹	В¹	в³	А¹	А²	А³ \| В'	в²	в³
3352735	/	3417723	100544	96843	10(3466	3458180	3448062	3412971 100179	/	101731
3385227	100284	3439738 100955
0,0296	0,0293
-1,53	-1,53

Было установлено, что 1од Р для гидрохлорида Ь-бС-3'-валинового эфира равняется -1,53; следовательно, для Ь-бС-3'-валинового эфира в большей степени, чем для Ό-бС, предпочтительна вода октанолу.

Определяли значения 1од Р для гидрохлорида Ь-бС-5'-валинового эфира и гидрохлорида Ь-бС-3',5'дивалинового эфира. Результаты представлены в табл. 12. Однако следует отметить, что значение 1од Р для гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира возможно ниже, чем определенное (-0,86). Во время опыта наблюдали значительное превращение дивалинового эфира в 3'- или 5'-моновалиниловый эфир или даже Ь-бС. Отмечали 50% превращение гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира в водной фазе и 14% в органической фазе. Данное превращение шло за счет нестабильности эфиров в фосфатном буфере при рН 7 (см. примеры 15 и 16).

______ ___ ___________Таблица 12

Соединение	1од Р (октанол/вода)
О-бС	-1,41
гидрохлорид Ь-бС-З'-валинового эфира	-1, 53
гидрохлорид Ь-с1С-5'-валинового эфира	-1, 42
гидрохлорид Ъ-бС-З',5'-дивалинового эфира	-0,86
гидрохлорид Ъ-ЭС-З',5'-диацетилового эфира	-0,74

Пример 14. Ьод Р'-исследование - вода Μί11ίφ.

Для того чтобы избежать превращения дивалинового эфира в моноэфиры и Ь-бС, провели альтернативный опыт по определению 1од Р с использованием воды Μί11ίφ (А') вместо фосфатного буфера (рН 6,5 вместо 7,2). Важно отметить, что в воде можно растворить только гидрохлорид дивалинилового эфира. Примерно 1,5 мг гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинилового эфира растворяли в 2,2 мл воды Μί11ίφ (А', рН 6,5), насыщенной октанолом-1 (В). К 1 мл данного раствора добавляли 1 мл октанола-1 (В), насыщенного водой Μί11ίφ (А'). Полученную смесь встряхивали и центрифугировали; отбирали три пробы из каждой фазы и анализировали ВЭЖХ, как представлено в табл. 13. ВЭЖХ проводили на колонке №уаРаск С18 (3,9x150 мм) в градиенте 0-25% ΘΗ^Ν в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1 мл в минуту. Было установлено, что 1од Р' для 3',5'дивалина в данных условиях равнялся -2,72, что указывает на сильное воздействие противоионов в фос

- 34 005774 фатном буфере. Не обнаруживали превращения дивалина в моноэфиры или Ь-бС ни в водной, ни в органической фазах.

____ Таблица 13

	А¹'	А²'	Опы А³’	т 1 В¹	В¹	в³	А¹'	А¹'	Опы А³’	т 2 В¹	В²	в³
Площадь	3778293	3292150	32*2281	5484	УП6	¢496	3282927	3327122	3297985	5829	5615	6139
В среднем	3284241	5919	3302678	5861
Г ДО)	ι,βοχίσ³	1,77 хЮ'³
ЬщР*	-2,7

Аналогично, примерно 1,5 мг гидрохлорида Ь-бС-5'-валинилового эфира растворяли в 2,2 мл воды Μίΐΐίρ (А', рН 6,5), насыщенной октанолом-1 (В). К 1 мл данного раствора добавляли 1 мл октанола-1 (В), насыщенного водой Μίΐΐίρ (Α'). Полученную смесь встряхивали и центрифугировали; отбирали три пробы из каждой фазы и анализировали ВЭЖХ, как представлено в табл. 14. ВЭЖХ проводили на колонке Νονα-Раск С18 (3,9x150 мм) в градиенте 0-25% ί.Ή₃ί.’Ν в 20 мМ триэтиламмониевом ацетатном буфере (ТЕААс) в течение 15 мин со скоростью потока 1 мл в минуту. Было установлено, что 1од Р для 5'валина в данных условиях равнялся -2,75, значение вновь было ниже, чем установленное в опыте при определении 1од Р с использованием фосфатного буфера.

Таблица 14

А¹'	А³’	Опыт 1 А³’ 1 В¹	в² \| в³	А¹'	А²’	Ош А³’	ыт2 В¹	В²	в³
3722494	3771963	378*317 I ««	ЯП2 \| /	3619900	3975353	4062284	•414	9454	5877
3760924 5813	3885845	7938
1,54 x1ο³	2Д4Х1О^-3
-2,81	-2,69

В данных условиях значения 1од Р' для гидрохлорида Ь-бС-5'-валинилового эфира и гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинилового эфира были очень сходными (табл. 15).

___Таблица 15

Соединение	1од Р (октанол/вода)	1од Р' (октанол/вода)
гидрохлорид Ь-дС-5'-валинового эфира	-1,42	-2,75
гидрохлорид Ь-сЮ-З', 5' дивалинового эфира	-0,86	-2,72

Пример 15. Изучение стабильности при рН 7,4.

Определяли скорость разложения каждого метаболита гидрохлорида Ь-бС-3'-валинового эфира. Было установлено, что период полураспада гидрохлорида Ь-бС-3'-валинового эфира при рН 7,40 составлял 7 ч в 0,2 М Трис-НС1 растворе при 37°С. В данных условиях гидрохлорид Ь-бС-3'-валинового эфира просто превращался в Ь-бС. Не было обнаружено цитозина, таким образом, отсутствовало детектируемое расщепление гликозидной связи.

Аналогично определяли скорость разложения каждого метаболита гидрохлорида Ь-бС-3',5'дивалинового эфира. Было установлено, что период полураспада гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира гидрохлорида при рН 7,42 составлял 24 ч в 0,2 М Трис-НС1 растворе при 37°С. В данных условиях гидрохлорид Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира частично гидролизовался в 3'- и 5'-валинил-Ь-бС, которые затем превращались в Ь-бС. Цитозин не обнаруживали, что, таким образом, указывает на отсутствие детектируемого расщепления гликозидной связи (схема 4, фиг. 9а и 9Ь).

- 35 005774

Схема 4

Пример 16. Изучение стабильности при рН 7,20.

Было установлено, что период полураспада гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира при рН 7,20 равнялся 2,2 ч в 20 мМ фосфатном буфере. В данных условиях гидрохлорид Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира частично гидролизовался в 3'- и 5'-валинил-Ь-бС, которые затем превращались в Ь-бС. Цитозин не обнаруживали, что, таким образом, указывает на отсутствие детектируемого расщепления гликозидной связи (схема 5, фиг. 10а и 10Ь).

Схема 5

Пример 17. Изучение стабильности при рН 4,75.

Было установлено, что период полураспада гидрохлорида Ь-бС-3'-валинового эфира при рН 4,5 равнялся 8,6 суткам в 20 мМ ацетатном буфере. Вновь, гидрохлорид Ь-бС-3'-валинового эфира гидрохлорид просто превращался в Ь-бС. Цитозин не обнаруживали, что, таким образом, указывает на отсутствие детектируемого расщепления гликозидной связи.

Аналогично установили, что период полураспада гидрохлорида Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира при рН 4,51 равняется 44 ч в 20 мМ ацетатом буфере. В данных условиях гидрохлорид Ь-бС-3',5'-дивалинового эфира частично гидролизовался в 3'- и 5'-валинил-Ь-бС, которые затем превращались в Ь-бС. Цитозин не был обнаружен, что, таким образом, указывает на отсутствие расщепления гликозидной связи (фиг. 11а и 11Ь).

- 36 005774

Пример 18. Изучение стабильности при рН 1,2.

Было установлено, что период полураспада гидрохлорида Ь-бС-3'-валинового эфира при рН 1,2 выше 48 ч в 135 мМ буферном растворе КС1-НС1. Цитозин не был обнаружен, что, таким образом, указывает на отсутствие расщепления гликозидной связи.

Аналогично проводили изучение стабильности гидрохлорида Ь-бС-5'-валинового эфира. Данное соединение полностью стабильно при рН 1,2 при отсутствии других метаболитов или продуктов разложения вплоть до 23 ч. В течение 2 суток в растворе не обнаруживали расщепления гликозидной связи.

Было установлено, что 3',5'-диацетиловый эфир Ь-бС имеет период полураспада при рН 1,2, равный 11,2 ч. В данных условиях соединение частично гидролизовалось в 3'- или 5'-производные, которые затем превращались в Ь-бС. В течение 2 суток в растворе не обнаруживали расщепления гликозидной связи.

Было установлено, что 3',5'-дивалиниловый эфир Ь-бС полностью стабилен при рН 1,23, поскольку не было обнаружено других соединений в течение 48 ч в данных условиях. В течение 2 суток в растворе не обнаруживали расщепления гликозидной связи (фиг. 12).

Альтернативно, когда Ν''-положение Ь-бС маскировалось диметиламинометиленом или ацетилом, период полураспада соединения при рН 1,2 составлял, соответственно, только 26 или 50 мин.

Пример 19. Биодоступность однократной дозы Ь-бС у синомологичных обезьян.

Изучали фармакокинетику Ь-бС после внутривенного и перорального введения Ь-бС синомологичным обезьянам. В данном опыте 10 мг/кг меченного тритием ([3Н])-Ь-бС вводили трем синомологичным обезьянам в виде однократной внутривенной дозы. Через 6 недель периода выделения тем же трем обезьянам вводили такую же дозу Ь-бС перорально. Пробы крови для фармакокинетических анализов отбирали перед введением и через 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6, 8 и 24 ч после введения. Пробы мочи для фармакокинетических анализов отбирали с помощью мочеприемника перед введением и в течение следующих периодов времени после введения: 0-2, 2-4, 4-8 и 8-12 ч и затем на протяжении 12-часовых интервалов времени в течение 336 ч после введения. Определяли лекарство и концентрацию с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Концентрации лекарства в крови и моче анализировали немоделирующим математическим методом, и значения АИС получали линейной аппроксимацией методом трапеций.

Внутривенное введение Ь-бС. Среднее значение С_тах Ь-бС после внутривенного введения составляло 95,7 мкМ, и у всех животных оно обнаруживалось при самом раннем времени отбора проб (15 мин после введения). Концентрация Ь-бС в плазме крови снижалась в течение времени после внутривенного введения в виде болюса со средним значением !Е, равным 1,59 ч. Общий клиренс (С1) и почечный клиренс (СЬК) Ь-бС после внутривенного введения в среднем составляли, соответственно, 0,53 л/ч/кг и 0,46 л/ч/кг. Среднее значение кажущегося объема распределения (У_б) 1,22 л/кг указывало на то, что Ь-бС имел значительное внесосудистое распределение в тканях.

Выделение с мочой было быстрым, при выделении 71% от введенной дозы в течение 2 ч. Основная часть (94%) дозы, извлеченной из мочи, приходилась на Ь-бС. Почечный клиренс (0,46 л/ч/кг) был ответственен за 87% от общего клиренса Ь-бС, на основании чего можно было предположить, что выделение с почками является основным путем выделения.

Ь-бИ обнаруживали в плазме и моче, что указывает на то, что после внутривенного введения Ь-бС также имеет место метаболическое элиминирование Ь-бС. Ь-бИ в низких концентрациях обнаруживали в плазме крови на уровне следовых количеств (нижний предел определения (ЬЬОЬ) = 0,1 мкМ). За исключением Ь-бИ, других метаболитов в плазме и крови не обнаруживали.

Пероральное введение Ь-бС. С_тах составляла 3,38 мкМ, и время установления максимальной концентрации Т_тах равнялось 2,33 ч. Концентрация Ь-бС в плазме снижалась бифазным характером со средним конечным значением !Е, равным 2,95 ч, и она была ниже предела определения к 24 ч у всех обезьян. Ь-бС всасывался из желудочно-кишечного тракта со средней пероральной биодоступностью (Б), равной 16,4%.

Ь-бИ обнаруживали в плазме и моче, на основании чего можно предположить, что после перорального введения имело место метаболическое элиминирование Ь-бС. Были установлены низкие концентрации Ь-бИ в плазме на уровне ЬЬОЬ. За исключением Ь-бИ, других метаболитов в плазме и крови не обнаруживали.

Примерно 8,5% введенной перорально дозы выделялось с мочой, собранной в течение 12 ч. Через 72 ч выделялось 15,5±8%. Основная часть (~69%) выделяемого с мочой лекарства приходилась на Ь-бС. Выделение Ь-бИ с почками составляло 29% об общей выделенной дозы. Фекалии не собирали.

В табл. 16 представлено краткое заключение по результатам фармакокинетических исследований при внутривенном и пероральном введении Ь-бС синомологичным обезьянам.

- 37 005774

Таблица 16 Анализ фармакокинетических данных после внутривенного и перорального введения

Ь-бС (10 мг/кг) у синомологичных обезьян

Путь введения (п)	(мМ-ч)	<ч>	Сшс (мМ)	(ч)	СЬ (л/ч/кг)	СЬв (л/ч/кг)	(л/кг)	Р (*)
в/в	81,1	1,59	95,7	0	0,53	0, 46	1,22	-
(3)	(+5,7)	(±0,09)	(±13)		(±0,04)		(±0,11)
пер-
орально	13,7	2, 95	3,38	2,33	-	-	-	16,4
(31	(±4,3)	(±1,3)	(±1,3)	(±1,5)				(±5,0)

Среднее значение (± стандартное отклонение)

Пример 20. Биодоступность однократной дозы Ь-бС у макак резус.

Изучали фармакокинетику Ь-бС после перорального введения Ь-бС макакам резус. В данном опыте 10 мг/кг меченного тритием ([3Н]) Ь-бС вводили трем макакам резус в виде однократной пероральной дозы. Пробы крови для фармакокинетических анализов отбирали перед введением и через 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6, 8 и 24 ч после введения. Пробы мочи для фармакокинетических анализов отбирали с помощью мочеприемника перед введением и в течение следующих периодов времени после введения: 0-2, 2-4, 4-8 и 8-12 ч и затем в течение 12-часовых интервалов времени в течение 336 ч после введения. Определяли лекарство и концентрацию с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Концентрации лекарства в крови и моче анализировали немоделирующим математическим методом и значения АИС получали линейной аппроксимацией методом трапеций.

Средние значения АиС₀,₂₅^₈ и С_тах составляли, соответственно, 12,2 мкМ-ч и 3,23 мкМ. С_тах установлена при Т_тах 0,83 ч. Среднее значение 1½ равнялось 3,34 ч, и концентрация Ь-бС была ниже предела определения через 24 ч у всех обезьян. Средний почечный клиренс Ь-бС был равен 0,273 л/ч/кг. В плазме крови обезьян, получивших Ь-бС, метаболиты не были обнаружены.

Примерно 8,5% от введенной перорально дозы (биодоступность при пероральном введении Ь-бС ~16%) было обнаружено в моче в течение 8 ч. Через 48 ч выделялось 15%. Основная часть (~77%) лекарства, выделенного с мочой, приходилась на Ь-бС. Выделение Ь-бИ с мочой составляло 23% от общей извлеченной дозы. За исключением Ь-бИ, другие метаболиты не были обнаружены.

Значения АИС и С_тах для Ь-бС после введения макакам резус были аналогичны установленным у синомологичных обезьян.

Пример 21. Биодоступность однократной дозы Ь-бС у крыс.

Изучали фармакокинетику и биодоступность Ь-бС у крыс. В данном опыте 10 мг/кг [3Н]радиомеченного Ь-бС вводили трем крысам самкам Спрегью-Даули в виде одной внутривенной дозы. Вторая группа из трех животных получала такую же дозу Ь-бС перорально. Пробы крови для фармакокинетических исследований отбирали через 0,17; 0,33; 0,5; 1, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения. Мочу собирали в течение 8 и 24 ч после введения. Определяли лекарство и определяли концентрацию в плазме крови и моче с использованием ВЭЖХ с обращенной фазой. Данные анализировали немоделирующим математическим методом и значения АИС получали линейной аппроксимацией методом трапеций.

Внутривенное введение Ь-бС. Среднее значение АиС_0>25^₈ равнялось 30,1 мМ-ч. С_тах составляла 91,1 мкМ и достигалась в самое раннее время отбора проб (10 мин после введения) у всех животных. Концентрация Ь-бС в плазме крови снижалась бифазным характером после внутривенного введения в виде болюса со средним значением БД равным 1,21 ч. Среднее значение СЬ Ь-бС составляло 1,44 л/ч/кг. Среднее значение Уб, равное 2,53 л/кг, указывало на то, что Ь-бС имел значительное внесосудистое распределение в тканях. В моче крыс, получивших Ь-бС, метаболиты не были обнаружены.

Большая часть радиоактивности, определенная в моче, приходилась на Ь-бС. В моче обнаруживали Ь-бИ, на основании чего можно предположить, что после внутривенного введения происходит метаболическое элиминирование Ь-бС.

Пероральное введение Ь-бС. Среднее значение АиС₀,₂₅^₈ равнялось 4,77 мМ-ч. Среднее значение С_тах составляло 1,50 мкМ и достигалось при Т_тах, равном 1,0 ч. Концентрации Ь-бС в плазме крови снижались при БД равном 2,52 ч. Для Ь-бС было характерно ограниченное всасывание из желудочнокишечного тракта со средней биодоступностью при пероральном введении (Б), равной 15,4%. В плазме крови крыс после перорального введения Ь-бС метаболитов не обнаруживали.

Большая часть радиоактивности, определенная в моче, приходилась на Ь-бС. Ь-бИ обнаруживали в плазме и моче, на основании чего можно предположить, что после перорального введения происходит метаболическое элиминирование Ь-бС.

В табл. 17 представлено краткое заключение по результатам фармакокинетических исследований при внутривенном и пероральном введении Ь-бС.

- 38 005774

Таблица 17 Анализ фармакокинетических данных после внутривенного и перорального введения

Ь-бС (10 мг/кг) у крыс

Путь введения (п)	Аис₀-25-г» (мМ-ч)	ЪЧ (ч)	С-.. (мМ)	Тгя^е· (Ч)	С1> (л/ч/кг)	У<1 (л/кг)	г (%)
в/в	30,1	1,21	91,1	0	1, 44	2,53	-
(3)	(±4,7)	(±0,06)	(±6,6)		(±0,29)	(±0,60)
пер-	4,77	2, 52	1,50	1,0	-	-	15,4
орально
(3)	(±2,1)	(±1,3)	(±0,68)				(±4,6)

Среднее значение (±стандартное отклонение)

Пример 22. Биодоступность однократной дозы Ь-бС у лесных сурков.

