DK175715B1

DK175715B1 - Vaccine til beskyttelse af katte mod infektiös katteperitonitis

Info

Publication number: DK175715B1
Application number: DK198805406A
Authority: DK
Inventors: Jay Dean Gerber; Jerald Dee Ingersoll
Original assignee: Pfizer
Priority date: 1987-10-01
Filing date: 1988-09-28
Publication date: 2005-01-31
Also published as: JPH01113321A; FI884521A; ES2063048T3; NZ226353A; FI94488B; HUT47867A; IL87911A0; NO884340L; DK540688D0; NO884340D0; PT88592B; ATE103496T1; FI884521A0; KR890006255A; DE3888775T2; NO177555C; DK540688A; EP0310362B1; DE3888775D1; PT88592A

Description

i DK 175715 B1

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine, som er anvendelig til immunisering af katte over for den infektiøse katteper itonitisvirus (FlP-virus). I særdeleshed angår den en svækket, temperaturfølsom vaccine, som effektivt 5 beskytter katte mod FIP.

Infektiøs katteperitonitis (FIP) er en sygdom, som rammer både huskatte og vilde katte. Virusen påvirker de fleste af dyrets indre organer og er næsten altid dødelig. Virusen er meget 10 smitsom og påvirker killinger såvel som voksne katte.

FIP-virusen blev identificeret som en coronavirus af Horzinek og Osterhaus, Arch. Virol. 59:1(1979). FIP-virus er beslægtet med overførbare gastroenteri tisvirus (TGEV) hos grise, ente-15 risk coronavirus hos hunde og en respiratorisk coronavirus hos mennesket. Oer findes også en enterisk kattecoronavirus (FECV), som hovedsagelig replikeres i tarmen og derfor kun forårsager en mild diarresygdom. Lutz et al., J. Small Animal Pract. 27:108 (1986).

20

Selv om det er kendt, at FIP forårsages af en coronavirus, forstås den måde, hvorpå infektionen overføres blandt katte, og dens pathogenese stadig meget dårligt. Sygdommens pathoge-nese er meget kompleks, og undersøgelser indikerer, at værts-25 faktorer, virale faktorer og omgivelsesfaktorer spiller en rolle i sygdommens form og. fremskriden. Pedersen et al., 34th Annual Symposium, Viral Diseases of Small Animals 7:1001 (1985).

30 FIP kan forekomme i to forskellige former: den våde eller effusive form, som er karakteriseret ved et fibrinøst, perito-nealt ekssudat, og den tørre eller parenkymatøse form, som er karakteriseret ved granulomatøs inflammation af forskellige organer og lidt eller intet ekssudat. Lutz et al., supra.

35

Da der er andre coronavirusinfektioner hos katte, f.eks. FECV, som er antigenbeslægtet med FIP-virus, har FIP's pathogenese været vanskelig at karakterisere. Som et resultat deraf har _ ____ ._:_

I DK 175715 B1 I

I I

serologiske tests til diagnose af sygdommen manglet speci- I

I ficitet og har forvirret fortolkningen af tidligere undersø- I

I gelser. Pederson, Feline Practice 13:13 (1983). Η I 5 Indtil for nylig har beskyttende aktiv, immunisering over for

I FIP ikke været mulig. Tværtimod har vaccinerede katte været I

I mere modtagelige for sygdom. Pedersen, et al., Am. J. Vet.

I Res. 44:229 (1983); Weiss et al., Comp. Immun. Microbiol. In- I

I fect. Dis. 4:175 (1981); Weiss et al., Am. J. Vet. Res. 41:663 I

I 10 (1980). I

I Katte inficeres ad oronasal vej. FIP-virus formeres i epitel- I

I celler i det øvre respiratoriske system og tarmen. Klinisk I

I påviselig FIP opstår, efter at virusen krydser siimhindebarri- I

H

I 15 eren og forårsager en immunformidlet sygdom. Lutz et al., I

I supra., Weiss et al., Am. J. Vet. Res. 42:382 (1981). I

H Stimulering af en næsesiimhindeimmunreaktion sker bedst ved I

H intranasal administration af en vaccine. Bienenstock et al., I

20 Immunology 41:249 (1980); Murray, The Veterinary Record 10. I

november:500 (1973). SIimhinde-B-lymfocytter, som er stimule- I

H rede til at udski11e ant i-FIP-vi rus-IgA-antistof, vil også I

vandretil tarms 1 i mhi nden og også give lokal tarmi mmuni tet. I

Murray, supra. I

I 25 I

En udførelsesform for opfindelsen er en FIP-vaccine til oral I

eller intranasal indgift, som er i stand til at fremkalde im- I

munitet over for infektion af FIP-virus hos katte uden alvor- I

lige bivirkninger. En sådan vaccine omfatter en effektiv mæng- ! I

I 30 de af en temperaturføl som (tf) FIP-virus. I

I en anden udførelsesform for opfindelsen beskrives en frem- I

gangsmåde til fremstilling af en vaccine mod FIP-virus, som I

er ejendommelig ved at man svækker FIP-virus ved et højt an- I

35 tal passager igennem modtagelige celler; udsætte svækket FIP- I

virus for et mutagent middel; dyrker svækket FIP-virus, som I

efter at være blevet udsat for det mutagene middel nu er tem- I

peraturfølsomt, og opsamler den svækkede tf-FIP-virus . I

3 DK 175715 B1 I endnu en anden udførelsesform for opfindelsen beskrives en fremgangsmåde til immunisering af katte over for FIP-virus, hvilken fremgangsmåde omfatter indgift ad oral eller intrana-sal vej af en svækket, temperaturfølsom FIP-virus.

5 I yderligere en udførelsesform for opfindelsen beskrives en FIP-virus, som er anvendelig til fremstillingen af en vaccine.

