CZ2003122A3

CZ2003122A3 - 3´-Substituované-beta-L-nukleosidy

Info

Publication number: CZ2003122A3
Application number: CZ2003122A
Authority: CZ
Inventors: Martin L. Bryant; Gilles Gosselin; Jean-Louis Imbach
Original assignee: Idenix (Cayman) Limited; Centre National Da La Recherche Scientifique (Cnrs)
Priority date: 2000-06-15
Filing date: 2001-06-15
Publication date: 2003-06-18
Also published as: CN1452627A; NO20026001D0; CN1295242C; DE60136181D1; ZA200300168B; JP2004533403A; ZA200404306B; IL153379A; KR20070048277A; NO20026001L; ES2317912T3; EP1296995A2; AP1771A; OA12384A; AU2001266927B2; NZ535246A; CN101012259A; JP4639032B2; IL178864A0; UY26779A1

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká 3'-prekurzorů 2'-deoxy-p-L-nukleosidů pro léčbu virové hepatitidy B.

Priorita nároků přihlášky z vychází z předběžné přihlášky US č. 60/212,100, podané 15. června 2000.

Dosavadní stav techniky

Virová hepatitida B („HBV“) je pouze druhým onemocněním za tabákem, který způsobuje rakovinu u člověka. Mechanizmus, kterým HBV indukuje rakovinu, je neznámý, ačkoliv se uvádí, že se chronickým zánětem, cirhózou a buněčnou regenerací spojenou s infekcí může přímo nebo nepřímo spustit nádorové bujení.

Virová hepatitida B dosáhla úrovně epidemie na celém světě. Po dvou až šesti měsících inkubační periody, po kterou si hostitel neuvědomuje infekci, může infekce HBV vést k akutní hepatitidě a poškození jater, které způsobuje bolest břicha, žloutenku a zvýšenou hladinu některých enzymů v krvi. HBV může způsobit fulminantní hepatitidu, rychle progresivní, často fatalní formu onemocnění, při kterém se zničí masivní části jater. Pacienti se obvykle zotaví z akutní virové hepatitidy. U některých pacientů však vysoké hladiny virového antigenu setrvávají v krvi delší nebo nedefinovanou dobu, přičemž způsobují chronickou infekci. Chronické infekce mohou vést ke chronické trvalé hepetitídě. Infikovaní pacienti s trvalou HBV se nejčastěji nacházejí v rozvojových zemích. Chronická trvalá hepetitída může způsobit vyčerpanost, cirhózu jater a hepatocelulární karcinom, primární rakovinu jater. Vysoce rizikové skupiny infekce HBV v západních průmyslových zemích zahrnují ty skupiny, které přicházejí do kontaktu s nosiči HBV nebo jejich vzorky krve. Epidemiologie HBV je v podstatě velmi podobná epidemiologii syndromu získané imunodeficience, což vysvětluje proč je infekce HBV obvyklá mezi pacienty s infekcí AIDS nebo infekcí spojenou s HIV. Avšak HBV je nakažlivější než HIV.

Denní léčby α-interferonem, proteinem genetického inženýrství, vypadaly slibně. Vakcína odvozená od lidského séra byla vyvinuta pro imunizaci pacienta proti HBV. Vakcíny byly vyrobeny pomocí genetického inženýrství. Zatímco se vakcína stala efektivní, výroba vakcíny je problematická, protože zdroj lidského séra z chronických nosičů je omezena a postup čištění je dlouhý a drahý. Dále každá dávka vakcíny vyrobená z různého séra se musí testovat na šimpanzech pro zajištěni bezpečnosti. Navíc vakcína vždy nepomáhá pacientům infikovaným virem.

Hlavním krokem ve způsobu účinku purinového a pyrimidinového nukleosidu proti virovým onemocněním, zvláště HBV a HIV, je jejich metabolická aktivace buněčnou nebo virovou kinázou za vzniku mono-, di- nebo trifosfátových derivátů. Biologicky aktivním druhem mnoha nukleosidů je trifosfátová forma, která inhibuje DNA polymerázu nebo reverzní transkriptázu nebo způsobuje terminaci řetězce.

Bylo identifikováno mnoho syntetických nukleosidů, které vykazují aktivitu proti HBV. (-)-Enantiomer BCH-189 (2',3'-dideoxy-3'-thiacytidin), známý jako 3TC, nárokovaný v patentu US 5,539,116, Liotta, et al., je v současné době v klinických testech pro léčbu hepatitidy B. Viz také EPA 0 494 119 A1 podané BioChem Pharma, lne.

P-2-Hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxythiolan („FTC“), nárokovaný v patentu č. US 5,814,639 a 5,914,331, Liotta et al., projevuje aktivitu proti

HBV. Viz Furman et al., „The Anti-Hepatitis B Virus Activities, Cytotoxicities • · • · · · ··· · · ·** · ··· ·· · · · · ······· · ··· · · _ Q _ · · ···· ···· '“J ···· · ·· ·· ·· ·· and Anabolic profiles of the (-) and (+) Enantiomers of cis-5-Fluoro-1-{2(Hydroxymethyl)-1,3-oxythiolane-5-yl}-Cytosine“ Antimicrobial Agents and Chemotherapy, prosinec 1992, str. 2686-2692; a Cheng et al., Journal of Bioloqical Chemistry, svazek 267(20), 13938-13942 (1992).

Patenty č. US 5,565,438; 5,567,688 a 5,587,362 (Chu, et al.) popisují použití 2'-f|uoro-5-methyl-p-L-arabinofuranoyluridinu (L-FMAU) pro léčbu hepatitidy B a viru Epstein Barra.

Pencyklovir (PCV; 2-amino-1,9-dihydro-9-{4-hydroxy-3-(hydroxymethyl)butyl}6H-purin-6-on) prokázal aktivitu proti hepatitidě B. Viz patenty č. US 5,075,445 a 5,684,153.

Adefovir (9-{2-(fosfonomethoxy)ethyl}adenin, také uvedený jako PMEA nebo kyselina {2-(6-amino-9H-purin-9-yl)ethoxy}methylfosfonová), také prokazoval aktivitu proti hepatitidě B. Viz například patenty č. US 5,641,763 a 5,142,051.

Yale University a The University of Georgia Research Foundation, lne. popisují použití L-FDDC (5-fluoro-3'-thia-2,3'-dideoxycytidin) pro léčbu virové hepatitidy B v WO 92/18517.

Jiná léčiva zkoumaná z hlediska léčby HBV zahrnují adenosin arabinosid, thymosin, acyklovir, fosfonoformát, zidovudin, (+)-kyanidanol, chinakrin a 2'fluoroarabinosyl-5-jodouracil.

Patenty č. US 5,444,063 a 5,684,010 Emory University popisují použití enantiomerně čistých β-D-l ,3-dioxolan purin nukleosidů pro léčbu hepatitidy

B.

• ·

WO 96/40164, podaná Emory University, UAB Research Foundation a Centra national de la Recherche Scientifique (CNRS), popisuje mnoho β-1_-2',3'dideoxynukleosidů pro léčbu hepatitidyl B.

WO 95/07287, také podaná Emory University, UAB Research Foundation a Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS), popisuje 2'nebo 3'deoxy a 2',3'-dideoxy-p~L-pentofuranosyl nukleosidy pro léčbu infekce HIV.

WO 96/13512, podaná Genencor International, Inc. a Lipitek, Inc., popisuje přípravu L-ribofuranosyl nukleosidů jako prostředků proti rakovině a prostředků, které ničí viry.

WO 95/32984 popisuje lipidové estery nukleosidu monofosfátů jako imunosupresivní léčiva.

DE 4224737 popisuje cytosin nukleosidy a jejich farmaceutická použití.

Tsai et al., v Biochem. Pharmacol. 1994, 48(7), 1477-81, popisuje účinek prostředku proti HIV 2-p-D-F-2',3'-dideoxynukleosidových analogů na buněčný obsah mitochondriální DNA a produkci laktátu.

Galvez, J. Chem. Inf. Comput. Sci. 1994, 35(5), 1198-203, popisuje molekulární komputaci (výpočet) p-D-3'-azido-2',3'-dideoxy-5-fluorocytidinu.

Mahmoudian, Pharm. Research 1991, 8(1), 43-6, popisuje kvantitativní analýzy poměru stuktury a aktivity prostředků HIV, jako p-D-3'-azido-2',3'dideoxy-5-fluorocytidin.

• · · ·

-5Patent č. US 5,703,058 popisuje (5-karboximido nebo 5-fluoro)-2',3'nenasycené nebo 3'-modifikované) pyrimidinové nukleosidy pro léčbu HIV nebo HBV.

Lin et al., popisuje syntézu a antivirovou aktivitu různých 3'-azido analodů βD-nukleosidů v J. Med. Chem. 31(2), 336-340 (1988).

WO 00/3998, podaná Novirio Pharmaceuticals, Ltd, popisuje metody přípravy substituovaných 6-benzyl-4-oxopyrimidinů a použití těchto pyrimidinu pro léčbu HIV.

Novirio Pharmaceuticals, Ltd byla také první firma, která popsala 2'-deoxy-pL-erythropentofuranonukleosidy a jejich použití pro léčbu HBV v přihlášce WO 00/09531. Způsob léčby infekce hepatitidy B u lidí a jiných zvířecích hostitelů je popsán tak, že zahrnuje podávání účinného množství biologicky aktivního 2'-deoxy-p-L-erytro-pentafuranonukleosidu (alternativně uveden jako β-L-dN a P-L-2'-dN) nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo prekurzoru, zahrnující β-L-deoxyribothimidin (β-L-dT), β-L-deoxyribocytidin (β-L-dC), β-L-deoxyribouridin (β-L-dU), β-L-deoxyriboguanosin (β-L-dG), β-L-deoxyriboadenosin (β-L-dA) a β-L-deoxyriboinosin (β-L-dl), podávané buď samostatně nebo v kombinaci, případně na farmaceuticky přijatelném nosiči. Acylované nebo alkylované deriváty 5'a N⁴ (cytidin) nebo N⁶ (adenosin) aktivní sloučeniny nebo 5'-fosfolipid nebo 5'-etherlipidy byly také popsány.

Byly vyzkoušeny různé antivirové prekruzory. Nejpozoruhodnější patent č. US 4,957,924 Beauchamp popisuje různé léčebné estery acykloviru.

Ve světle faktu, že virová hepatitida B dosáhla epidemické úrovně na celém světě a má vážné a často tragické účinky na infikovaného pacienta, existuje

-6velká nutnost zajistit nové účinné farmaceutické prostředky pro léčbu lidí infikovaných virem, které mají nízkou toxicitu na hostitele.

• · · · • · · · · · • · · · · • · · · ·

Proto je předmětem předkládaného vynálezu poskytnoust sloučeniny, farmaceutické prostředky a způsoby léčby lidských pacientů nebo jiných hostitelů infikovaných HBV.

Podstata vynálezu

3-Prekurzory 2'-deoxy-p-L-nukleosidů nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli nebo farmaceuticky přijatelné formulace, obsahující tyto sloučeniny, jsou výhodě pro prevenci a léčbu infekcí hepetitídy B a jiných příbuzných stavů, jako jsou stavy protilátka proti HBV pozitivní a HBV-pozitivní, chronický zánět jater způsobený HBV, cirhóza, akutní hepatitida, fulminantní hepatitida, chronická perzistentní hepatitida a vyčerpanost. Tyto sloučeniny nebo formulace se mohou také použit profylakticky pro prevenci nebo zastavení progrese klinického onemocnění u jednotlivců, kteří jsou pozitivní protilátka proti HBV nebo na antigen HBV, nebo kteří byly vystaveni HBV.

Způsob léčby virové infekce hepatitidy B u hostitele, včetně člověka, je také popsán tak, ža zahrnuje podávání účinného množství 3'-prekurzoru biologicky aktivního 2'-deoxy-3-L-nukleosidu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, podávaného buď samostatně nebo v kombinaci nebo alternaci s jiným prostředkem proti viru HBV, případně na farmaceuticky přijatelném nosiči. Pojem 2'-deoxy, používaný v této specifikaci, znemaná nukleosid, který nemá žádný substituent v poloze 2'. Pojem 3'-prekurzor, používaný v této specifikaci, znamená 2'-deoxy-p-L-nukleosid, který má biologicky odštěpitelnou část v poloze 3', zahrnující bez omezení skupinu acyl a v jednom provedení L-amimokyselinu.

-7• ·

V jednom provedení 3'-prekurzor 2'-deoxy-p-L-nukleosidu zahrnuje biologicky odštěpitelné části v poloze 3' a/nebo 5'. Výhodnými částmi jsou estery aminokyselin, zahrnující valylester a alkylester, zahrnující acetyl. Proto tento vynález specificky zahrnuje 3'-L-aminokyselinový ester a 3',5'-Ldiaminokyselinový ester 2'-p-L-deoxynukleosidů s některou požadovanou purinovou nebo pyrimidinovou baží, kde původní léčivo má hodnotu EC₅₀menší než 15 mikromol a výhodně menší než 10 mikromol v buňkách2.2.15; 3'-(alkyl nebo arylester)- nebo 3', 5 '-L-di(alkyl nebo arylester)-2'~p-Ldeoxynukleosidy s některou požadovanou purinovou nebo pyrimidinovou baží, kde původní léčivo ma hodnotu EC₅₀ menší než 10 nebo 15 mikromol v buňkách 2.2.15; a prekuzory 3',5'-diesterů 2'-deoxy-p-L-nukleosidů, kde (i) 3'-ester je aminokyselinový ester a 5'-ester je alkyl nebo arylester; (ii) oba estery jsou aminokyselinové estery; (iii) oba estery jsou nezávisle alkyl nebo arylester; a (iv) 3'-ester je nezávisle alkyl nebo arylester a 5'-ester je aminokyselinový ester, kde původní léčivo má hodnotu EC₅o menší než 10 nebo 15 mikromol v buňkách 2.2.15.

Příklady prekurzorů spadajících do vynálezu jsou 3'-L-valin ester 2'-deoxy-pL-cytidinu; 3'-L-valin ester 2'-deoxy-p-L-thyminu; 3'-L-valin ester 2'-deoxy-pL-adenosinu; 3'-L-valin ester 2'-deoxy-p-L-guanosinu; 3'-L-valin ester 2'deoxy-p-L-5-fluoro-cytidinu; 3'-L-valinester 2'-deoxy-p-L-uridinu; 3'-acetyl ester 2'-deoxy-p-L-cytidinu; 3'-acetyl ester 2'-deoxy-p-L-thyminu; 3'-acetyl ester 2'-deoxy-p-L-adenosinu; 3'-acetyl ester 2'-deoxy-p-L-guanosinu; 3'acetyl ester 2'-deoxy-p-L-5-fluoro-cytidinu; a 3'-estery 2'-deoxy-P-L-(cytidinu, 5-fluoro-cytidinu, guanosinu, uridinu, adenosinu nebo thyminu), kde (i) 3'ester je aminokyselinový ester; nebo (ii) 3'-ester je alkyl nebo aryl ester.

Dalšími příklady prekurzorů spadajících do vynálezu jsou 3',5'-L-divalin ester

2'-deoxy~p-L-cytidinu (dival-L-dC); 3',5'-L-divalin ester 2'-deoxy-p-L-thymin;

3',5'-L-divalin ester 2'-deoxy-p-L-adenosinu; 3',5'-L-divalin ester 2'-deoxy-pL-guanosinu; 3',5'-divalin ester 2'-deoxy-p-L-5-fluoro-cytidinu; 3',5'-L-divalin ester 2'-deoxy-p-L-uridinu; 3',5'-diacetyl ester 2'-deoxy-p-L-cytidinu; 3',5'• · • 99 9 9 9 9 9 9 • · · ·· · · · ·

8······· · ··· · · _ · · ········ • ·· · · · · ·· ·· · « diacetyl ester 2'-deoxy-p-L-thyminu; 3',5'-diacetyl 2'-deoxy-p-L-adenosinu; 3',5'-diacetyl ester 2'-deoxy-p-L-guanosinu; 3',5'-diacetyl ester 2-deoxy-P-L~ 5-fluoro-cytidinu; a 3',5'-diestery 2'-deoxy-p-L-(cytidinu, 5-fluorocytidinu, guanosinu, uridinu, adenosinu nebo thyminu), kde (i) 3'-ester je aminokyselinový ester a 5'-ester je alkyl nebo aryl ester; (ii) oba estery jsou aminokyselinové estery; (iii) oba estery jsou nezávisle alkyl nebo aryl estery; nebo (iv) 3'-ester je alkyl nebo aryl ester a 5'-ester je aminokyselinový ester.

V dalším provedení vynález poskytuje β-L-nukleosid 3'-prekurzor, definovaný vzorcem (I):

, BASE

0) nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxylakyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu;

X je atom O, S, SO2 nebo CH₂; a

BASE je purinová nebo pyrimidinová báze, která může být případně substituovaná.

• · · ·

-9Ve výhodném provedení X je atom O.

Ve výhodném provedení jsou R¹ a/nebo R² aminokyselinové zbytky.

V jednom provedení je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

V dalším provedení předkládaného vynálezu 3'-prekurzor β-L-nukleosid je βL-2'-deoxypurin podle vzorce:

γ

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem, cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, • · • · « · • · · ·

aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di-nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu;

Y je skupina OR³, NR³R⁴ nebo SR³; a

X¹ a X² jsou nezávisle zvoleny ze skupin H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, halogen, OR⁵, NR⁵R⁶ nebo SR⁵; a

R³, R⁴, R⁵ a R⁶jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

V jednom provedení je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR^wR¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R^w za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodíku, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

-11 Ve zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je p-L-2'-deoxyadenosin podle vzorce;

nr³r⁴

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem, cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxylakyl, COsubstituovaná skupina alkyl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s římým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu; a

R³ a R⁴ jsou nezávisle skupiny vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem, cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

-.12R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán ne R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaná na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

V jiném výhodném provedení R² je aminokyselinový zbytek a zvláště L-valinyl

V jednom provedení R³ je atom vodíku a R⁴ je dimethylaminomethylen.

V jiném provedení R³ je atom vodíku a R⁴ je skupina acetyl.

V jiném provedení R³ je atom vodíku a R⁴je L-vaiinyl.

V jiném zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukfeosid je 3-L-2'-deoxy guanosin podle vzorce:

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO·· · ·» · » t · • ♦ · · » • «····· · • · · » « · · · » · *

- 134 · · • « * « » * i 9 · 9 • · · · substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu; a

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Ve výhodném provedení R¹ je atom H.

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

π

V jiném výhodném provedení R je aminokyselinový zbytek a zvláště L-valinyl.

-14V jednom provedení R⁵ je skupina vodík a R⁶ je skupina dimethylaminomethylen.

•» 0 • » 0 C * * · · · * 0 0 0 > · 0

00 0 » •» 0000

0 4« 0

0 0 0 ·

0 · · * 0

0 0 · 0 0 0

0000

V jiném provedení R⁵ je skupina vodík a R⁶ je skupina acetyl.

V jiném provedení R⁵ je skupina vodík a R⁶ je L-valinyl.

V jiném zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je β-L-2'-deoxyinosin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl nebo jeho prekurzor podle vzorce:

o

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem, cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu.

Ve výhodném provedení R¹ je atom H.

15V jednom provedení je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklícká část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo skupina alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

o

V jiném provedení podle předkládaného vynálezu 3'-prekurzor β-L-nukleosid je p-L-2'-deoxypyrimidin podle vzorce:

x¹A) ’N

R^lO

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-16• · · · • · • · substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl aminokyselinového zbytku, mono-, di nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu;

Y je skupina OR³, NR³R⁴ nebo SR³;

X¹ je zvolen ze skupin H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, halogen, OR⁵, NR⁵R⁶nebo SR⁵; a

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaná na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

V jednom zvláštním provedení podle vynálezu 3'-prekurzor β-L-nukleosid je βL-2'-deoxycytidin podle vzorce:

-17nr³r⁴

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono- di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trífosfátu nebo fosfátového derivátu;

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nazávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

V jednom provedení X¹ je skupina vodík.

• ·

-18V jiném provedení X¹ je skupina halogen, konkrétně fluor, chlor, brom nebo jod.

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroárylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl,propyl a cyklopropyl).

V jiném výhodném provedení R² je aminokyselinový zbytek a zvláště L-valinyl.

V jednom provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina dimethylaminomethylen.

V jiném provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina acetyl.

V jiném provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina L-valinyl.

V jiném provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je p-L-2'-deoxyuridin podle vzorce:

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový . derivát; a

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu.

Ve výhodném provedení R¹ je atom H.

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

• · • · · ·

-20··· · \f jiném výhodném provedení R² je aminokyselinový zbytek a zvláště L-valinyl.

V jiném provedení β-L-nukleosid 3'-prekurzor je β-L-thymidin podle vzorce:

o nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono- di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu.

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo hetarocyklická část;

-21 R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

Vynález také poskytuje kombinace alespoň dvou z popsaných prekurzorů.

Vynález dále poskytuje alespoň některý z popsaných 3'-prekurzorů v kombinaci nebo alternaci s druhým nukleosidem tak, že prokazuje aktivitu proti hepetitídě B, přičemž zahrnuje, bez omezení, základní látku (parent drug) kteréhokoliv z definovaných prekurzorů, např. 2'-deoxy-p-L-nukleosidy, zahrnující 2'-deoxy-p-L-cytidin; 2'-deoxy-p-L-cytidin; 2'-deoxy-P-L-thymin; 2'-deoxy-p-L-adenosin; 2'-deoxy-p-L-guanin; 2'-deoxy-p-L-5-fluorocytidin. Alternativně mohou být 3'-prekurzory podávány v kombinaci nebo v alternaci s jiným prostředkem proti viru hepatitidy B, jako je (-)-cis-2',3'-dideoxy-3'thiacytidin; cis-2',3'-dideoxy-3'-thia-5-fluorocytidin; L-FMAU; adefovir; famcyklovir; a entecivir nebo kterákoliv jiná sloučenina, která má hodnotu EC₅o menší než 10 nebo 15 mikromol v buňkách2.2.15; nebo jejich prekurzory nebo farmaceuticky přijatelné soli.

Vynález dále zahrnuje podávání prekurzorů v kombinaci nebo alternaci s imunomodulátorem nebo jiným farmaceuticky aktivním modifikátorem virové replikace, zahrnující biologický materiál, jako je protein, peptid, oligonukleotid nebo gama globulin, zahrnující, bez omezení, interfereon, interleukin, nebo protismyslové oligonukleotidy na geny, které způsobují nebo regulují replikaci hepatitidy B.

• · · ·

QQ · ···· · · · · · · · «

-čí- j ·..··..· ·..··..·

Účinost základních léčiv podle sloučeniny proti HVB lze měřit podle koncentrace sloučeniny nezbytné pro snížení míry replikace viru in vitro o 50 % (např. hodnota EC₅o sloučeniny), podle metod uvedených podrobněji. Ve výhodných provedeních má základní látka (parent) prekuzoru sloučeniny hodnotu EC₅o menší než 15 nebo výhodně menší než 10 mikromol in vitro, pokud se testovala v buňkách 2.2.15 naočkovaných virem hepatitidy.

Podrobný popis vynálezu

Popisovaným vynálezem je sloučenina, způsob a prostředek pro léčbu viru hepatitidy B u lidí a jiných zvířecích hostitelů. Způsob léčby HBV zahrnuje podávání účinného množství 3'-prekurzoru β-L-nukleosidu popsaného ve vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, případně farmaceuticky přijatelný nosič. Sloučenina podle vynálezu má buď antivirovou aktivitu (např. anti-HBV), nebo se metabolizuje na sloučeninu, která má potom tuto aktivitu.

Souhrně předkládaný vynález zahrnuje následující charakteristické znaky:

(a) 3'-Prekurzory β-L-2'-deoxynukleosidu, popsané ve vynálezu, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a směsi;

(b) 3'-Prekurzory β-L-deoxy-nukleosidu, popsané ve vynálezu, a jejich farmaceuticky přijatelné soli, estery a směsi pro použití při léčbě nebo profylaxi infekce heapatitídy B, zvláště u jednotlivců s diagnózou infekce hepatitidy B nebo existuje riziko, že dostanou infekci hepatitidy B;

(c) Použití těchto 3'-prekurzorů β-Ι,-ζ'^βοχν-ηυΜβοβ'^υ a jejich farmaceuticky přijatelných solí, esterů a směsí při výrobě léčiva pro léčbu infekce hepatitidy B;

(d) Farmaceutické formulace, obsahující 3'-prekurzory β-L-2'-deoxynukleosidu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem;

• · · • · • · · ·

(e) 3'-Prekurzory p-L-2'-deoxy-nukleosidu nebo jejich farmaceiuticky přijatelné soli, estery a směsi, popsané v podstatě za nepřítomnosti opozitních enantiomerů popsaného nukleosidu nebo v podstatě izolované od jiných chemických entit;

(f) Způsoby výroby 3'-prekurzorů p-L-2'-deoxy-nukleosidu, popsané podrobněji níže;

(g) Způsoby výroby 3'-prekurzorů p-L-2'-deoxynukleosidu v podstatě za nepřítomnosti enantiomerů popsaného nukleosidu nebo v podstatě izolované od jiných chemických entit;

(h) Léčba hostitele infikovaného hepatitidou B, které zahrnuje podávání účinného množství 3'-prekurzoru p-L-2'-deoxynukleosidu, jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo směsi s druhým prostředkem proti hepatitidě B;

(i) Léčba hostitele infikovaného hepatitidou B, která zahrnuje podávání účinného množství 3'-prekurzoru p-L-2'-deoxy-nukleosidu, jeho farmaceuticky přijatelné soli, esteru nebo směsi se základní látkou (parent) různého p-L-2'-deoxynukleosidu;

(j) Léčba hostitele infikovaného hepatitidou B, která zahrnuje podávání účinného množství 3'-prekurzoru p-L-2'-deoxycytidinu, jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo esteru se základní látkou druhého prostředku proti hepatitidě B;

(k) Léčba hostitele infikovaného hepatitidou B, která zahrnuje podávání účinného množství 3',5'-divalyl nebo diacetyl esteru p-L-2'-deoxycytidinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo esteru s druhým prostředkem proti hepatitidě B; a (l) Léčba hostitele infikovaného hepatitidou B, která zahrnuje podávání účinného množství 3',5-divalyl nebo diacetyl esteru p-L-2'-deoxycytidinu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli nebo esteru s p-L-2'deoxythymidinem nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli.

• 9 • · 9

-24Zvláště výhodnou kombinací je 3',5'-prekurzor β-L-dC (také se uvádí jako LdC) se základní látkou β-L-dT (také se uvádí jako L-dT) a zvláště 3',5'-divalyl nebo 3’,5'-diacetyl ester β-L-dC v kombinaci s β-L-dT. Orální biologická dostupnost L-dC jako neutrální baze a soli HCl je nízká u hlodavců a nelidských primátů. Ukázalo se, že existuje značná kompetice L-dC s jinými nukleosidy nebo analogy nukleosidů při absorpci nebo transportu z gastrointestinálního traktu a kompetice jiných nukleosidů nebo analogů nukleosidů při absobci L-dC. Aby se zvýšila orální biologická dostupnost a snížil potenciál interakce léčivo - léčivo, byl zaveden farmakokinetický obraz u opic. Tento obraz identifikoval 3'-prekurzory L-dC, které měly vyšší orální biologickou dostupnost, než molekula základní látky, a snížený účinek na biologickou dostupnost jiných nukleosidů nebo analogů nukloezidů používaných v kombinaci. Příklady těchto nukleosidů nebo analogů nukleosidů, používaných v kombinaci s prekurzory L-dC, jsou L-dT, L-dA, lamivudin nebo FTC.

Tímto přístupem se zjistilo, že 3',5'-divalin ester L-dC měl vyšší orální biologickou dostupnost, než základní látka L-dC a sníženou interakci s jinými nuklozidy nebo analogy nuklozidů, pokud se používaly v kombinaci, ve srovnání s L-dC. Farmakokinetická studie také ukázala, že 3',5'-divalin ester L-dC se převedl na základní látku L-dC deesterifikcí v gastrointestinální sliznici, krvi nebo játrech

3',5'-Divalin ester L-dC je zřejmě aktivně transportován z gastrointestinálního průchodu (lumen) po orální dávce do krevního toku aminokyselinovou trasportní fukcí sliznice gastrointestinálního traktu. To vysvětluje zvýšení orální biologické dostupnosti ve srovnání se základní látkou L-dC, která by byla trasportována primárně nukleosidovou trasportní funkcí. To by také vysvětlilo sníženou kompetici absopce 3',5'-divalin esteru L-dC s jinými nukleosidy nebo analogy nukleosidů, které jsou transportovány nukleosidovou transportní funkcí a nikoliv aminokyselinovou transportní funkcí. Protože částečná deesterifikace divalin esteru L-dC nastává před dokončením

-25···· ·· ···· • · · · · • · · · · · • · · · · · · • · · · · · absorpce, monovalin ester pokračuje v absorpci za použití aminokyselinové trasportní funkce. Proto se udržuje žádaný výsledek lepší absorpce nebo biologické dostupnosti a snížená kompetice s jinými nukleosidy nebo analogy nukleosidů pro absopci do krevního toku.

I. Sloučeniny definované vynálezem

V prvním provedení 2'-deoxy-p-L-nukleosid 3'-prekurzor zahrnuje biologicky odštěpitelné části v obou polohách 3'a 5'. Výhodnými částmi jsou estery L-aminokyseliny, jako je L-valyl a alkyl ester, jako je acetyl. Vynález specificky zahrnuje 3',5'-|_-aminokyselina-p-L-2'-deoxynukleosidy s některou žádanou purinovou nebo pyrimidinovou baží, přičemž základní látka má hodnotu EC50 menší než 15 mikromol, výhodně menší než 10 mikromol, v buňkách 2.2.15; 3',5'-(alkyl nebo aryl)-p-L-2'-deoxynukleosidy s některou žádanou purinovou baží, kde základní látka má hodnotu EC₅₀ menší než 15 a výhodně menší než 10 mikromol v buňkách 2.2.15; a prekurzory 3',5'-diesterů 2'-deoxy-p-Lnukleosidů, kde (i) 3'-ester je ester aminokyseliny a 5'-ester je alkyl nebo aryl ester; (ii) oba estery jsou estery aminokyselin; (iii) oba estery jsou nezávisle alkyl nebo aryl estery a (iv) 3'-ester je nezávisle alkyl nebo aryl ester a 5'ester je ester aminokyseliny, kde základní látka má hodnotu EC50 na dávkování menší než 15 mikromol v buňkách 2.2.15;

Příklady 3'-prekurzorů, spadající do vynálezu, jsou 3',5'-L-valin ester 2'deoxy-p-L-cytidinu; 3',5'-L-vylin ester 2'-deoxy^-L-thyminu; 3',5'-L-valin ester 2'deoxy-p-L-adenosinu; 3',5'-L-valin ester 2'-deoxy-3-L-guanosinu; 3',5-L-valin ester 2'-deoxy-P-L-5-fluoro-cytidinu; 3',5'-L-vylin ester 2'-deoxyβ-L-uridinu; 3',5'-acetylester 2'-deoxy^-L-cytidinu; 3',5-acetyl ester 2'-deoxyβ-L-thyminu; 3',5-acetylester 2'-deoxy^-L-adenosinu; 3',5'-acetylester 2'deoxy^-L-guanosinu; 3',5'-acetylester 2'-deoxy^-L-5-fluoro-cytidinu; a 3',5'diestery 2'-deoxy^-L-(cytidinu, 5-fluorocytidinu, guanosinu, uridinu, adenosinu nebo thyminu), kde (i) 3'-ester je ester aminokyseliny a 5'-ester je

9999 » * « 999

· • · »

-269 9 · 4 alkyl nebo aryl ester; (ii) oba estery jsou aminokyselinové estery, (iii) oba estery jsou nezávisle alkyl nebo aryl estery nebo (iv) 3'-ester je alkyl nebo aryl ester a 5'-ester je aminokyselinový ester.

V jednom provedení vynález poskytuje 3'-prekurzor β-L-nukleosid definovaný vzorcem (I):

R^JO

(I)

BASE nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, kde

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-araloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono- di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu;

X je atom O, S, skupina SO₂ nebo CH₂; a

BASE purinová nebo pyrimidinová baze, která může být případně substituovaná.

Ve výhodném provedení X je atom O.

-27• *

V jednom provedení je aminokyselinový zbytek podle vzorce

C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ ja alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alky!) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaná na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupina methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

V prvním subprovedení R² je C(O)-alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V druhém subprovedení R² je C(O)-nižší alkyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V třetím subprovedení R² je C(O)-methyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve čtvrtém subprovedení R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹) a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V pátém subprovedení R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je isopropyl, alespoň některý z R¹⁰ a R¹¹ je skupina vodíku a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V šestém subprovedení R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je aminokyselinový postranní řetězec a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

-28··· · · · ··· ······· · · · · · · • · ·«·· ···· ···· · ·· * · · · ··

V sedmém subprovedení R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je nepolární aminokyselinový postranní řetězec a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Neomezující příklady subprovedení mohou být definovány vzorce (I), kde

(1)	R²	je C(O)-methyl a BASE je adenin;
(2)	R²	je C(O)-methyl a BASE je chráněný adenin;
(3)	R²	je C(O)-methyl a BASE je cytosin;
(4)	R²	je C(O)-methyl a BASE je chráněný cytosin;
(5)	R²	je C(O)-methyl a BASE je thymin;
(6)	R²	je C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸ je isopropyl a BASE je adenin;
(7)	R²	je C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸ je isopropyl a BASE je chráněný adenin;
(8)	R²	je C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸ je isopropyl a BASE je cytosin;
(9)	R²	je C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸ je isopropyl a BASE je chráněný cytosin;
(10)	R²	je C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R₈ je isopropyl a BASE je thymin.