Изучали фармакокинетику и биодоступность Ь-бС у лесных сурков. В данном опыте 10 мг/кг [3Н]меченного Ь-бС вводили трем лесным суркам в виде одной внутривенной дозы. Пробы крови для фармакокинетических исследований отбирали через 2, 5, 15 и 30 мин и 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0 и 24 ч после введения. После 7-дневного периода выведения тем же животным вводили 10 мг/кг Ь-бС в виде однократной пероральной дозы. Пробы крови для фармакокинетических исследований отбирали через 15 и 30 мин и 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 и 24 ч после введения. Мочу собирали в течение 24 ч. Определяли концентрации в плазме крови, СЬ, 1½ и Р. Уровни лекарства определяли с использованием ВЭЖХ при детекции по радиоактивности и при сцинтилляционном подсчете.

Внутривенное введение Ь-бС. Среднее значение Стах Ь-бС составляло 112 мкМ и достигалось в самое раннее время, отбора проб (2 мин после введения) у всех животных. Концентрации Ь-бС в плазме крови снижались бифазным характером после внутривенного введения в виде болюса при среднем значении 1½. равном 2,85 ч. Среднее значение СЬ Ь-бС составляло 0,39 л/ч/кг. Среднее значение У_б равнялось 1,17 л/кг. Большая часть радиоактивности, определенной в моче, приходилась на Ь-бС. Ь-бИ обнаруживали в плазме крови и моче, что указывало на то, что после внутривенного введения происходит метаболическое элиминирование Ь-бС. Концентрации Ь-бИ, обнаруживаемые периодически в плазме крови, были на уровне или ниже предела количественного определения со средним значением С_тах, равным 0,75 мкМ.

Пероральное введение Ь-бС. Значение С_тах составляло 1,37 мкМ и достигалось при Т_тах, равном 3 ч. Концентрации Ь-бС снижались со средним значением 1½. равным 5,22 ч. Ь-бС всасывался из желудочнокишечного тракта с биодоступностью при пероральном введении в пределах от 5,60 до 16,9% при среднем значении 9,57%. Большая часть радиоактивности, определенная в моче, приходилась на Ь-бС. Ь-бИ обнаруживали в плазме крови и моче, что указывало на то, что после внутривенного введения происходит метаболическое элиминирование Ь-бС. Концентрации Ь-бИ, обнаруживаемые периодически в плазме крови, были на уровне или ниже предела количественного определения со средним значением С_тах, равным 0,19 мкМ.

В табл. 18 представлено краткое заключение по результатам фармакокинетических исследований при внутривенном и пероральном введении Ь-бС.

Таблица 18 Анализ фармакокинетических данных по Ь-бС (10 мг/кг) после внутривенного и

		перорального введения лесным суркам
Путь	лис^Г	±4	Смя		СЬ		Г
введения
(П)	(мкМ-ч)	(ч)	(мкМ)	• (ч)	(л/ч/кг)	(л/кг)	(%)
в/в	174	2,85	112	0	0,39	1,17	-
(3)	(±120)^Б	(±130)	(±33)		(±0,3)	(±0,36)
пер-	11,3	5,22	1,37	’ 3,0		-	9,57
орально
(3)	(±4,7)	(±2,7)	(±0,22)	(±1)			(±6,4)

а 1=0,033 ч при внутривенном и 0,25 ч при пероральном введении Ъ среднее значение (±стандартное отклонение)

Пример 23. Биодоступность пролекарств Ь-бС.

Оценивали биодоступность Ь-бС, 5'-моноэфира Ь-бС, дивалинового эфира Ь-бС и диацетилового эфира Ь-бС на синомологичных обезьянах с и без Ь-бТ. Когда дивалиновый эфир Ь-бС вводили перорально обезьянам, всасывалось примерно 73% дозы. Более 99% всосавшегося дивалинового эфира Ь-бС быстро превращалось в Ь-бС с получением высокой концентрации Ь-бС в плазме, и не обнаруживали на детектируемом уровне дивалинового эфира Ь-бС. Низкую концентрацию моновалинового эфира Ь-бС в

- 39 005774 плазме обнаруживали вскоре после перорального введения дивалинового эфира Ь-бС. Низкую концентрацию β-^-2'-дезоксиуридина (Ь-бИ) обнаруживали периодически. Других метаболитов не обнаруживали. Результаты приведены в табл. 19. Как уже указывалось, комбинация 3',5'-дивалинового эфира Ь-бС с Ь-бТ обеспечивала наиболее высокую биодоступность Ь-бС.

Таблица 19

	Ъ-ЦС исходный (ММ=227,22)	Ь-бС³5'-валин (ММ=399,27)	Ц-ЦС 3'-валин (ММ-399,27)	Ь-с1С дивалин (ММ=534,87)	Ь-с1С диацетил (ММ-347,75)
Биодоступность¹, %	16,4±5,0	39,0±11,4	85,1±24,5	72,7±22,0	23,0±6,5
Биодоступность, % м/ЬС1Т²	11,9±1,7			74,6±9,9	24,9±4,0

¹ установлено по отношению к АЦС Ь-ЦС (пероральное введение) ² совместное введение с Ь-ΰΤ в дозе 10 мг/кг ³ удельная активность 5'-моновалина, основываясь на общей радиоактивной дозе

ΝΏ, не определяли

Чистота = 87% Ь-бС-моновалина, 12% Ь-бС

Пример 24. Биодоступность однократной дозы дивалил-Ь-бС у синомологичных обезьян.

Трем незараженным синомологичным обезьянам (тасаса Га5с1сн1аг15) вводили 10 мг/кг диУа1-Ь-бС внутривенно со следовым количеством меченного тритием ([3Н]^-) препарата (250 мкКюри) в стерильном 0,9% физиологическом растворе. После 6-недельного периода выделения тем же трем животным вводили диУа1-Ь-бС в той же дозе перорально. Пробы крови отбирали в пробирки с гепарином перед введением (~18 ч) и через 0,25, 0,50, 1, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения. Мочу собирали в периоды 0-2, 2-4, 4-8, 8-12 и затем с 12-часовыми интервалами в течение 336 ч после введения. Лекарство количественно определяли в плазме и моче методом жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии (ЬС-М8). После введения диУа1-Ь-бС анализировали концентрацию Ь-бС во времени немоделирующим математическим методом и площадь под кривыми время-концентрация (АИС) получали линейной аппроксимацией методом трапеций. Биодоступность (Е) для Ь-бС после внутривенного или перорального введения диУа1-Ь-бС ^{рассчитывали по АиС для} Ь^-бС, ^{где Е А}иСПерорально^/А ^иСВНутривенно X ^дозавнутривенно^/дозаперорально.

Введенный внутривенно диУа1-Ь-бС быстро превращался в Ь-бС после внутривенного введения. ДиУа1-Ь-бС обнаруживали в плазме крови через 15 мин (1,39 мкМ) и 30 мин (0,36 мкМ, у 1 из 3 животных) [нижний предел количественного определения (ЬЬОО) = 0,23 мкМ или 100 нг/мл]. ДиУа1-Ь-бС не обнаруживали в плазме крови через 30 мин после введения. В плазме крови была обнаружена частично деэтерифицированная форма диУа1-Ь-бС, β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валиновый эфир, через 15 мин (3,23 мкМ), и в течение 2 ч ее концентрация снижалась до 0,08 мкМ (ЬЬОО = 0,031 мкМ или 10 нг/мл). Ь-бС представлял основную часть лекарства, находящегося в плазме крови после внутривенного введения. Среднее значение АиС_0>25^₈ для Ь-бС составляло 19,8 мкМ-ч. Средняя максимальная концентрация в плазме крови (С_тах) Ь-бС равнялась 24,6 мкМ (ЬЬОО = 0,088 мкМ или 20 нг/мл) и достигалась в самое раннее время отбора проб (15 мин после введения) у всех животных. Концентрация в плазме крови Ь-бС снижалась бифазным характером со средним значением ЬД равным 1,73 ч. Общий клиренс (СЬ) и кажущийся объем распределения (У_б) для Ь-бС в среднем, соответственно, равнялись 1,01 л/ч/кг и 2,46 л/кг, что указывает на значительное внесосудистое распределение в тканях. Связывание диУа1-Ь-бС и Ь-бС с белками плазмы человека ех νίνο составляло, соответственно, 13,3%±2,6% и 19,7±5,9%. Влияние связывания белками плазмы человека на концентрации диУа1-Ь-бС и свободного Ь-бС было минимальным, на основании чего можно предположить, что не предполагаются взаимодействия лекарства с участием замен мест связывания.

Выделение с мочой было быстрым при выделении 58±3% от введенной дозы диУа1-Ь-бС в течение 2 ч после внутривенного введения. Большая часть (~93%) лекарства, выделенного с мочой, приходилась на Ь-бС. Ь-бИ также обнаруживали в плазме и моче. На основании этого можно предположить, что после введения диУа1-Ь-бС также имеет место метаболическое элиминирование Ь-бС. Низкие уровни Ь-бИ обнаруживали периодически в плазме крови у двух из трех животных при концентрациях в пределах от 0,22 до 0,88 мкМ (ЬЬОО = 0,22 мкМ или 50 нг/мл). У третьей обезьяны детектируемые концентрации Ьби отсутствовали в любые временные точки. Выделение через почки Ь-бИ и частично деэтерифицированной формы диУа1-Ь-бС, β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира было минимальным, составляя примерно, соответственно, 2,5% и 3,7% от общей выделенной дозы. ДиУа1-Ь-бС обнаруживали в моче у одного из трех животных через 2 ч после внутривенного введения, на который приходилось примерно 0,15% от выделенной дозы.

Вследствие периодически появляющихся низких концентраций как моновалиновых эфиров, так и Ь-бИ в плазме и моче, было нецелесообразно проводить фармакокинетический анализ данных метаболитов. Появление моновалинового эфира диУа1-Ь-бС не было неожиданным, поскольку он представляет промежуточный продукт при превращении диУа1-Ь-бС в Ь-бС. Кроме того, при исследовании клеточно

- 40 005774 го метаболизма в условиях ίη ν 11 го в обезьяньих, крысиных и первичных гепатоцитах человека и в экстрактах клеток НсрС2 было показано, что Ь-бС непосредственно не деаминируется в Ь-бИ, но Ь-бС монофосфат (-МР) превращается в Ь-бИ-МР, который либо активируется в Ь-бИ-дифосфат (-ЭР) и трифосфат (-ТР), или метаболизируется в Ь-бИ, который затем обнаруживают во внеклеточном пространстве (плазме). Ь-бИ не был цитотоксичным (СС₅₀>200 мкМ), и Ь-бИ-ТР имел значение 1С₅₀ в условиях ίη νίίΓΟ в отношении дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) полимеразы вируса гепатита В, равное 5,26 мкМ (см. «Микробиологию и вирусологию», раздел 10).

При введении перорально диУа1-Ь-бС также быстро превращался в Ь-бС после введения через рот, и его не обнаруживали в пробах плазмы крови в любой временной точке (ЬЬОО диУа1-Ь-бС в растворе = 0,23 мкМ или 100 нг/мл). Частично деэтерифицированный метаболит диУа1-Ь-бС, β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валиновый эфир, обнаруживали в плазме крови через 30 мин и 1 ч при концентрации в пределах от 0,034 мкМ до 0,107 мкМ (ЬЬОО моноэфира в растворе = 0,031 мкМ или 10 нг/мл). ДиУа1-Ь-бС не обнаруживали в плазме крови.

Ь-бС представлял основную часть (>99% при С_тах) концентрации лекарства в плазме крови после введения диУа1-Ь-бС перорально. Среднее значение ЛиС_0>25^₈ для Ь-бС составляло 14,0 мкМ-ч. Значение С_тах для Ь-бС равнялось 8,26 мкМ (ЬЬОО Ь-бС в растворе = 0,088 мкМ или 20 нг/мл), и оно достигалось через 0,67 ч после введения диУа1-Ь-бС. Концентрация Ь-бС в плазме крови снижалась бифазным характером со средним значением РЛ, равным 2,28 ч. Среднее значение пероральной биодоступности Ь-бС после введения диУа1-Ь-бС равнялось 72,7%±22%.

Ь-бИ также обнаруживали в плазме крови, что указывает на то, что после перорального введения диУа1-Ь-бС происходит метаболическое элиминирование Ь-бС. Низкие концентрации Ь-бИ детектировали в плазме крови в течение периода времени от 30 мин до 4 ч у двух из трех животных при концентрациях в пределах от 0,24 мкМ до 0,66 мкМ (ЬЬОО Ь-бИ в растворе = 0,22 мкМ или 50 нг/мл) и у одного животного только через 8 ч при концентрации 0,39 мкМ.

После перорального введения диУаЪЬ-бС быстро всасывался из желудочно-кишечного тракта и превращался в Ь-бС в результате первичного кишечного и/или печеночного метаболизма. Метаболизм ни диУа1-Ь-бС, ни Ь-бС не связан с фракцией микросомальных ферментов печени. После введения диУа1-Ь-бС в высоких дозах временно обнаруживали моновалиновый эфир Ь-бС перед превращением в Ь-бС. ДиУа1-Ь-бС не обнаруживали после введения через рот. Периодические низкие концентрации Ь-бИ обнаруживали в плазме крови на уровне или ниже предела количественного определения. Ь-бИ образовывался в результате деаминирования Ь-бС после поглощения клетками Ь-бС.

Примерно 31±8% от введенной перорально дозы было выделено с мочой в течение 4 ч. Через 72 ч было выделено 39±8%. Большая часть (~95%) лекарства, выделенного с мочой, приходилась на Ь-бС. Выделение Ь-бИ и частично деэтерифицированной формы диУаЪЬ-бС, β-^-2'-дезоксицитидин-5'валинового эфира, почками было минимальным, составляя примерно, соответственно, 2,5 и 0,2% от общей выделенной дозы. ДиУа1-Ь-бС в моче не обнаруживали.

В табл. 20 представлено краткое заключение по результатам фармакокинетических исследований для Ь-бС после внутривенного и перорального введения диУа1-Ь-бС.

Таблица 20 Анализ фармакокинетических данных после внутривенного и перорального введения диУа1-Ь-бС (10 мг/кг) у синомологичных обезьян

Фармакокинетический параметр²

Путь введения (П)	АиСо,г5-*₀ (ыкМ ч)	РН (ч)	Спи (мкМ)	т-« (ч)	сь (л/ч/кг)	ν₄ (л/кг)	К (%)
в/в	19,8	1,73	24,6	0	1,01	2,46
(3)	(±5,2)	(±0,33)	(±2,6)		(±0,32)	(±0,47)
пер-	14,0	2,28	8,26	0, 67	-	-	72,7
орально
(3}	(±2,4)	(±1,4)	(±0,71)	(±0,3)			(±22)

(3) среднее значение (±стандартное отклонение)

В табл. 21 представлена схема образования метаболита диУа1-Ь-бС, моновалинового производного Ь-бС, Ь-бС и Ь-бИ после внутривенного и перорального введения диУа1-Ь-бС. Также указана С_тах каждого метаболита.

- 41 005774

Таблица 21

Образование метаболитов при внутривенном и пероральном введении диУа1-Ь-бС

внутривенно (10 мг/кг диУа1-Ь-<1С)
Стах	диУа1-Ь-с1С-> 1,39 мкМ	моноУа1-Б-с1С—> 3,23 мкН	Ь-бС—>—> 24,6 мкМ	ь-άϋ 0,88 ыкМ
перорально (10 мг/кг диУа!-Ь-<1С)
	Уа1-Ь-<ЗС-*	моноУа1-Ь-<1С—>	Ь-с1С->—»	ь-<би
Стах	не обнаружено	0,11 мкМ	8,26 мкМ	0,66 мкМ

Пример 25. Биодоступность Ь-бС при пероральном введении диУа1-Ь-бС у синомологичных обезьян.

Трем незараженным синомологичным обезьянам самцам (таеаеа £акс1си1апк) вводили 10 мг/кг диУа1-Ь-бС перорально со следовым количеством [3Н]-меченого лекарства (250 мкКюри), растворенного в стерильном 0,9% физиологическом растворе. Пробы крови отбирали в пробирки с гепарином перед введением (~18 ч) и через 0,25, 0,50, 1, 2, 3, 4, 6, 8 и 24 ч после введения. Мочу собирали в периоды 0-2, 2-4, 4-8, 8-12 и затем через 12-часовые интервалы в течение 336 ч после введения. Лекарство количественно определяли в плазме крови и моче с использованием ВЭЖХ. После введения диУа1-Ь-бС определяли концентрацию Ь-бС в плазме крови немоделирующим математическим методом, и площадь под кривыми время-концентрация (АИС) получали линейной аппроксимацией методом трапеций. ДиУа1-ЬбС быстро всасывался и превращался в Ь-бС после перорального введения. Анализ проб плазмы крови радиохроматографической высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ) подтвердил, что большая часть выделенной радиоактивности представляла Ь-бС. ДиУа1-Ь-бС определяли только у одного животного через 15 мин после введения при концентрации 0,35 мкМ. Частично деэтерифицированную форму диУа1-Ь-бС, β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валиновый эфир, не обнаруживали в плазме крови или моче. Примерно 26% от введенной пероральной дозы было обнаружено в моче в течение 8 ч. Через 72 ч было выделено 31%. Большая часть (~89%) лекарства, выделенного с мочой, приходилась на Ь-бС. Выделение Ь-бИ через почки было минимальным, составляя примерно 10% от выделенной дозы. В моче не обнаруживали ни диУа1-Ь-бС, ни его частично деэтерифицированную форму.

Фармакокинетический профиль в целом был сравним с таковым, определенным в фармакокинетическом исследовании, что было показано аналогичными соотношениями С_тах к АИС. Низкие концентрации Ь-бИ детектировали в плазме крови у двух из трех животных при среднем значении С_тах, равном 0,33 мкМ. В плазме крови третьего животного не было обнаружено Ь-бИ. Концентрация Ь-бИ была на уровне или ниже предела количественного определения, препятствуя проведению фармакокинетического анализа.

Пример 26. Метаболизм диУа1-Ь-бС в условиях ш уйго.