En sådan FIP-virus er svækket og temperaturfø1 som.

10 I nok en udførelsesform for opfindelsen beskrives en vaccine-dosisenhed til fremkaldelse af immunitet over for infektion af FIP-virus, som omfatter 0,5 til 1.5 ml af en væske, som er egnet til intranasal eller oral indgift til en kat, indeholdende 101 2 3 4 5 til 106 TCID50 af en temperaturfølsom FIP-virus.

15 I endnu en udførelsesform for opfindelsen beskrives en kombinationsvaccine til oral eller intranasal indgift, som er i stand til at fremkalde immunitet hos katte over for infektion af FIP-virus og en eller flere andre pathogene organismer el-20 ler vira uden alvorlige bivirkninger, hvilken kombinationsvaccine omfatter en effektiv mængde tf-FIP-virus og effektive mængder af et eller flere andre antigener, som beskytter mod infektion af andre pathogene organismer eller vira.

® En effektiv FIP-vaccine skal stimulere en stærk slimhindeim-munreaktion for at forhindre en infektion i at passere slim-hindebarr ieren og en celleformidlet immunreaktion (CMI-re-aktion), som omgående vil standse spredningen af virus, hvis den krydser slimhinden. Den temperaturføl somme FIP-virus 2 30 (tf-FIP-virus) ifølge opfindelsen kan indgives intranasalt eller. oralt. I den foretrukne udførelsesform for opfindelsen indgives tf-FIP-virus intranasalt. Når den gives intranasalt, 3 vil tf-FIP-virusen, på grund af dens evne til at vokse ved de temperaturer, som findes i næsesvælgområdet, let formeres og 4 35 stimulere en CMI-reaktion og lokal immunreaktion. Desuden sti 5 mulerer tf-FIP-virus en CMI-reaktion over for FIP-virus, efter provokation, som ikke påvises hos katte, som er blevet vac 6 cineret systemisk, eller hos katte, som er inficerede med virulent FIP-virus.

I DK 175715 B1 I

I 4 I

I Den FIP-virus, som anvendes til fremstillingen af vaccinen I

I ifølge opfindelsen, isoleres fra organer eller væv, fortrins* I

I vis leveren, fra dyr, som er inficerede med virusen. Organerne I

I eller vævene formales og gives oralt til forsøgsdyrene, for- fl

I 5 trinsvis til særlige pathogenfrie katte (SPF-katte). B

I Efter flere in vivo passager af inficerede organer, fortrins- B

I vis fem in vivo passager af inficerede milte eller levere, B

isoleres FIP-virusen. FIP-virusen isoleres fra de inficerede B

I 10 organer ved anvendelse af standardfremgangsmåder ifølge den I

I kendte teknik og dyrkes sammen med katteceller. FIP-virusen B

vokser let sammen med katteceller fra enhver kilde, f.eks. B

milt, mesenterisk lymfeknude, endotelcel1 er eller fostercel- I

lekulturer som beskrevet af Dav.is, US patentskrift nr. I

B 15 4.303.644, og Fishman et al., US patentskrift nr. 4.571.386. I B

den foretrukne udførelsesform for opfindelsen isoleres FIP- B

B virusen fra det syge vævs celler og dyrkes sammen med katteny- fl

B receller. B

B 20 Virusen, som er ekstraheret fra de syge væv, dyrkes sammen med B

B katteceller for at tilpasse virusen til in vitro formering. In B

B vitro formering påvises ved dannelse af mangekernede syncyti- B

I alceller sammen med andre kendte cytotiske virkninger ("cpe"), B

I som er typiske for coronavira. Virusen føre igennem, indtil B

25 den er blevet svækket, og muteres derefter for at blive gjort B

I temperaturfølsom. I den kendte teknik betyder "svækket" pr. B

I definition, at virusen er blevet mod ifi cieret på en sådan B

I måde, at den ikke længere er i stand til at forårsage sygdom. B

I Til sidst indgives den svækkede, temperaturfølsomme virus til B

B 30 katte ad enten oral eller intranasal vej. B

B I en foretrukken udførelsesform svækkes FIP-virusen ved et B

I stort antal passager, f.eks. mindst 60 passager, fortrinsvis B

I 95-100 passager, gennem kattenyreceller. For at udvikle en B

B 35 temperaturføl som FIP-virus udsættes en aliquot mængde dyrk- B

I ningsvæske ved et stort antal passager for et mutagent middel, B

I f.eks. kemisk eller stråling, fortrinsvis ultraviolet strå- B

I ling, indtil virustiter efter formering ved ca. 31*C er på B

5 DK 175715 B1 mindst 1 x 102 TCID50» fortrinsvis ca. l x 105 TCIO50» større end ved 39°C. (TCIO50 er den vævskulturinficerende dosis, som frembringer en cytotisk virkning i 50% af de dyrkede celler, som udsættes for virusen.) 5

For at opnå optimal viruslevedygtighed, opsamles de virale væsker hvert 5. minut og opbevares ved -70°C. Tifoldige seriefortyndinger (IOO til 10-7) af hver 5 minutters prøve afprøves for viruslevedygtighed på sammenflydende kattenyrecel1emono-10 lag. Den optimale prøve, fortrinsvis 5 minutters prøven, ud vælges og opformeres ved 31eC ved forskellige fortyndinger. Virusvæsker fra brønde indeholdende enkelte plakker opsamles.

Tabel 1 viser virkningen af ultraviolet stråling på en viru-15 lent stamme af FIP-virus (DF2-FIP-virus) ved 3l°C. FIP-virus var fuldstændig inaktiveret efter at være blevet udsat for ultraviolet lys i 10 minutter.

