EA005163B1 - СПОСОБЫ КРУПНОМАСШТАБНОГО ПРОИЗВОДСТВА ВЫВЕДЕННЫХ ИЗ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК МОЛЕКУЛ tPA ИЛИ K2S - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к области тромбоза и получению производных тканевого активатора плазминогена (tPA) в прокариотических клетках. В патенте описаны также способы получения выведенного из рекомбинантной ДНК tPA, его варианта или молекулы, несущей «кренделеобразный» домен 2 и домен сериновой протеазы (K2S), или ее варианта в прокариотических клетках, где tPA или K2S или вариант секретируются внеклеточно в виде активного протеина с правильной складчатостью, и прокариотическая клетка содержит и экспрессирует вектор, который содержит ДНК, кодирующую tPA или K2S или вариант, фукционально связанную с ДНК, которая кодирует сигнальный пептид OmpA. Изобретение относится также к некоторым производным K2S, получаемым с помощью указанного способа. Изобретение относится также у указанным молекулам ДНК и к применению молекул ДНК согласно указанным способам.

Description

Изобретение относится к тромболизу и получению производного тканевого активатора плазминогена (ΐΡΑ) в прокариотических клетках.

Изобретение относится к способам получения выведенных из рекомбинантной ДНК тканевого активатора плазминогена (ΐΡΑ), его варианта, молекулы К28 (несущей «кренделеобразный» домен 2 и сериновый домен) (К28) или ее варианта в прокариотических клетках, где ΐΡΑ или К28 или вариант секретируются внеклеточно в виде активного протеина с правильной складчатостью, и прокариотическая клетка содержит и экспрессирует вектор, который несет ДНК, кодирующую ΐΡΑ или К28 или вариант, которая функционально связана с ДНК, кодирующей сигнальный пептид ОтрА.

Изобретение относится также к специфическим производным К28. которые можно получать указанным способом. Кроме того, изобретение относится к молекулам ДНК и к применению этих молекул ДНК согласно указанным способам.

Предпосылки создания изобретения

Тканевый активатор плазминогена (ΐΡΑ) представляет собой полипептид, содержащий 527 аминокислотных остатков (27), молекулярная масса которого составляет 72 кДа. Молекула содержит 5 структурных доменов. Вблизи Νконцевой области расположен образующий петлю «пальцеобразный» («йидег») домен, за которым расположен домен фактора роста. За ними находятся два аналогичных домена «кренделеобразный» домен 1(«кгшд1е 1») и «кренделеобразный» домен 2 («кгшд1е 2»). Как «пальцеобразный» домен, так и «кренделеобразный» домен 2, специфично связываются с фибриновыми сгустками, усиливая тем самым активацию связанного плазминогена протеином ΐΡΑ. Далее по ходу транскрипции относительно «кренделеобразного» домена 2 расположена сериновая протеаза, каталитический сайт которой локализован на С-конце. Сериновая протеаза ответственна за превращение плазминогена в плазмин, т. е. за реакцию, играющую важную роль в гомеостазе образования фибрина и рассасывания сгустка. Для правильной складчатости ΐΡΑ необходимо правильное спаривание 17 дисульфидных мостиков в молекуле (1).

В клинических условиях ΐΡΑ используют в качестве тромболитического агента для лечения острого инфаркта миокарда, легочной эмболии, «удара», периферических артериальных окклюзии и других тромбоэмболических заболеваний. Его преимуществом является отсутствие побочных воздействий, связанных с системным кровотечением и истощением фибриногена (7).

Первоначально для получения ΐΡΑ в терапевтических целях использовали клетки бычьей меланомы (12). Поскольку для клинических целей необходимо иметь стабильный процесс, обеспечивающий эффективное получение высо коочищенного протеина с достаточным выходом, была создана полноразмерная рекомбинантная молекула ΐΡΑ (г-ΐΡΑ), экспрессирующаяся в клетках млекопитающих. Клетки яичника китайского хомячка трансфектировали геном ΐΡΑ для 8синтеза г-ΐΡΑ (8, 22). Выведенный из рекомбинантной ДНК продукт, полученный с помощью ферментационной системы с использованием культур клеток млекопитающих, собирали и очищали от культуральной среды. Принимая во внимание простоту и экономичность производства, были предприняты многочисленные попытки получения г-ΐΡΑ из микроорганизмов, прежде всего из бактерий, и более предпочтительно из ЕксйепсЫа со11 (10, 13, 30). Для решения проблем, связанных с низким выходом и образованием внутриклеточных телец, что приводило к неправильной складчатости и инактивации фермента, был предложен целый ряд стратегий.

Было предложено несколько вариантов делеционных мутантов, содержащих «кренделеобразный» домен 2 и сериновую протеазу (К28). Однако проявление ферментативной активности рекомбинантной молекулы К28 (г-К28) достигалось только после процессов повторного образования складчатости выделенных из цитоплазматического компартмента внутриклеточных телец (16, 29). Для того, чтобы избежать сложности процессов повторного образования складчатости, загрязненности протеинами с неправильной складчатостью и переноса протеинов в периплазму, применяли специальные бактериальные системы экспрессии (6, 31). Несмотря на периплазматическую экспрессию ΐΡΑ, сверхэкспрессия приводила к получению неактивных агрегатов даже в условиях относительно высокого окисления в периплазме.

Из прототипов известно несколько описаний методов получения рекомбинантной молекулы К28 в Е. сой. Однако отсутствует описание метода, обеспечивающего эффективное с точки зрения стоимости крупномасштабное производство биологически активной молекулы К28.

У ОЬико\\'1сх с соавторами (25) предложен метод экспрессии и очистки г-К28 из периплазматического пространства. Очевидным недостатком этого метода является дополнительная стадия экстракции из периплазмы, непригодная для крупномасштабного производства.

У 8айо с соавторами (29) описана экспрессия г-К28 в цитоплазме. Для экспрессии молекулы г-К28, которую выделяли из цитоплазматического пространства Е. со11 в виде внутриклеточного тельца, авторы использовали процессы ренатурации ίη угьо. Исследователи фирмы Воейпидег Маппйеип применяли аналогичный сложный процесс денатурации/повторного образования складчатости, включающий стадии расщепления клеток, солюбилизации в денатурирующих и восстанавливающих условиях и реактивации в окислительных условиях в присутствии С8Н/О88О (восстановленный глутатион/окисленный глутатион), который является не эффективным с точки зрения стоимости (24) и для которого необходима мутация аминокислотной последовательности, что может сопровождаться появлением антигенных свойств.

В 1991 г. \Уа1бсп51гот с соавторами (34) сконструировали вектор (ρΕΖΖΚ2Ρ) для секреции конструкции «кренделеобразный» домен 2 плюс домен сериновой протеазы в супернатант культуры Е.со11. Для удаления слитого протеина ΖΖ из очищенной с помощью ЦС-Сефарозы фракции использовали гидроксиламин. Для расщепляющего агента гидрокисламина необходима модификация сайтов расщепления конструкции «кренделеобразный» домен 2 плюс сериновая протеаза (Лкп¹⁷⁷-> 8ет и Лкп¹⁸⁴-> Οίη). обеспечивающая защиту ее от расщепления гидроксиламином. Однако полученную в результате этого не встречающуюся в естественных условиях молекулу Κ28 с неправильной складчатостью нельзя применять для терапевтических целей. Она не обладает ферментативной активностью в отношении связывания фибрина/протеазной активностью. Не встречающаяся в естественных условиях последовательность может даже активировать человеческую иммунную систему.

Таким образом, в основу настоящего изобретения была положена задача разработать приемлемый с коммерческой точки зрения способ крупномасштабного производства молекул ΐΡΑ и их производных, например, Κ28, который предусматривает секрецию молекулы Κ28 в биологически активной форме в супернатант культуры.

Подробное описание изобретения

Пути решения поставленной задачи представлены в формуле и описании настоящего изобретения.

Изобретение не ограничено применением одного или нескольких пунктов формулы изобретения или описания, а включает также их модификации. Изобретение относится к способу получения выведенных из рекомбинантной ДНК тканевого активатора плазминогена (ΐΡΑ), варианта ΐΡΑ, молекулы, содержащей «кренделеобразный» домен 2 и домен сериновой протеазы (Κ28), или варианта Κ28 в прокариотических клетках, где ΐΡΑ, вариант ΐΡΑ, молекула Κ28 или вариант Κ28 секретируются внеклеточно в виде активного протеина с правильной складчатостью, и прокариотическая клетка содержит и экспрессирует вектор, который несет ДНК, кодирующую ΐΡΑ вариант ΐΡΑ, молекулу Κ28 или вариант Κ28, функционально связанную с ДНК, которая кодирует сигнальный пептид ОтрА или его функционально активное производное.

При создании изобретения неожиданно было установлено, что сигнальный пептид ОтрА индивидуально и/или в сочетании с Ν’ концевыми аминокислотами 8ΕΟΝ (8ΕΟ ΙΌ N0:9)/ 8ΕΟΝ8Ό (8 НО ΙΌ N0: 10) переносит выведенные из рекомбинантной ДНК ΐΡΑ, вариант ΐΡΑ, молекулу Κ28 или вариант Κ28 к внешней поверхности и облегчает высвобождение функциональной и активной молекулы в культуральную среду в большей степени, чем это достигается при использовании любого другого известного из существующего уровня техники метода. Согласно способу по изобретению перед пересечением наружной мембраны выведенный из рекомбинантной ДНК протеин приобретает правильную складчатость. Сигнальный пептид отщепляется, образуя зрелую молекулу. Неожиданно было установлено, что эффективность удаления сигнального пептида является очень высокой и приводит к правильной складчатости выведенного из рекомбинантной ДНК протеина.

Сигнальный пептид ОтрА взаимодействует с 8есΕ и его перенос через внутреннюю мембрану осуществляется с помощью энергии, которая генерируется 8есΑ при связывании с компонентами 8ес (8есΕ-8есΥ).8есΥ образует поры для секреции, предназначенные для переноса выведенного из рекомбинантной ДНК протеина по изобретению. Пространство между наружной мембраной и внутренней мембраной грамотрицательных бактерий, т.е. периплазма, обладает более высокими окислительными условиями по сравнению с цитоплазматическим пространством. Это способствует образованию дисульфидных мостиков и правильной складчатости выведенного из рекомбинантной ДНК протеина (например, Κ28) в периплазме, что приводит к получению активной молекулы. Согласно настоящему изобретению сигнальный пептид должен отщепляться с образованием зрелой молекулы. Комплекс, включающий секретин ΟκρΌ и липопротеин Οκρδ на наружной мембране служит в качестве воротного механизма ионного канала для секреции выведенного из рекомбинантной ДНК протеина по изобретению во внеклеточную среду. Для этого процесса секреции требуется энергия которая образуется в цитоплазме с помощью связывающего нуклеотид ΟκρΕ протеина, и затем переносится на протеин внутренней мембраны (Οκρ 0-1, Е и Κ-Ν). ΟκρΟ переносит энергию на ΟκρΌ путем образования поперечной связи между рядом протеинов внутренней мембраны (Οκρ 0-1, Е и Κ-Ν) и ΟκρΌ. Перед успешным пересечением наружной мембраны выведенный из рекомбинантной ДНК протеин приобретает правильную складчатость.

Согласно изобретению понятие «функционально связанный» обозначает, что ДНК, кодирующую ΐΡΑ, вариант ΐΡΑ, молекулу Κ28 или вариант Κ28 (предпочтительно содержащую нуклеиновую кислоту, которая кодирует 8ΕΟΝ или 8ΕΟΝ8Ό на Ν-конце), клонируют в векторе в непосредственной близости с ДНК ОтρА для достижения экспрессии слитого протеина ОтρА и ίΡΆ, варианта ΐΡΆ, молекулы К28 или варианта К28п и для направления секреции наружу из прокариотической клетки-хозяина. Как правило, секретируется большая часть ίΡΆ, вариантов ΐΡΆ, молекул К28 или вариантов К28, и их можно затем очищать с помощью приемлемых методов, таких как осаждение сульфатом аммония и/или аффинная хроматография, и с помощью дополнительных стадий очистки. Под объем изобретения подпадает также применение индукторов, таких как ИПТГ (изопропилтиогалактозид) или ИПТГ в сочетании с глицерином, улучшение условий инкубации и периода сбора с целью максимального повышения количества активного протеина.

Согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения ДНК, кодирующую сигнальный пептид ОтрА, можно сливать с коротким пептидом, который отличается наличием аминокислотной последовательности 8ΕΟΝ или 8ΕΟΝ8Ό кодирующей нуклеотидной последовательности ТСТСАСССАААС(8Ер ГО N0:20) или ТСТСАСССАААСАСТСАС (8ΕΟ ГО N0:1), и локализован в Ν-концевой области или вблизи Ν-концевой области ίΡА, варианта ίΡА, молекулы К28 или варианта К28. Так, предпочтительно этот слитый протеин содержит 0ιηρΛ-8Ε0Ν80-ΐΡΛ. -ΐΡΛ-вариант. -К28МопеКупа или -К28-ВариаНТ.

Еще более предпочтительно эти аминокислотные последовательности, характеризующиеся наличием 8ΕΟΝ или 8ΕΟΝ8Ό, могут иметь точковую мутацию или могут быть заменены на не встречающиеся в естественных условиях аминокислоты. И еще более предпочтительно между ОтрА и 8ΕΟΝ или 8ΕΟΝ8Ό и ίΡА, вариантом ίΡА, молекулой К28 или вариантом К28 может находиться аминокислотный или неаминокислотный спейсер.

Таким образом, согласно предпочтительному способу по изобретению прокариотическая клетка содержит и экспрессирует вектор, содержащий ДНК, которая кодирует ίΡА, вариант ίΡА, молекулу К28 или вариант К28, функционально связанный с ДНК, которая кодирует сигнальный пептид 0трА, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, которая имеет последовательность

ТСТСАСССАААСАСТСАС, или с ее функционально активным производным.

Способ по изобретение предусматривает применение прокариотических клеток-хозяев, таких как (но не ограничиваясь ими) Εδε^ήεΗία соб (Ε. сой). ВасШиз зиЫбйз, 8!гер!отусез, Ρзеиботопаз, например, Ρзеиботоηаз рибба, Ρ^оίеиз тиаЫШз, 8ассйаготусез, ΡΚΙιίη или 8ίарйу1ососсиз, например, 8!арйу1ососсиз сагиозиз. Предпочтительно клетка-хозяин по изобретению представляет собой грамотрицательную бактерию.

Предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что прокариотическая клетка представляет собой Ε. сой. Пригодные штаммы включают (но не ограничиваясь ими) штаммы Ε. сой ХЬ-1 Ыие, ΒΕ21(ΌΕ3), 1М109, ΌΗ-серии, ТОРЮ и НВ101.

Предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что осуществляют следующие стадии:

а) амплифицируют с помощью ПЦР ДНК, кодирующую ίΡА, вариант ίΡА, молекулу К28 или вариант К28;

б) очищают ПЦР-продукт;

в) встраивают указанный ПЦР-продукт в вектор, содержащий ДНК, которая кодирует сигнальный пептид 0трА, и ДНК, которая кодирует дрШ, таким образом, чтобы ПЦРпродукт в этом векторе был функционально связан против хода транскрипции с ДНК, кодирующей сигнальную последовательность 0трА, и связан по ходу транскриции с ДНК, кодирующей дрШ;

г) встраивают стоп-кодон между ίΡА, вариантом ίΡА, молекулой К28 или вариантом К28 и дрШ;

д) экспрессируют вектор с помощью прокариотической клетки;

е) очищают ίΡА, вариант ίΡА, молекулу К28 или вариант К28. При осуществлении стадии а) способа по изобретению выбор/создание праймеров является важным для клонирования в экспрессионном векторе ДНК в правильной локализации и направлении (см. пример 1). Так, праймеры, которые приведены в качестве примера в примере 1 и на фиг. 4, являются важным объектом настоящего изобретения. Указанный на стадии в) др III, т.е. ген протеина III, представляет собой ген, который присутствует главным образом в фагмидных векторах. Стопкодон встраивают для того, чтобы избежать транскрипции др III, что в конце концов приводит к секреции представляющего интерес ίΡА, варианта ίΡА, молекулы К28 или варианта К28. Для встраивания стоп-кодона можно применять любой пригодный метод, такой как сайтнаправленный мутагенез (см., например, у Аешег ΜΡ, Соз!а СЬ (1994) ЕСЕ Ме!йобз Арр1 4(3):8131136; Аешег ΜΡ, Созίа СЬ, 8сйоеб1ш А, С1ше I, МаШиг Ε, ВаиеНС (1994) Сепе 151(1-2): 119123; см. также пример 1).

Согласно изобретению можно применять любой вектор, предпочтительно вектор представляет собой фагмидный вектор (см. ниже).

Предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что ίΡА, вариант ίΡА, молекулу К28 или вариант К28 выбирают из ряда, включающего человеческий тканевый активатор плазминогена ^А, фиг. 16) или его фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединицу, химическое производное, слитый протеин или их гликозилированные варианты. Такие фрагменты, аллельные варианты, функционально активные варианты, варианты, полученные благодаря вы005163 рожденности нуклеотидного кода, слитые протеины с протеином ίΡΆ по изобретению, химические производные или гликозилированный вариант протеинов ίΡΆ по изобретению могут содержать один, несколько или все перечисленные ниже домены или субъединицы или варианты:

1. «Пальцеобразный» домен (4-50).

2. Домен фактора роста (50-87).

3. «Кренделеобразный» домен 1 (87-176).

4. «Кренделеобразный» домен 2 (176-262).

5. Протеазный домен (276-527).

Нумерация/название доменов соответствует нумерации/названию, приведенным для протеина, имеющего регистрационный номер СепЬаик С1 137119, или они описаны в №1Шге 301 (5897), 214-221 (1983).

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что 5 ίΡΑ, вариант ίΡΑ, молекулу К28 или вариант К28 выбирают из ряда, включающего «Кренделеобразный» домен 2 (4.) плюс домен сериновой протеазы (5.), вариант К28 человеческого тканевого активатора плазминогена или его фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединицу, химическое производное, слитый протеин или их гликозилированные варианты.

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что вектор представляет собой фагмидный вектор, содержащий ДНК, которая кодирует сигнальный пептид ОтрА, и ДНК, которая кодирует др111.

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что вектор представляет собой фагмидный вектор рСотЬ3Н88 (см. также пример 1).