Были проведены исследования с целью определения стабильности и связывания с белками диУа1-ЬбС и его деэтерифицированных метаболитов в плазме человека. ДиУа1-Ь-бС инкубировали в человеческой плазме при 37°С и пробы анализировали в различные временные точки до 24 ч (фиг. 13). ДиУа1-ЬбС не обнаруживали через 24 ч при полном его превращении в Ь-бС. Также было отмечено наличие двух дополнительных метаболитов ф-Ь-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира и β-^-2'-дезоксицитидинвалинового эфира). Непостоянное присутствие метаболитов указывало на то, что они являются промежуточными продуктами при превращении диУа1-Ь-бС в Ь-бС. В условиях ш νίΙΐΌ было установлено, что период полураспада диУа1-Ь-бС в плазме человека при 37°С равнялся примерно 39 мин.

Также исследовали влияние связывания с белками плазмы крови человека на свободный уровень диУа1-Ь-бС и Ь-бС с использованием метода ультрафильтрации. Связывание диУа1-Ь-бС с белками плазмы равнялось 13,3%±2,6%. Связывание Ь-бС с белками плазмы составляло 19,7±5,9%. В данном опыте было показано, что влияние связывания с белками плазмы крови человека на диУа1-Ь-бС и Ь-бС было минимальным, и на основании этого можно предположить, что не ожидаются взаимодействия лекарства с участием замены мест связывания.

Пример 27. Метаболическая активация и внутриклеточный профиль Ь-бС.

Изучали метаболизм Ь-бС в клетках с использованием клеток НерС2 и первичных гепатоцитов человека. Результаты высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) показывали, что Ь-бС интенсивно фосфорилировался в гепатоцитах. Основным метаболитом в клетках НерС2, подвергнутых воздействию 10 мкМ Ь-бС в течение 24 ч, был Ь-бС-ТР, концентрация которого достигала 72,4±1,8 мкМ (см. табл. 23). В первичных гепатоцитах человека концентрация Ь-бС-ТР за 24 ч была равна 90,1±37 мкМ, на уровне, близком к таковому, для фосфорилирования в клетках НерС2. Воздействие на гепатоциты Ь-бС приводило к активации второго 5'-трифосфатного производного, Ь-бИ-ТР. В клетках НерС2, подвергнутых воздействию 10 мкМ Ь-бС, уровень Ь-бИ-ТР достигал 18,2 мкМ (43,5 пМ в первичных гепатоцитах человека) за 24 ч. В первичных крысиных и обезьяньих гепатоцитах степень фосфорилирования Ь-бС была несколько ниже.

- 42 005774

Таблица 23

Активация Ь-άΟ (10 мкМ) в гепатоцитах

Метаболит (10 мкМ)

Клетки⁸	и	1ДС-МР	юи-мр	ЬДС-ϋΡ	Ь-ОСОР-	Ъ-вС-ТР	ь-аи-тр
ХОЛИН	ЪчЯЛ)Р
НерС2	3	23,3*0,86	6,73*0,41	10,2*1,9	25,6*0,08	2)69*0,45	72,4*1,8	18,2*1,0
пвртгиш* гопя.’гсадм’щ	3	27,6*15	5.74*2,4	7,19*2,3	15,8*1,8	3,93*1,6	90,1*37	434*27

11.2

10,4

Х11

21.9

(а) Клетки инкубировали в течение 24 ч с [³Η]-ί-άΟ, удельная активность: в тесте с НерС2 = 0,5 Кюри/ммоль; в тесте гепатоцитами человека, обезьяны и крысы = 1,0 Кюри/ммоль.

В дополнение к фосфорилированным производным Ь-άΟ и Ь-άυ отмечали образование метаболита [β-^-2'-дезоксилипонуклеотида]. В культурах клеток НерС2 и первичных гепатоцитах, подвергнутых воздействию 10 мкМ Ь-άΟ в течение 24 ч, обнаруживали [3-Ь-2'-дезоксицитидин-5'-дифосфохолин] (ЬάΟ-ΌΡ-холин), при концентрации 25,6 мкМ (в пределах 25,6-25,7 мкМ) и 12,3 мкМ (в пределах 8,82-15,8 мкМ), соответственно.

Метаболический профиль, полученный через 24 ч воздействия на клетки НерС2 10 мкМ [3Η]-ί-άΟ, представлен на фиг. 14. Кажущийся внутриклеточный период полураспада Ь-άΟ-ΤΡ составлял 15,5±0,34 ч, что коррелировало с пролонгированной противовирусной активностью после отмены лекарства в опытах с восстановлением вируса. Характер фосфорилирования, установленный в первичных гепатоцитах человека в качественном и количественном отношении, был аналогичен таковому, полученному с использованием клеток НерС2 (фиг. 15).

Пример 28. Клеточные киназы, связанные с метаболической активацией.

Ό-Дезоксицитидин (άΟγά) представляет природный субстрат цитозольной άСуάкиназы (άΟΚ) и митохондриальной тимидинкиназы (ТК2) для превращения в άСуά-5'-монофосфат (άΟΜΡ). Цитозольная тимидинкиназа (ТК1) и ТК2 используют Ό-тимидин (ΤΗά) в качестве природного субстрата для превращения в ΤΗά-5'-монофосфат (ТМР). Клеточная киназа, участвующая в первоначальном фосфорилировании Ь-άΟ, была идентифицирована в конкурентных опытах с использованием Ь-άΟ и природных эндогенных ΤΗά и άΟγά. Внутриклеточное фосфорилирование Ь-άΟ снижалось в зависимости от дозы под воздействием άΟγά, но не ΤΗά. Таким образом, άΟγά действовал в качестве ингибитора фосфорилирования Ь-άΟ. Изменение внутриклеточного фосфорилирования Ь-άΟ было аналогичным, когда клетки НерС2 подвергались воздействию обоих ΤΗά и άΟγά или одного άΟγά. На основании ингибирования фосфорилирования Ь-άΟ только под воздействием природного дезоксипиримидина, άΟγά, было высказано предположение, что άΟΚ участвует в фосфорилировании Ь-άΟ.

Роль данных киназ пиримидиновых нуклеозидов в фосфорилировании Ь-άΟ дополнительно исследовалась на клеточных линиях с дефицитом киназ. Имело место значительное снижение количества фосфорилированных метаболитов Ь-άΟ в клетках с дефицитом άΟΚ. Однако не наблюдали значительного различия в фосфорилировании Ь-άΟ в клетках с дефицитом ТК1. Эти данные совпадают с результатами исследований по конкуренции, описанных выше, и указывают на то, что άΟΚ играет ключевую роль в фосфорилировании Ь-άΟ при его превращении в Ь-άΟ-ΜΡ.

С использованием цитозольных экстрактов клеток НерС2 в качестве источника ферментов стационарные параметры кинетики фосфорилирования для Ь-άΟ, ΤΗά и άΟγά были аналогичными, на что указывают значения кажущейся константы Михаэлиса-Ментена (К_т) и максимальной первоначальной скорости (У_тах) (Ь-άΟ: К_т равно 5,75 мМ и У_тах равно 1,12 ммоль/мин/мг белка; ΤΗά: К_т равно 4,06 мМ и У_тах равно 1,26 ммоль/мин/мг белка; άΟγά: К_т равно 4,85 мМ и У_тах равно 2,15 ммоль/мин/мг белка). Кроме того, эффективность фосфорилирования Ь-άΟ, ΤΗά и άΟγά была аналогичной, что определялось их соответствующими значениями У_тах/К_т (соответственно, 0,19, 0,31 и 0,44).

Кроме того, степень внутриклеточного фосфорилирования Ь-άΟ была сравнима с природными эндогенными субстратами, ΤΗά и άΟγά, в экстрактах печени лесных сурков. Это было сделано для обоснования тестирования противовирусной активности на модели хронического гепатита на лесных сурках. Фосфорилирование Ь-άΟ было аналогичным таковому для эндогенных субстратов. Кроме того, уровень фосфорилирования Ь-άΟ был сравним с таковым для Ь-άΟ и эндогенных субстратов в экстрактах печени человека.

- 43 005774

Пример 29. Противовирусная активность Ь-бС в отношении гепаднавируса.

Противовирусную активность Ь-бС в отношении вируса гепатита В человека оценивали по снижению внеклеточной ДНК НВУ и репликационных промежуточных соединений по сравнению с необработанными контрольными клетками в клеточной линии гепатомы, экспрессирующей НЕУ, 2.2.15 (см. табл. 24). Подтверждающее тестирование противовирусной активности Ь-бС с использованием ряда РНК- и ДНК-содержащих вирусов проводили по программе противовирусных исследований и антимикробной химии N14.

Ь-бС не ингибировал репликацию какого-либо вируса, кроме гепаднавирусов (ΈΒΥ, ЭНбУ). Ь-бС обладал высокой противовирусной активностью в отношении репликации НВУ в условиях ίη νίΐτο, снижая продуцирование внеклеточной ДНК №У при ЕС₅₀, равной 0,24 мкМ (ЕС₉₀ 1,06 мкМ). Также Ь-бС уменьшал количество внутриклеточных промежуточных соединений, образующихся при репликации ДНК №У (К1), при ЕС₅₀, равной 0,5 мкМ. Кроме того, Ь-бС приводил к зависимому от дозы ингибированию синтеза ДНК вируса гепатита В утки (ОНЗУ) в культуре первичных утиных гепатоцитов (РОМ) при ЕС50, равной 0,87 мкМ.

Таблица 24

Противовирусная активность, избирательность и цитотоксичность Ь-бС ίη νίΐτο Вирус (клеточная; линиж)ЕСяЛ (ккМ)ССво” (мкМ)

НВУ (2.2.15)	0,24+0,08	>2000
РНВУ (ΡΏΗ)	0,87	ηΉ
Н1У-1 (РВМС)	>200	>200
НЗУ-1 (НЕЕ)®	>100	>100
НЗУ-2 (НЕЕ)®	>100	>100
νζν (НЕЕ)®	18, 6	>100
ЕВУ (Эаиб!)'	>50	>50
НСМУ (НЕЕ)®	>100	>100
Грипп Α/Η1Ν1 (МОСК)	>100	>100
Грипп Α/Η3Ν2 (МОСК)	>100	>100
Грипп В (МОСК)	>100	>100
Корь (СУ-1)	>100	>100
Парагрипп тип 3 (МА-104)	>100	>100
Риновирус тип 5 (КВ)	>100	>100
ВЗУ тип А (МА-104)	>100	>100

a. РБН, первичные утиные гепатоциты; РВМС, периферические моноядерные клетки крови; НЕТ, форескин фибробласты человека; В-клеточная лимфома Дауди, Буркитта; МБСК, собачьи почечные эпителиальные клетки; СУ-1, почечные фибробласты африканской зеленой мартышки; ΚΒ, носоглоточная карцинома человека; МА-104, почечные эпителиальные клетки макаки резус.

b. Ε^₀ = 50% эффективная концентрация.

c. СС₅₀ = 50% цитотоксическая концентрация.

б. п6 = не определяли.

е. Данные выражены в большей степени в мкг/мл, чем в мкМ.

Не обнаруживали цитотоксичности при максимальных концентрациях Ь-бС, тестированного на любой из клеточных линий или первичных клеточных типах, используемых для поддержания репликации различных ДНК- и РНК-содержащих вирусов. Токсичность отсутствовала для РВМС человека, НЕЕ или других типов клеток млекопитающих.

Пример 30. Противовирусная активность Ь-бС на лесных сурках при введении в течение 28 суток.

Лесные сурки, хронически зараженные ^НУ, широко применяются в качестве модели Н8Уинфекции, и они доказали свою пригодность для оценки эффективности противовирусных агентов в отношении Н8У. Выло доказано, что эта модель дает положительный прогноз противовирусной активности для лечения хронической НЗУ-инфекции и служит в качестве чувствительной системы для оценки безопасности нуклеозидов и их аналогов.

Ь-бС вводили лесным суркам перорально один раз в день в дозах от 0,01 до 10 мг/кг/день в течение 28 суток. В сыворотке крови определяли уровни ДНК \УНУ в течение 28 суток лечения лекарством и 56 суток после лечения посредством ДНК-гибридизации с использованием дот-блоттинга (пределы определения примерно 100 геномных эквивалентов (гэкв.)/мл сыворотки) и количественной ПЦР (пределы определения 300 гэкв./мл сыворотки) (1). Репликация ДНК \УНУ была значительно подавлена в первые несколько дней лечения, и ингибирование сохранялось во время периода лечения. Сразу же в день перорального введения Ь-бС вызывал высокий противовирусный эффект, который зависел от дозы, что было установлено ДНК-гибридизацией с использованием дот-блоттинга (фиг. 16).

На фиг. 17 представлена противовирусная активность Ь-бС для отдельных животных, обработанных 10 мг/кг/день в течение 28 суток, на модели хронического гепатита В на лесных сурках. Заметно, что в группе, обработанной 10 мг/кг/день Ь-бС, к 14-28 суткам вирусная нагрузка снижалась на 2-6 1ο§ по

- 44 005774 сравнению с контролем, что определяли с помощью количественной ПЦР. После отмены лекарства вирусная нагрузка достигала уровня, предшествующего лечению, между 1 и 2 неделей.

В группе, обработанной ламивудином (10 мг/кг/день, перорально), вирусная нагрузка НВУ снижалась примерно на 0,5-1,0 1од (гэкв./мл, данные не представлены), что совпадает с ранее проведенными исследованиями при использовании аналогичных концентраций ламивудина, который представляет аналог цитидиннуклеозида (30).

Пример 31. Восстановление вируса в клетках, обработанных Ь-бС.

Восстановление вируса в клетках 2.2.15, обработанных Ь-бС, имело место после отмены лекарства. Репликация НВУ восстанавливалась до 50% от уровня перед обработкой к 18 суткам после обработки. На основании кинетики восстановления вируса после обработки Ь-бС можно предположить, что значительное противовирусное действие продолжалось после отмены лекарства, что совпадало с внутриклеточным периодом полураспада Ь-бС-ТР (15,5 ч в клетках НерС2).

Пример 32. Противовирусная активность Ь-бС в отношении резистентного к лекарствах НВУ.

При контролируемых клинических испытаниях ламивудина (100 мг один раз в день), введенного пациентам, зараженным НВУ, распространение ΎΜΌΌ-мутантного НВУ составляло 14-32% после одного года лечения и 58% после 2-3 лет лечения (18-20). Доказательство наличия мутантного вируса было связано со сниженной ответной реакцией в сравнении с пациентами, подвергнутыми лечению ламивудином, без наличия ΎΜΌΌ-мутаций.

На основании генотипического анализа вирусных изолятов, полученных от пациентов с признаками вновь возникшей репликации НВУ во время приема ламивудина, можно предположить, что снижение чувствительности НВУ к ламивудину связано с мутациями, приводящими к замене метионина на валин или изолейцин в ΎΜΌΌ-мотиве каталитического домена полимеразы НВУ (положение 552) и замене лейцина на метионин в положении 528.

НВУ-рекомбинанты, включающие ΎΜΌΌ-мутации, представляют резистентные к ламивудину и несколько менее компетентные в отношении репликации по сравнению с НВУ дикого типа в условиях ίη νίΐΐΌ (21). Трифосфатное производное Ь-бС будет тестировано против ДНК-полимеразы НВУ дикого типа и мутантного для сравнения значений 1С₅₀. Кроме того, будет проведено тестирование противовирусной активности Ь-бС в отношении резистентных к ламивудину изолятов НВУ и рекомбинантных вирусов с мутациями в положениях 552 и 528.

Кроме того, также предусматривается отбор резистентных к Ь-бС мутантов НВУ в условиях ίη νί\Ό во время продолжительного лечения ^НУ-зараженных лесных сурков. Уместность отбора резистентных к лекарству мутантов на лесных сурках является неопределенной, поскольку спектр резистентных к ламивудину мутантов на лесных сурках не соответствует таковым, идентифицированным у пациентов, зараженных НВУ (20-22). Постановка такого длительного опыта (12-24 месяца) может обеспечить информацией, относящейся к связанному с лечением элиминированию ковалентно замкнутой кольцевой (ссс) ДНК НВУ из зараженных гепатоцитов. В настоящее время невозможно использовать ЬНВУ в качестве модели ίη νίΐΐΌ для отбора мутаций, приводящих к резистентности к лекарствам, поскольку первичные утиные гепатоциты, использованные в данной модели, не могут поддерживаться в течение продолжительного периода времени, необходимого для отбора резистентного к лекарству вируса.

Пример 33. Комбинированная противовирусная активность и цитотоксичность Ь-бТ+Ь-бС.

Противовирусную активность в отношении НВУ и цитотоксичность комбинации Ь-бТ и Ь-бС, находящихся примерно в эквимолярных соотношениях, тестировали на клетках 2.2.15, и было установлено, что они оказывали синергетический эффект в соотношениях 1:1, 1:3 и 3:1 (см. табл. 25).

- 45 005774

Таблица 25

Комбинированная противовирусная активность Ь-бТ+Ь-бС на зараженных НВУ клетках 2.2.15

Обработка	сс₅₀ ^а(мкМ)	ЕС А (мкМ)	5.1.= (СС50/ЕС50)	Анализ синергизма (при ЕС₅о)
ЗТС	>1000	0,180±0,007	>5,000
ь-<ат	3022	1,2+0,1	2,518	-
ь-<зс	3000±96	1,1±0,1	2,727	-
ь-дт+ь-дс	>1500	0,297±0,016	>5,051	синергетический
(1:1)
Ъ-с1Т+Ъ-с1С	1331±67	0, 333±0,023	3, 997	синергетический
(1:3)
ь-егг+ъ-ас	2957±88	0,409+0,079	7,230	синергетический
(3:1)
Ь-ЙТ+ЗТС (1:1)	>1000	0,089±0,004	>11,000	синергетический
Е-ОТ+ЗТС	1000	0,068±0,004	14,706	синергетический
(3:1)
Ц-С1Т+ЗТС	>1000	0,191±0,017	>5,000	синергетический
(10:1)
Ъ-йС+ЗТС (1:1)	>1000	0,200±0,013	>5,000	синергетический {аддитивный при высоких концентрациях)
ъ-ос+зтс	>1000	0,216±0,013	>5,000	синергетический
(3:1)
ъ-<зс+зтс	>1000	0,084±0,006	>11,000	синергетический
(10:1)

а СС₅₀ = концентрация лекарства, при которой наблюдается 50% ингибирование поглощения нейтральной красной краски (по сравнению с необработанными культурами).

Ъ ЕС₅₀ = концентрация лекарства, при которой наблюдается 10-кратное уменьшение содержания ДНК НВУвириона (по сравнению с необработанными культурами).

