PL206783B1 - Sposób wytwarzania rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu tPA lub cząsteczki K2S, cząsteczka DNA, białka fuzyjne, wektor, komórka gospodarza i ich zastosowanie - Google Patents

Description

Rzeczypospolitej Polskiej (21) Numer zgłoszenia: 361881 (22) Data zgłoszenia: 07.11.2001 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

07.11.2001, PCT/EP01/012857 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

23.05.2002,WO02/40650 (11) 206783 (13) B1 (51) Int.Cl.

C12N 15/62 (2006.01) C12N 9/72 (2006.01) C12N 15/58 (2006.01) C12N 5/10 (2006.01)

Sposób wytwarzania rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu tPA (54) lub cząsteczki K2S, cząsteczka DNA, białka fuzyjne, wektor, komórka gospodarza i ich zastosowanie (30) Pierwszeństwo:

14.11.2000, GB, 0027779.8 (43) Zgłoszenie ogłoszono:

04.10.2004 BUP 20/04 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.09.2010 WUP 09/10 (73) Uprawniony z patentu:

BOEHRINGER INGELHEIM INTERNATIONAL GMBH, Ingelheim am Rhein, DE (72) Twórca(y) wynalazku:

ROLF^NTHER WERNER,

Biberach an der Riss, DE

FRIEDRICH GOETZ, ^bingen, DE CHATCHAI TAYAPIWATANA, Bangkok, TH JIRADEJ MANOSROI, Muang Chiang Mai, TH ARANYA MANOSROI, Muang Chiang Mai, TH (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Mirosława Ważyńska

PL 206 783 B1

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy rozpuszczania skrzepu i wytwarzania pochodnej tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA) w komórkach prokariotycznych.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania tPA pochodzącego z rekombinowanego DNA, jego wariantu lub cząsteczki K2S (Seryna z domeną Kringle 2) lub jej wariantu w komórkach prokariotycznych, gdzie tPA lub K2S lub wariant jest wydzielany pozakomórkowo jako aktywne i prawidłowo sfałdowane białko a komórka prokariotyczna zawiera i eksprymuje wektor zawierający DNA kodujący tPA lub K2S lub wariant, połączony funkcjonalnie z DNA kodującym peptyd sygnałowy OmpA. Przedmiotem wynalazku są ponadto specyficzne pochodne K2S możliwe do otrzymania omawianym sposobem, cząsteczki DNA i ich zastosowanie.

Tkankowy aktywator plazminogenu (tPA) jest polipeptydem zawierającym 527 reszt aminokwasowych (27) o masie cząsteczkowej 72 kDa. Cząsteczka zawiera pięć domen strukturalnych. W pobliż u regionu N-terminalnego znajduje się zapę tlona domena palcowa oraz domena czynnika wzrostu. Kolejno znajdują się dwie podobne domeny, kringle 1 i kringle 2. Domeny palcowa i kringle 2 wiążą się specyficznie ze skrzepami fibrynowymi, przyspieszając przez to aktywację związanego plazminogenu przez białko tPA. Po kringle 2 znajduje się proteaza serynowa, z jej miejscem katalitycznym umiejscowionym przy końcu C. Proteaza serynowa jest odpowiedzialna za przekształcenie plazminogenu w plazminę, ważną reakcję w utrzymaniu równowagi pomiędzy tworzeniem fibryny a rozpuszczaniem skrzepu. Prawidł owe sfałdowanie tPA wymaga prawidłowego sparowania 17 mostków disiarczkowych (1) w cząsteczce.

Klinicznie, tPA jest rozpuszczającym skrzep środkiem z wyboru przy leczeniu ostrego zawału mięśnia sercowego, zatoru tętnicy płucnej, udaru, zamknięcia tętnic obwodowych i innych stanów zakrzepowych z zatorami. Jego zaletą jest to, że nie wywołuje skutków ubocznych, krwotoku układowego i nadmiernej utraty fibrynogenu (7). Początkowo przy wytwarzaniu tPA w celach leczniczych jako źródło wykorzystywano komórki czerniaka Bowes'a (12). Ponieważ dla zastosowania klinicznego potrzebny jest odpowiedni proces otrzymywania z wydajną produkcją wysoko oczyszczonego białka, tworzenie rekombinowanego tPa (r-tPA) o pełnej długości przeniesiono do komórek ssaków. W celu zsyntetyzowania r-tPA (8, 22) komórki jajowe chomika chińskiego transfekowano genem tPA. Produkt pochodzący z rekombinowanego DNA wytworzony przez układ fermentacyjny hodowli komórek ssaków zbiera się z pożywki i oczyszcza. Ze względu na prostotę i opłacalność produkcji, podjęto wiele prób wytwarzania r-tPA z udziałem mikroorganizmów, zwłaszcza bakterii, w szczególności Escherichia coli (10, 13, 30). Ze względu na niską wydajność i tworzenie się ciałek inkluzyjnych, co skutkuje niewłaściwym sfałdowaniem i powstawaniem nieaktywnego enzymu, zaproponowano liczne strategie dla ominięcia tych problemów.

Wzięto pod uwagę szereg wariantów mutantów delecyjnych zawierających domenę kringle 2 oraz proteazę serynową (K2S). Jednakże, aktywność enzymatyczną rekombinowanej K2S (r-K2S) otrzymywano jedynie wtedy, gdy dochodziło do ponownego sfałdowania oczyszczonych ciałek inkluzyjnych z przedziału cytoplazmatycznego (16, 29). Aby uniknąć kłopotliwych procesów ponownego fałdowania, zanieczyszczeń niewłaściwie sfałdowanymi białkami i dostarczania białka peryplazmatycznego, wykorzystywano specjalne bakteryjne systemy ekspresji (6, 31). Pomimo ekspresji tPA w przestrzeni peryplazmatycznej, nadekspresja prowadziła do nieaktywnych agregatów, nawet w stosunkowo wysokich warunkach utleniających w peryplazmie.

W obecnym stanie wiedzy istnieją nieliczne opisy sposobów otrzymywania rekombinowanej K2S w E. coli. Nie odkryto jednak metody prowadzącej do ekonomicznej produkcji na dużą skalę biologicznie czynnej K2S.

Obukowicz i in. (25) prowadzili ekspresję i oczyszczanie r-K2S z przestrzeni peryplazmatycznej. Oczywistą niedogodnością tej metody był dodatkowy etap ekstrakcji pozaperyplazmatycznej, który nie jest dogodny w produkcji na dużą skalę.

Saito i in. (29) ujawnili cytoplazmatyczną ekspresję r-K2S. Procesy renaturacji r-K2S, którą w wyniku ekspresji otrzymano w przestrzeni cytoplazmatycznej w postaci ciał ek inkluzyjnych, autorzy prowadzili w warunkach in vivo. W Boehringer Mannheim stosuje się podobny kłopotliwy proces denaturacji/ponownego fałdowania obejmujący etapy trawienia komórki, solubilizacji w warunkach denaturujących i redukujących oraz reaktywacji w warunkach utleniających w obecności GSH/GSSG, co nie jest ekonomiczne (24) i wymaga mutacji w sekwencji aminokwasowej nadającej białku potencjał antygenowy.

PL 206 783 B1

W 1991 r. Waldenstrom i in. (34) skonstruowali wektor (pEZZK2P) do wydzielania domeny kringle 2 z proteazą serynową do nadsączu hodowli E. coli. Do usunięcia peptydu fuzyjnego ZZ z frakcji oczyszczonej przy użyciu IgG-Sepharose wykorzystano hydroksyloaminę. Hydroksyloamina jako środek rozszczepiający wymaga modyfikacji miejsc rozszczepienia domeny kringle 2 z proteazą serynową (Asn >Ser i Asn¹⁸⁴- >Gln) w celu zabezpieczenia przed strawieniem hydroksyloaminą. Otrzymana tak nienatywna, nieodpowiednio sfałdowana cząsteczka K2S nie jest jednak odpowiednia do celów leczniczych. Nie stwierdzono aktywności enzymatycznej względem wiązania fibryny/ aktywności proteazy. Nietypowa sekwencja może nawet aktywować system immunologiczny człowieka.

Problemem leżącym u podstaw wynalazku było dostarczenie metody nadającej się do zastosowania przemysłowego dla produkcji na dużą skalę cząsteczek tPA i ich pochodnych, np. K2S, gdzie cząsteczka K2S jest wydzielana w jej biologicznie aktywnej postaci do nadsączu hodowli.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA), wariantu tPA, cząsteczki proteazy serynowej z domeną Kringle 2 (K2S) lub wariantu K2S, w komórkach prokariotycznych, przy czym tPA, wariant tPA, cząsteczka K2S lub wariant K2S wydzielane są pozakomórkowo jako aktywne i prawidłowo sfałdowane białka, charakteryzujący się tym, że komórka prokariotyczna zawiera i eksprymuje wektor, który zawiera DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S połączony funkcjonalnie z DNA kodującym peptyd sygnałowy OmpA.

Korzystnie według wynalazku komórka prokariotyczna zawiera i eksprymuje wektor, który zawiera DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S połączony funkcjonalnie z DNA kodującym peptyd sygnałowy OmpA, który jest połączony funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego określoną sekwencją TCTGAGGGAAACAGTGAC (SEQ ID NO:1) lub jej funkcjonalną pochodną.

Korzystnie taką komórką prokariotyczną jest E. coli.

Sposób według wynalazku obejmuje następujące etapy:

a) amplifikuje się w reakcji PCR DNA kodujący tPa, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S;

b) oczyszcza się produkt PCR;

c) wstawia się produkt PCR do wektora zawierającego DNA kodujący peptyd sygnałowy OmpA i DNA kodujący gpIII tak, że produkt PCR przyłącza się funkcjonalnie powyżej DNA kodującego sekwencję sygnałową OmpA i przyłącza się poniżej sekwencji DNA wektora kodującej gpIII;

d) wstawia się kodon stop pomiędzy tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S a gpIII;

e) poddaje się ekspresji wektor w komórce prokariotycznej;

f) oczyszcza się tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S.

Wektorem jest korzystnie wektor fagmidowy zawierający DNA kodujący białko sygnałowe OmpA i DNA kodujący gpIII lub fagmid pComb3HSS.

Sekwencja DNA OmpA przyłączona powyżej K2S obejmuje następującą sekwencję lub wariant wynikający z degeneracji kodu nukleotydowego:

PL 206 783 B1

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGG

CGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCC

GGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTG

GGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG

TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT

TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTC

CTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCG

AAAAATACATATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACC

GTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACC

GTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCT

GATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACAT

AATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCA

GGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAG

CCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAG

GCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATAC

TCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCA

CCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAA

TTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACA

TTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCG

CACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCC

GGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATG

TCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGA

CAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCC

TGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGG

GCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGT

TACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG (SEQ ID NO:2).

Korzystnie sekwencja DNA OmpA obejmuje następującą sekwencję: ATGAAAAAGAGAGCTATCGCGATTGGAGTGGCAGTGGGTGGTTTGGCTACCGTGGCCCAGG CGGCC (SEQ ID NO:3).

Korzystnie sekwencja DNA OmpA obejmuje następującą sekwencję: ATGAAAAAGACAGCTATGGCGATTGCAGTGGCAGTGGCTGGTTTGGGTACCGTGGCCCAGGGGGGG (SEQ ID NO:3).

PL 206 783 B1

Natomiast przed regionem kodującym tPA, wariantu tPA, cząsteczki K2S lub wariantu K2S obecny jest promotor lac i/lub miejsce wiązania rybosomu.

DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S jest korzystnie wybrany z grupy cząsteczek DNA kodujących co najmniej 90% aminokwasów 87 - 527, 174 - 527, 180 - 527 lub 220 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.

Sekwencja DNA K2S obejmuje następującą sekwencję lub jej wariant funkcjonalny lub wariant wynikający z degeneracji kodu nukleotydowego:

TCTGAGGGAAACAGTTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGC

CTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTT

ACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAA

TCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAG

TACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTC

GCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGC

CAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGC

YGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGA

TCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAA

ATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAG

CTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTC

CCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCA

TGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACTCA

TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTG

CTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTC

GGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGG

GGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAG

ACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:4).

Sekwencja DNA K2S składa się korzystnie z następującej sekwencji:

TCTGAGGGAAACAGTTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGC

CTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTT

ACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAA

TCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAG

TACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTC

GCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGC

CAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGC

YGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGA

TCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAA

ATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAG

PL 206 783 B1

CTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTC

CCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCA

TGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACTCA

TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTG

CTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTC

GGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGG

GGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAG

ACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:4).

Cząsteczka DNA według wynalazku koduje:

a) białko OmpA i jest funkcjonalnie połączona z

b) cząsteczką DNA kodującą polipeptyd zawierający domenę Kringle 2 i domenę proteazy serynowej białka tkankowego aktywatora plazminogenu.

Sekwencja DNA obejmuje następującą sekwencję lub wariant wynikający z degeneracji kodu nukleotydowego:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGG

CGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCC

GGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTG

GGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG

TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT

TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTC

CTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCG

AAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCT

GCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGC

CTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCA

AGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTA

CCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG

PL 206 783 B1

TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCG

ATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAG

CTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTAC

CTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQ ID NO:5).

Sekwencja DNA korzystnie składa się z następującej sekwencji:

ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGG

CGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCC

GGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTG

GGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG

TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT

TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTC

CTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCG

AAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCT

GCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGC

CTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCA

AGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTA

CCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG

TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCG

ATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAG

CTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTAC

CTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQ ID NO:5).

Sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 87-527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu. Korzystnie sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 174 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu lub korzystnie sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 180 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu lub sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 220 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.

Sekwencja DNA b) w ostrych warunkach hybrydyzuje do następującej sekwencji:

PL 206 783 B1

TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCC

TCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTA

CACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAAT

CCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGT

ACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCG

CATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCC

AAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCT

GGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGAT

CTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAT

ACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCT

GAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCC

CGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGA

GGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCC

AGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTG

GAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGG

AGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGC

CTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACT

GGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:7).