V osmém subprovedení X je atom O, R² je skupina C(O)-alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V devátém subprovedení X je atom O, R² je C(O)-nižší alkyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V desátém subprovedení X je atom O, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

-29V jedenáctém subprovedení X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹) a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvanáctém subsprovedení X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸je isopropyl, alespoň některý z R¹⁰ a R¹¹ je skupina vodíku a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V třináctém subprovedení X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je aminokyselinový postranní řetězec a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve čtrnáctém subprovedení X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹); R⁸ je nepolární aminokyselinový řetězec; alespoň některý z R⁵ a R⁶ je skupina vodík a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Neomezující příklady subprovedení mohou být definovány vzorcem (I), kde;

(1) X je atom O, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je adenin;

(2) (3) (4)

X je atom O, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je chráněný adenin;

X je atom O, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je cytosin;

X je atom O, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je chráněný cytosin;

(5) X je atom O, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je thymin;

(6) X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je isopropyl a BASE je adenin;

(7) X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je chráněný adenin;

(8) X je atom O, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je cytosin;

• · · ·· · · · · ··· · · · ·· · ······· · ··· · ·

ΛΛ · · ···· ····

- ου - ···· · ·· ·· ·· ·· (9) X je atom 0, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je chráněný cytosin;

(10) Xje atom O, R²je C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); Rs je skupina isopropyl a BASE je thymin.

V patnáctém subprovedení X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V šestnáctém subprovedení X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-nižší alkyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V sedmnáctém subprovedení X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V osmnáctém subprovedení X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹) a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

V devatenáctém subprovedení X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je isopropyl, alespoň některý z R¹⁰ a R¹¹ je skupina vodík a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin a thymin.

2

Ve dvacátém subprovedení X je atom O, R je skupina vodík, R je

C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je aminokyselinový postranní řetězec a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

• »

-31 Ve dvacátém prvním subprovedení X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹); R⁸ je nepolární aminokyselinový postranní řetězec; alespoň některý z R⁵ a R⁶ je skupina vodík a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Neomezující příklady subprovedení mohou být definovány vzorcem (I), kde:

(1) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je adenin;

(2) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je chráněný adenin.

(3) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je cytosin;

(4) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je chráněný cytosin;

(5) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je skupina C(O)-methyl a BASE je thymin;

(6) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je adenin;

(7) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je chráněný adenin;

(8) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je cytosin;

(9) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je chráněný cytosin;

(10) X je atom O, R¹ je skupina vodík, R² je C(O)C(R⁸)H)(NH²); R⁸ je isopropyl a BASE je thymin.

• · · · · · ·· · ······· · · · · · ·

ΛΑ * · ···· ····

- “ ···· · ·· ·· ·« ··

Ve dvacátém druhém subprovedení X je atom 0, R¹ a R² jsou nezávisle skupiny C(O)-alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvacátém třetím subprovedení X je atom O, R¹ a R²jsou nezávisle skupiny C(O)-nižší alkyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvacátém čtvrtém subprovedení X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle skupiny C(O)-methyl a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvacátém pátém subprovedení X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹) a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvacátém šestém subprovedení X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je skupina isopropyl, alespoň některý z R¹⁰ a R¹¹je skupina vodík a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvacátém sedmém subprovedení X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹), R⁸ je aminokyselinový postranní řetězec a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

Ve dvacátém osmém subprovedení X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NR¹⁰R¹¹); R⁸ je nepolární aminokyselinový postranní řetězec; alespoň některý z R⁵ a R⁶ je skupina vodík a BASE je adenin, chráněný adenin, cytosin, chráněný cytosin nebo thymin.

• ·

-33Neomezující příklady subprovedení mohou být definovány vzorcem (I), kde:

(1) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle skupina C(O)-methyl a BASE je adenin;

(2) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle skupina C(O)-methyl a BASE je chráněný adenin;

(3) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle skupina C(O)-methyl a BASE je cytosin;

(4) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle skupina C(O)-methyl a BASE je chráněný cytosin;

(5) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle skupina C(O)-methyl a BASE je thymin;

(6) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NH₂); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je adenin;

(7) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je chráněný adenin;

(8) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je cytosin;

(9) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R^S)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je chráněný cytosin;

(10) X je atom O, R¹ a R² jsou nezávisle C(O)C(R⁸)(H)(NH²); R⁸ je skupina isopropyl a BASE je thymin.

V jiném provedení předkládaného vynálezu 3'-prekurzor β-L-nukleosid je p-L-2'-deoxypurin podle vzorce:

γ

r2 • · ··« ·· · « ··· · · · ·· • ···»·· « ··« · οχ · * · ·» · » · ·

- Ο*+ “ ··»·· ··.->· ·« nebo jeho farmaceuticky přijatelná sů, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo trifosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkysulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu;

Y je skupina OR³, NR³R⁴ nebo SR³; a

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně

R⁸ je alkylová, arylová, heteroaralová nebo heterocyklícká část;

• « * * · » · · · · ·

-35R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

Ve zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je p-L-2'-deoxyadenosin podle vzorce:

niFr⁴

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trofosfát nebo fosfátový derivát;

R³ a R⁴jsou nezávisle skupiny vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen) CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

• · • · · ·

Ve výhodném provedení R¹ je atom H.

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

V jiném výhodném provedení R² je aminokyselinový zbytek, zvláště L-valinyl.

V jiném provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina acetyl.

V jiném provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je L-valinyl.

V jiném zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je β-L-2'-deoxyguanosin podle vzorce:

• « • · • » · ·

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R⁵ a R⁶ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinová zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a • ·

QQ · · · · · · · νθ “ ···· · ·« · · _{w e}

V jednom provedení R⁵ je skupina vodík a R⁶ je skupina dimethylaminomethylen.

V jiném provedení R⁵ je skupina vodík a R⁶ je skupina acetyl.

V jiném provedení R⁵ je skupina vodík a R⁶ je L-valinyl.

V jiném zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je β-L-2'-deoxyinosin nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl nebo prekurzor podle vzorce:

o

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

-39• ·

R² je zvolen za skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu.

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

V jiném provedení podle předkládaného vynálezu 3'-prekurzor β-L-nukleosid je β-L-2'-deoxypyrimidin podle vzorce:

• · · ·

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinového zbytku, mono-, di- nebo trifosfátu nebo fosfátového derivátu;

Y je skupina OR³, NR³R⁴ nebo SR³;

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl) dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

-41 R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

V jednom zvláštním provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je β-L-2'-deoxycytidin podle vzorce:

nr³r⁴

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubtituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R³ a R⁴ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl (zvláště cyklopropyl), dialkylaminoalkylen (zvláště » · • · ·

-42dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono-, di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklické část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸), nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupina methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

V jednom provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je dimethylaminomethylen.

V jiném provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina acetyl.

V jiném provedení R³ je skupina vodík a R⁴ je L-valinyl.

-43o

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, COsubstituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono- di- nebo trifosfát nebo fosfátový derivát: a

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

·· · • ♦ » • · · · • · · «

• · · · • · · ·

-44V jiném výhodném provedení R² je aminokyselinový zbytek a zvláště L-valinyl.

V jiném provedení 3'-prekurzor β-L-nukleosid je β-L-thymidin podle vzorce:

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

Ve výhodném provedení R¹ je skupina H.

R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

• · · · • · · *

-45R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

II. Definice a použití pojmů

Uvedený pojem alkyl, pokud není uvedeno jinak, znamená nasycený, primární, sekundární nebo terciární uhlovodík Ci až C10 s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický a specificky zahrnuje skupiny methyl, trifluormethyl, ethyl, propyl, isopropyl, cyklopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, cyklopentyl, isopentyl, neopentyl, hexyl, isohexyl, cyklohexyl, cyklohexylmethyl, 3-methylpentyl, 2,2-dimethylbutyl a 2,3-dimethylbutyl. Pojem zahrnuje substituovanou i nesubstituovanou skupinu alkyl. Částmi, kterými může být alkylová skupina substituovaná, jsou zvoleny ze skupin hydroxyl, amino, alkylamino, arylamino, alkoxy, aryloxy, nitro, kyano, kyseliny sulfonové, sulfátu, kyseliny fosforečné, fosfátu nebo fosfonátu, buď nechráněných nebo chráněných podle potřeby, jako je známo odborníkovi v oboru, například, jak je uvedeno v Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, druhá edice, 1991, a tím začleněno do reference.

Používaný pojem nižší alkyl, pokud není uvedeno jinak, znamená skupinu Ci až C₄ alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo, pokud je to vhodné, cyklický alkyl, zahrnující substituovanou nebo nesubstituovanou formu. Pokud není v této přihlášce uvedeno jinak, je-li skupina alkyl vhodná část, skupina nižší alkyl je výhodná. Podobně, je-li skupina alkyl nebo nižší alkyl vhodná část, nesubstituovaná skupina alkyl nebo nižší alkyl je výhodná.

• f • ·

9 0999

9

90 9

-46Používaný pojem „chráněný“ a pokud není uvedeno jinak znamená skupinu, která se přidá k atomu kyslíku, dusíku nebo fosforu, aby se předešlo jeho další reakci nebo pro jiné účely. Odborníkovi v oboru organických syntéz je známo velké množství ochranných skupin atomu kyslíku a dusíku. Neomezující příklady ochranných skupin jsou uvedeny v Greene, et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, druhá edice, 1991.

Používaný pojem aryl, pokud není uvedeno jinak, znamená skupinu fenyl, bifenyl nebo naftyl a výhodně fenyl. Pojem zahrnuje substituovanou i nesubstituovanou část. Arylová skupina může být substituovaná jednou nebo více částmi, zvolenými ze skupin hydroxyl, amino, alkylamino, arylamino, alkoxy, aryloxy, nitro, kyano, kyselina sulfonová, sulfát, kyselina fosforečná, fosfát nebo fosfonát, buď nechráněná nebo chráněná podle potřeby, jak je známo odborníkovi v oboru, například, jako uvedeno v Greene et al., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley and Sons, druhá edice, 1991.

θ

Pojem purinová nebo pyrimidinová baze zahrnuje, bez omezení, adenin, N alkylpuriny, N⁶-acylpuriny (kde acyl je C(O)(alkyl, aryl, alkylaryl nebo arylalkyl), N⁶-benzylpurin, N⁶-halogenpurin, N⁵-vinylpurin, N⁶-acetylenový purin, N⁶-acylpurin, N⁶-hydroxyalkylpurin, N⁶-thioalkylpurin, N²-alkylpuriny, N²alkyl-6-thiopuriny, thymin, cytosin, 5-fluorocytosin, 5-methylcytosin, 6-azapyrimidin, zahrnující 6-azacytosin, 2-a/nebo 4-merkaptopyrimidin, uracii, 6-halogenuracil, zahrnující 5-fluorouracil, C⁵-alkylpyrimidiny, C⁵-benzylpyrimidiny, C⁵-halogenpyrimidiny, C⁵-vinylpyrimid in, C⁵-acetylpyrimidin, C⁵-acylpyrimidín, C⁵-hydroxyalkylpurin, C⁵-amindopyrimidin, C⁵-kyanopyrimidin, C⁵-nitropyrimidin, C⁵-aminopyrimidin, N²-alkylpuriny, N²-alkyl-6thiopuriny, 5-azacytidinyl, 5-azauracilyl, triazolopyridinyl, imidazolopyridinyl, pyrrolopyrimidinyl a pyrazolopyrimidinyl. Purinové báze zahrnují, bez omezení, guanin, adenin, hypoxanthin, 2,6-diaminopurin a 6-chloropurin.

• r ·» td···

t t

·· ···

-47Funkční skupiny kyslík a dusík na bázi mohou být chráněny, je-li to nutné nebo podle potřeby. Vhodné ochranné skupiny jsou odborníkovi v oboru dobře známé a zahrnují skupiny trimethylsilyl, dimethylhexylsilyl, t-butyldimethylsilyl a t-butyldifenylsilyl, trityl, alkyl a acyl, jako je skupina acetyl a propiionyl, methansulfonyl a p-toluensulfonyl.

Pojem acyl znamená ester karboxylové skupiny, kde nekarbonylová část esterové skupiny je zvolena ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl nebo nižší alkyl, alkoxyalkyl, zahrnující skupiny methoxymethyl, aralkyl, zahrnující skupiny benzyl, aryloxyalkyl, jako je skupiny fenoxymethyl, aryl, zahrnující skupinu fenyl případně substituovanou skupinou halohgen, Ci až C₄ alkyl nebo C-ι až C₄ alkoxy, sulfonátové estery, jako je skupina alkyl nebo aralkyl sulfonyl, zahrnující skupinu methansulfonyl, mono-, di- nebo trifosfátový ester, trityl nebo monomethoxytrityl, substituovaná skupina benzyl, trialkylsilyi (např. dimethyl-t-butylsilyl) nebo difenylmethylsilyl. Arylové skupiny v esterech případně obsahují fenylovou skupinu.

Pojem „nižší acyl“ znamená acylovou skupinu, kde nekarbonylová část je nižší alkyl.

Pojem aminokyselina zahrnuje v přírodě se vyskytující nebo syntetické α, β, γ nebo δ aminokyseliny a zahrnuje, bez omezení, aminokyseliny, které se nacházejí se v proteinech, např. glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, methionin, fenylalanin, tryptofan, prolin, serin, threonin, cystein, tyrosin, asparagin, glutamin, aspartát, glutamát, lysin, arginin a histidin. Ve výhodném provedení je aminokyselina L-konfiguraci. Alternativně může být aminokyselina derivát alanylu, valinylu, leucinylu, isoleucinylu, prolinylu, fenylalaninu, tryptofanylu, methioninu, glycinylu, serinylu, threoninylu, cysteinylu, tyrosinylu, asparaginylu, glutaminylu, aspartoylu, glutaroylu, lysinylu, argininylu, histidinylu, β-alanylu, β-valinylu, β-leucinylu, β-isoleucinylu, β-prolinyiu, β-fenylalyninylu, β-tryptofanylu, β-methioninylu, β-glycinylu, β-serinylu, β-threoninylu, β-cysteinylu, β-tyrosinylu, β-aspara• · · • · · · • · · · • · · · · · ·

-48ginylu, β-glutaminylu, β-aspatroylu, β-glutaroylu, β-lysinylu, β-argininylu nebo β-histidinylu.

Používaný pojem heteroaryl nebo heteroaromatický znamená aromatickou část, která zahrnuje alespoň jeden atom síry, kyslíku dusíku nebo fosforu v aromatickém kruhu. Pojem heterocyklický znamená nearomatickou cyklickou skupinu, kde existuje alespoň jeden heteroatom, jako je atom kyslíku, síry, dusíku nebo fosforu ve kruhu. Neomezující příklady heteroarylových a heterocyklických skupin zahrnují skupiny furyl, furanyl, pyridyl, pyrimidyl, thienyl, isothiazolyl, imidazolyl, tetrazolyl, pyrazinyl, benzofuranyl, benzothiofenyl, chinolyl, isochinolyl, benzothienyl, isobenzofuryl, pyrazolyl, indolyl, isoindolyl, benzimidazolyl, purinyl, karbazolyl, oxazolyl, thiazolyl, isothiazolyl, 1,2,4-thiadiazolyl, isooxazolyl, pyrrolyl, chinazolinyl, cinnolinyl, ftalazinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, thiofen, furan, pyrrol, isopyrrol, pyrazol, imidazol, 1,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oxazol, isoxazol, thiazol, isothiazol, pyrimidin nebo pyridazin a pteridinyl, aziridiny, thiazol, isothiazol, 1,2,3oxadiazol, thiazin, pyridiny, pyrazin, piperazin, pyrrolidin, oxazirany, fenazinfenothiazin, morfolinyl, pyrazolyl, pyridazinyl, pyrazinyl, chinoxalinyl, xanthinyl, hypoxanthinyl, pteridinyl, 5-azacytidinyl, 5-azauracilyl, triazolopyridinyl, imidazolopyridinyl, pyrrolopyrimidinyl, pyrazolopyrimidinyl, adenin, N6-alkylpuriny, N6-benzylpurin, N6-halopurin, N6-vinylpurin, N6-acetylenový purin, N6-acylpurin, N6-hydroxyalkylpurin, N6-thialkylpurin, thymin, cytosin, 6azapyrimidin, 2-merkaptopyrimidin, uráčil, N5-alkylpyrimidiny, N5benzylpyrimidiny, N5-halogenpyrimidiny, N5-vinylpyrimidin, N5-acetylenový pyrimidin, N5-acylpyrimidin, N5-hydroxyalkylpurin a N6-thioalkylpurin a isocazolyl. Heteroaromatické a heterocyklické části mohou být případně substituované způsobem popsaným výše pro skupinu aryl, včetně substituované jedním nebo více substituenty zvolenými ze skupin halogen, halogenalkyl, alkyl, alkoxy, hydroxy, karboxylové deriváty, amido, amino, alkylamino, dialkylamino. Heteroaromatická skupina může být částečně nebo zcela hydrogenované podle potřeby. Jako neomezující příklad se může použít dihydropyridin místo pyridinu. Funkční skupiny kyslík a dusík na heteroarylové skupině se mohou chránit, je-li to nutné nebo podle potřeby, vhodné ochranné • · «·· · · · · * * ······· · ··· · · /Λ · · ········

- 4y - ···· · ·· ·· ·· ·· skupiny jsou odborníkovi v oboru dobře známé a zahrnují skupiny trimethylsilyl, dimethylhexylsilyl, t-butyldimethylsilyl a t-butyldifenylsilyl, trityl nebo substituované skupinu trityl, alkyl, acyl, jako je skupina acetyl a propionyl, methansulfonyl a p-toluensulfonyl.

Používaný pojem „v podstatě volný enantiomer“ nebo „v podstatě v nepřítomnosti enantiomerů“ znamená nukleosidovou směs, která zahrnuje alespoň 95 % až 98 % hmotn. a dokonce výhodněji 99 % až 100 % hmotn. dezignovaného enantiomerů tohoto nukleosidu. Ve výhodné provedení, ve způsobech a sloučeninách podle vynálezu jsou sloučeniny v podstatě volné enantiomery.

Podobně pojem „izolovaný“ znamená nukleosidovou směs, která zahrnuje alespoň 85 % nebo 90 % hmotn., výhodně 95 % až 98 % hmotn. a dokonce výhodněji 99 % až 100 % hmotn. nukleosidu, zbytek obsahuje jiné chemické druhy nebo enantiomery.

Používaný pojem „nezávisle“ označuje proměnlivost tím, že se proměná používá nezávisle podle aplikace. Tedy, ve sloučenině, jako je R“XYR“, kde R“ je „nezávisle uhlík nebo dusík“ mohou být obě skupiny R“ uhlík nebo dusík nebo jedna skupina R“ může být uhlík a druhá skupina R“ dusík.

Používaný pojem hostitel znamená unicelulární nebo multicelulární organizmus, kde se může virus replikovat, včetně buněčných linií a zvířat, a výhodně člověka. Alternativně může být hostitel nosičem části genomu viru hepatitidy B, jehož replikace nebo funkce může být upravena sloučeninami podle předkládaného vynálezu. Pojem hostitel specificky znamená infikované buňky, buňky transfikované celým nebo částí genomu HBV a zvířata, zvláště primáti (včetně šimpanzů) a lidé. U většiny zvířecích aplikací podle vynálezu je hostitelem lidský pacient. Veterinární aplikace, avšak v určitých indikacích, • « · jsou jasně anticipovány (předjímány) předkládaným vynálezem (jako šimpanzi).

-50Pojem „farmaceuticky přijatelné soli“ a „farmaceuticky přijatelné komplexy“ se používají se specifikací popsat některou farmaceuticky přijatelnou formu nukleosidové sloučeniny, která při podávání pacientovi poskytuje nukleosidovou sloučeninu a má minimální, pokud možno žádné, nežádoucí toxikologické účinky. Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují soli odvozené od farmaceuticky přijatelných anorganických baží a kyselin. Neomezující příklady těchto solí jsou (a) adiční soli s kyselinami tvořené s anorganickými kyselinami (například kyselina chlorovodíková, kyselina bromovodíková, kyselina sírová, kyselina fosforečná, kyselina dusičná a podobně), a soli tvořené s organickými kyselinami, jako je kyselina octová, kyselina oxalová, kyselina vinná, kyselina jantarová, jablečná, kyselina askorbová, kyselina benzoová, kyselina tříslová, kyselina palmová, kyselina alginová, kyselina polyglutamová, kyselina naftalensulfonová, kyselina naftalendisulfonová a kyselina polygalakturonová; (b) adiční soli s bázemi tvořené s kationty, jako jsou soli odvozené od alkylických kovů, soli odvozené od kovů alkalických zemin, sodíku, draslíku, zinku, vápníku bismutu, bária, hořčíku, hliníku, mědi, kobaltu, niklu, kadmia a podobně, nebo s organickým kationtem vytvořeným z Ν,Ν-dibenzylethylendiaminu, čpavku nebo ethylendiaminu; nebo (c) kombinace (a) a (b); např. sůl tanátu zinku nebo podobně.

Farmaceuticky přijatelné prekurzory znamenají sloučeninu, která se v hostiteli metabolizuje, například hydrolyzuje nebo oxiduje, za vzniku sloučeniny podle předkládaného vynálezu. Typické příklady prekurzorů zahrnují sloučeniny, které mají biologicky labilní ochranné skupiny na funkční části aktivní sloučeniny. Prekurzory zahrnují sloučeniny, které lze oxidovat, redukovat, aminovat, deaminovat, hydroxylovat, dehydroxylovat, hydrolyzovat, dehydrolyzovat, alkylovat, dealkylovat, acylovat, deacylovat, fosforylovat, defosforylovat za vzniku aktivní sloučeniny. Sloučeniny podle vynálezu mají anti-51 virovou aktivitu proti HBV nebo se metabolizují na sloučeninu, která má takovou aktivitu.

III. Formulace nukleotidové soli nebo prekurzoru

V případech, kdy jsou sloučeniny dostatečně bazické nebo kyselé, aby tvořily stabilní netoxické soli kyseliny nebo baze, může být vhodné podávání sloučeniny ve formě farmaceuticky přijatelné soli. Příklady farmaceuticky přijatelných solí jsou adiční soli s organických kyselinami, které tvoří fyziologicky přijatelný aniont, například tosylát, methansulfonát, acetát, citrát, malonát, tartarát, sukcinát, benzoát, askorbát, α-ketoglutarát a a-glycerofosfát. Mohou se také tvořit vhodné anorganické soli, které zahrnují sulfát, nitrát, bikarbonát a karbonát.

Farmaceuticky přijatelné soli se mohou získat za použití standardních postupů, které jsou dobře známé v oboru, například reakcí dostatečně bazické sloučeniny, jako je amin s vhodnou kyselinou, přičemž vznikne fyziologicky přijatelný aniont. Mohou se také vyrobit soli alkalických kovů (například sodíku, draslíku nebo lithia) nebo kovů alkalických zemin (například vápníku) karboxylových kyselin.

Některé z popsaných nukleosídů se mohou podávat ve formě nukleosidového prekurzoru, aby se zvýšila aktivita, biologická dostupnost, stabilita nebo se jinak změnily vlastnosti nukleosidu. Je známo mnoho ligandů prekurzoru nukleotidu. Obecně alkylace, acylace nebo jiná lipofilní modifikace mono-, dinebo trifosfátu nukleosidu zvýší stabilitu nukleotidu. Příklady skupin substituentů, které mohou nahradit jeden nebo více atomů vodíku na fosfátové části, jsou skupiny alkyl, aryl, steroidy, uhlovodany, zahrnující cukry, 1,2-diacylglycerol a alkoholy. Mnohé jsou popsány v R.Jones a N.Bischofberger, Antiviral Research, 27 (1995), 1-17. Některé z nich se • · • · · · mohou použít v kombinaci s popsanými nukleosidy pro dosažení žádaného efektu.

Aktivní p-L-3'-prekurzor nukleosidu lze také uvést jako 5'-fosfoether lipid nebo 5'-ether lipid, jak je uvedeno v následujících odkazech, které jsou začleněny do referencí: Kučera, L.S., N.lyer, E.Leake, A.Raben, Modest E.K.,

D.L.W., a C.Piantadosi, 1990, „Novel membrane-interactive ether lipid analogs thet inhibit infectious HIV-1 production and induce defective virus formation“, AIDS Res. Hum. Retro Viruses, 6:491-501; Piantadosi, C.,

J. Marasco C.J., S.L. Morris-Natschke, K.L.Meyer, F.Gumus, J.R.Surles,

K. S.Ishaq, L.S.Kučera, N.lyer, C.A.Wallen, S.Piantadosi and E.J.Modest, 1991, „Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleoside conjugates for anti-HIV activity“, J.Med.Chem. 34:1408-1414; Hosteller, K.Y., D,D.Richman, D.A.Carson, L.M. Stuhmiller, G.M.T. van Wijk a H. van den Bosch, 1992, „Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1 replication in CEM and HT4-6C celíš by 3'-deoxythymidine dipfosphate dimyristoylglycerol, a lipid prodrug of 3'-deoxythymidine“, Antimicrob. Agents Chemother., 36:2025-2029; Hosteller, K.Y., L.M. Stuhmiller, H.B.Ienting, H van den Bosch a D.D.Richman, 1990, „Synthesis and antiretroviral activity of phospfolipid analogs of azidothymidin and other antiviral nucleosides“,

J.Biol.Chem. 265:61127.

Neomezující příklady patentů US, které popisují vhodné lipofilní substituenty, které mohou být kovalentně začleněny do nukleosidu, výhodně v poloze 5'OH nuklozidu nebo lipofilní přípravky, zahrnují patenty US č. 5,149,794 (Sep. 22, 1992, Yatvin et al.); 5,194,654 (Mar. 16, 1993, Hosteller et al., 5,223,263 (June 29, 1993, Hosteller et al.); 5,256,641 (Oct. 26, 1993, Yatvin et al.); 5,411,947 (May 2, 1995, Hostetler et al.); 5,463,092 (Oct. 31, 1995, Hostetler et al.); 5,543,389 (Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,390 (Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); 5,543,391 (Aug. 6, 1996, Yatvin et al.); a 5,554,728 (Sep. 10, 1996; Basava et al.), všechny jsou začleněny do referencí. Zahraniční patentové přihlášky, které popisují lipofilní substituenty, které se mohou vázát rQ * · ···« ···«

- oo - ···· · ·· ·· ·. ·« na nukleosidy podle předkládaného vynálezu nebo lipofilní přípravky, zahrnující WO 89/02733, WO 90/00555, WO 91/16920, WO 91/18914, WO 93/00810, WO 94/26273, WO 96/15132, EP 0350 387, EP 93917054.4 a WO 91/19721.

3'-Prekurzor může být podáván jako kterýkoliv derivát, který je schopen přímého nebo nepřímého podávání příjemci, 3'-prekurzor základní sloučeniny nebo který samostatně projevuje aktivitu. Neomezující příklady jsou farmaceuticky přijatelné soli (alternativně uvedené jako „fyziologicky přijatelné soli“) a N⁴-pyrimidin nebo N² a /nebo N⁶-purin alkylované (zvláště s dimethylamino-methylenem) nebo acylované (zvláště skupinou acetyl nebo aminoacetyl) deriváty aktivní sloučeniny. V jednom neomezujícím provedení je acylová skupina ester karboxylové skupiny, kde nekarbonylová část esterové skupiny je zvolena ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl nebo nižší alkyl, alkoxyalkyl, zahrnující skupiny methoxymethyl, aralkyl, zahrnující skupiny benzyl, aryloxyalkyl, jako je skupina fenoxymethyl, aryl, zahrnující skupinu fenyl případně substituovanou skupinou halogen, Cí až C₄ -alkyl nebo Cí až C₄ -alkoxy, estery sulfonátu, jako je skupina alkyl nebo aralkyl sulfonyl, zahrnující skupiny methansulfonyl, fosfát, zahrnující, bez omezení, mono-, di- nebo trifosfátester, trityl nebo monomethoxytrityl, substituovanou skupinu benzyl, trialkylsilyl (např. dimethyl-5-butylsilyl) nebo difenylmethylsilyl. Arylové skupiny v esterech případně zahrnují fenylovou skupinu.

Modifikace 3'-prekurzoru nebo základní sloučeniny a zvláště v poloze N⁴pyrimidinylu nebo N² a/nebo N⁶ purin může mít vliv na biologoíckou dostupnost a rychlost metabolizmu aktivní složky, proto umožňuje kontrolu nad dodávkou aktivní složky. Dále modifikace mohou působit tak, že má antivirová aktivita sloučeniny v některých případech vyšší aktivitu než základní sloučenina. To lze snadno stanovit tím, že se připraví derivátu a testuje jeho antivirové aktivity podle metod popsaných v této přihlášce nebo jiných metod, které jsou známé odborníkovi v oboru.

-54IV. Stereochemie

Vzhledem k tomu, že uhlíky 1'a 4' cukru (uvádí se genericky jako cukerná část) nukleosidu jsou chirální, jejich nevodíkové substituenty (CH2OR a pyrimidinová a nebo purínová báze) mohou mít uspořádání buď cis (na stejné straně) nebo trans (na opačných stranách) s ohledem na kruhový systém cukru. Čtyři optické izomery jsou proto reprezentovány následujícími konfiguracemi (pokud orientace cukerné části v horizontální rovině je taková, že „primární“ kyslík (který je mezi atomy ďa C4' vzadu): ,,β„ nebo „cis“ (s oběma skupinami „nahoře“, které korespondují s konfigurací v přírodě se vyskytujících nukleosidu, např. konfigurace D), ,,β„ nebo cis (s oběma skupinami „dole“, což je konfigurace , která se v přírodě nevyskytuje, např. konfigurace L), „a“ nebo „trans“ (se substituentem C2 „nahoře“ a se substituentem C5 „dole“) a „cc„ nebo trans (se substituentem C2 „dole“ a substituentem C5 „nahoře“).

Nukleosidy podle předkládaného vynálezu jsou v β-L-konfiguraci. Ve výhodném provedení je 2'-deoxy^-L-nukleosid podáván v podstatě ve formě samotného izomeru, např. alespoň přibližně 95 % v označené stereokonfiguraci.

V. Kombinovaná a střídavá terapie

V kombinované terapii jsou efektivní dávky dvou nebo více prostředků podávány společně, zatímco během střídavé terapie je efektivní dávka každého prostředku podávaná v sérii. Dávky budou závislé na rychlostech absorpce, inaktivace a vyměšování léčiva a také na jiných faktorech, které jsou známé odborníkovi v oboru. Je nutno poznamenat, že se hodnoty dávek budou také měnit podle obtížnosti podmínek, které se mají zmírnit. Dále se rozumí, že pro kterýkoliv konkrétní subjekt, by se měly upravit specifické

-55• · dávkovači režimy a programy v čase podle individuální potřeby a profesionálního úsudku osoby podávající nebo dohlížející na podávání prostředku.

Například v některém z popsaných provedení, pokud se podává 3'-prekurzor β-L-deoxynukleosid podle předkládaného vynálezu v kombinaci nebo alternaci s druhým nukleosidovým nebo nenukleosidovým inhibitorem reverzní transkriptázy, který je fosforylovaný na aktivní formu, v jednom provedeni je druhá sloučenina sloučeninou, kterou lze fosforylovat enzymem, který je odlišný od enzymu, který fosforyluje zvolený β-L·2'-nukleosid podle předkládaného vynálezu in vivo. Příklady enzymů kinázy jsou thymidinkináza, cytosinkináza, guanosinkináza, adenosinkináza, deoxycytidinkináza, 5'nukleotidáza a deoxyguanosinkináza.

Tedy v jednom provedení vynález poskytuje kombinaci dvou nebo více prekurzoru nukleosidu podle předkládaného vynálezu, výhodně nukleosidy, které jsou fosforylované odlišnými enzymy, nebo působí rozdílnými biologickými cestami. V jiném provedení vynález poskytuje alespoň jeden prekurzor v kombinaci nebo alternaci s nukleosidem, který prokazuje aktivitu proti hepatitidě B, včetně, bez omezení, základní látku některého z definovaných prekurzorů, např. 2'-deoxy^-L-nukleosidy, zahrnující 2'-deoxyβ-L-cytidin; 2'-deoxy^-L-thymin; 2'-deoxy^-L-adenosin; 2'-deoxy^-L-guanin; 2'-deoxy^-L-5-fluorocytidin; 2',3'-dideoxy-3'-thiacytidin; 2',3'-dodeoxy-3'thia-5-fluorocytidin. Alternativně sloučeniny podle předkládaného vynálezu mohou být také podávány v kombinaci nebo alternaci s některým jiným známým prostředkem proti virové hepatitidě B, jako je entecivir, cis-2hydroxymethyl-5-(5-fluorocytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan, výhodně v podstatě ve formě (-)-optického izomeru („FTC“, viz WO 92/14743); (-)-enantiomer cis-2hydroxymethyl-5-(cytosin-1-yl)-1,3-oxathiolan (3TC); β-D-l ,3-dioxolanpurin nukleosidy, popsané v patentu US č. 5,444,063 a 5,684,010; β-D-dioxolan nukleosidy, jako jsou β-D-dioxolanyl-guanin (DXG), β-D-dioxolanyl-2,6diaminopurin (DAPD) a β-Ο^ΐοχο^ηγΙ-δ-οΜοΓορυπη (ACP), L-FDDC (5-fluoro• · · · • · · · • · · · · · · * · ······· · ·«· · —Λ · · ···· · · · 4

- 00 - ·*·· · ·· ·» ·· ··

3'-thia-2',3'-dideoxycytidin), L-enantiomery 3'-fluoro-modifikované p-2'-deoxyribonukleosid 5'-trifosfáty, karbovir, interferonm penciklovir a famciklovir, L-FMAU, famciklovir, penciklovir, BMS-200475, bis porn PMEA (adefovir, dipivoxil); lobukavir, ganciklovir nebo ribavarin; nebo některá jiná sloučenina, která prokazuje hodnotu EC₅o nižší než 15 mikromol v buňkách 2.2.15; nebo jejich prekurzory nebo farmaceuticky přijatelné soli.

Kombinovaná a střídavá terapie může být také uplatněna v boji s rezistencí léčiva. Bylo zjištěno, že varianty rezistence viru na léčivo se může objevit po prodloužené léčbě antivirovým prostředkem. Rezistence léčiva se nejobvykleji vyskytuje při mutaci genu, která zakóduje enzym používaný přo replikaci viru. Účinnost léčiva proti infekci hepatitidy B se může prodloužit, zvětšit nebo obnovit podáváním sloučeniny v kombinaci nebo alternaci s druhou a možná třetí antivirovou sloučeninou, která způsobuje odlišnou mutaci od mutace způsobené základní látkou. Alternativně farmakokinatika, biologická distribuce nebo jiný parametr léčiva může být změněn touto kombinovanou nebo střídavou terapií. Obecně kombinovaná terapie má obvykle přednost před střídavou terapií, protože způsobuje viru mnoho souběžných stresů.