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что последовательность ДНК содержит или представляет собой приведенную ниже последовательность ДНК, которая кодирует ОтрА и К28 или ее функционально активный вариант или вариант, полученный благодаря вырожденности нуклеотидного кода:

АТОАААААОАСАССТАТСОСОАТТОСАОТООСАСТООСТСОТТТСССТАССО ТООСССАООСОаССТСТОАОООАААСАОТОАСТССТАСТТТОООААТООбТС АСССТАССОТООСАСССАСАОССТСАССОАОТС6СОТОССТССТОССТСССО ТООААТТССАТОАТССТОАТАООСААООТТТАСАСАОСАСАОААССССАСТО СССАООСАСТОООССТОООСАААСАТААТТАСТОССООААТССТОАТ6ССО АТОССААССССТООТбССАСОТбСТСААОААССОСАООСТСАССТаООАОТ АСТ6Т0АТ0Т0СССТССТ0СТССАССТ0С00ССТСА0АСА0ТАСА0ССА6СС ТСАОТТТСССАТСАААООАаООСТСТТССССОАСАТСОССТСССАССССТОО СА6ССТСССАТСТТТОССААОСАСАООАОСТСОСССООАОАОСООТТССТОТ ОСОаОООСАТАСТСАТСАССТССТОСТССАТТСТСТСТСССОСССАСТОСТТС САООАОАООТТТССОССССАССАССТОАССОТОАТСТТСОССАОААСАТАСС ОСОТООТСССТООССАООАОСАОСАОАААТТТОААОТССАААААТАСАТТО ТССАТААООААТТСОАТОАТОАСАСТТАСОАСААТОАСАТТОСССТОСТОСА ОСТОАААТСООАТТСОТСССОСТОТОСССАООАОАОСАССОТбОТССОСАСТ СТОТСССТТССССССОСООАССТССАОСТОССООАСТСОАССОАаТСТОАОС ТСТСССССТАССОСААОСАТСАСбССТТаТСТССТТТСТАТТСаОАбССбСТ СААССАСССТСАТ0ТСА0АСТ6ТАСССАТССА0СС0СТ0САСАТСАСААСАТ ТТАСТТААСАОААСАОТСАССОАСААСАТОСТОТСТОСТССАОАСАСТСООА СССССОООССССАООСАААСТТОСАСОАСОССТОССАОООСОАТТСОООА6 ССССССТ00ТСТ0ТСТ0ААС0АТ00СС0САТ0АСТТТС0Т060САТСАТСАС СТООСОССТССОСТОТО6АСАОААССАТ0ТССС6ОСТ0ТОТАСАСАААС6Т ТАССААСТАССТА6АСТ0САТТС0Т0АСААСАТ0ССАСС0 (8Е0 ГО N0:2)

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что последова тельность ДНК ОтрА содержит или представляет собой приведенную ниже последовательность или ее функционально активный вариант или вариант, полученный благодаря вырожденности нуклеотидного кода: АТСАААААСАСАССТАТССССАТТССАСТ СССАСТСССТССТТТСССТАСССТСССССА ССССССС (8ЕО ГО N0:3).

Указанная ДНК кодирует приведенную ниже аминокислотную последовательность ОтрА. Таким образом, ОтрА содержит или представляет собой протеин, который отличается тем, что приведенная ниже аминокислотная последовательность МККТА1А1АУАЬАСЕАТУАЦАА (8ЕЦ ГО NО:21) или ее фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединица, химическое производное или гликозилированный вариант подпадают под объем изобретения.

Нетранслируемая область может содержать регуляторный элемент, такой, например, как инициатор транскрипции (промотор) или энхансер. Промотор может, например, представлять собой конститутивный, индуцибельный или контролируемый стадией развития промотор. Предпочтительно (но не исключая другие известные промоторы) используют конститутивные промоторы человеческого цитомегаловируса (ЦМВ) и вируса саркомы Рауса (РСВ), а также обезьянего вируса 40 (ОВ-40) и промотор вируса герпеса простого. Согласно изобретению индуцибельные промоторы представляют собой промоторы, обеспечивающие устойчивость к антибиотикам, промоторы, индуцируемые тепловым шоком, индуцируемый гормонами «промотор вируса рака молочной железы» и промотор металлотионеина. Предпочтительные промоторы включают промотор фага Т3, промотор фагаТ7, Ьае/ага1 и ИеЮ-1.

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что ДНК, кодирующую ίΡΑ, вариант ίΡΑ, молекулу К28 или вариант К28, помещают под контроль промотора 1ас и/или сайта связывания рибосомы, такого как последовательность Шайна-Дальгарно (см. также пример).

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что ДНК, кодирующую ίΡΑ, вариант ίΡΑ, молекулу К28 или вариант К28, выбирают из группы молекул ДНК, кодирующих по меньшей мере 90% аминокислот 87-527, 174 - 527, 180 - 527 или 220 527 протеина человеческого тканевого активатора плазминогена.

Более предпочтительно способ по изобретению отличается также тем, что последовательность ДНК К28 содержит или представляет собой следующую последовательность:

ТСТбАОООАААСАОТОАСТОСТАСТТТОаОААТбОСТСАСССТАСССТОССА СОСАСАОССТСАССОА6ТСОООТОССТССТОССТСССОТООААТТССАТОАТ ССТОАТАООСААООТТТАСАСАОСАСАСААССССАОТССССАОбСАСТООО ССТ6С0СААЛСА ААТТАСТ6ССООААТССТСАТООООАТОССААОСССТСО ТСССАСОТОСТОААОААССОСАООСТОАСОТСОСАСТАСТОТОАТОТССССТ ССТССТССАССТОСОСССТОАОАСАОТАСАОССАОССТСАСТТТС6САТСАА АООАОООСТСТТСОССОАСАТСОССТСССАССССТООСАООСТОССАТСТТТ ОССААОСАСАООАОСТСОСССООАОАОСООТТССТОТОСОООООСАТАСТС АТСАССТССТОСТООАТТСТСТСТОССОСССАСТОСТТССАОСАОАООТТТСС СССССАССАССТОАСООТОАТСТТООССАОААСАТАССОООТООТСССТООС ОАООАООАОСАаАААТТТОААОТСОАААААТАСАТТОТССАТААОСААТТС 6АТОАТОАСАСТТАССАСААТОАСАТТОСОСТОСТОСАССТСАААТСООАТТ СОТСССОСТОТОСССАООАОАОСАОСОТООТССОСАСТОТОТСССТТССССС ОССООАССТССАОСТОССООАСТООАС6<ЗАСТСТОАОСТСТСССОСТАСОО СААОСАТОАбОССТТОТСТССТТТСТАТТСООАОСООСТОААОСАООСТСАТ ОТСА6АСТСТАСССАТССАОСС6СТОСАСАТСАСААСАТТТАСТТААСАОАА САОТСАСС6АСААСАТОСТОТОТОСТООАОАСАСТСООАОСООССОССССС АООСАААСТТОСАСОАС6ССТОССАОООС6АТТСОООАС6СССССТООТОТ СТСТбААСОАТОаССОСАТСАСТТТООТОООСАТСАТСАССТССООССТбОО СТОТОСАСАСААОСАТОТССССОСТОТСТАСАСАААООТТАССААСТАССТА САСТ6ОАТТСОТСАСААСАТОСОАССОТОА (8ЕЦ Ю N0:4).

Настоящее изобретение относится также к вариантам описанных выше молекул нуклеиновых кислот, полученным благодаря вырожденности нуклеотидного кода, или их фрагментам, к нуклеиновым кислотам, которые гибридизуются с указанными нуклеиновыми кислотами в строгих условиях, к их аллельным и функционально активным вариантам. Изобретение относится также к нуклеиновым кислотам, которые содержат нуклеиновую кислоту К28, слитую с нуклеиновой кислотой, кодирующей молекулу другого протеина.

Строгие условия, как должно быть очевидно специалистам в данной области, представляют собой условия, которые позволяют отбирать нуклеиновые кислоты, гомологичные более чем на 85%, предпочтительно более чем на 90% (8атЬтоок и др., 1989; Мо1еси1аг С1ошид: А ЬаЬота1оту Мапиа1, 2-ое изд., Со1б 8рпид НагЬог ЬаЬогаЮгу Ргекк, Со1б 8рпид НагЬог, Иете Уогк).

Гибридизацию следует осуществлять, например, в смеси: 6х 88С/5х раствор Денхардта/0,1% ДСН (ДСН обозначает додецилсульфат натрия) при 65°С. Степень строгости определяется на стадии отмывки. Так, например, для отбора последовательностей ДНК, гомология которых составляет примерно 85% или более, пригодны следующие условия: 0,2 х 88С/0,01% ДСН/65°С, а для отбора последовательностей ДНК, гомология которых составляет примерно 90% или более, пригодны следующие условия: 0,1х 88С/ 0,01% ДСН/ 65°С. Состав указанных реагентов описан у 8атЬтоок и др. (1989, выше).

Другим важным объектом настоящего изобретения является вариант человеческого тканевого активатора плазминогена, содержащий или представляющий собой протеин: «кренделеобразный» домен 2 (4.) плюс сериновая протеаза (5.) (сокращенно К28) или его вариант или фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединица, химическое производное или их гликозилированные варианты.

Нумерация/название доменов соответствует нумерации/названию, приведенным для протеина, имеющего регистрационный номер Сеи

Ьаик С1 137119, или они описаны в №11иге 301 (5897), 214-221 (1983), причем «кренделеобразный» домен 2 простирается от аминокислоты 176 до 262, а протеазный домен от аминокислоты 276 до 527. Таким образом, согласно изобретению предпочтительная молекула К28 может содержать аминокислоты 176-527, включая аминокислоты между «кренделеобразным» доменом 2 и доменом протеазы (аминокислоты 263 - 275; см. пример, приведенный на чертеже (структура А)). Молекула К28 по изобретению содержит минимальный фрагмент «кренделеобразного» домена 2 и домен протеазы, еще сохраняющий протеазную активность и активность в отношении связывания с фибрином (указанные активности оценивали, например, согласно методам, приведенным в описании/примерах). Молекула К28 по изобретению содержит аминокислоты 8ЕСИ или 8ЕСИ8О на Ν-конце (см. выше).Предпочтительная молекула А не содержит аминокислоты 1-3 или 1-5 молекулы 1РА. Предпочтительно молекула К28 по изобретению содержит аминокислоту Аки в положениях 177 и 184, т.е. для не требуются описанные у \Уа1бепк1гот модификации для улучшения продуктивности согласно способу по изобретению. Таким образом, предпочтительная молекула К28 по изобретению имеет нативную аминокислотную последовательность (без мутации) в отличие от известных из прототипов молекул. Наиболее предпочтительная молекула К28 по изобретению представляет собой молекулу, которая отличается наличием нативной аминокислотной последовательности или ее фрагмента, не содержит ни аминокислот 1-3, ни 1-5 1РА и содержит Ν-концевые аминокислоты 8ЕСN или 8ЕС№И для улучшения продуктивности и/или правильной складчатости молекулы.

Важно, что протеин К28 по изобретению содержит на Ν-конце пептид, имеющий аминокислотную последовательность 8ЕСН что позволяет осуществлять промышленное производство с помощью описанного выше способа секретируемого протеина К28 с правильной складчатостью. Указанные 4 аминокислоты, обозначенные как 8ЕСН могут содержать на Ν-конце еще одну или несколько аминокислот, однако указанные аминокислоты должны быть локализованы в Ν-концевой области, а не в С-концевой области. Более предпочтительно указанные аминокислоты локализованы в Ν-концевой области. Предпочтительно аминокислоты, обозначенные как 8ЕСН могут нести точковую мутацию или могут иметь замены на не встречающуюся в естественных условиях аминокислоты.

Таким образом, еще одним важным объектом изобретения является протеин К28, отличающийся тем, что он содержит аминокислоты, последовательность которых обозначена как 8ЕСН или его вариант или фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединица, химическое производное, слитый протеин или их гликозилированные варианты.

Примеры таких фрагментов, простирающихся от аминокислоты 193 до аминокислоты 527 приведены, например, на фиг. 10 (структура Б-1) и на фиг. 11 (структура Б-2). В структуре Б1 присутствует нативная аминокислота Сук в положении 261, а в структуре Б-2 эта аминокислота заменена 8ег. Другие фрагменты по изобретению, включающие аминокислоты 220-527 (фиг. 14, структура В) или аминокислоты 260527 (фиг. 15, структура Г), можно модифицировать согласно изобретению путем добавления аминокислот 8ΕΟΝ и/или замены Сук-261 на 8ег. Специалист в данной области может определить минимальную длину молекулы К28 по изобретению, необходимую для сохранения ее биологической функции, и получить молекулу К28, обладающую повышенной продуктивностью и/или правильной складчатостью, путем добавления аминокислот 8ΕΟΝ в Ν-концевую область. Таким образом, еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения является указанная минимальная по размеру молекула К28, несущая 8ΕΟΝ в Ν-концевой области.

Следующим важным объектом изобретения является протеин К28, отличающийся тем, что он содержит аминокислоты, последовательность которых обозначена как 8ΕΟΝ8Ό, или его вариант или фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединицу, химическое производное, слитый протеин или их гликозилированные варианты. Примеры таких фрагментов, простирающихся от аминокислоты 191 до аминокислоты 527 приведены, например, на фиг. 12 (структура Б-3) и на фиг. 13 (структура Б-4). В структуре Б-3 присутствует нативная аминокислота Сук в положении 261, а в структуре Б-4 эта аминокислота заменена 8ег. Другие фрагменты по изобретению, включающие аминокислоты 220-527 (фиг. 14, структура В) или аминокислоты 260-527 (фиг. 15, структура Г), можно модифицировать согласно изобретению путем добавления аминокислот 8ΕΟΝ8Ό и/или замены Сук-261 на 8ег. Специалист в данной области может определить минимальную длину молекулы К28 по изобретению, необходимую для сохранения ее биологической функции, и получить молекулу К28, обладающую повышенной продуктивностью и/или правильной складчатостью, путем добавления аминокислот 8ΕΟΝ8Ό в Ν-концевую область. Таким образом, еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения является указанная минимальная по размеру молекула К28, несущая 8ΕΟΝ8Ό в Ν-концевой области.

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является протеин К28, который содержит протеин, отличающийся наличием следующей аминокислотной последовательности или ее варианта или фрагмента, функционально активного варианта, аллельного варианта, субъединицы, химического производного или гликозилированного варианта:

δΕαΝδϋεΥΡΟΝΟδΑΥΚΟΤΗδΕΤΕδΟΑδΟίΡνΝδΜΙΕΙΟΚνΥΤΑΟΝΡδΑΟΑΕΟΕΟ ΚΗΝΥΟΚΝΡΟΟΟΑΚΡίνΕΗνΕΚΝΚΚΕΤΧνΕΥΟΟνΡδΰδΤΟΟΕΚΟΥδΡΡΟΕΚΙΚΟΟΕ ΡΑΟΙΑδΗΡίνΟΑΑΙΡΑΚΗΚΚδΡΟΕΚΡΕΟΟΟΙΕΙδδείνίΕδΑΑΗΟΡΟΕΚΡΡΡΗΗΕΤνΐ ΕσΚΤΥΚννΡΟΕΕΕ(}ΚΓΕνΕΚΥΐνΗΚ.ΕΓΟΟΟΤΥ0ΝΟΙΑΕΕ(2ΕΚ.8ΟδδΚ.εΑ9Ε88ν νΚΤνΟΕΡΡΑΟΕΟΕΡΟίνΤΕΰΕΕδΟΥΟΚΗΕΑΕδΡΡΥδΕΚΕΚΕΑΗνΚΕΥΡδδΚΟΤδς ΗΕΕΝΚΤνΤΟΝΜΕΟΑΟΟΤΚδΟΟΡρΑΝΕΗΟΑΟρΟΟδσΟΡΕνΟΕΝΟΟΚΜΤΕνΟΙΙδ ΨΟΕΟΟΟρΚΟνΡΟνΥΤΚνΤΝΥΕΟννίΚΟΝΜΚΡ* (8Ε0 ΙϋΝΟ: 11).

В настоящем описании звездочкой (*) обозначен 8ΤΘΡ (т.е. кодируемая стоп-кодоном аминокислота). Пример этой молекулы К28 приведен на фиг. 8.

Одним из вариантов молекулы К28 по изобретению является слитый протеин К28, который слит с молекулой другого протеина.

Следующим предпочтительным вариантом осуществления настоящего изобретения является протеин К28, представляющий собой протеин, который имеет следующую аминокислотную последовательность: δΕσΝ8ϋΟΥΡΟΝ68ΑΥΚΟΤΗ8ΕΤΕ8ΟΑ8ΟΕΡνΝδΜΙΕΙΟΚνΥΤΑ0ΝΡ8Α0ΑΕΟΕΟ ΚΗΝΥΟΚΝΡΟΟΟΑΚΡΧνθΗνΕΚΝΚ.Κ.ΕΤλνΕΥ€θνΡ8€8Τ€ΟΕΚ9Υ8ρΡρΡΚ.ΙΚΟΟΕ РАО1А8НРХ¥0АА1РАКНК.К8РОЕЕРЕСаО1Е188С^1Е8ААНСГ0ЕК.РРРННЕТУ1 ΕΟΚΤΥΚννΡΟΕΕΕρΚΡΕνΕΚΥΐνΗΚΕΡΟΟΡΤΥΟΝΟΙΑΕΕρΕΚδϋδδΚΟΑΟΕδδν УКТУСЕРРАОЕСЕРО^ТЕСЕЕ80УОКНЕАЕ8РРУ8ЕКЕКЕАНУКЕУР88КСТ80 ΗΕΕΝΚΤνΤΟΝΜΕεΑΟΌΤΚ.8ΟΟΡ0ΑΝΕΗΒΑθρθΠ8ΟΟΡΕν0ΕΝΟΟΚ.ΜΤΕνθΙΙ8 ν/ΟΕΟΟΟΟΚΟνΡΟνΥΤΚνΤΝΥΕϋνίΚΟΝΜΚΡ· (8Ε<> Ю ΝΟ: 11).

Указанные молекулы К28 могут кодироваться описанной выше молекулой ДНК.

Еще одним важным объектом изобретения является молекула ДНК, отличающаяся тем, что она кодирует:

а) протеин ОтрА или его функционально активное производное, функционально связанные с

б) молекулой ДНК, которая кодирует полипептид, содержащий «кренделеобразный» домен 2 и домен сериновой протеазы протеина тканевого активатора плазминогена.