Sekwencja DNA b) składa się z następującej sekwencji:

TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCC

TCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTA

CACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAAT

CCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGT

PL 206 783 B1

ACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCG

CATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCC

AAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCT

GGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGAT

CTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAA

TACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGC

TGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCC

CCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCAT

GAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCAT

CCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGC

TGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCG

GGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGG

GCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGA

CTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:7).

Białko fuzyjne OmpA i K2S według wynalazku zawiera białko, które charakteryzuje sekwencja aminokwasów:

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNCMILIGK VYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPU FRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLT VILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDLALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVC LPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNML CAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNY LDWIRDNNRPG (SEQ ID NO:8).

Białko fuzyjne OmpA i K2S składa się z białka, które charakteryzuje następująca sekwencja aminokwasów:

MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNCMILIGK

VYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPU

FRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLT

PL 206 783 B1

VILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDLALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVC LPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNML CAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNY

LDWIRDNNRPG (SEQ ID N0:8).

Białko K2S charakteryzuje następująca sekwencja aminokwasów:

SEGNSDCYVGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRN PDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFA KHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEK YIVHKEFDDDTYDNDIALLOLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKH EALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDS GGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP* (SEQ ID NO:11).

Wektor zawiera sekwencję DNA określoną powyżej.

Wektor kodujący powyższą sekwencję DNA ma promotor lac i miejsce wiązania rybosomu znajdujące się przed sekwencją DNA.

Wektor pComb3HSS zawierający określony DNA charakteryzuje się tym, że ekspresja białka gpIII jest wyciszona lub zahamowana na skutek delecji cząsteczki DNA kodującej białko gpIII lub przez kodon stop znajdujący się pomiędzy genem kodującym polipeptyd, zawierający domenę kringle 2 i domenę proteazy serynowej białka tkankowego aktywatora plazminogenu a genem białka gpIII.

Komórka prokariotycznego gospodarza zawiera określoną cząsteczkę DNA lub wektor zawierający określoną sekwencję DNA.

Komórka E. coli zawiera określoną cząsteczkę DNA lub wektor zawierający określoną sekwencję DNA.

Zastosowanie cząsteczki DNA określonej w wynalazku lub wektora lub komórki gospodarza w sposobie wytwarzania polipeptydu o aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu stanowi także przedmiot wynalazku.

Zastosowanie peptydu sygnałowego OmpA samego i/lub w kombinacji z N-terminalnymi aminokwasami SEGN (SEQ ID NO:9)/ SEGNSD (SEQ ID NO:10) nieoczekiwanie przemieszcza pochodzący od rekombinowanego DNA tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S do powierzchni zewnętrznej i ułatwia uwalnianie funkcjonalnej i aktywnej cząsteczki do pożywki hodowlanej w większym stopniu niż jakakolwiek inna dotychczas znana metoda. Przed przejściem przez zewnętrzną błonę, pochodzące od rekombinowanego DNA białko zostaje prawidłowo sfałdowane zgodnie ze sposobem według wynalazku. Peptyd sygnałowy zostaje odcięty tak, że tworzy się dojrzała cząsteczka. Nieoczekiwanie, skuteczność usunięcia peptydu sygnałowego jest bardzo wysoka i prowadzi do prawidłowego sfałdowania białka pochodzącego od rekombinowanego DNA.

Omawiany peptyd sygnałowy OmpA oddziałuje z SecE i jest dostarczany przez błonę wewnętrzną dzięki energii wytworzonej przez SecA, który wiąże się z komponentami Sec (SecE-SecY). SecY tworzy por wydalniczy dla przesyłania pochodzącego od rekombinowanego DNA białka według wynalazku. Przestrzeń między membraną zewnętrzną i membraną wewnętrzną bakterii Gramujemnych, peryplazma, ma lepsze warunki utleniające w porównaniu z przestrzenią cytoplazmatyczną. Wspomaga to tworzenie mostków disiarczkowych i właściwe fałdowanie pochodzącego od rekombinowanego DNA białka (np. K2S) w peryplazmie, z utworzeniem aktywnej cząsteczki.

Zgodnie z wynalazkiem, peptyd sygnałowy zostaje odszczepiony tak, że tworzy się dojrzała cząsteczka. Kompleks sekretyny GspD i lipoproteiny GspS na błonie zewnętrznej służy jako kanał bramkowany do wydzielania pochodzącego od rekombinowanego DNA białka według wynalazku do środowiska pozakomórkowego. Ten proces sekrecji wymaga energii, która generowana jest w cytoPL 206 783 B1 plazmie przez białko wiążące nukleotyd GspE a następnie przenoszona na białko błony wewnętrznej (Gsp G-J, F i K-N). GspC przenosi energię do GspD przez tworzenie połączenia między grupą białek membrany wewnętrznej (Gsp G-J, F i K-N) a GspD. Przed udanym przejściem przez membranę zewnętrzną, pochodzące od rekombinowanego DNA białko zostaje prawidłowo sfałdowane.

Określenie „połączony funkcjonalnie oznacza, że DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S (korzystnie zawierający kwas nukleinowy kodujący SEGN lub SEGNSD w jego części N-terminalnej) klonowany jest w bliskim sąsiedztwie DNA kodującego OmpA w wektorze, w celu osiągnięcia ekspresji białka fuzyjnego OmpA-tPA, wariant tPA, cząsteczka K2S lub wariant K2S i bezpośredniego wydzielenia na zewnątrz prokariotycznej komórki gospodarza. Zazwyczaj, większość tPA, wariantu tPA, cząsteczek K2S lub wariantu K2S zostaje wydzielona i może być następnie oczyszczana odpowiednimi metodami, takimi jak wytrącanie siarczanem amonu i/lub chromatografia powinowactwa oraz w innych dalszych etapach oczyszczania. Opisano również zastosowania induktorów takich jak IPTG lub IPTG w połączeniu z gliceryną, ulepszenia warunków inkubacji i okresu zbioru w celu maksymalizacji ilości aktywnego białka.

W zalecanym wykonaniu, DNA kodują cy peptyd sygnał owy OmpA moż e być przyłączony do DNA kodującego krótki peptyd o sekwencji aminokwasowej SEGN lub SEGNSD lub kodującej sekwencji kwasu nukleinowego TCTGAGGGAAAC (SEQ ID NO:20) lub TCTGAGGGAAAGAGTGAG (SEQ ID NO:1) i umieszczony w części N-terminalnej lub przy części N-terminalnej tPA, wariantu tPA, cząsteczki K2S lub wariantu K2S. Tak więc, korzystnie, białko fuzyjne zawiera OmpA-SEGNSD-tPA, wariant tPA, -cząsteczka K2S lub -wariant K2S. Jeszcze korzystniej, aminokwasy charakteryzowane przez SEGN lub SEGNSD mogą nieść mutację punktową lub mogą być podstawione nienaturalnym aminokwasem. Jeszcze korzystniej, pomiędzy OmpA a SEGN lub SEGNSD a tPA, wariantem tPA, cząsteczką K2S lub wariantem K2S może znajdować się wstawka aminokwasowa lub nie-aminokwasowa.

Tak więc w korzystnym sposobie według wynalazku, komórka prokariotyczna zawiera i eksprymuje wektor obejmujący DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S połączony funkcjonalnie z DNA kodującym peptyd sygnałowy OmpA, który jest połączony funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego określonego sekwencją TCTGAGGGAAAGAGTGAG lub jego funkcjonalną pochodną.

Sposób według wynalazku obejmuje prokariotyczne komórki gospodarzy takie jak, lecz bez ograniczenia, Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, np. Pseudomonas putida, Proteus mirahilis, Saccharomyces, Pichia lub Staphylococcus, np. Staphylococcus carnosus. Korzystnymi komórkami-gospodarzami według wynalazku są bakterie Gram-ujemne.

Korzystnie, sposób według wynalazku, charakteryzuje się tym, że komórką prokariotyczna jest E. coli. Odpowiednie szczepy obejmują, lecz nie są ograniczone do E. coli XL-1 Blue, BL21(DE3), JM109, seria DH, TOP10 i HB101.

Jak wspomniano, sposób zgodnie z wynalazkiem obejmuje etapy, w których kolejno:

a) DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S powiela się metodą PCR,

b) produkt PCR oczyszcza się,

c) produkt PCR wstawia się do wektora zawierającego DNA kodujący peptyd sygnałowy OmpA i DNA kodujący gpIII w tak, że produkt PCR przyłącza się funkcjonalnie powyżej DNA kodującego sekwencję sygnałową OmpA i przyłącza się poniżej DNA kodującego gpIII wektora,

d) między tPa, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S a gpIII wstawia się kodon stop,

e) wektor poddaje się ekspresji w komórce prokariotycznej,

f) tPA, wariant tPA, cząsteczka K2S lub wariant K2S oczyszcza się.

Dla etapu a) w sposobie według wynalazku, dla klonowania DNA we właściwym miejscu i kierunku wektora ekspresyjnego ważny jest wybór/zaprojektowanie starterów (przykład 1). Tak więc startery takie jak przedstawiono w przykładzie 1 i na Fig. 4 stanowią istotny aspekt wynalazku.

Jako białko gpIII z etapu c) sposobu rozumie się białko genowe III, które jest obecne głównie w wektorach fagmidowych. Kodon stop wstawia się dla uniknię cia transkrypcji gpIII prowadzą cej do ewentualnej sekrecji tPA, wariantu tPA, cząsteczki K2S lub wariantu K2S. Może zostać wykorzystana dowolna odpowiednia metoda insercji kodonu stop, taka jak mutageneza ukierunkowana (np. Weiner M.P., Costa G.L. (1994) PCR Methods Appl. 4(3) :S131-136; Weiner M.P., Costa G.L., Schoettli W., Cline J., Mathur E., Bauer J.C., (1994) Gene 151 (1-2): 119-123; przykład 1).

W sposobie według wynalazku można zastosować dowolny wektor, przy czym korzystnie jest to wektor fagmidowy.

PL 206 783 B1

Korzystnie, tPA, wariant tPA, cząsteczka K2S lub wariant K2S są wybrane spośród ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA, fig. 16) lub jego fragmentu, wariantu funkcjonalnego, wariantu allelicznego, podjednostki, pochodnej chemicznej, białka fuzyjnego lub wariantu glikozylowanego. Takie fragmenty, warianty alleliczne, warianty funkcjonalne, warianty wynikające z degeneracji kodu kwasu nukleinowego, białka fuzyjne z białkiem tPA według wynalazku, pochodne chemiczne lub warianty glikozylowane białek tPA mogą zawierać jedną, kilka lub wszystkie z poniższych domen lub ich podjednostek lub wariantów:

1. Domena palcowa (4-50)

2. Domena czynnika wzrostu (50-87)

3. Domena kringle 1 (87-176)

4. Domena kringle 2 (176-262)

5. Domena proteazy (276-527)

Korzystnie, również tPA, wariant tPA, cząsteczka K2S lub wariant K2S są wybrane z kringle 2 (4.) z proteazą serynową (5.) wariantu K2S tkankowego aktywatora plazminogenu lub jego fragmentu, wariantu funkcjonalnego, wariantu allelicznego, podjednostki, pochodnej chemicznej, białka fuzyjnego lub wariantu glikozylowanego.

DNA koduje sekwencję aminokwasową OmpA. OmpA zawiera więc białko opisanego przez tę sekwencję aminokwasową lub jej fragment, wariant funkcjonalny, wariant alleliczny, podjednostkę, pochodną chemiczną lub wariant glikozylowany, jako część wynalazku: MKKTAIAIAVALAGFATVAQAA (SEQ ID NO:21).

Region, który nie ulega translacji może zawierać element regulujący, taki jak np. jednostkę inicjującą transkrypcję (promotor) lub sekwencję wzmacniającą. Promotorem może być, na przykład, promotor konstytutywny, indukowany lub promotor zależny od wzrostu. Korzystnie, bez wykluczenia innych znanych promotorów, konstytutywne promotory ludzkiego cytomegalowirusa (CMV) i wirusa mięsaka Rousa (RSV), a także wirusa małpiego 40 (SV40) i promotora opryszczki pospolitej. Promotory indukowane według wynalazku obejmują promotory odporne na antybiotyki, promotory szoku cieplnego, indukowany przez hormon „promotor wirusa raka sutka i promotor metalotioneiny. Do zalecanych promotorów należą promotor T3, promotor T7, Lac/aral i Ltet0-1.

Przedmiotem wynalazku są również warianty cząsteczek kwasu nukleinowego wynikające z degeneracji kodu lub ich fragmenty, kwasy nukleinowe, które hybrydyzują do kwasów nukleinowych w ostrych warunkach, warianty alleliczne lub funkcjonalne oraz kwasy nukleinowe zawierające kwas nukleinowy K2S przyłączony do kwasu nukleinowego kodującego inną cząsteczkę białka.

Za ostre warunki specjalista uważa warunki, które pozwalają uzyskać ponad 85% homologię, korzystnie ponad 90% (Sambrook i in. 1989; Molecular Clonong: A Laboratory Manual, 2nd er., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York). Hybrydyzacja będzie prowadzona np. w 6x SSC/5x roztwór Denhardta/0,1% SDS (SDS: dodecylosulfonian sodu) w 65°C. O stopniu ostrości decyduje się na etapie przemywania. Tak więc, na przykład, dla selekcji sekwencji DNA z homologią około 85% lub wię kszą , odpowiednie są warunki 0,2 x SSC/0,01% SDS/65°C, a dla selekcji sekwencji DNA o homologii około 90% lub większej, 0,1 x SSC/0,01% SDS/65°C. Składy odczynników są opisane w Sambrook i in. (1989, powyżej).

Domeny są numerowane/nazywane zgodnie z Genbank accesion number GI 137119 lub Nature 301 (5897), 214-221 (1983), gdzie domena kringle 2 rozciąga się od aminokwasu 17 6-2 62, a domena proteazy od 276-527. Tak więc, korzystna cząsteczka K2S może obejmować aminokwasy 176527 włącznie z aminokwasami między kringle 2 i proteazą (aminokwasy 263- do 275; zilustrowane fig. (struktura A)). Cząsteczka K2S według wynalazku obejmuje minimalną część domeny kringle 2 i domeny proteazy, nadal zachowując aktywność proteazy i aktywność wiązania fibryny (mierzone jak przedstawiono w opisie/przykładzie). Cząsteczka K2S według wynalazku zawiera aminokwasy SEGN lub SEGNSD w swojej części N-terminalnej. Zalecana cząsteczka K2S nie obejmuje aminokwasów 1 do 3 lub 1 do 5 cząsteczki tPA. Korzystnie, cząsteczka K2S według wynalazku ma aminokwas Asn w pozycjach 177 i 184, tzn. nie wymaga modyfikacji przedstawionych u Waldenstroma dla uzyskania poprawy produktywności. Cząsteczka K2S ma korzystnie sekwencję natywnego aminokwasu (bez mutacji) w przeciwieństwie do cząsteczek znanych z dotychczasowego stanu wiedzy. Najkorzystniej, cząsteczka K2S według wynalazku jest cząsteczką, którą charakteryzuje sekwencja natywnego aminokwasu lub jej część, nie ma ani aminokwasów 1 do 3 ani 1 do 5 tPA i zawiera N-terminalne aminokwasy SEGN lub SEGNSD dla poprawy produktywności i/lub prawidłowego sfałdowania cząsteczki.

PL 206 783 B1

Jest istotne, żeby białko K2S według wynalazku zawierało w swojej części N-terminalnej peptyd charakteryzujący się sekwencją aminokwasu SEGN, który umożliwia produkcję przemysłową opisaną metodą, prowadząc do prawidłowo sfałdowanego wydzielanego białka K2S. Omawiane 4 aminokwasy charakteryzowane przez SEGN mogą mieć jeden lub kilka aminokwasów bardziej N-terminalnych, jednak muszą być zlokalizowane w części N-terminalnej w przeciwieństwie do części C-terminalnej. Najkorzystniej, omawiane aminokwasy są zlokalizowane w części N-terminalnej. Aminokwasy charakteryzowane przez SEGN ewentualnie niosą mutację punktową lub mogą być podstawione nienaturalnym aminokwasem.

Tak więc wynalazek dotyczy białka K2S zawierającego aminokwasy definiowane przez sekwencję SEGN lub jej fragment, wariant funkcjonalny, wariant alleliczny, podjednostkę, pochodną chemiczną, białko fuzyjne lub wariant glikozylowany.

Takie fragmenty zostały zilustrowane np. fig. 10 (struktura B-1) i fig. 11 (struktura B-2) rozciągając się od aminokwasów 193-527. Struktura B-1 ma natywny aminokwas Cys w pozycji 261, gdzie w B-2 aminokwas jest podstawiony przez Ser. Kolejne fragmenty, obejmują ce aminokwasy 220-257 (fig. 14, struktura C) lub obejmujące aminokwasy 260-527 (fig. 15, struktura D) mogą być modyfikowane przez dodanie aminokwasów SEGN i/lub podstawienie Cys-261 przez Ser. Specjalista może określić minimalną długość cząsteczki K2S według wynalazku w celu zachowania jej funkcji biologicznej i stworzyć cząsteczkę K2S o poprawionej produktywności i/lub prawidłowym sfałdowaniu przez dodanie aminokwasów SEGN w części N-terminalnej.

Innym korzystnym rozwiązaniem jest więc minimalna cząsteczka K2S z SEGN w jej części N-terminalnej.

Inne wykonanie wynalazku dotyczy białka K2S, które zawiera aminokwasy określone przez sekwencję SEGNSD lub jej wariant lub fragment, wariant funkcjonalny, wariant alleliczny, podjednostkę, pochodną chemiczną, białko fuzyjne lub wariant glikozylowany. Takie fragmenty przedstawia np. fig. 12 (struktura B-3) i fig. 13 (struktura B-4), od aminokwasu 191 do 527. Struktura B-3 ma natywny aminokwas Cys w pozycji 261, gdzie w B-4 aminokwas jest podstawiony przez Ser. Kolejne fragmenty, zawierające aminokwasy 220-527 (fig. 14, struktura C) lub zawierające aminokwasy 260-527 (fig. 15, struktura D) mogą być modyfikowane według wynalazku przez dodanie aminokwasów SEGNSD i/lub podstawienie Cys-261 przez Ser. Specjalista może określić minimalną długość cząsteczki K2S według wynalazku w celu zachowania jej funkcji biologicznej i stworzyć cząsteczkę K2S o poprawionej produktywności i/lub prawidłowym sfałdowaniu przez dodanie aminokwasów SEGNSD w części N-terminalnej. Tak więc innym korzystnym rozwiązaniem jest minimalna cząsteczka K2S z SEGNSD w jej części N-terminalnej.

Inne bardziej zalecane wykonanie wynalazku dotyczy białka K2S zawierającego białko charakteryzowane przez sekwencję aminokwasową lub jej wariant lub fragment, wariant funkcjonalny, wariant alleliczny, podjednostkę, pochodną chemiczną lub wariant glikozylowany:

SEGNSDCYVGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRN

PDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFA

KHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEK

YIVHKEFDDDTYDNDIALLOLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKH

EALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDS

GGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP* (SEQ ID

NO:11).

Według wynalazku, * oznacza STOP (tzn. kodowane przez kodon stop). Ta cząsteczka K2S jest zilustrowana fig. 8.

Jeden wariant cząsteczki K2S według wynalazku dotyczy białka fuzyjnego K2S połączonego z inną cząsteczką białka.

Korzystny jest wektor według wynalazku, w którym omawiana sekwencja DNA poprzedzana jest przez promotor lac i miejsce wiązania rybosomu. Odpowiednie wektory według wynalazku obejmują, lecz nie są do nich ograniczone, wektory wirusowe takie jak np. Vaccinia, Semliki-Forest-Wirus i Ade14

PL 206 783 B1 nowirus, wektory fagmidowe i tym podobne. Zalecane są wektory, które mogą być korzystnie użyte u E. coli, lecz takż e u każ dego innego prokariotycznego gospodarza takiego jak pPROTet.E, pPROLar.A, przedstawiciele rodziny pBAD, rodziny pSE, rodziny pQE i pCAL.

Jednocześnie opisano kompozycję farmaceutyczną zawierającą substancje możliwe do otrzymania tym sposobem i dopuszczalne farmaceutycznie zaróbki i nośniki. Przykładem takiej substancji jest cząsteczka K2S. Określenie „dopuszczalny farmaceutycznie nośnik w znaczeniu tu użytym dotyczy konwencjonalnych zaróbek i dodatków farmaceutycznych stosowanych w dziedzinie produkcji farmaceutycznej. Takie dopuszczalne fizjologicznie związki obejmują na przykład węglowodany takie jak glukoza, cukroza lub dekstrany, antyutleniacze takie jak kwas askorbinowy lub glutation, środki chelatujące, białka o niskim ciężarze cząsteczkowym lub inne stabilizatory lub zaróbki (zobacz także np. Remington's Pharmaceutical Sciences (1990, wyd.18, Mack Publ., Easton)). Kompozycje farmaceutyczne można podawać dożylnie jako jednorazową dawkę, np. jako pojedynczą jednorazową dawkę dożylnie w ciągu 5 do 10 sekund.

Opisano zastosowanie substancji, które można otrzymać sposobem według wynalazku do wytwarzania leków w leczeniu udaru, zawału serca, ostrego zawału mięśnia sercowego, zatoru tętnicy płucnej, zamknięcia tętnic obwodowych, zamknięcia tętnic wewnątrzmózgowych (np. tętnic zasilających mózg), obwodowe zamkniętych tętnic, głębokiej zakrzepicy żył lub podobnych chorób związanych z niepożądanym krzepnięciem krwi. Poniższe przykłady służą lepszemu zrozumieniu wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Materiały i metody

Projektowanie starterów.

W celu amplifikacji okreś lonego fragmentu genu tPA, zsyntetyzowano parę starterów sK2/174

[5'GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGAC3'] (SEQID NO:22) i assp [5'GAGGAGGAGCTGGCCGGGGTGGCCCGGTGGCATGTTGTCACG 3'] (SEQ ID NO:23) (Kife Technologies, Grand Island, NY).

Startery te zaprojektowano w oparciu o sekwencję ludzkiego genu tPA dostępnego w bazie danych NCBI (g137119). Zostały one zsyntetyzowane tak aby zawierały końcowe miejsca klonowania Sfi (podkreślone) tak, aby ramka odczytu genu gpIII rozpoczynająca się od ATG w wektorze fagmidowym, pComb3HSS, została zachowana w obrębie wstawionej sekwencji. Inny zestaw starterów do mutagenezy ukierunkowanej zaprojektowano tak aby przyłączyły się one do sekwencji znajdującej się między genem K2S a genem gpIII w pComb3H-K2S. Sekwencję starterów z mutacjami (podkreślone) do wytworzenia nowego kodonu stop stanowiły msTPA [5'ACATGCGACGGTGACAGGCCGGCCAG 3'] (SEQ ID NO:24) i MASTPA [5'CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT 3'] (SEQ ID NO:25).

Amplifikacja genu K2S w reakcji PCR. Jeden μg starterów SK2/174 i AsSP razem z 50 ng matrycy p51-3 (otrzymanej od DR. Hiroshi Sasaki, Fujisawa Pharmaceutical, Japonia) zawieszono w 100 μl mieszaniny PCR. Na końcu do roztworu dodano polimerazę Taq (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) w ilości 2,5 U.

Ustalono następujące warunki amplifikacji: reakcję rozpoczęto w 85°C przez 4 min, następnie prowadzono denaturację w 95°C przez 50 s, przyłączanie starterów w 42°C przez 50 s, elongację w 72°C przez 1,5 min. Powtórzono 35 cykli. Mieszaninę następnie inkubowano w 72°C przez 10 min. Następnie zamplifikowany produkt o 1110 bp oczyszczono przy użyciu QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Poprawność oczyszczonego produktu potwierdzono za pomocą enzymów restrykcyjnych.

Konstruowanie fagmidu eksprymującego K2S.

Oczyszczony produkt PCR K2S i fagmid pComb3HSS (dostarczono przez dr. Carlosa F. Barbasa, Scripps Institute, USA) strawiono za pomocą Sfi (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) w celu otrzymania specyficznych spójnych miejsc klonowania. 4 μg oczyszczonego produktu PCR strawiono za pomocą 60 U Sfi w 50°C przez 18 h. Dla pComb3HSS 20 μg wektorów fagmidowych traktowano 100 U Sfi I. Produkty trawienia oczyszczonego produktu PCR K2S i pComb3HSS (około 3300 bp) oczyszczono następnie na żelu przy użyciu QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Do mieszaniny 0,7 μg oczyszczonego wytrawionego przez Sfi I pComb3HSS i 0,9 μg oczyszczonego wytrawionego przez Sfi I produktu PCR wprowadzono 5 U ligazy T4 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN). Reakcję ligacji prowadzono w 30°C przez 18 h. Nowoskonstruowany fagmid nazwano pComb3H-K2S.

Transformacja E. coli XL-1 Blue.

PL 206 783 B1

200 μ! komórek kompetentnych E. coli XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, CA) uzyskanych z CaCl2 poddano transformacji 70 ng produktu ligacji lub mutacji. Transformowane komórki namnażano na agarze LB zawierającym 100 μg/ml ampicyliny i 10 μg/md tetracykliny (Sigma, Saint Louis, MO). Po 18 h hodowli w 37°C wyselekcjonowano kolonie odporne na antybiotyk w celu izolacji plazmidów na małą skalę (miniprep) metodą lizy alkalicznej. Każdy oczyszczony plazmid poddano analizie miejsc restrykcyjnych Sfi I. Transformanty niosące plazmid z prawidłowym miejscem/(miejscami) restrykcyjnym(i) Sfi I namnażano kolejne 18 h w 37°C w 100 ml bulionu LB ze 100 μg/ml ampicyliny i 10 μg/ml tetracykliny.

Przeprowadzono izolację plazmidów na dużą skalę (maksiprep) stosując OUIAGEN Plasmid Maxi Kit (QIAGEN, Hilden, Niemcy). Oczyszczony plazmid sprawdzono powtórnie pod kątem specyficznych miejsc restrykcyjnych za pomocą Sfi I i zsekwencjonowano za pomocą AmpliTaq DNA Polymeraze Terminator Cycle Sequencing Kit (The Perkin-Elmer Corporation, Forster City, CA).

Mutageneza ukierunkowana pComb3H-K2S.

ng matrycy pComb3H-K2S zmieszano ze 125 ng starterów MSTPA i MASTPA. Do przeprowadzenia cyklicznej amplifikacji do mieszaniny dodano 2,5 U polimerazy DNA PfuTurbo (Stratagene, La Jolla, CA). Reakcję rozpoczęto cyklem w 95°C. Następnie przeprowadzono 16 cykli obejmujących: 95°C przez 30 s, 55°C przez 1 min. i 68°C przez 9 min. Probówkę reakcyjną umieszczono następnie na 2 min. na lodzie. W celu zniszczenia nici matrycy do mieszaniny reakcyjnej dodano 10 U enzymu restrykcyjnego Dpn I (Stratagene, La Jolla, CA) i inkubowano przez 1 h w 37°C. Tak zsyntetyzowany produkt (MpComb3H-K2S) stosowano następnie do transformowania E. coli XL-Blue.

Przygotowanie fagowej ekspresji rekombinanta-K2S.

Po transformacji komórek XL-1 Blue za pomocą MpComb3H-K2S zastosowano technikę fagowej ekspresji peptydów. Komórki E. coli XL-1 Blue transformowane klonem MpComb3H-K2S namnażano w 37°C w 10 ml pożywki super broth zawierającej 100 μg/ml ampicyliny i 10 μg/ml tetracykliny aż do osiągnięcia gęstości optycznej O.D. [600 nm] 1,5. Następnie hodowlę bakteryjną namnażano w 100 ml tej samej pożywki i prowadzono hodowlę przez 2 h. Do zainfekowania transformowanych komórek E. coli XL-1 Blue użyto 10¹² pfu faga pomocniczego VCSM13 (Stratagene, La Jolla, CA). Po 3 h inkubacji do hodowli dodano kanamycynę w stężeniu końcowym 70 μg/ml. Hodowlę pozostawiono na wytrząsarce (200 obr/min) na 18 h w 37°C. Bakteriofagi, które przyjęły K2S na gp3 (K2S-<I>) zebrano przez dodanie 4% w/v PEG MW 8000 (Sigma, Saint Louis, MO) i 3% w/v NaCl. Na koniec zebrany fag zawieszono ponownie w 2 ml PBS o pH 7,4. Liczbę fagów określono przez zainfekowanie E. coli XLBlue. Jednostkę tworzenia kolonii na mililitr (cfu/ml) obliczono w sposób opisany wcześniej (21).

Ekspresja rekombinanta-K2S w kolbach wytrząsarki.

Komórki E. coli XL-1 Blue transformowane MpComb3H-K2S hodowano w 100 ml pożywki super broth (3% w/v tryptonu, 2% ekstraktu drożdży i 1% w/v MOPS) przy pH 7,0 w obecności ampicyliny (100 μg/ml) w 37°C do osiągnięcia O.D. 600 nm] 0,8. Następnie zaindukowano syntezę białka przez 1 mM IPTG (Promega, Madison, WI). Bakterie hodowano następnie na wstrząsarce (200 obr/min) przez 6 h w 30°C. Nadsącz z hodowli zebrano i wytrącono 55% nasyconym siarczanem amonu (32). Osad rekonstytuowano PBS, pH 7,2 i dializowano w tym samym roztworze buforowym w 4°C przez 18 h. Peryplazmatyczne białka ekstrahowano z komórek bakteryjnych metodą szoku chloroformowego sposobem opisanym przez Amesa i in. (2).

Ilościowa ocena immunologiczna rekombinanta-K2S.

W celu wykrycia r-K2S, fazę stałą opłaszczono monoklonalną domeną anty-kringle 2 (16/B) (dostarczoną przez Dr. Ute Zacharias, Central Institute of Molecular Biology, Berlin-Buch, Niemcy). Przeprowadzono standardowe procesy przemywania i blokowania według ELISA. Do każdej studzienki opłaszczonej anty-kringle 2, wprowadzono 50 μl K2S-<I> lub wydzielniczego r-K2S o 10¹¹ cfu/ml.

Detekcję antygen-przeciwciało przeprowadzono następująco: do każdej studzienki reakcyjnej po etapie przemywania dodano HRP sprzężone z owczymi anty-M13 (PharmaciaBiotech, Uppsala, Szwecja) lub HRP sprzężone z owczymi anty-tPA (Cedarlane, Ontario, Kanada). Do każdej studzienki dodano substrat TMB i reakcję ostatecznie zakończono po 30 min inkubacji za pomocą roztworu H2SO4. Jako kontrolę pozytywną zastosowano wzorzec tPA czerniaka 86/670 (National Institute for Biologigal Standards and Control, Hertfordshine, W.Bryt).

Badanie aktywności amidolitycznej.

Zestaw testowy do wykrywania aktywności amidolitycznej tPA zakupiono w Chromogenix (Molndal, Szwecja). Do określania aktywności enzymatycznej proteazy serynowej zastosowano mieszaninę wyjściową zawierającą plazminogen i S-2251. Rozcieńczenie 10^-2 każdej próbki po wytrące16

PL 206 783 B1 niu amoniakiem poddano analizie ze stymulatorem (fragmenty ludzkiego fibrynogenu) i bez niego. Procedura badania była zgodna z podręcznikiem t-PA COASET.

SDS-PAGE i immunoblotting.

Dializowany produkt wytrącony z nadsączu hodowli zatężono 10-krotnie za pomocą centrikonu 10 (AMICIN, Beverly, MA). Zatężoną próbkę poddano rozdziałowi białka za pomocą SDS-PAGE, w 15% ż elu rozdzielają cym, w buforze redukują cym a nastę pnie przeniesiono na nitrocelulozę (elektroblotting). Nitrocelulozę blokowano następnie przez 2 h 4% odtłuszczonym mlekiem. W celu wykrycia r-K2S, na nitrocelulozę naniesiono HRP sprzężone z owczymi anty-tPA w odpowiednim rozcieńczeniu. Pasmo immunoreaktywne wizualizowano za pomocą czułego układu detekcyjnego, zestawu Amplified Opti-4GN (BIORAD, Hercules, GA).

Elektroforeza w żelu poliakrylowym skopolimeryzowanym z plazminogenem.

11% rozdzielający żel poliakryloamidowy skopolimeryzowano z plazminogenem i żelatyną jak opisano wcześniej przez Heussen i in. (14). Żel zagęszczający sporządzono w stężeniu 4% bez plazminogenu i żelatyny. Elektroforezę prowadzono w 4°C przy stałym natężeniu 8 mA. Pozostałość SDS usunięto z żelu ostrożnie wytrząsając przez 1 h w temperaturze pokojowej z 2,5% Tritonem X-100. Następnie żel wybarwiono i odbarwiono przy użyciu standardowego układu barwiącego Coomassie brillant blue (R-250). Brak wybarwienia wskazywał na obecność peptydu o aktywności enzymatycznej, w przeciwieństwie do tł a zabarwionego na niebiesko.

Wyniki

Konstrukcja wektora niosącego gen K2S. Z wektora p-51-3 powielono fragment tPA zawierający kringle 2 oraz proteazę serynowa (Ser¹⁷⁴ w domenie kringle 2 do Pro⁵²⁷ w proteazie serynowej) stosując startery sK2/174 i ASSP. Zamplifikowany produkt 1110 bp przedstawiono na żelu agarozowym (Fig. 1, ścieżka 2) i wstawiono do fagmidu pCombSHSS w miejscach podwójnego rozcięcia Sfi I na końcach 5' i 3' w prawidłowej ramce odczytu. Tak został utworzony nowy wektor, pComb3H-K2S, zawierający K2S. W wektorze tym powyżej K2S znajduje się sekwencja sygnałowa OmpA, a poniżej K2S-gp3. Prawidłowość wstawienia K2S potwierdzono przez analizę restrykcyjną za pomocą Sfi I (Fig. 2, ścieżka 3), analizę PCR (wykazanie pojedynczego prążka przy 1110 bp) i sekwencjonowanie DNA. Schematyczną mapę 2Comb3H-K2S przedstawiono na Fig. 3.

Fagowa ekspresja r-K2S.

Fag filamentowy VCSM13 wykorzystano do zainfekowania transformowanych komórek E. coli

XL-1 Blue, X[K2S] za pomocą pComb3H-K2S. VCSM13 namnożono i włączono białko fuzyjne K2Sgp3 w procesie pakowania wirusa. Otrzymano zrekombinowany fag (K2S-<I>) w stężeniu 5,4x1ο¹¹ cfu/ml, co oznaczono przez reinfekowanie E. coli XL-1 Blue fagiem wytrąconym przez PEG. Cząsteczki rekombinowanego faga zweryfikowano pod kątem ekspresji r-K2S metodą sandwich ELISA. Związane z fagiem heterologiczne białko K2S zostało rozpoznane przez monoklonalne przeciwciała anty-kringle 2 (16 B) przy zastosowaniu układu wykrywania: przeciwciała HRP sprzężone z owczymi anty-tPA. Absorbancja w tym badaniu wyniosła 1,12 ± 0,03 (Tabela 1). Ilość K2S wykrywalna na 10¹² cząstek faga jest równa 336 ng białka w stosunku do standardowego tPA czerniaka. W celu potwierdzenia, że białko fuzyjne K2S-gp3 związane było z cząstkami faga, przeciwciała HRP sprzężone z anty-tPA owcy zastąpiono HRP sprzężonymi z przeciwciałami anty-M13 owcy. Ta immunoreakcja wykazała absorbancję 1,89 ± 0,07 (Tabela 1). W przeciwieństwie do tego, jeśli przeciwciałami wiążącymi były owcze przeciwciała anty-M13 obserwowano skrajnie małą ilość K2S z przeciwciałami HRP sprzężonymi z owczymi anty-tPA. Absorbancja wynosiła tylko 0,17 ±0,01 (Tabela 1). Pozwala to przypuszczać, że jedynie niewielka liczba cząstek oczyszczonego faga niesie białko fuzyjne K2S-gp3. Jako kontrolę negatywną sporządzono VCSM13 z niestransformowanych komórek XL-1 Blue.

Konstruowanie MpComb3H-K2S.

Przy pomocy starterów mutagennych (MSTPA i MASTPA) utworzyliśmy w pComb3H-K2S kodon stop pomiędzy K2S a gp3 (Fig. 4). W celu wzbogacenia nowozsytetyzowanego i zmutowanego MpComb3H-K2S, mieszanina amplifikacyjna była starannie wytrawiona Dpn I w celu degradacji starej dam-metylowanej matrycy MpComb3H-K2S (Dpn I preferuje dam-metylowany DNA). Po transformacji E. coli XL-1 Blue MpComb3H-K2S, do dalszych badań wyselekcjonowano transformant XM[K2S]. W wyniku podstawienia bp, po mutagenezie ukierunkowanej zostało utracone jedno miejsce rozszczepienia Sfi I blisko końca 3' genu K2S. Wersję liniową MpComb3H-K2S rozszczepionego Sfi I obserwowano przy 4319 bp bez ukazania się wstawionego fragmentu genu K2S (Fig. 5, ścieżka 3). Tak więc w XM[K2S] gen K2S kodowany przez MpComb3H-K2S ulegał ekspresji, ale nie w postaci fuzyjnej z gp3.

PL 206 783 B1

Ekspresja i oczyszczenie K2S.

Ekspresję K2S w XM[K2S] indukowano IPTG. r-K2S był wykrywalny za pomocą ELISA zarówno w przestrzeni peryplazmatycznej jak i w nadsączu z hodowli. Ilość białka heterologicznego w każdym preparacie oznaczono metodą sandwich ELISA i odniesiono do wzorca tPA. Ze 100 ml hodowli bakteryjnej w kolbie wytrząsarki o O.D. [600 nm] równej 50, frakcja peryplazmatyczna dała 1,38 μg r-K2S (w przybliżeniu 32%), podczas gdy w wytrąconym amoniakiem nadsączu z hodowli otrzymano 2,96 μg r-K2S (w przybliżeniu 68%). Metodę sandwich ELISA zastosowano do weryfikacji faga wytrąconego PEG z XM[K2S] zainfekowanego VCSM13. Za pomocą HRP sprzężonego z anty-M13 nie wykryto żadnego r-K2S opłaszczonego/związanego przez przeciwciała monoklonalne anty-kringle 2, co wskazuje, że przy nieobecności gp3, K2S nie jest prezentowana na cząstkach faga.

Pomiar aktywności amidolitycznej.

Jeśli w próbce obecna jest domena proteazy serynowej, plazminogen będzie przekształcany w plazminę. Wytworzona plazmina będzie z kolei trawić substrat S-2251 do barwnego produktu, p-nitroaniliny, która ma maksimum absorbancji przy 405 nm. Aktywność właściwa rekombinowanego produktu jest zgodna z absorbancją. Oceniono i porównano zależną od fibrynogenu aktywność enzymatyczną każdej próbki, tj. K2S-<I>, peryplazmatycznego r-K2S lub r-K2S z nadsączu z hodowli. Zarówno K2S-<I> jak peryplazmatyczny r-K2S wykazują znacząco niską aktywność enzymatyczną, poniżej czułości testu (0,25 lU/ml). r-K2S z nadsączu z hodowli wykazała zależną od fibrynogenu aktywność enzymatyczną 7 lU/ml. Tak więc ze 100 ml hodowli uzyskano łącznie 700 lU aktywności enzymatycznej. Bez fibrynogenu nie obserwowano aktywności enzymatycznej oczyszczonej K2S z nadsączu z hodowli, podczas gdy wzorzec tPA czerniaka wykazał pewną aktywność.

Wykazanie obecności białka rekombinowanego przez immunoblotting.

Przy użyciu przeciwciał anty-tPA owcy wykazano, że częściowo oczyszczona K2S z nadsączu hodowli XM[K2S] ma masę cząsteczkową 39 kDa (Fig. 6). Kontrola negatywna, częściowo oczyszczony nadsącz z hodowli nietransformowanych komórek XL-1 Blue, nie zawierał pasma reakcyjnego o podobnym rozmiarze.

Lokalizacja aktywnego enzymu metodą PAGE.

Plazminogen przed elektroforezą kopolimeryzowano i immobilizowano za pomocą żelatyny w żelu poliakryloamidowym. Analizowano wytrącone siarczanem amonu nadsącze z hodowli E. coli XL-1 Blue, E. coli transformowane pComb3HSS i XM[K2S] (Fig. 7).

Wszystkie próbki obrabiano w warunkach nieredukujących dla zachowania prawidłowej konformacji i aktywności domeny proteazy serynowej. Przezroczyste obszary plazminogenu trawionego proteaza serynowa obserwowano tylko w wytrąconych siarczanem amonu nadsączach z hodowli XM[K2S] w pozycjach 34 i 37 kDa. Inne próbki nie dały czystych stref. Ścieżka pozytywnej kontroli wzorca tPA czerniaka również wykazała aktywność enzymatyczną w pozycjach 66 i 72 kDa.

Literatura

1. Allen, S., H. Y. Naim i N. J. Bulleid. 1995. Intracellular folding of tissue-type plasminogen activator. Effects of disulfide bond formation on N-linkes glycosylation and secretion. J. Biol. Chem. 270:4797-4804.

2. Ames, G. F., C. Prody I S. Kustu. 1984. Simple, rapid, and quantitative release of periplasmic proteins by chloroform. J. Bacteriol. 160:1181-1183.

3. Barbas, C. F. III, A. S. Kang, R. A. Lerner i S. J. Benkovic. 1991. Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surfaces; the gene III site. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88:7978-7892.

4. Barbas, C. F. III I J. Wagner. 1995. Synthetic human antibodies: selecting and evolving functional proteins. A Companion to Methods in Enzymology 8: 94-103.

5. Bennett, W. F. , N. F. Paoni, B. A. Keyt, D. Botstein, A. J. Jones, L. Presta, F. M. Wurm i M. J. Zoller. 1991. High resolution analysis of functional determinants on human tissue-type plasminogen activator. J. Biol. Chem. 266:5191-5201.

6. Betton, J. M., N. Sassoon, M. Hofnung I M. Laurent. 1998. Degradation versus aggregation of misfolded maltose-binding protein in the periplasm of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 273:8897-8902.

7. Camiolo, S. M., S. Thorsen i T. Astrup. 1971. Fibrinogenolysis and fibrynolysis with tissue plasminogen activator, urokinase, streptokinase-activated human globulin and plasmin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 38:277-280.

8. Cartwright, T. 1992. Production of t-PA from animal cell culture, str.217-245. W R. E. Spier i J. B. Griffiths (wyd.), Animal Cell Biotechnology, tom 5, Academic Press, N.Y.

PL 206 783 B1

9. Curry, K. A., A. W. Yem, M. R. Deibel, Jr., N. T. Hatzenbuhler, J. G. Hoogerheide i C. S. Tomich. 1990. Escherichia coli expression and processing of human interleukin-1 beta fused to signal peptides. DNA Cell Biol. 9: 167-175.

10. Datar, R. V., T. Cartwright I C.-G. Rosen. 1993. Process economics of animal cell and bacterial fermentations: a case study analysis of tissue plasminogen activator. Biotechnology 11:349-357.

11. Denefle, P., S. Kovarik, T. Ciora, N. Gosselet, J. C. Benichou, M. Latta, F. Guinet, A. Ryter I J. F. Mayaux. 1989. Heterologous protein export in Escherichia coli: influence of bacterial signal peptides on the export of human interleukin beta. Gene 85:499-510.

12. Griffiths, J. B., A. Electricwala. 1987. Production of tissue plasminogen activators from animal cells. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 34:147-166.

13. Harris, T. J., T. Patel, F. A. Marston, S. Little, J. S. Emtage, G. Opdenakker, G. Volckaert, W. Romabuts, A. Biliau I P. de Sonor. 1986. Cloning of c-DNA coding for human tissue plasminogen activator and its expression in Escherichia coli. Mol. Biol. Med. 3:279-292.

14. Heussen, C. i E.B.Dowdle. 1980. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem. 102:196-202.

15. Heussen, C, F. Joubert i E. B. Dowdle. 1984. Purification of human tissue plasminogen activator with Erythrina trypsin inhibitor. J. Biol. Chem. 259:11635-11638.

16. Hu, C. K., U. Kohnert, O. Wilhelm, S. Fischer i M. Llinas. 1994. Tissue-type plasminogen activator domain-deletion mutant BM 06.022: modular stability, inhibitor binding, and activation cleavage. Biochemistry 33:11760-11766.

17. KipriyanoY, S. M., G. Moldenhauer i M. Little. 1997. High level production of soluble single chain antibodies in small-scale Escherichia coli cultures. J.Immunol.Methods 200:69-77.

18. Ko,J.H., D.K.Park, I.G.Kim, S.H.Leee i S.M.Byun. 1995. Hihg-level expression and secretion of streptokinase in Escherichia coli. Biotechnol. Lett. 17:1019-1024.

19. Kouzuma, Y., N. Yamasaki i M. kimura. 1997. The tissue-type plasminogen activator inhibitor ETIa from Erythrina variegata: structural basis for inhibitory activity by cloning, expression, and mutagenesis of the cDNA encoding ETIa. J. Biochem. (Tokyo) 121:456-463.

20. Lasters, I., N. Van Herzeele, H. L. Lijnen, D. Gollen i L. Jespers. 1997. Enzymatic properties of phage-displayed fragments of human plasminogen. Eur. J. Biochem. 244:946-952.

21. Lobel, L. I., P. Rausch, I. Trakht, S. Pollak i J. W. Lustbader. 1997. Filamentous phage displaying the extracellular domain of the hLH/GG receptor bind hCG specifically. Endocrinology. 138: 1232-1239.

22. A.Lubiniecki, R.Arathoon, G.Polastri, J.Thomas, M. Wiebe, R. Garnick, A. Jones, R. van Reis i S. Builder. Selected strategies for manufacture and control of recombinant tissue plasminogen activator prepared from cell culture, str.442-451. W R.E. Spier, J.B. Griffiths, J.Stephenne i P.J. Crooy (wyd.), Advances in animal celi biology and technology for bioprocesses. Butterworths, London.

23. Lucie, M. R., B. E. Forbes, S. E. Grovenor, J. M. Carr, J. C. Wallace i G. Forsberg. 1998. Secretion in Escherichia coli and phage-display of recombinant insulin-like growth factor binding protein-2. J. Biotechnol. 61:95-108.

24. Martin, U., S. Fischer, U. Kohnert, H. Lill, R. Rudolph, G. Sponer, A. Stern i K. Strein. 1990. Properties of a novel plasminogen activator (BM 06.022) produced in Escherichia coli. Z. Kardiol.

79:167-170.

25. Obukowicz, M. G., M. E. Gustafson, K. D. Junger, R. M. Leimgruber, A. J. Wittwer, T. C. Wun, T. G. Warren, B. F. Bishop, K. J. Mathis, D. T. McPherson, N. R. Siegel, M. G. Jenning, B. B. Brightwell, J. A. Diaz-Cllier, L. D. Bell, C. S. Craik i W. C. Tacon. 1990. Secretion of active kringle-2serine protease in Escherichia coli. Biochemistry 29:9737-9745.

26. Parmley, S. F. I G. P. Smith. 1998. Antibody-selectable filamentous fd phage vectors: affinity purification of target genes. Gene 73:305.318.

27. Pennica, D. , W. E. Holmes, W. J. Kohr, R. N. Harkins, G. A. Vehar, C. D. Ward, W. F. Bennett, E. Velverton, P. H. Seeburg, H. I. Heyneker, D. V. Goeddel I D. Gollen. 1983. Cloning and expression of human tissue-type plasminogen activator cDNA in E. coli. Nature 301:214-221.

28. Rippmann, J. F. , M. Klein, C. Hoischen, B. Brocks, W. J. Rettig, J. Gumpert, K. Pfizenmaier, R. Mattes i D. Moosmayer. 1998. Procaryotic expression of single-chain variable-fragment (scFv) antibodies: secretion in L-forms cells of Proteus mirabilis leads to active product and overPL 206 783 B1 comes the limitations of periplasmic expression in Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol. 64:48624869.

29. Saito, Y., Y. Ishii, H. Sasaki, M. Hayashi, T. Fujimura, Y. Imai, S. Nakamura, S. Suzuki, J. Notani, T. Asada, H. Horiai, K. Masakazu I N. Mineo. 1994. Production and characterization of a novel tissue-type plasminogen activator derivative in Escherichia coli. Biotechnol. Prog. 10:472-479.

30. Sarmientos, P., M. Duchesne, P. Denefle, J. Boiziau, N. Fromage, N. Delporte, F, Parker, Y. Lelievre, J.-F. Mayaux i T. Cartwright. 1989. Synthesis and purification of active human plasminogen activator from Escherichia coli. Biotechnology 7:495-501.

31. Scherrer, S., N. Robas, H. Zouheiry, G. Branlant i C. Branlant. 1994. Periplasmic aggregation limits the proteolytic maturation of the Escherichia coli penicillin G amidase precursor polypeptide. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42: 85-89.

32. Soeda, S., M. Kakiki, H. Shimeno i A. Nagamatsu. 1986. Rapid and high-yield purification of porcine heart tissue-type plasminogen activator by heparin sepharose chromatography. Life Sci. 39:1317-1324.

33. Szarka, S. J., E. G. Sihota, H. R. Habibi i S.-L. Wong. 1999. Staphylokinase as a plasminogen activator component on recombinant fusion proteins. Appl. Environ. Microbiol. 65:506-513.

34. Waldenstróm, M., E. Holmgren, A. Attersand, C. Kalderen, B. Lowenadler, B. Raden, L. Hansson i G. Pohl. 1991. Synthesis and secretion of a fibrinolytically active tissue-type plasminogen activator variant in Escherichia coli. Gene 99:243-248.

35. Wan, E.W.-M. i F.Baneyx. 1998. TolAIII Co-overexpression Facilitates the Recovery of Periplasmic Recombinant Proteins into the Growth Medium of Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 14:13-22.

36. Zacharias, U., B. Fischer, F. Noll i H Will. 1992 Characterization of human tissue-type plasminogen activator with monoclonal antibodies: mapping of epitopes and binding sites for fibrin and lysine. Thromb. Haemost. 67:88-94.

Opisy rysunków

Fig. 1.

Potwierdzenie produktu amplifikacji PCR genu K2S z wektora p51-3 przy użyciu starterów SK2/174 i assp.

Ścieżka 1 - przedstawia marker 1 kb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, ON).

Na ścieżkę 2 naniesiono 1 μI powielonego produktu. Został zaznaczony pojedynczy prążek przy 1110 bp. Elektroforezę prowadzono w 1% żelu agarozowym.

Fig. 2.

Identyfikację wstawionego genu K2S przy 1110 bp (*) po trawieniu pComb3H-K2S za pomocą Sfi I przedstawiono na ścieżce 3.

Ścieżka 1 przedstawia marker 1 kb.

Na ścieżkę 2 naniesiono nieprzecięty pComb3H-K2S. Elektroforezę prowadzono w 1% żelu agarozowym.

Fig. 3.

Schemat pComb3H-K2S ukazujący dwa miejsca klonowania Sfi I, w które został wstawiony gen K2S. Przedstawiono również sekwencje sygnałowe (OmpA), miejsce wiązania rybosomu (RIBS), promotor lac i gen gpIII.

Fig. 4.

Schematyczny diagram miejsca mutacji w połączeniu genu K2S i gpIII w pComb3H-K2S.

Zestaw starterów mutagennych (MSTPA i MASTPA) zawierających zmodyfikowane oligonukleozydy (podkreślone) związany jest z pComb3H-K2S w miejscach przyłączenia starterów. Po przeprowadzeniu amplifikacji, miejsce Sfi I (wytłuszczone) zostaje zmodyfikowane i utracone w nowozsyntetyzowanej nici.

Fig. 5.

Charakteryzowanie nowo-zsyntetyzowanego pComb3H-K2S za pomocą enzymu restrykcyjnego Sfi I. Pojedynczy prążek przy 4319 bp, który odnosi się do pojedynczego miejsca rozszczepienia MpComb3H-K2S widać na ścieżce 3. Przy 1110 bp nie widać żadnego prążka dla wstawionej K2S. Ścieżka 1 przedstawia marker 1 kb. Elektroforezę prowadzono w 1% żelu agarozowym.

Fig. 6.

Identyfikacja immunologicznie reaktywnego pasma białka pochodzącego z rekombinowanego DNA oczyszczonego z nadsączu hodowli XM[K2S] za pomocą HRP sprzężonego z anty-tPA owcy. Na ścieżkę 1 naniesiono 40 ng wzorca tPA czerniaka (86/670), który wykazał prążek reaktywny przy

PL 206 783 B1 kDa. Częściowo oczyszczone i zatężone nadsącze z hodowli z nietransformowanych E. coli XL1Blue i XM[K2S] zostały naniesione odpowiednio na ścieżki 2 i 3. Wyraźne prążki reaktywne pokazano szczególnie na ścieżce 3 przy 39 kDa.

Fig. 7.

Oznaczenie masy cząsteczkowej pozakomórkowej r-K2S z domeną aktywnej proteazy serynowej za pomocą elektroforezy w żelu poliakryloamidowym skopolimeryzowanym z plazminogenem. Ścieżka 1 zawierała wzorce o wskazanej masie cząsteczkowej (x10^-3), SDS-6H (Sigma, Saint Louis, MO). Na ścieżki 2, 3 i 4 naniesiono odpowiednio 50 μg wytrąconego 55% nasyconym siarczanem amonu nadsączu hodowli XL-1 Blue, XL-1 Blue transformowanych za pomocą pComb3H-K2S i XM[K2S]. Ścieżka 5 zawierała 50 mlU wzorca tPA czerniaka (86/670). Przezroczyste strefy wytrawionego plazminogenu w żelu polakryloamidowym są widoczne tylko w ścieżce 4 przy masie cząsteczkowej 34 i 37 kDa (B) i w ścieżce 5 przy masie cząsteczkowej 66 i 72 kDa (A).

Fig. 8.

Natywna cząsteczka K2S z aminokwasów 174-527 bez modyfikacji.

Fig. 9.

Natywna cząsteczka K2S z aminokwasów 197-527 bez modyfikacji.

Fig. 10.

Cząsteczka K2S z aminokwasów 193-527, w której do struktury B-0 z Fig. 9 w części N-terminalnej zostały dodane aminokwasy SEGN.

Fig. 11.

Cząsteczka K2S z aminokwasów 193-527, jak na Fig. 10, w której Cys-261 została zamieniona na Ser.

Fig. 12.

Cząsteczka K2S z aminokwasów 191-527, w której do struktury B-0 z Fig. 9 w części N-terminalnej zostały dodane aminokwasy SEGNSD.

Fig. 13.

Cząsteczka K2S z aminokwasów 191-527, jak na Fig. 12, w której Cys-261 została zamieniona na Ser.

Fig. 14.

Struktura C (SEQ ID NO:17)

Natywna cząsteczka K2S z aminokwasów 220-527 bez modyfikacji. Cząsteczka ta może być następnie modyfikowana w sposób podobny do przedstawionego dla struktury B na figurach 10-13.

Fig. 15.

Struktura D (SEQ ID NO:18)

Natywna cząsteczka K2S z aminokwasów 260-527 bez modyfikacji. Cząsteczka ta może być następnie podobnie modyfikowana jak dla struktury B na figurach 10-13.

Fig. 16.

Wykrywanie cząsteczki r-K2S w preparacie fagowym za pomocą sandwich ELISA

Przeciwciała wiążące	Przeciwciało detekcyjne (sprzężone HRP)
Anty-tPA	Anty-M-13
K2S-<'I>	VCSM13	K2S-<'I>	VCSM13
Anty-kringle 2b	1,12±0,04c	0,12±0,03	1,89±0,02	0,16±0,02
Anty-M13	0,17±0,01	0,14±0,05	1,91±0,02	1,88±0,03

^a VCSM13 otrzymano z komórek XL-1 Blue transformowanych pComb3HSS ^b Wykorzystano przeciwciała monoklonalne anty-kringle 2 (16/B). Pozostał e przeciwciał a otrzymano z owczej immunoglobuliny. ^c Wartość jest średnią absorbancją dla każdej próbki, którą badano w trzech powtórzeniach.

PL 206 783 B1

WYKAZ SEKWENCJI <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Sposoby wytwarzania na dużą skalę cząsteczek tPA lub K2S pochodzących z rekombinowanego DNA <130> przypadek 1-1170 <140>

<141>

<150> GB 0027779.8 <151> 2000-11-14 <160> 25 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Sztuc zna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca N-terminalną część białka K2S <400> 1 tctgagggaa acagtgac

<210>	2
<211>	1128
<212>	DNA
<213>	Sztuczna

PL 206 783 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca N-terminalną część białka fuzyjnego 0mpA-K2S <400> 2

α t. CJ <2.3. 3 <2 3 CJ 3	cagctatcgc	gattgcagtg	gcactggctg	gtttcgctac	cgtggcccag	60
gcggcctctg	agggaaacag	tgactgctac	tttgggaatg	ggtcagccta	ccgtggcacg	120
cacagcctca	ccgagtcggg	tgcctcctgc	ctcccgtgga	attccatgat	cctgataggc	180
aaggtttaca	cagcacagaa	ccccagtgcc	caggcactgg	gcctgggcaa	acataattac	240
tgccggaatc	ctgatgggga	tgccaagccc	tggtgccacg	tgctgaagaa	ccgcaggctg	300
acgtgggagt	actgtgatgt	gccctcctgc	tccacctgcg	gcctgagaca	gtacagccag	360
cctcagtttc	gcatcaaagg	agggctcttc	gccgacatcg	cctcccaccc	ctggcaggct	420
gccatctttg	ccaagcacag	gaggtcgccc	ggagagcggt	tcctgtgcgg	gggcatactc	480
atcagctcct	gctggattct	ctctgccgcc	cactgcttcc	aggagaggtt	tccgccccac	540
cacctgacgg	tgatcttggg	cagaacatac	cgggtggtcc	ctggcgagga	ggagcagaaa'	600
tttgaagtcg	aaaaatacat	tgtccataag	gaattcgatg	atgacactta	cgacaatgac	660
attgcgctgc	tgcagctgaa	atcggattcg	tcccgctgtg	cccaggagag	cagcgtggtc	720
cgcactgtgt	gccttccccc	ggcggacctg	cagctgccgg	actggacgga	gtgtgagctc	780
tccggctacg	gcaagcatga	ggccttgtct	cctttctatt	cggagcggct	gaaggaggct	840
catgtcagac	tgtacccatc	cagccgctgc	acatcacaac	atttacttaa	cagaacagtc	900
accgacaaca	tgctgtgtgc	tggagacact	cggagcggcg	ggccccaggc	aaacttgcac	960
gacgcctgcc	agggcgattc	gggaggcccc	ctggtgtgtc	tgaacgatgg	ccgcatgact	1020
ttggtgggca	tcatcagctg	gggcctgggc	tgtggacaga	aggatgtccc	gggtgtgtac	1080
acaaaggtta	ccaactacct	agactggatt	cgtgacaaca	tgcgaccg		1128

<210> 3 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <4 00> 3 acgaasaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcc 66 <210> 4 <211> 1065 <212> DNA

PL 206 783 B1 <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca białko K2S <400> 4 tctgagggaa acagtgactg ctactttggg aatgggtcag cctaccgtgg cacgcacagc 60 ctcaccgagt cgggtgcctc ctgcctcccg tggaattcca tgatcctgat aggcaaggtt 120 tacacagcac agaaccccag tgcccaggca ctgggcctgg gcaaacataa ttactgccgg 180 aatcctgatg gggatgccaa gccctggtgc cacgtgctga agaaccgcag gctgacgtgg 240 gagtactgtg atgtgccctc ctgctccacc tgcggcctga gacagtacag ccagcctcag 300 tttcgcatca aaggagggct cttcgccgac atcgcctccc acccctggca ggctgccatc 360 tttgccaagc acaggaggtc gcccggagag cggttcctgt gcgggggcat actcatcagc 420 tcctgctgga ttctctctgc cgcccactgc ttccaggaga ggtttccgcc ccaccacctg' 480 acggtgatct tgggcagaac ataccgggtg gtccctggcg aggaggagca gaaatttgaa 540 gtcgaaaaat acattgtcca taaggaattc gatgatgaca cttacgacaa tgacattgcg 600 ctgctgcagc tgaaatcgga ttcgtcccgc tgtgcccagg agagcagcgt ggtccgcact 660 gtgtgccttc ccccggcgga cctgcagctg ccggactgga cggagtgtga gctctccggc 720 tacggcaagc atgaggcctt gtctcctttc tattcggagc ggctgaagga ggctcatgtc 780 agactgtacc catccagccg ctgcacatca caacatttac ttaacagaac agtcaccgac 840 aacatgctgt gtgctggaga cactcggagc ggcgggcccc aggcaaactt gcacgacgcc 900 tgccagggcg attcgggagg ccccctggtg tgtctgaacg atggccgcat gactttggtg 960 ggcatcatca gctggggcct gggctgtgga cagaaggatg tcccgggtgt gtacacaaag 1020 gttaccaact acctagactg gattcgtgac aacatgcgac cgtga 1065 <210> 5 <211> 1128 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220> .

<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca białko fuzyjne OmpA-K2S <400> 5 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcctctg agggaaacag tgactgctac tttgggaatg ggtcagccta ccgtggcacg 120

PL 206 783 B1 cacagcctca ccgagtcggg tgcctcctgc ctcccgtgga attccatgat cctgataggc 180 aaggtttaca cagcacagaa ccccagtgcc caggcactgg gcctgggcaa acataattac 240 tgccggaatc ctgatgggga tgccaagccc tggtgccacg tgctgaagaa ccgcaggctg 300 acgtgggagt actgtgatgt gccctcctgc tccacctgcg gcctgagaca gtacagccag 360 cctcagtttc gcatcaaagg agggctcttc gccgacatcg cctcccaccc ctggcaggct 420 gccatctttg ccaagcacag gaggtcgccc ggagagcggt tcctgtgcgg gggcatactc 480 atcagctcct gctggattct ctctgccgcc cactgcttcc aggagaggtt tccgccccac 540 cacctgacgg tgatcttggg cagaacatac cgggtggtcc ctggcgagga ggagcagaaa 600 tttgaagtcg aaaaatacat tgtccataag gaattcgatg atgacactta cgacaatgac 660 attgcgctgc tgcagctgaa atcggattcg tcccgctgtg cccaggagag cagcgtggtc 720 cgcactgtgt gccttccccc ggcggacctg cagctgccgg actggacgga gtgtgagctc 780 tccggctacg gcaagcatga ggccttgtct cctttctatt cggagcggct gaaggaggct 840 catgtcagac tgtacccatc cagccgctgc acatcacaac atttacttaa cagaacagtc 900 accgacaaca tgctgtgtgc tggagacact cggagcggcg ggccccaggc aaacttgcac 960 gacgcctgcc agggcgattc gggaggcccc ctggtgtgtc tgaacgatgg ccgcatgact·1020 ttggtgggca tcatcagctg gggcctgggc tgtggacaga aggatgtccc gggtgtgtac 1080 acaaaggtta ccaactacct agactggatt cgtgacaaca tgcgaccg 1128 <210> 6 <211> 66 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcc . ₆₆ <210 7 <211> 1065 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca białko K2S <400> 7

PL 206 783 B1

tctgagggaa acagtgactg ctactttggg aatgggtcag cctaccgtgg cacgcacagc 60
ctcaccgagt	cgggtgcctc	ctgcctcccg	tggaattcca	tgatcctgat	aggcaaggtt	120
tacacagcac	agaaccccag	tgcccaggca	ctgggcctgg	gcaaacataa	ttactgccgg	180
aatcctgatg	gggatgccaa	gccctggtgc	cacgtgctga	agaaccgcag	gctgacgtgg	240
gagtactgtg	atgtgccctc	ctgctccacc	tgcggcctga	gacagtacag	ccagcctcag	300
tttcgcatca	aaggagggct	cttcgccgac	atcgcctccc	acccctggca	ggctgccatc	360
tttgccaagc	acaggaggtc	gcccggagag	cggttcctgt	gcgggggcat	actcatcagc	420
tcctgctgga	ttctctctgc	cgcccactgc	ttccaggaga	ggtttccgcc	ccaccacctg	480
acggtgatct	tgggcagaac	ataccgggtg	gtccctggcg	aggaggagca	gaaatttgaa	540
gtcgaaaaat	acattgtcca	taaggaattc	gatgatgaca	cttacgacaa	tgacattgcg	600
ctgctgcagc	tgaaatcgga	ttcgtcccgc	tgtgcccagg	agagcagcgt	ggtccgcact	660
gtgtgccttc	ccccggcgga	cctgcagctg	ccggactgga	cggagtgtga	gctctccggc	720
tacggcaagc	atgaggcctt	gtctcctttc	tattcggagc	ggctgaagga	ggctcatgtc	780
agactgtacc	catccagccg	ctgcacatca	caacatttac	ttaacagaac	agtcaccgac	840
aacatgctgt	gtgctggaga	cactcggagc	ggcgggcccc	aggcaaactt	gcacgacgcc	900
tgccagggcg	attcgggagg	ccccctggtg	tgtctgaacg	atggccgcat	gactttggtg	960
ggcatcatca	gctggggcct	gggctgtgga	cagaaggatg	tcccgggtgt	gtacacaaag	1020
gttaccaact	acctagactg	gattcgtgac	aacatgcgac	cgtga		1065

<210> 8 <211> 377 <212> ΡΗΤ <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: białko fuzyjne 0mpA-K2S <400> 8

Met 1

Lys

Lys

Thr

Ala 5

Ile

Ala

Ile

Ala

Val 10

Ala

Leu

Ala

Gly

Phe 15

Ala

Thr

Val

Ala

Gin

Ala

Ala

Ser

Glu

Gly

Asn

Ser

Asp

Cys

Tyr

Phe

Gly

20

25

30

Asn

Gly

Ser

Ala

Tyr

Arg

Gly

Thr

His

Ser

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Ala

35

40

45

PL 206 783 B1

Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Val Tyr Thr 50 55 60

Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr 65 70 75 80

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Val Leu Lys 85 90 95

Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser Cys Ser Thr 100 105 110

Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly 115 120 125

Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala 130 135 140

Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu

145 150 155 160

Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg

165 170 175

Phe Pro Pro His His Leu Thr Val Ile. Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val 180 185 190

Val Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val 195 200 205

His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu 210 215 220

Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val

225 230 235 240

Arg Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr

245 250 255

PL 206 783 B1

Glu Cys	Glu	Leu Ser 260	Gly	Tyr	Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe
265	270
Tyr Ser	Glu	Arg Leu	Lys	Glu	Ala His Val Arg	Leu Tyr Pro Ser Ser
	275				280	285
Arg Cys	Thr	Ser Gin	His	Leu	Leu Asn Arg Thr	Val Thr Asp Asn Met
290				295		300
Leu Cys	Ala	Gly Asp	Thr	Arg	Ser Gly Gly Pro	Gin Ala Asn Leu His
305			310		315	320
Asp Ala	Cys	Gin Gly	Asp	Ser	Gly Gly Pro Leu	Val Cys Leu Asn Asp
		325			330	335
Gly Arg	Met	Thr Leu	Val	Gly	Ile Ile Ser Trp	Gly Leu Gly Cys Gly
		340			345	350
Gin Lys	Asp	Val Pro	Gly	Val	Tyr Thr Lys Val	Thr Asn Tyr Leu Asp
	355				360	365
Trp Ile	Arg	Asp Asn	Met	Arg	Pro Gly
370				375
<210> 9
<211> 4
<212> PRT
<213> sztuczna sekwencja
<220>
<223> Opis	sztucznej sekwencji: sekwencja

peptydowa <400> 9

Ser Glu Gly Asn 1

PL 206 783 B1 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: sekwencja peptydowa <400> 10

Ser Glu Gly Asn Ser Asp 1 5 <210> 11 <211> 354 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: K2S 174-527 <400> 11

Ser 1

Glu Gly Asn

Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg

5

10

15

Gly

Thr

His

Ser

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Ala

Ser

Cys

Leu

Pro

Trp

Asn

20

25

30

Ser

Met

Ile

Leu

Ile

Gly

Lys

Val

Tyr

Thr

Ala

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

35

40

45

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

50

55

60

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

65

70

75

80

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

cys

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

PL 206 783 B1

90 95

Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala 100 105 110

Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro 115 120 125

Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile 130 135 140

Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu

145 150 155 160

Thr Val Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val Pro Gly Glu Glu Glu

165 170 175

Gin Lys Phe Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His Lys Glu Phe Asp Asp 180 185 190

Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 195 200 205

Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg Thr Val Cys Leu Pro 210 215 220

Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly

225 230 235 240

Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys

245 250 255

Glu Ala His Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His 260 265 270

Leu Leu Asn Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr 275 280 285

Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp

PL 206 783 B1

290 295 300

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Val

305

310

315

320

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

Pro

Gly

325

330

335

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Ile

Arg

Asp

Asn

Met

340

345

350

Arg

Pro

<210> 12
<211> 331
<212> PRT
<213> Sztuczna	sekwencja
<220> <223> opis sztucznej sekwencji: K2S 197-527 <400> 12
Ser Gly Ala Ser 1	Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys 5 10 15
Val Tyr Thr Ala 20	Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys 25 30
His Asn Tyr Cys 35	Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His 40 45
Val Leu Lys Asn 50	Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Val Pro Ser 55 60
Cys Ser Thr Cys 65	Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile 70 75 80