с Значения ЕС₅₀ использовали для расчета показателя избирательности (8.Ι.), поскольку снижение содержания ДНК НВУ менее, чем в три раза, обычно статистически недостоверно в данном тесте.

б Анализ эффективности комбинированных обработок лекарством проводили комбинированной программой для оценки Са1си8уи (Вюзой, 1ис.).

Пример 34. Оценка токсичности Ь-бС в отношении клеток-предшественников костного мозга человека.

Наличие миелосупрессорного действия некоторых аналогов нуклеозидов привело к необходимости тестирования на потенциальное действие в отношении роста клеток-предшественников костного мозга в клоногенных тестах. В частности, анемия и нейтропения являются наиболее частыми, вызываемыми лекарством клиническими токсическими проявлениями, относящимися к лекарству зидовудину ЩЭУ). эффективному против Н1У. Данную токсичность смоделировали в тесте 1и уйго, в котором используются клетки костного мозга, полученные от здоровых добровольцев (ЬоттабоА 1-Р, Саг1Ыс К. «Тохкйу о! 3'-а/|бо-3'-бсоху111ут1бтс аиб 9-(1,3-бШубгоху-2-ргорохутс!йу1)диашис Гог иогта1 Питан йсто!оро1сйс ргодсийог сс1к т уйго» АийтюгоЪ Адси!§ Сйсто!йсг 1987, 31 (3), 452-454). Было показано, что 2ЭУ непосредственно ингибирует гранулоцитарно-макрофагальную колониеобразующую (КОЕ-ГМ) и эритроидную бурстобразующую активность (БОЕ-Е) при применении в клинике при концентрациях 1-2 мкМ. С использованием клоногенных тестов на костном мозге человека с 2ЭУ в качестве положительного контроля и ламивудином в качестве отрицательного контроля, Ь-бС имел 1С₅₀ в КОЕ-ГМ и БОЕ-Е при концентрации >10 мкМ (см. табл. 26).

Таблица 26 Токсичность Ь-бС для костного мозга на клетках-предшественниках гранулоцитов и макрофагов и клетках-предшественниках эритроцитов

КОЕ-ГМ® ВОЕ-Е*

Соединение 1С$р (мкМ)1С₅о (мкМ)

Ь-с1С	>10	>10
Ламивудин	>10	>10
Ζϋν	1,8	0,7

а Значения представляют результаты трех независимых опытов в трех повторностях

Пример 35. Тест на митохондриальную токсичность для Ь-бС.

Аналоги противовирусных нуклеозидов, разрешенные для лечения Н1У, такие как 2ЭУ, ставудин (б4Т), диданозин (бб1) и залцитабин (ббС), также связаны с ограничивающей их применение в клинике замедленной токсичностью, такой как периферическая невропатия, миопатия и панкреатит (8-11). Дан

- 46 005774 ные клинические побочные эффекты возникают в результате подавления функции митохондрий за счет уменьшения содержания митохондральной ДНК (мтДНК) и включения аналогов нуклеозидов в мтДНК. Кроме того, конкретный аналог нуклеозидов, фиалуридин (ΡΙΑυ) вызывает печеночную недостаточность, панкреатит, невропатию, миопатию и молочный ацидоз за счет непосредственной митохондриальной токсичности. Связанное с лекарством увеличение продуцирования молочной кислоты может рассматриваться в качестве маркера нарушенной функции митохондрий или окислительного фосфорилирования.

Для оценки потенциальной возможности Ь-бС вызывать митохондриальную токсичность проводили несколько опытов в условиях ίη νίΐΓο с использованием клеточной линии гепатомы человека НерС2. Данные исследования включали анализ продуцирования молочной кислоты, содержания мтДНК и определение изменений в морфологии (например, исчезновение крист, растворение и набухание матрикса и образование жировых капель) ультраструктуры митохондрий. Данные по воздействию Ь-бС на митохондрии представлены в табл. 27.

Не наблюдали различий в концентрации молочной кислоты, образованной в клетках при продолжительной обработке Ь-бС и в необработанных клетках. Продуцирование молочной кислоты в клетках, обработанных ΖΌν и ΡΙΑυ, увеличивалось на 100% по сравнению с контролем на растворитель. Воздействие Ь-бС на клетки НерС2 в течение 14 суток при концентрации до 10 мкМ не оказывало влияния на содержание митохондриальной ДНК по сравнению с 87% снижением в ббС-обработанных клетках. Через 14 суток воздействия 10 мкМ Ь-бС исследовали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии ультраструктуру клеток НерС2 и, в частности, митохондрий. Не было обнаружено серьезных изменений в структуре клеток и морфологии митохондрий. Размеры и организация митохондриальных крист была в норме. В обработанных ΖΌν клетках наблюдали типичные набухшие митохондрии с потерей крист. Морфология митохондрий была также аномальной в клетках, обработанных ббС и ΡΙΑυ.

Таблица 27 Влияние Ь-бС на пролиферацию гепатоцитов, функцию и морфологию митохондрий в клетках НерС2 Соединение ^с^⁵°^а Конц. % от контроля Образование Морфология (мкМ) (мкМ) Ь-лактат мтДНК жировых митокапель хондрий

Контроль	-	-	100	100	отрицат.	нормальн.
ь-ас	>2000	10	101+2	107+8	отрицат.	нормальн.
паи	4	10	203	86	положит.	аяомальн.
ΖΌν	14	50	239±34	119	отрицат.	аномальн.
ббС	20	1	95±4,4	13	отрицат.	аномальн.

а СС₅₀ после 14 суток обработки

Пример 36. Тест на токсичность Ь-бС в отношении ДНК-полимераз человека α, β и γ.

Нуклеозиды и аналоги нуклеозидов обычно метаболизируются внутри клеток с превращением в их ТР-производные. Обычно клеточные ДНК-полимеразы ответственны за нормальный ядерный и митохондриальный синтез и репарацию ДНК. Поскольку ТР-метаболиты являются потенциальными субстратами для ДНК-полимераз, были проведены исследования с целью определить, насколько ингибируются ДНК-полимеразы человека под воздействием Ь-бС-ТР.

Аналог нуклеозида, 3'-амино-3'-дезокситимидин (АМТ) ТР, ингибировал ДНК-полимеразу человека α на 30% при концентрации 10 мкМ. ДНК полимеразы человека β и γ ингибировались под действием ббС-ТР, соответственно, на 50% (5 мкМ) и 35% (2,5 мкМ). Ь-бС-ТР и Ь-би-ТР не оказывали ингибирующего действия на ДНК-полимеразы человека α, β и γ до концентрации 100 мкМ (табл. 28). На основании данных результатов можно предположить, что ТР Ь-бС и Ь-би обладают низкой аффинностью в отношении данных ядерных и митохондриальных ДНК-полимераз человека, что совпадает с благоприятным профилем безопасности Ь-бС, наблюдаемым в условиях ίη νίΐτο и ίη νίνο.

Таблица 28

Влияние Ь-бС-ТР на ДНК-полимеразу вируса гепатита В и ДНК-полимеразы человека α, β и γ

1С50 (мкМ)

Субстрат*	Вирусная ДНКполимераза¹’	ДНКполимераза человека а°	ДНКполимераза человека	ДНКполимераза человека у°
1-бС-ТР	1,82±0,23	>100	>100	>100
Ъ-сШ-ТР	5,26±2,4	>100	>100	>100
Ламивудин-ТР^а	0,50±0,1	>5	1,2	0,01
Ь-ЕТ4А.и-ТР^а	0,15+0,05	>50	>50	>50
Ь-άάΑ-ΤΡ	2,0±0,3	>100	>100	->100

а Каждый ряд данных представляет среднее арифметическое и, где приводится, стандартное отклонение трех независимых опытов.

- 47 005774

Ь ДНК-полимеразы ХУНУ.

с 3'-Амнно-3'-дезокснтимндин ТР ингибировал полимеразу α на 30% при концентрации 10 мкМ; ййС-ТР ингибировал полимеразу β на 50% при концентрации 5 мМ и полимеразу γ на 35% при концентрации 3,5 мкМ.

й Данные по воздействию ламивудина-ТР и Ь-ЕМАЦ-ТР на ДЫК-полимеразу человека приведены из СЬапд е! а1. (13) и Уао е! а1. (14), соответственно.

Пример 37. Токсичность диУа1-Ь-йС в отношении крыс.

Определяли токсичность диУаГЬ-йС при однократном пероральном введении крысам. В опыте в целом участвовало 40 животных (крысы Спрегью-Даули, в возрасте от 6 до 8 недель); десять животных в каждом случае в отдельности (пять самцов и пять самок) произвольно разделяли на получивших однократно перорально диУа1-Ь-йС в одной из трех доз, выбранных из ряда доз в данном исследовании (500, 1000 или 2000 мг/кг) или контрольных животных. За животными наблюдали в течение 15 суток. Наблюдения за животными в клетках на состояние, близкое к гибели, или падеж регистрировали дважды в день. Клинические наблюдения и определение массы тела проводили один раз в день на 1, 8, 14 и 15 сутки. Также на 15 сутки отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей. После завершения обследования на 15 сутки животных усыпляли и подвергали полному патологоанатомическому исследованию, которое включало макроскопическое обследование внешней поверхности тела, всех отверстий и черепной, грудной и брюшной полостей и их содержимого. Также определяли массу тела и отдельных органов и соотношения массы органа-к-массе тела и массы органа-к-массе мозга.

Очевидных признаков токсичности не наблюдали в данном опыте, и не было установлено связанных с лекарством эффектов на массу тела, массу органов, и не обнаруживали клинических патологических признаков. Отсутствовали связанные с лекарством нарушения гематологических или биохимических показателей. Кроме того, отсутствовали в результате воздействия лекарства макроскопические участки поражения при вскрытии. Основываясь на результатах данного опыта, ЫОАЕЬ (недействующая доза) для диУа1-Ь-йС после однократного перорального введения крысам была установлена на уровне 2000 мг/кг.

Пример 38. Токсичность диУа1-Ь-йС в отношении обезьян.

Оценивали потенциальную токсичность диУа1-Ь-йС в пяти возрастающих дозах в отношении синомологичных обезьян. Каждое из четырех животных (два самца и две самки) получали в целом пять доз диУа1-Ь-йС перорально, один раз каждую дозу (20, 100, 500, 1000 и 2000 мг/кг) на 1, 4, 7, 10 и 14 сутки, соответственно. Наблюдения за животными в клетках на состояние, близкое к гибели, или падеж регистрировали дважды в день. Клинические наблюдения проводили ежедневно. Отбирали пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей и массы тела перед обработкой на 1, 4, 7, 10 и 14 сутки и перед вскрытием на 17 сутки. После завершения обследования на 17 сутки всех животных усыпляли и проводили полное патологоанатомическое вскрытие, включая макроскопическое обследование и отбор большинства тканей.

Не было обнаружено связанных с обработкой лекарством аномалий. После введения первой дозы на 1 сутки у каждого животного была установлена потеря массы тела примерно на 0,6 кг. Начиная с 4 суток и в последующие сутки опыта, все животные сохраняли массу тела.

Были отмечены следующие наблюдения по отдельным гематологическим показателям. На 17 сутки снизилось число эритроцитов (ВВС), гемоглобин (НСВ) и гематокрит (НСТ) (примерно на 15-27%), суммарно у всех четырех животных по сравнению со значениями на 1 сутки. Исключение составляло животное № 1001 (самец), на каждой временной точке изменения данных параметров составляли <10% от ранее установленного значения. У животного № 1001 на 4 сутки значения ВВС, НСВ и НСТ снизились примерно на 18% по сравнению со значениями на 1 сутки; следовательно, в целом изменения для данного животного составляли < ±9%. Причина данного первоначального изменения неизвестна, и токсикологическое значение является неопределенным. На 1 сутки число лейкоцитов (ХУВС) было заметно выше у животного № 1101 (самка, 36,3 х 10³ клеток/мл), но к 4 суткам оно снижалось примерно на 55%. Абсолютное количество полиморфоядерных лейкоцитов (АРЬУ) и процент полиморфоядерных лейкоцитов (РЬУ) также снижались (соответственно, на 73 и 40%) к 4 суткам по сравнению с повышенными уровнями на 1 сутки. Изменения колебались в остальные дни опыта. Токсикологическое значение является неопределенным.

Были отмечены следующие наблюдения для отдельных биохимических показателей сыворотки крови. На 17 сутки уровень азота мочевины (ВИЫ) снижался (в целом на ~43%) у всех обезьян по сравнению со значениями на 1 сутки. Данные суммарные изменения находятся в пределах от -39 до +46%. Данные изменения были у всех обезьян в опыте, однако, их токсикологическое значение не ясно.

Основываясь на результатах данного опыта, ЫОАЕЬ для диУа1-Ь-йС после однократного перорального введения обезьянам через желудочный зонд была установлена на уровне 2000 мг/кг.

Пример 39. Токсичность Ь-йС на лесных сурках при введении в течение 28 суток.

Модель хронического гепатита В на лесных сурках является ценной для доклинической токсикологической оценки аналогов нуклеозидов. На данной модели была установлена замедленная тяжелая гепатоцеллюлярная токсичность, индуцированная ЕЬАи, у людей, которую не обнаруживали при проведе

- 48 005774 нии доклинических исследований на грызунах или приматах. Индуцированная РЬАИ токсичность, наблюдаемая на лесных сурках, включающая значительную потерю массы, отказ от корма и гепатоцеллюлярное повреждение, установленное при исследовании биопсийного материала печени, была установлена, начиная с 6-8 недель от начала лечения, и она была аналогичной наблюдаемой у пациентов, зараженных НВУ, при лечении РЬАИ.

Определяли противовирусную активность и безопасность Ь-бС, а также восстановление вируса после лечения на зараженных вирусом гепатита (^НУ) лесных сурках. Новорожденных лесных сурков самцов и самок заражали подкожным введением разбавленной сыворотки носителей \УНУ. и они все были хроническими носителями \УНУ. Произвольно животных (в возрасте 16-18 месяцев) разделяли на сравнимые группы на основе массы тела, активности γ-глютамилтрансферазы (СОТ), пола и концентрации ДНК \УНУ (>10^п геномных эквивалентов/мл сыворотки), что определяли дот-блоттингом.

Трем животным, в каждом случае в отдельности, вводили перорально Ь-бС в дозах 0,01, 0,1, 1,0 или 10,0 мг/кг/день в течение 28 суток. Кроме того, три животных получали ламивудин в дозе 10 мг/кг/день перорально в течение 28 суток. Четырем животным вводили растворитель в качестве контроля по аналогичной схеме. У всех животных прослеживали восстановление \УНУ еще в течение 56 суток после лечения. Пробы крови на содержание ДНК \УНУ отбирали на -7, 0, 3, 7, 14, 21 и 28 сутки, концентрацию ДНК \УНУ также определяли на 1, 3, 7, 14, 28 и 56 сутки после лечения. Концентрацию ДНК \УНУ определяли полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Одновременно фиксировали массу тела и соответственно доводили дозу лекарства. В случае, когда наблюдали признаки токсичности, проводили определение клинических биохимических и гематологических показателей. Проводили патологоанатомическое обследование, включая гистологическое исследование тканей, у одного животного, которое пало во время опыта.

В течение 4-недельного периода лечения или 8-недельного периода после лечения признаков токсичности не наблюдали. Кроме того, не было потери массы тела ни в одной группе, обработанной Ь-бС по сравнению с контрольными животными (фиг. 18). Все животные прибавляли в массе тела аналогично контрольным животным в течение 84-дневного периода опыта. Одно животное (#98051), получавшее препарат в дозе 0,1 мг/кг/день, пало на 8 сутки после окончания лечения. В результате патологоанатомического обследования была обнаружена большая гепатокарцинома (8х5х2 см) в левой латеральной доле печени, и падеж был отнесен за счет опухоли печени. Гепатоцеллюлярные неоплазмы на данной модели обнаруживаются в возрасте 9 месяцев и становятся причиной падежа в возрасте 15 месяцев. Падеж данного животного был отнесен за счет гепатоцеллюлярной карциномы, которая является ожидаемым компонентом естественного протекания ^НУ-инфекции, и он не рассматривался, как связанный с лечением Ь-бС, поскольку отсутствовали признаки, указывающие на то, что токсичность препарата является причиной падежа животного.

Пример 40. Токсичность Ь-бС на лесных сурках при введении в течение 12 недель.

Определяли противовирусную активность и безопасность Ь-бС на лесных сурках. В данном опыте четырем животным, в каждом случае в отдельности, вводили Ь-бС в дозе 1,0 мг/кг/день или растворитель в качестве контроля в течение 12 недель. Еще четыре животных получали Ь-бС вместе с другим аналогом нуклеозидов, Ь-бТ. Произвольно животных разделяли на сравнимые группы по полу, массе и уровням ДНК \УНУ и активности ССТ в сыворотке крови до лечения.

Концентрацию ДНК \УНУ и массу тела определяли на 0, 1, 3, 7, 14, 21, 28, 42, 56 и 84 дни, а также на 7, 14, 21, 28, 42, 56, 70 и 84 дни после лечения. Уровень ДНК \УНУ определяли количественной ПЦР. Соответствующие пробы для определения гематологических, биохимических показателей сыворотки, серологии на \УНУ и биопсийный материал печени отбирали перед лечением и на 84 сутки. Концентрацию лекарства в плазме крови определяли в пробах, отобранных через 2,5 ч после введения на 0; 14 и 84 сутки.

Ь-бС (1 мг/кг/день, перорально) хорошо переносился, и токсичность, связанная с лекарством, не проявлялась в течение 12 недель или в течение 12 недель после лечения. Виремия \УНУ у лесных сурков с хронической инфекцией, подвергнутых лечению Ь-бС в течение 12 недель (1 мг/кг/день, перорально), снижалась на 0,5-1 1од₁₀ к концу 12 недель лечения, аналогично ответной реакции в 28-дневном опыте в этой же дозе. В данное исследование входили дополнительные группы, обработанные Ь-бТ в дозе 1 мг/кг/день, и Ь-бС (1 мг/кг/день) плюс Ь-бТ (1 мг/кг/день), введенные в комбинации. Данная комбинация Ь-бС и Ь-бТ снижала вирусную нагрузку до пределов определения аналогично тому, что наблюдали во время лечения Ь-бС или Ь-бТ в дозе 10 мг/кг/день в 28-дневном опыте. Отсутствовало различие в массе тела между животными в группах, обработанных Ь-бС, и контрольной группой (см. фиг. 19). Одно животное в контрольной группе пало на 8 неделе; при вскрытии выявленной причиной смерти стала дегенерация и разрыв аорты. Хотя это и необычно, спонтанный разрыв восходящей части аорты наблюдался у незараженных и зараженных \УНУ лесных сурков. Масса у всех животных несколько снижалась в течение 24-недельного периода опыта. В предшествующем опыте было установлено, что данное незначительное снижение массы имело место за счет впадания в зимнюю спячку (В.ТеппапЬ ЬУМ; МагтоШесН. 1пс.). Биохимические показатели сыворотки крови и гематологические параметры у всех животных были

- 49 005774 в нормальных пределах перед и через 12 недель опыта. Во всех группах гистоморфология ткани печени, что оценивали микроскопией, была в норме. Отсутствовали признаки жирового изменения (микровезикулярный стеатоз).