Более предпочтительно молекула ДНК по изобретению отличается также тем, что последовательность ДНК содержит или представляет собой приведенную ниже последовательность ДНК, кодирующую ОтрА и К28, или ее функционально активный вариант или вариант, полученный вследствие вырожденности нуклеотидного кода:

АТОЛА АААОАСАОСТАТСОССАТТ6САОТООСАСТ6ССТ06ТТТСОСТАСС6

ТООСССАбОСОСССТСТОАСООАААСАОТОАСТОСТАСТТТОООААТОООТС АОССТАССОТСОСАСССАСАОССТСАССОАОТСОООТОССТССТСССТСССО ТСОААТТССАТОАТССТОАТАОССААООТТТАСАСАССАСАОААССССАОТО СССАООСАСТОООССТОООСАААСАТААТТАСТССССаААТССТОАТаООа АТОССААОСССТООТСССАСОТОСТСААОААССССАООСТ6АСОТОООАОТ АСТОТОАТОТОСССТССТОСТССАССТОСООССТОАОАСАОТАСАОССАОСС ТСАОТТТСССАТСАААООАОООСТСТТСОСССАСАТСаССТСССАССССТСО САООСТОССАТСТТТОССААОСАСАООАООТСОСССОСАОАССС6ТТССТОТ ОСОООООСАТАСТСАТСАОСТССТОСТ6САТТСТСТСТОСС6СССАСТОСТТС САСОАСАООТТТСССССССАССАССТОАСООТОАТСТТОООСАОААСАТАСС ОООТООТСССТООСаАООАОСАОСАОАААТТТСААОТСОАААААТАСАТТО ТССАТААООААТТСОАТОАТОАСАСТТАСОАСААТОАСАТТОСОСТаСТОСА ОСТСАААТСООАТТСОТСССССТОТОСССАСОАОАбСАОСбТОаТССОСАСТ ОТОТОССТТСССССООСООАССТОСАОСТССССОАСТОСАСОСАОТОТОАОС ТСТССООСТАСООСААОСАТОАСОССТТОТСТССТТТСТАТТСООАОССОС ТОААОаАОаСТСАТОТСАОАСТСТАСССАТССАОССОСТОСАСАТСАСААС АТТТАСТТААСАОААСАОТСАССОАСААСАТОСТОТОТОСТООАОАСАСТС ООАОС60ССОСССССАООСАААСТТОСАСОАСОССТОССАООССОАТТСО СбАООСССССТООТОТСТСТСААСбАТбСССССАТОАСТТТООТОООСАТС АТСАССТ0000ССТ000СТ0Т00АСАСАА00АТ0ТССС60СТ0Т0ТАСАС АААОСТТАССААСТАССТАОАСТСОАТТСОТОАСААСАТОССАССО (8Е<2 ГО Νο:2).

Указанная молекула ДНК кодирует следующий слитый протеин ОтрА и К28. Этот слитый протеин ОтрА и К28, отличающийся тем, что он содержит или представляет собой протеин, который имеет приведенную ниже аминокислотную последовательность или его фрагмент, функционально активный вариант, аллельный вариант, субъединицу, химическое производное или их гликозилированные варианты, является важным объектом настоящего изобретения:

ΜΚΚΤΑΙΑΙΑνΑΕΑΟΡΑΤνΑ₉ΑΑ8ΕΟΝ8θεΥΕΟΝ68ΑΥΚΟΤΗ8ΕΤΕ8ΟΑ80ΕΡ\ν Ν8ΜΙΕ16Κ V ΥΤΛ(3ΝΡ8Λ9ΛΕ6ΕΓίΚΗΝΥ<_ΊίΝΡΕ6Γ.)ΑΚΡν.ΌΙ νΕΚΝΕΡΕΤν/ΕΥΕ О\’Р8С8ТС<И.Р9У'89Р9ЕК1К(ЗОЕЕАЕ>1А8НР\У9АА1ЕАКНЕИ8РСЕКЕ1.ССт<НЕ1 ΕΕΕ'ΛΊΕΕΛΛΕίΕΡρΕ.ΚΕΡΡΙΙΕίΙ.ΤνΠ,ΰΚΤΥΚννρΟΕΕΕΟΚΕΕνΕ,Κ ΥΐνΗΚΕΡΓ)Γ>Γ)Τ ΥΕ)Ε-'[) ЕЛ Е Ι.Ο1.Κ М)88 (<СЛ<,1Е88 V V ЕТ ΥΕΕΡΡΛ Ш/,1 !.Р1> У/ТЕСЕЕ8< т ΥΟΚ ί I ЕЛ 1.8 ΡΡΥ8ΕΚΕΚΕΑΗνΚΕΥΡ88Κ(:Τ8<2ΗΕΕΝΚΤνΤΟΝΜΕΕΑ60ΤΚ86αΡ<2ΑΝΕΗΒΑΟ (ΑΠ>8Γ,<,ΡΕνΕΕΝΐκ,ΚΜΤΓΛ4ΗΙ8ν/<ΗΧ;Ε<Χ.>ΚΓ™<τνΥΤΚνΤΝΥΕΓ>\νίΚΟΝΜΚ ΡΟ(8ΕΟΙΟΝΟ:8)

Следующим предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе б) последовательность ДНК кодирует по меньшей мере 90% аминокислот 87-527 протеина человеческого тканевого активатора плазминогена (в настоящем описании использована нумерация, предложенная для С1 137119 или описанная в ХаИие 301 (5897), 214-221 (1983)).

Еще одним предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе б) последовательность ДНК кодирует по меньшей мере 90% аминокислот 174-527 протеина человеческого тканевого активатора плазминогена.

Следующим предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе б) последовательность ДНК кодирует по меньшей мере 90% аминокислот 180 - 527 протеина человеческого тканевого активатора плазминогена.

Еще одним предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе б) последовательность ДНК кодирует по меньшей мере 90% аминокислот 220 - 527 протеина человеческого тканевого активатора плазминогена.

Следующим предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе а) последовательность ДНК гибридизуется в строгих условиях со следующей последовательностью:

АТОАААААОАСАОСТАТСОСОАТТОСАОТОаСАСТООСТООТТТСОСТАССО ТООСССАООСООСС (8Е<2 Ю N0:3).

Еще одним предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе а) последовательность ДНК имеет следующую последовательность:

АТОАААААбАСАОСТАТСОСОАТТОСАСТОССАСТОССТСОТТТСОСТАССО ТСОСССАООСООСС (5Е(2 Ю N0:3).

Следующим предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе б) последовательность ДНК гибридизуется в строгих условиях со следующей последовательностью:

ТСТОАОООАААСАОТОАСТОСТАСТТТОООААТОООТСАОССТАССОТООСА СССАСАОССТСАССОАОТСС6СТОССТССТОССТСССОТООААТТССАТ6АТ ССТСАТАООСААООТТТАСАСАОСАСАОААССССАОТОСССАСССАСТССО ССТСОССАААСАТААТТАСТОССОСААТССТОАТС666АТСССААССССТОО ТОССАСОТОСТОАА6ААСС6САООСТОАСОТОООАОТАСТОТОАТОТОСССТ ССТОСТССАССТССООССТОАОАСАОТАСАОССАОССТСА6ТТТСОСАТСАА АССА66ССТСТТС6СССАСАТС0ССТСССАССССТСССА00СТСССАТСТТТ СССААОСАСАООАООТСОСССООАОАОСООТТССТбТССООССОСАТАСТС АТСАССТССТбСТССАТТСТСТСТСССбСССАСТбСТТССАСгСАСАСбТТТСС 0ССССАССАССТ6АС00Т0АТСТТ000СА0ААСАТАСС000Т00ТСССТ00С ОАООАООАОСАОАААТТТОААОТСОАААААТАСАТТОТССАТААООААТТС ОАТОАТОАСАСТТАСОАСААТОАСАТТССОСТОСТОСАОСТОАААТСООАТТ ССТСССССТОТ6СССА6САОА6СА6СОТООТССОСАСТСТОТСССТТССССС ОбСООАССТОСАССТОССООАСТООАСбОАаТОТОАОСТСТССОССТАСОО СААОСАТОАООССТТОТСТССТТТСТАТТСбСгАССОССТОААООАООСТСАТ СТСА6АСТСТАСССАТССА6ССССТОСАСАТСАСААСАТТТАСТТААСАОАА СА6ТСАССОАСААСАТОСТСТОТОСТООАОАСАСТСООАСССССС60СССС АООСАААСТТОСАСОАСОССТОССАОООСОАТТСОООАООСССССТООТСТ аТСТОААСОАТСОССОСАТОАСТТТООТОООСАТСАТСАОСТСОООССТООО СТ6ТС0АСАСААС0АТ0ТССС0С0Т6Т0ТАСАСААА00ТТАССААСТАССТА ОАСТООАТТСОТОАСААСАТОСОАССОТОА (8Е() 10 N0:4).

Следующим предпочтительным объектом изобретения является молекула ДНК по изобретению, отличающаяся тем, что указанная в разделе б) последовательность ДНК имеет следующую последовательность:

ТСТ0А600АААСА0Т0АСТ0СТАСТТТ0С0ААТСС6ТСА0ССТАСС6Т00СА СбСАСАОССТСАСССАОТСббОТСССТССТСССТСССОТООААТТССАТСАТ ССТОАТАСССААСОТТТАСАСАССАСАОААССССАОТОСССАООСАСТООО ССТ000САААСАТААТТАСТ0СС00ААТССТ0АТ0660АТСССАА0СССТ00 ТОССАСОТОСТОААОААССОСАООСТаАСбТОООАОТАСТОТОАТОТОСССТ ССТОСТССАССТОСООССТОАОАСАбТАСАОССАбССТСАОТТТСОСАТСАА АООАОООСТСТТСОССОАСАТСОССТСССАССССТСССАОбСТбССАТСТТТ ОССААОСАСАООАСОТСОСССООАОАОСООТТССТОТОСОООСОСАТАСТС АТСАССТССТОСТООАТТСТСТСТСССОСССАСТбСТТССАСгОАОАСОТТТСС ОССССАССАССТОАСбОТОАТСТТООССАОААСАТАССОООТООТСССТСОС 6А6САООАОСАСАААТТТОААСТС6АААААТАСАТТОТССАТААОСААТТС ОАТОАТОАСАСТТАСОАСААТОАСАТТОСбСТОСТОСАОСТСАААТСббАТТ СОТСССОСТОТОСССАООАОАССАСССТОСТССССАСТОТОТСССТТССССС ООСО6АССТ6СА6СТ6ССООАСТООАСО6А6ТОТОАОСТСТСС6ССТАСОО СААОСАТОАОСССТТОТСТССТТТСТАТТСООАОСООСТОААОбАбОСТСАТ СТСАОАСТОТАСССАТССАОССОСТОСАСАТСАСААСАТТТАСТТААСАСАА 1СА6ТСАССОАСААСАТОСТОТОТССТООА6АСАСТСССАОСООСОООСССС АОССАААСТТОСАСОАСОССТОССАОООСОАТТССООАОбСССССТОаТОТ 6ТСТОААС6АТС6ССССАТ6АСТТТ06ТОООСАТСАТСАОСТООООССТОСО СТСТООАСАОААООАТОТСССОООТОТОТАСАСАААООТТАССААСТАССТА 6АСТСОАТТСОТСАСААСАТОСОАСССТОА (8Ер Ю N0:4).

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения является вектор, содержащий последовательность ДНК по изобретению.

Следующим предпочтительным вариантом осуществления изобретения является вектор по изобретению, где указанная последовательность ДНК находится под контролем промотора 1ас и сайта связывания рибосомы. Приемлемые векторы по изобретению включают (но не ограничиваясь ими) вирусные векторы, такие, например, как вирус коровьей оспы, вирус СемликиФореста (§етйк1-Гоге81) и аденовируса, фагмидные векторы и т.п. Предпочтительными являются векторы, которые целесообразно использовать в Е. сой, а также в другом прокарио тическом хозяине, такие как ρΡΚΌΊεΐ.Ε, ρΡΚΌЬаг.А, представители семейства ρΒΛΌ, семейства ρ8Ε, семейства ρΟΕ и рСАЬ.

Еще одним предпочтительным вариантом осуществления изобретения является вектор ρСοтЬ3Η88, который содержит ДНК по изобретению, где экспрессию протеина §ρ III подавляют или ингибируют путем делении молекулы ДНК, кодирующей протеин §ρ III, или с помощью стоп-кодона, расположенного между геном, который кодирует полипептид, содержащий «кренделеобразный» домен 2 и домен сериновой протеазы протеина тканевого активатора плазминогена, и геном протеина III.

Следующим важным объектом настоящего изобретения является прокариотическая клеткахозяин, содержащая молекулу ДНК по изобретению.

Еще одним важным объектом настоящего изобретения является прокариотическая клеткахозяин, содержащая вектор по изобретению.

Следующим важным объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин Е. сой, содержащая молекулу ДНК по изобретению.

Еще одним важным объектом настоящего изобретения является клетка-хозяин Е. сой, содержащая вектор по изобретению.

И еще одним важным объектом настоящего изобретения является применение молекулы ДНК по изобретению или вектора по изобретению или клетки-хозяина по изобретению согласно методу получения полипептида, обладающего активностью тканевого активатора плазминогена.

И еще одним важным объектом настоящего изобретения является применение по изобретению, как описано выше, где указанный способ представляет собой способ по изобретению.

Еще одним очень важным объектом является фармацевтическая композиция, содержащая субстанцию, получаемую с помощью способа по изобретению, и фармацевтически приемлемые эксципиенты и носители. Примером такой субстанции является описанная выше молекула К28. Понятие «фармацевтически приемлемый носитель» в контексте настоящего описания относится к общепринятым фармацевтическим эксципиентам или добавкам, применяемым в области приготовления фармацевтических препаратов. Такие физиологически приемлемые соединения включают, например, углеводы, такие как глюкоза, сахароза или декстраны, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или глутатион, хелатирующие агенты, низкомолекулярные протеины или другие стабилизаторы или эксципиенты (см., например, также Кештдои'к РйагтасеиИса1 8сюпсск (1990, 18-ое изд., изд-во Маск РиЫ., Еак1оп.)). Указанную фармацевтическую композицию по изобретению целесообразно вводить внутривенно в виде болюса, например, в виде однократного быстрого внутривенного введения больших объемов жидкости в течение 5-10 с.

Изобретение относится также к применению субстанций, получаемых способом по изобретению, для приготовления лекарственного средства, предназначенного для лечения «удара», инфаркта сердца, острого инфаркта миокарда, легочной эмболии, любой артериальной окклюзии, такой как окклюзия коронарной артерии, окклюзия внутричерепной артерии (например, артерий головного мозга), окклюзия периферических артерий, глубокий тромбоз вен, или родственных заболеваний, связанных с нежелательным коагулированием крови.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах, не ограничивающих его объем.

Пример 1. Материалы и методы.

Конструирование праймеров. Для амплификации определенного фрагмента гена ίΡΛ синтезировали пару праймеров 8К2/174 [5

ОАОСАООАООТОаСССАОаССОССТСТОАООСАААСАСТОАС 3' ] (ЯЕО ЮИО:22) и А88Р [5'САСОАООАОСТСОСС06ССТООСССООТСОСАТСТТОТСАСО 3'1 (8Е<2 Ю ΝΟ: 23) (фирма ЫГе Тес11по1ощек. Гранд Айленд, штат Нью-Йорк). Эти праймеры конструировали на основе гена человеческого ίΡΛ, полученного из базы данных 30 NСΒI (§137119). Их синтезировали с помощью концевых сайтов клонирования 8Г11 (подчеркнуты) таким образом, чтобы рамка считывания, начинающаяся с кодона АТС гена ^Ш, сохранялась в последовательности, встроенной в фагмидный вектор ρСотЬ3Η88.

Конструировали другой набор праймеров для сайтнаправленного мутагеназа, предназначенный для «отжига» последовательности, расположенной между геном К28 и геном III в ρСотЬ3Η-К28. Последовательности праймеров с замененными в результате мутации основаниями (подчеркнуты) с целью получения нового стоп-кодона представляют собой Μ8ΤΡΑ [5' АСАТОСОАССОТОАСАООССООССАО 3’] <8Е<) ГО ΝΟ: 24) и МА8ТРА [5’ СТООССССССТОТСАСОСТСССАТСТ 3'] <8Е() ГО N0:25),

Амплификация гена К28 с помощью ПЦР. 1 мкг праймеров 8К2/174 и Α88Ρ вместе с 50 нг матрицы р51-3 (полученной от Др. НпокЫ 8акак1, фирма Еицката Ρйа^тасеиί^са1, Япония) суспендировали в 100 мкл смеси для ПЦР. Затем к раствору добавляли 2,5 ед. полимеразы Тас.| (фирма Косйе Мо1еси1аг Вюсйеткак, Индианаполис, штат Индиана). Осуществление амплификации в заданных условиях инициировали резким началом при 85°С в течение 4 мин, с последующей денатурацией при 95°С в течение 50 с, отжигом при 42°С в течение 50 с, удлинением при 72°С в течение 1,5 мин. Реакцию осуществляли с использованием 35 повторяющихся циклов. Смесь дополнительно инкубировали при 72°С в течение 10 мин. Амлифицированный продукт длиной 1110 пар оснований затем очищали с помощью набора р^цшск ΡίΤ Ρи^^Гϊсаί^оη (фирма 0!ΑΟΕΝ, Гильден,

Германия). Правильность очищенного продукта подтверждали с помощью рестриктаз.

Конструкция для экспрессии К2З в фагмидном векторе. Очищенный ПЦР-продукт К2З и фагмидный вектор рСотЬ3НЗЗ (любезно предоставленный Др. Сат1о8 Р. ВагЬак, Зспррк 1п5Йи(е, США) расщепляли с помощью ЗР11 (фирма Воске Мо1еси1аг Вюскеткак,

Индианаполис, штат Индиана), получая специфические «липкие» сайты клонирования. 4 мкг очищенного ПЦР-продукта расщепляли с помощью 60 ед. Зй1 при 50°С в течение 18 ч. Для расщепления рСотЬ3НЗЗ 20 мкг фагмидных векторов обрабатывали 100 ед. ЗР11. Затем расщепленные продукты очищенного ПЦРпродукта К2З и рСотЬ3НЗЗ (-3300 пар оснований), очищали на геле с помощью набора ΟΙΑс.|шск Се1 Ех1гас1юп (фирма 0ΙΑΟΕΝ, Гильден, Германия). В смесь, содержащую 0,7 мкг очищенного расщепленного с помощью Зй1 рСотЬЗНЗЗ и 0,9 мкг очищенного, расщепленного с помощью ЗШ ПЦР-продукта, интродуцировали 5 ед. лигазы фага Т4 (фирма Воске Мо1еси1аг Вюскеткак, Индианаполис, штат Индиана). Реакционную смесь для лигирования инкубировали при 30°С в течение 18 ч. Вновь сконструированный фагмидный вектор обозначили как рСотЬЗН-К2З.

