DK2622073T5 - Fremgangsmåde til fremstilling af et beriget bibliotek - Google Patents

Claims (13)

1: En fremgangsmåde til fremstilling af et beriget bibliotek omfattende specifik nukleinsyre sekvensinformation, der tillader at identificere mindst en bindingsenhed, der binder til mindst ét mål, hvor den specifikke bindingsenhed har været til stede i et in vitro display- bibliotek, og hvor fremgangsmåden omfatter trinene: (i) : fremstilling af et in vitro display-bibliotek med mindst 100 forskellige bindingsenheder Bn, hvor n = 100 eller mere, hvor hver bindingsenhed er fæstnet til et nukleinsyremolekyle, og nukleinsyremolekylet omfatter specifik nukleinsyresekvensinformation, der gør det muligt at identificere bindingsenheden - hvorved når man kender nukleinsyremolekylets specifikke nukleinsyresekvensinformation, kender man direkte strukturen af den specifikke bindingsenhed, der er fæstnet til nukleinsyremolekylet, hvor strukturen af bindingsenheden fæstnet til nukleinsyremolekylet heri betegnes B-struktur; (ii) : fremstilling af nukleinsyremolekyler med mindst et mål Tn, hvor n = 1 eller mere, fæstnet til et nukleinsyremolekyle, og hvor nukleinsyremolekylet omfatter specifik nukleinsyresekvensinformation, der tillader at identificere det specifikke mål, hvor målet er i stand til at binde til mindst en af bindingsenhederne til stede i biblioteket i trin (i) - strukturen af målet fæstnet til nukleinsyremolekylet heri betegnes T-struktur; og (iii) : blanding afen opløsning omfattende X, hvor X er et tal større end 104, antal B-strukturer i biblioteket i trin (i) med en opløsning omfattende Y, hvor Y er et tal større end 102, antal T-strukturer i trin (ii) under bindingsbetingelser, der er betingelser, hvor en B-struktur indeholdende en bindingsenhed, der er i stand til at binde til et målmolekyle, binder mere effektivt til den tilsvarende T-struktur end en B-struktur indeholdende en bindingsenhed, der ikke er i stand til at binde til det samme mål gør, og hvor man opnår binding af mindst en af bindingsenhederne til mindst et mål og hvorved skabes et kompleks omfattende en B-struktur bundet til en T-struktur, heri betegnet BBoundToT-struktur; (iv) : anvendelse af et in vitro opdelingssystem - under bindingsbetingelser, der er betingelser, hvor en B-struktur indeholdende en bindingsenhed, der er i stand til at binde til et målmolekyle, binder mere effektivt til den tilsvarende T-struktur end en B-struktur indeholdende en bindingsenhed, der ikke er i stand til at binde til det samme mål gør - hvor opdelingssystemet omfatter mindst 2 gange flere individuelle rum end Y-antallet af T-strukturer, til stede i trin (iii) under betingelser, hvor B-strukturerne, T-strukturerne og BBoundToT-strukturerne indtræder tilfældigt i de enkelte rum; og (v) : fusion af nukleinsyremolekylerne af en B-struktur og en T-struktur, der begge er tilstede indenfor det samme individuelle rum - hvilket er fusion af nukleinsyremolekylet af B-strukturen til nukleinsyremolekylet af T- struktur - denne struktur er heri betegnet BTFused-struktur, og BTFuSed-strukturen omfatter den specifikke nukleinsyresekvensinformation, der tillader at identificere bindingsenheden fra trin (i) og den specifikke nukleinsyresekvensinformation, der tillader at identificere det specifikke mål i trin (ii); og (vi) : kombination af indholdet af de enkelte rum i trin (v) under betingelser, hvor der ikke er fusion af nukleinsyremolekylerne af en B-struktur og en T-struktur -hvorved der ikke dannes nogen ny BTFused-struktur der ikke allerede er dannet i trin (v) - for at få et bibliotek af BTFused-strukturer, hvor biblioteket er et beriget bibliotek af arter af BTFused-strukturer stammende fra bindende par af mål og bindingsenheder i sammenligning med BTFused-strukturer stammende fra ikke-bindende par af mål og bindingsenheder; og hvor BsoundToT-strukturerne forbliver suspenderet i opløsning i de enkelte rum i trin (iv); og/eller hvor fremgangsmåden ikke er afhængig afmålimmobilisering på en fast bærer; og hvor BTFuSed-strukturerne, der er til stede i det berigede bibliotek i trin (vi) intensiveres.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor bindingsenheden i trin (i) er fæstnet til nukleinsyremolekylet ved f.eks. en kovalent binding, og hvor målet i trin (ii) er fæstnet til nukleinsyremolekylet ved en kovalent binding, og hvor nukleinsyremolekylet i B-strukturen er DNA, og nukleinsyremolekylet i T-strukturen er DNA.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, hvor DNA nukleinsyremolekylet i B-strukturen er et dobbeltstrenget nukleinsyremolekyle, og hvor DNA nukleinsyremolekylet i T-strukturen er et dobbeltstrenget nukleinsyre molekyle.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor nukleinsyremolekylet fæstnet til bindingsenheden i B-strukturen indeholder et PCR initieringssted og hvor nukleinsyremolekylet fæstnet til målet i T-strukturen indeholder et PCR initieringssted.

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor in vitro biblioteket i trin (i) omfatter mindst 105 forskellige bindingsenheder Bn, hvor η = 105 eller mere, og hvor bindingsenhederne i trin (i) er kemiske forbindelser med en gennemsnitlig molekylevægt MW under 5000 dalton.

6: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor der er mindst to forskellige mål Tn i trin (ii), hvor n = 2 eller mere.

7: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor mindst ét mål er et protein.

8: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor der i trin (iii) er mindst 105 kopier afen T-struktur af interesse - hvor Ύ" er mindst 105, og hvor koncentrationen af T-strukturer i "blandetrin (iii)" er mindst 10'9 M.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor trin (iii) udføres under bindingsbetingelser, hvor en B-struktur indeholdende en bindingsenhed, der er i stand til at binde til et målmolekyle, binder 100 gange mere effektivt til den tilsvarende T-struktur end en B-struktur indeholdende en bindingsenhed, der ikke er i stand til binde til det samme mål gør.

10: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor fremgangsmåden ifølge krav 1 omfatter et yderligere trin (iii-b), der udføres før trin (iv) ifølge krav 1, der omfatter: (iii-b): fortynding af opløsningen i trin (iii) mindst 100 gange under bindingsbetingelser, der er betingelser, hvor en B-struktur indeholdende en bindingsenhed i stand til at binde til et målmolekyle binder mere effektivt til den tilsvarende T-struktur end en B-struktur indeholdende en bindingsenhed der ikke i stand til at binde til det samme mål gør.

11: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor der i trin (iv) ifølge krav 1 er mindst 100 gange flere individuelle rum end Y-antallet af T-strukturer til stede i trin (iii), og hvor der i trin (iv) ifølge krav 1 er mindst kvadratroden af 10 (3,16) gange flere individuelle rum end X-antallet af B-strukturer i trin (iii).

12: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor in vitro fordelingssystemet i trin (iv) er et vand-i-olie emulsionssystem, og hvor det gennemsnitlige volumen af et rum er mindre end 10'12 liter.

13: Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor der er et ekstra trin (vii), omfattende anvendelse af det berigede bibliotek i trin (vi) til at identificere mindst en individuel bindingsenhed, der binder til mindst et mål af interesse.