Tabel 1 20

Virkning af UV-strålingstid på virustiteren Antal virusinficerede brønde/fortynding TCID50 2 5 Prøve_10° 1Q~1 10~2 iq-3 iq~4 iq-5 iq-6 10-7 titer før-UV 4/43 4/4 4/4 . 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 »106'57 5 min. 4/4 3/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 101»33 10 min. 0/4 0/4 0/4 0/4 0 15 min. 0/4 0/4 0/4 0/4 0 3 0 _____ a Antal FIPV-i nficerede brønde/samlede antal brønde.

FIP-virusvæsker, som ved en 1:16 fortynding blev udsat for ul-35 trav i olet stråling i 5 minutter, indeholdt virale plakker. Der opformeres enke 1tp1 akker i et flertal af brøndene.

Individuelle enke 1tp1 akker titreres i tifoldige fortyndinger (!°-3 til 10-8) -j 24 brøndsplader ved 31eC, 37eC og 39eC (ta-

DK 175715 B1 I

I I

bel 2). I

I Tabel 2 I

5 Titrering af UV-bestrålede virale plakker ved I

I 31 * C, 3 7 * C og 39 9 C I

Antal virusinficerede brønde/fortynding I

Plak Temperatur TCID50- I

I 10 £LLj__LQ~3 10~4 10~5 1Q~6 iq-7 iq-8 titer I

I 1 31 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 7,00 I

37 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 0/4 6,50 I

39 4/4 4/4 4/4 ' 2/4 1/4 0/4 6,23 I

15 2 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 7,50 I

I 37 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 7,33 I

33 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 6,00 I

I 3 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 7,67 , I

20 37 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 1/4 6,88 I

I 39 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4 6,33 I

I 4 31 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 0/4 7,50 I

I 37 4/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 6,50 I

25 _39_0/4a 0/4^ 0/4 0/4 0/4 0/4 $3.50 I

a Fire brønde udviste ardannelse eller indikation af, at tid- I

I lig infektion var lægt. : I

I 30 b Tre brønde udviste ardannelse eller indikation af at tidlig I

I infektion var lægt. I 1

De optimale betingelser for opformering af virusen er baseret I

I på dens evne til at blive opformeret ved tilladelige tempera- I

I 35 turer. Ved 39eC er TCID50 mindst ca. 1 x 102 enheder lavere I

I end TCID50 ved 31®C og er fortrinsvis mindst ca. 1 x 105 en- I

I heder lavere. I

7 DK 175715 B1

Tabel 3

En sammenligning af virusopformering for 5 in vitro passager af en temperaturfølsom plakisoleret FIP-virus ved 3l*c og 39®C 5

Antal virusinficerede brønde/fortynding Pas- Tempe- TCID50 sage ratur 10~1 10~2 iq-3 iq-4 10-5 iq-6 iq-7 10-B titer 1 31® 4/4a */4 4/4 4/4 4/4 3/4 0/4 0/4 6,33 10 39® 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1,50 2 31* 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 5,67 39® 4/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 1,50 15 3 31® 4/4 4/4 4/4 4/4 3/4 1/4 0/4 0/4 5,50 39® 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 <1.50 4 31® 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 1/4 0/4 0/4 5,67 39® 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 <1,50 20 5 31® 4/4 4/4 4/4 4/4 4/4 2/4 0/4 0/4 6,00 _39* 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 0/4 <1,50 a Antal FIP-virusinficerede brønde/samlede antal brønde.

25

Oen svækkede, temperaturfølsomme FIP-virus ifølge den foreliggende opfindelse kan indgives til katte for at beskytte dyrene mod FIP-virus. Oer vælges en uskadelig dosis, dvs. en, som ikke forårsager alvorlige bivirkninger og som er effektiv, dvs.

30 som inducerer en beskyttende cellulær reaktion og lokal immunreaktion efter indgift.

FIP-vaccinen kan indgives intranasalt eller oralt. Den foretrukne indgiftsmåde er intranasal, idet en typisk dosis er 102 35 til 107 TCIO50 i et volumen på 0,5 til 1,5 ml.

Oosen kan indgives som en enkeltdosis eller som flere fortyndede doser over et tidsrum. En enkeltdosis på 105«5 TCID50 vi-