Трансформация штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие. 200 мкл СаСЧз-компетентного штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие (фирма З1та1адепе, Ла Джолла, штат Калифорния) трансформировали с использованием 70 нг лигированного или мутантного продукта. Трансформированные клетки размножали, распределяя на ЬВ-агаре, содержащем 100 мкг/мл ампициллина и 10 мкг/мл тетрациклина (фирма Зщта. Сент Луис, штат Миссури). После культивирования при 37°С в течение 18 ч отбирали с использованием метода щелочного лизиса несколько устойчивых к антибиотикам колоний для получения минипрепаратов плазмид. Каждую очищенную плазмиду подвергали анализу в отношении сайтов рестрикции Зй1. Затем несущую трансформант плазмиду с правильным(ими) сайтом(ами) рестрикции Зй1 размножали в течение 18 ч при 37°С в 100 мл ЬВбульона, дополненного ампициллином (100 мкг/мл) и тетрациклином (10 мкг/мл).

Максипрепараты плазмид получали с помощью набора ^IΑСΕN Р1а§т1б Мах1 (фирма О1АСЕП Гильден, Германия). Очищенную плазмиду повторно оценивали в отношении специфичных сайтов рестрикции с помощью Зй1 и секвенировали с использованием набора Атр1|Тас.| ΌΝΑ Ро1утета§е Тетт1па1от Сус1е Зесщепстд (фирма Тке Реткт-Е1тет Сотротайоп, Форстер Сити, штат Калифорния).

Сайтнаправленный мутагенез рСотЬ3НК2З. 10 нг матрицы рСотЬ3Н-К2З смешивали с 125 нг праймеров МЗТРА и МАЗТРА. К смеси добавляли 2,5 ед. ДНК-полимеразы РкиТитЬо (фирма З1та1адепе, Ла Джолла, штат Калифорния) для осуществления циклической амплификации. Реакцию начинали с одного цикла при 95°С в течение 30 с. Затем осуществляли 16 циклов, включающих: 95°С в течение 30 с, 55°С в течение 1 мин и 68°С в течение 9 мин. Затем реакционную пробирку помещали на лед на 2 мин. Для расщепления цепей матрицы в реакционную смесь для амплификации добавляли 10 ед. рестриктазы Ирп1 (фирма З1та1адепе, Ла Джолла, штат Калифорния) и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Этот синтезированный продукт (МрСотЬ3Н-К2З) затем применяли для трансформации штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие.

Получение выявляемой с помощью фага рекомбинантной молекулы К2З. После трансформации штамма ХЬ-1 В1ие с помощью рСотЬ3Н-К2З использовали методику выявления с помощью фага. Клон рСотЬ3Н-К2З, которым трансформировали штамм Е. сой ХЬ-1 В1ие, размножали в 10 мл супер-бульона, содержащего ампициллин (100 мкг/мл) и тетрациклин (10 мкг/мл), при 37 С до достижения оптической плотности (ОП) [при 600 нм], равной 1,5. Затем бактериальную культуру размножали в 100 мл такой же среды и культивировали в течение 2 ч. Для заражения трансформированного штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие использовали 10 БОЕ (бляшкообразующих единиц) фага- хелпера УСЗМ13 (фирма З1та1адепе, Ла Джолла, штат Калифорния). После инкубации в течение 3 ч в культуру добавляли канамицин в конечной концентрации 70 мкг/мл. Культуру выдерживали при встряхивании (200 об/мин) в течение 18ч при 37°С. Затем собирали бактериофаги, несущие К2З на др3 (К2З-(|)), добавляя 4% (мас./об.) ПЭГ с молекулярной массой 8000 (фирма Зщша, Сент Луис, штат Миссури) и 3% (мас./об.) №С1. И, наконец, собранный фаг ресуспендировали в 2 мл ЗФР, рН 7,4. Количество фага определяли, заражая штамм Е. сой ХЬ-1 В1ие. Количество колониеобразующих единиц на один миллилитр (КОЕ/мл) расчитывали согласно описанному ранее методу (21).

Экспрессия полученной рекомбинантным путем молекулы К2З во встряхиваемых колбах. Трансформированный МрСотЬ3Н-К2З штамм Е. сок ХЬ-1 В1ие культивировали в 100 мл «супер»-бульона (3% (мас./об.) триптон, 2% (мас./об.) дрожжевой экстракт, 1% (мас./об.) МОРЗ [3 -(№морфолино)пропансульфоновая кислота]) при рН 7,0 в присутствии ампициллина (100 мкг/мл) при 37 С до достижения ОП [600 нм], равной 0,8.

Затем синтез протеина индуцировали с помощью 1мМ ИПТГ (фирма Рго те да, Мэдисон, штат Висконсин). Затем бактерии культивировали при встряхивании (200 об/мин) в течение 6 ч при 30°С. Супернатант культуры собирали и осаждали 55%-ным насыщенным раствором сульфата аммония (32). Осадок восстанав ливали с помощью ЗФР, рН 7,2 и подвергали диализу в противотоке такого же буферного раствора при 4°С в течение 18 ч. Периплазматические протеины из бактериальных клеток экстрагировали, используя хлороформный шок согласно описанному ранее методу (А тек и др.) (2).

Количественный иммуноанализ полученной рекомбинантным путем молекулы К28.

Для обнаружения г-К28 твердую фазу сенсибилизировали моноклональным антителом к «кренделеобразному» домену 2 (16/В) (любезно предоставленным Др. И1е Ζ;·ιο1ι;·ιπ;·ΐ5. Сеи1га1 1пкШШе о£ Мо1еси1аг Вю1оду, Берлин-Бух, Германия). Осуществляли отмывку и блокирование согласно стандартному методу ЕБ18А. В каждую лунку, сенсибилизированную антителом к «кренделеобразному» домену 2, добавляли по 50 мкл 10 КОЕ/мл К28-ф или секреторного гК28. Оценку комплекса антиген-антитело осуществляли согласно описанному ниже процессу. В каждую реакционную лунку после стадии отмывки добавляли либо овечье антитело к М13, конъюгированное с пероксидазой из хрена (НКР) (фирма Рйагшас1а Вю1ес11. Уппсала.Швеция), или овечье антитело к (РА, конъюгированное с НКР (фирма Себаг1апе, Онтарио, Канада). В каждую лунку вносили субстрат ТМБ (тетраметилбензидин) и, наконец, после инкубации в течение 30 мин реакцию прекращали, добавляя раствор Н₂8О₄. В качестве позитивного контроля использовали стандартный полученный из меланомы 1РА 86/670 (Ыайопа1 1п5111и(е £ог Вю1ощса1 81аибагбк и Соп1го1, Хертфордшин, Великобритания).

Анализ амидолитической активности.

Для оценки амидолитической активности (РА использовали набор, поставляемый фирмой Сйготодешх (Молндал, Швеция). Для определения ферментативной активности сериновой протеазы в качестве субстрата использовали смесь, содержащую плазминоген и 8-2251. Активность каждого осажденного аммонием и разбавленного в 100 раз образца оценивали с добавлением в качестве стимулятора фрагментов человеческого фибриногена или без стимулятора. Анализ выполняли согласно руководству СОА8ЕТ 1-РА.

ДСН-ПААГ и иммуноблоттинг. Подвергнутый диализу осажденный из супернатанта культуры продукт дополнительно концентрировали в 10 раз с помощью центрикона 10 (фирма АМ1СОИ, Беверли, штат Миннесота). Протеины сконцентрированного образца разделяли с помощью ДСН-ПААГ, используя 15%-ный фильтрующий гель в восстанавливающем буфере, с последующим электроблоттингом на нитроцеллюлозу. Затем нитроцелюлозу блокировали с помощью 4%-ного снятого молока в течение 2 ч. Для обнаружения г-К28 нитроцеллюлозу обрабатывали соответствующим образом разведенным овечьим антителом к (РА, конъюгиро ванным с НКР. Иммунореактивную полосу визуализировали с помощью чувствительной системы обнаружения, набора АшрйПеб Орй-4СК (фирма ВЮКАЭ, Геркулес, штат Калифорния).

Электрофорез в сополимеризированном с плазминогеном полиакриламидном геле. 11%ный фильтрующий полиакриламидный гель подвергали сополимеризации с плазминогеном и желатином согласно описанному ранее методу (Неиккеп и др.) (14). 4%-ный концентрирующий гель готовили без плазминогена и желатина. Электрофорез осуществляли при 4 С при постоянной силе тока 8 мА. Оставшийся в полосе геля ДСН удаляли послеосторожного встряхивания при комнатной температуре в течение 1 ч в 2,5%-ном Тгйоп Х-100. Затем полосу геля инкубировали в 0,1М глицине-ЫаОН, рН 8,3 в течение 5 ч при 37°С. И, наконец, полосу геля окрашивали и обесцвечивали с помощью стандартной системы для окраски гелей на основе кумасси бриллиантового голубого (К-250). Область, в которой была локализована присущая пептиду ферментативная активность, не окрашивалась красителем в противоположность окрашенному в голубой цвет фону.

Результаты

Конструирование вектора, несущего ген К28. Из вектора р51-3 амплифицировали «кренделеобразный» домен 2 плюс домен сериновой протеазы (РА (от 8ег¹⁷⁴ в «кренделеобразном» домене 2 до Рго⁵²⁷ в сериновой протеазе) с помощью праймеров 8К.2/174 и А88Р. Полученный в результате амплификации продукт длиной 1110 пар оснований выявляли с помощью электрофореза в агарозном геле (фиг. 1, полоса 2) и встраивали в фагмидный вектор рСошЬ3Н88 с использованием двух сайтов расщепления 8ίΐ1 на 5'- и 3'-концах в правильной рамке считывания. Таким образом получали новый вектор рСотЬ3Н-К28, несущий К28. В этом векторе ген К28 фланкирован против хода транскрипции сигнальной последовательностью ОтрА и по ходу транскрипции - геном др3. Правильность вставки К28 подтверждали рестрикционным анализом с использованием 8ίΐ1 (фиг. 2, полоса 3), ПЦР-анализом (продемонстрировано наличие одной полосы, соответствующей 1110 парам оснований) и секвенированием ДНК. Схематичная диаграмма карты рСотЬ3Н-К28 приведена на фиг. 3.

Выявляемая с помощью фага молекула г-К28. Для заражения трансформированного рСотЬ3Н-К28 штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие, Х[К28] использовали нитчатый фаг УС8М13. УС8М13 размножали и встраивали в него слитый протеин К28-др3 во время процесса упаковки вируса. Собранный рекомбинантный фаг (К28-ф) имел концентрацию 5,4 х 10 КОЕ/мл, которую определяли путем повторного заражения штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие осажденным с помощью ПЭГ фагами. В этих рекомбинантных фаговых частицах с помощью сэндвич- ЕЫ8А подтверждали наличие экспрессии г-К28. Связанный с фагом гетерологичный протеин К28 выявляли с помощью моноклонального антитела к «кренделеобразному» домену 2 (16/В), используя в качестве системы для обнаружения овечье антитело к 1РЛ, конъюгированное с НИР. В этом анализе коэффициент абсорбции составил 1,12 ± 0,03 (табл. 1). Количество К28, обнаруженного на 10 в 12 степени фаговых частицах, соответствовало 336 нг протеина в пересчете на стандартный полученный из меланомы 1РЛ. Для подтверждения того, что слитый протеин К28-др3 связан с фаговыми частицами, овечье антитело к 1РЛ. конъюгированное с НИР, заменяли овечьим антителом к М13, конъюгированным с НИР. Для этой иммуннологической реакции коэффициент абсорбции составлял 1,89 ± 0,07 (табл. 1). В отличие от этого, если иммобилизованное антитело представляло собой овечье антитело к М13, то был выявлен очень низкий уровень К28 при использовании овечьего антитела к 1РЛ, коъюгированного с НИР; коэффициент абсорбции составлял только 0,17 ± 0,01 (таблица 1). Этот позволяет предположить наличие лишь небольшого количества очищенных фаговых частиц, несущих слитый протеин К28др3. В качестве негативного контроля использовали УС8М13, полученный из нетрансформированного штамма ХЬ-1 В1ие.

Конструкция МрСошЬ3Н-К28. Стоп-кодон помещали между К28 и др3 в рСошЬ3Н-К28 с помощью мутагенных праймеров (М8ТРЛ и МЛ8ТРЛ) (фиг. 4). Для повышения количества вновь синтезированного и мутантного МрСошЬ3Н-К28, смесь для циклической амплификации преднамеренно расщепляли с помощью Эрп1 с целью расщепления старой батметилированной матрицы рСошЬ3Н-К28 (Эрп1 обладает специфичностью в отношении батметилированной ДНК). После трансформации штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие с помощью МрСотЬ3Н-К28 для дальнейших исследований был выбран трансформант ХМ[К28]. В результате замены пар оснований один из сайтов расщепления 8ίϊ1, прилегающий к 3'-концу гена К28, был удален после сайтнаправленного мутагенеза. Была выявлена линейная версия длиной 4319 пар оснований расщепленного с помощью 81Ϊ1 МрСотЬ3Н-К28, в которой не обнаружен встроенный фрагмент гена К28 (фиг. 5, полоса 3). Таким образом, ген К28, кодируемый МрСотЬ3Н-К28, экспрессировался в ХМ[К28] в не слитой с др3 форме.

Экспрессия и очистка К28. Экспрессию К28 в ХМ[К28]индуцировали с помощью ИПТГ. С помощью ЕЫ8Л г-К28 был выявлен как в периплазматическом пространстве, так и в супернатанте культуры. Количество гетерологичного протеина определяли в каждом препарате с помощью сэндвич-ЕЫ8Л и сопоставляли со стандартным 1РЛ. Из 100 мл бактериальной культуры во встряхиваемых колбах при ОП [600 нм], равном 50, в периплазматической фракции обнаружено 1,38 мкг г-К28 (примерно 32%), в то время как в осажденном аммонием супернатанте культуры обнаружено 2,96 мкг г-К28 (примерно 68%). Метод сэндвич-ЕЫ8Л применяли для оценки осажденного ПЭГ фага из зараженного УС8М13 ХМ[К28]. Никакого г-К28, иммобилизованного с помощью моноклонального антитела к «кренделеобразному» домену 2, не было обнаружено при выявлении с помощью антитела к М13, конъюгированного с НИР, эти результаты свидетельствуют о том, что К28 не присутствовал на фаговых частицах, в том случае, если отсутствовал др3.

Оценка амидолитической активности. Если в образце присутствует домен сериновой протеазы, то плазминоген превращается в плазмин. Полученный плазмин далее расщепляет субстрат 8-2251 с образованием окрашенного продукта, пара-нитроанилина, который имеет максимум абсорбции при 405 нм. Удельная активность рекомбинантного продукта кореллирует с коэффициентом абсорбции. Оценивали и сравнивали зависящую от фибриногена ферментативную активность каждого образца, т.е. К28-ф, периплазматического г-К28 или выделенного из супернатанта культуры г-К28. Для обоих таких образцов, как К28-ф и перипоазматический гК28, выявлен очень низкий уровень ферментативной активности, который оказался ниже уровня чувствительности метода (0,25 ед./мл). Выделенный из супернатанта культуры г-К28 обладал зависящей от фибриногена ферментативной активностью, составляющей 7 ед./мл. Таким образом, из 100 мл культуры получали всего 700 ед. ферментативной активности. Без фибриногена никакой ферментативной активности г-К28, очищенного из супернатанта культуры, не было обнаружено, в то время как стандартный полученный из меланомы 1РЛ обладал некоторой активностью.

Демонстрация наличия рекомбинантного протеина с помощью иммуноблоттинга. С использованием овечьих антител к 1РЛ установлено, что молекулярная масса частично очищенного К28, полученного из супернатанта ХМ[К28], составляет 39 кДа (фиг. 6). Негативный контроль, т. е. частично очищенный супернатант культуры не трансформированного штамма ХЬ 1-В1ие, не имел никакой реактивной полосы, соответствующей указанному размеру.

Локализация активного фермента с помощью ПААГ. Плазминоген подвергали сополимеризации и иммобилизовали с помощью желатина в полиакриламидном геле до осуществления электрофореза. Анализировали осажденные аммонием супернатанты культур штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие, штамма Е. сой ХЬ-1 В1ие, трансформированного рСотЬ3Н88 и ХМ[К28] (фиг. 7). Все образцы разгоняли в невосстанавливающих условиях для сохранения правильной конформации и активности домена сериновой протеа зы. Прозрачные области, полученные в результате расщепления плазминогена сериновой протеазой, были обнаружены только в осажденных аммонием супернатантах культуры ХМ[К28] в положениях, соответствующих 34 и 37 кДа. При использовании других образцов не выявлено очищенных зон. На соответствующей позитивному контролю полосе стандартного полученного из меланомы !РА также продемонстрирована ферментативная активность в положениях, соответствующих 66 и 72 кДа.

Ссылки

1. Айей 8., Н. Υ. Νιίηι и N. 1. Ви11е1б. 1995. 1и1гасе11и1аг Го1бтд οί йккие-1уре р1акттодеп ас!1уа!ог. ЕГГес!к οί б1ки1йбе Ьопб Гогтайоп οη Ν1ткеб д1усоку1айоп и кесгейоп. 1. Βίο1. Сйет. 270:4797-4804.

2. Атек С. Р., С. Ргобу и 8. Кик!и. 1984. 81тр1е, гарИ, и диапЫайуе ге1еаке οί репр1акт1с ргсЛетк Ьу сЫогоГогт. 1. Вас!епо1. 160:11811183.

3. 8.ВагЬак С. Р. 111, А. 8. Капд, В. А. Ьетег и 8. 1. Вепкоую. 1991. АккетЬ1у οί сотЬта!опа1 апйЬобу йЬгапек оп рйаде кигГасек: !йе депе III кйе. Ргос. №11. Асаб. 8ск и. 8. А. 88:7978-7982.