Пример 41. Токсикокинетика многократных доз диУа1-Ь-бС на синомологичных обезьянах.

Определяли потенциальную токсичность и фармакокинетику диУа1-Ь-бС после перорального введения в течение 25 суток синомологичным обезьянам. Восемь животных (четыре самца и четыре самки) произвольно разделяли для введения диУа1-Ь-бС перорально в одной из трех доз (500, 1000 и 2000 мг/кг) или растворителя в качестве контроля один раз в день в течение 25 суток (общее N = 32). Наблюдения за животными в клетках на состояние, близкое к гибели, и падеж регистрировали дважды в день, и клинические наблюдения проводили один раз в день. Массу тела определяли перед обработкой, на 1, 8, 15 и 25 сутки и перед умерщвлением на 26 сутки. Потребление корма фиксировали ежедневно и выражали в среднем за неделю. Физические и офтальмологические обследования и анализ мочи проводили перед обработкой и при вскрытии. По завершении обследований на 26 сутки всех животных подвергали эвтаназии и полному патологоанатомическому обследованию, которое включало макроскопическое исследование внешней поверхности тела, всех отверстий и черепной, грудной и брюшной полостей и их содержимого. Также определяли массу тела и отдельных органов и соотношение массы органов к массе тела и массу органов к массе мозга. Полученные при полном патологоанатомическом вскрытии ткани оценивал гистоморфологически дипломированный ветеринарный патологоанатом.

A. Масса тела.

Все животные либо сохраняли, либо прибавляли в массе тела во время опыта, за исключением животных № 2002 (группа с дозой 500 мг/кг) и 4001 и 4003 (группа с дозой 2000 мг/кг), у которых наблюдали потерю массы тела на 0,1 кг на 25 сутки (по сравнению с 1 сутками). Статистически значимые различия между самцами в контрольной группе и самцами в обработанных диУа1-Ь-бС группах не были отнесены за счет проявления токсичности, поскольку средняя масса тела у контрольных животных перед началом опыта была выше по сравнению со средней массой в группах, подвергнутых обработке, на 0,130,25 кг.

B. Потребление корма.

В течение опыта у всех животных сохранялось адекватное потребление корма с ожидаемой вариабельностью. Среднее потребление печенья было меньше, чем у контрольных самцов, в группе самцов, получавших лекарство в дозе 500 мг/кг на 8/9; 15/16 и 16/17 сутки; в группе самцов с дозой 1000 мг/кг на 24/25 сутки и в группе самцов с дозой 2000 мг/кг на 8/9, 15/16, 16/17, 20/21 и 23/24 сутки. Небольшим только отличием, отмеченным у самок, было снижение потребления корма в группе самок, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг на 7/8 сутки. Данные различия не рассматриваются, как проявление токсичности.

C. Клиническая патология.

Гематология. На 1 сутки перед началом обработки отсутствовали различия между контрольными и опытными группами по всем гематологическим параметрам. На 26 сутки был отмечен ряд статистически достоверных различий по показателям, касающимся эритроцитов, включая пониженное число эритроцитов (ВВС) (у всех обработанных самок), пониженный гемоглобин (НСВ) (у всех обработанных самцов) и сниженный гематокрит (НСТ) (у животных опытных групп обоего пола). У самцов также отмечали пониженное ВВС, но различия не носили статистически значимый характер. Концентрация гемоглобина была также ниже у обработанных самок, но это не было статически достоверным. По сравнению с 1 сутками ВВС, НСВ и НСТ снижались на 26 сутки у контрольных и обработанных диУа1-Ь-бС самцов и самок. Однако относительные снижения, наблюдаемые у контрольных животных, были меньше, чем отмеченные у животных, получавших диУа1-Ь-бС. Данные результаты указывают на наличие клинической негемолитической анемии, однако, зависимость ответной реакции от дозы была минимальной и на основании гистопатологической оценки было высказано предположение, что за этот эффект был ответственен костный мозг. Следовательно, маловероятны какие-либо прогрессирующие или долговременные эффекты.

Для лейкоцитов имело место снижение абсолютного числа полиморфоядерных лейкоцитов (АРЬУ) (в группах самок, получавших лекарство в дозах 500 мг/кг и 1000 мг/кг, и в группах самцов и самок с дозой 2000 мг/кг), пониженный процент полиморфоядерных лейкоцитов (РЬУ) (в группах самок, получавших лекарство в дозах 1000 мг/кг и 2000 мг/кг) и повышенный процент лимфоцитов (ЬУМ) (в группе самцов с дозой 2000 мг/кг и группах самок с дозами 1000 мг/кг и 2000 мг/кг).

Биохимические показатели сыворотки крови. Средние значения активности щелочной фосфатазы (АЬК) для всех обработанных самцов были значимо ниже по сравнению со средним значением АЬК в контрольной группе на 26 сутки. Также были повышены средние значения концентрации глобулина (СЬОВ) и кальция (САЬ) в группе самцов с введением лекарства в дозе 2000 мг/кг на 26 сутки. Данные изменения не рассматривались, как клинически значимые. Средние показатели уровня калия (К) были выше у самцов, получавших лекарства в дозах 1000 и 2000 мг/кг, по сравнению с контрольной группой, и это можно отнести за счет негемолитической анемии, имеющей место в данных опытных группах. У самок на 26 сутки изменения каких-либо биохимических показателей сыворотки крови отсутствовали.

- 50 005774

Анализ мочи. Среднее значение рН мочи было несколько ниже в группе самцов, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг, и в группе самок с дозами 1000 и 2000 мг/кг, но различия не носили статистически значимый характер. Заслуживает внимания и совпадает с подкислением мочи отсутствие кристаллов в моче в группах самцов и самок с самой высокой дозой лекарства.

Ό. Массы органов.

Статистически значимое падение массы органов отмечали для легких (абсолютная) в группах самцов при дозах 1000 и 2000 мг/кг и относительной массы тимуса (тимус: мозг) в группе самцов при дозе 2000 мг/кг. Однако данные различия не рассматривались, как проявление токсичности.

Е. Патологоанатомические исследования.

Макроскопические. Макроскопические данные, которые можно было бы интерпретировать, как относящиеся к введению диУа1-Б-бС, отсутствовали. Результаты макроскопических исследований были типичными, как обычно присутствующие в качестве случайных у приматов, не относящихся к человеку.

Микроскопические. Атрофия тимуса была единственным микроскопическим признаком, который можно было бы интерпретировать в качестве относящегося к воздействию лекарства. Частота и выраженность атрофии тимуса возрастала в группах самцов и самок, которым лекарство вводили в дозах 1000 и 2000 мг/кг, но это отсутствовало в группе животных с дозой 500 мг/кг. Однако клиническую значимость атрофии тимуса сочли сомнительной. Зависимость реакции от дозы была низкой, это воздействие отмечали не у всех самцов в группах с дозой 1000 мг/кг и 2000 мг/кг, и обычно атрофия тимуса проявляется у приматов с возрастом. Другими микроскопическими признаками, отмеченными в данном опыте, были незначительные воспалительные или дегенеративные изменения обычного типа и частоты, наблюдаемые у приматов в этом возрасте.

Токсикокинетика. Пробы крови для определения гематологических и биохимических показателей сыворотки отбирали на 1 сутки перед обработкой и перед убоем на 26 сутки. Пробы крови отбирали для фармакокинетических исследований на 25 сутки от каждого животного в следующие периоды времени после введения: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 и 24 ч. Из крови готовили плазму и анализировали на содержание диУа1-Ь-бС и трех метаболитов: Ь-бС, Ь-бИ и частично деэтерифицированной формы диУа1-Ь-бС, β-2'дезоксицитидин-5'-валинового эфира. Количественно можно было определить только Ь-бС и β-2'дезоксицитидин-5'-валиновый эфир. Средние данные по показателю концентрация-время для групп с дозами 1000 и 2000 мг/кг подвергали некомпонентному фармакокинетическому анализу с использованием \νίηΝοπ1ίπ 1,5 (модель 200). Анализ по группе с дозой 500 мг/кг находится в работе.

Концентрация β-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира в плазме крови на 25 сутки достигала максимальных значений (С_тах) через 1 ч (среднее значение Т_тах) после перорального введения диУа1-Ь-бС по сравнению со средним значением Т_тах, равным 2-4 ч для Ь-бС. Однако значения С_тах для β-2'дезоксицитидин-5'-валинового эфира были примерно на 2 порядка ниже, чем для Ь-бС. После достижения С_тах концентрация Ь-бС снижалась выраженным биэкспоненциальным образом для каждой группы. Установленные средние значения периода полураспада в терминальной фазе составляли примерно 4-5 ч для самцов и самок в группах с обеими дозами. Однако данные значения периода полураспада следует рассматривать в качестве минимальных значений, поскольку большая часть индивидуальных значений основывалась на данных от 6 до 12 ч после введения, в периоде времени, при котором терминальные фазы не могут быть полностью охарактеризованы. Средние значения концентрации β-2'-дезоксицитидин-5'валинового эфира также снижались после достижения С_макс, но терминальные фазы не были адекватно определены для установления периода полураспада.

Средние значения С_тах для Ь-бС и β-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира были аналогичны для самцов и самок в группах с каждой дозой, за исключением самцов, получавших лекарство в дозе 1000 мг/кг, у которых они были ниже наполовину по сравнению с самцами с дозой 2000 мг/кг. Следовательно, оказалось, что С_тах возрастала с дозой только у самцов, получавших лекарство в дозе 1000 мг/кг.

Сравнение ЛИС_1а81 для Б-бЭ у самцов и самок было аналогичным таковым, отмеченным для С_тах У самцов в группе с дозой 1000 мг/кг, у которых значения были ниже примерно наполовину, чем ЛИС_1а81 у самцов с дозой 2000 мг/кг. Сравнение значений ЛИС_1а81 β-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира показало отсутствие половых различий и оказалось, что ЛИС_1а81 возрастала прямо пропорционально увеличению доз.

На основании данных можно предположить, что при пероральном введении диУа1-Б-бС быстро превращается в деэтерифицированную форму диУа1-Б-бС, β-2'-дезоксицитидин-5'-валиновый эфир и затем Ь-бС, но в целом воздействие в 100 раз выше для Ь-бС, чем для β-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира. Воздействие в целом метаболита β-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира, по-видимому, возрастает примерно в линейной зависимости с увеличением дозы.

Обобщенные данные токсикокинетических исследований представлены в табл. 29.

- 51 005774

Таблица 29 Фармакокинетический анализ многократных доз диУа1-Ь-бС при пероральном введении в дозах 1000 и 2000 мг/кг на обезьянах

Фармакокинетический параметр¹

за /кг/давь]	Пол	(п)	Ст-, (иг/мв)	Т1И·»		<41 АиС1ж,с (иг-ч/кк)	лис {КГ^ч/м·)	(ч>
						ь-ас
1000	самцы	(4)	66,7	2	12	273	295	4,1
			(±29,1)			(±107)	(±110)	(±1,8)
1000	самки	(4)	106	2	12	429	468	3,7
			(±39)			(±19)	(ΝΑ)	(ΝΑ)
2000	самцы	(4)	116	4	12	668	726	3,8
			(±13)			(±127)	(±114)	(±1,3)
2000	самки	(4)	103	2	24	567	598	5,1
			(±12)			(±208)	(±220)	(±1/7)

¹ Средние значения (± стандартное отклонение) на 25 сутки ² η=4 для всех параметров как для Ь-бС, так и Р-Р.-2'-дез,оксицитидин-5'-валиновово эфира, за исключением группы самок, которым вводили дозу 2000 мг/кг, для которых η=3, и для ЛИС и 1½ для группы самок с дозой 1000 мг/кг, где η=2 за счет неадекватной характеристики терминальной фазы ³ Срединные (в большей мере, чем средние) значения представлены для Т_тах и Т_Ь|к1

NЛ = не применимо

Ш = недостаточно данных для определения терминальной фазы для всех животных

Фармакокинетический параметр¹

Доза (мг/хг/мо)	Пол	(П)	С™ (кг/кя)		<Ч)	АиС_1а,_с(хг-ч/нд)	лис <№~Ч/МП)	1*4 (ч)
			р-Ь-2'	-деЗОксицитидин-5'-валиновый эфир
1000	самцы	(4)	0,624	1	5	1, 46	ДО	ю
1000	самки	(4)	(±0,273) 1,23	1	4	(±0,45) 1, 90	ΙΌ	ю
2000	самцы	(4)	(±0,25) 1,64	1	10	(±0,41) 3,66	ΙΟ	ю
2000	самки	(4)	(±0,42) 1,29	1	8	(±0,88) 3,67	Ю	ю
			(±0,28)			(±0,42).

Пример 42. Токсикокинетика диУа1-Ь-бС при многократном введении на крысах.

Определяли потенциальную токсичность и фармакокинетику диУа1-Ь-бС после перорального введения в течение 28 суток крысам. Двадцать животных (10 самцов и 10 самок) произвольно разделили для введения диУа1-Ь-бС перорально одной из трех доз (500, 1000 и 2000 мг/кг) или растворителя в качестве контроля один раз в день в течение 28 суток. Наблюдения за животными в клетках на состояние, близкое к гибели, и падеж регистрировали дважды в день, и клинические наблюдения проводили один раз в день. Массу тела определяли перед обработкой на 1, 8, 15, 22 и 28 сутки и перед умерщвлением на 29 сутки. Потребление корма фиксировали ежедневно и выражали в среднем за неделю. Физические и офтальмологические обследования и анализ мочи проводили перед обработкой и при вскрытии. По завершении обследований на 29 сутки всех животных подвергали эвтаназии и полному патологоанатомическому обследованию, которое включало макроскопическое исследование внешней поверхности тела, всех отверстий и черепной, грудной и брюшной полостей и их содержимого. Также определяли массу тела и отдельных органов и соотношение массы органов к массе тела и массы органов к массе мозга. Полученные при полном патологоанатомическом вскрытии ткани оценивал гистоморфологически дипломированный ветеринарный патологоанатом.

A. Масса тела.

Средние значения массы тела в группе самцов, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг, были достоверно ниже на 22 и 28 сутки по сравнению со средним значением в контрольной группе самцов. Среднее значение массы тела в группе самок с дозой 2000 мг/кг на 28 сутки было также достоверно ниже, чем среднее значение у самок контрольной группы.

B. Потребление корма.

Потребление корма было снижено в группе самцов с дозой 2000 мг/кг в течение всего опыта. Также потребление корма в группе самцов, получавших лекарство в дозе 1000 мг/кг, в течение третьей недели опыта было достоверно ниже по сравнению с контрольной группой самцов. Потребление корма было достоверно ниже у самок, которым лекарство вводили в дозах 1000 и 2000 мг/кг в течение второй, третьей и четвертой недель опыта.

- 52 005774

С. Клиническая патология.

Гематология. На 29 сутки был отмечен ряд статистически достоверных различий по показателям, касающимся эритроцитов. Число эритроцитов (КВС) было достоверно ниже у самцов и самок при всех трех дозах (500, 1000 и 2000 мг/кг). Уровень гемоглобина (НОВ) снижался в группе самцов, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг, и в группе самок с дозой 1000 мг/кг и в группе самок с дозой 2000 мг/кг. Было отмечено снижение гематокрита (НСТ) в группах самцов и самок, которым лекарство вводили в дозе 1000 и 2000 мг/кг. Средний объем клеток (ΜΕν) был достоверно выше в группах самцов с дозами 500, 1000 и 2000 мг/кг и в группах самок с дозами 500 и 1000 мг/кг. Среднее содержание гемоглобина (МСН) в клетках было достоверно выше в группах самцов и самок, получавших лекарство в дозах 500, 1000 и 2000 мг/кг. Средняя концентрация гемоглобина в клетках (МСНС) была повышена у самок при дозе 1000 мг/кг. Число эритроцитов с ядрами (ИКС; абсолютное и относительное) снижалось у самцов при дозах 1000 и 2000 мг/кг и повышалось у самок при дозе 2000 мг/кг. Данные изменения указывали на умеренную ответную анемию, связанную с обработкой лекарством.

Число лейкоцитов (^ВС) снижалось у самцов, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг. Имело место снижение числа моноцитов (ΜNО; абсолютного и процентного) в группе самцов с дозой 2000 мг/кг. Повышалось число тромбоцитов у самцов при дозе 2000 мг/кг. Однако данные изменения в количественном отношении были незначительными, и их токсикологическое значение является неопределенным.

Биохимические показатели сыворотки крови. Средняя концентрация глобулина (СЬОВ) снижалась в группе самцов, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг, и в группе самок с дозой 1000 мг/кг на 29 сутки. Соотношение альбумин/глобулин было выше в группах самцов, которым лекарство вводили в дозах 1000 и 2000 мг/кг, и в группе самок при дозе 1000 мг/кг. Активность щелочной фосфатазы (АЬК) была выше в группе самок с дозой 500 мг/кг. Уровень холестерина (СНОЬ) повышался у самок при дозе 1000 мг/кг. Данные незначительные изменения не носили зависимые от дозы характер или тенденции, на основании чего можно предположить, что они не являются проявлением токсичности лекарства.

Ό. Массы органов.

Достоверное снижение абсолютных значений массы органов было отмечено для легких (группы самцов и самок с дозой 2000 мг/кг) и тимуса (группа самцов с дозой 2000 мг/кг, группа самок с дозой 1000 мг/кг и группа самок с дозой 2000 мг/кг). Также статистически достоверным было снижение средней абсолютной массы простаты и семенных пузырьков в группе самцов, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг. Среднее абсолютное значение массы сердца было снижено в группах самок при дозе 1000 мг/кг и 2000 мг/кг. Средняя масса слюнных желез снижалась в группе самок при дозе 2000 мг/кг. Средняя масса селезенки была повышена в группе самок, которым лекарство вводили в дозе 2000 мг/кг.

Относительные (к массе тела) изменения массы органов включали повышенную массу мозга в группах самцов и самок при дозе 2000 мг/кг. Также было отмечено увеличение средней массы семенников в группах самцов, получавших лекарство в дозах 1000 и 2000 мг/кг. Относительная масса тимуса была понижена в группе самцов с дозой 2000 мг/кг и в группе самок с дозой 1000 и 2000 мг/кг. Средняя относительная масса селезенки повышалась в группе самок с дозой 2000 мг/кг.

Также относительные (к массе мозга) изменения массы органов включали пониженную относительную массу легких в группе самцов, которым лекарство вводили в дозе 2000 мг/кг. Относительная масса тимуса снижалась в группах самцов и самок с дозой 1000 и 2000 мг/кг. Относительная средняя масса простаты и семенных пузырьков была также ниже в группе самцов с дозой 2000 мг/кг. Средняя относительная масса сердца уменьшалась в группе самок, получавших лекарство в дозе 2000 мг/кг, как и средняя относительная масса слюнных желез. Относительная средняя масса селезенки увеличивалась в группе самок при дозе 2000 мг/кг.

Снижение массы органов (тимуса, легких, сердца, слюнных желез, простаты, семенных пузырьков и мозга) рассматривались, как вторичные по отношению к общей потере массы тела, имеющей место в группах животных, которым лекарство вводили в дозах 1000 и 2000 мг/кг. Атрофия тимуса, которую наблюдали при микроскопических исследованиях в группах животных с дозой 1000 и 2000 мг/кг, совпадала с пониженной массой тимуса. Для других тканей с пониженной массой совпадения с результатами микроскопии отсутствовали. Повышенную массу селезенки можно рассматривать, как следствие эритропоэтической активности, наблюдаемой при микроскопии.

Е. Патологоанатомические исследования.

Микроскопические. Частота атрофии тимуса и некроза лимфоидной ткани была выше в группах животных, которым лекарство вводили в дозах 1000 и 2000 мг/кг, но данные изменения отсутствовали при дозе 500 мг/кг. Однако клиническую значимость атрофии тимуса и некроза лимфоидной ткани можно рассматривать, как сомнительную, поскольку зависимость ответной реакции от дозы была незначительной. Также подобные изменения тимуса часто присутствуют в качестве неспецифических изменений у животных, подвергнутых стрессу различными факторами, и в данном опыте наблюдали достоверное снижение массы тела в группах животных, получавших лекарство в дозах 1000 и 2000 мг/кг.

В группах самцов и самок, которым лекарство вводили в дозах 1000 и 2000 мг/кг, был повышен эритропоэз в достаточной степени по сравнению с контролем, но селезенка в группе животных с дозой 500 мг/кг не отличалась от контроля. Гематопоэз в печени повышался в группе самцов и самок с дозой

- 53 005774

2000 мг/кг в достаточной степени по сравнению с контролем, но состояние печени в группах животных, которым лекарство вводили в дозах 500 и 1000 мг/кг, было аналогичным таковому у контрольных животных. В группах самцов и самок с дозой 2000 мг/кг наблюдали гиперплазию в грудинном костном мозге. Эритропоэз в селезенке, повышенный гематопоэз в печени и гиперплазия в костном мозге, все рассматривались, как ожидаемые и соответствующие ответные реакции на умеренную анемию, наблюдаемую по результатам гематологических исследований. Данные результаты подтверждают ответный характер анемии во время продолжительного введения лекарства.

В данном опыте имело место несколько других микроскопических изменений. Наиболее часто отмечали незначительные воспалительные и дегенеративные изменения обычного типа и частоты, наблюдаемые у грызунов в опытах с пероральным введением.

Токсикокинетика. У 54 дополнительных животных (27 самцов и 27 самок) отбирали пробы крови для фармакокинетических исследований на 1 и 28 сутки. В оба дня пробы отбирали в шестую из шести временных точек (у двух животных на каждую временную точку): 0,5, 1, 2, 4, 8 и 24 ч после введения. Из крови готовили плазму и анализировали на содержание диУа1-Ь-бС и трех метаболитов: Ь-бС, Ь-бИ и частично деэтерифицированной формы диУа1-Ь-бС, β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира.

Количественно можно было определять только Ь-бС и β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валиновый эфир. Средние данные по показателю концентрация-время для групп с дозами 1000 и 2000 мг/кг подвергали некомпонентному фармакокинетическому анализу с использованием \νίηΝοη1ίη 1,5 (модель 200). Анализ по группе с дозой 500 мг/кг находится в работе.

Средняя концентрация метаболита, Ь-бС в плазме достигала максимальных значений (С_тах) через 2 ч после введения (Т_тах) в группе с дозой 1000 мг/кг и через 1-4 ч после введения в группе с дозой 2000 мг/кг. Средние значения С_тах у самцов и самок были сравнимыми в каждой из групп с введением лекарства в дозах 1000 и 2000 мг/кг и были аналогичными на 28 сутки по сравнению с 1 сутками в обеих группах. В большинстве случаев значение С_тах увеличивалось с дозой, но степень увеличения была различной. После достижения С_тах концентрация Ь-бС снижалась выраженным биэкспоненциальным образом для каждой группы. Установленные средние значения периода полураспада в терминальной фазе в группе с введением дозы 1000 мг/кг (9-17 ч) были выше по сравнению с группой 2000 мг/кг (6-8 ч), но значения периода полураспада следует интерпретировать с осторожностью. Для установления периода полураспада необходимо использование только трех точек данных, и данные колебались. Также одна из трех использованных точек данных составляла точку 4 ч, в данное время терминальную фазу установить невозможно. Т|_гЫ для концентраций Ь-бС имело место через 24 ч. Значения АЬС|,_Ы были сравнимы для самцов и самок в каждой группе и значительно не различались на 28 сутки по сравнению с 1 сутками. Несмотря на то, что С_тах для Ь-бС постоянно не возрастала с увеличением дозы диУа1-Ь-бС, как указывалось выше, АЬС₁₍._Ы для Ь-бС увеличивалась с диУа1-Ь-бС, как оказалось, почти пропорционально дозе.

Средние концентрации β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира в плазме достигали максимальных значений (Стах) через 1-2 ч после введения (Ттах). Средние значения Стах для самцов и самок были одинаковыми в группе с каждой дозой с тенденцией к более высоким величинам у самок. Значения Стах были примерно на 14-50% выше для самок на 1 сутки и 28 сутки, за исключением самок в группе с дозой 2000 мг/кг, где значения С_тах β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира были примерно на 164% выше по сравнению с самцами на 28 сутки. При сравнении значений по полу Стах на 28 сутки была аналогичной 1 суткам, за исключением самок в группе с введением лекарства в дозе 2000 мг/кг, у которых значения С_тах были на 130% выше на 28 сутки по сравнению с 1 сутками. В каждом случае С_тах возрастало с дозой, но при коэффициенте, который, как правило, был ниже, чем это имело бы место при прямо пропорциональной зависимости от дозы.

Кажущаяся терминальная фаза элиминирования β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира не была хорошо охарактеризована и, следовательно, периоды полураспада не приводятся. Т_1гЫ для концентраций β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира имел место через 4-8 ч после введения в группе с дозой 1000 мг/кг и через 8-24 ч для группы с дозой 2000 мг/кг. Как уже отмечалось для С_тах, АЬС_1нл1 было выше на 25-50% для самок по сравнению с самцами. Значение АЬС_1нл1 было несколько выше на 28 сутки по сравнению с 1 сутками как для самцов, так и для самок (на 30-62%). АИСш возрастало с дозой в зависимости, которая оказалась примерно прямо пропорциональной дозе.

На основании этих данных можно предположить, что как Ь-бС, так и β-^-2'-дезоксицитидин-5'валиновый эфир, попадали в кровяное русло довольно быстро. Воздействие в целом, при оценке по Стах, было в 10-40 раз выше для Ь-бС по сравнению с β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валиновым эфиром, и в 35-80 раз выше при оценке по АИСш. Воздействие увеличивалось пропорционально дозе в пределах доз 10002000 мг/кг/день. В целом воздействие на 29 сутки Ь-бС было сравнимо с наблюдаемым на 1 сутки, в то время как воздействие β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валинового эфира, в основном, было выше на 28 сутки, на основании чего можно предположить, что β-^-2'-дезоксицитидин-5'-валиновый эфир может накапливаться во время многократного введения.

Обобщенные данные токсикокинетических исследований представлены в табл. 30.

- 54 005774

Таблица 30 Фармакокинетический анализ однократной и многократных доз диУа1-Ь-бС при пероральном введении в дозах 1000 мг/кг и 2000 мг/кг на крысах

Фармакокинетический параметр¹_______________________

Доза Сутки Пол С___ Т___ Т1_ав1 АОС1_Дае лис £4 (иг/кг/диь)(мг/мя)(ч){мг-ч/мй) (нг-ч/мп)<ч)

	ь-ас
1000	1	самцы	33, 6	2	24	255	363	17, 3
1000	1	самки	48,5	2	24	239	279	9,4
1000	28	самцы	52, 9	2	24	254	334	12, 9
1000	28	самки	46,6	2	24	239	277	8,8
2000	1	самцы	70, 9	2	24	700	478	5, 8
2000	28	самки	59, 4	2	24	461	487	5,6
2000	23	самцы	51, 1	4	24	500	550	ΝΑ
2000	28	самки	77,7	1	24	578	561	8,5
			₽-Ъ-2'	-дезоксицитидин-5'	-валиновый эфир
1000	1	самцы	1,31	1	4	2,81	ΙΟ	ΙΟ
1000	1	самки	1,70	2	4	4,07	и	Ю
1000	28	самцы	1, 32	2	8	3,96	ю	Ю
1000	28	самки	1,97	2	4	5, 36	ΙΟ	Ю
2000	1	гмтм	2,38	2	8	8,09	ю	Ю
2000	1	самки	2,71	2	8	10,2	ю	Ю
2000	28	самцы	2,36	1	8	11,0	ΙΟ	ю
2000	28	самки	6,24	2	24	16, 5	ΙΌ	ю

NА = не применимо; терминальная фаза не была адекватно охарактеризована Ш = недостаточно данных для определения терминальной фазы для всех животных

Пример 43. Оценка на мутагенную активность на 8. Ινρΐιίιηιιπιιιη и Е. сой (генотоксичность).

При пероральном введении диУа1-Ь-бС животным он быстро превращается в Ь-бС с появлением высоких концентраций Ь-бС в плазме крови и не детектируемых для диУа1-Ь-бС. Следовательно, исследования по оценке на мутагенную активность ίη νίίτο проводили с использованием Ь-бС. Данное исследование проводили в соответствии с указаниями БИА СЬР. Ь-бС тестировали на его потенциальную способность вызывать мутации в гистидиновом опероне штаммов 8а1топе11а 1урЫтитшт ТА98, ТА100, ТА1535 и ТА1537 и в триптофановом опероне штамма ЕксйейсЫа сой \УР2иугА. Тестировали Ь-бС при концентрациях 50, 100, 500, 1000 и 5000 мг/чашка плюс положительный и отрицательный контроли. Тест-штамм подвергали воздействию Ь-бС или контролей в отсутствие экзогенной активации и в присутствии индуцированного экстракта печени крысы 8-9 плюс экзофакторы. После инкубации примерно в течение 68 ч Ь-бС и контроли оценивали на число ревертантов на чашку и целостность фонового газона микроколоний.

Как отрицательный, так и положительный контроли соответствовали требованиям теста. Результаты как основного, так и подтверждающего тестов указывали на то, что Ь-бС не индуцировал статистически значимое увеличение числа ревертантных колоний у какого-либо тест-штамма в присутствии и в отсутствие индуцированного экстракта печени крысы 8-9. Основываясь на результатах этого опыта, было сделано заключение, что отсутствовали доказательства мутагенного действия Ь-бС в тестах на 8. 1ур1ититшт или Е. сой при концентрациях до 5000 мг/чашка.

Пример 44. Тест хромосомных аберраций.

При пероральном введении диУаТЬ-бС животным он быстро превращается в Ь-бС с появлением высоких концентраций Ь-бС в плазме крови и не детектируемых для диУаТЬ-бС. Следовательно, исследования по оценке на мутагенную активность ίη νίύΌ проводили с использованием Ь-бС. Данное исследование проводили в соответствии с указаниями БОА СБР. Ь-бС тестировали на его потенциальную способность вызывать хромосомные аберрации в культивируемых клетках СНО. В основном тесте Ь-бС при концентрациях 100, 500, 1000 и 5000 мг/мл и положительные, и отрицательные контроли тестировали с и без метаболической активации. После непрерывной обработки в течение 18 ч определяли токсичность по снижению относительного роста клеток (ЯСС) и относительному митотическому индексу (ЯМ1). Основываясь на значениях ЯСС и ЯМ1, хромосомные аберрации оценивали в баллах при трех наиболее высоких концентрациях (500, 1000 и 5000 мг/мл). Из каждой параллельной культуры при каждой концентрации (включая положительный и отрицательный контроли) просматривали сто метафаз.

Подтверждающий тест проводили без активации только с Ь-бС при концентрациях 1,0, 10, 100, 500, 1000 и 5000 мг/мл. После непрерывной обработки в течение 18 ч определяли снижение ЯСС и ЯМ1. Основываясь на значениях ЯСС и ЯМ1, хромосомные аберрации оценивали в баллах при трех наиболее высоких концентрациях (500, 1000 и 5000 мг/мл). Из каждой параллельной культуры при каждой концентрации (включая положительный и отрицательный контроли) просматривали сто метафаз.

Результаты как основного, так и подтверждающего тестов указывали на то, что Ь-бС не индуцировал статистически значимое увеличение (определяли как р-значение £0,05 по тесту СЫ-кдиате) процента

- 55 005774 клеток с аберрациями при любой из тестированных концентраций как с, так и без метаболической активации по сравнению с растворителем в качестве контроля. Основываясь на результатах данного опыта, было сделано заключение, что отсутствовали доказательства наличия хромосомных аберраций в тесте на СНО после воздействия Ь-бС при концентрациях до 5000 мг/мл, и Ь-бС не рассматривается в качестве кластогенного агента.

Пример 45. Микроядерный тест на мышах.

При пероральном введении диУа1-Ь-бС животным он быстро превращается в Ь-бС с появлением высоких концентраций Ь-бС в плазме крови и не детектируемых для диУа1-Ь-бС. Следовательно, исследования по оценке на мутагенную активность ίη νίίτο проводили с использованием Ь-бС. Данное исследование проводили в соответствии с указаниями ΕΌΆ СЬР. С учетом того, что биодоступность при пероральном введении у грызунов составляет 10-20% (см. РЬагтасо1о§у апб Тох1со1о§у, 8ес1юп 8.1.7.3), воздействие Ь-бС (в дозе 2000 мг/кг) будет достигать или превышать 400 мг/кг. Данный уровень воздействия будет превышать предполагаемый уровень воздействия у людей в 20-50 раз.

Ь-бС тестировали на его потенциальную способность вызывать появление полихромных эритроцитов с микроядрами (МРСЕ) в клетках костного мозга мышей самцов и самок. Тестировали Ь-бС при концентрациях 500, 1000 и 2000 мг/кг и положительный и отрицательный контроли. Изучаемые лекарства вводили перорально в однократной дозе. Проводили два сбора клеток примерно через 24 и 48 ч после введения Ь-бС или отрицательного контроля, и один сбор клеток примерно через 24 ч после введения положительного контроля. Использовали по пять самцов и пять самок мышей на каждую дозу на время сбора клеток. В каждой временной точке определяли процент полихромных эритроцитов (РСЕ) и частоту появления МРСЕ.

Результаты данного теста указывали на отсутствие статистически значимого увеличения (определяли как р-значение £0,025 в тесте Стьюдента) числа МРСЕ в любую временную точку при любой дозе ЬбС по сравнению с отрицательным контролем. Снижение более чем на 20%, по сравнению с растворителем в качестве контроля, процента РСЕ как показателя токсичности наблюдали в каждой тестированной дозе при экспозиции 24 ч у мышей обоего пола (от -30,5% до -43,1% для самцов и от -26,1% до -32,2% для самок). Снижение также указывает на соответствующее воздействие тестируемого лекарства на ткань-мишень. Однако данное снижение более чем на 20% не наблюдали ни в одной дозе через 48 ч экспозиции у мышей обоего пола.

Результаты данного опыта указывают, что в условиях теста и соответственно критериям, установленным для оценки результатов теста, Ь-бС давал отрицательный ответ в микроядерном тесте на самцах и самках в дозах до 2000 мг/кг.

Пример 46. Суммарное заключение по результатам токсикологических исследований.

Для оценки цитотоксичности Ь-бС и любых клеточных метаболитов использовали общепринятые тесты на клетках. Ь-бС не был цитотоксичным (50% цитотоксическая концентрация, СС₅₀, >2000 мкМ) на линии клеток гепатомы человека 2.2.15, которая обычно используется для определения активности против 1-1ВУ потенциальных противовирусных агентов. Ь-бС не был токсичным для моноядерных клеток периферической крови человека (РВМС; СС₅₀ >100 мкМ) и клеток-предшественников костного мозга человека (50% ингибирующая концентрация, 1С₅₀, >10 мкМ в гранулоцитарно-макрофагальных колониеобразующих единицах (КОЕ-ГМ) и эритроидных бурстобразующих единицах (БОЕ-Е)).

Таблица 31 Цитотоксичность Ь-бС ίη νίΙΐΌ

Клеточная линия³ СС_5О ^Ь (мМ)

2.2.15°	>2000
РВМС⁰	>200
НГГ^с'^е	>100
Оаис11^с'^е	>50
моск^ь	>100
СУ-I^е	>100
МА-104^с	>100

^а РВМС, моноядерные клетки периферической крови; I ПТ. форескин фибробласты человека; В-клеточная лимфома Дауди, Буркитта; МБСК, собачьи почечные эпителиальные клетки; СУ-1, почечные фибробласты африканской зеленой мартышки: МА-104, почечные эпителиальные клетки макаки резус ^Ь СС₅₀ = 50% цитотоксическая концентрация; '>' указывает, что СС₅₀ не была достигнута при наиболее высокой тестируемой концентрации лекарства ^с ΝΙΗ, исследовательская программа по противовирусным и антимикробным препаратам ^б Я. 8с11та/н Етогу ШАекку, Vеΐе^аη8 ΛΐΊίΐίιτ Меб1са1 Сеи1ег ^е Результаты представлены в мкг/мл в большей степени, чем в мкМ

Кроме того, Ь-бС не был цитотоксичным для других многочисленных клеточных линий человека и других млекопитающих. Не было отмечено существенных изменений функции, морфологии и содержания ДНК в митохондриях, и отсутствовало накопление молочной кислоты в обработанных Ь-бС гепато

- 56 005774 цитах (1С₅₀ >10 мкМ). Трифосфатная форма Б-йС не оказывала ингибирующего действия на ДНКполимеразы человека α, β и γ до концентраций 100 мкМ.