V jiném provedení je prekurzor podáván v kombinaci nebo alternaci s imunitním modulátorem nebo jiným farmaceuticky aktivním modifikátorem virové replikace, zahrnující biologický materiál, jako je protein, peptid, oligonukleotid nebo gama globulin, zahrnující, bez omezení, interferon, interleukin nebo antismyslové oligonukleotidy na geny, které vytlačují nebo regulují replikaci hepatitidy B.

Může se použít některá metoda alternace, která poskytuje pacientovi léčbu. Neomezující příklady modelů alternace zahrnují 1-6 týdnů podávání účinného množství jednoho prostředku a následně 1-6 týdnů podávání účinného množství druhého prostředku proti HBV. Program alternace může zahrnovat periody bez léčby. Kombinovaná terapie obecně zahrnuje souběžné podávání účinného poměru dávek dvou nebo více prostředků proti HBV.

-57Protože se HBV často nachází u pacientů, kteří jsou také pozitivní na protilátku proti HIV nebo na antigen HIV, nebo kteří byly vystaveni působení HIV, mohou být sloučeniny aktivní proti HBV, popsané v této přihlášce, nebo jejich deriváty nebo prekurzory podávány ve vhodné situaci v kombinaci nebo alternaci s léčivy proti HIV.

Druhým antivirovým prostředkem pro léčbu HIV, v jednom provedení, může být inhibitor reverzní transkriptázy („RTi“), který může být buď syntetický nukleosid („NRTI“) nebo nenukleosidová sloučenina („NNRTI“)· V alternativním provedení, v případě HIV, druhým (nebo třetím) antivirovým prostředkem může být inhibitor proteázy. V jiných provedeních, druhý (nebo třetí) sloučeninou může být pyrofosfátový analog nebo inhibitor fuzní vazby. Seznam zahrnující údaje o orezistenci zjištěné in vitro a in vivo pro mnoho antivorových sloučenin se nalézá v Schinazi, et al., Mutation in retroviral genes associated with drug resistance, International Antiviral News, Volume 1(4), International Medical Press 1996.

Aktivní prostředky proti HBV se také mohou podávat v kombinaci s antibiotiky, jinými antivirovými sloučeninami, protiplísňovými prostředky nebo jinými farmaceutickými prostředky, podávanými pro léčbu sekundárních infekcí.

-58VI. Farmaceutické prostředky

Lidé, kteří trpí některou z uvedených poruch, včetně hepatitidy B, se mohou léči tak, že se pacientov podává účinné množství 3'-prekurzoru p-L-2'-deoxynukleosidu podle předkládaného vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli za přítomnosti farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla. Aktivní materiály mohou být podávány kteroukoliv vhodnou cestou, například orálně, parenterálně, intravenózně, intradermálně, subkutáně nebo lokálně v kapalné nebo pevné formě.

Aktivní sloučenina se zapracuje do farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla v dostatečném množství tak, aby se pacientovi dodalo terapeuticky účinné množství sloučeniny pro inhibici replikace viru in vivo, aniž by způsobla řadu toxických účinků u léčeného pacienta. „Inhibiční množství“ znamená množství aktivní složky, které dostatečné pro uplatnění inhibičního účinku, které se například měří dále popsaným testem.

Výhodná dávka sloučeniny pro všechny výše uvedené podmínky bude v rozmezí od asi 1 do 50 mg/kg, výhodně 1 až 20 mg/kg tělesné hmotnosti na den, obecněji 0,1 až asi 100 mg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce na den. Účinný rozsah dávek farmaceuticky přijatelného prekurzorů může být vypočten na základě hmotnosti základního dodávaného nukleosidu. Pokud prekurzor prokazuje aktivitu samostatně, může být účinné dávkování odhadnuto při výše uvedeném použití hmotnosti prekurzorů nebo jinými prostředky, které jsou známé odborníkovi v oboru.

Sloučenina se výhodně podává v jednotce kterékoliv vhodné dávkové formy, zahrnující, bez omezení, 7 až 3000 mg, výhodně 70 až 1400 mg aktivní složky na jednotku dávkové formy. Obvykle je výhodná orální dávka 50-1000 mg.

• ·

-59« ·

Ideálně by měla být aktivní složka podávána tak, aby se dosáhlo píku koncentrací aktivní sloučeniny v plazmě asi 0,2 až 70 μΜ, výhodně asi 1,0 až 10 μΜ. Toho lze dosáhnout například intravenózní injekcí 0,1 až 5% roztoku aktivní složky, případně v roztoku soli, nebo podávat jako bolus aktivní složky.

Koncentrace aktivní sloučeniny ve farmaceutickém prostředku bude záviset na rychlosti absorpce, inaktivace a vyměšování léčiva a také na jiných faktorech, které jsou známé odborníkovi v oboru. Je třeba poznamenat, že se hodnoty dávek také budou měnit podle bolesti, která se má zmírnit. Dále se rozumí, že pro některý konkrétní subjekt by se měly specifické dávkovači režimy upravit v čase podle individuální potřeby a profesionálního úsudku osoby, podávající nebo dohlížející na podávání prostředků, a že uvedené rozsahy koncentrací jsou pouze exemplární a nemají omezovat oblast nebo použití nárokovaného prostředku. Aktivní složka může být podávána najednou nebo se může rozdělit na více menších dávek pro podávání v různích časových intervalech.

Výhodný způsob podávání aktivní sloučeniny je orální způsob. Orální prostředky obecně zahrnují inertní ředidlo nebo jedlé nosiče. Mohou být vloženy do želatinových kapslí nebo stlačeny do tablet. Pro účel orálního terapeutického podávání může být aktivní sloučenina spojena s pomocným prostředkem a použita ve formě tablet, pastilek nebo kapslí. Farmaceuticky přijatelná pojivá a/nebo adjuvantní materiály se mohou zahrnuty jako součást prostředku.

Tablety, pilulky, kapsle, pastilky a podobně mohou obsahovat některou z následujících složek, nebo sloučenin podobné povahy; pojivá, jako je mikrokrystalická celulóza, tragantová guma nebo želatina; pomocný prostředek, jako je škrob nebo laktóza; dezintegrační prostředek, jako je kyselina alginová, Primogel nebo kukuřičný škrob; lubrikant, jako je stearan • ·

ΛΛ · · ···· ···

- b(j - ·..· · .. .. .. ..

hořečnatý nebo Sterotes; glidant (klouzavý prostředek), jako je koloidní oxid křemičitý; sladidlo, jako je sacharóza nebo sacharín; nebo chuťové prostředky, jako je máta peprná, methylsalicylát nebo vůně pomeranče. Pokud je formou jednotkové dávky kapsle, může navíc, kromě výše uvedeného typu materiálu, obsahovat kapalný nosič, jako jsou mastné oleje. Navíc f mohou ormy jednotkové dávky obsahovat různé jiné materiály, které modifikují fyzikální formu jednotkové dávky, například, potažení cukrem, šelak nebo jiné střevní prostředky.

Sloučenina může být podávána jako složka elixíru, suspenze, sirupu, vody, žvýkací gumy nebo podobně. Sirup může kromě aktivní sloučeniny navíc obsahovat sacharózu jako sladidlo a určité konzervanty, barviva, pigmenty a chuťové prostředky.

Sloučenina nebo farmaceuticky přijatelný derivát nebo jejich soli se mohou také smíchat s jinými aktivními materiály, které nepoškozují žádaný účinek, nebo s materiály, které podporují žádaný účinek, jako jsou antibiotika, protiplísňové prostředky, protizánětlivé prostředky, inhibitory proteázy nebo jiné nukleosidové nebo nenukleosidové antivirové prostředky. Roztoky nebo suspenze používané pro parenterální, intradermální, subkutánní nebo lokální aplikaci mohou zahrnovat následující složky; sterilní ředidlo, jako je voda pro injekci, solný roztok, mastné oleje, polyethylenglykoly, glycerol, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla; antibakteriální prostředky, jako je benzylakohol nebo methylparabens; antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo hydrogensiřičitan sodný; chelatační činidla, jako je kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry, jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty a prostředky pro úpravu napětí, jako je chlorid sodný nebo dextróza. Parentální přípravky se mohou vkládat do ampulí, injekčních stříkaček pro jedno použití nebo lahviček vyrobených ze skla nebo plastu.

Pokud se podává intravenózně, jsou výhodnými nosiči fyziologický roztok soli nebo fosfátem pufrovaný roztok soli (PBS).

» · • ·

-61 Ve výhodném provedení jsou aktivní sloučeniny vyrobeny s nosiči, které budou sloučeninu chránit proti rychlé eliminaci z těla, jako je formulace řázeného uvolňování, zahrnující implantáty a systémy mikroopouzdřené dodávky. Mohou se použít biologicky odbouratelné, biologicky kompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyortoestery a kyselina poloctová. Způsoby výroby těchto formulací budou zřejmé odborníkovi v oboru. Materiály se také mohou získat komerčně od firmy Alza Corporation.

Lipozomální suspenze (zahrnující lipozomy zaměřené na infikované buňky a monoklonální protilátky na virové antigeny) jsou také výhodné jako farmaceuticky přijatelné nosiče. Mohou se připravit podle metod známých odborníkovi v oboru, například způsobem popsaným v patentu US č. 4,522,811. Například formulace lipozomu lze připravit rozpuštěním vhodného lipidu (lipidů) (jako je stearoyl fosfatidyl ethanolamin, stearoyl fosfatidyl cholin, arachadoyl fosfatidyl cholin a cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se potom odpaří, přičemž zanechá tenkou vrstvu suchého lipidu na povrchu zásobníku. Vodný roztok aktivní sloučeniny nebo jejího monofosfátového, difosfátového a/nebo trifosfátového derivátu se potom zavede do zásobníku. Zásobník se potom rychle krouží v ruce, až se ze stěn zásobníku uvolní lipidový materiál a dispergují se lipidové shluky, přičemž se vytvoří lipozomální suspenze.

• ·

-62VII. Způsoby výroby aktivních sloučenin

A. Způsob výroby 6-L-3'-derivátů β-L-nukleosidů

3-L-3'-deriváty 2'-deoxynukleosidu se mohou vyrobit některými postupy, které jsou známé v oboru, zvláště známými metodami ochrany sekundárních alkoholů acylovými částmi, např. anhydridem nebo pomocí vazebného prostředku. Jako neomezujícím příklad lze uvést přípravu 3'-derivátů podle následujícího reakčního sledu;

kde B je a) adenin nebo chráněný adenin

0=0

b) cytosin

ην·^\Γ^0Η3 nebo chráněný cytosin

NHR'

I

c) thymin

R je skupina alkyl nebo aryl

R'a R jsouobvykle používané ochranné skupiny

Alternativně se 3'-deriváty odvodí od aminoacylové části. Klíčovým výchozím materiálem pro tento proces je také vhodně substituovaný β-L-nukleosid. β-L• · · ·

OQ * · ···· ··· ” UO “ ···· · · · · · · · « nukleosid se může koupit nebo vyrobit některými známými postupy, zahrnující standardní vazebné reakce s L-cukernou částí.

Tyto aminoacylové deriváty se mohou vyrobit nejdříve selektivní ochranou skupiny 5'-hydroxyl, vhodnou ochrannou skupinou kyslíku, jako je ochranná skupina acyl silyl, a případně ochranou některého volného aminu v heterocyklické nebo heteroaromatické bázi. Následně se může volná skupina 3'-hydroxyl vázat na N-chráněnou a nebo β-aminokyselinu.

Následně se β-L-nukleosid váže na skupinu aminoacyl za použití standardních vazebných reagentů, které podporují vznik vazby. Některé neomezující příklady vazebných reagentů jsou reagenty typu Mitsunobu (např. dialkyl azodikarboxyláty, jako jsou diisopropyl azodikarboxylát a diethyl azodikarboxylát) s trifenyl fosfinem nebo různými typy karbodiimidů.

Vazebná reakce se může provést při teplotě, při které se dosáhne žádaného výsledku, např. která je vhodná pro reakci, aby se pokračovalo při přijatelné rychlosti, aniž by nastal rozklad nebo nadbytek vedlejších produktů.

Může se zvolit kterékoliv reakční rozpouštědlo, které může dosáhnout nezbytné teploty a které může rozpouštět reakční siožky. Neomezujícím příkladem je kterékoliv aprotické rozpouštědlo, zahrnující, bez omezení, alkylové nebo halogenalkylové rozpouštědlo, jako je hexan, cyklohexan, dichlormethyn nebo dichlorethan, toluen, aceton, ethylacetát, dithiany, THF, dioxan, acetonitril, diethylether, pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylacetamid nebo kterákoliv jejich kombinace.

Schéma 1 je neomezující příklad výroby β-L-3'-aminoacylnukleosidu odvozeného od L-deoxyribonukleosidu.

• · * ·

-64Schema 1

^β^_γ^ορ HoAcRKtr*“· Ur”

OH O-S-ÍCRR^-NHR odstranění ochrany

B. Způsob výroby 6-L-5'-derivátů β-L-nukleosidů

P-L-5'-deriváty β-L-nukleosidu mohou být vyrobeny kterýmkoliv způsobem známým v oboru, zvláště známými metodami ochrany primárních alkoholů acylovými částmi, např. pomocí anhydridu nebo pomocí vazebného činidla. Jako neomezující příklad mohou být β-L-5'-derivázy vyrobeny podle následujícícho reakčního sledu:

kde B je a)

OH

nebo chráněný adenin

NHR’

b) cytosin nebo chráněný cytosin

NHR’

* · · · · ·

-65c) thymin □V

I

R je skupina alkyl nebo aryl

R' je obvykle používaná ochranná skupina

Ve výhodném provedení je 5'-derivát odvozen od aminoacylové části. Klíčovým výchoým materiálem pro tento proces je vhodně substituovaný β-Lnukleosid.

β-L-nukleosid se může nakoupit nebo se může vyrobit kterýmikoliv způsoby, včetně stadardních vazabných reakcí s L-cukernou částí, jako je deoxyribóza. Aminoacylové deriváty se mohou vyrobit selektivní vazbou aminokyseliny na β-L-nukleosid, výhodně bez jakékoliv další ochrany nukleosidů. Vazebné reakce se může dosáhnout použitím vhodných vazebných reagentů, které podporují vznik vazby. Některými neomezujícími příklady vazebných reagentů jsou reagenty typu Mitsunobu (např. dialkyl azodikarboxyláty, jako jsou diisopropyl azodikarboxylát a diethyl azodikarboxylát) s trifenylfosfinem nebo různými typy karbodiimidů.

Vazebná reakce se může provést při kterékoliv teplotě, při které se dosáhne žádaného výsledku, např. to je vhodné pro reakcí, aby probíhala přijatelnou rychlostí, aniž by se podporoval rozklad nebo vznik vedeljšich produktů.

Může se zvolit kterékoliv reakční rozpouštědlo, které může dosáhnout nezbytné teploty a které může rozpouštět reakční složky. Neomezujícím příkladem je kterékoliv aprotické rozpouštědlo, zahrnující, bez omezení, alkylové nebo halogenalkylové rozpouštědlo, jako je hexan, cyklohexan, dichlormethyn nebo dichlorethan, toluen, aceton, ethylacetát, dithiany, THF, • · » · • · · · · « » * 0 0 · · *····*· · ·

- 66 - · · 0 ·0 · v V 0··· · «φ _{9 β} dioxan, acetonitril, diethylether, pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylacetamid nebo jejich kombinace.

Schéma 2 je neomezujícím příkladem výroby p-L-5'-aminoacylnukleosidu odvozeného od L-deoxyribonukleosidu.

o

Schéma 2

o hoAcrrk''™

(CRR¹)—NHR

OH odstranění ochrany

(CRR¹)—NHj

C. Způsob výroby |3-L-3',5'-bis-O-derivátů β-L-nukleosidů

P-L-3',5'-O-deriváty β-L-nukleosidu se mohou vyrobit kterýmkoliv způsobem, známým ze stavu techniky, zvláště způsoby známými pro ochranu primárních a sekundárních alkoholů acylovými částmi., např. pomocí anhydridu nebo pomocí vazebného činidla. Jako neomezující příklad lze uvést přípravu 3',5'bis-O-derivátů podle následujícího sledu reakcí:

o

kde B je a) adenin

I »

• « · « • 0 t * ¹ » · · * * 9 9 · 9 t 9 · 9 9 • * · · · ·

99 * 99 99

-67c) thymin o

I

R je alkylová nebo arylová skupina.

Ve výhodném provedení je 3',5'-bis-O-derivát odvozen od aminoacylové části. Klíčovým výchozím materiálem pro tento proces je také vhodně substituovaný β-L-nukleosid. 3',5'-Bis-O-deriváty β-L-nukleosidů lze nakoupit nebo se mohou připravit některými známými prostředky, zahrnující standardní vazebné reakce s L-cukerným zbytkem, jako je deoxyribóza. Následně se může volná skupina 3'- a 5'-hydroxyl navázat na N-chráněnou a nebo β aminokyselinu. Vazebné reakce se může dosáhnout za použití vhodných vazebných reagentů, které podporují tvorbu vazby. Některými neomezujícími příklady vazebných reagentů jsou reagenty typu Mitsunobu (např. dialkyl azokarboxyláty, jako je diisopropyl azodikarboxylát a diethyl azodikarboxylát) s trifenylfosfinem nebo různými typy karbodiimidů.

Vazebná reakce se může provést při kterékoli teplotě, při které se dosáhne žádaného výsledku, např. která je vhodná pro reakci, aby probíhala přijatelnou rychlostí, aniž by podporovala rozklad nebo vznik nadbytku vedlejších produktů.

Může se zvolit kterékoliv reakční rozpouštědlo, které může dosáhnout nezbytné teploty a které může rozpouštět reakční složky. Neomezujícím příkladem je aprotické rozpouštědlo, zahrnující bez omezení alkyiové nebo halogenalkylové rozpouštědlo, jako je hexan, cyklohexan, dichlormethan nebo dichlorethan, toluen, aceton, ethylácetát, dithiany, THF, dioxan, acetonitril, diethylether, pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylacetamid nebo některé jejich kombinace.

9

I »>

• « *

-68• · · 9 9 • »·»0 » ΐ * » * · · · »9 · 9 9 99 9

Schéma 3 je neomezujícím příkladem přípravy p-L-3',5'-diaminoacylnukleosidu odvozeného od L-deoxyribonukleosidu.

Schéma 3

H-ΟΠ B___r-O-^1J-(CRR')—NHR

B r—<OH

HO (CRR% 'JL.

O-U-tCRRj—NHR

B r-O^-(CRR·)—NH₂ odstranění < s n

-*- ~ n ochrany O-“—(CRR¹)—NH₂

D. Vhodný způsob rozšíření aminoacylové části

Titulní sloučeniny se mohou vyrobit reakcí skupiny 3'a 5'-hydroxyl s vhodným derivátem, jako je skupina acyl a zvláště skupina aminoacyl. Pokud vzniká derivát nukleosidů aminoacylovou částí, může být žádoucí další vazba volného aminu na N-chráněnou α nebo β aminokyselinu. Vazebné reakce se může dosáhnout za použití vhodných vazebných reagentů, které podporují tvorbu vazby. Některými neomezujícími příklady vazebných reagentů jsou reagenty typu Mitsunobu (např. Dialkyl azokarboxyláty, jako je diisopropyl azodikarboxylát a diethyl azodikarboxylát) s trifenyl fosfinem nebo různými typy karbodiimidů.

Vazebná reakce může být provedena při kterékoliv teplotě, při které se dosáhne žádaných výsledků, např. která je vhodná pro reakci, aby probíhala přijatelnou rychlostí, aniž by podporovala rozklad nebo vznik nadbytku vedlejších produktů.

Může se zvolit kterékoliv reakční rozpouštědlo, které může dosáhnout nezbytné teploty a které může rozpouštět reakční složky. Neomezujícím příkladem je kterékoli aprotické rozpouštědlo, zahrnující bez omezení alkylové • ·

nebo halogenalkylové rozpouštědlo, jako je hexan, cyklohexan, dichlormethan nebo dichlorethan, toluen, aceton, ethylacetát, dithiany, THF, dioxan, acetonitril, diethylether, pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethyl-sulfoxid (DMSO), dímethylacetamid nebo kterákoliv jejich kombinace.

E. Vhodný způsob vzniku derivátu heteroaromatické nebo heterocyklické baze

Titulní sloučeniny se mohou vyrobit případnou ochranou kterékoliv volné skupiny amino v heterocyklické nebo heteroaromatické bázi, například N⁴cytosin, N⁶-adenin nebo N²-guanin. Například aminová skupina může být chráněna acylovou částí nebo dialkylaminomethylenovou částí podle následujícícho obecného schéma:

Ochrana může být provedena při kterékoliv teplotě, při které se dosáhne žádaných výsledků, např. která je vhodná pro reakci, aby probíhala přijatelnou rychlostí, aniž by podporovala rozklad nebo vznik přebytku vedlejších produktů.

Může být zvoleno kterékoliv reakční rozpouštědlo, které může dosáhnou nezbytné teploty a které může rozpouštět reakční složky. Neomezujícím příkladem je kterékoliv aprotické rozpouštědlo, zahrnující bez omezení alkylové nebo halogenalkylové rozpouštědlo, jako je hexan, cyklohexan, dichlormethan nebo dichlorethan, toluen, aceton, ethylacetát, dithiany, THF, dioxan, acetonitril, diethylether, pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), dímethylacetamid nebo kterákoliv jejich kombinace.

• · · ·

Následně se může skupina 3'-hydroxyl vázat na N-chráněnou a nebo β aminokyselinu. Vazebné reakce lze dosáhnout za použití vhodných vazebných reagentů, které podporují vznik vazby. Některými neomezujícími příklady vazebných reagentů jsou reagenty typu Mitsunobu (např. dialkyl azodikarboxyláty, jako je diisopropyl azodikarboxylát a diethyl azodikarboxylát) s trifenyl fosfinem nebo různými typy karbodiimidů.

Vazebná reakce se může provést při kterékoliv teplotě, při které se dosáhne žádaných výsledků, např, která je vhodná pro reakci, aby probíhala přijatelnou rychlostí, aniž by podporovala rozklad nebo vznik přebytku vedlejších produktů.

Může být zvoleno kterékoliv reakční rozpouštědlo, které může dosáhnou nezbytné teploty a které může rozpouštět reakční složky. Neomezujícím příkladem je kterékoliv aprotické rozpouštědlo, zahrnující bez omezení alkylové nebo halogenalkylové rozpouštědlo, jako je hexan, cyklohexan, dichlormethan nebo dichlorethan, toluen, aceton, ethylacetát, dithiany, THF, dioxan, acetonitril, diethylether, pyridin, dimethylformamid (DMF), dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylacetamid nebo kterákoliv jejich kombinace.

V alternativním provedení je N⁴- nebo N⁶-acyl derivát odvozen od aminoacylové části a může se připravit podle následujícího sledu reakcí, za případné ochrany volných hydroxylových skupin, následně kondenzační reakcí s vhodně chráněným aminoesterem a odstranění hydroxylových ochraných skupin, pokud je to nutné.

případná ochrana

HOČX.

NHR

H

RHN—C—η—NH ROB’

Β i—i

OR’ případné

H

I

RHN-Codstraněni ochrany •NH

ROB' r—OH

OH

-71 Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1a a 1b jsou bez omezení ilustrativní příklady syntézy 3'- a 5'-valinyl esterů 2'-deoxy-p-L-cytidinu (β-L-dC) z 2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 2 je bez omezení ilustrativní příklad syntézy A/⁴-acetyl-2'-deoxy^-l_cytidinu z 2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 3 je bez omezení ilustrativní příklad syntézy /\/⁴-[(dimethylamino)methylenj-2'-deoxy^-L-cytidinu z 2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 4 je bez omezení ilustrativní příklad syntézy 3',5'-di-O-acetyl-2'deoxy^-L-cytidinu z 2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 5 je bez omezení ilustrativní příklad syntézy 3',5'-di-O-valinyl esteru 2'-deoxy^-L-cytidinu z 2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 6 je bez omezení ilustrativní příklad syntézy /V⁴-(Boc-valinyl) esteru 2'-deoxy^-L-cytidinu z 2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 7 je bez omezení ilustrativní příklad syntézy 3',5', A/⁴-tri-(L-valinyl)2'-deoxy^-L-cytidinu z 3',5',A/⁴-tri-(Boc-L-valinyl)-2'-deoxy^-L-cytidinu podle předkládaného vynálezu.

Obrázek 8 je spojnicový diagram, znázorňující standardní kalibrační techniku vhodnou pro stanovení rozpustnosti různých nukleouzidů.

Obrázek 8a je kalibrační křivka, stanovená pro přírodní β-D-deoxyribocytosin.

Obrázek 8b je kalibrační křivka, stanovená pro 3',5'-divalinyI ester β-L-deoxyribocytosin.

Obrázek 9a je bez omezení příklad HPLC profilu používaného pro stanovení stability 3',5'-divalinyl esteru β-L-deoxyribocytosinu při hodnotě pH 7,42.

HPLC profil vyznačuje přítomnost 3',5'-divalinyl esteru β-L-deoxyribocytosinu

-72• · · · < · společně s 3. aktivními metabolity, 3'-valinyl ester β-L-deoxyribocytosinu, 5'valinyl ester β-L-deoxyribocytosinu a L-dC.

Obrázek 9b je spojnicový diagram znázorňující relativní koncentrace 3',5'~ divalinyl ester β-L-deoxyribocytosinu a jeho metabolitu v čase.

Podobně obrázek 10a a 11a jsou bez omezení příklady HPLC profilů, používaných pro stanovení stability 35'-divalinyl esteru β-L-deoxyribocytosinu při hodnotě pH 7,20 a nebo 4,51. Při těchto hodnotách pH HPLC profily vyznačují přítomnost 35 '-divalinyl esteru β-L-deoxyribocytosinu společně s 3. aktivními metabolity, 3'-valinyl ester β-L-deoxyribocitosinu, 5'valinyl ester β-L-deoxyribocytosinu a L-dC.

Obrázky 10b a 11b jsou spojnicové diagramy, znázorňující relativní koncentrace 3',5-divalinyl ester β-L-deoxyribocytosinu a jeho metabolity v čase.

Obrázek 12 je bez omezení příklad HPLC profilu, používaného pro stanovení stability 35'-divalinyl ester β-L-deoxyribocytosinu při hodnotě pH 1,23. Při této hodnotě pH HPLC profil pouze vyznačuje přítomnost 3',5'-divalinyI ester β-L-deoxyribocytosinu bez jakéhokoliv rozkladu kteréhokoliv z jeho 3. metabolitů.

Obrázek 13 je spojnicový diagram, znázorňující in vitro metaboiizmus 3',5'divalinyl ester β-L-deoxyribocytosinu v lidské plazmě.

Obrázek 14 je spojnicový diagram, znázorňující intracelulární metaboiizmus β-L-deoxyribocytosinu (L-dC) v buňkách HepG2.

Obrázek 15 je spojnicový diagram, znázorňující intracelulární akumulaci L-dC v primárních lidských hepatocytech.

Obrázek 16 sloupkový diagram, znázorňující odpověď antivirové dávky L-dC při léčbě virové infekce chronické hepatitidy B během 28 dní na modelu chronické virové infekce hepatitidy B sviště.

Obrázek 17 je spojnicový diagram, znázorňující aktivitu L-dC na modelu virové infekce chronické hepatitidy B sviště.

-73• A · ·· AAAA A A ···· • · ♦ · · AAA A

AAA ··· · A A

AAAAAAA A AAA A A

A A AAAA AAAA «ΑΑΑ A AA AA AA A ť»

Obrázek 18 jsou spojnicové diagramy, vyznačující tělesné hmotnosti jednotlivých modelů sviště, léčených 28 dní pomoci L-dC (0,02 - 10 mg/kg/den) orálně.

Obrázek 19 jsou spojnicové diagramy, vyznačující tělesné hmotnosti jednotlivých modelů sviště, léčených 12 dýdnů pomocí L-dC (1 mhg/kg/den) orálně.

• · · ·· · · · · • · · ·· « ·· · ······· · · * · « ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: ⁴/V-mMTr-2'-deoxy-p-L-cytidin (1_, obrázek 1) β-L-dC (1 g; 4,40 mmol) se pohltil v suchém pyridinu (44 mol). Po dočasné ochraně trimethylsilylovou skupinou (TMSCI, 3,34 ml, 26,4 mmol) a následném přidání mMRrCI (3,38 mg, 11 mmol) a 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 540 mg, 4,40 mmol) se reakční směs míchala 3 dny při pokojové teplotě {A.Nyilas; C. Glemarec; J. Chattopadhyaya; Tetrahedron Lett. 1990, 46, 2149-2164}. Po extrakci hydrogenuhličitanem sodným se organická vrstva promyla vodou, odpařila a pohltila v dioxanu (40 ml). Po kapkách se přidával vodný roztok čpavku (8,5 ml) a reakční směs se míchala přs noc. Po odpaření všeho těkavého materiálu se pevný zbytek čistil na silikagelové koloně {eluent: krokový gradient MeOH (0-10 %) v CH₂CI₂}, za vzniku žádané sloučeniny 1 (1,02 g, 46,5 %) ve formě pěny.

¹H NMR (DMSO-de) δ ppm 8,39 (br s, 1H, NH, D2O vyměnitelná), 7,70 (d, 1H, H-6, J=7,3 Hz), 7,4-6,8 (m, 14H, (C6H5)2C(C6H4)OCH3), 6,23 (d, 1H, H-5, J=7,3 Hz), 6,2 (t, 1H, H-V, J=6,5 Hz), 5,16 (d, 1H, OH-3', J=3,8 Hz, D2O vyměnitelná), 4,9 (br s, 1H, OH-5', D2O vyměnitelná), 4,1 (m, 1H, H-3'), 3,7 (m, 4H, H-4', OCH3), 3,5 (m, 2H, H-5', H-5), 2,1-1,8 (2m, 2H, H-2', H-2); FAB<0, (GT) m/e 498 (M-H)', 382 (B)'; 226 (M-mMTr)'; FAB>0 (GT) 500 (M+H)⁺, 273 (mMTr)⁺; UV (EtOH 95) Xmax = 279 nm; 7_min = 250 nm.

Příklad 2: 5 -L-N-(terc-butoxykarbonyl) valin ester ⁴/V-mMTr-2 -deoxy-βL-cytidinu (2, obrázek 1)

Do roztoku sloučeniny 1. (1 g, 2,00 mmol) v suchém DMF (34 ml) se po sobě přidaly 4-dimethylaminopyridin (DMAP, 37 mg, 0,3 mmol), N-(terc.-butoxykarbonyl)-L-valin (Boc-Val-OH, 587 mg, 2,7 mmol) a N,N'-dicyklohexylkarbo• · ···· ·· ····

-75diimid (DCC, 660 mg, 3,2 mmol) {L.M. Beauchamp; G.F.Orr; P. De Miranda; T. Burnette; T.A. Krenitsky; Antiviral Chem. Chemother. 1992, 3, 157-164}. Roztok se míchal při pokojové teplotě. Po 40. hodinách se do reakční směsi opět přidal další DMAP (37 mg, 0,3 mmol), Boc-Val-OH (587 mg, 2,7 mmol) a DCC (660 mg, 3,2 mmol) a směs míchala při pokojové teplotě 40 hodin. Směs se zfiltrovala, DMF se odstranil z filtrátu za sníženého tlaku a zbytek se chromatografoval na silikagelové koloně {eluent: krokový kradient MeOH (010 %) v CH₂CI₂} za vzniku žádané sloučeniny 2 (515 mg, 37 %) ve formě pěny.

¹H NMR (DMSO-c/6) δ ppm 8,44 (br s, 1H, NH, D2O vyměnitelná), 7,7-6,8 (m, 15H, H-6 a (C6H5)2C(C6H4)OCH3), 6,26 (d, 1H, H-5, J=7,3 Hz), 6,06 (t, 1H, H1', J=6,6 Hz), 5,7 (bs, 1H, OH-3', D2O vyměnitelná), 4,2-4,0 (m, 3H, H-3', H4'a CH), 3,8-3,9 (m, 2H, H-5', H-5), 3,7 (s, 3H, OCH3), 2,0-1,9 (m, 3H, H-2', H-2, CH), 1,36 (s, 9H, (CH3)3C), 0,86 (m, 6H, (CH3)2CH); FAB<0, (GT) m/e 1395 (2M-H)’, 697 (M-H)', 425 (M-mMTr)', 382 (B)'; 216 (BocVal-H)'; FAB>0 (GT) 384 (B+2H)⁺, 273 (mMTr)⁺; 57 (CH3)₃C)⁺; UV (EtOH 95) Z_max = 279 nm; Z_min = 249 nm.

Příklad 3: 5-L-valin ester 2 -deoxy-p-L-cytidin hydrochloridu (3, obrázek 1)

Sloučenina 2 (500 mg, 0,715 mmol) se rozpustila ve 20% roztoku kyseliny trifluoroctové v CH₂CI₂ (25 ml) a přidal se triisopropylsilan (1,47 ml, 71,5 mmol). Reakční směs se míchala při pokojové teplotě jednu hodinu a valin ester se vysrážel v Et₂O ve formě trifluoracetátové soli. Po několika odpařováních s vodou se sraženina rozplavila ve vodě (2 ml), upravila nasyceným roztokem HCI v dioxanu (20 ml) a odpařovala za sníženého tlaku. Tato úprava se opakovala třikrát a žádaná sloučenina 3 se nakonec vysrážela v etheru (207 mg, 73 %) ve formě hydrochloridové soli.

¹H NMR (DMSO-d₆) δ ppm 9,7 (br s, 1H, 1/2 N/-/₂, D₂O vyměnitelná), 8,6 (br s,

4H, 1/2N/7₂, N/7₃, D₂O vyměnitelná), 7,98 (d, 1H, H-6, J=7,8 Hz), 6,17 (d, 1H, • · • · · ·

H-5, J=7,8 Hz), 6,11 (pt, 1H, Η-Γ), 5,5 (bs, <1H, OH-3', D₂0 vyměnitelná), 4,4 (m, 2H, H-5', 5”), 4,3 (m, 1H, H-3'), 4,2-4,0 (m, 2H, H-4', CH), 3,8-3,9,

3,7 (s, 3H, OCH₃), 2,3-2,1 (m, 3H, H-2', H-2, CH), 0,94 (dd, 6H, (CH₃)₂CH, J=3,7 a 6,6 Hz); FAB<0, (GT) m/e 361 (M+CI)', 325 (M-H)’, 116 (Val-H)', 110 (Β)’; 216 (BocVal-H)'; FAB>0 (GT) 653 (2M+H)⁺, 327 (M+H)⁺; 112 (B+2H)⁺; {cc}D²⁰ - 28,57 (c = 0,49 v DMSO); UV (EtOH 95) Xmax = 272 nm (ε 8700); 7_min= 255 nm (ε 7600); HPLC rt = 8,37 min (gradient z 9 na 50 % CH₃N ve 20 mM triethylamoniumacetátovém pufru naprogramovaný po dobu 30. minut s průtokem 1 ml/min).

Příklad 4: N⁴-Acetyl-2'-deoxy-p-L-cytidin (4, obrázek 2)

Do suspenze nukleosidu β-L-dC (415 mg, 1,83 mmol) v N,N-dimethylformamidu (9,2 ml) se přidal anhydrid kyseliny octové (207 μΙ, 2,20 mmol) a směs se míchala při pokojové teplotě 24 hodin [V.Bhat; B. G. Ugarkar; V.A.sayeed, K.grimm; N.Kosora; P.A.Domenico; E.Stocker, Nucleosides & Nucieotides, 1989, 8 (2), 1789-183], Po odstranění DMF za sníženého tlaku se výseledný zbytek čistil na silikagelové koloně chromatograficky [eluent: 15% MeOH v CH₂CI₂] za vzniku žádané sloučeniny (310 mg, 63%), která krystalizovala z ethanolu; rap 128-170 °C;

¹H NMR (DMSO-de) δ ppm 10,86 (s, 1H, NH, D2O vyměnitelná), 8,31 (d, 1H, H-6, J=7,5 Hz), 7,18 (d, 1H, H-5, J=7,5 Hz), 6,09 (t, 1H, H-1J=6,3 Hz), 5,25 (d, 1H, OH-3', D2O vyměnitelná, J=4,2 Hz), 5,03 (t, 1H, OH-5', D2O vyměnitelná, J=5,0 Hz), 4,1-4,2 (m, 1H, H-3'), 3,8 (m, 1H, H-4'), 3,4-3,6 (m, 2H, H-5', H-5), 2,2-2,3 (m, 1H, H-2'), 2,08 (s, 3H, CH3), 2,0-1,9 (m, 1H, H2); FAB<0, (GT) m/e 806 (3M-H)', 537 (2M-H)', 360 (M+G-H)', 268 (M-H)', 152 (B)'; FAB>0 (GT) 808 (3M+H)⁺, 539 (2M+H)⁺, 362 (M+G+H)⁺, 270 (M+H)⁺, 154 (B+2H)⁺, 117 (S)⁺; UV (H2O) 7_max = 297 nm (ε 8300); X_min = 270 nm (ε 3500); X_max = 245 nm (ε 14400); X_min = 226 nm (ε 5800); [a]_D ²⁰ - 81,31 (c = 1,07 v DMSO).

-77• »

Příklad 5: N⁴-[(Dimethylamino)methylen]-2'-deoxy-p-L-cytidin (5, obrázek 3)

Titulní sloučenina byla připravena podle publikovaného postupu vyvinutého pro přípravu odpovídajícího D-enantiomeru [S.G.Kerr a T.I.Kalman, J.Pharm. Sci. 1994, 83, 582-586], Roztok L-dC (500 mg, 2,20 mmol) v DMF (4,8 ml) se upravil dimethylacetalem dimethylformamidu (2,8 ml, 21,08 mmol) a míchal při pokojové teplotě přes noc. Roztok se odpařoval za sníženého tlaku a společně odpařoval s ethanolem. Krystalizaci z ethanolu/etheru vznikla titulní sloučenina (501,2 mg, 81 %) ve formě světle žlutých krystalů. Teplota tání 174-176 °C (lit.: 188-190 °C pro D-enantiomer);

¹H NMR (DMSO-ď₆) δ ppm 8,60 (s, 1H, N=CHú, 8,00 (d, 1H, H-6), 6,15 (t, J=6,6 Hz, 1H, H-1'), 5,96 (d, J=7,2 Hz, 1H, H-5), 5,22 (d, J=4,2 Hz, 1H, OH3'), 5,01 (t, J=5,2 Hz, 1H, OH-5'), 4,20 (m, 1H, H-4'), 3,80 (m, 1H, H-3'), 3,56 (m, 2H, H-5'a H-5), 3,15 a 3,02 (2s, 3H a 3H, N(CH₃)₂), 2,22-1,90 (2 m, 1H a 1H, H-2'a H-2); FAB>0 (GT) 847 (3M+H)⁺, 565 (2M+H)⁺, 283 (M+H); FAB<0, (GT) m/z 599 (2M+CI)', 317 (M+CI)', 165 (B)'.

Příklad 6; 3,5-Di-O-acetyl-2-deoxy-p-L-cytidin (6, obrázek 4)

Titulní sloučenina byla syntetizovaná v jednom kroku, přičemž se vycházelo z L-dC a následně z postupu vyvinutého Breinerem et al [R.G.Breiner; W.Rose; J.A.Dunn; J.E.Mae Diarmid a J.Bardos; J.Med Chem. 1990, 33, 2596-2603] pro přípravu D-enantiomeru. Roztok L-dC (765 mg, 3,37 mmol) a acetylchlorid (960 μΙ, 13,48 mmol) v glaciální kyselině octové (4,8 ml) se míchaly při pokojové teplotě 10 mimut, potom se přidal suchý chloroform (3,5 ml), a míchání pokračovalo 24 hodin. Roztok se odpařoval za sníženého tlaku a společně odpařoval s ethanolem. Krystalizaci z ethanolu vzniklo 78% žádané sloučeniny, teplota tání 192-193°C (lit.: 187-189 °C pro D-enantiomer [Breiner et al. J.med.Chem. 1990, 33, 2596-2603]);

-78¹H NMR (DSMO-č/g) δ ppm 9,8 a 8,7 (2 br s, <3H, NH3⁺, D2O vyměnitelná), 8,0 (d, 1H, H-6, J=7,8 Hz), 6,18 (d, 1H, H-5, J=7,8 Hz), 6,08 (t, 1H, H-1', J=6,7 Hz), 5,2 (m, 1H, H-3'), 4,3-4,1 (m, 3H, H-4', H-5', H-5”), 2,4-2,5 (m, 2H, H-2', H-2”), 2,06 a 2,03 (2 s, 6H, 2 CH₃); FAB<0, (GT) m/e 968 (3M+CI)', 657 (2M+CI)’, 438 (M+G+CI)', 346 (M+CI)', 310 (M-H)’, 110 (B)’; 59 (CH₃COO)’; FAB>0 (GT) 623 (2M+H)⁺, 312 (M+H)⁺, 201 (S)⁺, 112 (B+2H)⁺, 43 (CH3CO)⁺; [oc]D²⁰ 36,27 (c = 1,02 v DMSO); UV (MeOH) X_max = 277 nm (ε 9900); Z_min = 246 nm (ε 5000).

Příklad 7: 3',5'-L-N-(t-Butoxykabonyl)valin diester 2'-deoxy-P-L-cytidinu (9, obrázek 5)

Roztok /V^-[(d imethylam ino)methylen]-2'-deoxy-^-L-cytid in u (7, 500 mg, 1,77 mmol) v DMF (35 ml) se upravil Boc-Val-OH (1,31 g, 6,03 mmol), DMAP (86,5 mg, 0,71 mmol), 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochloridem (EDC) (1,36 g, 7,09 mmol) a míchal při pokojové teplotě 40 hodin. Přidala se další množství Boc-Val-OH (655 mg, 3,01 mmol), DMAP (43,2 mg, 0,35 mmol), EDC (680 mg, 3,55 mmol) a roztok se míchal dalších 20 hodin. Po odpařování za sníženého tlaku se zbytek rozplavil v CH2CI2 a extrahoval několiktrát vodou. Organická vrstva se promyla solným roztokem (100 ml), sušila (Na₂SO₄) a odpařovala za sníženého tlaku za vzniku sloučeniny 8 ve formě surového materiálu, který se použil v dalším kroku bez dalšího čištění. Zbytek se rozplavil v dioxanu (18 ml), upravil 26% vodným roztokem NH4OH a míchal při pokojové teplotě jednu hodinu. Roztok se odpařoval za sníženého tlaku a zbytek se čistil chromatograficky na silikagelu za použití krokového gradientu MeOH (0-5 %) v CH₂CI₂ za vzniku titulní sloučeniny (698,7 mg, 58% z 9).

¹H NMR (DMSO-ď₆) δ ppm 7,58 (d, 1H, H-6), 7,29-7,18 (m, 4H, NH-Boc a NH₂), 6,20 (t, J=6,6 Hz, 1H, H-1'), 5,75 (d, J=7,3 Hz, 1H, H-5), 5,20 (br s, 1H, H-3'), 4,29 (m, 2H, H-5'a H-5”), 4,14 (br s, 1H, H-4'), 3,86 (m, 2H, CH-NHBoc), 2,31-2,21 (m, 2H, H-2'a H-2”), 2,13-1,98 (m, 2H, CH(iPr)), 1,38 a 1,36 (2s, 18H, tBu), 0,88 a 0,85 (2 d, J=6,8 Hz, 12H, CH(CH₃)₂);

• ·

¹³C NMR (DMSO-de) δ ppm 172,67 a 172,46, 166,41, 156,64 a 155,70, 141,39, 95,43, 85,78, 82,03, 79,14, 75,57, 64,90, 60,37 a 60,11, 37,40, 30,33, 29,00, 19,83-19,12; FAB>0 (GT) 626 (M+H)⁺, 112 (B+2H)⁺, 255 (MBoc)⁺; FAB<0, (GT) m/z 1249 (2M-H)', 624 (M-H)'.

Příklad 8: 3,5'-L-Valin ester 2'-deoxy-p-L-cytidin hydrochloridu (10, obrázek 5)

Roztok sloučeniny 9 (675 mg, 1,08 mmol) v dioxanu (30 ml) se upravil 26% roztokem HCI v dioxanu (30 ml) a míchal při pokojové teplotě 1 hodinu 55 minut. Výsledná bílá suspenze se odpařovala za sníženého tlaku. Bílý pevný zbytek se rozplavil v minimálním množství MeOH a roztok se srážel v etheru za vzniku titulní sloučeniny 10 ve formě bílé pevné látky. Teplota tání 187 °C (rozklad);

¹H NMR (DMSO-de) δ ppm 9,79 (br s, 1H, 1/2 NH2), 8,72 (br s, 7H, 1/2 NH2 a NH3⁺), 8,04 (d, 1H, H-6), 6,21 (d, J=7,8 Hz, 1H, H-5), 6,16 (t, J=6,9 Hz, 1H, H1'), 5,39 (m, 1H, H-3'), 4,50-4,40 (m, 3H, H-4', H-5'a H-5), 3,90 (2 br d, 2H, CH-NH3⁺), 2,63-2,50 (2m, 2H, H-2'a H-2), 2,21 (m, 2H, CH(iPr)), 1,02-0,94 (m, 12H, CH(CH₃)2);

¹³C NMR (DMSO-de) δ ppm 169,50 a 168,94, 161,02, 148,50, 145,26, 95,18, 87,19, 82,15, 76,14, 65,77 a 65,59, 58,12 a 58,07, 37,00, 30,16, 19,26-18,51; FAB>0 (GT) 426 (M+H)⁺, 112 (B+2H)⁺; FAB<0, (GT) m/z 885 (2M+CI)', 460 (M+CI); UV (H2O) X_max = 270 nm (ε 7600).

-80Příklad 9: A/⁴-Boc-VaIinyl ester 2'-deoxy-p-L-cytidin (13, obrázek 6)

Směs L-dC (1,80 g, 7,92 mmol) a triethylaminu (8,8 ml, 63,14 mmol) v bezvodém THF (80 ml) se upravila chlorotrimethylsilanem (6 ml, 47,28 mmol) a míchala při pokojové teplotě přes noc. Reakční směs se prudce schladila přidáním vodného nasyceného roztoku NH₄CI (26 ml) a vody (10 ml). Vodná vrstva se extrahovala třikrát EtOAc. Organické vrstvy se spojily, promyly solným roztokem, sušily (Na2SO₄) a odpařovaly za sníženého tlaku za vzniku surové světle žluté směsí pěny a oleje, obsahující sloučeninu 11, která se použila v dalším kroku bez dalšího čištění. Tento zbytek se rozplavil v CH₂CI₂(104 ml), upravil N-(terc.-butoxykarbonyl)-L-valinem (Boc-Val-OH) 1,72 g, 7,90 mmol), benzotriazol-1-yloxy-tris(dimethylamino)fosfonium hexafluorofosfátem (BOP, 4,20 g, 9,50 mmol), triethylaminem (2,2 ml, 15,78 mmol) a roztok se míchal při pokojové teplotě 2 dny. Roztok se zředil EtOAc a extrahoval dvakrát nasyceným roztokem NaHCO3. Organická vrstva se sušila (Na₂SO₄) a odpařovala za sníženého tlaku za vzniku sloučeniny 12 ve formě surového materiálu, který se použil v následném kroku bez dalšího čištění. Zbytek se rozplavil v dioxanu (80 ml), upravil 26% vodným roztokem NH₄OH a míchal při pokojové teplotě 6 hodin 45 minut. Roztok se odpařoval za sníženého tlaku, společně odpařoval s absolutním EtOH a zbytek se čistil chromatograficky na silikagelu za použití krokového gradientu MeOH (5-10%) v CH₂CI₂ za vzniku titulní sloučeniny 13 ve formě pěny (1,64 g, 48,5% celkového výtěžku).

¹H NMR (DMSO-d₆) δ ppm 10,88 (s, 1H, NH-4), 8,40 (d, 1H, H-6), 7,26 (d, J=7,4 Hz, 1H, H-5), 7,06 (d, J=8,2 Hz, 1H, CH-NH-Boc), 6,15 (t, J=6,3 Hz, 1H, H-1'), 5,32 (d, J=4,2 Hz, 1H, OH-3'), 5,09 (t, J=5,2 Hz, 1H, OH-5'), 4,27 (m, 1H, H-3'), 4,06 (pt, J=7,5 Hz, 1H, CH-NH-Boc), 3,91 (m, 1H, H-4'), 3,63 (m, 2H, H-5'a H-5), 235 (m, 1H, H-2), 2,06 (m, 2H, H-2'a CH(CH₃)₂), 1,43 (s, 9H, tBu), 0,92 (pt, J=6,6 Hz, 6H, CH(CH₃)₂);

¹³C NMR (DMSO-de) δ ppm 174,41, 162,94, 155,24, 146,10, 96,06, 88,79,

87,10, 79,09, 70,75, 61,78, 61,55, 41,74, 30,63, 29,02, 19,91 a 19,10; FAB>0

-81 (GT) 853 (2M+H)⁺, 427 (M+H)⁺, 311 (B+2H)⁺, 255 (M-Boc)⁺; FAB<0, (GT) m/z

851 (2M-H)', 425 (M-H)', 309 (B)'.

Příklad 10: 3',5'-/V⁴-Trivalyl-2'-deoxycytidin (14, obrázek 7)

Výchozí materiál 3',5'-A/⁴-tri(Boc-valyl)-2'-deoxycytidin se rozpustil CH2CI2, ale protože obsahoval nerozpustný materiál, vzorek se zfiltroval přes perlit. To způsobilo zvýšení objemu použitého CH2CI2. Potom se za míchání přidal reagent HCI/dioxan. Během několika sekund bylo možné v roztoku pozorovat bublinky a potom se zakalil. Směs se míchala při pokojové teplotě asi 1 hodinu. Během této doby sraženina více zkrystalizovala. Směs se rychle zfiltrovala, filtrační koláč se promyl CH₂CI₂ a potom se sušil za vzniku 0,16 g (69%) krémově bílých krystalů. Reagenty a podmínky jsou explicitněji popsané níže v tabulce 1.

Tabulka 1

Reagent	Mol.jedn.	Hm./obj. kaik	Mol/pts	Hm./obj. použ.	Mol/pts	Ekvivalent
3',5',A/⁴-triBoc-Val-2'-dC (CyVal2a-2a)	825,0 FW	0,30 g	0,00036	0,3 g	0,00036	1,00
CH₂CI₂	5,0 částí	1,5 ml	5	3,0 ml	10	10,0
HCI, 3,9 M v dioxanu	256,0 ml/mol	0,47 g	0,00182	0,5 g	0,00195	5,37
3',5',/V⁴-triVal-2'-dC, surový	634,0 FW	0,23 g	kalk-obt	0,16 g	69,4 %

» · · • · • · · • · · · · • · · · • · · ·

-82Příklad 11: Metoda stanovení HPLC pro DiBocValyl-2'-dC a DiBocValyl2'-dU

Vzorek 1,0 mg/ml se vyrobil rozpuštěním žádané sloučeniny v absolutním ethanolu. Roztok se potom ředil roztokem, který obsahoval 50% MeOH a 50% KH₂PO₄ (0,015 M, pH=3,30-3,50), dokud se nezískala koncentrace 0,16 mg/ml. (Poznámka: všechna použitá rozpouštědla se před použitím odplynila). Roztok 20 μΙ se potom ihned injektoval do kolony HPLC od firmy WATERS (NOVAPAK C18-4pm-3,9 X 150 mm). Nastavil se průtok 1 ml/min a teplota kolony 35 °C. Aby se detekovaly sloučeniny, byla nastavena detekční vlnová délka 275 nm pro Di-Boc 2'dC, 260 nm pro Di-Boc 2'dU a 204 nm pro nečistoty po 15. minutách. Kolonou procházel KH2PO4 (0,015 M, pH=3,303,50, upraven H₃PO₄ 10 % obj/obj) čerpadlem A a acetonitril pro HPLC čerpadlem B. Zobrazení gradientu je vyznačeno v tabulce 2.

Tabulka 2

#	Čas	Modul	Případ	Objem
1	0,01	Čerpadla	Tok T	1
2	0,01	Čerpadla	Konc. B	45
3	12,00	Čerpadla	Konc. B	45
4	20,00	Čerpadla	Konc. B	70
5	28,00	Čerpadla	Konc. B	70
6	28,00	Čerpadla	Konc. B	45
7	32,00	Čerpadla	Konc. B	45
8	32,01	SCL-10Avp	STOP	0

-83VIII. Aktivita aktivních sloučenin proti HBV

Lidské DNA polymerázy a mitochondriální funkce nebyly ovlivněny L-dC in vitro. L-dC byla netoxická na lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMCs), progenitorní buňky kostní dřeně a mnohou buněčných linií lidského nebo nelidského savčího původu.

Antivirová aktivita a bezpečnost L-dC byla zkoumána ve dvou studiích za použití modelu chronické infekce hepatitidy B sviště. V první studii byly svišti chronicky infikované WHV (>1011 genomových ekvivalentů/ML séra) léčeni kapalnou formulací L-dC orální cestou jednou denně 28 dní. Kontrolní zvířata obdržela lamivudin nebo kapalnou formulaci bez léčiva. Ve skupině léčené LdC klesala virová zátěž v závislosti na dávce. Při nejvyšší testované dávce (10 mg/kg/den) klesala virová zátěž až 6 log vzhledem k základně při kvantitativním stanovení polymerázové řetězové reakce (PCR). Opěrovná vazba viru po léčení byla detekována v týdnu 2. Všechna zvířata zvětšila hmotnost a nebyla pozorována toxicita léčiva během léčebné fáze čtyř týdnů nebo následujících osm týdnů po léčbě.

Koncentrace s 50% účinkem in vitro (EC₅o) pro snížení extracelulární virové deoxyribonukleové kyseliny (DNA) pomocí L-dC byla 0,24 μΜ proti HBV a 0,87 μΜ proti DHBV. Navíc L-dC snížila intracelulární replikační meziprodukty (Rl) HBV DNA s EC₅o 0,51 μΜ. Koncentrace s 90% účinkem (EC₉₀) L-dC proti replikaci HBV byla 1,07 μΜ. Vztah struktury a aktivita (SAR ukazuje, že náhrada hydroxylové skupiny v poloze 3'(3'-OH) rozšířila antivirovou aktivitu z hepadnavirů na jiné viry včetně lidského viru imunodficience (HIV) a na některé herpes viry. Substituce v bázi snížila antivirovou potenci a selektivitu.

• ·

-84• •flfl ······· · · * · · · • ···· ···· ···· · flfl · · ·» ··

Druhá studie pomocí modelu virové infekce chronické hepatitidy B sviště testovala antivirový účinek a bezpečnost L-dC v kombinaci s druhým zkoumaným nukleosidem [p-L-2'-deoxythymidinem (L-dT)]. Součástí studie byla léčba, při které se použila L-dC jako jediný prostředek (1 mg/kg/den).

U samotné L-dC nebo v kombinaci s L-dT nebyla pozorována žádná toxicita léčiva během 12. týdenní léčebné fáze nebo v období 12 týdnů po léčbě. Nenastaly žádné změny tělesné hmotnosti vzhledem ke kontrolním zvířatům nebo chemického složení séra nebo hematologických parametrů. Vyšetření jaterní tkáně na konci léčby neukázala žádanou histomorfologickou přítomnost tukových změn (microvesicular steatosis). Kombinace L-dC (1 mg/kg/den) plus L-dT (1 mg/kg/den) byla synergická a snížila virovou zátěž až na 8 iog vzhledem k základně.

Antivirové nukleosidy a nukleosidové analogy uplatňují svůj antivirový účinek jako intracelulární trifosfátové deriváty na úrovni virové polymerázy během replikace viru. Jako přírodní nukleosidy (D-deoxycytidin a D-thymidin) a antivirové nukleosidové analogy (např. lamivudin a zidovudin) se L-dC aktivovala intracelulárné fosforylací. V lidských hepatocytech byla deoxycytidin kináza (dCK) odpovědná za konverzi L-dC na 5'-monofosfátový (MP) derivát závislou na počáteční dávce. L-dC-MP se potom převedla na 5'difosfátovou (DP) formu, která se následně převedla na predominantní intracelulární 5'-trifosfátový (TP) metabolit. Hladina L-dC-TP dosáhla 72,4 μΜ v buňkách HepG2 vystavených 10 μΜ L-dC (90,1 μΜ v primárních lidských hepatocytech) 24 hodin a měly intracelulární poločas života 15,5 hodiny. V testech endogenní polymerázy inhibovala L-dC-TP virem asociovanou DNA polymerázu WHV 50% inhibíční koncentrací (IC50) 1,82 μΜ. Podrobný mechanizmus inhibice HBV DNA polymerázy pomocí L-dC je ve stádiu zkoumání. Vystavení buněk HepG2 nebo lidských hepatocytů v primární kultuře L-dC také vytvořilo druhý TP derivát, p-L-2'-deoxyuridin 5'-trifosfát (LdU-TP). Hladina L-dU-TP dosáhla 18,2 μΜ u buněk HepG2 vystavených 10 μΜ L-dC (43,5 μΜ v primárních lidských hepatocytech) 24 hodin. V testech endogenní polymerázy inhibovala L-dU-TP virem asociovanou DNA polymerázu WHV IC₅₀ 5,26 μΜ.

-85• · ·

V primárních lidských kulturách hepatocytů a v lidské buněčné linii hepatomu (HepG2) hlavním metabolitem L-dC byla L-dC-TP. Vystavení těchto buněk LdC také vedlo ke vzniku L-dU-TP. Farmakologická stanovení in vitro ukázala, že L-dC-TP inhibovala hepadnavírovou syntézu DNA IC50 1,82 mM proti virem asociované DNA polymeráze. L-dU-TP inhibovala hepadnavírovou syntézu DNA IC₅o 5,26 μΜ. L-dC-TP a L-dU-TP neinhibovaly lidské DNA polymerázy α, β a γ až do koncentrací 100 μΜ, nejvyšší testovaná koncentrace.

Schopnost aktivních sloučenin inhibovat růst viru v buněčných kulturách 2.2.15 (buňky HepG2 transformované virem hepatitidy) se může rozvíjet způsobem popsaným podrobněji níže.

Souhrn a popis stanovení antivirových účinků v tomto systému a analýza HBV DNA byly popsány (Korba a Milman, 1991, Antiviral Res., 15:217). Antivirové evoluce se provádějí na dvou oddělených částech buněk. Všechny jamky na všech destičkách se očkují při stejné hustotě a ve stejném čase.

Inherentními změnami v hladinách intracelulární a extracelulární HBV DNA se za statisticky významné (P<0,05) považují pouze deprese větší než 3,5 násobné (pro HBV virion DNA) nebo 3,0 násobné (pro meziprodukty replikace HBV DNA) z půměrných hladin pro tyto formy HBV DNA v neléčených buňkách. Hladiny integrovaných HBV DNA v každém přípravku celulární DNA (která zůstává konstantní na buněčný základ v těchto experimentech) se používají pro výpočet hladin intracelulárních forem HBV DNA, přičemž se zajistí, že stejná množství celulární DNA se porovnají mezi jednotlivými vzorky.

Typické hodnoty pro extracelulární HBV virion DNA v neléčených buňkách se pohybují od 50 do 150 pg/ml kulturního prostředí (průměrně přibližně 76 pg/ml). Intracelulární meziprodukty replikace HBV DNA v neléčených buňkách • · · ·

-86• · · · · se pohybují od 50 do 100 pg/pg buněčné DNA (průměrně přibližně 74 pg/pg buněčné DNA). Obecně deprese v hladinách intracelulární HBV DNA způsobená léčbou antivirovými sloučeninami jsou méně výrazné a nastávají pomaleji, než deprese v hladinách HBV virion DNA (Korba a Milman, 1991,

Antiviral Res., 15:217).

Způsob, kterým se provádějí hybridizační analýzy, má za následek ekvivalenci přibližně 1,0 pg intracelulární HBV DNA ke 2-3 genomovým kopiím na buňku a 1,0 pg/ml extracelulární HBV DNA ke 3 χ 10⁵ virových částic/ml.

Příklady

Příklad 12: Studie rozpustnosti

Byla srovnána rozpustnost přírodního deoxyribocytosinu (D-dC), 3'-valinyl esteru L-dC a 3',5'-divalinyl esteru L-dC ve vodě. Rozpustnost L-dC byla nejprve stanovena analýzou dat HPLC (např. oblast pod křivkou) následnými injekcemi různých dobře známých koncentrací β-L-dC, jak je uvedeno v tabulce 3. HPLC probíhala na koloně Nova-pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientem 0 až 25% CH₃CN ve 20 mM triethylamoniumacetátovém pufru (TEAAc) programovaného v patnácti minutové periodě s průtokem 1 ml za minutu. Koncentrace roztoku ve vztahu k oblasti pod křivkou vytvořily lineární vztah y = 4150049477 x - 4334,46845 (obrázek 8a).

-874 · » · ·· ·

Tabulka 3

Koncentrace (mol/l)	10‘³	5 χ 10'⁴	10’⁴	10'⁵
Oblast	4175916	2031950	440122	55264

Připravil se nasycený roztok s přírodním deoxyribocytosinem (D-dC); odebraly se 3 vzorky a injektovaly do HPLC. Koncentrace nasyceného roztoku byla stanovena na 1,07, 1,08 a 0,96 mol/l; proto měl nasycený roztok průměrnou nasycenou koncentraci 1,03 mol/l nebo 272 g/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4

Výsledky	Oblast	Koncentrace (mol/l)
1. vzorek	4420674000	1,07
2. vzorek	4475191000	1,08
3. vzorek	3983845000	0,96

Podobně se vyhodnotila rozpustnost 3'-valinyl ester hydrochloridu β-L-dC ve vodě. Kalibrační křivka se stanovila následnými injekcemi různých koncentrací 3'-valiny! ester hydrochloridu β-L-dC do HPLC a měřením oblasti pod křivkou, jak je zobrazeno v tabulce 5. Opět HPLC probíhala na koloně Nova-Pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientam 0 až 25% CH₃CN ve 20 mM triethylamoniumacetátovém pufru (TEAAc) programovaného v patnáctiminutové periodě s průtokem 1 ml za minutu. Koncentrace roztoku ve vztahu k oblasti pod křivkou vytvořily lineární vztah y = 3176423963 x - 33051,63.

* • 0 * 0 · 4 • 94 < 4 4 9 0 «

0 · »

-88* · « • 0 0 4 4 4 « • 0 0 »

00

Tabulka 5

Koncentrace (mol/l)	10‘³	5 χ 10'⁴	10’⁴	5 x 10‘⁵	10'⁵
Oblast	3,166,842	1,514,479	254,296	119,668	19,269

Byla snaha vytvořit nasycený roztok pro 3'-valinyl ester hydrochlorid β-L-dC; avšak nezískal se. Proto se maximální množství 3'-valinyl ester hydrochloridů β-L-dC dostupné v laboratoři rozpustilo ve vodě. Odebraly se 3 vzorky a z oblasti pod křivkou z HPLC byly stanoveny půměrné koncentrace 1,013, 0,996 a 1,059 mol/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6

Výsledky	Oblast	Koncentrace (mol/l)
1 .vzorek	3218013000	1,013
2.vzorek	3162471000	0,996
3.vzorek	3362725000	1,059

Všechny tři výsledky spadají do předem definované oblasti vypočtené z kalibrační křivky, označující celkovou rozpustnost sloučeniny při těchto vysokých koncentracích, označující, že nasycený roztok tohoto vzorku je větší než půměr tří vzorků, např. větší než 1,023 mol/l nebo 408 g/l.

Rozpustnost 3', 5'-divalinyl ester hydrochloridů β-L-dC ve vodě byla vyhodnocena. Kalibrační křivka se stanovila následnými injekcemi různých koncentrací 3',5'-diva!inyl ester hydrochloridů β-L-dC do HPLC a měřením oblasti pod křivkou, jako je uvedeno v tabulce 7. HPLC probíhala na koloně Nova-Pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientem 0 až 25% CH3CN ve 20 mM triethylamoniumacetátovém pufru (TEAAc), programovaného v patnácti• ••·

-89- ·*.. : ·..*·..* ·..· minutové periodě rychlostí 1 ml za minutu. Koncentrace roztoku vzhledem k oblasti pod křivkou vytvořily lineární vztah y = 3176423963 x - 33051,63 (obrázek 8b).

Tabulka 7

Koncentrace (mol/l)	10'³	5 x 10‘⁴	10'⁴	5 χ 10’⁵	10'⁵
Oblast	2863372	1466574	211046	115678	14435

Byla snaha vytvořit nasycený roztok pro 3',5'-divalinyl ester hydrochlorid β-LdC; avšak nezískal se. Proto se maximální množství 3',5'-divalinyl ester hydrochloridu β-L-dC dostupné v laboratoři rozpustilo ve vodě. Odebraly se 3 vzorky a z oblasti pod křivkou z HPLC byly stanoveny průměrné koncentrace 2,8, 2,4 a 2,4 mol/l. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8

Výsledky	Oblast	Koncentrace (mol/l)
1 .vzorek	8336188000	2,8
2.vzorek	7054012000	2,4
3.vzorek	6970838000	2,4

Všechny tři výsledky spadají do předem definovaného rozsahu vypočteného z kalibrační křivky, označující celkovou rozpustnost sloučeniny při těchto vysokých koncentracích, označující, že nasycený roztok tohoto vzorku je větší než půměr tří vzorků, např. větší než 2,5 mol/l nebo 1337 g/l.

Podobné studie rozpustnosti byly vytvořeny pro 5'-valinyl ester hydrochlorid β-L-dC (větši než 5,1 mol/l nebo 1664 g/l) a 3',5'-diacetyl ester hydrochlorid • · · · • · · ·

-90« · · · • · · · β-L-dC (3,3 mol/1 nebo 1148 g/l). Kumulativní výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

Tabulka 9

Sloučenina	Rozpustnost (mol/l)	Rozpustnost (g/l)
D-dC	1,03	272
5'-val-L-dC	> 5,1	> 1664
3'-val-L-dC	> 1,023	> 408
3',5'-diacetyl-L-dC	3,3	1148
3',5'-dival-L-dC	>2,5	> 1337

Příklad 13:

Studie Log P - fosfátový pufr

Přibližně 1,5 mg D-dC se rozpustilo ve 2,2 ml 0,02 M roztoku fosfátového pufru (A, 100 ml, pH 7,2), vyrobeného ze směsi roztoku fosforečnanu draselného (28,5 ml) roztoku dihydrogenfosforečnamu draselného (71,5 ml), nasyceného oktanolem-1 (B). Do 1 ml tohoto roztoku se přidal 1 ml oktanolu-1 (B) nasyceného 0,02 M roztokem fosfátového pufru (A). Výsledná směs se třepala a odstředila; z každé fáze byly odebrány tři vzorky a analyzovány HPLC, jako je uvedeno v tabulce 10. HPLC probíhala na koloně Nova-Pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientem 0 až 25 % CH₃CN ve 20 mM triethylamoniumacetátového pufru (TEAAc) programovaného v patnáctiminutové periodě rychlostí 1 ml za minutu. Bylo zjištěno, že log P D-dC je -1,41; proto D-dC dává přednost vodě před oktanolem.

• · • · · ·

-91 Tabulka 10

	Studie 1	Studie 2
A¹	A²	A³	B¹	B²	B³	A¹	A²	A³	B¹	B²	B³
Oblast	19484 81	21307 20	21973 77	79838	82172	80159	23801 41	23266 54	23390 59	93123	90275	89651
Průměr	2092193	80723	2348618	91016
P(B/A)	0,039	0,039
logP	-1,41	-1,41

Podobně přibližně 1,5 mg L-dC-3'-valin ester hydrochloridu se rozpustilo ve

2,5 ml 0,02 M roztoku fosfátového pufru (A, 100 ml, pH 7,2), vyrobeného ze směsi roztoku fosforečnanu draselného (28,5 ml) a dihydrogenfosforečnanu draselného (71,5 ml). Roztok se potom nasytil oktanolem 1 (B). Do 1 ml tohoto roztoku se přidal 1 ml oktanolu-1 (B) nasyceného 0,02 M roztokem fosfátového pufru (A). Výsledná směs se třepala a odstředila; z každé fáze byly odebrány tři vzorky a analyzovány HPLC, jak je uvedeno v tabulce 11. HPLC probíhala na koloně Nova-pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientem 0 až 25% CH₃CN ve 20 mM triethylamoniumacetátového pufru (TEAAc) programovaného v patnáctiminutové periodě s průtokem 1 ml za minutu.