I DK 175715 B1 I

I 8 I

H rus i 0/5 ni bærer foretrækkes med indgift af halvdelaf 0,5 ml I

H (0,25 ml) med f.eks. spray eller sammenpresningsf1 aske eller I

ved dråber i hvert af dyrets næsebor. Eksperimentelle resul- I

tater viser, at en effektiv vaccineringsdosis kan indgives som I

5 en enkeltdosis, idet der dog foretrækkes to doser. I

FIP-vaccinen kan indgives direkte, dvs. at virusen dyrkes i I

celledyrkningsvæske, og at dyrkningsvæsken derefter anvendes I

H som bærer for indgiften. Dyrkningsvæsken kan fortyndes eller I

10 opkoncentreres ved standardmetoder til opnåelse af den ønske- I

de koncentration af svækket tf-FIP-virus. Alternativt kan I

opnås et farmaceutisk acceptabelt middel med tf-FIP-virus ved I

at ekstrahere den svækkede, temperåturføl somme virus fra cel- I

lekulturen ved f.eks. saccharosedensi tetscentrifuger ingsad- I

15 ski 1 lel sesteknikker og sammenblanding med en egnet bærer, I

f.eks. vand, saltvand, choleratoxoid eller ovalbumin, eller I

med et hjælpestof, f.eks. "Quil" A, alhydrogel, eller en olie- I

emulsion. I

I 20 I den foretrukne udførelsesform indgives virusen i dyrknings- I

væsken, og der fremstilles aliquote mængder af enkeltdosis- I

I mængder. Den avirulente tf-FIP-virus kan også lyofiliseres i I

H enkeltdosismængder og lagres indtil anvendelse. Når vaccinen I

I lagres som et lyofiliseret pulver, rekonstitueres den før ind- I

I 25 gift i vand, saltvand, dyrkningsvæske eller andre hensigtsmæs- I

sige bærere, som er egnede til direkte intranasal indgift til I

I katte. I

I Målinger af antistofreaktion bestemmes ved anvendelse af stan- I

30 dardmetoder, såsom enzymbundet immunosorbentanalyse (ELISA) I

I og en serumvi rusneutral isationstest (VN-test), og udføres på I

I blodprøver fra individuelle dyr. Målinger foretages optimalt I

I på prøver efter vaccination og provokation. Lymfocytbi astoge- I

I nesefremgangsmåden som beskrevet af Pedersen et al.. The Com- I

I 35 pendium on Continuing Education 7:1001 (1985) anvendes til at I

vise en celleformidlet (lymfocyt)reaktion efter vaccination og I

I provokation. I

DK 175715 B1 I

Et yderligere formål med denne opfindelse er fremstillingen og I

anvendelsen af kombinationsvacciner, som består af vaccine- mængder af tf-FIP-virusen og en eller flere kendte kattevira.

F.eks. kan kombinationsvacciner fremstillet til oral eller H

5 intranasal indgift og indeholde tf-FIP-viruskomponenten og en H

eller flere kattevira, som vides at forårsage respiratoriske I

infektioner, f.eks. calicivirus, katteherpes (rhinotrachei- I

tis)-vi rus.

10 Andre kombinationsvacciner, som er i stand til at fremkalde I

immunitet hos katte over for infektion af FIP-virus og en

eller flere andre pathogene organismer eller vira, kan også I

fremstilles ved anvendelse af tf-FIP-viruskomponenten og andre I

ikke-respiratorisk beslægtede viruskomponenter eller pathoge- I

15 ne organismer, f.eks. kattesyge (panleukopenia) , chlamydia, I

katteleukæmi. I

Underenhedsvacciner kan også fremstilles. Tf-FIP-virusen kan I

kombineres med underenheder af aflivede eller svækkede patho- I

20 gener, f.eks. underenhedskomponenter af kattesygevirus, cali civirus, katteherpesvi rus eller 1ignende, til parenteral eller intranasal indgift. Tf-FIP-virusen kan også kombineres med katteleukæmi vi rusvaccine til parenteral indgift.

25 Fremstillingen og anvendelsen af sådanne kombinationsvacciner udføres i overensstemmelse med de beskrevne fremgangsmåder eller som det er kendt for fagmanden ved vaccinefremstilling og anvendelse.

30 Eksempler I De følgende eksempler er illustrative og begrænser ikke opfin delsen .

DK 175715 B1

Eksempel 1; Effektivitetsundersøgelse 1 I

14 SPF hankatte (26 måneder gamle) fra Liberty Labs (Liberty, I

New Jersey) blev anvendt til den første vaccinations-provoka- I

5 tionsundersøgelse. Vaccinerede katte blev holdt i ét isoleret I

rum og ikke-vaccinerede katte i et andet. I

10 katte blev vaccinerede 3 gange intranasalt (IN) med 3 ugers I

H mellemrum med tf-FIP-virus. 5 katte blev vaccinerede med tf- I

10 FIP-vi rus med en vi rusti ter på 10®»5 TCIDsg/ml ved 31eC og 5 I

H med en virustiter på 102'5 TCIOso/ml ved 31°C. De 10 vaccine- I

H rede dyr og 4 kontroldyr blev provokeret oralt med 1 ml 1:600 I

H fortynding af virulent FIP-virus (FIP-virus-DF2, passage 10, I

provokationstiter = 102»68 TciDsø/ml) 2 uger senere. I

I 15

Oen serologiske Igl-reaktion på FIP-virus blev bestemt ved I

ELISA, Osterhaus et al., Veterinary Quaterly 1:59 (1979). VN- I

titerne (Pedersen et al., Am. J. Vet. Res. 44:229 (1983)) blev I

også bestemt. I

I 20

De tf-FIP-virusvaccinerede dyrs IgG-ELISA-titere er vist i I

tabel 4. Vaccinerede kattes prævaccinat ionst itere blev målt I

den dag, de blev fjernet fra isolationsburene. Kontrolkattene I

fik foretaget prævaccinations-ELISA-titere 15 dage efter fjer- I

B 25 nel se fra isolationsburene. Kontrol kattenes IgG-reakt ion over I

for FIP-virus skyldes antistoffer til krydsreagerende enterisk I

kattecoronavirus (FECV), som er endemisk i SPF-kattekolonien, I

B som anvendes til eksperimenterne. Som et resultat deraf er de I

B vaccinerede kattes IgG-reaktion forårsaget af FECV såvel som I

B 30 vaccinevirusen. I

Virusneutraliserende titere, som i modsætning til IgG-ELISA- I

I titere var negative forud for vaccination (tabel 5), forøge- des efter hver vaccination. Serum blev ikke indsamlet efter 35 . provokation til anti stofti trer ing. At udsætte vaccinerede kat- te og kontrolkatte for FECV på forhånd havde lille eller ingen effektpå provokat i onen, idet begge grupper havde udviklet en

I reagerende antistof reaktion på FIP-virus. 3 ud af 4 ikke-vac- I

11 DK 175715 B1 cinerede kontrolkatte udviklede FIP og døde. Den fjerde kat, LK2, havde et klinisk resultat på 13 (jo større taljo mere alvorlige symptomer, idet død giver resultatet 50), hvilket var 3 gange så højt som enhver af de 9 beskyttede, vaccinerede 5 katte.

Eksempel 2: Effektivi tetsundersøge 1 se 2 12 coronavirusnegative SPF-hankatte (12 måneder gamle) fra Li-10 berty Labs blev anvendt i en anden vaccinations-provokations undersøgelse. Alle kattene blev anbragt i isolationsbure (3 katte pr. bur).