4. ВагЬак С. Р. 111 и I. Щ ад пег. 1995. 8уп!йейс йитап апйЬоб1ек: ке1есйпд апб еуоМпд Гипсйопа1 рго!етк. А Сотрапюп 1о Ме!йобк ш Епхуто1оду 8: 94-103.

5. Веппей Щ. Р., Ν. Р. Раош, В. А. Кеу!, Ό. Во!к!ет, А. I. 1опек, Ь. Ргек!а, Р. М. Щигт и М. I. Ζο1Βγ. 1991. Н1дй геко1ийоп апа1ук1к οί Гипсйопа1 бе!егттап!к оп йитап йккие-1уре р1акттодеп асйуа!ог. I. Вю1. СЬет. 266:5191-5201.

6. Вейоп I. М., Ν. 8аккооп, М. НоГпипд, и М. Ьаигеп!. 1998. Оедгабайоп уегкик аддгедайоп οί т1кГо1беб таИоке-Ьтбшд рго!ет ш !йе репр1акт οί ЕксйепсЫа сой. I. Вю1. СЬет. 273:8897-8902.

7. Сатю1о 8. М., 8. Тйогкеп и Т. Акйир. 1971. Р1Ьгтодепо1ук1к апб йЬппо1ук1к тейй йккие р1акттодеп асйуа!ог, игоктаке, к!гер!октакеасйуа!еб йитап д1оЬийп апб р1актт. Ргос. 8ос. Ехр. Вю1. Меб. 38:277-280.

8. СагтйдЫ Т., 1992. Ргобисйоп οί !-РА йот атта1 се11 сийиге, с. 217-245. В В. Е. 8р1ег и I. В. СпГГййк (ред.). Ашта1 Се11 Вю!есйпо1оду, том 5. Асабетю Ргекк, Ν.Υ.

9. Сипу, К. А., А. Щ. Υет, М. В. Эекек 1г., Ν. Т. НаЫепЬиЫег, I. С. Ноодегйе1бе и С. 8. Тотюй 1990. ЕксйепсЫа сой ехргеккюп апб ргосеккшд οί йитап т!ег1еикт-1 Ье!а Гикеб 1о к1дпа1 рерйбек. ПХ'А Се11 Вю1. 9:167-175.

10. Эа1аг В. V., Т. СагйгпдЫ и С.-С. Вокеп. 1993. Ргосекк есопописк οί ашта1 се11 апб Ьас!епа1 Гегтеп!айопк: а саке к!ибу апа1ук1к οί йккие р1акттодеп асйуа!ог. Вю!есйпо1оду 11:349-357.

11. ОепеПе Р., 8. Коуапк, Т. Сюга, Ν. Соккек!, I. С. ВеЫсйои, М. Ьайа, Р. СтпеЕ А. Ву!ег и I. Р. Мауаих. 1989. Не!его1одоик рго!ет ехрой т ЕксйепсЫа сой: тГЫепсе οί Ьас1епа1 кгдпа1 рерйбек оп !йе ехрой οί йитап т!ег1еикт 1 Ье!а. Сепе 85:499-510.

12. СпГГййк I. В., А. Е1ес1пс\\Ыа. 1987. Ргобисйоп οί йккие р1акттодеп асйуа!огк йот ашта1 се11к. Абу. Вюсйет. Епд. Вю1есйпо1. 34:147166.

13. Натк Т. I., Т. Ра!е1, Р. А. Магк!оп, 8. Ьййе, I. 8. Ет!аде, С. Орбепаккег, С. ^1скаей, Щ. ВотЬаЫк, А. Вййаи и Р. Эе 8отег. 1986. С1ошпд οί с^NА собтд Гог йитап Иккиейуре р1акттодеп асйуа!ог апб йк экспрессия т ЕксйепсЫа сой. Мо1. Вю1. Меб. 3:279-292.

14. Неиккеп С., и Е. В. Оо\\б1е. 1980. Е1ес!горйогейс апа1ук1к οί р1акттодеп асйуа!огк т ро1уасгу1ат1бе де1к соп!аштд кобшт бобесу1 ки1Га!е апб соро1утепхеб киЬк1га!ек. Апа1. Вюсйет. 102:196-202.

15. Неиккеп С., Р. 1оиЬей и Е. В. Оо\\б1е. 1984. Ршзйсайоп οί йитап йккие р1акттодеп асйуа!ог тейй Егу!йппа йуркт шЫЬйог. I. Вю1. Сйет. 259:11635-11638.

16. Ни С. К., и. Койпей, О. Щ11йе1т, 8. Р1ксйег и М. Ьйпак. 1994. Т1ккие-1уре р1акттодеп асйуа!ог ботат-бе1е!юп ти!ап! ВМ 06.022: тоби1аг к!аЫ1йу, тЫЬйог Ьтбтд, апб асйуайоп с1еауаде. Вюсйет1к!гу 33:11760-11766.

17. К1рпуапоу 8. М., С. Мо1бепйаиег и М. Ьййе. 1997. Н1дй 1еуе1 ргобисйоп οί ко1иЬ1е ктд1е сйат апйЬобгек т кта11-кса1е ЕксйепсЫа сой сийигек. I. 1ттипо1. Ме!йобк 200:69-77.

18. Ко I. Н., Ό. К. Рагк, I. С. Кип, 8. Н. Ьее и 8. М. Вуип. 1995. Н1дй-1еуе1 ехргеккюп апб кесгейоп οί к!гер!октаке т ЕхсйепсЫа сой. Вю!есйпо1. Ьей. 17:1019-1024.

19. Копхпта Υ., Ν. Υатакак^ и М. К1тига. 1997. Тйе йккие-1уре р1акттодеп асйуа!ог тЫЬйог ЕТЕ1 Ггот Егу!йппа уапеда!а: к1гис!ига1 Ьак1к Гог !йе 1пЫЬйогу асйуйу Ьу с1оЫпд, ехргеккюп апб тЫадепещк оГ !йе с^NА епсобтд ЕТЫ. I. Вюсйет. (Токуо) 121:456-463.

20. Ьак!егк I., Ν . Vаη Негхее1е, Н. В. Ьупеп, Ό. Со11еп и Ь. 1екрегк. 1997. Епхутабс ргорегйек оГ рйаде-б1кр1ауеб ГгадтеШк оГ йитап р1акттодеп. Еиг. ЕВюсйет. 244:946-952.

21. ЬоЬе1 Ь. I., Р. Ваиксй, I. Тгакй!, 8. Ро11ак и I. Щ. Ьик!Ьабег. 1997. РПатеШоик рйаде бгкр1аутд !йе ех!гасе11и1аг ботат оГ !йе йЬН/СС гесер!ог Ыпб йСС кресйгсайу. Епбосппо1оду. 138:1232-1239.

22. ЬцЫпкскг А., В. Ага!йооп, С. Ро1ак1гг I. Тйотак, М. ЩгеЬе, В. СагЫск, А. 1опек, В. уап Ве1к и 8. Вийбег. 8е1ес!еб к1га1ед1ек Гог тапиГас!ше апб соп!го1 оГ гесотЫпап! йккие р1акттодеп асйуа!ог ргерагеб Ггот се11 сийиге, с. 442-451. В В. Е. 8ркг, I. В. СпГГййк, I. 8!ерйеппе и Р. I. Сгооу (ред.). Абуапсек т аЫта1 се11 Ью1оду апб !есйпо1оду Гог Ьюргосеккек. Вийегооййк, Ьопбоп.

23. Ьисю М. В., В. Е. РогЬек, 8. Е. Сгокуепог, I. М. Сагг, I. С. Ща11асе и С. РогкЬегд. 1998. 8есгейоп т ЕксйепсЫа сой апб рйаде-б1кр1ау оГ гесотЫпап! ткийп-йке дгоМй Гас!ог Ьтбтд ргокт-2. I. Вю!есйпо1. 61:95-108.

24. Матбп и., 8. Рйсйет, и. Койпей, Н. Ы11, В. Вибо1рй, 6. 8ропег, А. 8!егп и К. 8беш. 1990. Рторетбек оГ а поуе1 рИктшодеп асбуа!от (ВМ 06.022) ргобисеб ш ЕксйейсЫа сой. Ζ. Катбю1. 79:167-170.

25. ОЬико\\'1сх М. 6., М. Е. 6ик!аГкоп, К. Ό. Ыпдет, В. М. йеппдгиЬег. А. 1. ЭДЫ^ет, Т. С. ЭДип, Т. 6. ЭДаггеп, В. Р. Вййор, К. 1. МаГй1к, Ό. Т. МсРйегкоп, N. В., 81еде1, М. 6. 1епЫпд, В. В. ВпдЫге11, 1. А. ЭГах-СШет, Ь. Ό. Ве11, С. 8. Сга1к и ЭД. С. Тасоп. 1990. 8естебоп оГ асбуе кппд1е-2кеппе рго!еаке ш ЕксйейсЫа сой. Вюсйешййу 29:9737-9745.

26. Рагт1еу,8. Р. и 6. Р. 8шйй. 1988. АпбЬобу-ке1ес!аЬ1е Гйатеп!оик Гб рйаде уесЮгк: аГйпйу ритТбсабоп оГ 1агце1 депек. 6епе 73:305318.

27. РепЫса Ό., ЭД. Е. Но1тек, ЭД. 1. Койг, В. N. Наткшк, 6. А. Уейаг, С. А. ЭДагб, ЭД. Р. Веппей, Е. Уе1уейоп, Р. Н. 8ееЬигд, Н. I. Неупекег, Ό. V. 6оеббе1 и Ό. Со11еп. 1983. С1ошпд апб ехртеккюп оГ йишап бккие-1уре р1акш1подеп асбуа!от сЭЙЛ ίπ Е. сой. №1иге 301:214-221.

28. В1рршапп 1. Р., М. К1ет, С. Нойсйеп, В. Вгоскк, ЭД. 1. Ве!бд, 1. 6итрей, К. РГ17епша1ег, В. Ма!!ек и Ό. Мооктауег. 1998. Ртосатуобс экспрессия оГ ктд1е-сйат уапаЫе-Ггадтеп! (ксРу) апбЬоб1ек: кесгебоп т Ь-Гогт се11к оГ Рго!еик т1гаЬШк 1еабк Ю асбуе ргобис! и оуегсотек !йе бтйабопк оГ репрЫктю ехртеккюп ш ЕксйейсЫа сой. Арр1. Епуйоп. М1сгоЫо1. 64:4862-4869.

29. 8айо Υ., Υ. 1кйб, Н. 8акак1, М. НауакЫ, Т. Риртига, Υ. 1та1, 8. Nакаши^а, 8. 8и/икГ 1. №1апк Т. Акаба, Н. Нопак К. Макакахи и N. Мтео. 1994. Ргобисбоп апб сйатас!епхабоп оГ а поуе1 Пккие-1уре р1акттодеп асбуа!ог бепуабуе т ЕксйейсЫа сой. Вю1есйпо1. Ргод. 10:472-479.

30. 8апЫеп1ок Р., М. Эисйекпе, Р. ЭепеДе, 1. Во171аи, N. Рготаде, N. Эе1ройе, Р. Рагкег, Υ. Ьепеуге, Е-Р. Мауаих и Т. Саг1\тпдЫ. 1989. 8уп!йек1к апб ритТДсабоп оГ асбуе йитап бккие р1акттодеп асбуа!ог Ггот ЕксйейсЫа сой. Вю!есйпо1оду 7:495-501.

31. 8сйеггег 8., N. ВоЬак, Н. Ζоийе^^у, 6. Вгап1ап! и С. Вгап1ап!. 1994. Репр1акт1с аддгедабоп йтйк !йе рго!ео1убс таЫгабоп оГ !йе ЕксйепсЫа сой решсШш 6 ат1баке ргесигког ро1урерйбе. Арр1. М1сгоЫо1. Вю!есйпо1. 42:85-89.

32. 8оеба 8., М. Как1к1, Н. 8й1тепо и А. №дата1ки. 1986. Вар1б апб Ыдй-у1е1б ригГДсабоп оГ рогсше йеай Иккие-1уре р1актйюдеп асбуа!ог Ьу йерапп-керйатоке сйгота!одгарйу. ЬГГе 8сГ 39:1317-1324.

33. 8хагка 8. 1., Е. 6. 81йо!а, Н. В. НаЫЬк и 8.-Ь. ЭДопд. 1999. 8!арйу1окшаке ак а р1акттодеп асбуа!ог сотропеп! т гесотЬтап! Гикюп рго!етк. Арр1. Епуйоп. М1сгоЪю1. 65:506-513.

34. ЭДа1бепк!гот М., Е. Но1тдгеп, А. Айегкапб, С. Ка1бегеп, В. Ьотепаб1ег, В. Вабеп, Ь. Напккоп и 6. Рой1. 1991. 8упГйек1к апб кесгебоп оГ а ДЬппо1убса11у асбуе бккие-Гуре рИктшодеп асбуа!ог уапап! т ЕксйейсЫа соб. 6епе 99:243248.

35. ЭДап Е. ЭД.-М. и Р. Вапеух. 1998. То1А111 Со-оуегэкспрессия Расбйа1ек !йе Весоуегу оГ Рег1р1акт1с ВесотЫпап! Рго!ешк т!о !йе Сго\\Й1 Мебшт оГ ЕксйейсЫа сой. Рго!ет Ехрг. РипГ 14:13-22.

36. Ζасйа^^ак и., В. Рйсйег, Р. №11 и Н. ЭД111. 1992. С11агас1епхабоп оГ йитап 11ккие-1уре р1актйюдеп асбуа!ог тейй топос1опа1 апбЬоб1ек: тарршд оГерйорек апб Ьтбшд кйек Гог ПЬпп апб 1укше. ТйготЬ. Наеток!. 67:88-94.

Описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - подтверждение характеристик продукта ПЦР-амплификации гена К28 из вектора р51-3 с помощью праймеров 8К2/174 и А88Р. Ряд 1 соответствует маркеру размером 1 т.п.н. (фирма Восйе Мо1еси1аг ВЫсИеп-исаК Индианаполис, штат Иллинойс). Ряд 2 соответствует продукту амплификации, внесенному в количестве 1 мкл. Обозначена индивидуальная полоса, соответствующая 1110 парам оснований. Электрофорез осуществляли в 1%-ном агарозном геле;

на фиг. 2 - ряд 1 соответствует встроенному гену К28 на полосе, соответствующей 1110 пар оснований (*), после расщепления с помощью 8Г11 вектора рСотЬ3Н-К28. Ряд 1 соответствует маркеру размером 1 т.п.н. Ряд 2 соответствует нерасщепленному вектору рСотЬ3НК28. Электрофорез осуществляли в 1%-ном агарозном геле;

на фиг 3. - схематичное изображение рСотЬ3Н-К28 с указанием двух сайтов клонирования 8Гб, в которые встраивали ген К28. Также обозначены сигнальная последовательность (ОтрА), сайт связывания рибосомы (В1В8), промотор 1ас и ген др111;

на фиг. 4. - схематичная диаграмма сайта мутации в стыке между генами К28 и дрШ в векторе рСотЬ3Н-К28. Сайтренатурации рСотЬ3Н-К28 связывали с набором праймеров для мутации (М8ТРА и МА8ТРА), которые содержали модифицированные олигонуклеозиды (подчеркнуто). После осуществления цикла амплификации сайт 1 8Г11 (выделен жирным шрифтом) модифицировали и удаляли из вновь синтезированной цепи;

на фиг. 5. - характеризация вновь синтезированного вектора МрСотЬ3Н-К28 с помощью рестриктазы 8Г1 I. Ряд 3 соответствует полосе размером 4319 пар оснований, которая соответствует одному сайту расщепления МрСотЬ3НК28. В области, соответствующей 1110 парам оснований, не удалось визуализировать встроенный ген К28. Ряд 1 соответствует маркеру размером 1 т. п. н. Ряд 2 соответствует нерасщепленному вектору МрСотЬ3Н-К28. Электрофорез осуществляли в 1%-ном агарозном геле;

на фиг. 6 - идентификация иммунологически реактивной полосы, соответствующей вы веденному из рекомбинантной ДНК протеину, полученному из супернатанта культуры ХМ[К28], с помощью овечьего антитела к ίΡΆ, конъюгированного с НКР. В ряд 1 вносили 40 нг стандартного полученного из меланомы ίΡΑ (86/670), для которого обнаружена реактивная полоса, соответствующая 70 кДа. В ряд 2 и 3 соответственно вносили очищенные и сконцентрированные супернатанты культур нетрансформированных штаммов Е. сой ХЬ1- В1ие и ХМ[К28]. Индивидуальная реактивная полоса, соответствующая 39 кДа, особенно хорошо видна в ряду 3;

на фиг. 7 - определение молекулярной массы внеклеточного Г-К28, несущего активный домен сериновой протеазы, путем электрофореза в полиакриламидном геле сополимеризованного плазминогена. В ряд 1 внесены стандарты молекулярной масс (510'), ДСН-6Н (фирма 81дша, Сент Луис, штат Миссури). В ряды 2, 3 и 4 соответственно вносили по 50 мкг осажденного насыщенным 55%-ным раствором сульфата аммония супернатанта культуры ХЬ-1 В1ие, XI1 В1ие, трансформированного рСошЬ3Н88, и ХМ[К28]. В полосу 5 вносили 5 мед. стандартного полученного из миеломы ίΡΑ (86/670). Прозрачные зоны расщепленного плазминогена в полиакриламидном геле обнаружены только в ряду 4 в областях, соответствующих молекулярным массам 34 и 37 кДа (Б) и в ряду 5 в области, соответствующей молекулярным массам 66 и 72 кДа (А);

на фиг. 8 - структура Α (8ЕО ГО N0: 11)

Нативная молекула К28 от аминокислоты 174 до 527 без модификации;

на фиг. 9 - структура В-0 (8ЕЭ ГО N0: 12)

Нативная молекула К28 от аминокислоты 197 до 527 без модификации;

на фиг. 10 - структура Б-1 (8ЕЭ ГО N0: 13)

Молекула К28 от аминокислоты 193 до 527, где к структуре В-0, приведенной на фиг. 9, к Ν-концевой области добавлены аминокислоты 8Ε6Ν;

на фиг. 11 -структура Б-2 (8Е0 ГО N0: 14)

Молекула К28 от аминокислоты 193 до 527, соответствующая молекуле, приведенной на фиг. 10, где Сук-261 заменен на 8ег;

на фиг. 12 - структура Б-3 (8Е0 ГО N0: 15)

Молекула К28 от аминокислоты 191 до 527, где к структуре В-0, приведенной на фиг. 9, к ^концевой области добавлены аминокислоты 8ЕС.Х81);

на фиг. 13 - структура Б-4 (8ЕЭ ГО N0: 16)

Молекула К28 от аминокислоты 191 до 527, соответствующая молекуле, приведенной на фиг. 12, где Сук-261 заменен на 8ег;

на фиг. 14 - структура В (8Е0 ГО N0: 17)

Нативная молекула К28 от аминокислоты 220 до 527 без модификации. Эту молекулу можно дополнительно модифицировать аналогично тому, как описано для структуры Б на фиг. 10-13;

на фиг. 15 - структура Ό (8Е0 ГО N0: 18)

Нативная молекула К28 от аминокислоты 260 до 527 без модификации. Эту молекулу можно дополнительно модифицировать аналогично тому, как описано для структуры Б на фиг. 10-13;

на фиг. 16 - молекула ίΡΑ (8ЕЭ ГО N0: 19).