Tabulka 11

	Studie 1	Studie 2
A1	A2	A3	B1	B2	B3	A1	A2	A3	B1	B2	B3
Oblast	335273 5	/	34177 23	10054 4	96843	10346 6	34581 80	34480 62	34129 71	10017 9	/	10173 1
Průměr	3385227	100284	3439738	100955
P (B/A)	0,0296	0,0293
log P	-1,53	-1,53

• · • · · · • ·

-92• · · · * • · · ·

Bylo zjištěno, že log P L-dC-3'-valin ester hydrochloridu je -1,53; proto L-dC3'-valin ester dává přednost vodě před oktanolem ve větším stupni než D-dC.

Hodnoty log P byly vypočteny pro L-dC-5'-valin ester hydrochlorid a L-dC3',5'-divalin ester hydrochlorid. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 12. Avšak mělo by se poznamenat, že hodnota log P pro L-dC-3',5-divalin ester hydrochlorid je patrně nižší než hodnota naměřená (-0,86). Výrazná konverze divalin esteru na 3'- nebo 5'-monovalinyl ester nebo dokonce L-dC byly pozorována během experimentu. 50% konverze L-dC-3',5'-divalin ester hydrochloridu byla detekována ve vodní fázi a 14% v organické fázi. Tato konverze je způsobena nestabilitou esterů ve fosfátovém pufru při hodnotě pH 7 (viz příklady 15 a 16).

Tabulka 12

Sloučenina	log P (oktanol/voda)
D-dC	-1,41
L-dC-3'-valin ester hydrochlorid	-1,53
L-dC-5'-valin ester hydrochlorid	-1,42
L-dC-3',5'-divalin ester hydrochlorid	-0,86
L-dC-3',5'-diacetyl ester hydrochlorid	-0,74

Příklad 14:

Studie log P - voda MilliQ

Aby se předešlo konverzi divalin esteru na monoestery a L-dC, byla provedena alternativní studie log P za použití vody MilliQ (A') místo fosfátového pufru (pH 6,5 místo 7,2). Je důležité poznamenat, že pouze ··· ······ ·· • · · · · · . . , ··· ·· · ·· · ···· · ·· ·· *· hydrochloridová forma divalinyl esteru může být považována za rozpustnou ve vodě. Přibližně 1,5 mg L-dC-3',5'-divalinyl ester hydrochloridu se rozpustilo ve 2,2 ml vody MilliQ (A', pH 6,5) nasycené octanolem-1 (B). Do 1 ml tohoto roztoku se přidal 1 ml oktanolu-1 (B) nasycený vodou MulliQ (A'). Výsledná směs se třepala a odstředila; z každé fáze se odebraly tři vzorky a analyzovaly HPLC, jak je uvedeno v tabulce 13. HPLC probíhala na koloně Nova-Pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientem 0 až 25% CH₃CN ve 20 mM triethylamoniumacetátovém pufru (TEAAc) programovaným v patnáctiminutové periodě s průtokem 1 ml za minutu. Bylo zjištěno, že log P'3',5'divalinu za těchto podmínek byl -2,72, označující silný účinek opačných iontů ve fosfátovém pufru. Žádná konverze divalinu na monoestery nebo L-dC nebyla pozorována ani ve vodné ani v organocké fázi.

Tabulka 13

	Studie 1	Studie 2
A¹	A²'	A³'	B¹	B²	B³	A¹	A²'	A³'	B¹	B²	B³
Oblast	32782 93	32921 50	32822 81	5484	5776	6496	32829 27	33271 22	32979 85	5829	5615	6139
Průměr	3284241	5919	3302678	5861
P'(B/A')	1,80 χ 10'³	1,77 x 10‘³
Log P'	-2,7	-2,75

Podobně přibližně 1,5 mg L-dC-5'-valinyl ester hydrochloridu se rozpustilo ve

2,2 ml vody MilliQ (A', pH 6,5) nasycené oktanolem-1 (B). Do 1 ml tohoto roztoku se přidal 1 ml oktanolu-1 (B) nasyceného vodou MilliQ (A'). Výsledná směs se třepala a odstředila; z každé fáze se odebraly tři vzorky a analyzovaly HPLC, jak je uvedeno v tabulce 14. HPLC probíhla na koloně Nova-Pack C18 (3,9 x 150 mm) gradientem 0 až 25% CH₃CN ve 20 mM triethylamoniumacetátovém pufru (TEAAc) programovaný v patnáctimunutové periodě s průtokem 1 ml za minutu. Bylo zjištěno, že log P 5'-valinu za těchto

-94* · · · * · · · · · · • · · • · · · · · · podmínek byl -2,75, opět hodnota nižší než nalezená ve studii log P za použití fosfátového pufru.

Tabulka 14

	Studie 1	Studie 2
ΑΓ	A2'	A3'	B1	B2	B3	A1'	A2'	A3	Έ1	B2	B3
Oblast	37224 94	37719 63	37883 17	6545	5082	i	36199 00	39753 53	40622 84	8484	9454	5877
Průměr	3760924	5813	3885845	7938
P'(B/A')	1,54 x 10’³	2,04 x 10’³
Log P'	-2,81	-2,69

Za těchto podmínek hodnoty log P' pro L-dC-5'-valinyl ester hydrochloridu a L-dC-3',5'-divalinyl ester hydrochloridu jsou velmi podobné (tabulka 15).

Tabulka 15

Sloučenina	log P (oktanol/voda)	log P'(oktanol/voda)
L-dC-5'-vylin ester hydrochlorid	-1,42	-2,75
L-dC-3',5'-divalin ester hydrochlorid	-0,86	-2,72

Příklad 15:

Studie stability při hodnotě pH 7,4

Rychlost rozkladu každého metabolitů L-dC-3'-valin ester hydrochloridu byla vypočtena. Poločas života L-dC-3'-valin ester hydrochloridu při hodnotě pH

7,40 byl stanoven na 7 hodin v 0,2 M roztoku Tris-HCI při teplotě 37 °C. V těchto podmínkách se L-dC-3'-valin ester hydrochlorid snadno transformuje

-95na L-dC. Nebyl detekován žádný cytosin, tedy nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby.

Podobně, rychlost rozkladu každého metabolitu L-dC-3',5'-divalin ester hydrochloridu byla vypočtena. Poločas života L-dC-3',5'-divalin ester hydrochloridu při hodnotě pH 7,42 byla stanovena na 2,4 hodiny v 0,2 M roztoku Tris-HCl při teplotě 37 °C. V těchto podmínkách se L-dC-3',5'-divalin ester hydrochlorid částečně hydrolyzuje na 3'- a 5'-valinyl-L-dC, které se později transformují na L-dC. Nebyl detekován žádný cytosin, tedy nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby (schéma 4, obrázky 9a a 9b).

Schéma 4

NH2

N

-A

O NH₂

NHí

OH

L-dC λ max = 269.9 nm rt-3.1 min

3‘,5'-dI- O -valinyl ester of L-dC T_1/2= 2;4h λ max = 268.7 nm rt= 10.7 min

fy = H R₂ = OVal or fy =OVal R_Z = H

Rl

R2

3'-or 5'- O -valinyl ester of L-dC T_1;2= 6.9h λ max = 268.7 nm rt = 7.2 min

Příklad 16:

Studie stability při hodnotě pH 7,20

Poločas života L-dC-3',5'-divalin ester hydrochloridu při hodnotě pH 7,20 byl stanoven na 2,2 hodiny ve 20 mM fosfátovém pufru. V těchto podmínkách se L-dC-3',5'-divalin ester hydrochlorid částečně hydrolyzuji na 3'- a 5'-valinylLdC, které se později transformují na L-dC. Nebyl detekován žádný cytosin, • · · ·

-96tedy, nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby (schéma 5, obrázky 10a a 10b).

Schéma 5

3',5‘-di-O-vaIinyl ester of L-dC

3’-or 5'-O-vallnyl ester of L-dC T_1/Z=7h λ max * 268.7 nm rt = 7.1 min

λ max = 2G9.9 nm rt = 3.0 min

Příklad 17:

Studie stability při hodnotě pH 4,5

Poločas rozpadu L-dC-3'-valin ester hydrochloridu při hodnotě pH 4,5 byl stanoven na 8,6 dní ve 20 mM acetátovém pufru. Opět se L-dC-3'-valin ester hydrochlorid snadno transformuje na L-dC. Nebyl detekován žádný cytosin, tedy nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby..

Podobně poločas života L-dC-3',5'-divalin ester hydrochloridu při hodnotě pH 4,51 byl stanoven na 44 hodin ve 20 mM acetátovém pufru. V těchto podmínkách se L-dC-3',5'-divalin ester hydrochlorid částečně hydrolyzuje na 3'- a 5'-valinyl-L-dC, které se později transformují na L-dC. Nebyl detekován žádný cytosin, tedy, nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby (obrázky 11a a 11b).

• · • · · • · · « ·

-97Příklad 18: Studie stability při hodnotě pH 1,2

Poločas života L-dC-3'-valin ester hydrochloridu při hodnotě pH 1,2 byl stanoven větší než 48 hodin v 135 mM roztoku KCI-HCI. Nebyl detekován žádný cytosin, tedy nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby.

Podobně byly udělány studie stability L-dC-5'-valin ester hydrochloridu. Tato sloučenina je zcela stabilní při hodnotě pH 1,2, aniž by se během až 23 hodin detekovaly žádné jiné metabolity nebo produkty rozkladu. V roztoku nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby až 2 dny.

Zjistilo se, že 3',5'-diacetylester L-dC má poločas rozpadu 11,2 hodin při hodnotě pH 1,2. Za těchto podmínek se sloučenina částečně hydrolyzovala na 3'- a 5'-deriváty, které se později transformovaly na L-dC. V roztoku nebylo detekováno žádané rozštěpení glykozidické vazby až dva dny.

Zjistilo se, že 35'-divalinyl ester L-dC je zcela stabilní při hodnotě pH 1,23, protože za těchto podmínek nabyly až 48 hodin detekovány žádné jiné sloučeniny. V roztoku nebylo detekováno žádné rozštěpení glykozidické vazby až 2 dni (obrázek 12).

Alternativně, pokud se poloha N⁴ L-dC maskuje skupinou dimethylaminomethylen nebo acetyl, poločas života sloučeniny při hodnotě pH 1,2 je pouze 26 minut a nebo 50 minut.

• ·

-98• · · ·

Příklad 19:

Biodostupnost nárazové dávky L-dC u opice (cynomologus monkey)

Byly stanoveny farmakokinetiky L-dC po IV a orálním podávání L-dC opicím (cynomologus monkeys). V této studii bylo třem opicím (cynomologus monkeys) podáno 10 mg/kg L-dC, radioaktivně značené tritiem ([3H]), jako nárazová dávka IV. Po šesti týdnech obdržely stejné tři opice identickou orální dávku L-dC. Vzorky krve pro farmakokinetické anylýzy byly odebrány před dávkou a 0,24, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 a 24 hodin po dávce. Vzorky moči pro farmakokinetické anylýzy byly odebrány záchytem do nádoby před dávkou a v následujících intervalech pod dávce: 0-2, 2-4, 4-8, a 8-12 hodin a následně ve 12-hodinových intervalech během 336 hodin po dávce. Léčivo bylo detekováno a koncentrace stanovena za použití techniky reverzní fáze HPLC. Data hladiny léčiva v krvi a moči byla analyzována nemodelovou matematickou metodou a AUC odvozené lineárním trapeziodálním (lichoběžníkovým) pravidlem.

Intravenózní podávání L-dC. Hodnota C_max L-dC po IV podávání byla 95,7 μΜ a nastala v prvním vzorkovacím čase (15 minut po dávce) u všech zvířat. Koncentrace L-dC v plazmě klesaly v době po jednorázově podané IV dávce s hodnotou t-i/2 1,59 hodin. Celkové očišťovací schopnost (CL) a ledvinová očišťovací schopnost CLR L-dC po IV podávání je průměrně 0,53 l/h/kg a nebo 0,46 l/h/kg. Hodnota viditelného objemu distribuce (V_d) 1,22 l/kg znamená, že L-dC se značně distribuovala do extravaskulární tkáně.

Močové vylučování bylo rychlé, 71 % podávané dávky se odstranilo do 2 hodin. L-dC představovala hlavní podíl (94 %) dávky odstraněné v moči. Ledvinová očišťovací schopnost (0,46 l/h/kg) představovala 87 % celkové očišťovací schopnosti L-dC a dokládá, že ledvinové vylučování bylo hlavní cestou eliminace.

• ·

-99L-dU byla detekována v plazmě a moči a znamená, že metabolická eliminace L-dC také nastává po IV podávání. Nízké hladiny L-dU byly detekovány v plazmě při mezní detekci (nižší mezní detekce (LLOD) = 0,1 μΜ). Ledvinové vylučování L-dU bylo 4,0 % celkové dávky odstraněné v moči. S výjimkou LdU nebyly v plazmě nebo moči detekovány žádné jiné metabolity.

Orální podávání L-dC. Hodnota C_max byla 3,38 μΜ a nastala při hodnotě T_max2,33 hodin. Koncentrace L-dC v plazmě klesala dvoufázově s koncovou hodnotou tv₂ 2,95 hodin a byla pod detekčními limity 24 hodin u všech opic. L-dC se absorbovala z gastrointestinálního traktu s hodnotou orální biodostupností (F) 16,4 %.

L-dU byla detekována v plazmě a moči, což dokazuje, že metabolická eliminace L-dC nastala po orálním podávání. Nízké hladiny L-dU byly detekovány v plazmě při LLOD. S výjimkou L-dU nebyly v plazmě nebo moči detekovány žádné jné metabolity.

Ppřibližně 8,5 % podáváné orální dávky se odstranilo v moči do 12 hodin. Po 72 hodinách bylo odstraněno 15,5 % ± 8 %. L-dC představovala hlavní podíl (~69 %) léčiva vyloučeného do moči. Ledvinové vylučování L-dU bylo 29 % z celkové odstraněné dávky. Zbytky nebyly sbírány.

Tabulka 16 představuje souhrn farmakokinetických výsledků pro IV a orální podávání L-dC u opic (cynomologus monkeys).

• · • * • · · «

-100Tabulka 16: Farmakokinetické analýzy po intravenozním a orálním

podávání L-dC (10 mg/kg) u opice (cynomologus monkey)

Cesta (h)	AUCposi, (mM-h)	t-l/2 (h)	Dmax (mM)	T max (h)	CL (l/h/kg)	CLr (l/h/kg)	v_d (l/kg)	F (%)
IV	81,1	1,59	95,7	0	0,53	0,46	1,22	-
(3)	(±5,7)	(±0,09)	(±13)		(±0,04)		(±0,11)
Orálně	13,7	2,95	3,38	2,33	-	-	-	16,4
(3)	(±4,3)	(±1,3)	(±1,3)	(±1,5)				(±5,0)

Střední hodnota (±SD)

Příklad 20: Biodostupnost jednotlivé dávky L-dC u opice makak rhesus (rhesus monkey)

Byly stanoveny farmakokinetiky L-dC po orálním podávání i opice makak rhesus. V této studii bylo třem opicím makak rhesus podáno 10 mg/kg L-dC radioaktivně značeného tritiem [3H], jako nárazová orální dávka. Vzorky krve pro farmakokinetické analýzy byly odebrány před dávkou a v 0,25, 0,5, 1, 2, 3, 6, 8 a 24 hodin po dávce. Vzorky moče pro farmakokinetické analýzy byly odebrány záchytem do nádoby (via pan catch) před dávkou a v následujících intervalech po dávce: 0-2, 2-4, 4-8 a 8-12 a potom v 12-hodinových intervalech během 336 hodin po dávce. Data hladiny léčiva v krvi a moči byla analyzována nemodelovou matematickou metodou a AUC odvozené lineárním trapezoidálním (lichoběžníkovým) pravidlem.

Průměrné hodnoty AUC 0,25 ->β θ C_max byly 12,2 mgM.h a nebo 3,23 mgM. Hodnota C_max nastala při T_max 0,83 hodiny. Střední hodnota ti/2 byla 3,34 hodiny a koncentrace L-dC v plazmě byla pod detekčními hladinami 24 hodin u všech opic. Střední hodnota, ledvinové očišfovací schopnosti L-dC byla 0,273 l/h/kg. V plazmě opic s obsahem L-dC nabyly pozorovány žádné metabolity.

-101 Přibližně 8,5 % podáváné orální dávky (orální biodostupnost L-dC ~16 %) bylo odstraněno do moči do 8 hodin. Po 48 hodinách bylo odstraněno 15 %. L-dC představovala hlavní podíl (~77 %) léčiva vyloučeného do moči. Ledvinové vylučování L-dU bylo 23 % z celkově odstraněné dávky. S výjimkou L-dU nebyly detekovány žádné jiné metabolity.

Hodnoty AUC a C_max pro L-dC po orálním podávání opicím makak rhesus byly podobné hodnotám, pozorovaným u opic cynomologus.

Příklad 21:

Biodostupnost nárazové dávky L-dC u krysy

Byly stanoveny farmakokinetiky a biodostupnost L-dC u krys. V této studii bylo třem samicím krys Sprague-Dawley podáváno 10 mg/kg L-dC radioaktivně značeného tritiem [3H], jako nárazová IV dávka. Druhá skupina třech zvířat obdržela identickou orální dávku L-dC. Vzorky krve pro farmakokinetické analýzy byly odebrány v 0,17, 0,33, 0,5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 a 24 hodin po dávkování. Vzorky moči byly talé odebrány 8 a 24 hodin po dávkování. Léčivo bylo detekováno a koncentrace stanovena v plazmě a moči za použití techniky reverzní fáze HPLC. Data byla analyzována nemodelovou matematickou metodou a AUC odvozené lineárním trapezoidáoním (lichoběžníkovým) pravidlem.

Intravenozní podávání L-dC. Průměrná hodnota AUC₀,25^8 byla 30,1 mM.h. Hodnota Cmax L-dC byla 91,1 mgM a nastala v době prvního vzorkování (10 minut po dávce) u všech zvířat. Koncentrace L-dC v plazmě klesala dvoufázově po jednorázově podané IV dávce se střední hodnotou t-1/2 1,21 hodiny. Hodnota CL L-dC činila v průměru 1,44 l/h/kg. Střední hodnota V_d2,53 l/kg znamená, že se L-dC značně distribuoval do extravaskulární tkáně. V plazmě krys s obsahem L-dC nebyly pozorovány žádné metabolity.

• ·

L-dC představoval hlavní podíl radioaktivity odstraněné do moči. L-dU byl detekován v moči, což dokázalo, že metabolická eliminace L-dC nastala po IV podávání.

Orální podávání L-dC. Průměrná hodnota AUC₀,₂5^s byla 4,77 mM.h. Střední hodnota C_max byla 1,50 mgM a nastala při hodnotě T_max 1,0 hodina. Koncentrace L-dC v plazmě klesala s hodnotou tv₂ 2,52 hodiny. L-dC omezoval absorpci z gastrointestinálního traktu se střední hodnotou orální biodostupnosti (F) 15,4 %. V plazmě krys po orálním podávání L-dC nebyly pozorovány žádné metabolity.

L-dC představoval hlavní podíl radioaktivity odstraněné do moči. L-dU byl detekován v plazmě a moči, což dokázalo, že metabolická eliminace L-dC nastala po orálním podávání.

Tabulka 17 představuje souhrn farmakokinetických výsledků pro IV a orální podávání L-dC.

Tabulka 17 Farmakokinetické analýzy po intravenozním a orálním podávání L-dC (10 mg/kg) u krysy

Cesta (h)	AUCo,25-8 (mM-h)	t-l/2 (h)	Cmax (mM)	T max (h)	CL (l/h/kg)	V_d (l/kg)	F (%)
IV	30,1	1,21	91,1	0	1,44	2,53	-
(3)	(+4,7)	(±0,06)	(±6,6)		(±0,29)	(±0,60)
Orálně	4,77	2,52	1,50	1,0	-	-	15,4
(3)	(±2,1)	(±1,3)	(±0,68)				(±4,6)

Střední hodnota (±SD)

- 103 Příklad 22:

Biodostupnost nárazové dávky L-dC u sviště

Byly stanoveny farmakokinetiky a biodostupnost L-dC u sviště. V této studii bylo třem svišťům podáváno 10 mg/kg L-dC radioaktivně značeného tritiem [3H], jako nárazová IV dávka. Vzorky krve pro farmakokinetické analýzy byly odebrány 2, 5, 15 a 30 minut a 1,0, 1,5 , 2,0, 3,0 , 4,0 a 24 hodin po dávce. Po sedmi dnech obdržela stejná zvářata 10 mg/kg L-dC jako nárazovou orální dávku. Vzorky krve pro farmakokinetické analýzy byly odebrány 15 a 30 minut a 1,0, 1,5, 2,0, 3,0, 4,0, 8,0 a 24 hodin po dávce. Vzorky moči byly odebrány v periodě 24 hodin po dávce. Hladiny léčiva v plazmě, CL, ti_/2 a F byly stanoveny. Hladiny léčiva byly stanoveny za použití metody HPLC s radioaktivní detekcí in-line a scintilačním sčítáním.

Intravenozní podávání L-dC. Střední hodnota C_max L-dC byla 112 μΜ a nastala při prvním odebráním vzorku (2 minuty po dávce) u všech zvířat. Koncentrace L-dC v plazmě klesala dvoufázově po nárazové IV dávce léčiva se střední hodnotou t_1/2 2,85 hodin. Průměrná hodnota CL L-dC byla 0,39 l/h/kg. Střední hodnota V_d byla 1,17 l/kg. L-dC představoval hlavní podíl radioaktivity odstraněné do moči. L-dU byla detekována v plazmě a moči a znamená, že metabolická eliminace L-dC nastala po IV podávání. Hladiny LdU detekované periodicky v plazmě byly na mezi nebo pod mezí kvantitativního stanovení se střední hodnotou C_max 0,75 μΜ.

Orální podávání L-dC. Hodnota C_max byla 1,37 μΜ a nastala při hodnotě T_max3 hodiny. Koncentrace L-dC v plazmě klesaly se střední hodnotou ti/₂ 5,22 hodin. L-dC byla absorbována z gastrointestinálního traktu s orální biodostupnosti v rozmezí 5,60 až 16,9 % se průměrnou hodnotou 9,57 %. LdC představovala hlavní podíl radioaktivity odstraněné do moči. L-dU byla detekována v plazmě a moči, což znamená, že metabolická eliminace L-dC • · ♦ · • · · *

-104• · • · nastala po orálním podávání. L-dU v plazmě byla blízko kvantitativní meze se střední hodnotu C_max 0,19 μΜ.

Tabulka 18 představuje souhrn farmakokinetických výsledků pro IV a orální podívání L-dC.

Tabulka 18 Farmakokinetické analýzy L-dC (10 mg/kg) po intravenozním a orálním podávání u sviště

Cesta (h)	AUC^₂4^a (μΜ-h)	tl/2 (h)	X £ s O -3	f~max (h)	CL (l/h/kg)	v_d (i/kg)	F (%)
IV	174	2,85	112	0	0,39	1,17	-
(3)	(±120)b	(±130)	(±33)		(±0,3)	(±0,36)
PO	11,3	5,22	1,37	3,0	-	-	9,57
(3)	(±47)	(±2,7)	(±0,22)	(±1)			(±6,4)

a t = 0,022 hodin pro podávání IV a 0,25 hodin pro podávání PO b střední hodnota (±SD)

Příklad 23:

Biodostupnost prekurzorů L-dC

Biodostupnost L-dC, 5'-monoesteru L-dC, divalin esteru L-dC a diacetylesteru L-dC byla vyhodnocena u opic cynomologus s a bez L-dT. Pokud byi divalin ester L-dC podáván opicím orálně, přibližně 73 % dávky bylo absorbováno. Z absorbovaného divalin esteru L-dC bylo více než 99 % rychle převedeno na L-dC za vzniku vysoké koncentrace L-dC ve plazmě a nedetekovatelného divalin esteru L-dC. Nízká koncentrace monovalin esteru L-dC v plazmě byla detekována brzo po orální dávce divalin esteru L-dC. Nízká koncentrace β-L2'-deoxyuridinu (L-dU) v plazmě byla detekováná občasně. Nebyly detekovány žádné jiné metabolity. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 19.

Ί nc . ······ · ··. »

- 1 Uu - .· · ······· ···· · ·· ·· ··

Z toho vyplývá, že kombinace 3',5'-divalyl esteru L-dC s L-dT poskytuje největší biodostupnost L-dC.

Tabulka 19

	L-dC základní (mw=227,22)	L-dC³ 5 '-valin (mw=399,27)	L-dC 3 '-valin (mw=399,27)	L-dC divalin (mw=534,87)	L-dC diacetyl (mw=347,75)
% BA¹	16,4±5,0	39,0±11,4	85,1±24,5	72,7±22,0	23,0±6,5
% BA w/L-dT²	11,9±1,7	ND	ND	74,6±9,9	24,9±4,0

odhadnuto ve vztahu k AUC L-dC (orální dávka) podáváno společně s 10 mg/kg L-dT studie specifické aktivity 5'-mono-valinu, vztaženo na celkovou radioaktivní dávku

ND není stanoveno

Čistota = 87 % L-dC-mono-valin, 12 % L-dC

Příklad 24:

Biodostupnost náratové dávky dival-L-dC u opice (cynomologus monkey)

Tři nenaivní opice cynomologus (macaca fascicularis) obdržely intravenozně 10 mg/kg dival-L-dC značeného stopovým množstvím tritia ([3H]') (250 pCi) rozpuštěného ve sterilním 9,0% roztoku soli. Po 6. týdnech obdržely stejná tři zvířata identickou orální dávku dival-LdC. Vzorky krve byly odebrány do heparinizovaných zkumavek před dávkou (~18 hodin) a 0,25, 0,50, 1, 2, 3, 4, 6, 8 a 24 hodin po dávce. Vzorky moči byly také odebrány v intervalech 0-2, 2-4, 4-8, 8-12 hodin a potom ve 12-hodinových intervalech během 336 hodin po dávce. Léčivo bylo kvantifikováno v plazmě a moči technikou kapalinové chromatografie-hmotnostní spektrometrie (LC-MS). Po podávání dival-L-dC byla nemodelovou matematickou metodou analyzována časová závislost ·♦·· • · · ·

- 106koncentrace L-dC v plazmě a oblast pod křivkou čas-koncentrace (AUC) byly odvozená lineárním trapeziodálním (lichoběžníkovým) pravidlem. Biodostupnost (F) L-dC po IV a PO podávání dival-L-dC byla vypočtena z AUC LdC, kde F = AUCpo/AUCiv x dávka iv/dávka po.

Intravenozně podávaný dival-L-dC byl rychle převeden na L-dC po intravenozním podávání. Dival-L-dC byla detekován v plazmě po 15 minutách (1,39 μΜ) a po 30 minutách (0,36 μΜ, 1 ze 3 zvářat) [nižší kvantitativní mez (LLOQ) = 0,23 μΜ nebo 100 ng/ml]. Dival-L-dC nebyl detekován v plazmě po

30. minutách po dávce. Částečně deesterifikovaná forma dival-L-dC, β-Ι_-2'deoxycytidin-5'-vylin esteru, byla detekována v plazmě po 15. minutách (3,23 μΜ) a klesla na koncentraci 0,08 μΜ během 2 hodin (LLOQ = 0,031 μΜ nebo 10 ng/ml). L-dC znamenala hlavní podíl léčiva přítomného v plazmě po intravenozním podávání. Průměrná hodnota AUCo,25->8 pro L-dC byla 19,8 pM.h. Střední hodnota koncentrace (C_max) L-dC v plazmě byla 24,6 μΜ (LLOQ = 0,088 μΜ nebo 20 ng/ml) a nastala v čase prvního odebrání vzorku (15 minut po dávce) u všech zvířat. Koncentrace L-dC v plazmě klesala dvoufázově se střední hodnotou ti/₂ 1,74 hodin. Celkové očištění těla (CL) a průměrný zřejmý objem distribuce (V_d) L-dC byl 1,01 l/h/kg a nebo 2,46 l/kg, který znamená, že se L-dC značně distribuoval do extravaskulární tkáně. Vazba dival-L-dC a L-dC na protein lidské plazmy ex vivo byla 13,3 % ± 2,6 % a nebo 19,7 % ± 5,9 %. Vliv proteinu lidské plazmy, který se váže na hladiny volného léčiva dival-L-dC a L-dC byl minimální, což dokazuje, že vzájemné reakce léčiva, které se týkají posunutí vazebného místa, se neanticipují (nepředjímají).

Do moči bylo rychle vyloučeno 58±3 % podávané dávky dival-L-dC do 2 hodin po intravenozním podávání. L-dC představoval hlavní podíl (~93 %) léčiva vyloučeného do moči. L-dU byl také detekován v plazmě a moči. To dokazovalo, že metabolická eliminace L-dC také nastává po podávání dival-LdC. Nízké hladiny L-dU byly detekovány v plazmě v periodických časových bodech u dvou nebo třech zvířat při koncentracích v rozmezí 0,22 μΜ až 0,88

• «1 · • ·

- 107μΜ (LLOQ = 0,22 μΜ nebo 50 ng/ml). Neexistovaly žádné detekovatelné hladiny L-dU v kterémkoliv časovém bodě u třetí opice. Ledvinové vylučování L-dll a částečná deesterifikovaná forma dival-L-dC, p-L-2'-deoxycytidin-5'valin esteru byla malá a představovala přibližně 2,5 % a nebo 3,7 % celkově odstraněné dávky. Dival-L-dC byl detekován v moči jednoho ze tří zvířat 2 hodiny po IV podávání, což představovalo přibližně 0,15 % odstraněné dávky.

Kvůli periodicky nízkých koncentrací obou monovalin esterů a L-dU v plazmě a moči nebylo vhodné provést farmakokinetické analýzy těchto metabolitů. Výskyt monovalin esteru dival-L-dC nebylo neočekávané, protože je přítomen a je prostředníkem při konverzi dival-L-dC na L-dC. Navíc studie celulárního metabolizmu in vitro v primárních hepatocytech u opice, krysy a člověka a extrakty buněk HepG2 prokazují, že L-dC nebyl přímo deaminován na L-dU, ale že se L-dC monofosfát (-MP) převedl na L-dU-ΜΡ, který se buď aktivuje na L-dU difosfát (-DP) a trifosfát (-TP) nebo metabolizuje na L-dU, který se potom detekuje v extracelulární oblasti (plazma). L-dU nebyl cytotoxický (CC50 > 200 μΜ) a L-dU-TP měl hodnotu IC50 in vitro proti polymeráze deoxyribonukleové kyseliny (DNA) viru hepatitidy B 5,26 μΜ (viz Microbiology and Virology, sekce 10).

Orálně podávaný dival-L-dC byl také rychle převeden na L-dC po orálním podávání a nebyl detekovatelný ve vzorkách plazmy v kterémkoliv časovém bodu (LLOQ dival-L-dC v roztoku = 0,23 μΜ nebo 100 ng/ml). Částečně deesterifikovaný metabolit dival-L-dC, p-L-2'-deoxycytidin-5'-valin esteru byl detekován v plazmě po 30. minutách a 1 hodině při koncentraci v rozmezí 0,034 β až 0,107 β (LLOQ monoesteru v roztoku = 0,031 μΜ nebo 10 ng/ml). Dival-L-dC nebyl detekován v plazmě.

L-dC představoval hlavní podíl (> 99 % při C_max) hladin léčiva v plazmě po orálním podávání dival-L-dC. Průměrná hodnota AUCo,25->8 pro L-dC byla 14,0 μΜ-h. Hodnota C_max L-dC byla 8,26 μΜ (LLOQ L-dC v roztoku = 0,088 μΜ • · nebo 20 ng/,1) a nastala 0,67 hodiny po podávání dival-L-dC. Koncentrace L-dC v plazmě klesala dvoufázově se střední hodnotou ti/₂ 2,28 hodin. Střední hodnota orální biodostupnosti L-dC po podávání dival-L-dC byla

72,7 % ± 22 %.

L-dU byl také detekován v plazmě, což znamená, že metabolická eliminace LdC nastává po orálním podávání dival-L-dC. Nízké hladiny L-dU byly detekovatelné v plazmě 30. minut až 4 hodin u dvou ze tří zvířat při koncentracích v rozmezí 0,24 μΜ až 0,66 μΜ (LLOQ L-dU v roztoku = 0,22 μΜ nebo 50 ng/ml) a u jednoho zvířete pouze 8 hodin při koncentraci 0,39 μΜ.

Po orálním podávání byl dival-L-dC rychle absorbován z gastrointestinálního traktu a převeden na L-dC intestinálním a/nebo hepatickým metabolizmem. Ani dival-L-dC ani L-dC metabolízmus nebyl asociován s jaterními mikrozomálními enzymy. Po podávání výsokých hladin dávek dival-L-dC byl monovalin ester L-dC krátce detekován před konverzí na L-dC. Po orálním podávání nebyl detekován žádný dival-L-dC. Periodicky nízké hladiny L-dU v plazmě byly detekovány na nebo pod nižší kvantitativní mezi. L-dU se vytvořil deaminací L-dC po celulární absopci L-dC.

Přibližně 31 ± 8 % podávané orální dávky bylo odstraněno do moči do 4 hodin. Po 72 hodinách bylo odstraněno 39 ± 8 %. L-dC představoval hlavní podíl (-95%) léčiva vyloučeného do moči. Ledvinové vylučování L-dU a částečně deseterifikované formy dival-L-dC, p-L-2'-deoxycytidin-5'-valin esteru bylo malé a představovalo přibližně 2,5 % a nebo 0,2 % celkově odstraněné dávky. V moči nebyl detekován žádný dival-L-dC.

Tabulka 20 představuje souhrn farmakokinetických výsledků pro L-dC po IV a orálním dávkování dival-L-dC.

·· « »» • · t · A • * * A · « • » * A A A A « • * · · · ··»· * AA ««

-109• * » ·

Tabulka 20 Farmakokinetické analýzy po intravenózním a orálním podávání dival-L-dC (10 mg/kg) u opic cynomologus

Farmakokinetické parametry ²
Cesta (n)	AUCo,25->8 (μΜ-h)	tl/2 (h)	Cmax (μΜ)	T max (h)	CL (l/h/kg)	v_d (l/kg)	F (%)
IV	19,8	1,73	24,6	0	1,01	2,46
(3)	(±5,2)	(±0,33)	(±2,6)		(±0,32)	(±0,47)
orálně	14,0	2,28	8,26	0,67			72,7
(3)	(±2,4)	(±1,4)	(±0,71)	(±0,3)			(±22)

(3) Střední hodnota [tstadardní odchylka (SD)]

Tabulka 21 představuje schematickou formu tvorby metabolitu dival-L-dC, monovalinový derivát L-dC, L-dC a L-dU po IV a orálním podávání dival-L-dC. Hodnota Cmax každého metabolitu je také zaznamenána.