В исследованиях острой токсичности в однократной дозе (включая 500, 1000 и 2000 мг/кг однократно перорально) на крысах и обезьянах (при увеличении дозы в течение 1, 4, 7, 10 и 14 суток до 2000 мг/кг) отсутствовали явные признаки токсичности и воздействия диУа1-Б-йС на массу тела, потребление корма или клинические патологические параметры (гематологические и биохимические показатели сыворотки крови). Кроме того, отсутствовали макроскопические участки поражения при вскрытии, как и микроскопические изменения при гистоморфологическом исследовании, относящиеся к воздействию диУа1-Б-йС. Основываясь на результатах данных исследований, уровень отсутствия эффекта поражения (КОАЕБ) для диУа1-Б-йС после однократного перорального введения крысам Спрегью-Даули и синомологичным обезьянам составлял 2000 мг/кг.

В субхронических (25 суток) токсикологических исследованиях на обезьянах КОАЕБ диУа1-Б-йС был меньше 500 мг/кг. Атрофия тимуса была единственным микроскопическим признаком, который, возможно, был связан с воздействием диУа1-Б-йС, но ее клиническая значимость рассматривалась как сомнительная. При дозе 500 мг/кг отмечали умеренную негемолитическую анемию (пониженное число эритроцитов, пониженный уровень гемоглобина и гематокрит) и снижение абсолютного и процентного числа полиморфоядерных лейкоцитов без явных последствий. В группах со всеми дозами других проявлений токсичности, чем нежели гематологические изменения, не наблюдали.

В субхронических (28 суток) токсикологических исследованиях на крысах КОАЕБ диУа1-Б-йС был ниже 500 мг/кг. Пероральное введение диУа1-Б-йС в течение 28 суток крысам в дозе 2000 мг/кг приводило к связанным с обработкой изменениям, которые включали умеренную макроцитарную анемию, сниженную массу тимуса, повышенную массу селезенки (только у самок), пониженную массу тела и гематопоэз в селезенке, печени и грудинном костном мозге. Пероральное введение диУа1-Б-йС в течение 28 суток крысам в дозе 1000 мг/кг приводило к связанным с обработкой изменениям, которые включали умеренную макроцитарную анемию, атрофию тимуса (только у самок) и гематопоэз в селезенке. Гистоморфологические изменения, обнаруженные в печени, селезенке и костном мозге, отражают гематологический ответ на умеренную анемию. Пероральное введение диУа1-Б-йС в течение 28 суток крысам в дозе 500 мг/кг приводило к умеренной макроцитарной анемии. Другие токсические ответные реакции, чем гематологические изменения и гематопоэтические проявления, не были отмечены в группах с любой дозой.

У нормальных здоровых лесных сурков или лесных сурков с хроническим гепатитом В (модель для оценки эффективности лечения НВУ-инфекции) не наблюдали проявлений токсичности у животных, получавших Б-йС во время исследования острой (в дозе 10 мг/кг однократно внутривенно или перорально) или субхронической токсичности (в дозе 10 мг/кг/день в течение 12 недель).

Отсутствовала потеря массы в группах, которым вводили Б-йС, по сравнению с контрольными животными, клинические патологические признаки (гематологические и биохимические показатели сыворотки крови) находились в нормальных пределах и в биопсийном материале печени, взятом в конце обработки в 12-недельном опыте, не было признаков жирового изменения (микровезикулярный стеатоз).

Б-йС не проявлял мутагенной активности в тесте на 8. 1урЫтигшт или Е. сой при концентрациях до 5000 мкг/чашка. Отсутствовали признаки хромосомных аберраций в тесте на яичникам китайских хомяков (СНО) после воздействия Б-йС при концентрациях до 5000 мкг/мл (или 22,0 мМ). В микроядерном тесте на мышах Б-йС не был кластогенным для самцов или самок при дозах до 2000 мг/кг.

Умеренная анемия, обнаруженная у обезьян, не была связана с какими-либо клиническими признаками даже при самой высокой дозе (2000 мг/кг) и у крыс при дозе 500 мг/кг. Кроме того, число ретикулоцитов оставалось без изменений. Несмотря на то, что в данных исследованиях отсутствовала соответствующая обратимость, является очевидным, что может иметь место восстановление гематологических показателей, на что указывал экстрамедуллярный гематопоэз, установленный в селезенке и печени, при более высоких дозах у крыс.

Таблица 32

Межвидовое сравнение доз по массе и площади поверхности тела ДоЗа,

	Масса	Доза	Фактор	эквивалентная человеку
тела	Доза
Виды	(кг)	(мг/кг)	(иг/животнов)	превращения	(НЕД) (иг/кг)	Кратная разница

Крыса	0,2	500	100	6	16,6	23
Обезьяна	4,0	500	2000	3	666	93Θ
Лесной сурок	3,0	10	30	3	10	14
Человек	70	0,71	50	1	0,71	-

(предполагаемое|

Аналогичные гематологические изменения при сравнимых или более низких дозах наблюдали в доклинических исследованиях токсичности ламивудина (ЕрМг-НВУТ™) и валацикловира (УаЙгех™). Оба этих разрешенных к применению лекарства являются представителями такой же хорошо охаракте

- 57 005774 ризованной группы (нуклеозиды или аналоги нуклеозидов), как и диУа1-Ь-бС. Выбор ламивудина для сравнения основан на том факте, что он представляет производное цитозина, как и диУа1-Ь-бС, а также он разрешен для лечения хронического гепатита В. Выбор валацикловира для сравнения основан на том факте, что он представляет пролекарство валинового эфира нуклеозида ацикловира.

Данное изобретение описано при обращении к его предпочтительным воплощениям. Вариации и модификации изобретения, очевидно, понятны специалистам в данной области из предшествующего подробного описания изобретения.

Подразумевается, что все такие вариации и модификации включены в объем данного изобретения.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. 3'-Замещенный-в-Ь-нуклеозид формулы (I)

О) или его фармацевтически приемлемая соль, в которой

К¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

К² представляет остаток аминокислоты;

X представляет О, 8, 8О₂ или СН₂ и

ΒΑ8Ε представляет пуриновое или пиримидиновое основание, которое необязательно может быть замещенным;

где термин «алкил» сам по себе или как часть других терминов, относится к насыщенному, нормальному, разветвленному или циклическому, первичному, вторичному или третичному углеводороду С1-С10, который может быть замещен по одному или нескольким атомам углерода одной или несколькоми группами, выбраными из группы, состоящей из гидроксила, амино, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфата, фосфорной кислоты, фосфата или фосфоната; любой из которых может быть защищен группой, выбранной из бутоксикарбонила, п-толуоила и бензоила; термин «арил», сам по себе или как часть других терминов, относится к фенилу, бифенилу или нафтилу, которые могут быть замещены одной или более группами, выбранными из группы, состоящей из гидроксила, амино, алкиламино, ариламино, алкокси, арилокси, нитро, циано, сульфоновой кислоты, сульфата, фосфорной кислоты, фосфата или фосфоната, любой из которых может быть защищен группой, выбранной из бутоксикарбонила, п-толуоила и бензоила; термин «ΒΑ8Ε, которое необязательно может быть замещенным» включает цитозин, 5-фторцитозин, 5-бромцитозин, 5-иодцитозин, урацил, 5фторурацил, 5-бромурацил, 5-иодурацил, 5-хлорурацил, 5-метилурацил, 5-метилцитозин, тимин, аденин, гуанин, инозин, ксантин, гипоксантин, 2,6-диаминогуанин, 2,6-диаминоаденин, 2,6-диаминоксантин, 2,6диаминогипоксантин, 6-аминогуанин, 6-аминоаденин, 6-аминоксантин, 6-аминогипоксантин, 6хлоргуанин, 6-хлораденин, 6-хлорксантин, 6-хлоргипоксантин, 2,6-дихлоргуанин, 2,6-дихлораденин, 2,6дихлорксантин, 2,6-дихлоргипоксантин, 6-бромгуанин, 6-бромаденин, 6-бромксантин, 6бромгипоксантин, 2,6-дибромгуанин, 2,6-дибромаденин, 2,6-дибромксантин, 2,6-дибромгипоксантин, 6иодгуанин, 6-иодаденин, 6-иодксантин, 6-иодгипоксантин, 2,6-дииодгуанин, 2,6-дииодаденин, 2,6дииодксантин, 2,6-дииодгипоксантин, 5-бромвинилцитозин, 5-бромвинилурацил, 5-бромэтенилцитозин, 5-бромэтенилурацил, 5-трифторметилцитозин, 5-трифторметилурацил, Ц⁶-алкиладенин, Ц⁶-алкилгуанин, Ц⁶-алкилксантин, Ц⁶-алкилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-алкиладенин, Ц⁶-С(=О)-алкилксантин, Ц⁶-С(=О)алкилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-фениладенин, Ц⁶-С(=О)-фенилксантин, Ц⁶-С(=О)-фенилгипоксантин, Ν⁶С(=О)-бифениладенин, Ц⁶-С(=О)-бифенилксантин, Ц⁶-С(=О)-бифенилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-нафтиладенин, Ц⁶-С(=О)-нафтилксантин, Ц⁶-С(=О)-нафтилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-алкилгуанин, Ц⁶-С(=О)фенилгуанин, Ц⁶-С(=О)-бифенилгуанин, Ц⁶-С(=О)-нафтилгуанин, Ц⁶-С(=О)-алкилариладенин и Ν⁶С(=О)-арилалкиладенин, Ц⁶-С(=О)-алкилксантин, Ц⁶-С(=О)-фенилксантин, Ц⁶-С(=О)-бифенилксантин, Ц⁶-С(=О)-нафтилксантин, Ц⁶-С(=О)-алкилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-фенилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-бифенилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-нафтилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-алкиларилгуанин и Ц⁶-С(=О)-арилалкилгуанин, Ц⁶-С(=О)-бензиладенин, Ц⁶-С(=О)-бензилгуанин, Ц⁶-С(=О)-бензилксантин, Ц⁶-С(=О)-бензилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-хлораденин, Ц⁶-С(=О)-хлоргуанин, Ц⁶-С(=О)-хлорксантин, Ц⁶-С(=О)-хлоргипоксантин, Ц⁶-С(=О)-бромаденин, Ц⁶-С(=О)-бромгуанин, Ц⁶-С(=О)-бромксантин, Ц⁶-С(=О)-бромгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-фтораденин, Ц⁶-С(=О)-фторгуанин, Ц⁶-С(=О)-фторксантин, Ц⁶-С(=О)-фторгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-иодаденин, Ц⁶-С(=О)-иодгуанин, Ц⁶-С(=О)-иодксантин, Ц⁶-С(=О)-иодгипоксантин, Ц⁶-виниладенин, Ц⁶-винилгуанин, Ц⁶-винилксантин, Ц⁶-винилгипоксантин, Ц⁶-ацетиленаденин, Ν⁶ацетиленгуанил, Ц⁶-ацетиленксантин, Ц⁶-ацетиленгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-аденин, Ц⁶-С(=О)-гуанин, Ν⁶- 58 005774

С(=О)-ксантин, Ц’-С^Одгипоксантин, ЦМидроксиалкиладенин и Ц’-гидроксиалкилгуанин, Ν⁶гидроксиалкилксантин и Ц⁶-гидроксиалкилгипоксантин, Ц⁶-С(=О)-хлоргуанин, Ц⁶-С(=О)-хлораденин, Ц⁶-С(=О)-хлорксантин, Ц⁶-С(=О)-хлоргипоксантин, Ц⁶-тиоалкиладенин и Ц⁶-тиоалкилгуанин, Ν⁶тиоалкилксантин и N⁶-тиоалкилгипоксантин, ^-алкиладенин и ^-алкилгуанин, ^-алкилксантин и Ν²алкилгипоксантин, N²-алкил-6-тиоаденин и ^-алкилтиогуанин, N²-алкил-6-тиоксантин и ^-алкил^тиогипоксантин, 6-азацитозин, 6-азатимин, 2-меркаптоцитозин, 2-меркаптотимин, 2,4-меркаптоцитозин, 2,4-меркаптотимин, 4-меркаптоцитозин, 4-меркаптотимин, 2-меркаптоурацил, 2,4-меркаптоурацил, 4меркаптоурацил, С⁵-алкилцитозин, С⁵-алкилтимин, С⁵-алкилурацил, С⁵-бензилцитозин, С⁵-бензилтимин, С⁵-бензилурацил, С⁵-хлорцитозин, С⁵-фторцитозин, С⁵-иодцитозин, С⁵-бромцитозин, С⁵-хлортимин, С⁵фтортимин, С⁵-иодтимин, С⁵-бромтимин, С⁵-хлорурацил, С⁵-фторурацил, С⁵-иодурацил, С⁵-бромурацил, С⁵-винилцитозин, С⁵-винилтимин, С⁵-винилурацил, С⁵-ацетиленцитозин, С⁵-ацетилентимин, С⁵ацетиленурацил, С⁵-ацилцитозин, С⁵-ацилтимин, С⁵-ацилурацил, С⁵-амидоцитозин, С⁵-амидотимин, С⁵амидоурацил, С⁵-цианоцитозин, С⁵-цианотимин, С⁵-цианоурацил, С⁵-нитроцитозин, С⁵-нитротимин, С⁵нитроурацил, С⁵-аминоцитозин, С⁵-аминотимин, С⁵-аминоурацил, ^-алкилгуанин, ^-алкиладенин, Ν²алкилтиогуанин, ^-тиоаденин, N²-алкил-6-тиогуанин, N²-алкил-6-тиоаденин, ^-(диметиламино) метиленцитозин, Ν'-(диметиламино)метилентимин, Ν'-(диметиламино)метиленурацил, 5-азацитидин, 5азаурацил, триазолопиридин, имидазолопиридин, пирролопиридин, пирролопиримидин, пиразолопиримидин, имидазолопиримидин и тиазолопиримидин; термин «аминокислота» включает природные и синтетические α, β, γ или δ аминокислоты, а также аминокислоты, имеющиеся в белках, такие как глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, фенилаланин, триптофан, пролин, серии, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин, глутамин, аспартат, глутамат, лизин, аргинин и гистидин, или аминокислота может быть производным аланила, валинила, лейцинила, изолейцинила, пролинила, фенилаланинила, триптофанила, метионила, глицинила, серинила, треонинила, цистеинила, тирозинила, аспарагинила, глутаминила, аспартоила, глутароила, лизинила, аргининила, гистидинила, β-аланина, β-валинила, β-лейцинила, β-изолейцинила, β-пролинила, β-фенилаланинила, β-триптофанила, β-метионинила, β-глицинила, βсеринила, β-треонинила, β-цистеинила, β-тирозинила, β-аспарагинила, β-глутаминила, β-аспартоила, βглутароила, β-лизинила, β-аргининила или β-гистидинила.
2. Соединение по п.1, в котором X представляет О.
3. Соединение по п.2, в котором В² представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸) (В⁹) (ΝΚ¹¹^¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил), где термин «гетероарил» относится к ароматической группе, которая включает по меньшей мере один атом серы, азота или фосфора в ароматическом кольце; термин «гетероциклическая группа» относится к неароматической циклической группе, в которой имеется по меньшей мере один гетероатом, такой как кислород, сера, азот или фосфор, в кольце.
4. Соединение по п.3, в котором В² представляет Ь-валинил.
5. Соединение по п.2, в котором В¹ представляет водород.
6. Соединение по п.2, в котором В¹ представляет СО-алкил.
7. Соединение по п.2, в котором В¹ представляет остаток аминокислоты формулы СХО)^⁸)^⁹)^¹⁰^¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С₁.₄ алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
8. Соединение по п.7, в котором В¹ представляет Ь-валинил.
9. Соединение по п.8, в котором В¹ и В² независимо представляют Ь-валинил.
10. Соединение по п.1, в котором 3'-замещенный-β-^-нуклеозид представляет β-^-2'-дезоксипурин формулы

- 59 005774 или его фармацевтически приемлемую соль, в которой К¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

К² представляет остаток аминокислоты;

Υ представляет ОК³, ИК³К⁴ или §К³, и

X¹ и X² независимо выбраны из группы, состоящей из Н, нормального, разветвленного или циклического алкила, СО-алкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, галогена, ОК⁵, ИК⁵К⁶ или §К⁵ и

К³, К⁴, К⁵ и К⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил, диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СОарилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.
11. Соединение по п.10, в котором К² представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(К⁸)(К⁹) (ИК¹⁰К^П), в которой

К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая С_!-4 алкил) или арил и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
12. Соединение по п.11, в котором К² представляет Ь-валинил.
13. Соединение по п.10, в котором К¹ представляет водород.
14. Соединение по п.10, в котором К¹ представляет СО-алкил.
15. Соединение по п.10, в котором К¹ представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(К⁸)(К⁹)(ИК¹⁰К¹¹), в которой

К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая С1_-4 алкил) или арил и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
16. Соединение по п.15, в котором К¹ представляет Ь-валинил.
17. Соединение по п.10, в котором К¹ представляет водород и К² представляет Ь-валинил.
18. Соединение по п.10, в котором К¹ и К² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(К⁸)(К⁹)(ИК¹⁰К^П), в которой К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая С1_-4 алкил) или арил и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
19. Соединение по п.18, в котором К¹ и К² независимо представляют Ь-валинил.
20. Соединение по п.10, в котором β-Ε-Σ'^·’^^^·]}™ представляет β-^-2'-дезоксиаденозин фор мулы или его фармацевтически приемлемую соль,

- 60 005774 в которой В¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

В² представляет остаток аминокислоты;