6 katte blev vaccinerede 3 gange IN med 3 ugers mellemrum med i 15 tf-FIP-virus. 3 katte blev vaccineret 2 gange IN med tf-FIP-virus og 1 gang oralt. Tf-FIP-virustiteren var 105·5 TCID50/ ml. Oe 3 ikke-vaccinerede kontrolkatte blev holdt i et bur, som var adskilt fra de vaccinerede katte.

20 Oe 9 vaccinerede katte og de 3 kontrolkatte blev provokeret oralt med 1 ml 1:600 fortynding af virulent FIP-virus (FIP-vi-rus-DF2, passage 10, provokationstiter = 102'*·5 TCIDso/ml).

Serum-IgG-ant i-FIP-vi rusantistofreakt ionen hos tf-FIP-virus-25 vaccinerede katte og ikke-vaccinerede katte ifølge ELISA er vist i tabel 6. Den største forøgelse i IgG-antistofti ter blev noteret efter den første og anden vaccination. Der skete ikke nogen forøgelse i titer hos de katte, som var blevet vaccineret IN en tredje gang, hvilket bekræfter at en eller højst to 30 doser var tilstrækkeligt til at udløse beskyttelse. IgG-anti-stoftitere forøgedes brat efter provokation. De virusneutraliserende antistoft itere forøgedes efter hver af de 3 vaccinationer og provokationer (tabel 7).

35 2 af 3 ikke-vaccinerede kontrolkatte udviklede FIP og døde.

Alle de vaccinerede katte overlevede. 2 vaccinerede katte, SN1 og SYl, havde midlertidig bloddyskrasi, hovedsagelig Doehle-legemer, lavt pakket cellevolumen og forhøjet kropstemperatur.

DK 175715 B1 I

I I

De viste imidlertid ikke nogen tegn på gulsot« hvilket ellers I

er en god indikator for nært forestående død. I

H Eksempel 3: Effektivitetsundersøqelse 3 I

H 5 I

H 18 coronavirusnegative SPF-hankatte (12 måneder gamle) fra I

H Liberty Labs blev anvendt. Alle kattene blev anbragt i isola- I

H tionsbure (2 katte pr. bur). I

10 6 katte blev vaccinerede 2 gange IN med 3 ugers mellemrum med I

H tf-FIP-virus. 6 katte blev vaccinerede 1 gang IN. Tf-FIP-vi- I

H rustiteren var 105'5 TCIDso/ml. Yderligere 6 katte blev vacci- I

neret subkutant (SC) med tf-FIP-virus med "Concanavalin" A I

(Con A) som hjælpestof og holdt i bure, som var adskilt fra de I

15 IN vaccinerede dyr. S ikke-vaccinerede kontrolkatte blev holdt I

i bure, som var adskilt fra de vaccinerede dyr. I

H De 12 vaccinerede dyr og de 6 kontroldyr blev provokeret oralt I

3 uger senere med 1 ml 1:600 fortynding af virulent FlP-virus I

I 20 (FIP-virus-DF2, passage 10, provokationstiter =102'®1tCID5q/ I

I I

Tabel 8 viser ELISA-IgG-titerne af IN og subkutant tf-FIP-vi- I

rusvaccinerede og ikke-vaccinerede dyr. Katte, som blev vac- I

25 cineret 2 gange IN og endda 1 gang IN, havde højere gennem- I

I snitlige titere end katte, som var vaccineret SC på provoka- I

I tionstidspunktet. Katte, som modtog 2 IN doser tf-FIP-virus- I

I vaccine, havde også højere VN-titere end katte, som modtog en I

enkelt IN dose før provokation (tabel 9). Selv én dosis tf- I

30 FIP-virus indgivet IN frembragte højere VN-titere end 2 doser I

givet SC. I

Perifere blodlymfocytter fra 5 ud af 6 katte, som var vacci- I

neret 2 gange IN, reagerede på FIP-virus i lymforcytblastoge- I

35 neseundersøgelsen før provokation. 3 katte, som var vaccineret I

1 gang IN, og kun 1 kat, som var vaccineret 2 gange subkutant, I

I viste en lignende reaktion. I

13 DK 175715 B1 2 af de 5 katte, der var blevet vaccineret IN med 2 doser, og som viste en lymforcytblastogenesereaktion før provokation, plus 1 kat, som var blevet vaccineret IN med 2 doser, og som ikke reagerede, viste en kraftig blastogenesereaktion efter 5 provokation. Kun lymfocytter fra en enkelt kat, som var vaccineret 1 gang IN, reagerede på FIP-virus efter provokation. Ingen af de katte, der var vaccineret to gange subkutant (SC), reagerede på FIP-virus efter provokation.

10 Alle 6 katte, som var vaccineret 2 gange IN, var effektivt beskyttede mod FIP-virusprovokation. 1 ud af de 6 katte (UX6), som var vaccineret 1 gang IN, udviste bloddyskrasi, som er indikativt for FIP, men overlevede. I modsætning dertil udviklede 2 ud af 4 ikke-vaccinerede katte og 5 ud af 6 katte, som j 15 var vaccineret subkutant, FIP og døde. 1 ud af 2 overlevende kontrolkatte (HI2) udviste bloddyskrasi, hvilket antydede FIP.

De fleste subkutant vaccinerede katte udviklede FIP hurtigere end ikke-vaccinerede katte.