PL 206 783 B1

PL 206 783 B1

<210>	13
<211>	339
<212>	PRT
<213>	Sztuczna sekwencja
<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: zmodyfikowane K2S 193-527
<4 00>	13

Ser 1

Glu

Gly

Asn

Ser 5

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly 10

Ala

Ser

Cys

Leu

Pro 15

Trp

Asn

Ser

Met

Ile 20

Leu

Ile

Gly

Lys

Val 25

Tyr

Thr

Ala

Gin

Asn 30

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala 35

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys 40

His

Asn

Tyr

Cys

Arg 45

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp 50

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys 55

His

Val

Leu

Lys

Asn 60

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp 65

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val 70

Pro

Ser

Cys

Ser

Thr 75

Cys

Gly

Leu

Arg

Gin 80

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin 85

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly 90

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp 95

Ile

Ala

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

Ile

Phe

Ala

Lys

His

Arg

Arg

Ser

PL 206 783 B1

PL 206 783 B1

305 310 315 320

Gly Val Tyr Thr Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn 325 330 335

Met Arg Pro <210> 14 <211> 335 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: zmodyfikowane K2S 193-527 <400> 14

Ser Leu Thr Glu Ser

Gly Ala Ser

Cys

Leu Pro Trp Asn Ser Met

Ile

1

5

10

15

Leu

Ile

Gly

Lys

Val

Tyr

Thr

Ala

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala

Leu

20

25

30

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

35

40

45

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

50

55

60

Asp

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

65

70

75

80

Gin

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp

Ile

Ala

Ser

His

Pro

85

90

95

Trp

Gin

Ala

Ala

Ile

Phe

Ala

Lys

His

Arg

Arg

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

100

105

110

PL 206 783 B1

PL 206 783 B1

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 325 330 335 <210> 15 <211> 343 <212> PRT

<21

3> s

ztuc

zna

sekw

enc j

a

<22'

0>

<22

3> 0

pis

s ztu

czne

j se

:kwenc j i :

: zmodyf:

ikow

ane

K

2S i

91-5

27

<40'

0> 1.

5

Ser

Glu

Gly

Asn

Ser

Asp

Thr

His

Ser

Leu

Thr

Glu

Ser

Gly

Ala

Ser

1

5

10

15

Cys

Leu

Pro

Trp

Asn

Ser

Met

Ile

Leu

Ile

Gly

Lys

Val

Tyr

Thr

Ala

20

25

30

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

Cys

35

40

45

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

50

55

60

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Cys

Ser

Thr

Cys

65

70

75

80

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly

Gly

Leu

85

90

95

Phe

Ala

Asp

Ile

Ala

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

Ile

Phe

Ala

Lys

100

105

110

His

Arg

Arg

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

Ile

Leu

Ile

115

120

125

PL 206 783 B1

Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe 140

Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Val Val 155 160

Glu Val Glu Lys Tyr Ile Val His 170 175

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin 185 190

Ala Gin Glu Ser Ser Val Val Arg 205

Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu 220

His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr 235 240

Val Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg 250 255

Arg Thr Val Thr Asp Asn Met Leu 265 270

Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp 285

Pro Leu Val Cys Leu Asn Asp Gly 300

Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin 315 320

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp 330 335

Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala 130 135

Pro Pro His His Leu Thr Val Ile 145 150

Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe 165

Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr 180

Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys 195 200

Thr Val Cys Leu Pro Pro Ala Asp 210 215

Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 225 230

Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His 245

Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn 260

Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly 275 280

Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly 290 295

Arg Met Thr Leu Val Gly Ile Ile 305 310

Lys Asp Val Pro Gly Val Tyr Thr 325

PL 206 783 B1

Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 340 <210> 16 <211> 343 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: zmodyfikowane K2S 191-527 <400> 16

Ser 1

Glu

dy

Asn

Ser Asp Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser

5

10

15

Cys

Leu

Pro

Trp

Asn

Ser

Met

Ile

Leu

Ile

Gly

Lys

Val

Tyr

Thr

Ala

20

25

30

Gin

Asn

Pro

Ser

Ala

Gin

Ala

Leu

Gly

Leu

Gly

Lys

His

Asn

Tyr

Cys

35

40

45

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

50

55

60

Arg

Arg

Leu

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Ser

Ser

Thr

Cys

65

70

75

80

Gly

Leu

Arg

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly

Gly

Leu

85

90

95

Phe

Ala

Asp

Ile

Ala

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

Ile

Phe

Ala

Lys

100

105

110

His

Arg

Arg

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

Ile

Leu

Ile

115

120

125

Ser

Ser

Cys

Trp

Ile

Leu

Ser

Ala

Ala

His

Cys

Phe

Gin

Glu

Arg

Phe

PL 206 783 B1

130

135

140

Pro

Pro

His

His

Leu

Thr

Val

Ile

Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

145

150

155

160

Pro

Gly

Glu

Glu

Glu

Gin

Lys

Phe

Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

Ile

Val

His

165

170

175

Lys

Glu

Phe

Asp

Asp

Asp

Thr

Tyr

Asp

Asn

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

Gin

180

185

190

Leu

Lys

Ser

Asp

Ser

Ser

Arg

Cys

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

195

200

205

Thr

Val

Cys

Leu

Pro

Pro

Ala

Asp

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

210

215

220

Cys

Glu

Leu

Ser

Gly

Tyr

Gly

Lys

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr

225

230

235

240

Ser

Glu

Arg

Leu

Lys

Glu

Ala

His

Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

245

250

255

Cys

Thr

Ser

Gin

His

Leu

Leu

Asn

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

260

265

270

Cys

Ala

Gly

Asp

Thr

Arg

Ser

Gly

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

275

280

285

Ala

Cys

Gin

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

290

295

300

Arg

Met

Thr

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

305

310

315

320

Lys

Asp

Val

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

325

330

335

Ile

Arg

Asp

Asn

Met

Arg

Pro

PL 206 783 B1

340 <210> 17 <211> 308 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <22 0>

<223> opis sztucznej sekwencji: K2S 220-527 <400> 17

Ser Ala . 1

Gin

Ala

Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn

Pro

5

10

15

Asp

Gly

Asp

Ala

Lys

Pro

Trp

Cys

His

Val

Leu

Lys

Asn

Arg

Arg

Leu

20

25

30

Thr

Trp

Glu

Tyr

Cys

Asp

Val

Pro

Ser

Cys

Ser

Thr

Cys

Gly

Leu

Arg

35

40

45

Gin

Tyr

Ser

Gin

Pro

Gin

Phe

Arg

Ile

Lys

Gly

Gly

Leu

Phe

Ala

Asp

50

55

60

Ile

Ala

Ser

His

Pro

Trp

Gin

Ala

Ala

Ile

Phe

Ala

Lys

His

Arg

Arg

65

70

75

80

Ser

Pro

Gly

Glu

Arg

Phe

Leu

Cys

Gly

Gly

Ile

Leu

Ile

Ser

Ser

Cys

85

90

95

Trp

Ile

Leu

Ser

Ala

Ala

His

Cys

Phe

Gin

Glu

Arg

Phe

Pro

Pro

His

100

105

110

His

Leu

Thr

Val

Ile

Leu

Gly

Arg

Thr

Tyr

Arg

Val

Val

Pro

Gly

Glu

115

120

125

Glu

Glu

Gin

Lys

Phe

Glu

Val

Glu

Lys

Tyr

Ile

Val

His

Lys

Glu

Phe

130

135

140

PL 206 783 B1

Asp Asp Asp Thr 145

Tyr

Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser

150

155

160

Asp

Ser

Ser

Arg

Cys

Ala

Gin

Glu

Ser

Ser

Val

Val

Arg

Thr

Val

Cys

165

170

175

Leu

Pro

Pro

Ala

Asp

Leu

Gin

Leu

Pro

Asp

Trp

Thr

Glu

Cys

Glu

Leu

180

185

190

Ser

Gly

Tyr

Gly

Lys

His

Glu

Ala

Leu

Ser

Pro

Phe

Tyr

Ser

Glu

Arg

195

200

205

Leu

Lys

Glu

Ala

His

Val

Arg

Leu

Tyr

Pro

Ser

Ser

Arg

Cys

Thr

Ser

210

215

220

Gin

His

Leu

Leu

Asn

Arg

Thr

Val

Thr

Asp

Asn

Met

Leu

Cys

Ala

Gly

225

230

235

240

Asp

Thr

Arg

Ser

Gly

Gly

Pro

Gin

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

cys

Gin

245

250

255

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

260

265

270

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

275

280

285

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Ile

Arg

Asp

290 295 300

Asn Met Arg Pro 305 <210> 18 <211> 268 <212> PRT ^<213^> sztuczna sekwencja

PL 206 783 B1 <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: K2S 260-527

<400> 18	Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg
Ser Cys 1	Ser	Thr
5	10	15
Ile Lys	Gly	Gly 20	Leu	Phe Ala Asp Ile Ala 25	Ser His Pro Trp Gin Ala 30
Ala Ile	Phe 35	Ala	Lys	His Arg Arg Ser Pro 40	Gly Glu Arg Phe Leu Cys 45
Gly Gly 50	Ile	Leu	Ile	Ser Ser Cys Trp Ile 55	Leu Ser Ala Ala His Cys 60
Phe Gin 65	Glu	Arg	Phe	Pro Pro His His Leu 70	Thr Val Ile Leu Gly Arg 75 80
Thr Tyr	Arg	Val	Val 85	Pro Gly Glu Glu Glu 90	Gin Lys Phe Glu Val Glu 95
Lys Tyr	Ile	Val 100	His	Lys Glu Phe Asp Asp 105	Asp Thr Tyr Asp Asn Asp 110
ile Ala	Leu 115	Leu	Gin	Leu Lys Ser Asp Ser 120	Ser Arg Cys Ala Gin Glu 125
Ser Ser 130	Val	Val	Arg	Thr Val Cys Leu Pro 135	Pro Ala Asp Leu Gin Leu 140
Pro Asp 145	Trp	Thr	Glu	Cys Glu Leu Ser Gly 150	Tyr Gly Lys His Glu Ala 155 160
Leu Ser	Pro	Phe	Tyr 165	Ser Glu Arg Leu Lys 170	Glu Ala His Val Arg Leu 175
Tyr Pro	Ser	Ser 180	Arg	Cys Thr Ser Gin His 185	Leu Leu Asn Arg Thr Val 190

PL 206 783 B1

Thr

Asp Asn 195

Met Leu Cys

Ala

Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin

200

205

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

210

215

220

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

225

230

235

240

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

245

250

255

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Ile

Arg

Asp

Asn

Met

Arg

Pro

260 265 <210> 19 <211> 527 <212> PRT

<213> Homo ;

sapiens

<400> 19

Ser

Tyr

Gin

Val

Ile

Cys

Arg

Asp

Glu

Lys

Thr

Gin

Met

Ile

Tyr

Gin

1

5

10

15

Gin

His

Gin

Ser

Trp

Leu

Arg

Pro

Val

Leu

Arg

Ser

Asn

Arg

Val

Glu

20

25

30

Tyr

Cys

Trp

Cys

Asn

Ser

Gly

Arg

Ala

Gin

Cys

His

Ser

Val

Pro

Val

35

40

45

Lys

Ser

Cys

Ser

Glu

Pro

Arg

Cys

Phe

Asn

Gly

Gly

Thr

Cys

Gin

Gin

50

55

60

Ala

Leu

Tyr

Phe

Ser

Asp

Phe

Val

Cys

Gin

Cys

Pro

Glu

Gly

Phe

Ala

65

70

75

80

Gly

Lys

Cys

Cys

Glu

Ile

Asp

Thr

Arg

Ala

Thr

Cys

Tyr

Glu

Asp

Gin

PL 206 783 B1

Thr

Asp Asn 195

Met Leu

Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly

Pro

Gin

200

205

Ala

Asn

Leu

His

Asp

Ala

Cys

Gin

Gly Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

210

215

220

Cys

Leu

Asn

Asp

Gly

Arg

Met

Thr

Leu

Val

Gly

Ile

Ile

Ser

Trp

Gly

225

230

235

240

Leu

Gly

Cys

Gly

Gin

Lys

Asp

Val

Pro

Gly

Val

Tyr

Thr

Lys

Val

Thr

245

250

255

Asn

Tyr

Leu

Asp

Trp

Ile

Arg

Asp

Asn

Met

Arg

Pro

260 265 <210> 19 <211> 527 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19

Ser 1

Tyr

Gin

Val

Ile 5

Cys

Arg

Asp

Glu

Lys 10

Thr

Gin

Met

Ile

Tyr 15

Gin

Gin

His

Gin

Ser 20

Trp

Leu

Arg

Pro

Val 25

Leu

Arg

Ser

Asn

Arg 30

Val

Glu

Tyr

Cys

Trp 35

Cys

Asn

Ser

Gly

Arg 40

Ala

Gin

Cys

His

Ser 45

Val

Pro

Val

Lys

Ser 50

Cys

Ser

Glu

Pro

Arg 55

Cys

Phe

Asn

Gly

Gly 60

Thr

Cys

Gin

Gin

Ala 65

Leu

Tyr

Phe

Ser

Asp 70

Phe

Val

Cys

Gin

Cys 75

Pro

Glu

Gly

Phe

Ala 80

Gly

Lys

Cys

Cys

Glu

Ile

Asp

Thr

Arg

Ala

Thr

Cys

Tyr

Glu

Asp

Gin

PL 206 783 B1

PL 206 783 B1

500 505 510

Lys Val Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 515 520 525 <210> 20 <211> 12 <212> DNA <9 1 J>

Sztuczna sekwencja <220 <223> Op^s sztucznej sekwencji: sekwencja kodująca SEGN <400> 20 tctgagggaa ac 12 <210> 21 <211> 22 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 21

Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala 15 10 15

Thr Val Ala Gin Ala Ala 20 <210 22 <211> 42 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter

PL 206 783 B1 <400> 22 gaggaggagg tggcccaggc ggcctctgag ggaaacagtg ac 42 <210> 23 <211> 42 <212> DNA <213> Sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 23 gaggaggagc tggccggcct ggcccggtcg catgttgtca cg 42 <210> 24 <211> 26 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: starter <400> 24 acatgcgacc gtgacaggcc ggccag 26 <210> 25 <211> 26 <212> DNA <213> sztuczna sekwencja <220>

<223> opis sztucznej sekwencji: starter <400> 25 ctggccggcc tgtcacggtc gcatgt 26

PL 206 783 B1

Claims (33)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania rekombinowanego tkankowego aktywatora plazminogenu (tPA), wariantu tPA, cząsteczki proteazy serynowej z domeną Kringle 2 (K2S) lub wariantu K2S, w komórkach prokariotycznych, przy czym rPa, wariant tPa, cząsteczka K2S lub wariant K2S wydzielane są pozakomórkowo jako aktywne i prawidłowo sfałdowane białka, znamienny tym, że komórka prokariotyczna zawiera i eksprymuje wektor, który zawiera DNA kodujący tPa, wariant tPa, cząsteczkę K2S lub wariant K2S połączony funkcjonalnie z DNA kodującym peptyd sygnałowy OmpA.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że komórka prokariotyczna zawiera i eksprymuje wektor, który zawiera DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S połączony funkcjonalnie z DNA kodującym peptyd sygnałowy OmpA, który jest połączony funkcjonalnie z cząsteczką kwasu nukleinowego określoną sekwencją TCTGAGGGAAACAGTGAC (SEQ ID NO:1) lub jej funkcjonalną pochodną.
3. 3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że komórką prokariotyczną jest E. coli.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przeprowadza się następujące etapy:

   a) amplifikuje się w reakcji PCR DNA kodujący tPa, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant

   K2S;

   b) oczyszcza się produkt PCR;

   c) wstawia się produkt PCR do wektora zawierającego DNAkodujący peptyd sygnałowy OmpA i DNA kodujący gpIII tak, że produkt PCR przyłącza się funkcjonalnie powyżej DNA kodującego sekwencję sygnałową OmpA i przyłącza się poniżej sekwencji DNA wektora kodującej gpIII;

   d) że wstawia się kodon stop pomiędzy tPa, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S a gpIII;

   e) poddaje się ekspresji wektor w komórce prokariotycznej;

   f) oczyszcza się tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że wektorem jest wektor fagmidowy zawierający DNA kodujący białko sygnałowe OmpA i DNA kodujący gpIII.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że wektorem jest fagmid pComb3HSS.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA OmpA przyłączona powyżej K2S obejmuje następującą sekwencję lub wariant wynikający z degeneracji kodu nukleotydowego:

   PL 206 783 B1 atgaaaaagacagctatcgcgattgcagtggcactggctggtttcgctaccgtggcccagg

   CGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

   CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

   GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCC

   GGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTG

   GGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG

   TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT

   TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTC

   CTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

   GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCG

   AAAAATAGATATGAAAAAGACAGGTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACC

   GTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACC

   GTGGCACGCACAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCT

   GATAGGCAAGGTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACAT

   AATTACTGCCGGAATCCTGATGGGGATGCCAAGGCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCA

   GGCTGACGTGGGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAG

   CCAGCCTCAGTTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAG

   GCTGCCATCTTTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATAC

   TCATCAGCTCCTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCA

   CCACCTGACGGTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAA

   TTTGAAGTCGAAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACA

   TTGCGCTGCTGCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCG

   CACTGTGTGCCTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCC

   GGCTACGGCAAGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATG

   TCAGACTGTACCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGA

   CAACATGCTGTGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCC

   TGCCAGGGCGATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGG

   GCATCATCAGCTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGT

   TACCAACTACCTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG (SEQ ID NO:2).

   PL 206 783 B1
8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA OmpA obejmuje następującą sekwencję:

   ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC (SEQ ID NO:3).
9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja DNA OmpA składa się z następującej sekwencji:

   ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGGCGGCC (SEQ ID NO:3).
10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że przed regionem kodującym tPA, wariantu tPA, cząsteczki K2S lub wariantu K2S obecny jest promotor lac i/lub miejsce wiązania rybosomu.
11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że DNA kodujący tPA, wariant tPA, cząsteczkę K2S lub wariant K2S jest wybrany z grupy cząsteczek DNA kodujących co najmniej 90% aminokwasów 87 527, 174 - 527, 180 - 527 lub 220 - 527 ludzkiego białka tkankowego aktywatora plazminogenu.
12. 12. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja DNA K2S obejmuje następującą sekwencję lub jej wariant funkcjonalny lub wariant funkcjonalny lub wariant wynikający z degeneracji kodu nukleotydowego:

    TCTGAGGGAAACAGTTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGC

    CTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTT

    ACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAA

    TCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAG

    TACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTC

    GCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGC

    CAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGC

    YGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGA

    TCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAA

    ATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAG

    CTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTC

    CCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCA

    TGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACTCA

    TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTG

    CTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTC

    GGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGG

    GGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAG

    ACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:4).
13. 13. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że sekwencja DNA K2S składa się z następującej sekwencji:

    PL 206 783 B1

    TCTGAGGGAAACAGTTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGC

    CTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTT

    ACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAA

    TCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAG

    TACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTC

    GCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGC

    CAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGC

    YGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGA

    TCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAA

    ATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAG

    CTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTC

    CCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCA

    TGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACTCA

    TCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTG

    CTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTC

    GGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGG

    GGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAG

    ACTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:4).
14. 14. Cząsteczka DNA, znamienna tym, że koduje:

    a) białko OmpA i jest funkcjonalnie połączone z

    b) cząsteczką DNA kodującą polipeptyd zawierający domenę Kringle 2 i domenę proteazy serynowej białka tkankowego aktywatora plazminogenu.
15. 15. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA obejmuje następującą sekwencję lub wariant wynikający z degeneracji kodu nukleotydowego:

    PL 206 783 B1

    ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGG

    CGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

    CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

    GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCC

    GGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTG

    GGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG

    TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT

    TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTC

    CTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

    GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCG

    AAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCT

    GCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGC

    CTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCA

    AGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTA

    CCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG

    TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCG

    ATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAG

    CTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTAC

    CTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQ ID NO:5).
16. 16. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA składa się z następującej sekwencji:

    PL 206 783 B1

    ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTGGCCCAGG

    CGGCCTCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCA

    CAGCCTCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAG

    GTTTACACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCC

    GGAATCCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTG

    GGAGTACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAG

    TTTCGCATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCT

    TTGCCAAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTC

    CTGCTGGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACG

    GTGATCTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCG

    AAAAATACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCT

    GCAGCTGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGC

    CTTCCCCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCA

    AGCATGAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTA

    CCCATCCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTG

    TGTGCTGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCG

    ATTCGGGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAG

    CTGGGGCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTAC

    CTAGACTGGATTCGTGACAACATGCGACCG(SEQ ID NO:5).
17. 17. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 87 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.
18. 18. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 174 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.
19. 19. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 180 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.
20. 20. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA b) koduje co najmniej 90% aminokwasów 220 - 527 białka ludzkiego tkankowego aktywatora plazminogenu.
21. 21. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA b) hybrydyzuje w ostrych warunkach do następującej sekwencji:

    PL 206 783 B1

    TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCC

    TCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTA

    CACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAAT

    CCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGT

    ACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCG

    CATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCC

    AAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCT

    GGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGAT

    CTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAT

    ACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGCT

    GAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCCC

    CGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCATGA

    GGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCATCC

    AGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGCTG

    GAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCGGG

    AGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGGGC

    CTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGACT

    GGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:7).
22. 22. Cząsteczka DNA według zastrz. 14, znamienna tym, że sekwencja DNA b) składa się z następującej sekwencji:

    PL 206 783 B1

    TCTGAGGGAAACAGTGACTGCTACTTTGGGAATGGGTCAGCCTACCGTGGCACGCACAGCC

    TCACCGAGTCGGGTGCCTCCTGCCTCCCGTGGAATTCCATGATCCTGATAGGCAAGGTTTA

    CACAGCACAGAACCCCAGTGCCCAGGCACTGGGCCTGGGCAAACATAATTACTGCCGGAAT

    CCTGATGGGGATGCCAAGCCCTGGTGCCACGTGCTGAAGAACCGCAGGCTGACGTGGGAGT

    ACTGTGATGTGCCCTCCTGCTCCACCTGCGGCCTGAGACAGTACAGCCAGCCTCAGTTTCG

    CATCAAAGGAGGGCTCTTCGCCGACATCGCCTCCCACCCCTGGCAGGCTGCCATCTTTGCC

    AAGCACAGGAGGTCGCCCGGAGAGCGGTTCCTGTGCGGGGGCATACTCATCAGCTCCTGCT

    GGATTCTCTCTGCCGCCCACTGCTTCCAGGAGAGGTTTCCGCCCCACCACCTGACGGTGAT

    CTTGGGCAGAACATACCGGGTGGTCCCTGGCGAGGAGGAGCAGAAATTTGAAGTCGAAAAA

    TACATTGTCCATAAGGAATTCGATGATGACACTTACGACAATGACATTGCGCTGCTGCAGC

    TGAAATCGGATTCGTCCCGCTGTGCCCAGGAGAGCAGCGTGGTCCGCACTGTGTGCCTTCC

    CCCGGCGGACCTGCAGCTGCCGGACTGGACGGAGTGTGAGCTCTCCGGCTACGGCAAGCAT

    GAGGCCTTGTCTCCTTTCTATTCGGAGCGGCTGAAGGAGGCTCATGTCAGACTGTACCCAT

    CCAGCCGCTGCACATCACAACATTTACTTAACAGAACAGTCACCGACAACATGCTGTGTGC

    TGGAGACACTCGGAGCGGCGGGCCCCAGGCAAACTTGCACGACGCCTGCCAGGGCGATTCG

    GGAGGCCCCCTGGTGTGTCTGAACGATGGCCGCATGACTTTGGTGGGCATCATCAGCTGGG

    GCCTGGGCTGTGGACAGAAGGATGTCCCGGGTGTGTACACAAAGGTTACCAACTACCTAGA

    CTGGATTCGTGACAACATGCGACCGTGA (SEQ ID NO:7).
23. 23. Białko fuzyjne OmpA i K2S, znamienne tym, że zawiera białko, które charakteryzuje sekwencja aminokwasów:

    MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNCMILIGK

    VYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPU

    FRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLT

    VILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDLALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVC

    LPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNML

    CAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNY

    LDWIRDNNRPG (SEQ ID NO:8).

    PL 206 783 B1
24. 24. Białko K2S, które charakteryzuje następująca sekwencja aminokwasów:

    MKKTAIAIAVALAGFATVAQAASEGNSDCYFGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNCMILIGK

    VYTAQNPSAQALGLGKHNYCRNPDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPU

    FRIKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLT

    VILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDLALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVC

    LPPADLQLPDWTECELSGYGKHEALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNML

    CAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNY

    LDWIRDNNRPG (SEQ ID NO:8).
25. 25. Białko K2S, które charakteryzuje następująca sekwencja aminokwasów:

    SEGNSDCYVGNGSAYRGTHSLTESGASCLPWNSMILIGKVYTAQNPSAQALGLGKHNYCRN PDGDAKPWCHVLKNRRLTWEYCDVPSCSTCGLRQYSQPQFRIKGGLFADIASHPWQAAIFA KHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEK YIVHKEFDDDTYDNDIALLOLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKH EALSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDS GGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP* (SEQ ID NO:11).
26. 26. Wektor, znamienny tym, że zawiera sekwencję DNA określoną w zastrz. 14 do 22.
27. 27. Wektor kodujący sekwencję DNA określoną w zastrz. 14 do 22, znamienny tym, że promotor lac i miejsce wiązania rybosomu znajduje się przed sekwencją DNA.
28. 28. Wektor pComb3HSS zawierający DNA określony w zastrz. 14 do 22, znamienny tym, że ekspresja białka gpIII jest wyciszona lub zahamowana na skutek delecji cząsteczki DNA kodującej białko gpIII lub przez kodon stop znajdujący się pomiędzy genem kodującym polipeptyd, zawierający domenę kringle 2 i domenę proteazy serynowej białka tkankowego aktywatora plazminogenu a genem białka gpIII.
29. 29. Komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 14 do 22.
30. 30. Komórka prokariotycznego gospodarza zawierająca wektor zawierający sekwencję DNA określoną w zastrz. 14 do 22.
31. 31. Komórka E. coli zawierająca cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 14 do 22.
32. 32. Komórka E. coli zawierająca wektor zawierający sekwencje DNA określoną w zastrz. 14 do 22.
33. 33. Zastosowanie cząsteczki DNA określonej według któregokolwiek z zastrz. 14 do 22 lub wektora określonego według dowolnego z zastrz. 26 do 28 lub komórki gospodarza określonej według dowolnego z zastrz. 29 do 32 w sposobie wytwarzania polipeptydu o aktywności tkankowego aktywatora plazminogenu.

    PL 206 783 B1

    Rysunki

    Fig. 2

    PL 206 783 B1 pComb3H-K2S

    4319 bp

    Operon Lac

    TGTACGCTGGCACTGTCCGGCCGGTC masTPA

    GACAACATGCGACCGGGCCAGGCCGGCCAGGAGGGTGGT

    K2S gen gplll gen

    AA

    CACTGTTGTACGCTGGCCCGGTCCGGCCGGTCCTCCCACCA

    ACATGCGACCGTGACAGGCCGGCCAG

    MSTPA

    Fig. 4

    RBS operon Lac RBS Omp A K2S gp ni Amp R

    2316-2513 2514-2533 2534-2599 2600-3664 3665-4219 515- 1394

    Fig. 3

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1 ας

    PL 206 783 B1

    PL 206 783 B1

    y.ojj c

    448

    PL 206 783 B1 att