Таблица 1. Обнаружение молекулы Г-К28 в препарате фага с помощью сэнвич- ЕЬ18А

Иммобилизованное антитело -	Антитело-метка (конъюгированное с НКР)
Антитело к (РА	Антитело к М13
	К28-ф	УС8М18* *	К28-ф	УС8М13
Антитело к «кренделеобразно -I6 му» домену 2 Антитело к М13	1,12± 0,04в 0,17 ±0,01	0,12 ±0,03 0,14 ±0,05	1,89 ±0,02 1,91 ±0,02	0,16 ±0,02 1,88 ±0,03

^а УС8М13 получали из штамма ХЬ-1 В1ие, трансформированного рСошЬ3Н88.

^б Применяли мышиное моноклональное антитело к «кренделеобразному» домену 2 (16/В). Другие антитела получали из овечьего иммуноглобулина.

^в Данные являются средними величинами абсорбции каждого образца, полученными по трем повторностям.

Перечень последовательностей <110> Бёрингер Ингельхайм Интернациональ ГмбХ, ИЕ <120> Способы крупномасштабного производства выведенных из рекомбинантной ДНК молекул б₽А или К23 <130> Сазе 1-11*70 <1 4 0>

<150> СВ 0027779.8 <151> 14 ноября 2000г.

<160> 25 <170> ВаеепЧп Уег . 2 . 1 <210> 1 <211> 18 <212> ΌΝΑ <220>

<223> Описание искусственной последовательности: кодирующая последовательность Ν-концевой области протеина К25 <400> 1 бсбдадддаа асадбдас <220>

<223> Описание искусственной последовательности: последовательность слитого протеина ОтрА-К25 <400> 2 абдааааада дсддссбсбд сасадссбса бдссддаабс асдбдддадб ссбсадбббс дссабсбббд абсадсбссб сассбдасдд бббдаадбсд аббдсдсбдс сдсасбдбдб дссббсссс бссддсбасд дсаадсабда ддссббдбс: сабдссад.

ассдасаа: дасдссбд. ббддбддд< асаааддб!

|са< бдб; бдсбдбдбдс адддсдаббс бсабса:

сдбддсссад 60 ссдбддсасд 120 ссбдабаддс 180 асабааббас 240 ссдсаддс-бд 300 дбасадссад 360 сбддсаддсб 420 :басбс 480 садсбабсдс даббдсадбд д< адддааасад бдасбдсбас Ы ... ссдадбсддд бдссбссбдс сбсссдбдд; садсасадаа ссссадбдс< сбдабдддда бдссаадсс< асбдбдабдб дсссбссбдс дсабсааадд адддсбсбб: ссаадсасад даддбсдсс: дсбддаббсб сбсбдссдс< бдабсббддд садаас;

бдсадсбдаа абсддаббсд ддсддассбд :бддсбд дбббсдсбас :ббдддаабд ддбсадссба • ' 1ббссабдаб саддсасбдд дссбдддсаа бддбдссасд бдсбдаадаа Ьссассбдсд дссбдадаса ддададсддб бссбдбдсдд дддс. сасбдсббсс аддададдбб бссд< сдддбддбсс сбддсдадда ддад< 1ад дааббсдабд абдасасбба сдасаабдас бсссдсбдбд сссаддадад садсдбддб< садсбдссдд асбддасдда дбдбдадсб» ссбббсбабб сддадсддсб дааддаддс’ сддадсддсд ддссс< сбддбдбдбс бдаасс бдбддасада аддабдбс< сдбдасааса бдсдассд

540

600

660

720

780 .сббаа садаасадбс 900 :саддс ааасббдсас 960 :дабдд ссдсабдасб 1020 дддбдбдбас 1080 1128 садссдсбдс бддадасасб дддаддсссс :дсбд дддссбдддс :аосб адасбддабб <210> 3 <211> бб <212> БЫА <213> ЕзсЬеххсЫа соИ <400> 3 айдааааада садсЕайсдс даЕйдсадЕд дсасйддсЕд дЕЕЕсдсЕас сдЕддсссад 60 дсддсс 66 <210> 4 <211> 1065 <212> ΟΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: кодирующая последовательность протеина К23 <400> 4

ЕсЕдадддаа	асадЕдасЕд	сЕасЕЕЕддд	ааЕдддЕсад	ссЕассдЕдд	сасдсасадс	60
сЕсассдадЕ	сдддЕдссЕс	сЕдссЕсссд	ЕддааЕЕсса	ЕдаЕссЕдаЕ	аддсааддЕЕ	120
Еасасадсас	адаассссад	Едсссаддса	сЕдддссЕдд	дсааасаЕаа	ЕЕасЕдссдд	180
ааЕссЕдаЕд	дддаЕдссаа	дсссЕддЕдс	сасдЕдсЕда	адаассдсад	дсЕдасдЕдд	240
дадЕасЕдЕд	аЕдЕдсссЕс	сЕдсЕссасс	ЕдсддссЕда	дасадЕасад	ссадссЕсад	300
ЕЕЕсдсаЕса	ааддадддсе	сЕЕсдссдас	аСсдссСссс	ассссЕддса	ддсЕдссаЕс	360
ЕЕЕдссаадс	асаддаддЕс	дсссддадад	сддЕЕссЕдЕ	дсдддддсаЕ	асЕсаЕсадс	420
ЕссЕдсЕдда	ЕЕсЕсЕсЕдс	сдсссасЕдс	ЕЕссаддада	ддЕЕЕссдсс	ссассассйд	480
асддЕдаЕсЕ	Едддсадаас	аЕассдддЕд	дЕсссЕддсд	аддаддадса	даааЕЕЕдаа	540
дЕсдаааааЕ	асаЕЕдЕсса	ЕааддааЕЕс	даЕдаЕдаса	сЕЕасдасаа	ЕдасаЕЕдсд	600
сЕдсЕдсадс	ЕдаааЕсдда	ЕЕсдЕсссдс	ЕдЕдсссадд	ададсадсдй	ддЕссдсасЕ	660
дЕдЕдссЕЕс	ссссддсдда	ссЕдсадсЕд	ссддасЕдда	сддадЕдЕда	дсЕсЕссддс	720
Еасддсаадс	аЕдаддссЕЕ	дЕсЕссЕЕЕс	ЕаЕЕсддадс	ддсЕдаадда	ддсЕсайдЕс	780
адасЕдЕасс	саЕссадссд	сЕдсасаЕса	саасаЕЕЕас	ЕЕаасадаас	адйсассдас	840
аасайдсЕдЕ	дЕдсЕддада	сасЕсддадс	ддсдддсссс	аддсааасЕЕ	дсасдасдсс	900
Едссадддсд	аЕЕсдддадд	сссссЕддЕд	ЕдЕсЕдаасд	аЕддссдсай	дасЕЕЕддйд	960
ддсаЕсаЕса	дсЕддддссЕ	дддсЕдЕдда	садааддаЕд	ЕсссдддЕдЕ	дЕасасааад	1020
дЕЕассаасЕ	ассЕадасЕд	даЕЕсдЕдас	аасайдсдас	сдЕда		1065

<210> 5 <211> 1128 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: кодирующая последовательность слитого протеина ОтрА-К23 · <400> 5 .

аЕдааааада садсЕаЕсдс даЕЕдсадйд дсасйддсЕд дЕЕЕсдсЕас сдЕддсссад 60 дсддссЕсЕд адддааасад ЕдасйдсЕас ЕЕЕдддааЕд ддйсадссЕа ссдЕддсасд 120 сасадссЕса ссдадЕсддд ЕдссСссЕдс сЕсссдЕдда аЕЕссаЕдаЕ ссЕдаЕаддс 180 ааддЕЕЕаса садсасадаа ссссадЕдсс саддсасЕдд дссЕдддсаа асаЕааЕЕас 240

ЕдссддааЕс сЕдаЕдддда Едссаадссс ЕддЕдссасд ЕдсЕдаадаа ссдсаддсЕд 300 асдйдддадЕ асЕдЕдаЕдЕ дсссЕссЕдс ЕссассЕдсд дссйдадаса дЕасадссад 360 ссЕсадЕЕЕс дсаЕсааадд адддсЕсЕЕс дссдасаЕсд ссЕсссассс сЕддсаддсЕ 420 дссаЕсЕЕЕд ссаадсасад даддЕсдссс ддададсддЕ ЕссЕдйдсдд дддсаЕасЕс 480 аЕсадсЕссЕ дсЕддаЕЕсй сЕсЕдссдсс сасЕдсЕЕсс аддададдЕЕ Ессдссссас 540 сассЕдасдд ЕдаЕсЕЕддд садаасаЕас сдддЕддЕсс сЕддсдадда ддадсадааа 600

ЕЕЕдаадЕсд аааааЕасаЕ ЕдЕссаЕаад дааЕЕсдаЕд аЕдасасЕЕа сдасааЕдас 660 аЕЕдсдсЕдс ЕдсадсЕдаа аЕсддаЕЕсд ЕсссдсЕдЕд сссаддадад садсдЕддЕс 720 сдсасЕдЕдЕ дссЕЕссссс ддсддассЕд садсЕдссдд асЕддасдда дЕдЕдадсЕс 780

ЕссддсЕасд дсаадсаЕда ддссЕЕдЕсЕ ссЕЕЕсСаЕЕ сддадсддсЕ дааддадд'сЕ 840 саЕдЕсадас ЕдЕасссаЕс садссдсйдс асаЕсасаас аЕЕЕасЕЕаа садаасадЕс 900 ассдасааса ЕдсЕдЕдЕдс ЕддадасасЕ сддадсддсд ддссссаддс ааасЕЕдсас 960 дасдссЕдсс адддсдаЕЕс дддаддсссс сЕддЕдЕдЕс ЕдаасдаЕдд ссдсаЕдасЕ 1020

ЕЕддЕдддса ЕсаЕсадсЕд дддссЕдддс ЕдЕддасада аддаЕдЕссс дддЕдЕдЕас 1080 асаааддЕЕа ссаасЕассЕ адасЕддаЕЕ сдЕдасааса Едсдассд 1128 <210> 6 <211> бб <212> ΏΝΑ <213> ЕзсЬеххсМа соИ <400> 6 аЕдааааада садсЕаЕсдс даЕЕдсадЕд дсасЕддсЕд дЕЕЕсдсЕас сдЕддсссад 60 дсддсс 66 <210> 7 <211> 1065 <212> ϋΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: кодирующая последовательность протеина К25 <400> 7

ЕсЕдадддаа	асадЕдасЕд	сЕасЕЕЕддд	ааЕдддйсад	ссЕассдЕдд	сасдсасадс	60
сЕсассдадЕ	сдддЕдссЕс	сЕдссЕсссд	ЕддааЕЕсса	ЕдаЕссЕдаЕ	аддсааддЕЕ	120
Еасасадсас	адаассссад	Едсссаддса	сЕдддссЕдд	дсааасаЕаа	ЕЕасЕдссдд	180
ааЕссЕдаЕд	дддаЕдссаа	дсссЕддЕдс	сасдЕдсЕда	адаассдсад	дсЕдасдЕдд	240
дадЕасЕдЕд	аЕдЕдсссЕс	сЕдсЕссасс	Едсддссйда	дасадЕасад	ссадссЕсад	300
ЕЕЕсдсаЕса	ааддадддсй	сЕЕсдссдас	аЕсдссйссс	ассссЕддса	ддсЕдссаЕс	360
ЕЕЕдссаадс	асаддаддЕс	дсссддадад	сддЕЕссЕдй	дсдддддсаЕ	асЕсаЕсадс	420
ЕссЕдсЕдда	ЕЕсЕсЕсЕдс	сдсссасЕдс	ЕЕссаддада	ддЕЕЕссдсс	ссассассЕд	480
асддЕдаЕсЕ	Едддсадаас	аЕассдддЕд	дЕсссЕддсд	аддаддадса	даааЕЕЕдаа	540
дЕсдаааааЕ	асаЕЕдЕсса	ЕааддааЕЕс	даЕдаЕдаса	сЕЕасдасаа	ЕдасаЕЕдсд	600
сЕдсЕдсадс	ЕдаааЕсдда	ЕЕсдЕсссдс	Едйдсссадд	ададсадсдй	ддЕссдсасЕ	660
дЕдЕдссЕЕс	ссссддсдда	ссЕдсадсЕд	ссддасйдда	сддадЕдЕда	дсЕсЕссддс	720
Еасддсаадс	аЕдаддссЕЕ	дЕсЕссЕЕЕс	ЕаЕЕсддадс	ддсЕдаадда	ддсЕсаЕдЕс	780
адасЕдЕасс	саЕссадссд	сйдсасаЕса	саасаЕЕЕас	ЕЕаасадаас	адЕсассдас	840
аасаЕдсЕдЕ	дЕдсЕддада	сасЕсддадс	ддсдддсссс	аддсааасЕЕ	дсасдасдсс	900
Едссадддсд	аЕЕсдддадд	сссссЕддЕд	ЕдЕсЕдаасд	аЕддссдсаЕ	дасЕЕЕддЕд	960
ддсаЕсаЕса	дсЕддддссЕ	дддсЕдЕдда	садааддаЕд	ЕсссдддЕдЕ	дЕасасааад	1020
дЕЕассаасЕ	ассЕадасЕд	даЕЕсдЕдас	аасаЕдсдас	сдЕда		1065

<400> 8 МеЕ Ьуз 1

Ьуз ТЬг

А1а Не 5

А1а

Не

А1а

Уа1 10

А1а

Ьеи

А1а

О1у

РЬе 15

А1а

ТЬг Уа1

А1а С1п 20

А1а А1а

Зег

С1и

С1у 25

Азп

Зег

Азр

Суз

Туг 30

РЬе

С1у

Азп С1у

Зег А1а 35

Туг Агд

С1у

ТЬг 40

Нхз

5ег

Ьеи

ТЬг

С1и 45

Зех

С1у

А1а

Зег Суз 50

Ьеи Рго

Тгр Азп

Зег 55

Мей

Не

Ьеи

Не

С1у 60

Ьуз

Уа1

Туг

ТЬг

А1а С1п 65

Азп

Рхо

Зег А1а 70

б1п

А1а

Ьеи

С1у

Ьеи 75

С1у

Ьуз

Нхз

Азп

Тух 80

Суз Агд

Азп Рго

Азр С1у 85

Азр

А1а

Ьуз

Рго 90

Тгр

Суз

ΗΪ5

Уа1

Ьеи 95

Ьуз

Азп Агд

Агд Ьеи 100

ТЬг Тгр

О1и

Туг

Суз 105

Азр

Уа1

Рго

Зег

Суз 110

Зех

ТЬг

Суз С1у

Ьеи Агд 115

С1п Туг

Зег

61п 120

Рго

Й1п

РЬе

Агд

Не 125

Ьуз

С1у

С1у

Ьеи РЬе 130

А1а Азр

Не А1а

Зег 135

Нхз

Рго

Тгр

<31п

А1а 140

А1а

Не

РЬе

А1а

Ьуз ΗΪ5 145

Агд Агд

Зег Рго 150

С1у

С1и

Агд

РЬе

Ьеи 155

Суз

С1у

С1у

Не

Ьеи 160.

Не Зег

Зег Суз

Тгр 11е 165

Ьеи

Зег

А1а

А1а 170

ΗΪ3

Суз

РЬе

С1п

С1и 175

Агд

РЬе Рго

Рго Нхз 180

Нхз Ьеи

ТЫ

Уа1

Не 195

Ьеи

61у

Агд

ТЬг

Тух 190

Ахд

Уа1

Уа1 Рго

С1у С1и 195

С1и С1и

С1п

Ьуз 200

РЬе

С1и

Уа1

С1и

Ьуз 205

Туг

Не

Уа1

Н1з Ьуз 210

б!и

РЬе

Агр Азр

Азр 215

ТЬг

Туг

Азр

Азп

Азр 220

Не

А1а

Ьеи

Ьеи

С1п Ьеи 225

1у, =ег

Азр Зег 230

Зег

Агд

Суз

А1а

С1п 235

С1и

Зег

Зех

Уа1

Уа1 240

Агд ТЬг

Уа1 Суз

Ьеи Рго 245

Рго

А1а

Азр

Ьеи 250

<31п

Ьеи

Рго

Азр

Тгр 255

ТЬх

С1и Суз

С1и Ьеи 260

Зег С1у

Туг

61у

Ьуз 265

ΗΪ3

б1и

А1а

Ьеи

Зег 270

Рго

РЬе

Туг Зег

С1и Агд 275

Ьеи Ьуз

С1и

А1а 280

Нхз

Уа1

Агд

Ьеи

Туг 285

Рго

Зех

Зег

Агд Суз 290

ТЬг Зег

61п Нхз

Ьеи 295

Ьеи

Азп

Агд

ТЬг

Уа1 300

ТЬг

Азр

Азп

МеЕ

Ьеи Суз 305

А1а С1у

Азр ТЬг 310

Агд

Зег

С1у

С1у

Рго 315

С1п

А1а

Азп

Ьеи

ΗΪ3 320

Азр

А1а Суз

С1п

С1у 325

Азр

Зех

<31у С1у

Рго 330

Ьеи Уа1

Суз

Ьеи

Азп 335

Азр

С1у

Агд

МеЕ

ТЬг

Ьеи

Уа1

<31у

Не

Не

Зег

Тгр

С1у

Ьеи

С1у

Суз

С1у

340

345

350

<31п

Ьуз

Азр

Уа1

Рго

С1у

Уа1

Туг

ТЬх

Ьуз

Уа1

ТЬх

Азп

Туг

Ьеи

Азр

355

360

365

Тхр

Не

Ахд

Азр

Азп

МеЕ

Ахд

Рхо

С1 у

370

375

<210> 9 <211> 4 <212> РНТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: пептидная последовательность <400> 9

Зег С1и С1у Азп <210> 10 <211> 6 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: пептидная последовательность <400> 10

Зег О1ц С1у Азп Зег Азр

5 <210> 8 <211> 377 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: слитый протеин ОшрАК2 3 <210> 11 <211> 354 <212> РРТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К23 174-527 <400> 11

Зег О1и С1у Азп 1

С1у ТЬг Н1з Зег

Зег МеЕ Не Ьеи

О1п А1а Ьеи О1у

Зег Азр Суз Туг

Ьеи ТЬг О1и Зег

Не 61у Ьуз Уа1

Ьеи О1у Ьуз Нхз

РЬе 61у Азп С1у

С1у А1а Зег Суз 25

Туг ТЬг А1а С1п

Азп Туг Суз Агд

Зег А1а Туг Агд

Ьеи Рго Тгр Азп

Азп Рго Зег А1а.