В³ и В⁴ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил, диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СОарилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.
21. Соединение по п.20, в котором В² представляет остаток аминокислоты формулы ОО^В^В^МВ^В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_!-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
22. Соединение по п.21, в котором В² представляет Ь-валинил.
23. Соединение по п.20, в котором В¹ представляет водород.
24. Соединение по п.20, в котором В¹ не является водородом.
25. Соединение по п.20, в котором В¹ представляет СО-алкил.
26. Соединение по п.25, в котором СО-алкил представляет СО-метил.
27. Соединение по п.25, в котором СО-алкил представляет СО-пропил.
28. Соединение по п.20, в котором В¹ представляет остаток аминокислоты формулы С^С^ДВ^КВ^В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_!-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
29. Соединение по п.28, в котором В¹ представляет Ь-валинил.
30. Соединение по п.20, в котором В¹ представляет водород и В² представляет Ь-валинил.
31. Соединение по п.20, в котором В¹ и В² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(НВ¹⁰В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу и

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_!-4 алкил) или арил;

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
32. Соединение по п.31, в котором В¹ и В² независимо представляют Ь-валинил.
33. Соединение по п.31, в котором В³ и В⁴ представляют водород.
34. Соединение по п.31, в котором В³ представляет водород и В⁴ представляет диметиламинометилен.
35. Соединение по п.31, в котором В³ представляет водород и В⁴ представляет СО-алкил.
36. Соединение по п.31, в котором В³ представляет водород и В⁴ представляет СО-метил.
37. Соединение по п.31, в котором В³ представляет водород и В⁴ представляет Ь-валинил.
38. Соединение по п.10, где представляет β-^-2'-дезоксигуанозин формулы или его фармацевтически приемлемую соль, в которой В¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

В² представляет остаток аминокислоты;

В⁵ и В⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил, диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО

- 61 005774 арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.
39. Соединение по п.38, в котором В² представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(ХК¹⁰В^П), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
40. Соединение по п.39, в котором В² представляет Ь-валинил.
41. Соединение по п.38, в котором В¹ представляет водород.
42. Соединение по п.38, в котором В¹ не является водородом.
43. Соединение по п.38, в котором В¹ представляет СО-алкил.
44. Соединение по п.43, в котором СО-алкил представляет СО-метил.
45. Соединение по п.43, в котором СО-алкил представляет СО-пропил.
46. Соединение по п.38, в котором В¹ представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹) (ΝΚ¹⁰^¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
47. Соединение по п.46, в котором В¹ представляет Ь-валинил.
48. Соединение по п.38, в котором В¹ представляет водород и В² представляет Ь-валинил.
49. Соединение по п.38, в котором В¹ и В² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸) (В⁹)(ХВ¹⁰В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
50. Соединение по п.49, в котором В¹ и В² представляют Ь-валинил.
51. Соединение по п.50, в котором В⁵ и В⁶ представляют водород.
52. Соединение по п.50, в котором В⁵ представляет водород и В⁶ представляет диметиламинометилен.
53. Соединение по п.50, в котором В⁵ представляет водород и В⁶ представляет СО-алкил.
54. Соединение по п.50, в котором В⁵ представляет водород и В⁶ представляет СО-метил.
55. Соединение по п.50, в котором В⁵ представляет водород и В⁶ представляет Ь-валинил.
56. Соединение по п.10, где представляет |1-Ь-2' -дезоксиинозин формулы или его фармацевтически приемлемую соль, в которой В¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

В² представляет остаток аминокислоты.
57. Соединение по п. 56, в котором В² представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(ХВ¹⁰В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
58. Соединение по п.57, в котором В² представляет Ь-валинил.

- 62 005774
59. Соединение по п.56, в котором В¹ представляет водород.
60. Соединение по п.56, в котором В¹ не является водородом.
61. Соединение по п.56, в котором В¹ представляет СО-алкил.
62. Соединение по п.61, в котором СО-алкил представляет СО-метил.
63. Соединение по п.61, в котором СО-алкил представляет СО-пропил.
64. Соединение по п.56, в котором В¹ представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(ЫВ¹⁰В^П), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
65. Соединение по п.64, в котором В¹ представляет Ь-валинил.
66. Соединение по п.56, в котором В¹ представляет водород и В² представляет Ь-валинил.
67. Соединение по п.56, в котором В¹ и В² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(ЫК¹⁰В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С_1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
68. Соединение по п.67, в котором В¹ и В² представляют Ь-валинил.
69. Соединение по п.2, где 3'-замещенный-в-Ь-нуклеозид представляет в-Ь-2'-дезоксипиримидин формулы или его фармацевтически приемлемую соль, в которой В¹ выбран из группы, состоящей из водорода, нормального, разветвленного или циклического алкила, СО-алкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, СО-арилоксиалкила, СО-замещенного арила, алкилсульфонила, арилсульфонила, аралкилсульфонила, остатка аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата;

В² представляет остаток аминокислоты;

Υ представляет ОВ³, ЫВ³В⁴ или 8В³;

X¹ выбран из группы, состоящей из Н, нормального, разветвленного или циклического алкила, СОалкила, СО-арила, СО-алкоксиалкила, галогена, ОВ⁵, ЫК⁵В⁶ или 8В⁵, и

В³, В⁴, В⁵ и В⁶ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил, диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СОарилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата.
70. Соединение по п.69, в котором В² представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(ЫК¹⁰В¹¹), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
71. Соединение по п.70, в котором В² представляет Ь-валинил.
72. Соединение по п.69, в котором В¹ представляет водород.
73. Соединение по п.69, в котором В¹ представляет СО-алкил.
74. Соединение по п.69, в котором В¹ представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(ЫК¹⁰В¹¹),

- 63 005774 в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
75. Соединение по п.74, в котором В¹ представляет Ь-валинил.
76. Соединение по п.69, в котором В¹ представляет водород и В² представляет Ь-валинил.
77. Соединение по п.69, в котором В¹ и В² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(СВ¹⁰В^П), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
78. Соединение по п.77, в котором В¹ и В² независимо представляют Ь-валинил.
79. Соединение по п.69, где β-^-2'-дезоксипиримидин представляет β-^-2'-дезоксицитидин формулы или его фармацевтически приемлемую соль, в которой В¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата;

В² представляет остаток аминокислоты и

В³ и В⁴ независимо представляют Н, нормальный, разветвленный или циклический алкил, диалкиламиноалкилен (в частности, диметиламинометилен), СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СОарилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, производное моно-, ди- или трифосфата или фосфата.
80. Соединение по п.79, в котором В² представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(СВ¹⁰В^П), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропилом и циклопропил).
81. Соединение по п.80, в котором В² представляет Ь-валинил.
82. Соединение по п.79, в котором В¹ представляет водород.
83. Соединение по п.79, в котором В¹ не является водородом.
84. Соединение по п.79, в котором В¹ представляет СО-алкил.
85. Соединение по п.84, в котором СО-алкил представляет СО-метил.
86. Соединение по п.84, в котором СО-алкил представляет СО-пропил.
87. Соединение по п.79, в котором В¹ представляет остаток аминокислоты формулы С(О)С(В⁸)(В⁹)(СВ¹⁰В^П), в которой В⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, В⁸ необязательно может быть соединен с В¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, В⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

В⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

В¹⁰ и В¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с В⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
88. Соединение по п.87, в котором В¹ представляет Ь-валинил.
89. Соединение по п.79, в котором В¹ представляет водород и В² представляет Ь-валинил.

- 64 005774
90. Соединение по п.79, в котором Я¹ и Я² независимо представляют остаток аминокислоты формулы ^ΘΉΉ^^χΝΚ/Ή¹¹), в которой Я⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, Я⁸ необязательно может быть соединен с Я¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, Я⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

Я⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

Я¹⁰ и Я¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с Я⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
91. Соединение по п.90, в котором Я¹ и Я² независимо представляют Ь-валинил.
92. Соединение по п. 91, в котором Я³ и Я⁴ представляют водород.
93. Соединение по п.91, в котором Я³ представляет водород и Я³ представляет диметиламинометилен.
94. Соединение по п.91, в котором Я³ представляет водород и Я⁴ представляет СО-алкил.
95. Соединение по п.94, в котором Я³ представляет водород и Я⁴ представляет СО-метил.
96. Соединение по п.91, в котором Я³ представляет водород и Я⁴ представляет Ь-валинил.
97. Соединение по п.69, где β-^-2'-дезоксипиримидин представляет β-^-2'-дезоксиуридин формулы или его фармацевтически приемлемую соль, в которой Я¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата и Я²представляет остаток аминокислоты.
98. Соединение по п.97, в котором Я² представляет остаток аминокислоты формулы ΟΟΉΉ^^χνκ'Ή¹¹), в которой Я⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, Я⁸ необязательно может быть соединен с Я¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, Я⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

Я⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

Я¹⁰ и Я¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с Я⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
99. Соединение по п.98, в котором Я² представляет Ь-валинил.
100. Соединение по п.97, в котором Я¹ представляет водород.
101. Соединение по п.97, в котором Я¹ не является водородом.
102. Соединение по п.97, в котором Я¹ представляет СО-алкил.
103. Соединение по п.102, в котором СО-алкил представляет СО-метил.
104. Соединение по п.102, в котором СО-алкил представляет СО-пропил.
105. Соединение по п.97, в котором Я¹ представляет остаток аминокислоты формулы ΟΟΉΉ^^χνκ/Ή¹¹), в которой Я⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, Я⁸ необязательно может быть соединен с Я¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, Я⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

Я⁹ представляет водород, алкил (включая С1-4 алкил) или арил и

Я¹⁰ и Я¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с Я⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
106. Соединение по п.105, в котором Я¹ представляет Ь-валинил.
107. Соединение по п.97, в котором Я¹ представляет водород и Я² представляет Ь-валинил.
108. Соединение по п.97, в котором Я¹ и Я² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(Я⁸)(Я⁹)^Я¹⁰Я^П), в которой Я⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, Я⁸ необязательно может быть соединен с Я¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, Я⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

Я⁹ представляет водород, алкил (включая С_1-4 алкил) или арил и

Я¹⁰ и Я¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с

Я⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
109. Соединение по п.108, в котором Я¹ и Я² независимо представляют Ь-валинил.
110. Соединение по п.69, где β-^-2'-дезоксипиримидин представляет β-Ь-тимидин формулы

- 65 005774 или его фармацевтически приемлемую соль, в которой К¹ представляет водород, нормальный, разветвленный или циклический алкил, СО-алкил, СО-арил, СО-алкоксиалкил, СО-арилоксиалкил, СО-замещенный арил, алкилсульфонил, арилсульфонил, аралкилсульфонил, остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфат или производное фосфата и

К² представляет остаток аминокислоты, моно-, ди- или трифосфата или производного фосфата.
111. Соединение по п.110, в котором К² представляет остаток аминокислоты формулы Ο(Ο)Ο(Κ⁸)(Κ⁹)(ΝΚ¹⁰Κ¹¹), в которой К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая Οι_-4 алкил) или арил и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
112. Соединение по п.111, в котором К² представляет Ь-валинил.
113. Соединение по п.110, в котором К¹ представляет водород.
114. Соединение по п.110, в котором К¹ не является водородом.
115. Соединение по п.110, в котором К¹ представляет СО-алкил.
116. Соединение по п.115, в котором СО-алкил представляет СО-метил.
117. Соединение по п.115, в котором СО-алкил представляет СО-пропил.
118. Соединение по п.110, в котором К¹ представляет остаток аминокислоты формулы Ο^Ο^^^χΝΕ.¹⁰^¹), в которой К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая Ο_1-4 алкил) или арил и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
119. Соединение по п.118, в котором К¹ представляет Ь-валинил.
120. Соединение по п.110, в котором К¹ представляет водород и К² представляет Ь-валинил.
121. Соединение по п.110, в котором К¹ и К² независимо представляют остаток аминокислоты формулы С(О)С(К⁸)(К⁹)ЩК¹⁰К^п), в которой К⁸ представляет боковую цепь аминокислоты и в которой, как в пролине, К⁸ необязательно может быть соединен с К¹⁰ с образованием кольцевой структуры или, альтернативно, К⁸ представляет алкил, арил, гетероарил или гетероциклическую группу;

К⁹ представляет водород, алкил (включая Ο_!-4 алкил) или арил и

К¹⁰ и К¹¹ независимо представляют водород, ацил (включая ацильное производное, соединенное с

К⁸) или алкил (включая, но не ограничиваясь ими, метил, этил, пропил и циклопропил).
122. Соединение по п.121, в котором К¹ и К² независимо представляют Ь-валинил.
123. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина, содержащая соединение по любому из предшествующих пп.1-122 или его фармацевтически приемлемую соль вместе с фармацевтически приемлемыми носителем или разбавителем.
124. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина, содержащая соединение по любому из предшествующих пп.1-122 или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более агентом против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
125. Фармацевтическая композиция по п.124, в которой агентом против вируса гепатита В является β-Ь-дезоксирибонуклеозид.
126. Фармацевтическая композиция по п.125, в которой β-Ь-дезоксирибонуклеозид выбран из группы, состоящей из β-Ь-дезоксириботимидина ф-Ь-άΤ). β-Ь-дезоксирибоцитозина (β-Ε-άΟ). β-Ьдезоксирибоуридина (β-Ε-άυ), β-Ь-дезоксирибоаденина (β-Ε-άΆ), β-Ь-дезоксирибогуанина (β-Ε-άΟ) или β-Ь-дезоксирибоинозина (β-Ε-άΙ).
127. Фармацевтическая композиция по п.126, в которой β-Ь-дезоксирибонуклеозид представляет βЬ-дезоксириботимидин (β-Ε-άΤ).

- 66 005774
128. Фармацевтическая композиция по п.127, в которой соединение представляет 3'-Уа1ф-Ь-бС и агент против вируса гепатита В представляет β-Ь-бТ.
129. Фармацевтическая композиция по п.127, в которой соединение представляет 3',5'-диУа1ф-Ь-бС и агент против вируса гепатита В представляет β-Ь-бТ.
130. Применение соединения или композиции по любому из предшествующих пп.1-129 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
131. Фармацевтическая композиция, которая содержит соединение по любому из предшествующих пп.1-129 или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более агентом против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
132. Фармацевтическая композиция по п.131, в которой агент против вируса гепатита В представляет β-Ь-дезоксирибонуклеозид.
133. Фармацевтическая композиция по п.132, в которой β-Ь-дезоксирибонуклеозид выбран из группы, состоящей из β-Ь-дезоксириботимидина (β-Ь-бТ), β-Ь-дезоксирибоцитозина (β-Ь-бС), β-Ь-дезоксирибоуридина (β-Ь-бИ), β-Ь-дезоксирибоаденина (β-Ь-бА), β-Ь-дезоксирибогуанина (β-Ь-бС) или β-Ьдезоксирибоинозина (β-Ь-бТ).
134. Фармацевтическая композиция по п.133, в которой β-Ь-дезоксирибонуклеозид представляет βЬ-дезоксириботимидин (β-Ь-бТ).
135. Фармацевтическая композиция по п.134, в которой соединение представляет 3'-Уа1ф-Ь-бС и агент против вируса гепатита В представляет β-Ь-бТ.
136. Фармацевтическая композиция по п.134, в которой соединение представляет 3'.5'-диVа1-β-^-бС и агент против вируса гепатита В представляет β-Ь-бТ.
137. Соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль.
138. Соединение формулы или его фармацевтически приемлемая соль.
139. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В, содержащая соединение формулы или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с β-Ь-дезоксириботимидином, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.

- 67 005774
140. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В, содержащая соединение формулы или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с β-Ь-дезоксириботимидином, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
141. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В, содержащая соединение формулы или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более агентами против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
142. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В, содержащая соединение формулы или его фармацевтически приемлемую соль в комбинации с одним или более агентами против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
143. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В, содержащая соединение формулы или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
144. Фармацевтическая композиция для лечения или профилактики вирусного гепатита В, содержащая соединение формулы

- 68 005774 или его фармацевтически приемлемую соль или сложный эфир вместе с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем.
145. Применение соединения или композиции по любому из предшествующих пп.131-144 в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
146. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
147. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
148. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли, в комбинации или при чередовании с терапевтическим количеством β-Ь-дезоксириботимидина, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
149. Применение соединения формулы

- 69 005774 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации или при чередовании с терапевтическим количеством β-Ь-дезоксириботимидина, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
150. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации или при чередовании с терапевтическим количеством одного или более агентов против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
151. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации или при чередовании с терапевтическим количеством одного или более агентов против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
152. Применение соединения формулы или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации или при чередовании с терапевтическим количеством одного или более агентов против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
153. Применение соединения формулы

- 70 005774 или его фармацевтически приемлемой соли в комбинации или при чередовании с терапевтическим количеством одного или более агентов против вируса гепатита В, необязательно с фармацевтически приемлемым носителем или разбавителем, в производстве лекарственного средства для лечения или профилактики вирусного гепатита В у хозяина.
154. Применение по любому из пп.130 и 145-153, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для пероральной доставки.
155. Применение по любому из пп.130 и 145-153, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для внутривенной доставки.
156. Применение по любому из пп.130 и 145-153, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для парентеральной доставки.
157. Применение по любому из пп.130 и 145-153, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для внутрикожной доставки.
158. Применение по любому из пп.130 и 145-153, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для подкожной доставки.
159. Применение по любому из пп.130 и 145-153, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для местной доставки.
160. Применение по любому из пп.130 и 145-159, где соединение находится в форме дозированной единицы.
161. Применение по п.160, где дозированная единица содержит 10-1500 мг соединения.
162. Применение по п.160 или 161, где дозированная единица представляет собой таблетку или кап сулу.
163. Применение по любому из пп.130 и 145-162, где хозяином является человек.
164. Применение по любому из пп.130 и 145-163, где лекарственное средство предназначено для лечения вирусного гепатита В у хозяина.
165. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, ски приемлемый носитель пригоден для пероральной доставки.
166. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, ски приемлемый носитель пригоден для внутривенной доставки.
167. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, ски приемлемый носитель пригоден для парентеральной доставки.
168. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136,

139-144, где фармацевтиче139-144, где фармацевтиче139-144, где фармацевтиче139-144, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для внутрикожной доставки.
169. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, 139-144, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для подкожной доставки.
170. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, 139-144, где фармацевтически приемлемый носитель пригоден для местной доставки.
171. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, 139-144, 165-170, где соединение находится в форме дозированной единицы.
172. Фармацевтическая композиция по п.171, где дозированная единица содержит 10-1500 мг со- единения.
173. Фармацевтическая композиция по п.171 или 172, где дозированная единица представляет таб летку или капсулу.
174. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, 139-144, 165-173, где хозяином является человек.
175. Фармацевтическая композиция по любому из пп.123-129, 131-136, 139-144, 165-174, где композиция предназначена для лечения вирусного гепатита В у хозяина.