20 Eksempel 4: Fremstilling af kombinationsvaccine

Der kan fremstilles en kombinationsvaccine bestående af tf-FIP-virus kombineret med calicivirus og katteherpesvirus (rhinotracheitis) til intranasal indgift. Kombinationsvaccinen 25 kan sammensættes som følger: 0,5 ml katteherpesvirus (TCID50 * 107'2) 0,50 ml calicivirus (TCiDso * 107 » ®) 0,5 ml tf-FIP-virus (TCID50 = 105'5) 30 0,8 ml stabilisator (NZ-amin, gelatine eller saccharose)

Kombinationsvaccinen kan lyofiliseres til forsendelse og lagring. Forud for anvendelse genhydreres kombinationsvaccinen til 1,0 ml i f.eks. vand, saltopløsning eller et andet for-35 tynd ingsmiddel, som er egnet til oral eller intranasal indgift.

I DK 175715 B1 I

I 14 I

H Eksempel 5: Fremstilling af en underenhedsvaccine I

H Den immunogene underenhed af tf-FIP-virus kan kombineres med I

hele virus eller underenhedskomponenter af kattesygevirus, I

5 calicivirus, katteherpesvirus, katteleukæmivi rus og chlamydia- I

vacciner og indgives parenteralt eller intranasalt. Underen- I

H hedskombinationsvaccinen af denne type kan sammensættes som I

følger: I

H 10 0,2 ml tf-FIP-virus {TCID50 = ΙΟ5»5) I

0,5 ml katteherpesvirus (TCID50 = ΙΟ7'2) I

I 0,25 ml kattesygevirus (TCID50 3 1o6* 0) I

0,25 ml calicivirus (TCID50 3 ΙΟ7'9) I

0,5 ml katteleukæmivi rus (500-3000 pg af gp 70 protein) I

I 15 0,25 ml chlamydia (TCID50 = ΙΟ6'5) I

Koncentrationen af de forskellige kattevira er den mængde, som I

vides at fremkalde en effektiv immunreaktion. Fortrinsvis I

B fremstilles den koncentrerede virus i de ovenfor anbefalede I

B 20 volumener for at komponenterne er til stede i et lille volu- I

B men, som er passende til indgift. I

Eksempel 6: Underenhedsvaccine med to komponenter I

B 25 En underenhedsvaccine med to komponenter til parenteral ind- I

B gift kan fremstilles ved anvendelse af den immunogene underen- I

B hed af tf-FIP-virus kombineret med den immunogene katteleukæ- I

B mivirusvaccine. Kombinationsunderenhedsvaccinen kan sammensæt- I

B tes som følger: I

I I

I 0,4 ml tf-FIP-virus (TCID50 = 105'5) I

I 0,4 ml katteleukæmivirusunderenhed (25-1000 pg) I

I 0,2 ml hjælpestof (aluminiumhydroxid, saponin). I

1 35 I

DK 175715 B1 I

15 I

Eksempel 7: Indgift af vacciner to steder I

Tf-FIP-virusvaccinen kan indgives intranasalt (0,5 ml pr. næ- I

sebor) samtidigt med parenteral indgift af calicivirus, katte- I

5 herpesvirus, kattesygevirus, katteleukæraivirus og chlamydia- I

(kattepneumonitis)-kombinationsvaccine. Oe forskellige kompo- I

nenters koncentrationer ville være som beskrevet i eksempel 4, I

bortset fra at tf-FIP skulle indgives intranasalt adskilt fra I

de andre viruskomponenter. I

10 I

Tabel 4 I

Serum-Ig6-anti-FIP-virus-antistofreaktion af tf-FlP-virusvac- I

cinerede og ikke-vaccinerede katte i effektivitetsundersøgelse I

t 15 ELISA-t i ter uger efter vaccination_ I Kat nr. Vaccinetiter_0a 3b 6c 8 KU4 105'* TClD50/ml >1,50 >1,50 1,260 >1,50 KV4 0,14 5e 0,748 0,806 1,183 LZ4 0,080e 0,590 0,719 1,201 MJ5 0,040® 0,557 0,747 1,075 2Q MM5_0,070e 0,449 0.787 1.015

Aritmetisk gennemsnit_0,367_0,769 0,864 1,195 KT4 10^*5 TCI050/ml 0,074® 0,602 0,787 1,420 KU2 0,129e 0,439 0,650 1,179 LC5 0,095® 0,505 0,788 0,914 LR7 0,364® 0,698 0,676 1,024 , MG2_0,095® 0.676 0.845 1,298

Aritmetisk gennemsnit_0,151 _0,584 0,749 1,167 25 KT3 ingen 0,483* 0,881 0,823 1,031 KV2 0,392f 0,715 0,827 1,202 L04 0,348f 0,702 0,842 0,973 LK2_;_0,499* 0.724 0.903 0,925

Aritmetisk gennemsnit_ 0.430_0,755_0,849 1,033 a første vaccination 30 b anden vaccination c tredje vaccination d absorbansværdier målt ved 405 nm, værdier >0,300 er positive.

® serum indsamlet på dagen for første vaccination ! * serum indsamlet 15 dage efter første vaccination.

I; I

DK 175715 B1

Tabel 5

Serum-vi rusneutral isat ions-anti-FIP-virus-anti stoftitere af tf-fIP-virusvaccinerede og ikke-vaccinerede katte i effektivitetsundersøgelse 1 5 reciprok værdi af virusneutralisationstiter, _uger efter vaccination _

Kat nr. Vaccinetiter_Of_3&__8

KU4 105'5 TCI050/ml <2d 64 192 NT

KV4 <2d 24 128 512 10 LZ4 NT 16 128 256 MJ5 <2d 192 192 384 MM5_<2d 16_48_512_

Geometrisk gennemsnit <2 38_124_401_ KT4 103'5 TClD50/ml <2d 96 192 384 15 KU2 <2d 48 96 512

LC5 NT 96 384 NT

LR7 <2d 64 96 192 MG2_<2fj_96_256_768_

Geometrisk gennemsnit <2_77_ 177__413_ 20 KT3 0 <2® <2 <2 <2 KV2 <2e <2 <2 <2 L04 <2e <2 <2 <2 LK2_<2f_<2_<2_<2_

Geometrisk gennemsnit <2_<2_<2_<2_ 25 a første vaccination b anden vaccination c tredje vaccination d serum indsamlet på dagen for den første vaccination 30 e serum indsamlet 15 dage efter første vaccination 35 17 DK 175715 B1

Tabel 6

Serum-IgG-anti-FIP-virus-antistofreaktion af tf-FIP-virusvaccinerede og ikke-vaccinerede katte i effektivitetsundersøgelse 2 5 ELISA-titer, _uger efter vaccination_

Kat Antal gange nr. vaccineret IN -1a_3β 3C_3^_12_18 501 0,110e 0,348 0,683 0,633 1.078 1.249 SL2 0,135 0,346 0,669 0,482 1.089 1.264 10 SN1 3 0,086 0,483 0,812 0,776 1.094 1.397 502 0,196 0,321 0,573 0,620 1.095 1.094 ST2 0,164 0,268 .0,609 0,532 1.275 1.229 SY3 _0,147 0,532 1.013 0.768 1.232 1.424

Aritmetisk gennemsnit 0,140 0,383 0.726 0,635 1.144 1.273 15 RY5 0,106 0,383 0,740 0,725 0,987 1.003 SI 2 2f 0,282 0,299 0,718 0,738 1.130 1.054 SY1_ 0,106 0,383 0.868 0,792 1.271 1.421

Aritmetisk gennemsnit 0,165 0,355 0,775 0,752 1.129 1.162 RZ3 0,123 0,052 0,063 0,073 0,589 død 20 SH4 O 0,074 0,030 0.047 0,049 0,417 død SL5_0,155 0.051 0,074 0,040 0,291 0,609

Aritmetisk gennemsnit 0,117 0,044 0,061 0,054 0,432 0,609 a første vaccination 25 k ° anden vaccination c tredje vaccination d provokeret 4 uger efter tredje vaccination e absorbansværdi er målt ved 405 nm. Værdier >0,300 er pos i t i ve.

3 0 f vaccineret en tredje gang oralt.

35

I DK 175715 B1 I

I 18 I

H Tabel 7 I

H Serum-virusneutralisations-anti-FIP-virus-antistoftitere af I

H tf-FIP-virusvaccinerede og ikke-vaccinerede katte i effektivi- I

tetsundersøge1 se 2 I

H 5 reciprok værdi af virusneutralisationsti ter, I

H _uger efter vaccination______ I

H Kat Antal gange I

H nr ,_vaccineret IN -1a_3b_6C 9<*_1_2_ΐβ I

SD1 1 0 64 384 NT 192 96 I

H SL2 0 96 1024 240 7200 9600 I

I 10 SN1 0 48 256 360 4800 9600 I

H S02 0 48 192 NT 900 192 I

H ST2 0 192 768 120 NT 64 I

I SY3_0_48_768 360 7200 7200 I

Geometrisk gennemsnit 0_71_474 247 2122 960 I

I 15 RV5 2e 0 48 192 NT 192 600 I

I SI 2 0 48 256 120 128 64 I

I SY1_0_96_1024 360 900 9600 I

Geometrisk gennemsnit 0_60_369 208 281 717 I

RZ3 0 0 0 8 0 900 død I

H 20 I

SH4 00 10 600 død I

SL5_0_0_1_0_2_3_ I

Geometrisk gennemsnit 0_0_ 2_0 81_3 I

aførstevaccination I

I 25 b anden vaccination I

c tredje vaccination I

I d provokeret 4 uger efter tredje vaccination I

I e vaccineret en tredje gang oralt I

I 30 .

I 35

Tabel 8 DK 175715 B1 19

Serum-IgG-anti-FIP-virus-antistofreaktion af intranasalt og subkutant tf-FIP-virusvaccinerede og ikke-vaccinerede katte i effektivitetsundersøgelse 3 * 5 ELISA-1 i ter, _uger efter vaccination_

Kat vej/antal vac- nr. cinationer_0a 3^_8C 11 14 16 SU4 IN/1 0,028<* 0,012 0,399 0,476 0,334 0,474 TR3 0,017 0,007 0,603 0,552 0,428 0,697 TT2 0,018 0,011 0,592 1.153 0,745 1,321 UN3 0,012 0,010 0,674 0,948 0,673 1,400 10 U04 0,064 0,021 0,329 0,414 0,397 0,269 UX6_0.035 0.020 0.683 1.116 0.856 1,475

Aritm. gennemsnit 0,029 0.014 0,547 0,776 0,574 0,939 0H2 IN/2 0,016 0,351 0,858 0,537 0,443 0,878 PQ4 0,104 0,095 0,578 0,682 0,610 0,704 QK4 0,013 0,191 0,660 0,502 0,498 0,727 UE1 0,029 0,223 0,881 1,193 0,885 1,543 15 USI 0,018 0,151 0,796 1.212 0,934 1,629 US2_0,016 0,176 0.773 0,731 0.514 0,886

Aritm. gennemsnit 0,033 0,198 0,758 0,809 0.647 1.061 QQ2 SC/2 0,030 0,021 0,229 død død død QJ1 0,125 0,142 0,235 0,828 død død QY3 0,189 0,108 0,603 1,034 død død RG3 0,017 0,150 0,516 0,981 1,37 død TU4 0,031 0,042 0,235 0,495 0,135 0,121 UGI_0.018 0,243 0,507 1.388 død død

Aritm. gennemsnit 0,068 0.118 0,388 0,945 0,752 0.121 HH5 kontrol NTe 0,041 0,042 0,403 død død HJ4 NT 0,015 0,062 0,561 NT 1,205 HG2 NT 0,030 0,059 0,744 0,743 død Η12_NT_0.007 0.048 0.298 0.514 1,225

Aritm. gennemsnit_0,023 0,053 0,501 0,629 1,215 25 a første vaccination af katte, som modtog 2 doser b anden vaccination af katte, som modtog 2 doser, og første vaccination af katte, som modtog 1 dosis c titere 1 uger før provokation d absorbansværdier målt ved 405 nm. Værdier £ 0,300 er positive 2q e ikke undersøgt.