Азп Рго Азр С1у

Азр 65

А1а

Рго

Тгр Суз Ηίε 70

Уа1

Ьеи

Ьуз

Азп 75

Агд

Агд Ьеи

ТЬг

Тгр 80

61и

Туг

Суз

Азр

Уа1

Рхо

Зех

Суз

Зег

ТЬг

Суз

61 у

Ьеи

Агд

61п

Тух

85

90

95

Зег

С1п

Рго

61п

РЬе

Агд

11е

Ьу5

61у

С1у

Ьеи

РЬе

А1а

Азр

Не

А1а

100

105

НО

Зег

Ηίε

Рго

Тгр

61п

А1а

А1а

Не

РЬе

А1а

Ьуз

Нхз

Агд

Агд

Зех

Рхо

115

120

125

61у

С1и

Агд

РЬе

Ьеи

Суз

С1у

С1у

Не

Ьеи

Не

Зег

Зег

Суз

Тгр

Не

130

135

140

Ьеи

Зег

А1а

А1а

ΗΪ3

Суз

РЬе

61п

61и

Агд

РЬе

Рго

Рго

Ηίε

Нхз

Ьеи

145

150

155

160

ТЬг

Уа1

Не

Ьеи

61у

Агд

ТЬг

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Рго

61у

61и

С1и

61и

165

170

175

61п

Ьуз

РЬе

61и

Уа1

б1и

Ьуз

Туг

11е

Уа1

Нхз

Ьуз

61и

РЬе

Азр

Азр

180

185

190

Αερ

ТЬх

Туг

Азр

Азп

Азр

Не

А1а

Ьеи

Ьеи

σΐη

Ьеи

Ьуз

Зег

Азр

Зег

195

200

205

Зег

Агд

Суз

А1а

С1п

61и

Зег

Зег

Уа1

Уа1

Агд

ТЬг

Уа1

Суз

Ьеи

Рго

210

215

220

Рго

А1а

Αερ

Ьеи

С1п

Ьеи

Рго

Азр

Тгр

ТЬг

С1и

Суз

61и

Ьеи

Зег

61у

225

230

235

240

Туг

61у

Ьуз

Ηίε

61и

А1а

Ьеи

Зег

Рго

РЬе

Туг

Зег

61и

Агд

Ьеи

Ьуз

245

250

255

61и

А1а

Ηίε

Уа1

Агд

Ьеи

Туг

Рго

Зег

Зег

Агд

Суз

ТЬх

Зег

61п

Нхз

260

265

270

Ьеи

Ьеи

Азп

Агд

ТЬг

Уа1

ТЬг

Азр

Азп

МеЕ

Ьеи

Суз

А1а

61у

Азр

ТЬг

275

280

285

Агд

Зег

С1у

61у

Рхо

61п

А1а

Азп

Ьеи

Нхз

Азр

А1а

Суз

61п

61у

Азр

290

295

300

Зег

61у

С1у

Рго

Ьеи

Уа1

Суз

Ьеи

Азп

Азр

61 у

Ахд

МеЕ

ТЬг

Ьеи

Уа1

305

310

315

320

С1у

Не

Не

Зег

Тгр

61у

Ьеи

С1у

Суз

С1у

61п

Ьуз

Азр

Уа1

Рхо

61у

325

330

335

Уа1

Туг

ТЬг

Ьуз

Уа1

ТЬх

Азп

Тух

Ьеи

Азр

Тгр

Не

Агд

Азр

Азп

МеЕ

340

345

350

Агд Рго <210> 12 <211> 331 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К23 197-527 <400> 12

Зех 1

61у А1а

Зег Суз 5

Ьеи

Рго Тгр Азп Зег 10

Мей

Не

Ьеи

11е

61у 15

Ьуз

Уа1

Туг

ТЬг

А1а

61п

Азп

Рго

Зег

А1а

61п

А1а

Ьеи

61у

Ьеи

61у

Ьуз

20

25

30

Ηίε

Азп

Туг

Суз

Агд

Азп

Рго

Азр

61у

Азр

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Суз

Ηίε

35

40

45

Уа1

Ьеи

Ьуз

Азп

Агд

Агд

Ьеи

ТЬг

Тгр

61и

Туг

Суз

Азр

Уа1

Рхо

Зег

50

55

60

Суз

Зег

ТЬг

Суз

61у

Ьеи

Агд

61п

Туг

Зег

С1п

Рго

61П

РЬе

Агд

Не

65

70

75

80

Ьуз

61у

61у

Ьеи

РЬе

А1а

Азр

11е

А1а

Зех

ΗΪ3

Рхо

Тхр

61п

А1а

А1а

85

90

95

11е

РЬе

А1а

Ьуз

Нхз

Агд

Агд

Зег

Рго

61у

О1и

Агд

РЬе

Ьеи

Суз

61у

100

105

110

61у

Не

Ьеи

Не

Зех

Зех

Суз

Тгр

Не

Ьеи

Зех

А1а

А1а

Нхз

Суз

РЬе

115

120

125

С1п

61и

Ахд

РЬе

Рго

Рго

Ηίε

Ηίε

Ьеи

ТЬг

Уа1

Не

Ьеи

61у

Агд

ТЬг

130

135

140

Туг

Агд

Уа1

Уа1

Рго

61 у

61и

61и

61и

61п

Ьуз

РЬе

61и

Уа1

61и

Ьуз

145

150

155

160

Туг

11е

Уа1

Ηίε

Ьуз

61и

РЬе

Азр

Αερ

Азр

ТЬг

Туг

Азр

Азп

Азр

Не

165

170

175

А1а

Ьеи

Ьеи

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

Азр

Зег

Зег

Агд

Суз

А1а

61п

61и

Зег

180

185

190

Зех

Уа1

Уа1

Ах д

ТЬг

Уа1

Суз

Ьеи

Рго

Рго

А1а

Азр

Ьеи

61п

Ьеи

Рго

195

200

205

Азр

Тгр

ТЬх

61и

Суз

61 и

Ьеи

Зег

61у

Туг

61у

Ьуз

Нхз

61и

А1а

Ьеи

210

215

220

Зег

Рхо

РЬе

Туг

Зег

С1и

Агд

Ьеи

Ьуз

61и

А1а

Ηίε

Уа1

Агд

Ьеи

Туг

225

230

235

240

Рхо

Зег

Зег

Агд

Суз

ТЬг

Зег

61п

Н15

Ьеи

Ьеи

Азп

Агд

ТЬг

Уа1

ТЬг

245

250

255

Азр

Азп

МеЕ

Ьеи

Суз

А1а

С1у

Азр

ТЬг

Агд

Зег

61у

61у

Рхо

61п

А1а

260

265

270

Азп

Ьеи

ΗΪ3

Αερ

А1а

Суз

61п

61у

Азр

Зег

61 у

61у

Рго

Ьеи

Уа1

Суз

275

280

285

Ьеи

Азп

Азр

61у

Агд

МеЕ

ТЬг

Ьеи

Уа1

61у

Не

Не

Зег

Тгр

61у

Ьеи

290

295

300

61у

Суз

61у

61л

Ьуз

Азр

Уа1

Рго

61у

Уа1

Туг

ТЬх

Ьуз

Уа1

ТЬг

Азп

305

310

315

320

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Не

Агд

Азр

Азп

МеЕ

Агд

Рго

325 330 <210> 13 <211> 339 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К25 193-527 модифицированный

<400> 13

Зег 1

61и

61у

Азп

Зег Ьеи 5

ТЬг

61и

Зег

61у А1а 10

Зег

Суз

Ьеи

Рго 15

Тгр

Азп

Зег

МеЕ

Не

Ьеи

Не

61у

Ьуз

Уа1

Туг

ТЬг

А1а

61п

Азп

Рго

Зег

20

25

30

А1а

61п

А1а

Ьеи

61у

Ьеи

61у

Ьуз

Нхз

Азп

Тух

Суз

Агд

Азп

Рго

Азр

35

40

45

61у

Азр

А1а

Ьуз

Рго

Тгр

Суз

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьуз

Азп

Агд

Агд

Ьеи

ТЬг

50

55

60

Тхр

61и

Туг

Суз

Азр

Уа1

Рго

Зег

Суз

Зег

ТЬг

Суз

61у

Ьеи

Агд

61п

65

70

75

80

Туг

Зег

61п

Рго

61п

РЬе

Агд

Не

Ьуз

61у

61у

Ьеи

РЬе

А1а

Азр

Не

85

90

95

А1а

Зег

Ηίε

Рхо

Тгр

61п

А1а

А1а

Не

РЬе

А1а

Ьуз

Ηίε

Агд

Агд

Зех

100

105

НО

Рхо

61у

61и

Ахд

РЬе

Ьеи

Суз

61у

61у

Не

Ьеи

Не

Зех

Зег

Суз

Тхр

115

120

125

Не

Ьеи

Зех

А1а

А1а

Н15

Суз

РЬе

О1п

61и

Агд

РЬе

Рхо

Рхо

Нхз

Нхз

130

135

140

Ьеи

ТЬг

Уа1

Не

Ьеи

61у

Агд

ТЬг

Тух

Ахд

Уа1

Уа1

Рго

С1у

С1и

61и

14 5

150

155

160

61и

61п

Ьуз

РЬе

61и

Уа1

61и

Ьуз

Туг

Не

Уа1

Нхз

Ьуз

61и

РЬе

Азр

165

170

175

Азр

Αερ

ТНг

Туг

Азр

Азп

Азр

Не

А1а

Ьеи

Ьеи

61п

Ьеи

Ьуз

Зег

Азр

180

185

190

5ег

Зех

Агд

Суз

А1а

61п

61и

Зег

Зег

Уа1

Уа1

Агд

ТЬг

Уа1

Суз

Ьеи

195

200

205

Рго

Рго

А1а

Αερ

Ьеи

61п

Ьеи

Рго

Азр

Тгр

ТЬг

61и

Суз

61и

Ьеи

Зех

210 215 220

61у Туг С1у Ьуз Ηχε С1и А1а Ьеи Зег Рго РЬе Туг Зег 61и Агд Ьеи

225 230 235240

Ьуз б1и А1а Ηίε Уа1 Агд Ьеи Туг Рго Зег Зег Агд Суз ТНг Зег61п

245 250255

Ηίε Ьеи Ьеи Азп Агд ТЬг Уа1 ТНг Азр Азп МеЕ Ьеи Суз А1а 61у Азр

260 265270

ТНг Агд Зег 61у 61у Рго 61п А1а Азп Ьеи Ηίε Αερ А1а Суз 61п С1у

275 280285

Азр

Зег 290

61у

61у Рго Ьеи Уа1 295

Суз

Ьеи Азп

Азр

61у 300

Агд МеЕ

ТЬг

Ьеи

Уа1

61у

Не

11е

Зег

Тхр

61у

Ьеи

61у

Суз

61у

61п

Ьуз

Азр

Уа1

Рго

305

310

315

320

61у

Уа1

Туг

ТЬг

Ьуз

Уа1

ТНг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Не

Ахд

Азр

Азп

325 330 335

МеЕ Агд Рго <210> 14 <211> 335 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К25 193-527 модифицированный

<400> 14

61и Зег 5

61у А1а Зег Суз

Ьеи Рго Тгр 10

Азп

Зег

МеЕ 15

Не

Зех 1

Ьеи

ТЬг

Ьеи

Не

61у

Ьуз

Уа1

Туг

ТЬг

А1а

61п

А5П

Рго

Зег

А1а

61п

А1а

Ьеи

20

25

30

61у

Ьеи

61у

Ьуз

Нхз

Азп

Туг

Суз

Агд

Азп

Рго

Азр

61у

Аар

А1а

Ьуз'

35

40

45

Рго

Тхр

Суз

Нхз

Уа1

Ьеи

Ьуз

Азп

Ахд

Агд

Ьеи

ТЬг

Тгр

61и

Туг

Суз

50

55

60

Азр

Уа1

Рхо

Зег

Зег

5ег

ТЬг

Суз

61у

Ьеи

Агд

61п

Тух

Зег

61п

Рго

65

70

75

80

61п

РЬе

Агд

11е

Ьуз

61 у

61у

Ьеи

РЬе

А1а

Азр

11е

А1а

Зег

ΗΪ5

Рго

85

90

95

Тгр

61п

А1а

А1а

Не

РЬе

А1а

Ьуз

Нхз

Агд

Агд

Зег

Рго

61у

61и

Агд

100

105

110

РЬе

Ьеи

Суз

61у

61у

Не

Ьеи

Не

Зег

Зег

Суз

Тхр

Не

Ьеи

Зег

А1а

115

120

125

А1а Нхз 130

Суз

РЬе

СЬп

СЬи

Агд 135

РЬе

Рго

Рго

Нхз Нхз Ьеи 140

ТЬг

УаЬ

1Ье

Беи

СЬу

Агд

ТЬг

Туг

Агд

УаЬ

УаЬ

Рго

СЬу

СЬи

СЬи

СЬи

С1п

Ьуз

РЬе

145

150

155

160

СЬи

УаЬ

СЬи

Ьуз

Туг

11е

УаЬ

Нхз

Ьуз

СЬи

РЬе

Азр

Аэр

Азр

ТЬг

Туг

165

170

175

Азр

Азп

Азр

Не

А1а

Ьеи

Ьеи

СЬп

Ьеи

Ьуз

Зег

Азр

Зег

Зег

Агд

Суз

180

185

190

АЬа

СЬп

СЬи

Зег

Зег

УаЬ

УаЬ

Агд

ТЬг

УаЬ

Суз

Ьеи

Рго

Рго

А1а

Азр

195

200

205

Ьеи

СЬп

Ьеи

Рго

Азр

Тгр

ТЬг

СЬи

Суз

С1и

Ьеи

Зег

СЬу

Туг

СЬу

Ьуз

210

215

220

Нхз

СЬи

А1а

Ьеи

Зех

Рго

РЬе

Туг

Зег

С1и

Агд

Ьеи

Ьуз

СЬи

АЬа

Нхз

225

230

235

240

УаЬ

Агд

Ьеи

Туг

Рго

Зег

Зег

Агд

Суз

ТЬг

Зег

СЬп

Нхз

Ьеи

Ьеи

Азп.

245

250

255

Агд

ТЬг

УаЬ

ТЬг

Азр

Азп

МеС

Ьеи

Суз

А1а

СЬу

Азр

ТЬг

Агд

Зег

СЬу

260

265

270

СЬу

Рго

СЬп

АЬа

Азп

Ьеи

НХЗ

Азр

А1а

Суз

СЬп

СЬу

Азр

Зег

СЬу

СЬу

275

280

285

Рго

Ьеи

УаЬ

Суз

Ьеи

Азп

Азр

СЬу

Агд

Мей

ТЬг

Ьеи

УаЬ

СЬу

Не

11е

290

295

300

Зег

Тгр

СЬу

Ьеи

СЬу

Суз

СЬу

СЬп

Ьуз

Азр

УаЬ

Рго

СЬу

νβΐ

Туг

ТЫ

305

310

315

320

Ьуз

УаЬ

ТЬг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

1Ье

Агд

Азр

Азп

МеЕ

Агд

Рго

325 330 335 <2Ь0> 15 <211> 343 <212> РАТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К25 191-527, модифицированный <400> 15

Зег СЬи 1

СЬу Азп Зег Азр ТЬг Нхз 5

Зег Ьеи ЬО

ТЬг СЬи

Зег

СЬу

АЬа 15

Зег

Суз

Ьеи

Рго

Тгр

Азп

Зег

МеЪ

1Ье

Ьеи

Не

СЬу

Ьуз

УаЬ

Туг

ТЬг

АЬа

20

25

30

СЬп

Азп

Рго

Зег

АЬа

СЬп

АЬа

Ьеи

С1у

Ьеи

СЬу

Ьуз

Нхз

Азп

Туг

Суз

35

40

45

Агд

Азп

Рго

Азр

СЬу

Азр

АЬа

Ьуз

Рго

Тгр

Суз

Нхз

УаЬ

Ьеи

Ьуз

Азп

50

55

60

Агд

Агд

Ьеи

ТЬг

Тгр

СЬи

Туг

Суз

Азр

УаЬ

Рго

Зег

Суз

Зег

ТЬг

Суз

65

70

75

80

51 у

Ьеи

Агд

СЬп

Туг

Зег

СЬп

Рго

СЬп

РЬе

Агд

Не

Ьуз

СЬу

СЬу

Ьеи

85

90

95

РЬе

АЬа

Азр

Не

АЬа

Зег

Нхз

Рго

Тгр

СЬп

АЬа

АЬа

Не

РЬе

АЬа

Ьуз

100

105

НО

Нхз

Агд

Агд

Зег

Рго

СЬу

СЬи

Агд

РЬе

Ьеи

Суз

СЬу

СЬу

Не

Ьеи

Не

115

Ь20

125

Зег

Зех

Суз

Тгр

1Ье

Ьеи

Зег

АЬа

АЬа

Нхз

Суз

РЬе

СЬп

СЬи

Агд

РЬе

130

135

140

Рго

Рго

Нхз

Нхз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Пе

Ьеи

СЬу

Агд

ТЬг

Тух

Агд

УаЬ

УаЬ

145

150

155

160

Рго

С1у

СЬи

СЬи

СЬи

СЬп

Ьуз

РЬе

СЬи

УаЬ

С1и

Ьуз

Туг

Не

УаЬ

Нхз

165

170

175

Ьуз

СЬи

РЬе

Азр

Азр

Азр

ТЬг

Туг

Азр

Азп

Азр

Не

АЬа

Ьеи

Ьеи

СЬп

180

185

190

Ьеи

Ьуз

Зег

Азр

Зег

Зег

Агд

Суз

АЬа

СЬп

СЬи

Зег

Зег

УаЬ

УаЬ

Агд

195

200

205

ТЬг

УаЬ

Суз

Ьеи

Рго

Рго

АЬа

Азр

Ьеи

СЬп

Ьеи

Рго

Азр

Тгр

ТЬг

СЬи

210

215

220

Суз

СЬи

Ьеи

Зег

СЬу

Туг

СЬу

Ьуз

Нхз

СЬи

АЬа

Ьеи

Зег

Рго

РЬе

Тух

225

230

235

240

Зег

СЬи

Агд

Ьеи

Ьуз

СЬи

АЬа

Нхз

УаЬ

Агд

Ьеи

Туг

Рго

Зег

Зег

Агд

245

250

255

Суз

ТЬг

Зег

СЬп

Нхз

Ьеи

Ьеи

Азп

Агд

ТЫ

УаЬ

ТЬг

Азр

Азп

МеЪ

Ьеи

260

265

270

Суз

А1а

СЬу

Азр

ТЬг

Агд

Зег

СЬу

СЬу

Рго

С1п

АЬа

Азп

Ьеи

Нхз

Азр

275

280

295

АЬа

Суз

СЬп

СЬу

Азр

Зег

СЬу

СЬу

Рго

Ьеи

УаЬ

Суз

Ьеи

Азп

Азр

СЬу

290

295

300

Агд

Мей

ТЬг

Ьеи

УаЬ

СЬу

1Ье

1Ье

Зег

Тгр

СЬу

Ьеи

СЬу

Суз

СЬу

СЬп

305

ЗЬО

315

320

Ьуз

Азр

УаЬ

Рго

СЬу

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьуз

УаЬ

ТЬг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

325

330

335

Не

Агд

Азр

Азп

МеС

Агд

Рго

340 <210> 16 <211> 343 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К23 191-527, модифицированный <400> 16