Tabulka 21 Tvorba metabolitu pro IV a PO podávání dival-L-dC

Intravenózně (10 mg/kg dival-L-dC)
	dival-L-dC->	mono-val-L-dC—>	L-dC->->	L-dU
Cmax	1,39 μΜ	3,23 μΜ	24,6 μΜ	0,88 μΜ
Orálně (10 mg/kg dival-L-dC)
	val-L-dC->	mono-val-L-dC->	L-dC->-+	L-dU
Cmax	nedetekováno	0,11 μΜ	8,26 μΜ	0,66 μΜ

• 9 » * 4 » · · « · <

• * · « · «

Příklad 25:

····

- 110• ···· · « • » · »··· « 4

Orální biodostupnost L-dC cestou dival-L-dC u opice (cynomologus monkey)

Tři nenaivní opičí samci cynomologus (macaca fascicularis) obdrželi orálně 10 mg/kg dival-L-dC, léčivo značené stopovým množstvím [3H] (250 μϋί) a rozpuštěné ve sterilním 0,9% roztoku soli. Vzorky krve byly odebrány do heparinizovaných zkumavek před dávkou (~18 hodin) a 0,25, 0,50, 1, 2, 3, 4, 6, 8 a 24 hodin po dávce. Vzorky moči byly odebrány v časech 0-2, 2-4, 4-8, 8-12 a potom po 12. hodinových intervalech během 336 hodin po dávce. Léčivo bylo kvantifikováno v plazmě a v moči za použití anylýzy HPLC. Po podávání dival-L-dC byl nemodelovou matematickou metodou analyzován časový průběh koncentrace L-dC v plazmě a oblast pod křivkou časkoncentrace (AUC) odvozen lineárním trapezoidálním (lichoběžníkovým) pravidlem. Dival-L-dC se po orálním podání rychle absorboval a převedl na LdC. Radiochromatografické vysokotlaké kapalinové chromatografické (HPLC) analýzy vzorků plazmy potvrdily, že hlavní podílem odstraněné radioaktivity byl L-dC. Dival-L-dC byl detekován pouze u jednoho zvířete 15 minut po dávce při koncentraci 0,035 μΜ. Částečně deesterifikovaná forma dival-L-dC, P-L-2'-deoxycytidin-5'-valin ester, nebyl detekován v plazmě nebo moči. Přibližně 26 % podáváné orální dávky bylo odstraněno do moči do 8 hodin. Po 72 hodinách bylo odstraněno 31 %. L-dC představoval hlavní podíl (~89 %) léčiva vyloučeného do moči. Ledvinové vylučování L-dU bylo malé, představovalo přibližně 10 % odstraněné dávky. Žádný dival-L-dC a jeho částečně deesterifikovaná forma a žádné jiné metabolity nebyly detekovány.

Celkový farmakokinetický profil byl srovnatelný s profilem stanoveným ve farmakokinetické studii, protože představoval podobné poměry C_max k AUC. Nízké hladiny L-dU byly detekovány v plazmě u dvou ze tří zvířat s průměrnou hodnotou C_max 0,33 μΜ. Nebyl detekován žádný L-dU v plazmě třetího zvířete.

• · • » · · · · • ·····* · ·

-111 Hladina L-dU byla na nebo pod kvantitativní mezí, zamezující farmakokinetickým analýzám.

Příklad 26:

Metabolizmus dival-L-dC in vitro

Byly provedeny studie pro stanovení stability a proteinové vazby dival-l-dC a jeho deesterifikovaných metabolitů v lidské plazmě. Dival-L-dC se inkuboval v lidské plazmě při teplotě 37 °C a vzorky se analyzovaly v různých časových bodech až do 24 hodin (obrázek 13). Žádný dival-L-dC nabyl detekovatelný 24 hodin s celkovou konverzí na L-dC. Dva další metabolity (β-Ι_-2'deoxycytidin-5'-valin ester a β-L-2'-deoxycytidin-valin ester) byly také zaznamenány. Přechodná povaha těchto metabolitů znamená, že jsou meziprodukty při konverzi dival-L-dC na L-dC. Poločas života in vitro dival-LdC v lidské plazmě při teplotě 37 °C byl stanoven přibližně na 39 minut.

Vliv proteinové vazby lidské plazmy na volné hladiny dival-L-dC a L-dC byl také zjištěn za použití metody ultrafiltrace. Plazmatická proteinová vazba dival-L-dC byla 13,3 % ± 2,6 %. Vazba L-dC na plazmatické proteiny byla

19,7 % ± 5,9. Studie ukazuje, že vliv proteinové vazby lidské plazmy na divalL-dC a L-dC je minimální a dokazuje, že se neočekávají (anticipují) vzájemné reakce léčiva, které způsobují posun vazebného místa.

Příklad 27:

Metabolická aktivace a intracelulární profil L-dC

Celulární metabolizmus L-dC byl zkoumán za použití buněk HepG2 a lidských primárních hepatocytů. Analýzy vysokotlaké kapalinové chromatografie (HPLC) ukazují, že L-dC byl extenzivně fosforylován v hepatocytech. Predominantním metabolitem v buňkách HepG2, vystavených 10 μΜ L-dC během 24 hodin, byl L-dC-TP, který dosáhl hodnoty 72,4 ± 1,8 μΜ (viz tabulka 23). V primárních lidských hepatocytech byla koncentrace L-dC-TP 24 hodin • ·

-11290,1 ± 37 μΜ, podobná k hladině fosforylace v buňkách HepG2. Vystavení hepatocytů L-dC vedlo k aktivaci sekundárního 5'-trifosfátového derivátu, L-dU-TP. V buňkách HeppG2, vystavených 10 μΜ L-dC, dosáhla hladina L-dU-TP 18,2 μΜ (43,5 pM v primárních lidských hepatocytech) 24 hodin. V primárních hepatocytech krysy a opice byl rozsah fosforylace L-dC mírně nižší.

Tabulka 23 Aktivace L-dC (10 μΜ) v hepatocytech

Metabolit (10 μΜ)
Buňky³	n	L-dC-MP	L-dU-MP	L-dC-DP	L-dC-DPcholin	L-dU-DP	L-dC-TP	L-dU-TP
HepG2	3	23,3±0,86	6,7±0,41	10,2±0,08	25,6±0,08	2,69±0,45	72,4±1,8	1 8,2±1,0
Lidské primární hepatocyty	3	27,6±1 5	5,7±2,4	7,19±2,3	15,8±1,8	3,93±1,6	90,1 ±37	43,5±27
Opičí primární hepatocyty	1	11,2	2,54	7,66	10,4	3,11	39,3	21,9
Krysí primární hepatocyty	3	5,09±2,1	3,53±0,97	1,52±0,38	8,82±3,1	7,90±1,4	14,2±1,4	46,9±5,2

(a) Buňky byly inkubovány 24 hodin [³H]-L-dC, specifická aktivita:

Stanovení HepG2 = 0,5 Ci/mmol; Stanovení hepatocytů člověka, opice a krysy =1,0 Ci/mmol.

Navíc k fosforylováným derivátům L-dC a L-dU byla zaznamenána tvorba βL-2'-deoxyliponukleotidového metabolitu. V buňkách HepG2 a v kulturách primárního hepatocytů vystavených 10 μΜ L-dC 24 hodin, byl detekován 3-L3'-deoxycytidin-5'-difosfocholin (L-dC-DP) při koncentraci 25,6 μΜ (rozmezí

25,6 - 25,7 μΜ) a nebo 12,3 μΜ (rozmezí 8,82 - 15,8 μΜ).

Metabolický profil, získaný po 24-hodinové expozici buněk HepG2 10 μΜ [3H]L-dC je zobrazen na obrázku 14. Zřejmý poločas života L-dC-TP byl 15,5 ± • ·

-113• · · ·

0,34 hodin, který koreloval s prodlouženou antivirovou aktivitou po ústupu léčiva v experimentech opět vázaného viru. Fosforylační model detekovaný v primárních lidských hepatocytech byl kvalitativně a kvantitativně podobný modelu, získaného při použití buněk HepG2 (obrázek 15).

Příklad 28:

Celulární kinázy asociované s metabolickou aktivací

D-Deoxycytidin (dCyd) je přírodní substrát cytozolové dCyd kinázy (dCK) a mitochondrické thymidinové kinázy (TK2) pro konverzi na dCyd-5'-monofosfát (dCMP). Cytozolová thymidinová kináza (TK1) a TK2 používá D-thymidin (Thd) jako přírodní substrát pro konverzi na Thd-5'-monofosfát (TMP). Celulární kináza The, zahrnutá do počáteční fosforylace L-dC, byla identifikovaná v kompetičních studiích za použití L-dC a přírodních endogenních Thd a dCyd. Intracelulární fosforylace L-dC se snížila v závislosti na dávce pomocí dCyd, ale nikoliv Thd. Změna v intracelulární fosforylaci L-dC byla podobná, když buňky HepG2 byla vystaveny Thd a dCyd nebo pouze dCyd. Inhibice fosforylace L-dC pouze přírodním deoxypyrimidinem, dCyd, dokázala, že dCK byla zahrnuta do fosforylace L-dC.

Úloha těchto pyrimídinových nukleosidových kinázových aktivit ve fosforylaci L-dC byla dále zjišťována v buněčných liniích s nedostatkem kinázy. Nastalo výrazné snížení množství fosforylovaných metabolitů L-dC v buňkách s nedostatkem dCK. Avšak nevýrazný rozdíl byl pozorován u fosforylace L-dC v deficientních buňkách TK1. Tato data byla shodná s kompetičními studiemi popsanými výše a znamenají, že dCK hraje důležitou roli ve fosforylaci L-dC na L-dC-MP.

Za použití cytozolových extraktů buněk HepG2 jako zdroje enzymu byly stálé kinetické stavy L-dC, Thd a fosforylace dCyd podobné hodnotám označeným jako Michaelis-mentenova konstanta (Km) a hodnotám maximální počáteční

-114rychlosti (Vmax) (L-dC: K_m = 5,75 mM a V_max = 1,12 mmol/min/mg proteinu; Thd: K_m = 4,06 mM a V_max = 1,26 nmol/min/mg proteinu; dCyd: K_m = 4,85 mM a V_max = 2,15 nmol/min/mg proteinu). Navíc účinnosti fosforylace L-dC, Thd a dCyd byly podobné, definované jejich odpovídajícími hodnotami poměrů Vmax/Km (0,19, 0,31 a nebo 0,44).

Navíc rozsah intracelulární fosforylace L-dC byl porovnán s přírodními endogenními substráty, Thd a dCyd v jaterních extraktech sviště. To bylo provedeno, aby se podpořilo antivirové testování u modelu infekce viru chronické hepatitidy B sviště. Fosforylace L-dC byla podobná fosforylaci endogenních substrátů. Dále hladina fosforylace L-dC byla srovnatelná s hladinou fosforylace L-dC a endogenních substrátů v jaterních extraktech člověka.

Příklad 29:

Antivirová aktivita proti hepadnaviru L-dC

Antivirová aktivita L-dC proti lidskému viru hepatitidy B byla měřena redukcí v intracelulární HBV DNA a replikační meziprodukty byly srovnány s neléčenými kontrolními buňkami v buněčné linii 2.2.15 hepatomu s expresí HBV (viz tabulka 24). Srovnávací testování antivirové aktivity L-dC za použití panelu ribonukleové kyseliny (RNA) a DNA virů bylo provedeno pomocí NIH Antiviral Research and Antimicrobial Chemistry Program.

L-dC neinhiboval replikaci kteréhokoliv viru jiného než hepadnaviry (HBV, DHBV). L-dC měl schopnou protivirovou aktivitu proti replikaci HBV in vitro, snižující extracelulární produkci DNA HBV s hodnotou EC₅o 0,24 μΜ (EC₉₀1,06 μΜ). L-dC také redukoval intracelulární replikační meziprodukty DNA HBV (Rf) s hodnotou EC₅₀ 0,5 μΜ. Dále L-dC produkoval inhibici syntézy DNA urinálního viru hepatitidy B (DHBV) v primárních kulturách urinálního hepatocytu (PDH) v závislosti na dávce s hodnotou EC₅₀ 0,87 μΜ.

• · · · » • · · ·

-115Tabulka 24 Antivirová aktivita, selektivita a cytotoxicita L-dC in vitro

Virus (buněčná linie)	EC_SO ^b (μΜ)	CCso^c (μΜ)
HBV (2.2.15)	0,24 ± 0,08	> 2000
DHBV (PDH)	0,87	nd^d
HIV-1 (PBMC)	> 200	> 200
HSV-1 (HFF)^e	> 100	> 100
HSV-2 (HFF)^e	> 100	> 100
VZV (HFF)^e	18,6	> 100
EBV (Daudi)^e	> 50	> 50
HCMV (HFF)^e	> 100	> 100
Chřipka A/H1N1 (MDCK)	> 100	> 100
Chřipka A/H3N2 (MDCK)	> 100	> 100
Chřipka B (MDCK)	> 100	> 100
Spalničky (CV-1)	> 100	> 100
Parachřipka typu 3 (MA-104)	> 100	> 100
Rhinovirus typu 5 (KB)	> 100	> 100
RSV typu A (MA-104)	> 100	> 100

a. PDH, primární urinální hepatocyty; PBMC, periferní krevní mononukleární buňky; HFF, fibroblast lidské předkožky; Daudi, Burkittova buňka B lymfomu; MDCK epiteloté buňky ledviny psa; CV-I, buňky fibroblastů ledviny africké zelené opice; KB, lidský nosohltanový karcinom; MA-i 04, epiteiové buňky ledviny opice rhesus.

b. EC₅₀ = 50% účinná koncentrace.

c. CC50 = 50% cytotoxické koncentrace.

• · · · · · • * • ·»· · ·· ·· · ·

-116d. nd = není stanoveno

e. Výsledek uveden v pg/ml spíše než v μΜ.

Netoxicita byla detekována při maximálních koncentracích L-dC testovaných v kterékoliv z buněčných lininích nebo primárních buněčných typech používaných na podporu replikace různých DNA a RNA virů. Netoxicita byla zřejmá v lidských PBMC, HFF nebo jiných buněčných typech savčího původu.

Příklad 30:

Antivirová aktivita L-dC u svišťů - 28 dní

Svišti chronicky infikované WHV jsou široce akceptované jako model infekce HBV a dokázaly, že jsou vhodné pro vyhodnocení prostředků proti HBV. Bylo dokázáno, že je pozitivním předpovídateiem antivirové aktivity terapií chronické infekce HBV, a sloužil jako senzitivní systém pro zhodnocení bezpečnosti nukleosidů a jejich analogů.

L-dC byl podáván orálně svišťům jednou denně 0,01 až 10 mg/kg/den 28 dní. Hladiny WHV DNA v séru během 28 dnů léčby léčivem a následných 56 dnů po léčbě byly stanoveny hybridizaci dot-blot DNA (detekční limit přibližně 107 genomových ekvivalentů (seq)/ml séra) a kvantitativní PCR (detekční limit 300 geq/ml séra) (1). Replikace WHV DNA byla výrazně inhibována během prvních několika dnů léčby a byla udržována během léčebné fáze. Jednodenní orální dávka L-dC produkovala silný antivirový účinek, který byl závislý na dávce, jak je stanoveno za použití stanovení hybridizace dot-blot DNA (obrázek 16).

Obrázek 17 znamená antivirovou aktivitu L-dC pro jednotlivá zvířata léčená mg/kg/den 28 dní na modelu infekce chronické hepatitidy B sviště. Zvláště u skupiny léčené 10 mg/kg/den L-dC od 14 do 28 dne virové zatížení pokleslo o 2-6 log vzhledem k základně, měřeno kvantitativním měřením PCR. Po • · ústupu léčiva mezi 1 a 2 týdnem se opět dosáhlo hladiny virové reakce před léčbou.

U skupiny léčené lamivudinem (10 mg/kg/den, orálně) se virové zatížení snížilo přibližně o 0,5 log až 1,0 log (geq/ml; data neuvedena), což je shodné s předchozími studiemi za použití podobných koncentrací lamivudinu, který je analogem cytidin nukleosidu (30).

Příklad 31:

Virová reakce u buněk léčených L-dC

Virová reakce u buněk 2.2.15 léčených L-dC nastala po ústupu léčiva. Replikace HBV se vrátila na 50% hladiny před léčbou 18 dní po léčbě. Kinetiky virové reakce po léčbě L-dC dokázaly, že výrazný antivirový účinek pokračoval po ústupu léčiva, který byl shodný s intracelulární poločasem LdC-TP (15,5 hodin u buněk HepG2).

Příklad 32:

Antivirová aktivita L-dC proti HBV rezistení na léčivo

V řízených klinických studiích lamivudinu (100 mg jednou denně), podávaného pacientům infikovaných HBV, byla prevalence YMDD-mutantního HBV 14 až 32 % po jednom roce léčby a 58 % po dvou až třech letech léčby (18-20). Mutantní virus byl spojen s důkazem tlumené léčebné reakce týkající se pacientů léčených lamivudinem bez mutací YMDD.

Genotypové analýzy virových izolátů se získaly od pacientů, kteří prokázali důkaz obnovené replikace HNV, zatímco přijímání lamivudinu dokazuje, že snížení senzitivity HBV na lamivudin je spojeno s mutacemi, které jsou výsledkem substituce methioninu za valin nebo isoleucin v mutaci YMDD katalytické domény HBV polymerázy (poloha 552) a substituce leucinu za methionin v poloze 528.

-118Rekombinanty HBV, obsahující mutaci YMDD, jsou rezistentní na lamivudin a slabě méně schopné replikace než HBV divokého typu in vitro (21). Trifosfátový derivát L-dC bude testován proti DNA polymeráze divokého a mutantního typu HBV, aby se porovnaly hodnoty IC₅₀. Navíc bude provedeno antivirové testování L-dC proti izolátům HBV rezistentním na lamivudin a rekombinantním virům s mutacemi v polohách 552 a 528.

Navíc se předpokládá výběr mutantů HBV rezistentních na léčivo L-dC in vivo během chronické léčby svistů infikovaných WHV. Relevance výběru mutantů rezistentních na léčivo v modelu sviště in vivo je neurčitá, protože spektrum mutantů rezistentních na lamivudin u sviště neodpovídá mutantům, které se nacházely u pacientů infikovaných HBV (20-22). Součást této dlouhotrvající studie 12 až 24 měsíců) by mohla poskytnout informaci týkající se eliminace kovalentně uzavřené cirkulátní (ccc) DNA HBV z infikovaných hepatocytů. V součané době není možné pro výběr mutací rezistentních na léčivo použít model DHBV in vitro, protože primární močové hepatocyty, používané v tomto modelu, nemohou být trvalé v buněčné kultuře pro dost dlouhé periody, požadované pro výběr virů rezistentních na léčivo.

Příklad 33:

Kombinace antivirové aktivity a cytotoxicity L-dT + L-dC

Aktivita anti-HBV a cytotoxicita kombinace L-dT a L-dC v téměř ekvimolárních poměrech byly testovány u buněk 2.2.15 a shledány synergickými při poměrech 1:1, 1:3 a 3:1 (viz tabulka 25).

-119-

Tabulka 25 Kombinace antivirové aktivity L-dT + L-dC u buněk infikovaných HBV

Léčba	CC₅₀ ^a (μΜ)	EC₉₀ ^b (μΜ)	S.l.^c (CC50/EC90)	CalcuSyn analýza⁰(při EC₉₀)
3TC	> 1000	0,180 ± 0,007	> 5,000
L-dT	3022	1,2 ± 0,1	2,518	-
L-dC	3000 ± 96	1,1 ± 0,1	2,727	-
L-dT + L-dC (1:1)	> 1500	0,297 ± 0,016	> 5,051	synergická
L-dT + L-dC (1:3)	1331 ± 67	0,333 ± 0,023	3,997	synergická
L-dT + L-dC (3:1)	2957 ± 88	0,409 ± 0,079	7,230	synergická
L-dT + 3TC (1:1)	> 1000	0,089 ± 0,004	> 11,000	synergická
L-dT + 3TC (3:1)	1000	0,068 ± 0,004	14,706	synergická
L-dT + 3TC (10:1)	> 1000	0,191 ± 0,017	> 5,000	synergická
L-dC + 3TC (1:1)	> 1000	0,200 ± 0,013	> 5,000	synergická (aditivní při vysokých koncentracích)
L-dC + 3TC (3:1)	> 1000	0,216 ± 0,013	> 5,000	synergická
L-dC + 3TC (10:1)	> 1000	0,084 ± 0,006	> 11,000	synergická

a CC₅o = koncentrace léčiva, při které byla pozorována 50% inhibice absorpce neutrálního červeného barviva (ve srovnání s neléčenými kulturami) b EC90 = koncentrace léčiva, při které byla pozorováno 10-násobné snížení hladin DNA HBV (ve srovnání s neléčenými kulturami)

-120c EC₅o = hodnoty používané pro výpočet indexu selektivity (S.I.), protože redukce hladin DNA HBV, které jsou menší než trojnásobné, nejsou v tomto systému stanovení obecně statisticky významné d Analýzy účinosti kombinované lékové léčby programem zhonocení kombinací CalcuSyn (Biosoft, Inc.).

Příklad 34:

Stanovení toxicity L-dC pro progenitorní buňky kostní dřeně člověka

Účinky potlačující funkci kostní dřeně (myelosupresivní účinky) určitých nukleosidových analogů ukázaly na potřebu testovat potenciální účinky na růst progenitorních buněk kostní dřeně člověka v klonogenních testech. Zvláště anémie a neutropénie jsou nejběžnějšími klinickýcmi toxicitami, týkající se léčiva, spojené s léčivem proti HIV zidovudinem (ZDV). Tato toxicita byla modelována v testu in vitro, který používá buňky kostní dřeně získané ze zdravých dobrovolníků (Sommadossi J-P, Carlisle R. „Toxicity of 3'-azido-3'-deoxythymidin and 9-(1,3-dihydroxy-2-propoxymethyl)guanin for normál human hematopoietic progenitor celíš in vitro“ Antimicrob Agents Chemother 1987, 31(3), 452-454). ZDV se pojevil tím, že přímo inhibuje aktivitu lidského granulocytu-makrofágu tvořící kolonu (CFU-GM) a erythroidu v otevřené formě (erythroid busrt-forming)(BFU-E) při klinicky relevantních koncentracích 1-2 μΜ. Za použití klonogenních testů lidské kostní dřeně ZDV, jako pozitivní kontroly, a lamivudinem, jako negativní kontroly, L-dC měl hodnotu IC50 u CFU-GM a BFU-E > 10 μΜ (viz tabulka 26).

- 121 Tabulka 26 Toxicita L-dC kostní dřeně v progenitorních buňkách granulocytu makrofágu a v buňkách prekurzoru erythrocytů

Sloučenina	CFU-GM³ IC50 (μΜ)	BFU-E³ IC50 (μΜ)
L-dC	> 10	> 10
Lamivudin	> 10	> 10
ZDV	1,8	0,7

a Hodnoty představují výsledky tří nezávislých experimentů provedených ve třech vyhotoveních.

Příklad 35:

Test mitochondriální toxicity L-dC

Antivirové nukleosidové analogy schválené pro léčbu HIV, jako je ZDV, stavudin (d4T), didanosin (ddl) a zalcitabin (ddC) byly také spojeny s klinický omezujícími opožděnými toxicitami, jako je periferní neuropatie, myopatie a pankreatitída (8-11). Tyto klinicky nepříznivé jevy byly přisouzeny inhibici mitochondriální funkci snížením obsahu mitochondriální DNA (mtDNA) a začleněním nukleosidového analogu do mtDNA. Navíc, zvláště nukleosidový analog fialuridin (FIAU), způsobil přímou mitochondriální toxicitou hepatickou poruchu, pankreatitidu, neuropatii, myopatii a laktickou acidózu. Zvýšení produkce kyseliny mléčné spojené s léčivem lze považovat za známku poškozené mitochondriální funkce nebo oxidativní fosforylace.

Pro stanovení potenciálu L-dC produkovat mitochondriální toxicitu bylo provedeno několik studií in vitro za použití buněčné linie HepG2 lidského heparomu. Tyto studie zahrnovaly analýzy produkce kyseliny mléčné, obsahu mtDNA a stanovení změn morfologie (např. ztráta výběžků, bobtnání a • ·

-122rozpuštění matrice a tvorba lipidových kapiček) mitochondriální ultrastruktury.

Účinky L-dC na mitochondrie jsou uvedeny v tabulce 27.

Nebyly pozorovány žádné rozdíly v hladinách kyseliny mléčné produkované v buňkách souatavně léčených L-dC a u neléčených buněk. Produkce kyseliny mléčné v buňkách léčených ZDV a FIAU se zvýšila o 100 % ve srovnání s kontrolním vehikulem. Vystavení buněk hepG2 14 dní L-dC při koncentracích až 10 μΜ nemělo účinek na obsah mitochodriální DNA ve srovnání s 87% snížením v buňkách léčených ddC. Po 14-dnech vystavení 10 μΜ L-dC byla ultrastruktura buněk HepG2 a zvláště mitochodrie zkoumána transmisní elektronovou mikroskopií. Nebyly detekovány žádné zjistitelné změny v buněčné architektuře nebo mitochondriální morfologii. Velikost a organizace mitochodriálních výběžků byly normální. Buňky léčené ZDV prokazovaly typicky vystouplé mitochondrie bez výběžků. Mitochondriální morfologie byla také abnormální u buněk léčených ddC a FIAU.

Tabulka 27 Účinek L-dC na proliferaci hepatocytů, mitochondriální funkci a morfologii u buněk HepG2

Sloučenina	CC₅₀ ^a (μΜ)	Konc. (μΜ)	% kontroly L-laktát mtDNA	Tvorba lipidových kapiček	Mitochondriální morfologie
Kontrola	-	-	100	100	negativní	normální
L-dC	>2000	10	101 ± 2	107 ± 8	negativní	normální
FIAU	4	10	203	86	pozitivní	abnormální
ZDV	14	50	239±34	119	pozitivní	abnormální
ddC	20	1	95 ± 4,4	13	negativní	abnormální

a

CC50 po 14 dnech léčby • 9

-123Příklad 36 Test toxicity L-dC na lidské DNA polymerázy a, β a γ

Nukleosidy a nukleosidová analoga se obvykle metabolizují v buňkách na své deriváty TP. Celulární DNA polymerázy jsou soustavně odpovědné za normální nukleární a mitochondriální DNA syntézu a obnovu. Protože metabolity TP jsou potenciální substráty pro DNA polymerázy, vznikly studie pro stanovení, zda L-dC-TP inhiboval lidské DNA polymerázy.

Nukleosidový analog 3'-amino-3'-deoxythymidin (AMT) TP inhiboval lidskou DNA polymerázu α z 30 % při koncentraci 10 μΜ. Lidské DNA polymerázy β a γ byly inhibovány ddC-TP z 50 % (5 μΜ) a nebo z 35 % (2,5 μΜ). L-dC-TP a L-dU-TP nebyly inhibitory lidských DNA polymeráz α, β a γ až do koncentrací 100 μΜ (tabulka 28). Tyto výsledky prokázaly, že TP L-dC a L-dU mají nízkou afinitu k těmto nuklárním a mitochondriálním lidským DNA polymerázám, což je v souladu s příznivým bezpečnostním profilem L-dC pozorovaným in vitro a in vivo.

Tabulka 28 Účinek L-dC-TP na DNA polymerázu viru hepatitidy a lidské DNA polymerázy α, β a γ

IC₅₀ (μΜ)
Substrát³	Virová DNA pol^b	Lidská DNA pol a^c	Lidská DNA pol β°	Lidská DNA pol y^c
L-dC-TP	1,82 ± 0,23	> 100	> 100	> 100
L-dU-TP	5,26 ± 2,4	> 100	> 100	> 100
Lamivudin-TP	0,50 ± 0,1	> 5	1,2	0,01
L-FMAU-TP^d	0,15 ± 0,05	> 50	> 50	> 50
L-ddA-TP	2,0 ± 0,3	> 100	> 100	> 100

-124-

a Každý soubor dat představuje aritmetickou střední hodnotu a, pokud se uvádí, standardní odchylku tří nezávislých experimentů b WHV DNA polymeráza.

c 3'-Amino-3'-deoxythymidin TP inhiboval pol a 30 % při 10 μΜ; ddC-TP inhiboval pol β 50 % při 5 mM a pol γ 35 % při 3,5 μΜ.

d Data lidské DNA polymerázy pro lamivudin-TP a L-FMAU-TP od Chang et al. (13) a nebo Yao, et al. (14).

Příklad 37:

Test toxicity dival-L-dC u krys

Byla stanovena toxicita spojená s jednou orální dávkou dival-L-dC u krys. Bylo zkoumáno celkem 40 zvířat (krysy Sprague-Dawley, stáří šest až osm týdnů); všech deset náhodně vybraných zvířat (pět samic a pět samců) obdrželo nárazovou orální dávku dival-L-dC jednu tří dávek zvolených z rozmezí dávek podle studie (500, 100 nebo 2000 mg/kg) nebo kontrolní dávku. Zvířata byla sledována 15 dní. Pozorování skomírání a úmrtí v kleci bylo dokumentováno dvakrát denně. Klinická pozorování a tělesná hmotnost byly dokumentovány jednou denně ve dnech 1, 8, 14 a 15. Také v 15. dni byly odebrány vzorky krve pro hematologii a chemická složení séra. Po kompletním vyhodnocení 15. dne byla všechna zvířata euthanizována a podrobena úplné nekroskopii, která zahrnovala makroskopickou examinaci vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Byly dokumentovány tělesná hmotnost a hmotnost vybraného orgánu a poměry hmotností orgánu k tělu a k mozku.

Během studie nebyly pozorovány žádné zřetelné projevy toxicity a nebyly pozorovány žádné účinky na tělesnou hmotnost, hmotnost orgánu nebo klinické patologické parametry, týkající se léčby. Nebyly zaznamenány žádné abnormality v hematologii nebo chemickém složení séra, týkající se léčby. Dále nebyla pozorováná žádná makroskopická poranění při pitvě, týkající se • · • · · · n c ·······« ···

-125- .:.. .· ·..··..· léčby. Na základě výsledků této studie byla NOAEL pro dival-L-dC po jedné orální dávce u krysy 200 mg/kg.

Příklad 38:

Test toxicity dival-L-dC u opic

Byla stanovena potenciální toxicita pěti zvyšovaných dávek dival-L-dC u opic cynomologus. Všechna čtyři zvířata (dva samci a dvě samice) obdržela celkem pět orálních dávek dival-L-dC, jednu z každé dávky (20, 100, 500, 1000 a 2000 mg/kg) ve dnech 1, 4, 7, 10 a nebo 14.

Dvakrát denně byla dokumentována sledování skomírání a úmrtí z klece. Klinická pozorováni byla dokumentována denně. Byly odebrány vzorky krve pro hematologii a chemické složení séra a měřena tělesná hmotnost před léčbou ve dnech 1, 4, 7, 10 a 14 a před pitvou ve dni 17. Po úplném zhodnocení po dni 17 byla všechna zvířata euthanizována a byla provedena kompletní pitva, včetně makroskopické examinace a úplného odběru tkáně.

Nebyly pozorovány žádné abnormality, týkající se léčby. Po první dávce v prvním dni, každé zvíře zaznamenalo ztrátu tělesné hmotnosti přibližně o 0,6 kg. Od čtvrtého dne během studie si všechna zvířata udržovala tělesnou hmotnost.

V jednotlivých hematologických profilech byla pozorována následující pozorování. V 17. dni byly hodnoty erythrocytů (RBC), hemoglobinu (HGB) a hematokrytu (HCT) nižší (přibližně o 15 % až 27 %), kumulativně u všech čtyř zvířat ve srovnání s hodnotami získanými v prvním dni. S výjimkou zvířete č. 1001 (samec) byly v každém časovém bodu změny v parametrech < 10 % z výše uvedené hodnoty. U zvířete č. 1001 hodnoty RBC, HGB a HTC dne 4 klesly přibližně o 18 % ve srovnání s hodnotami dne 1; následně byly změny u tohoto zvířete <± 9 % celkově. Příčina této počáteční změny je neznámá a toxikologický význam je neurčitý. V den 1 se počet bílých krvinek (WBC)

-126• · • * · • · · · • · · znatelně zvýšil u zvířete č. 1101 (samice, 36,3 x 10³ buněk/μΙ), ale snížil na téměř 55 % v den 4. Absolutní hodnota polymorfonukleárních leukocytů (APLY) a procentuální hodnota polymofonukleárních leukocytů (PLY) se také snížila (73 % a nebo 40 %) v den 4 ze zvýšených hladin dne 1. Změny byly variabilní ve zbývající části studie. Toxikologická relevance je neurčitá.

Následující pozorování byla zaznamenána u jednotlivých profilů chemického složení. V den 17 klesly hodnoty dusíku močoviny v krvi (BUN) (o ~43 %, kumulativně) u všech čtyřech opic ve srovnání s hodnotami ke dni 1. Tyto kumulativní změny vycházejí z prozatímních variací -39 % až + 46 %. Tyto změny byly shodné u všech opic ve studii; avšak toxikologická relevance je neurčitá.

Na základě výsledků této studie NOAEL pro dival-L-dC po jedné orální dávce žaludeční sondou u opice byla 2000 mg/kg.

Příklad 39:

28. denní test toxicity L-dC u svišťů

Model chronické infekce hepatitidy B sviště měl význam pro předklinické toxikologické vyhodnocení nukleosidových analogů. Tento model identifikoval zpožděnou rozdělenou hepatocelulární toxicitu vyvolanou FIAU u lidí, která se neobjevuje v předklinickém vyhodnocení u hlodavců nebo primátů. Toxicita vyvolaná FIAU a pozorovaná u svišťů, zahrnující výraznou ztrátu hmotnosti, zhoubné a hepatocelulární poškození patrné na jaterní biopsii, byla identifikována na začátku šestého až osmého týdne od začátku léčby a byla podobná toxicitě, pozorované u pacientů infikovaných HBV a léčených FIAU.

Byla stanovena antivirová aktivita a bezpečnost L-dC a virová reakce po léčbě u svišťů infikovaných virovou hepatitidou sviště (WHV). Samci a samice sviště byly infikovány jako novorozenci subkutánní inokulací zředěného séra nosičů

WHV a byly všichni chronickými nosiči WHV. Zvířata (stáří 16 až 18 měsíců) • · • · ♦ ·

-127byly rozděleny do srovnatelných skupin na základě tělesné hmotnosti, hladin g-glutamyl transferázy (GGT), pohlaví, a kvantitativní anylýzou dot blot se měřila koncentrace DNA WHV séra (> 10¹¹ ekvivalentů genomu/ml séra).

Všechna tři zvířata obdržela L-dC o dávkách 0,01, 0,1, 1,0 nebo 10,0 mg/kg/den orálně 28 dní. Navíc tři zvířata obdržela lamuvidin 10 mg/kg/den orálně 28 dní. Čtyři zvířata obdržela kontrolní vehikulum stejným způsobem. Všechna zvířata byla monitorována na reakci WHV dalších 56 dní po dávce. Vzorky krve hladin DNA WHV byly získány ve dnech -7, 0, 1,3, 7, 14, 21 a 28 a hladiny DNA WHV byly také získány po léčbě ve dnech 1, 3, 7, 14, 28 a 56. Hladiny DNA WHV byly detekovány technikou řetězové reakce polymerázy (PCR). Tělesné hmotnosti byly získány současně a dávkování léčiva bylo nastaveno podobně. Pokud byl pozorován klinický důkaz toxicity, byly provedeny klinické biochemické a hematologické testy. Vyšetření po úmrtí, zahrnující histologické zhodnocení tkání, bylo provedeno na zvířeti, které zemřelo během studie.

Během čtyřtýdenní léčby nebo v době osm měsíců po léčbě nebyla pozorována žádná toxicita. Dále se neprojevila žádná ztráta hmotnosti v kterékoliv skupině léčené L-dC ve srovnání s kontrolními zvířaty (obrázek 18). Všechna zvířata získala hmotnost podobným způsobem jako kontrolní zvířata během doby protokolu 84 dní. Jedno zvíře (#98051) ve skupině 0,1 mg/kg/d zahynulo osmého dne po ukončené léčbě. Vyšetření po úmrtí odhalilo velký hepatický karcinom (8x5x2) v levé laterálním laloku jater a úmrtí bylo přisouzeno hepatickému zhoubnému nádoru. Hepatocelulární neoplazmy jsou v tomto modelu vidět brzy po devíti měsících věku a byly příčinou smrti brzy po 15 měsících věku. Úmrtí u tohoto zvířete přisouzeno hepatocelulárnímu karcinomu, který je očekávanou součástí přirozeného vývoje infekce WHV, a netýká se léčby L-dC, protože neexistuje žádná indikace, že toxicita léčiva byla faktorem úmrtí zvířete.

« · • ♦ · ·

-128Příklad 40 Test dvanáctitýdenní toxicity L-dC u svišťů

Byla stanovena antivirová aktivita a bezpečnost L-dC u svišťů. V této studii dostávalo každé ze čtyř zvířat orálně 1,0 mg/kg/den L-dC nebo kontrolní vehikulum 12 týdnů. Další čtyři zvířata dostávala L-dC spolu s jiným nukleosidovým analogem, L-dT. Zvířata byla rozdělena do srovnatelných skupin podle pohlaví, hmotnosti a hladin WHV DNA a GGT v séru před léčbou.

WHV DNA a tělesná hmotnost byly měřeny ve dnech 0, 1,3, 7, 14, 21, 28, 42, 56 a 84 a také po léčbě ve dnech 7, 14, 21, 28, 42, 56, 70 a 84. Hladiny WHV DNA byly stanoveny kvantitativní PCR. Vhodné vzorky pro hematologii, chemická složení séra, sérologii WHV a jaterní biopsii byly odebrány před léčbou a ke dni 84. Hladiny léčiva v plazmě byly stanoveny ze vzorků odebraných 2,5 hodin po dávce ve dnech 0, 14 a 84.

L-dC (1 mg/kg/den, orálně) byl dobře snášen a neprokázal žádnou toxicitu týkající se léčiva během 12 týdnů léčby nebo během 12 týdnů po léčbě. WHV virémie u chronicky infikovaných svišťů léčených 12 týdnů L-dC (1 mg/kg/den, orálně) se snížila o 0,5 až 1 Iog10 na konci 12. měsíční léčby, podobné reakci ve 28. denní studii při této dávce. Tato studie zahrnovala další skupiny léčení L-dT (1 mg/kg/den) a L-dC (1 mg/kg/den) plus L-dT (1 mg/kg/den podávané v kombinaci. Tato kombinace L-dC a L-dT snížila virovou zátěž na mez detekce, podobně jako při léčbě L-dC nebo L-dT 10 mg/kg/den ve 28. denní studii. Nebyl žádný rozdíl v hmotnosti mezi zvířaty ve skupinách léčených L-dC a kontrolní skupinou (viz obrázek 19). Jedno zvíře v kontrolní skupině zemřelo v týdnu 8; pitva odhalila, že příčinou smrti byla aortální degenerace a protržení. Avšak neobvyklé spontánní protržení vzestupné aorty bylo pozorováno v minulosti u obou svišťů, neinfikovaného a infikovaného WHV. Předchozí zkušenost ukázala, že tento mírný pokles hmotnosti byl způsoben • · *

- 129dosažením hybernačního cyklu (B. Tennant, DVM; Marmotech, Inc.) Chemická složení séra a hematologie všech zvířat byly v normálním rozmezí před a po 12. týdnech léčby. Histomorfologie jaterní tkáně, vyhodnocená mikroskopicky, byla normální u všech skupin. Nebyla prokázána žádná změna tuku (microvesicular steatosis).

Příklad 41:

Toxikokinetiky dival-L-dC u opic cynomologus při opakované dávce

Byla stanovena potenciální toxicita a farmakokinetiky dival-L-dC po orálním podávání 25 dní opicím cynomologus. Osm zvířat (čtyři samci a čtyři samice) bylo náhodně vybráno a dostávali dival-LdC žaludeční sondou jednu ze tří dávek (500, 100 nebo 200 mg/kg) nebo kontrolní vehikulum jednou denně 25 dní (celkem N = 32). Pozorování skomírání a úmrtí v kleci bylo dokumentováno dvakrát denně a klinická pozorování jednou denně. Tělesné hmotnosti byly dokumentovány před léčbou ve dnech 1, 8, 15 a 25 a před pitvou ve dni

26. Konzumace potravin byla dokumentována denně a zpracována po týdenních intervalech jako denní průměr. Fyzikální a oftalmologická vyšetření a urinalýzy byly provedeny před léčbou a při pitvě. Po kompletním zhodnocení dne 26, byla včechna zvířata eutanizována a podrobena úplné pitvě, která zahrnovala makroskopická vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahů. Hmotnost těla a vybraného orgánu a poměry hmotností orgánu k tělu a k mozku byly také dokumentovány. Tkáň získaná úplnou pitvou byla zhodnocena histomorfologicky veterinárním patologem certifikovaným ministerstvem.

A. Tělesné hmotnosti

Všechna zvířata si buď udržela nebo zvýšila tělesnou hmotnost během studie, s výjimkou zvířete č. 2002 (500 mg/kg skupina) a 4001 a 4003 (2000 mg/kg skupina), která zaznamenaly ztátu hmotnosti o 0,1 kg ke dni 25 (ve srovnání « · · · tm· ke dni 1). Statisticky významné rozdíly mezi samci v kontrolní skupině a samci ve skupinách léčených dival-L-dC se nepovažují za toxikologicky relevantní, protože střední hodnota tělesné hmotnosti kontrolní skupiny zvířat před studuií byla o 0,13 - 0,25 kg větší než střední hodnota tělesných hmotností léčených skupin.

B. Konzumace krmivá

V průběhu studie si všechna zvířata udržela odpovídající konzumaci krmivá s výjmečnou variabilitou. Střední hodnota konzumace sušenek byla nižší než u kontrolních samců pro 500 mg/kg skupinu samců ve dnech 8/9, 15/16 a 16/17; 1000 mg/kg skupinu samců ve dnech 24/25; a 2000 mg/kg skupinu samců ve dnech 8/9, 15/16, 16/17, 20/21 a 23/24. Pouze rozdíl zaznamenaný u samic znamenal snížení konzumace krmivá u 2000 mg/kg skupiny samic ke dni 7/8. Tyto rozdíly nejsou považovány za toxikologicky relevantní.

C. Klinická patologie

Hematologie. První den před začátkem léčby nebyly žádné rozdíly mezi kontrolní a léčenými skupinami v žádném hematologickém parametru. Ke dni 26 bylo zaznamenáno velké množství statisticky významných rozdílů v indexu erythrocytů, zahrnující snížené množství červených krvinek (RBC) (všechny léčené samice), snížený hemoglonin (HGB) (všechny léčení samci) a snížený hematokryt (HCT) (všechny léčené skupiny, obě pohlaví). Samci také zaznamenali sníženou hodnotu RBC, ale rozdíly nebyly statisticky významné. Koncentrace hemoglobinu byla také nižší u léčených samic, ale nebyla statisticky významná. Vzhledem ke dni 1 se hodnoty RBC, HGB a HCT snížily ke dni 26 u kontrolní skupiny a samců a samic léčených dival-LdC. Avšak relativní snížení pozorované u kontrolních zvířat bylo nižší, než snížení zaznamenaná u zvířat léčených dival-L-dC. Tyto výsledky indikují klinicky relevantní nehemolytickou anémii; avšak jakýkoliv fenomén reakce na dávku »« » • · ♦ » flflflfl flfl » «· ·

- 131 byl minimální a histopatologické vyhodnocení prokazuje, že kostní dřeň zůstala odpovídající. Proto kterékoliv progresivní nebo permanentní účinky se považují za nepravděpodobné.

V počtu bílých krvinek byl absolutní pokles polymorfonuklárních leukocytů (APLY) (500 mg/kg a 1000 mg/kg skupiny samic a 200 mg/kg skupiny samců a samic), procentuální pokles polymorfonukleárních leukocytů (PLY) (1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny samic), a procentuální zvýšení lymfocytů (LYM) (2000 mg/kg skupiny samců a 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny samic).

Chemické složení séra. Střední hodnoty hladin fosfatázy alkylických kovů (ALK) u léčených samců byly významně nižší než střední hodnota ALK kontrolní skupiny v den 26. Střední hodnoty hladin globulinu (GLÓB) a vápníku (CAL) byly také zvýšené u 2000 mg/kg skupiny samců v den 26. Tyto změny nebyly považovány za klinicky relevantní. Střední hodnoty draslíku (K) byly větší u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců než u kontrolní skupiny a mohly by být vzhledem k pozorované nehemolytické anémii přítomny v těchto léčených skupinách. Nebyly žádné změny v kterémkoliv chemickém parametru séra u samic ve dne 26.

Rozbor moči. Střední hodnota pH moči mírně poklesla u 2000 mg/kg skupiny samců a 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny samic, ale rozdíly nebyly statisticky významné. Pozoruhodný a ve shodě s kyselostí moči byl nedostatek krystalů v moči u samců a samic při vysoké dávce.

D. Hmotnosti orgánů

Statisticky významné poklesy ve hmotnostech orgánů byly zaznamenány u plic (absolutní) u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců a relativně u brzlíku (brzlík:mozek) u 2000 mg/kg skupiny samců. Avšak tyto rozdíly nebyly považovány za toxikologicky relevantní.

·» ··*·

- 132• e · • « :

* » * • ·· · ·» ···*

E. Patologie

Makroskopická. Nebyly žádné makroskopické nálezy, které by se vztahovaly na podávání dival-L-dC. Všechny makroskopické nálezy byly typické a běžně přítomné jako nahodilé nálezy u nelidských primátů.

Mikroskopická. Brzlíková atrofie byla pouze mikroskopickým nálezem, který se interpretoval jako nález, který se nevztahuje k léčbě. Výskyt a vážnost brzlíkové atrofie se zvýšila u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců a samic, ale nepůsobila u 500 mg/kg skupinu zvířat. Avšak klinický význam brzlíkové atrofie byla interpretován jako neprůkazný. Vztah dávka-reakce byl slabý a na všechny 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny samců nepůsobil a brzlíková atrofie se typicky objevuje u starších primátů.

Toxikokinetiky. Krevní vzorky pro hematologii a chemická složení séra byly odebrány před léčbou v den 1 a před pitvou ve den 26. Krevní vzorky byly odebrány pro farmakokinetické analýzy v den 25 od každého zvířete v každém z následujících časech po dávkování: 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 12 a 24 hodin. Plazma byla připravena z krve a analyzována pro koncentrace dival-L-dC a tři metabolity: L-dC, L-dU a částečně deesterifikovanou formu dival-l-dC, β-Ι_-2'deoxycytidin-5'-valinester. Pouze L-dC a β-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester byly kvantifikovatelné. Střední hodnota dat koncentrace plazmy v čase pro 1000 a 2000 mg/kg skupinu se podrobily farmakokinetické analýze nerozdělené na části za použití WinNonline 1,5 (Model 200). Analýza 500 mg/kg skupiny je ve vývoji.

Koncentrace β-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru v plazmě ke dni 25 dosáhla maximálních hodnot (C_max) 1 hodinu (střední hodnota T_max) po orálním podávání dival-L-dC ve srovnání se střední hodnotou T_max 2-4 hodiny pro LdC. Avšak hodnoty C_max β-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru byly přibližně o 2 • · · · • · · ·

-133• · · · · · · • ······ · to to · • · · · · to · • · · · · ·· to to « řády velikosti nižší než pro L-dC. Po dosažení C_max koncentrace L-dC klesaly zřejmě biexponenciálně u každé skupiny. Střední hodnoty poločasů odhadované koncové fáze byly přibližně 4-5 hodin u samců a samic u obou skupin dávkování. Tyto odhady poločasů by se měly chápat jako minimální hodnoty, protože většina jednotlivých odhadů byla založena na datech 6 až 12 hodin po dávce, kdy koncové fáze nebyly zcela určeny. Střední hodnota koncentrací p-L-2’-deoxycytídin-5'-valinesteru také klesala po dosažení hodnoty C_max, ale koncové fáze nebyly adekvátně definované, aby bylo možno odhadnout poločas. Střední hodnoty C_max pro L-dC a p-L-2'-deoxycytidin-5'valinester byly podobné u samců a samic v každé skupině dávkování, s výjimkou 1000 mg/kg skupiny samců, které byiy nižší o polovinu hodnot koncentrace 2000 mg/kg skupiny samců. Proto se ukázalo, že hodnota C_maxstoupá s dávkou pouze u 1000 mg/kg skupiny samců.

Porovnání L-dD AUC|_ast mezi samci a samicemi ukázalo podobné trendy, které byly zaznamenány pro C_max 1000 mg/kg skupiny samců, které mají hodnoty nižší přibližně o polovinu hodnot AUCi_ast 2000 mg/kg skupiny samců. Srovnání AUCi_ast p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru mezi samci a samicemi ukázalo absenci pohlaví vzhledem k rozdílům a AUC|_ast stoupá přímo úměrně se zvyšováním dávek.

Data prokazuji, že po orálním podávání dival-L-dC následuje rychlá konverze na deesterifikovanou formu dival-L-dC, p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester, a potom L-dC, ale po celkovém působení, je 100 násobně vyšší pro L-dC než pro p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester. Celkové působení na metabolit β-Ι_-2'deoxy-cytidin-5'-valinester se zvyšuje přibližně lineárně se zvyšováním dávek.

Souhrn toxikokinetických výsledků je uvedeno v tabulce 29.

-134Tabulka 29 Farmakokinetické analýzy opakované dávky diva,-L-dC

1000 mg/kg a 2000 mg/kg podávané orálně opici

Farmakokinetický parametr¹
Dávka (mq/kq/den)	Pohlaví	(n)	Cfnax (mq(ml)	T max (h)	T last (h)	AUC\|gst (mq-h/ml)	AUC (mq-h/ml)	t-J/2 (h)
	L-dC
1000	M	(4)	66,7 (±29,1)	2	12	273 (±107)	295 (±110)	4,1 (±1,8)
1000	F	(4)	106 (±39)	2	12	429 (±19)	468 (NA)	3,7 (NA)
2000	M	(4)	116 (±13)	4	12	668 (±127)	726 (±114)	3,8 (±1,3)
2000	F	(4)	103 (±12)	2	24	567 (±208)	598 (±220)	5,1 (±1,7)
	p-L-2'-d	eoxycytidin-5'-valinester
1000	M	(4)	0,624 (±0,273)	1	5	1,46 (±0,45)	ID	ID
1000	F	(4)	1,23 (±0,25)	1	4	1,90 (±0,41)	ID	ID
2000	M	(4)	1,64 (±0,42)	1	10	3,66 (±0,88)	ID	ID
2000	F	(4)	1,29 (±0,28)	1	8	3,67 (±0,42)	ID	ID

střední hodnoty (+SD) v den 25 ² n = 4 pro všechny parametry pro L-dC a 3-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester, s výjimkou 2000 mg/kg skupiny samic, pro kterou n = 3 a pro L-dC AUC a t-i/₂, 1000 mg/kg skupinu samic, kde n = 2 pro neadekvátní určení koncové fáze ³ medián (spíše střední hodnota) představují hodnoty T_max a T|_astNA nepoužitelné

ID nedostatečná data pro definování koncové fáze pro všechna zvířata • · • · · ·

- 135 Příklad 42:

• · ·

Toxikokinetiky divyl-L-dC u krys při opakované dávce

Byla stanovena potenciální toxicita a farmakokinetiky divyl-L-dC po orálním podávání 28 dní krysám. Každé z dvaceti zvířat (10 samců a 10 samic) bylo náhodně vybráno a dostávalo jednu ze tří dávek (500, 1000 nebo 2000 mg/kg) dival-L-dC žaludeční sondou nebo kontrolní vehikulum jednou denně 28 dní. Klinická pozorování byla dokumentována jednou denně. Tělesné hmotnosti byly dokumentovány před dávkováním ve dnech 1, 8,15, 22 a 28 a před pitvou ke dni 29. Přijímání potravy bylo dokumentováno týdně. Vzorky krve pro hematologii a chemické složení séra byly také odebrány před pitvou ke dni 29. Po kompletním vyhodnocení ke dni 29 byla všechna zvířata eutanizované a podrobena úplné pitvě, která zahrnovala makroskopické vyšetření vnějšího povrchu těla, všech otvorů a lebeční, hrudní a břišní dutiny a jejich obsahu. Hmotnost těla a zvoleného orgánu a poměry hmotností orgánu k tělu a orgánu k mozku byly také dokumentovány. Tkáň získaná úplnou pitvou byla vyhodnocena histomorfologicky veterinárním patologem certifikovaným ministerstvem.

A. Tělesné hmotnosti

Střední hodnoty tělesných hmotností u 2000 mg/kg skupiny samců ke dni 22 a 28 byly významně nižší než střední hodnota savce kontrolní skupiny. Střední hodnota tělesné hmotnosti 2000 mg/kg skupiny samic ke dni 28 byla také významně nižší než střední hodnota kontrolní skupiny samic.

B. Přijímání potravy

Přijímání potravy bylo sníženo u 2000 mg/kg skupiny samců v průběhu studie. Také přijímání potravy 1000 mg/kg skupiny samců během třetího týdne studie • · A ·

A ·

- 136• · · · AAA ·«· · · A A A • AAAAAA a A A · ·

A A · A A A · A «

AAA A AA AA AA bylo významně nižší než u kontrolní skupiny samců. Přijímání potravy bylo významně sníženo u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny samic během druhého, třetího a čtvrtého týdne studie.

C. Klinická patologie

Hematologie. Dne 29 byl zaznamenán velký počet statisticky významných rozdílů v indexu erythrocytů. Množství červených krvinek (RBC) se významně snížilo u samce i samice při všech třech hladinách dávek (500, 1000 a 2000 mg/kg). Koncentrace hemoglobinu (HGB) se snížila u 2000 mg/kg skupiny samců, 1000 mg/kg skupin samic a 2000 mg/kg skupiny samic. Pokles hematokrytu (HCT) byl zaznamenán u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců a samic. Střední hodnota objemu buňky (MCV) se významně zvýšil u 500, 1000 a 2000 mg/kg skupin samců a u 500 a 1000 mg/kg skupiny samic. Střední hodnota hemoglobinu buňky (MCH) se významně zvýšila u 500, 1000 a 2000 mg/kg skupin samců a samic. Střední hodnota koncentrace hemoglobinu buňky (MCHC) se zvýšila u 1000 mg/kg skupiny samic. Počet vytvořených červených krvinek (NCR; absolutní a relativní) se snížil u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců a zvýšil u 2000 mg/kg skupiny samic. Tyto změny znamenají slabou anemickou reakci, týkající se léčby.

Počet bílých krvinek (WBC) se snížil u 2000 mg/kg skupiny samců. Bylo to snížení monocytů (MNO; absolutní a procentové) u 2000 mg/kg skupiny samců. Krevní destičky (PLT) se zvýšily u 2000 mg/kg supiny samců. Avšak tyto změny byly kvantitativně malé a toxikologická relevance je neurčitá.

Chemické složení séra. Střední hodnota hladin globulinu (GLÓB) se snížily u 2000 mg/kg skupiny samců a 1000 mg/kg skupiny samic ke dni 29. Poměry albumin/globulin se zvýšily u 1000 a 2000 mg/kg skupiny samců a 1000 mg/kg skupiny samic. Hladiny alkalické fosfatázy (ALK) se zvýšily u 500 mg/kg skupiny samic. Hladiny cholesterolu (CHOL) se zvýšily u 1000 mg/kg skupiny « ·

-137samic. Tyto malé změny nevytváří profily týkající se reakce na dávku nebo trendy, které prokazují, že tyto hodnoty byly toxikologicky relevantní.

D. Hmotnosti orgánů

Významné absolutní snížení hmotností orgánů bylo zaznamenáno u plic (2000 mg/kg skupiny samců a samic) a brzlíku (2000 mg/kg skupina samců, 1000 mg/kg skupina samic a 2000 mg/kg skupina samic). Význané také bylo snížení střední hodnoty absolutní hmotnosti orgánu u prostaty a semenných váčků u 2000 mg/kg skupiny samců. Střední hodnoty absolutní hmotnosti srdce se snížily u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny samic. Střední hodnota hmotnosti slinných žláz se snížila u 2000 mg/kg skupin samic. Střední hodnota hmotnosti sleziny se zvýšila u 2000 mg/kg skupiny samic.

Změny relativní hmotnosti orgánů (k tělu) zahrnovaly zvýšenou hmotnost mozku u 2000 mg/kg skupin samců a samic. Zvýšení střední hodnoty hmotnosti varlat u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců bylo také zaznamenáno. Relativní hmotnost brzlíku se snížila u 2000 mg/kg skupiny samců a 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samic. Střední relativní hmotnost sleziny se zvýšila u 2000 mg/kg skupiny samic.

Také změny relativní hmotnosti orgánu (ke hmotnosti mozku) zahrnovaly sníženou relativní hmotnost plic u 2000 mg/kg skupiny samců. Relativní hmotnosti brzlíku se snížily u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců a samic. Relativní střední hodnoty hmotností prostaty a semenného váčku se také snížily u 2000 mg/kg skupiny samců. Střední hodnota relativní hmotnosti srdce se snížila u 2000 mg/kg skupiny samic tak, jako střední hodnota relativní hmotnosti slinných žláz. Relativní hmotnost sleziny se zvýšila u 2000 mg/kg skupiny samic.

• ·

-138·«····♦ · ··· · « • · ···· ···» • · · · · ·· · · ·« «φ

Snížení hmotností orgánů (brzlík, plíce, srdce, slinné žlázy, prostata, semenné váčky a mozek) bylo interpretováno jako sekundární vzhledem k všeobecné ztrátě tělesné hmotnosti zaznamenané u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupiny zvířat. Atrofie brzlíku, která byla pozorováná mikroskopicky u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin zvířat, byla shodná s pozorovaných snížením hmotnosti brzlíku. Jiné tkáně se sníženými hmotnostmi neměly mikroskopické koreláty. Zvýšené hmotnosti sleziny byly interpretovány jako následek erythropoetické aktivity pozorované mikroskopicky.

E. Patologie

Mikroskopická. Výskyt atrofie brzlíku a lymfoidní nekrózy se zvýšil u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin zvířat, ale neměl vliv na 500 mg/kg skupinu zvířat. Avšak klinický význam atrofie brzlíku a lymfoidní nekrózy byl interpretován jako neprůkazný, protože poměr dávka-rekace byl slabý. Tyto brzlíkové změny se také často prezentují jako nespecifické změny u zvířat stresovaných různými faktory a významná snížení telesné hmotnosti byla pozorována u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin zvířat v této studii.

Erythropoéza (tvorba červených krvinek) ve slezině se zvýšila u 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin samců a samic dostatečně, aby se odlišila od kontrol, ale sleziny 500 mg/kg skupin zvířat byly podobné kontrolám. Hematopoéza (krvetvorba) v játrech se zvýšila u 2000 mg/kg skupin samců a samic dostatečně, aby se odlišila od kontrol, ale játra 500 mg/kg a 1000 mg/kg skupin zvířat byla podobná játrům u kontrol. Hyperplazie v sternální kostní dřeni byla pozorována u 2000 mg/kg skupin samců a samic. Erythropoéza ve slezině, zvýšená hematopoéza v játrech a hyperplazie v kostní dřeni byly všechny interpretovány tak, jak se očekávalo, a příslušné reakce na slabou anémii byly zaznamenány jako součást hematologických výsledků. Tyto výsledky potvrzují odpovídající povahu anémie během pokračování léčby.

• * • ·

-139Ve této studii se vyskytlo několik dalších mikroskopických změn. Byly to většinou obvykle malé zánětlivé nebo degenerativní změny obvyklého typu a onemocnění zaznamenané ve studiích výživy žaludeční sondou u hlodavců.

Toxikokinetiky. Dalším 54 zvířatům (27 samců a 27 samic) byly odebrány vzorky pro farmakokinetické analýzy ve dnech 1 a 28. V obou dnech byly vzorky odebrány v každém ze šesti časových bodů (střídavě dvě zvířata na časový bod); 0,5, 1, 2, 4, 8 a 24 hodin po dávkování. Plazma byla připravena z krve a analyzována na koncentraci dival-L-dC a tři metabolity: L-dC, L-dU a částečně deesterifikovanou formu dival-L-dC, p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester. Pouze L-dC a p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester byly kvantifikovatelné. Střední hodnoty dat koncetrace plazmy v čase u 1000 a 2000 mg/kg skupin byly podrobeny farmakokinetické reakci nerozdělené na části za použití WinNonlin 1,5 (Model 200). Analýza 500 mg/kg skupiny se vyvýjí.

Střední hodnoty koncentrací metabolitu, L-dC, v plazmě dosáhly maximálních hodnot (C_max) 2 hodiny po dávce (T_max) u 1000 mg/kg skupiny a 1-4 hodiny po dávce u 2000 mg/kg skupiny. Střední hodnoty C_max u samců a samic byly srovnatelné v každé ze skupin 1000 mg/kg a 2000 mg/kg skupin a byly podobné ke dni 28 versus den 1 u obou skupin. Hodnota C_max se zvyšovala s dávkou ve většině případech, ale míra zvýšení byla variabilní Po dosažení hodnoty C_max koncentrace L-dC klesaly příslušným biexponenciálním způsobem u každé skupiny. Odhadnuté poločasy koncové fáze u 1000 mg/kg skupiny (9-17 hodin) měly sklon být delší než u 2000 mg/kg skupiny (6-8 hodin), ale odhady poločasu by měly být interpretovány opatrně. Odhad poločasů vyžaduje použití pouze data tří bodů a data mají sklon se měnit. Také jedno ze tří použitých bodů bylo ve 4 hodině, kdy čas koncové fáze nemohl být stanoven. Hodnota Ti_ast pro koncentrace L-dC nastala během 24 hodin pro všechny skupiny dat. Hodnota AUCi_ast byla srovnatelná u samců a samic v každé skupině a nebyla podstatně odlišná ke dni 28 versus den 1. Ačkoliv se hodnota C_max pro L-dC nezvyšovala se zvyšováním dávek dival-L• · • · ·

-140• · · · • · · » · • «·«·«· · • » · • · · · ♦ «« dC stejným způsobem, jak je uvedeno výše, hodnota AUCi_ast pro L-dC se zvyšovala s dival-L-dC v poměru, který byl přibližně proporcionální k dávce.

• · · · · ·

Střední hodnoty koncetrací p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru v plazmě dosáhly maximálních hodnot (C_max) 1 až 2 hodiny po dávce (T_max). Střední hodnoty Cmax u samců a samic byly podobné v každé skupině dávek s trendem směrem k vyšším hodnotám u samic. Hodnoty C_max byly přibližně o 14 % až 50 % vyšší u samic v každém dni 1 a dni 28, s výjimkou u samic 2000 mg/kg skupiny, kde hodnoty C_max P-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru byly přibližně o 164 % vyšší než u samců ke dni 28. Pokud se porovnají hodnoty u každého pohlaví, hodnoty C_max ke dni 28 byly podobné ke dni 1, s výjimkou u samic 2000 mg/kg skupiny, pro které hodnoty C_max byly o 130 % vyšší ke dni 28 než ke dni 1. Hodnota C_max se zvyšovala s dávkou v každém případě, ale s faktorem, který byl obecně menší, než lineárně proporcionální k dávce.

Patrná koncová eliminační fáze p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru nebyla dobře charakterizovaná a proto nebyly poločasy uvedeny. Hodnota Ti_ast pro koncentrace p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester nastala v rozmezí 4-8 hodin u 1000 mg/kg skupiny a v rozmezí 8-24 hodin u 2000 mg/kg skupiny. Jak bylo uvedeno pro hodnotu Cmax, hodnota AUC|_ast byla o 25 % až 50 % vyšší u samic než u samců. Hodnota AUCi_ast byla shodně mírně vyšší ke dni 28 versus den 1 u samců a samic (30 % až 62 %). Hodnota AUCi_ast se zvyšovala s dávkou v poměru, který byl přibližně lineárně proporcionální k dávce.

Tato data prokázala, že L-dC a p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester dosáhly systémové cirkulace relativně rychle. Celková expozice měřená hodnotou Cmax byla 10- až 40-násobně větší pro L-dC než pro p-L-2'-deoxycytidin-5'valinester a 35- až 80-násobně větší než měřená AUCi_ast· Expozice se zvyšovala proporcionálně s dávkou v rozsahu dávek 1000-2000 mg/kg/den. Celková expozice L-dC ke dni 29 byla srovnatelná k expozici zaznamenané v den 1, zatímco expozice p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinesteru byla obecně větší

-141 « · · · · · • · · » • » · · · • · * · · » ··« • · · · · ·· ·· ·· ke dni 28, což prokazuje, že akumulace p-L-2'-deoxycytidin-5'-valin-esteru může nastat během opakovaného dávkování.

Souhrn toxikokinetických výsledků je uveden v tabulce 30.

Tabulka 30 Farmakokinetické analýza jedné nebo opakované dávky dival-LdC 1000 mg/kg a 2000 mg/kg podávané orálně u krysy

Farmakokinetický parametr
Dávka (mg/kg/den	Den	Pohlaví	Cmax (pg/ml)	Tmax (tl)	T(ast (h)	AUC\|_ast (pg.h/ml)	AUC (pg-h/ml)	tl/2 (h)
	L-dC
1000	1	M	33,6	2	24	255	363	17,3
1000	1	F	48,5	2	24	239	279	9,4
1000	28	M	52,9	2	24	254	334	12,9
1000	28	F	46,6	2	24	239	277	8,8
2000	1	M	70,9	2	24	700	478	5,8
2000	28	F	59,4	2	24	461	487	5,6
2000	28	M	51,1	4	24	500	550	NA
2000	28	F	77,7	1	24	578	561	8,5

• · • ·

-- · · 1

- 142» · · · · ·

Pokračování tabulky 30

	p-L-2'-deoxycytidin-5'-valinester
1000	1	M	1,31	1	4	2,81	ID	ID
1000	1	F	1,70	2	4	4,07	ID	ID
1000	28	M	1,32	2	8	3,96	ID	ID
1000	28	F	1,97	2	4	5,36	ID	ID
2000	1	M	2,38	2	8	8,09	ID	ID
2000	1	F	2,71	2	8	10,2	ID	ID
2000	28	M	2,36	1	8	11,0	ID	ID
2000	28	F	6,24	2	24	16,5	ID	ID

NA = není aplikovatelné; koncová fáze nebyla adekvátně charakterizována ID = nedostatečná data pro definice koncové fáze u všech zvířat

Příklad 43:

Test mutace včlenění destičky S.Typhimurium a E.Coli (genotoxicita)

Když se zvířatům orálně podává dival-L-dC, rychle se převede na L-dC za vzniku vysokých koncentrací L-dC a nedetekovatalného dival-L-dC v plazmě. Proto studie mutagenity provedené in vitro byly provedeny za použití L-dC. Tato studie byla provedena podle pravidel FDA GLP. L-dC byl testován na svůj potenciál způsobovat mutaci histidinového operonu Salmonella typhimurium kmene TA98, TA100, TA1535 a TA 1537 a tryptofanového operonu Escherichia coli kmene WP2uvrA. Byly testovány L-dC o koncentracích 50, 100, 500, 1000 a 5000 mg/destičku plus pozitivní a negativní kontroly. Testované kmeny byly vystaveny L-dC nebo kontrole za nepřítomnosti exogenní aktivace a za přítomnosti indukovaného extraktu jater krysy S-9 plus eofaktory. Po inkubaci přibližně 68 hodin byly L-dC a kontroly

- 143 vyhodnoceny na množství revertantů na destičku a integritu podkladu mikrokolonového trávníku.

Obě kontroly, negativní a pozitivní kontrola, zcela splnily požadavky testu. Výsledky obou testů, konečného a konfirmačního testu, zaznamenaly, že LdC nevyvolal žádné významné zvýšení v počtu revertantních koloniíí v žádném z testrovných kmenů za přítomnosti nebo nepřítomnosti indukovaného extraktu jater krysy S-9. Na základě nálezů studie se usoudilo, že nenastal žádný důkaz mutagenity v testu mutace včleněním destičky

S.typhimurium nebo E.coli s koncentracemi L-dC až 5000 mg/destičku.

Příklad 44:

Test chromozomální aberace

Pokud se dival-L-dC podává zvířatům orálně, rychle se převede na L-dC za vzniku vysokých koncentrací L-dC v plazmě a nedetekovatelného dival-L-dC. Proto studie mutagenity provedené in vitro byly provedeny za použití L-dC. Tato studie byla provedena podle pravidel FDA GLP. L-dC byl testován na svůj potenciál indukovat chromozomální aberace v buňkách kultivovaných CHO. V konečném testu byly testovány L-dC o koncentraci 100, 500, 1000 a 5000 mg/ml a pozitivní a negativní kontrola s nebo bez metabolické aktivace. Po nepřetržité léčbě 18 hodin byla stanovena toxicita snížením relativního růstu buňky (RCG) a relativním mitotickým indexem (RMI). Na základě výsledků RCG a RMI byly chromozomální aberace záskány ze třech nejvyšších koncentrací (500, 1000 a 5000 mg/ml). Jednosto metafázi bylo získáno z každé z duplikátní kultury při každé koncentraci (včetně pozitivní a negativní kontroly).

Konfirmační test byl proveden bez aktivace pouze s LdC o koncentracích 1,0, 10, 100, 500, 1000 a 5000 mg/ml. Po nepřetržité léčbě 18 hodin byla stanoveno snížení hodnot RCG a RMI. Na základě výsledků RCG a RMI byly získány chromozomální aberace ze tří nejvyšších koncentrací (500, 1000 a

-1445000 mg/ml). Jednosto metafází bylo získáno z každé z duplikátních kultur při každé hladině koncentrace (včetně pozitivní a negativní kontroly).

··· · · · ··· #«···*· 4 * » · · · • · ···· ···· * · · * · ·· ·· ·· ··

Výsledky z konečného a konfirmačního testu udávají, že L-dC neindukoval statisticky významné zvýšení (definováno jako hodnota p 30,05 stanovená testem Chisquare) v procentech buněk s aberacemi při kterékoliv z testovaných koncentrací, oba s a bez metabolické aktivace, ve srovnání s rozpouštědlem kontrol. Na základě nálezů studie bylo zjištěno, že neexistoval žádný důkaz chromozomálních aberací v testu CHO po působení L-dC o koncentracích až 5000 mg/ml, a L-dC se nepovažoval za klastogenní činidlo.

Příklad 45:

Test mikrojádra myši

Když se dival-L-dC orálně podává zvířatům, rychle se převede na L-dC za vzniku vysokých koncentrací L-dC v plazmě a nedetekovatelného dival-L-dC. Proto studie mutagenity provedené in vitro byly provedeny za použití L-dC. Tato studie byla provedena podle pravidel FDA GLP. Za předpokladu orální biodostupnosti 10-20 % u hlodavců (viz Pharmacology and Toxicology, sekce 8.1.7.3) by expozice na L-dC (dávka 2000 mg/kg) dosáhla nebo překročila 400 mg/kg. Tato hladina expozice by překročila očekávanou expozici u lidí 20 až 50 krát.

L-dC byl testován na svůj potenciál indukovat mikronukleované polychromatické erythrocyty (MPCE) v buňkách kostní dřeně samců a samic myši. Byly testovány L-dC při koncentracích 500, 1000 a 2000 mg/kg a pozitivní a negativní kontrola. Zkoumané léčivo bylo podáváno orálně jako jedna dávka. Byly provedny dvě sklizně přibližně 24 a 48 hodiny po podávání L-dC nebo negativní kontroly a jedna sklizeň byly provedena přibližně 24 hodin po podávání pozitivní kontroly. Bylo použito pět samců a pět samic myši podle dávky skupiny podle doby sklizně. Procentové množství poly-chromatických erythrocytů (PCE) a frekvence MPCE byly stanoveny pro každý časový bod.

- 145• ·

Výsledky studie znamenají, že nenastalo žádné statisticky významné zvýšení (definováno jako hodnota p 30,024 stanovená Studentovým t-testem) v počtu MPCE v kterémkoliv časovém bodě při kterékoliv dávce skupiny ve srovnáni negativní kontrolou. Snížení více než 20 % versus vehikulové kontroly v procentovém množství PCE, jako indikace toxicity, bylo zjištěno při každé dávce testovaného druhu při každé 24 hodinové době sklizně u obou pohlaví (-30,5% až -43,1% pro samce a -26,1% až -32,2% pro samice). Snížení také znamená vhodnou expozici testovaného druhu na cílovou tkáň. Avšak toto snížení o více než 20 % nebylo zjištěno při kterékoliv hladině dávky testovaného druhu při 48 hodinové době sklizně u obou pohlaví.

Tato studie ukazuje, že za podmínek testu a podle souboru kritérií pro vyhodnocení výsledků testu byl L-dC negativní v mikrojaderném testu samců a samic zvířat při dávkách až 2000 mg/kg.

Příklad 46:

Integrovaný souhrn toxikologických nálezů

Obvyklé buněčné testy byly použity pro stanovení toxicity L-dC a některých buněčných metabolitů. L-dC byl netoxický (50 % cytotoxická koncentrace, CC₅₀ > 2000 μΜ) na lidskou buněčnou linii 2.2.15 hepatomu, která se rutinně používá pro stanovení aktivity proto l-IBV potenciálních antivirových prostředků. L-dC nebyl cytotoxický na lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMCs; CC₅₀ > 1000 μΜ) a na lidské progenitorní buňky kostní dřeně (50% inhibiční koncentrace, IC₅₀ > 10 μΜ u testů jednotky tvořící kolonu granulocyt-makrofág (CFU-GM) a erythroidní jednotky tvořící prasklinu (BFUE).

• ·

- 146 Tabulka 31 Cytotoxicita L-dC in vitro

Buněčná linie³	CC₅₀ ^b (mM)
2.2.15^c	> 2000
PBMC^d	> 200
HFF^ce	> 100
Daudiť⁶	> 50
MDCK^b	> 100
CV-1^c	> 100
MA-104^c	> 100

PBMC, mononukleární buňky periferní krve; HFF, fibroblast lidské předkožky; Daudi, Burkittova buňka B lymfomu; MDCK, epitelové buňky psí ledviny; CV-1, fibroblastové buňky ledviny africké zelené opice; MA104, epitelové buňky ledviny opice rhesus.

CC50 = 50% cytotoxická koncentrace; '>' znamená, že žádná hodnota CC50 nabyla dosažena při nejvyšší testované koncentraci léčiva.

NIH, antivirový výzkum a antivirový chemický program R.Schinazi, Emory University, Veterans Affairs Medical Center Výsledek uvedený v pg/ml spíše než v mM

Navíc L-dC nebyl cytotoxický na velký počet jiných buněčných linií člověka nebo jiných savců. Nebyly zaznamenány žádné zjistitelné změny ve funkci, morfologii nebo obsahu DNA mitochondrie a v hepatocytech (IC50 > μΜ) nebyla žádná akumulace kyseliny mléčné. Trifosfátová forma L-dC nebyla inhibitorem lidských DNA polymeráz α, β a γ až do koncentrací 100 μΜ.

V akutní toxikologické studii nárazové dávky (zahrnující 500, 1000 a 2000 mg/kg nárazovou orální dávku) u krys a u opic (eskalace dávky ve dnech 1,4, • ·

- 147• · * · · I • · · · · · I ······ · · » , • * · * · 4 • · « · « ·

7, 10 a 14 až do 2000 mg/kg) nebyly žádné zřejmé projevy toxicity ani se neprojevily žádné účinky, týkající se dival-L-dC, na tělesnou hmotnost, konzumaci potravin nebo parametry klinické patologie (hematologie a chemické složení séra). Navíc nebyly při pitvě zjištěny žádné makroskopické léze, ani žádné mikroskopické nálezy v histomorfologických analýzách, které lze přisoudit dival-L-dC. Na základě výsledků těchto studií nebyl zjištěná žádná hladina nepříznivého účinku (NOAEL) pro dival-L-dC, po nárazové dávce orální žaludeční sondou u krysy Sprague-Dawley a opice cynomologus 2000 mg/kg.

U subchronické (25 dní) toxikologické studii u opic byla NOAEL menší než 500 mg/kg pro dival-L-dC. Brzlíková atrofie byla pouze mikroskopickým nálezem, který se eventuálně vztahoval na dival-L-dC, ale klinický význam byl interpretován jako neprůkazný. Při dávce 500 mg/kg byla zaznamenána slabá nehemolytická anémie (snížení počtu červených krvinek, snížení hemoglobinu a hematokrytu) a zaznamenán pokles absolutního a procentového množství polymorfonukleárních leukocytů se žádným zřetelným následkem. U žádné skupiny dávek nebyly identifikovány žádné jiné toxicity než hematologické změny.

V subchronické toxikologické studii (28 dní) u krys byla NOAEL nižší než 500 mg/kg pro dival-L-dC. Orální podávání dival-L-dC po dobu 28 dní kryse při dávce 2000 mg/kg způsobilo změny týkající se léčby, které zahrnují slabou makrocytní anémii, sníženou hmotnost brzlíku, zvýšenou hmotnost sleziny (pouze u samic), sníženou tělesnou hmotnost a hematopoiézu ve slezině, játrech a kostní dřeni. Orální podávání dival-dC po dobu 28 dní kryse při dávce 1000 rog/kg způsobilo změny týkající se léčby, které zahrnují slabou makrocytovou anémii, brzlíkovou atrofii (pouze u samic) a hematopoiézu ve slezině. Histomorfologické změny nalezené v játrech, slezině a kostní dřeni odrážejí hematologickou reakci na slabou anémii. Orální podávání dival-L-dC po dobu 28 dní u krysy při dávce 500 mg/kg způsobilo slabou makrocytovou

- 148anémii. V žádné skupině dávek nebyly identifikovány žádné jiné toxicity než zaznamenané hematologické změny a hematopoiézní reakce.

U normálně zdravého sviště nebo sviště chronicky infikovaného virem hepatitidy B (účinný model léčby infekce HBV) nebyla zjištěna toxicita během akutní (10 mg/kg nárazové dávky IV a PO) a subchronické (28 dní při 10 mg/kg)den orálně a 12 týdnů při 1 mg/kg/den orálně) studie zvířat, které obdržely L-dC. Nenastala žádná ztráta hmotnosti u skupin léčených L-dC ve srovnání s kontrolními zvířaty, parametry klinické patologie (hematologie a chemické složení séra) byly v normálním rozmezí a jaterní biopsie na konci léčby ve 12 týdnu studie neprokázala žádný důkaz změny tuku (microvesicular steatosis).

L-dC nebyl mutagenní v testu mutagenity inkorporací destičky S.typhimurium nebo E.coli při koncentracích až do 5000 pg/destičku. Nevnikl žádný důkaz chromozomálních aberací v testu vajíčka čínského křečka (CHO) po expozici L-dC při koncentracích až do 5000 pg/ml (nebo 22,0 mM). V testu mikrojádra myši nebyl L-dC klastogenní u samců nebo samic zvířat při dávkách až 2000 mg/kg.

Slabá anémie zaznamenaná u opice nebyla spojená se žádnými klinickými koreláty dokonce při největší dávce (2000 mg/kg) a u krysy při dávce 500 mg/kg. Navíc množství retikulocytů bylo nezměněno. Ačkoliv neexistovala žádná formální reverzibilní složka v těchto studiích, je zřejmé, že může nastat hematologická reakce, označovaná extramedulární hematopoiézou, kterou lze vidět ve slezině a játrech při vysokých dávkách u krysy.

-149• ·

Tabulka 32 Mezidruhové srovnání dávek v oblasti hmotnosti a povrchu těla

Druh	Tělesná hmotnost (kg)	Dávka (mg/kg)	Dávka (mg/zvíře)	Faktor konverze	Dávkový ekvivalent člověka (HED) (mg/kg)	Složený rozdíl
Krysa	0,2	500	100	6	16,6	23
Opice	4,0	500	2000	3	666	938
Svišť	3,0	10	30	3	10	14
Člověk	70	0,71	50 (navrženo)	1	0,71	-

Podobné hematologické změny při srovnatelně nižších dávkách byly získány v preklinických studiích toxicity lamivudinu (Epivir-HBVT™) a valacykloviru (Valtrex™). Obě tato schválená léčiva jsou členy stejně dobře charakterizované třídy (nukleosidy nebo nukleosidová analoga) jako je dival-L-dC. Volba lamivudinu pro srovnání je založena na skutečnosti, že je to cytozinový derivát stejně jako dival-L-dC, a na jeho schválení pro léčbu chronické infekce hepatitidy B. Volba valacykloviru je pro srovnání založena na skutečnosti, že je to valinesterový prekurzor nukleosidového acykioviru.

Tento vynález byl popsán s odkazem na jeho výhodná provedení. Variace a modifikace vynálezu budou odborníkům v oboru z výše uvedeného podrobného popisu vynálezu zřejmá. Předpokládá se, že všechny tyto variace a modifikace jsou součástí oblasti vynálezu.

Zastupuje:

i z 'X • * ·

- 150-

Claims

Patentové nároky

1. 3'-Substituovaný-p-L-nukleosid podle vzorce (I) , BASE (I) nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

X je atom O, S, skupina SO₂ nebo CH₂; a

BASE je purinová nebo pyrimidinová báze, která může být případně substituovaná.
2. Nukieosid podle nároku 1, kde X je atom O.
3. Nukieosid podle nároku 2, kde R² je skupina CO-alkyl.

• · ··· · · ··· ♦·· «· · · β

Λ C4 ········ ···,

-ΙΟ- · · ······ ···· · ··*· « ·
4. Nukleosid podle nároku 2, kde R² je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
5. Nukleosid podle nároku 4, kde R² je L-valinyl.
6. Nukleosid podle nároku 2, kde R¹ je skupina vodík.
7. Nukleosid podie nároku 2, kde R¹ je skupina CO-alkyl.
8. Nukleosid podle nároku 2, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury, nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
9. Nukleosid podle nároku 8, kde R¹ je L-valinyl.

» ·

- 152 -
10. Nukleosid podle nároku 9, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.
11. Nukleosid podle nároku 1, kde 3'-substituovaným-p-L-nukleosidem je p-L-2'-deoxypurin podle vzorce γ

X² nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovanou skupinu aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

Y je skupina OR³, NR³R⁴ nebo SR³; a

X¹ a X² jsou nezávisle zvoleny ze skupin vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, COalkoxyalkyl, halogen, OR⁵, NR⁵R⁶ nebo SR⁵; a

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle skupiny vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkyl-153• · • 4 sulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di, nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.
12. Nukleosid podle nároku 11, kde R² je skupina CO-alkyl.
13. Nukleosid podle nároku 11, kde R je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
14. Nukleosid podle nároku 13, kde R² je L-valinyl.
15. Nukleosid podle nároku 11, kde R¹ je skupina vodík.
16. Nukleosid podle nároku 11, kde R¹ je skupina CO-alkyl.
17. Nukleosid podle nároku 11, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové sktruktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

φφφφ

- 154 -

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
18. Nukleosid podle nároku 17, kde R¹ je L-valinyl.
19. Nukleosid podle nároku 11, kde R¹ je skupina vodík a R²je L-valinyl.
20. Nukleosid podle nároku 11, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R muže být případně navázán na R¹⁰za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
21. Nukleosid podle nároku 20, kde R¹ a R²jsou nezávisle L-valinyl.
22. Nukleosid podle nároku 11, kde p-L-2'-deoxypurin je p-L-2'-deoxyadenosin podle vzorce:

nr³r⁴ • · ·

-155• * · · nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl se přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R³ a R⁴ jsou nezávisle skupiny vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, COaryloxyalkyl, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Nukleosid podle nároku 22, kde R² je skupina CO-alkyl.

Nukleosid podle nároku 23, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.

Nukleosid podle nároku 23, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.

Nukleosid podle nároku 22, kde R² je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde rt O

R je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo • · • · • · · · • · »

- 156• · · · • » · · • ·····« * » · tttt·· » • · · ♦ ♦ ·

1» tttt* · • · · · • · ·· alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R10 a Rn jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
27. Nukleosid podle nároku 26, R² je L-valinyl.
28. Nukleosid podle vzorce 22, kde R¹ je skupina vodík.
29. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ není skupina vodík.
30. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ je skupina CO-alkyl.
31. Nukleosid podle nároku 30, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
32. Nukleosid podle nároku 30, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.
33. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(P⁹)(NR^WR¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a ·· ····

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující arylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
34. Nukleosid podle nároku 33, kde R¹ je L-valinyl.
35. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ je skupina vodík a R² je skupina COalkyl.
36. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.
37. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ a R² jsou nezávisle skupiny acyl.
38. Nukleosid podle nároku 22, kde R¹ a R²jsou nezávisle aminokyselinové zbytky podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroárylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo alkyl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
39. Nukleosid podle nároku 38, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.
40. Nukleosid podle nároku 38, kde R³ a R⁴jsou skupiny vodík.

• · · ·

-15841. Nukleosid podle nároku 38, kde R³ je skupina vodík a R⁴je skupina dimethylaminomethylen.
42. Nukleosid podle nároku 38, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina COalkyl.
43. Nukleosid podle nároku 38, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina COmethyl.
44. Nukleosid podle nároku 38, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je L-valinyl.
45. Nukleosid podle nároku 11, kde p-L-2'-deoxypurin je p-L-2'-deoxyguanosin podle vzorce o

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxylalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, aryl• · ··· ·· ··· ··· ·· · flfl .········ ··♦· sulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R⁵ a R⁶jsou nezávisle skupina H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, COaryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl .aminokyselinový zbytek mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Nukleosid podle nároku 45, kde R² je skupina CO-alkyl.
47. Nukleosid podle nároku 46, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
48. Nukleosid podle nároku 46, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.
49. Nukleosid podle nároku 45, kde R² je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl nebo cyklopropyl).
50. Nukleosid podle nároku 49, kde R² je L-valinyl.
51. Nukleosid podle nároku 45, kde R¹ je skupina vodík.

• · ·

- 160• · ·
52. Nukleosid podle nároku 45, kde R¹ není skupina vodík.
53. Nukleosid podle nároku 45, kdeR¹ je skupina CO-alkyl.
54. Nukleosid podle nároku 53, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
55. Nukleosid podle nároku 53, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.
56. Nukleosid podle nároku 45, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
57. Nukleosid podle nároku 56, kde R¹ je L-valinyl.
58. Nukleosid podle nároku 45, kde R¹ je skupina vodík a R²je skupina COalkyl.
59. Nukleosid podle nároku 45, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.

- 161
60. Nukieosid podle nároku 45, kde R¹ a R² jsou nezávisle skupiny acyl.
61. Nukieosid podle nároku 45, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je akylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
62. Nukieosid podle nároku 61, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.
63. Nukieosid podle nároku 62, kde R⁵ a R⁶ jsou skupiny vodík.
64. Nukieosid podle nároku 62, kde R⁵ je skupina vodík a R⁶ je skupina dimethylaminomethylen.
65. Nukieosid podle nároku 62, kde R⁵ je skupina vodík a R⁶ je skupina COalkyl.
66. Nukieosid podle nároku 62, kde R⁵je skupina vodík a R⁶ je skupina COmethyl.
67. Nukieosid podle nároku 62, kde R⁵ je skupina vodík a R⁶ je L-valinyl.

- 162• · · ·
68. Nukleosid podle nároku 11, kde 3-L-2'-deoxypurin je p-L-2'-deoxyinosin podle vzorce o

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

Nukleosid podle nároku 68, kde R² je skupina CO-alkyl.

Nukleosid podle nároku 69, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.

Nukleosid podle nároku 69, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.

Nukleosid podle nároku 68, kde R²je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR^WR¹¹), kde • · • · · · * · · ’ ..........

-163 - : *..· ·..· ·.

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury: nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
73. Nukleosid podle nároku 72, kde R² je L-valinyl.
74. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ je skupina vodík.
75. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ není skupina vodík.
76. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ je skupina CO-alkyl.
77. Nukleosid podle nároku 76, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
78. Nukleosid podle nároku 76, kde CO-alkyl nebo skupina CO-propyl.
79. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a • · · «

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
80. Nukleosid podle nároku 79, kde R¹ je L-valinyl.
81. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ je skupina vodík a R² je skupina COalkyl.
82. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.
83. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ a R² jsou nezávisle skupiny acyl.
84. Nukleosid podle nároku 68, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde rt rt

R je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová a heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát

Q navázaný na R ) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
85. Nukleosid podle nároku 84, R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.
86. Nukleosid podle nároku 2, kde 3'-substituovaný-p-L-nukleosid je 3-L-2'deoxypyrimidin podle vzorce • ·

-165γ nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je zvolen ze skupin H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, araikylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, araikylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

Y je skupina OR³, NR³R⁴ nebo SR³;

X¹ je zvolen ze skupin H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, halogen, OR⁵, NR⁵R⁶ nebo SR⁵; a

R³, R⁴, R⁵ a R⁶ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substítuované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, araikylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.
87. Nukleosid podle nároku 86, R² je skupina CO-alkyl.

- 166• · · ·
88. Nukleosid podle nároku 86, R² je aminokyselinový zbytek podle vzorce

C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhovéstruktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
89. Nukleosid podle nároku 88, kde R² je L-valinyl.
90. Nukleosid podle nároku 86, kde R¹ je skupina vodík.
91. Nukleosid podle nároku 86, kde R¹ je skupina CO-alkyl.
92. Nukleosid podle nároku 86, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

-16793. Nukleosid podle nároku 92, kde R¹ je L-valinyl.
94. Nukleosid podle nároku 86, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.
95. Nukleosid podle nároku 86, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je akylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný ne R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
96. Nukleosid podle nároku 95, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.
97. Nukleosid podle nároku 86, kde 3-L-2'-deoxypyrimidin je p-L-2'-deoxycytidin podle vzorce nr³r⁴ nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát;

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivátu; a

R³ a R⁴ jsou nezávisle skupiny H, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, dialkylaminoalkylen (zvláště dimethylaminomethylen), CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxalkyl, COaryloxyalkyI, CO-substituované skupiny aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di, nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.
98. Nukleosid podle nároku 97, kde R² je skupina CO-alkyl.
99. Nukleosid podle nároku 98, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
100. Nukleosid podle nároku 98, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.
101. Nukleosid podle nároku 97, kde R je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a • · ·« ···· · · «··· ··· · ♦ · · · · • · · «· · · · ·

- 1 fíQ - ·····»·· · » · · ·

I W w _{9 t} «···«··· ···· * · · · » · · ··

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
102. Nukleosid podle nároku 101, kde R¹ je L-valinyl.
103. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ je skupina vodík.
104. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ není skupina vodík.
105. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ je skupina CO-alkyl.
106. Nukleosid podle nároku 105, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
107. Nukleosid podle nároku 105, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.
108. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
109. Nukleosid podle nároku 108, kde R¹ je L-valinyl.

• · ·

-170110. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ je skupina vodík a R² je skupina COalkyl.
111. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.
112. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ a R² jsou nezávisle skupiny acyl.
113. Nukleosid podle nároku 97, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylová a heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení) skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
114. Nukleosid podle nároku 113, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.
115. Nukleosid podle nároku 114, kde R³ a R⁴ jsou skupiny vodík.
116. Nukleosid podle nároku 114, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina dimethylaminomethylen.
117. Nukleosid podle nároku 114, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina

CO-alkyl.

• t

-171 • · » · » • ···««· t ··«· · ·· ·· ·« · ·
118. Nukleosid podle nároku 117, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je skupina CO-methyl.
119. Nukleosid podle nároku 114, kde R³ je skupina vodík a R⁴ je L-valinyl.
120. Nukleosid podlenároku 86, kde p-L-2'-deoxypyrimidin je p-L-2'-deoxyuridin podle vzorce o

nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.
121. Nukleosid podle nároku 120, kde R² je skupina CO-alkyl.
122. Nukleosid podle nároku 121, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.

• ·

-172 -
123. Nukleosid podle nároku 121, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.
124. Nukleosid podle nároku 120, kde R² je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové striktury; nebo alternativně R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).
125. Nukleosid podle nároku 124, kde R² je L-valinyl.
126. Nukleosid podle nároku 120, kde R¹ je skupina vodík.
127. Nukleosid podle nároku 120, R¹ není skupina vodík.
128. Nukleosid podle nároku 120, R¹ je skupina CO-alkyl.
129. Nukleosid podle nároku 128, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.
130. Nukleosid podle nároku 128, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.

- 173 131.

Nukleosid podle nároku 120, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroárylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivít navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

132.

133.

134.

135.

Nukleosid podle nároku

Nukleosid podle nároku CO-alkyl.

Nukleosid podle nároku

Nukleosid podle nároku
131, kde R¹ je L-valinyl.

120, kde R¹ je skupina vodík a R²je skupina

120, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.

120, kde R¹ a R² jsou nezávisle skupiny acyl.

136.

Nukleosid podle nároku 120, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroárylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a • · ·

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupina vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

137. Nukleosid podle nároku 136, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.

138. Nukleosid podle nároku 86, kde P-L-2'-deoxypyrimidin je β-L-thymidin podle vzorce nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl, kde

R¹ je skupina vodík, alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, OO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaná skupina aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát; a

R² je zvolen ze skupin alkyl s přímým nebo rozvětveným řetězcem nebo cyklický alkyl, CO-alkyl, CO-aryl, CO-alkoxyalkyl, CO-aryloxyalkyl, CO-substituovaných skupin aryl, alkylsulfonyl, arylsulfonyl, aralkylsulfonyl, aminokyselinový zbytek, mono, di nebo trifosfát nebo fosfátový derivát.

139. Nukleosid podle nároku 138, kde R² je skupina CO-alkyl.

• · « · · ·

A ~7CZ ····♦··· ···

-Ί/O- · · ···♦· ···· · ·· ·· ·

140. Nukieosid podle nároku 139, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.

141. Nukieosid podle nároku 139, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.

142. Nukieosid podle nároku 138, kde R² je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je akylová, arylová, heteroarylová nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

143. Nukieosid podle nároku 142, kde R² je L-valinyl.

144. Nukieosid podle nároku 138, kde R¹ je skupina vodík.

145. Nukieosid podle nároku 138, kde R¹ není skupina vodík.

146. Nukieosid podle nároku 138, kde R¹ je skupina CO-alkyl.

147. Nuleosid podle nároku 146, kde CO-alkyl je skupina CO-methyl.

148. Nukieosid podle nároku 146, kde CO-alkyl je skupina CO-propyl.

• ·

-176 149. Nukleosid podle nároku 138, kde R¹ je aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je alkylová, arylová, heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina hydrogen, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

150. Nukleosid podle nároku 149, kde R¹ je L-valinyl.

151. Nukleosid podle nároku 138, kde R¹ je skupina vodík a R² je skupina

CO-alkyl.

152. Nukleosid podle nároku 138, kde R¹ je skupina vodík a R² je L-valinyl.

153. Nukleosid podle nároku 138, kde R¹ a R² jsou nezávisle skupiny acyl.

154. Nukleosid podle nároku 138, kde R¹ a R² jsou nezávisle aminokyselinový zbytek podle vzorce C(O)C(R⁸)(R⁹)(NR¹⁰R¹¹), kde

R⁸ je postranní řetězec aminokyseliny a kde, jako v prolinu, R⁸ může být případně navázán na R¹⁰ za vzniku kruhové struktury; nebo alternativně, R⁸ je akylová, arylová heteroarylové nebo heterocyklická část;

R⁹ je skupina vodík, alkyl (zahrnující nižší alkyl) nebo aryl; a • « · · • · · ·

- 177• · · · · • ······ · • · · · • · · · * · ·

R¹⁰ a R¹¹ jsou nezávisle skupiny vodík, acyl (zahrnující acylový derivát navázaný na R⁸) nebo alkyl (zahrnující, bez omezení, skupiny methyl, ethyl, propyl a cyklopropyl).

155. Nukleosid podle nároku 154, kde R¹ a R² jsou nezávisle L-valinyl.

156. Farmaceutický prostředek pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z předcházejících nároků 1 až 154 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl polečně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

157. Farmaceutický prostředek pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z předcházejícíh nároků 1 až 154 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl v kombinaci s jedním nebo více prostředky proti viru hepatitidy B.

158. Farmaceutický prostředek podle nároku 157, vyznačující se t i m, že prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-deoxyribonukleosid.

159. Farmaceutický prostředek podle nároku 158, vyznačující se t i m, že β-L-deoxyribonukleosid je zvolen ze skupiny, sestávající z β-L-deoxyribothymidinu (β-L-dT), β-L-deoxyribocytosinu (β-L-dC), β-L-deoxyribouridinu (β-L-dU), β-L-deoxyriboadeninu (β-L-dA), β-L-deoxyriboguaninu (β-L-dG) nebo β-L-deoxyriboinosinu (β-L-dl).

160. Farmaceutický prostředek podle nároku 159, v y z n a č u j i c i se t i m, že β-L-deoxyribonukleosidem je β-L-deoxyribothymidin (β-L-dT).

- 178161. Farmaceutický prostředek podle nároku 160, v y z n a č u j í c í se t í m, že sloučeninou je 3'-val-p-L-dC a prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-dT.

162. Farmaceutický prostředek podle nároku 160, vyznačující se t í m, že sloučeninou je 3',5'-dival^-L-dC a prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-dT.

163. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeutického množství sloučeniny podle některého z předcházejících nároků 1 až 162 nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

164. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeutického množství farmaceutického prostředku, který obsahuje sloučeninu podle některého z předcházejících nároků 1 až 162 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl a farmaceuticky přijatelný nosič.

165. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeutického množství sloučeniny podle některého z předcházejících nároků 1 až 162 nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci nebo alternaci s terapeutickým množstvím jiného prostředku proti viru hepatitidy B.

166. Způsob podle nároku 165, vyznačující se tím, že prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-deoxyribonukleosid.

• 4 ··· · • · * · · « * «· • · · · · • » • » · · ·

-179167. Způsob podle nároku 166, vyznačující se tím, že β-L-deoxyribonukleosid je zvolen ze skupiny, sestávající z β-L-deoxyribothymidinu (β-L-dT), β-L-deoxyribo-cytosinu (β-L-dC), β-L-deoxyribouridunu (β-LdU), β-L-deoxyriboadeninu (β-L-dA), β-L-deoxyriboguaninu (β-L-dG) nebo β-L-deoxyribo inosinu (β-L-dl).

168. Způsob podle nároku 167, vyznačující se tím, že β-L-deoxyribonukleosidem je β-L-deoxy-ribothymidin (β-L-dT).

169. Způsob podle nároku 168, vyznačující se tím, že sloučeninou je 3'-val^-L-dC a prostředkem proti viru hepatitidy B je β-LdT.

170. Způsob podle nároku 168, vyznačující se tím, že sloučeninou je 3',5'-dival^-L-dC a prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-dT.

171. Použití nukleosidů podle některého z předcházejících nároků 1 až 162 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

172. Použití nukleosidů podle některého z předcházejících nároků 1 až 162 nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu léčiva pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

173. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle některého z předcházejících nároků 1 až 162 nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl v kombinaci s jedním nebo více prostředky proti viru hepatitidy B.

- 180 ·· » ·

174. ' Farmaceutický prostředek podle nároku 173, vyznačující se t í m, že prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-deoxyribonukleosid.

175. Farmaceutický prostředek podle nároku 174, vyznačující se t í m, že β-L-deoxyribonukleosid je zvolen ze skupiny, sestávající z β-L-deoxyribothymidinu (β-L-dT), β-L-deoxyribocytosinu (β-L-dC), β-L-deoxyribouridinu (β-L-dU), β-L-deoxyriboadeninu (β-L-dA), β-L-deoxyriboguaninu (β-L-dG) nebo β-L-deoxyriboinosinu (β-L-dl).

176. Farmaceutický prostředek podle nároku 175, vyznačující se t í m, že β-L-deoxyribonukleosidem je β-L-deoxyribothymidin (β-L-dT).

177. Farmaceutický prostředek podle nároku 176, vyznačující se t í m, že sloučeninou je 3'-val-p-L-dC a prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-dT.

178. Farmaceutický prostředek podle nároku 176, vyznačující se t í m, že sloučeninou je 3',5'-dival-p-L-dC a prostředkem proti viru hepatitidy B je β-L-dT.

179. Nukleosid podle vzorce • *

-181 « «. · 4 · · r · « « * · · · « ·« · ·»····« · ·«· · · • · ···· · · ·» · • 4 4 > 9 4 4 4 4 « 4 · · nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

180. Nukleosid podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelná sůl.

181.

Farmaceutický prostředek, vyznačující se t í m, že obsahuje sloučeninu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl v kombinaci s β-L-deoxyribothymidinem.

o ·»

- 182«»·»··» a « · * # » « • a » · · · · ··

182. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje sloučeninu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl v kombinaci s β-L-deoxyribothymidinem.

183. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeutického množství sloučeniny podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

• ·

- 183184. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce hepatitidy B, vyznačující se tím, že zahrnující podávání terapeuticého množství sloučeniny podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli.

185. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce hepatitidy B u hostitele, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání terapeutického množství sloučeniny podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli, v kombinaci nebo alternaci s terapeutickým množstvím β-L-deoxyribothymidinu.

• · • · · · • · « • · · · · • · · · · • · · ·

- 184186. Způsob léčby nebo profylaxe virové infekce heptitídy B u hostitele, vyznačující se tím, že zahrnující podávání terapeutického množství sloučeniny podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli, v kombinaci nebo alternaci s terapeutickým množstvím β-L-deoxyribothymidinu.

187. Použití nukleosidu podle vzorce γ nh₂ nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

• · • · · ·

- 185188. Použití nukleosidu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

189. Použití nukleosidu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci nebo alternaci s terapeutickým množstvím β-L-deoxyribothymidinu pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

- 186190. Použití nukleosidu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci nebo alternaci s terapeutickým množstvím β-L-deoxyribothymidinu pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

191. Použití nukleosidu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli při výrobě léčiva pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hositele.

-187 192. Použití nukleosidů podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu léčiva pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

193. Použití nukleosidů podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci s terapeutickým množstvím β-L-deoxyribothymidinu pro výrobu léčiva pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

-188194. Použití nukleosidu podle vzorce nebo její farmaceuticky přijatelné soli v kombinaci nebo alternaci s terapeutickým množstvím β-L-deoxyribothymidinu pro výrobu léčiva pro léčbu nebo profylaxi virové infekce hepatitidy B u hostitele.

Zastupuje;

PVJ.6Z)· /2 2.

1/13

1.

«η* ra xt

O