35

DK 175715 B1 I

Tabel 9 I

Serum-vi rus-neutralisationsanti-FIP-virus-antistoftitere af H

intranasalt og subkutant tf-FIP-virusvaccinerede og ikke-vac- I

cinerede katte i effektivitetsundersøgelse 3. I

5 reciprok værdi for virusneutralisationstiter, - H

Kat Vej/antal vac- uger efter vaccination H

nr. cinationer 0a 3b 8C n 14 15 |

SU4 IN/1 <4 <8 64 30 20 20 I

TR3 <2 <8 256 120 120 40 H

TT2 <2 <8 96 1920 640 480 UN3 <2 <8 512 320 3840 1280

10 U04 3 8 48 40 30 20 I

UX6_4_8 192 960 960 1920

Geometrisk gennemsnit <2_<8_140 210_235_163 H

0H2 IN/2 <2 48 256 120 60 80 I

PQ4 <2 96 512 120 60 60

QK4 <2 96 192 80 40 120 I

UE1 <2 128 768 1920 2560 2560

USI <2 96 512 160 640 960 I

15 US2_<2_64_512 120 240_80_ I

Geometrisk qennemsnit <2_84_414 187_196_220 H

QG2 SC <2 <8 8 død død død I

QJ1 <2 <8 <8 1280 død død I

QY3 <2 <8 128 640 død død

RG3 24 8 64 1920 død død I

TU4 <2 <8 12 <20 20 <20 H

2 0 UGI_<2_12_32 640 død død

Geometrisk gennemsnit <2 _<8_24 399 20_<20 H

HH 5 kontrol NT^ NT <2 ΪΤ5 død død H

HJ4 NT NT <2 120 480 480

HG2 NT NT <2 960 død død H

Η12_NT_NT_<2 240 3480 640

Geometrisk qennemsnit_<2 240 1292_554 H

25 a første vaccination af katte, som modtog 2 doser H

b anden vaccination af katte, som modtog 2 doser, og første H

vaccination af katte, som modtog 1 dosis H

c titere 1 uge før provokation H

d ikke undersøgt. H

3° Beskrivelsen og eksemplerne fremlægger opfindelsen fuldstæn- I

digt indbefattet foretrukne udførelsesformer deraf. Modifika- H

tioner af de beskrevne fremgangsmåder, som er indlysende for H

fagmanden i nden for vaccinefremstilling til anvende Iset i Ismå H

dyr, anses at være inden for rammerne af dé følgende krav. H

Claims

1. Infektiøs katteperitonitisvaccine (FIP-vaccine) til oral ' 5 eller intranasal indgift, som er i stand til at fremkalde im munitet over for infektion af FIP-virus hos katte uden alvorlige bivirkninger, kendetegnet ved, at den omfatter en effektiv mængde af en temperaturføl som (tf) FIP-virus.

2. Vaccine ifølge krav 1, kendetegnet ved, at FIP- virusen er svækket ved flere passager af virulent FIP-virus, som er isoleret fra inficerede kattes væv eller organer, ved passage af virusen igennem modtagelige celler, idet antallet af passager er mindst ca. 60. 15

3. Vaccine ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den temperaturfølsomme FIP-virus er svækket ved passage igennem kattenyreceller ved mellem 30 og 35°C mindst ca. 60 gange.

4. Vaccine ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at den svækkede FIP-virus er gjort températurfølsom ved at udsætte FIPvirusen for et mutagent middel.

5. Vaccine ifølge krav 4, k e n d e t e g n e t ved, at det 25 mutagene middel er ultraviolet lys.

6. Vaccine ifølge krav 3, 4 eller 5, kendetegnet ved, at den svækkede, temperaturføl somme FIP-virus viser en vækstforskel på ca. 1 x 102 TCID50 mellem 31eC og 39eC. 30

7. Vaccine ifølge krav 3, 4, 5 eller 6, kendetegnet ved, at den indeholder 102 til 10? TCID50 temperaturfølsom FIP-vi rus pr. ml.

8. Vaccine ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den indeholder 105»5 TCID50 temperaturfølsom FIP-virus pr. ml, når den dyrkes ved 31*C. I DK 175715 B1 I 1 22 I

9. Fremgangsmåde til fremstilling af en vaccine mod FIP- I I virus, kendetegnet ved, at man: I I 1} svækker FIP-virus ved et stort antal passager igennem mod- I I 5 tagelige celler; I I 2) udsætter den svækkede FIP-virus for et mutagent middel; * I I 3) dyrker svækket FIP-virus fra trin 2, som er temperaturføl- I I 10 som; og I I 4} opsamler den svækkede, temperaturfølsomme FIP-virus. I

10. Fremgangmsåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, I I 15 at FIP-virusen svækkes ved gentagne passager, mindst ca. 60, I I gennem kattenyreceller. I

11. Fremgangsmåde ifølge krav 9 eller 10, kendeteg- I I net ved, at FIP-virusen gøres temperaturfølsom ved at ud- I I 20 sætte FIP-virusen med det store antal passager for et muta- I I gent middel . I

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, I I at FIP-virusen gøres temperaturfø1 som ved at udsætte FIP-vi- I I 25 rusen med det store antal passager for ultraviolet lys i 3 til I I 5 minutter.

13. FIP-virus, kendetegnet ved, at den er en svæk- I I ket, temperaturføl som virus til anvendelse i en vaccine. I I I i I