Зег СЬи 1

СЬу Азп

Зег Азр 5

ТЬх Нхз

Зег

Ьеи ТЬг СЬи 10

Зег

СЬу АЬа 15

Зег

Суз Ьеи

Рго

Тгр

Азп

Зег

МеС

11е

Ьеи

Не

СЬу

Ьуз

УаЬ

Туг

ТЬг

АЬа

20

25

30

СЬп Азп

Рго

Зег

АЬа

С1п

АЬа

Ьеи

СЬу

Ьеи

СЬу

Ьуз

Нхз

Азп

Туг

Суз

35

40

45

Агд Азп

Рго

Азр

СЬу

Азр

АЬа

Ьуз

Рхо

Тгр

Суз

Нхз

УаЬ

Ьеи

Ьуз

Азп

50

55

60

Ахд Агд

Ьеи

ТЬг

Тгр

СЬи

Тух

Суз

Азр

УаЬ

Рхо

Зег

Зег

Зех

ТЬг

Суз

65

70

75

80

О1у Ьеи

Агд

СЬп

туг

Зег

СЬп

Рго

СЬп

РЬе

Агд

Не

Ьуз

СЬу

СЬу

Ьеи

85

90

95

РЬе АЬа

Азр

Не

АЬа

Зег

Нхз

Рго

Тхр

СЬп

АЬа

АЬа

Не

РЬе

А1а

Ьуз

100

105

110

Нхз Агд

Агд

Зех

Рго

СЬу

СЬи

Агд

РЬе

Ьеи

Суз

СЬу

СЬу

Не

Ьеи

Не

115

120

125

Зег Зег

Суз

Тгр

Не

Ьеи

Зег

АЬа

АЬа

Нхз

Суз

РЬе

СЬп

СЬи

Агд

РЬе

130

135

140

Рго Рго

Нхз

Нхз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Не

Ьеи

СЬу

Ахд

ТЬх

Туг

Агд

УаЬ

УаЬ

145

150

155

160

Рго СЬу

С1и

СЬи

СЬи

СЬп

Ьуз

РЬе

СЬи

УаЬ

СЬи

Ьуз

Туг

Не

УаЬ

Нхз

165

170

175

Ьуз СЬи

РЬе

Азр

Азр

Азр

ТЬг

Тух

Азр

Азп

Азр

Не

АЬа

Ьеи

Ьеи

СЬп

180

185

190

Ьеи Ьуз

Зег

Азр

Зег

Зег

Ахд

Суз

АЬа

СЬп

С1и

Зех

Зег

УаЬ

УаЬ

Агд

195

200

205

ТЬг УаЬ

Суз

Ьеи

Рго

Рхо

АЬа

Азр

Ьеи

СЬп

Ьеи

Рго

Азр

Тгр

ТЬг

СЬи

210

215

220

Суз СЬи

Ьеи

Зег

С1у

Туг

СЬу

Ьуз

Нхз

СЬи

АЬа

Ьеи

Зег

Рго

РЬе

Туг

225

230

235

240

Зег СЬи

Ахд

Ьеи

Ьуз

СЬи

АЬа

Нхз

УаЬ

Ахд

Ьеи

Туг

Рхо

Зег

Зех

Ахд

245

250

255

Суз ТЬг

Зех

СЬп

Нхз

Ьеи

Ьеи

Азп

Агд

ТЬг

УаЬ

ТЬг

Азр

Азп

МеС

Ьеи

260

265

270

Суз АЬа

СЬу

Азр

ТЬх

Ахд

Зех

СЬу

СЬу

Рго

СЬп

АЬа

Азп

Ьеи

Нхз

Азр

275

280

285

АЬа Суз

СЬп

СЬу

Азр

Зег

СЬу

СЬу

Рго

Ьеи

УаЬ

Суз

Ьеи

Азп

Азр

С1у

290

295

300

Агд МеЬ

ТЬг

Ьеи

УаЬ

СЬу

Не

Не

Зег

Тгр

СЬу

Ьеи

С1у

Суз

СЬу

С1п

305

310

315

320

Ьуз Азр

УаЬ

Рхо

СЬу

УаЬ

Туг

ТЬг

Ьуз

УаЬ

ТЬг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

325

330

335

11е Агд

Азр

Азп

МеЬ

Агд

Рго

340 <210> 17 <211> 308 <212> РАТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К23 220-527

<400> 17

Суз Агд

Азп 15

Рго

Зег 1

АЬа

СЬп

А1а

Ьеи 5

СЬу

Ьеи СЬу

Ьуз

Нхз 10

Азп

Туг

Азр

СЬу

Азр

АЬа

Ьуз

Рхо

Тгр

Суз

Нхз

УаЬ

Ьеи

Ьуз

Азп

Агд

Ахд

Ьеи

20

25

30

ТЬг

Тгр

СЬи

Туг

Суз

Азр

УаЬ

Рго

Зег

Суз

Зег

ТЬг

Суз

СЬу

Ьеи

Агд

35

40

45

СЬп

Туг

Зег

СЬп

Рго

СЬп

РЬе

Агд

Не

Ьуз

СЬу

СЬу

Ьеи

РЬе

АЬа

Азр

50

55

60

1Ье

АЬа

Зег

Нхз

Рго

Тгр

СЬп

АЬа

АЬа

1Ье

РЬе

АЬа

Ьуз

Нхз

Агд

Агд

65

70

75

80

Зег

Рго

СЬу

СЬи

Агд

РЬе

Ьеи

Суз

СЬу

СЬу

Не

Ьеи

Не

Зег

Зег

Суз

85

90

95

Тгр

1Ье

Ьеи

Зех

АЬа

АЬа

Нхз

Суз

РЬе

СЬп

СЬи

Агд

РЬе

Рго

Рго

Нхз

100

105

110

Нхз

Ьеи

ТЬг

УаЬ

Не

Ьеи

СЬу

Агд

ТЬг

Туг

Агд

УаЬ

УаЬ

Рго

СЬу

СЬи

115

120

125

СЬи

СЬи

СЬп

Ьуз

РЬе

СЬи

УаЬ

СЬи

Ьуз

Туг

Не

УаЬ

Нхз

Ьуз

СЬи

РЬе

130

Ь35

14 0

Азр

Азр

Азр

ТЬг

Туг

Азр

Азп

Азр

Не

АЬа

Ьеи

Ьеи

СЬп

Ьеи

Ьуз

Зег

145

150

155

160

Азр

Зег

Зег

Агд

Суз

АЬа

СЬп

СЬи

Зег

Зег

УаЬ

УаЬ

Агд

ТЬг

УаЬ

Суз

165

170

175

Ьеи

Рго

Рго

АЬа

Азр

Ьеи

СЬп

Ьеи

Рго

Азр

Тгр

ТЬг

СЬи

Суз

СЬи

Ьеи

180

185

190

Зег

СЬу

Туг

СЬу

Ьуз

Нхз

СЬи

АЬа

Ьеи

Зег

Рго

РЬе

Туг

Зег

СЬи

Агд

195

200

205

Ьеи

Ьуз

СЬи

АЬа

НЬз

УаЬ

Агд

Ьеи

Туг

Рго

Зег

Зег

Агд

Суз

ТЬх

Зег

210

215

220

С1п 225

НЬз

Ьеи

Ьеи

Азп

Агд ТЬг Уа1 ТЬг 230

Азр Азп 235

МеЕ

Ьеи Суз

А1а

С1у 240

Азр

ТЬг

Агд

Зег

51 у

С1у

Рго

С1п

А1а

Азп

Ьеи

НЬз

Азр

А1а

Суз

С1п

245

250

255

С1у

Азр

Зег

С1у

С1у

Рго

Ьеи

Уа1

Суз

Ьеи

Азп

Азр

51у

Агд

МеЕ

ТЬг·

260

265

270

Ьеи

Уа1

С1у

Не

Не

Зег

Тгр

С1у

Ьеи

С1у

Суз

61у

С1п

Ьуз

Азр

Уа1

275

280

285

Рго

С1у

Уа1

Туг

ТЬг

Ьуз

Уа1

ТЬг

Азп

Туг

Ьеи

Азр

Тгр

Не

Агд

Азр

290 295 300

Азп МеЕ Агд Рго

305 <210> 18 <211> 268 <212> РКТ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: К23 260-527 <400> 18

Зег Суз Зег ТЬг Суз С1у Ьеи Агд С1п Туг Зег С1п Рго С1п РЬе Агд 15 1015

Не Ьуз С1у С1у Ьеи РЬе А1а Азр Не А1а Зег НЬз Рго Тгр 61п А1а . 20 2530

А1а Не РЬе А1а Ьуз НЬз Агд Агд Зег Рго С1у С1и Агд РЬе Ьеи Суз 35 4045

С1у С1у Не Ьеи Не Зег Зег Суз Тгр Не Ьеи Зег А1а А1а НЬз Суз 50 5560

РЬе С1п С1и Агд РЬе Рго Рго НЬз НЬз Ьеи ТЬг Уа1 Не Ьеи С1у Агд 65 70 7580

ТЬг Туг Агд Уа1 Уа1 Рго С1у С1и С1и С1и С1п Ьуз РЬе С1и Уа1 С1и 85 9095

Ьуз Туг Не Уа1 НЬз Ьуз 61и РЬе Азр Азр Азр ТЬг Туг Азр Азп Азр 100 105110

Не А1а Ьеи Ьеи С1п Ьеи Ьуз Зег Азр Зег Зег Агд Суз А1а С1п С1и 115 120125

Зег Зег Уа1 Уа1 Агд ТЬг Уа1 Суз Ьеи Рго Рго А1а Авр Ьеи С1п Ьеи 130 135140

Рго Азр Тгр ТЬг С1и Суз С1и Ьеи Зег С1у Туг С1у Ьуз НЬз С1иА1а

145 150 155160

Ьеи Зег Рго РЬе Туг Зег С1и Агд Ьеи Ьуз С1и А1а НЬз Уа1 АгдЬеи

165 170175

Туг	Рго	Зег	Зег 180	Агд	Суз	ТЬг	Зег
ТЬг	Азр	Азп 195	МеЕ	Ьеи	Суз	А1а	С1у 200
А1а	Азп 210	Ьеи	НЬз	Азр	А1а	Суз 215	С1п
Суз 225	Ьеи	Азп	Азр	С1у	Агд 230	МеЕ	ТЬг
Ьеи	С1у	Суз	С1у	С1п 245	Ьуз	Азр	νβΐ

51п 185	ΗΪ3	Ьеи	Ьеи	Азп	190	ТЬг	Уа1
Азр	ТЬг	Агд	Зег	С1у 205	С1у	Рго	С1п
51у	Азр	Зег	С1у 220	С1у	Рго	Ьеи	Уа1
Ьеи	Уа1	С1у 235	11е	11е	Зег	Тгр	С1у 240
Рго	С1у 250	Уа1	Туг	ТЬг	Ьуз	Уа1 255	ТЬг

Азп Туг Ьеи Азр Тгр 11е Агд Азр

260

Азп МеЕ Агд Рго

265 <210> 19 <211> 527 <212> РКТ <213> Ното зарЬепз

<40С Зег 1

|> 18 Туг

С1п

Уа1

Не 5

Суз

Агд

Азр

51и

Ьуз 10

ТЬг

С1п

МеЕ

Не

Туг 15

С1п

51п

НЬз

С1п

Зег 20

Тгр

Ьеи

Агд

Рго

Уа1 25

Ьеи

Агд

Зег

Азп

Агд 30

Уа1

С1и

Туг

Суз

Тгр 35

Суз

Азп

Зег

С1у

Агд 40

А1а

Б1п

Суз

НЬз

Зег 45

Уа1

Рго

Уа1

Ьуз

Зег 50

Суз

Зег

С1и

Рго

Агд 55

Суз

РЬе

Азп

С1у

С1у 60

ТЬг

Суз

С1п

С1п

А1а 65

Ьеи

Туг

РЬе

Зег

70

РЬе

Уа1

Суз

С1п

Суз 75

Рго

С1и

С1у

РЬе

А1а 80

О1у

Ьуз

Суз

Суз

01и 85

Не

Азр

ТЬг

Агд

А1а 90

ТЫ

Суз

Туг

С1и

Азр 95

С1п

С1у

Не

Зег

Туг 100

Агд

С1у

ТЬг

Тгр

Зег 105

ТЬг

А1а

С1и

Зег

С1у 110

А1а

<31и

Суз

ТЬг

Азп

Тгр

Азп

Зег

Зег

А1а

Ьеи

А1а

С1п

Ьуз

Рго

Туг

Зег

С1у

115 120 125

Агд Агд Рго Азр А1а Не Агд Ьеи С1у Ьеи <51у Азп НЬз Азп Туг Суз 130 135 140

Агд Азп 145

Рго

Азр Агд Азр 150

Зег

Ьуз

Рго

Тгр

Суз 155

Туг

Уа1 РЬе

Ьуз

А1а 160

61у

Ьуз

Туг

Зег

Зег

<31и

РЬе

Суз

Зег

ТЬг

Рго

А1а

Суз

Зег

С1и

С1у'

165

170

175

Азп

Зег

Азр

Суз

Туг

РЬе

С1у

Азп

С1у

Зег

А1а

Туг

Агд

С1у

ТЬг

НЬз

С1у

Ьеи

С1у

Ьуз

НЬз

Азп

Туг

Суз Агд

Азп

Рго

Азр

С1у

Азр

А1а

Ьуз

225

230

235

240

Рго

Тгр

Суз

НЬз

Уа1

Ьеи

Ьуз

Азп Агд

Агд

Ьеи

ТЬг

Тгр

С1и

Туг

Суз

245

250

255

Азр

Уа1

Рго

Зег

Суз

Зег

ТЬг

Суз С1у

Ьеи

Агд

61п

Туг

Зег

С1п

Рго

260

265

270

С1п

РЬе

Агд

Не

Ьуз

С1у

С1у

Ьеи РЬе

А1а

Азр

Не

А1а

5ег

Н15

Рго

<220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 24 асаСдсдасс д+дасаддсс ддссад 26 <210> 25 <211> 26 <212> ΟΝΑ <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Описание искусственной последовательности: праймер <400> 25 сСддссддсс Ьд+сасддЬс дсаЕдС 26

Claims (7)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения тканевого активатора плазминогена (1РА), варианта 1РА, молекулы несущей домен кппДе 2 и серинпротеазу (К28) или варианта К28 в прокариотических клетках, где 1РА, вариант 1РА, молекула К28 или вариант К28 секретируется внеклеточно в виде активного протеина с правильной складчатостью, отличающийся тем, что прокариотическая клетка содержит и экспрессирует вектор, включающий ДНК, которая кодирует 1РА, вариант 1РА, молекулу К28 или вариант К28, функционально связанную с ДНК, которая кодирует сигнальный пептид ОтрА.
2. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что прокариотическая клетка содержит и экспрессирует вектор, который включает ДНК, кодирующую 1РА, вариант 1РА, молекулу К28 или вариант К28, функционально связанную с ДНК, которая кодирует сигнальный пептид ОтрА, функционально связанный с молекулой нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность ТСТСАСССАААСАСТСАС (8 ЕС) ГО N0:1), или ее функционально активным производным.
3. 3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что прокариотическая клетка представляет собой Е. сой.
4. 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что осуществляют следующие стадии:

   а) амплифицируют с помощью ПЦР ДНК, кодирующую 1РА, вариант 1РА, молекулу К28 или вариант К28;

   б) очищают ПЦР-продукт;

   в) встраивают указанный ПЦР-продукт в вектор, включающий ДНК, которая кодирует сигнальный пептид ОтрА, и ДНК, которая кодирует дрШ, таким образом, чтобы ПЦРпродукт в этом векторе был функционально связан против хода транскрипции с ДНК, кодирующей сигнальную последовательность ОтрА, и связан по ходу транскриции с ДНК, кодирующей дрШ;

   г) встраивают стоп-кодон между 1РА, вариантом 1РА, молекулой К28 или вариантом К28 и дрШ;

   д) экспрессируют вектор с помощью прокариотической клетки;

   е) очищают 1РА, вариант 1РА, молекулу К28 или вариант К28.
5. 5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что вектор представляет собой фаг мидный вектор, включающий ДНК, которая кодирует сигнальный пептид ОтрА, и ДНК, которая кодирует дрШ.
6. 6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что вектор представляет собой фагмидный вектор рСотЬ83Н88.
7. 7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что последовательность ДНК ОтрА, связанная против хода транскрипции с К28, включает следующую последовательность или ее вариант, полученный вследствие вырожденности нуклеотидного кода: