DK175350B1 - Fremgangsmåde til isolering af intakt gen og kloning heraf - Google Patents

Description

' ‘ 11 ,τ' .':·Ι ’~TO*iW«'’r--»C^- --'i -*»·'·»» '»-J-J *· · - DK 175350 B1 I 0 I Den foreliggende opfindelse angår tilvejebringelse af et funk- I tionelt intakt, helt gen direkte fra et genom, hvor dette I gen er egnet til ekspression af genprodukter. Den foreliggende I opfindelse angår endvidere en fremgangsmåde til udskæring I 5 af et komplet geh fra et genom i et enkelt trin og kloning I af det således frembragte gen.

I Ansøgerne er de første til at udvikle en hidtil ukendt frem- I gangsmåde til at frembringe et komplet, funktionelt intakt I 10 gen i et enkelt trin, som det er beskrevet nedenfor. Der er I således ikke ansøgerne bekendt nogen kendt teknik, som er I direkte sammenlignelig med den foreliggende opfindelse. Gængse I protokoller for kloning af gener anvender en af tre metoder I til at fremstille DNA til kloning: (1) Fremstillingen af kom- I 15 plementært DNA (cDNA) fra messenger RNA (dvs. kopiering af I mRNA til DNA); (2) iturivning af genom DNA til tilfældigt I brudte fragmenter; og (3) kløvning af genom DNA i reproducerbare I fragmenter med restriktionsendonucleaser.

I 20 Når DNA-fragmenterne er fremstillet, sammenføjes de i virus- I eller plasmidvektorer, hvor de reproduceres. Hvis DNA'et inde- I holder et gen, som koder for et proteinprodukt (som regel I er dette den kommercielle årsag til at klone DNA1 et overhovedet), I anvendes ekspressionen (produktionen) af dette protein eller I 25 en del deraf i klonen af interesse til at bestemme den genhol- I dige klon. En almindelig anvendt fremgangsmåde til at påvise I disse proteinprodukter er binding af antistoffer, der er spe- I cifikke for proteinproduktet.

30 cDNA-teknikkerne, som er de mest almindeligt anvendte til I fremstilling af DNA til kloning, har følgende begrænsninger: I (1)1 næsten ethvert tilfælde klones kun en del af genet; I (2) Det klonede genstykke er som regel skåret skævt i retning I af den del, som koder for proteinets carboxylterminale ende I 35 ; (3) Teknikken afhænger af en let adgang til mRNA, som i I de fleste tilfælde kun dannes i visse væv eller i visselivscy- I klusstadier, som kan være vanskelige at ramme.

I DK 175350 B1

Den foreliggende opfindelse undgår cDNA-teknikkens problemer I

ved at klone det komplette gen i et enkelt trin. Dette reduce- I

rer den tid, der er nødvendig for at få fat i det komplette I

gen, hvilket selvfølgelig også kan frembringes efter cDNA- I

5 kloning, men ved at gå videre til restriktionsendonuclease- I

fremgangsmåden til fremstilling af DNA til kloning og gentage ” I

kloningsprocessen. Eftersom fremgangsmåden til påvisning af I

en klon kan rettes bort fra de strukturer, der findes i prote- I

inet ved den carboxylterminale ende, har teknikken ifølge I

10 den foreliggende opfindelse, hvorved klones det komplette I

gen, ikke dette problem. Dette kan eksemplificeres ved et I

H celleoverflademembranantigen, hvor immunsystemet kun dannede I

antistoffer imod aminoterminale dele af proteinet. I

15 Ved teknikken ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles I

I endelig DNA-fragmenter, der indeholder generne i direkte forhold I

til antallet af kopier af dette gen i genomet nærmere end I

til den relative mRNA-mængde, der er til stede i den tilgænge- I

I lige biologiske prøve. Denne fordel løser problemet med kloning I

H 20 I

af et gen for et protein, som kun er til stede i begrænset I

mængde, eller som kun produceres i små mængder i en celleprøve, I

og som kun kan påvises ved følsomme påvisningsfremgangsmåder. I

Det forholder sig således, fordi mRNA'et til fremstilling I

af cDNA for genet af interesse normalt kun er til stede i I

25 I

celler, hvor proteinet dannes. I

De andre to almindeligt anvendte teknikker har måske ikke I

cDNA-teknikkens ulemper, men til gengæld har de hver deres I

I ulemper. Fremgangsmåden med tilfældig iturivning lider ikke I

30 I

af mangel på mRNA, men resulterer i lighed med cDNA-teknikkken I

oftest i kloning af kun en del af genet. På grund af de små I

størrelser af DNA-stykkerne, som anvendes i denne metode, I

må der også undersøgeset større antal kloner for at finde I

genet. I

35 I

Restriktionsendonuclease-fremgangsmåden til fremstilling af I

DNA til kloning er som regel et påkrævet andet trin i cDNA- I

og i tilfældig iturivningsteknikker for sluttelig at klone I

hele genet. Den kan også anvendes til at klone gener direkte, I

DK 175350 B1 I

I men har den ulempe, at der må prøves utallige restriktions- I

I enzymer for at finde bare ét (ud af ca. 100) enzym, som vil I

I kløve DNA'et i den rigtige position for at give genet eller I

I 5

I · en del deraf i en form, som kloningsvektoren kan muliggøre I

I en ekspression af. Årsagen hertil er, at et restriktionsenzym I

I ifølge sagens natur genkender en specifik 4 eller 6 basepar I

I lang DNA-sekvens og kløver det genome DNA alle de steder, I

I hvor denne genkendelsessekvens er til stede. Eftersom DNA I

I ^ basesekvensen er stabil, er positionen af disse kløvningspunkter I

I fastlagt. For mange geners vedkommende kan det være vanskeligt I

I eller umuligt at finde det egnede enzym til at kløve det gen- I

I holdige DNA-fragment i en form, der muliggør en ekspression I

I af genproduktet. I

I 15 I

I Den foreliggende opfindelse tilvejebringer fordele i forhold I

I til de tidligere kendte teknikker ved først at kløve DNA'et I

I i specifikke punkter, mindre end 100 baser fra begyndelsen I

I og afslutningen af genets kodende område. Det.kløver ikke I

I 20 I

tilfældigt inde i genet. Dette resulterer i DNA stykker, der I

I indeholder hele genet i modsætning til fragmenter eller små I

I dele af et gen. Frekvensen af det pågældende DNA-fragment I

I i klonblandingen er afhængig af gen-kopitallet og af størrelsen I

af genom-DNA'et nærmere end af mængden af tilgængelig mRNA. I

I 25 I

Desuden gør nærheden af kløvningspunktet til genets start I

I DNA'et egnet til ekspression af genproduktet i mange ekspres- I

I sionsvektorer. Yderligere er kløvningen ikke specifik for I

I en bestemt basesekvens, men genkender nærmere en struktur I i DNA'et og kløver nogenlunde tilfældigt inden for en bestemt I basestrækning, hvorved man løser det problem, at DNA'et i I mange ekspressionsvektorer må være i den rigtige læseramme I for at muliggøre ekspression af genproduktet. Den foreliggende I opfindelse er nyttig for eukaryote genomer.

I Det er således et formål med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe et isoleret, I 3 5 I funktionelt intakt helt gen fra en eukaryot kilde ved behandling af genomt DNA fra I kilden under kontrollerede betingelser med mungbønne-nuklease og formamid i en I mængde, der er tilstrækkelig til frigivelse af genet fra kilden.

I DK 175350 B1

Det er et yderligere formål med den foreliggende opfindelse I

at klone det isolerede, komplette gen. I

Det er desuden et formål med den foreliggende opfindelse at I

angive en bank eller bibliotek over intakte, hele gener eller I

genfragmenter, der stammer fra disse intakte, hele gener, I

I ® eller rekonstruerede, rekombinante variationer heraf. I

Det er yderligere et formål med den foreliggende opfindelse I

at tilvejebringe nyttige makromolekyler, inklusive genprodukter I

fra det klonede, hele gen. I

I I

I Endnu et formål med den foreliggende opfindelse er at angive I

en fremgangsmåde til at tilvejebringe intakte hele gener i I

en enkelttrinsproces bestående i behandling af det genome I

DNA med en blanding, der omfatter en mungbønne-nuclease og et I

H 15 I

denaturerende middel. I

I Andre formål og fortrin vil fremgå under beskrivelsen af den I

I foreliggende opfindelse. I

I 20 Med hensyn til operationsbetingelserne viste det sig, at den foretrukne mængde af I

mungbønne-nuclease ligger mellem omkring 0,5 og omkring 2 enheder nuclease pr. /ig I

I ' DNA. I

I På den anden side viste det sig også at den foretrukne mængde af formamid ligger I

2 5 I

I mellem omkring 5 rumfangs% til omkring 65 rumfangs% af reaktionsblandingens rum- I

I fang. I

I En mest foretrukket tilstand består i anvendelse af 1 enhed mungbønne-nuclease, form- I

I 30 I

amid i en mængde, der ligger fra omkring 30% til omkring 45%, idet DNA behandles I

I ved omkring 50°C i omkring 30 min i en pufferopløsning, der har en pH-værdi på om- I

I kring 4,6 og det opnåede gen derefter isoleres fra reaktionsblandingen. I

I 35 . Disse og andre formål, egenskaber og mange af de heraf følgende I

I fordele ved opfindelsen vil blive forstået bedre ved at læse I

I den følgende detaljerede beskrivelse sammen med de medfølgende I

I tegninger, hvor I

DK 175350 B1 5 fig. 1 viser en analyse af DNA-fragmenter, frigivet fra genomt DNA ved mung-bønne-nuclease-digestion. Plasmodium- eller rhesus-abé-DNA {1 μg) blev digesteret med mung-bønne-nuclease i forskellige mængder formamid. P. falciparum- og P. lophurae-DNA-di-5 gestioner blev udført i 30-40% formamid. DNA'et blev dernæst elektroforetiseret igennem 0,8% agarose i 22 timer ved 2 volt/cm " i en Aguebog apparatur Model 850 (Aguebog Machine Shop, Aguebog, N.Y.), overført til nitrocellulose og hybridiserét med en radioaktivt mærket sonde. (A) Southern blots blev hybridiseret 10 med et radioaktivt mærket fragment af et plasmid,, pAl, der indeholder et 'ky.llinge-?0-actin-gen. 1),,P. knowlesi-DNA i 40% formamid.. 2) P. knowlesi-DNA i 45% formamid. 3) Rhesus DNA i 45% formamid. (B) Et Southern blot, hybridiseret til en radioaktivt mærket DNA-plasmidsonde, 0 37, der indeholder I 15 β-tubulingenet fra Chlamydomonas. 1) P. knowlesi DNA i 40%

I formamid. 2) P. knowlesi DNA i 45% formamid. 3) Rhesus-DNA

I i 45% formamid. (C) Et Southern blot hybridiseret til et radioak- I tivt mærket oligonucleotid, der er homologt med det histidinrige I protein i P. lophurae. 1) P. lophurae-DNA i 30% formamid.

I 20 2) P. lophurae-DNA i 35% formamid. (D) Et Southern blot, hybri- I diseret til et plasmid pmPf5, der indeholder den komplette I kodende region for circumsporozitgenet fra P. falciparum.

I 1) P. falciparum-DNA i 35% formamid. 2) P. falciparum-DNA

I i 40% formamid.

I 25 I Fig. 2 viser et kort over mung-bønne-kløvningspunkter i P.

I falciparum-circumsporozoit-protein-(CSP)-genet. Den kodende I region er i en kasse; ikke-kodende regioner er angivet ved I en linie. Kløvningspunkter i 35% formamid, a, er angivet med I 30 pile. De foretrukne kløvningspunkter i 40% formamid, c, er I angivet med store fede pile. Mindre foretrukne kløvningspunkter I i 40% formamid, b, er angivet med små fede pile. Et bakteriofag- I λ-bibliotek, der indeholder indsatte mung-bønne-behandlede I P. falciparum-DNA-fragmenter blev konstrueret som beskrevet I 35 nedenfor i vektoren λ gtll. Kloner, der indeholder circumspo- I rozoit-proteingenet, blev selekteret ved immunoscreening ved I anvendelse af et monoklont antistof. Den primære DNA sekvens I på begge sider af enderne på adskillige kloner er vist.An- I tallet efter hver sekvenslinie angiver positionen af dette I DK 175350 B1

nucleotid i hele circumsporozoit-proteingensekvensen. Den I

understregede del af sekvensen blev opnået ved sekvensanalyse I

H af enderne af klonerne, a,' pmPfl; b, pmPfl5; c, pmPf5, pmPf8 I

og pmPfl3. I

I I

I Fig. 3 er et kort over det i plasmid pPbSL7.8 indsatte fragment I

I og viser restriktionssteder såvel som 3 mung-bønne-kløvnings- I

punkter, som optræder i restriktioner, der indeholder 45% I

formamid. De tykke linier repræsenterer, fra venstre til højre, I

I 10 det kodende område for det lille rRNA, 5,8S RNA'et og 2,2 I

kb af det store rRNA fra P. berghei. (A) Mung-bønne-nuclease I

kløvningspunkter i et klonet fragment fra det ribosomale gen I

I fra P. berghei. 0,5 'g prøver af pPbSL7.8 DNA blev behandlet I

I med EcoRl (bane 1), mung-bønne-nuclease og EcoRl efter hin- I

I 15 anden (bane 2) eller mung-bønne-nuclease alene (bane 3). Pro- I

I dukter fra reaktionerne blev dernæst elektroforetiseret gennem I

I 1,2% agarose ved. 2 v/cm i 18 timer og DNA'et synliggjort ved I

I farvning med ethidiumbromid. (B) Sammenligningen af digesti- I

onsprodukter opnået ved mung-bønne-kløvning af klonet og genomt I

I 20 DNA. DNA fra pPbSL7.8 (bane 1) og \Pb27 (bane 2) blev digesteret I

I med mung-bønne-nuclease, som det er beskrevet. I

I Genomt DNA (5 Mg) blev digesteret med mung-bønne-nuclease I

I i 40% (bane 3) eller 45% (bane 4) formamid. Produkterne blev I

I 25 sammenlignet ved Southern-blot-analyse ved anvendelse af en I

I radioaktivt mærket plasmidsonde (pPbSL5.6), som kun indeholder I

I genet for den lille rRNA underenhed. Båndet ved 6,7 kb i bane I

I 1 er resultatet af hybridisering af sonden til en pBr322 afledt I

I sekvens på aftrykket. I

30 I

Disse og andre formål og fortrin opnås ved den foreliggende I

opfindelse, der omfatter et isoleret, funktionelt intakt, ι I

helt gen og en fremgangsmåde til isolering af et funktionelt I

intakt, helt gen, der omfatter behandling af en kilde for I

35 . dette gen med en mængde af en enkeltstrengsnuclease og et I

denaturerende middel, der er i stand til at frigive genet I

fra kilden. I

.----1,-^- TC-W'rJBfca VaUr*. *' -»-Sjat* ., jm

DK 175350 B1 I

7 I

Enhver kilde, der indeholder gener, kan anvendes til udførelse ! I I af denne opfindelse. Genomer eller genomt DNA er eksempler I

I ‘på kildemateriale, fra hvilket disse intakte gener kan tilveje- I

I bringes. DNA, fra hvilke intakte gener kan tilvejebringes, , I

15 il I kan være enten fra prokaryote eller eukaryote organismer,

I naturlige eller rekombinante, naturlige eller syntetiske eller I

I af enhver anden type, når blot det har intakte gener til stede I

I deri. I

I En egnet nuclease, som kan anvendes, er enkeltstrengsnuclease, ! I

I il

I såsom mung bean nuclease, som er kommercielt tilgængelig, I

I f.eks. fra Pharmacia P-L Biochemicals, Piscataway, New Jersey. I

I Enzymet anvendes i en mængde, der er tilstrækkelig til at I

I udskære DNA'et, f.eks. 1 enhed enzym pr. 1 Mg DNA. Men mængden I

I kan variere fra 0,5 enhed til 2 enheder eller lignende, afhæn- I

I gigt af reaktionsbetingelserne. Enzymenheden er den, som er I

I defineret af fabrikanten, f.eks. Pharmacia P-L Biochemicals. I

I Andre nucleaser, som kunne anvendes, er sådanne, som er beskrevet I

Ion. I

i "Nucleases" Ed. Linn & Roberts, Cold Spring Harbor, N.Y. I

I 1982, som inkorporeres her ved denne henvisning, hvor en artikel I

I deri, som hedder "Single Strand Specific Nucleases" af Shishido I

I og Ando på side 167 og frem, er af særlig interesse. I

I Egnede denaturerende midler, som kan anvendes i udførelsen I

I af den foreliggende opfindelse, er fortrinsvis amider, især I formamid, i et koncentrationsområde fra omkring 5% til 65% I (v/v) formamid i reaktionsblandingen. Eksempler på andre denatu- I rerende midler er dimethylsulfoxid, dimethylformamid og form- I * aldehyd i en mængde på op til henholdsvis 50%, 30% og 2%.

I En beskrivelse af egnede denatureringsmidler kan findes i I Wells et al., Prog. Nucl. Acid Res. Mol. Biol. 24, 167, 1980, I som inkorporeres her ved denne henvisning.

I 3® Reaktionsblandingen er en pufferopløsning, der har en pH-værdi I på omkring 4,2-4,8. En foretrukken pufferopløsning omfatter I omkring 0,2M Nacl, ImM ZnSO^ og 30mM Na-acetat, pH 4,6.

I DK 175350 B1 m

Betegnelsen gen eller ekspressionsprodukt omfatter sådanne enheder som messenger-, transfer-, opløselige og ribosomale ribonucleinsyrer, peptider, polypeptider eller proteiner og antistoffer dannet imod disse peptider eller proteiner.

Delfragmenter, rekombinanter eller enhver anden form for rekon- struerede eller rekonstituerede enheder, der er afledt af det isolerede intakte gen, som er opnået i overensstemmelse

I med den foreliggende opfindelse, er omfattet af den foreliggende I

10 opfindelse. I

Mung-bønne-nucleasereaktioher udføres typisk i et volumen I

I på 100 μΐ. med 1 enhed enzym pr. 1 pg genomt DNA ved omkring I

I 50°c i varierende koncentrationer af formamid, fortrinsvis I

I 15 omkring 20%-50% (v/v) i omkring 20-40 min. i 0,2M NaCl, 1 I

mM ZnSo^ og 30mM Na-acetat, pH 4,6. Inkubationen foregår i I

I et tilstrækkeligt tidsrum, sædvanligvis omkring 30 min., i I

den ovennævnte reaktionsblanding. Opløsningen fortyndes dernæst I

I 4 gange med omkring 0,01M ethylendiamintetraacetat (EDTA) I

I 20 og ekstraheres med phenol, således som det er kendt af fagfolk. I

DNA-fragmenter, der indeholder de ønskede intakte hele gener, I

I isoleres dernæst fra denne reaktionsblanding ved fældning I

I af DNA-fragmenterne med 2 volumener absolut ethanol. Bundfaldet I

I henstår natten over ved -20°C ogcentrifugeres dernæst ved I

I 25 omkring 10.000 omdrejninger pr. min. (12.000 g) i omkring I

I 30 min. i en nedkølet centrifuge. Resten, der indeholder de(t) I

I isolerede intakte gen (er), skylles med 80% ethanol i f^O, I

supernatanten hældes bort, og bundfaldet recentrifugeres om I

I nødvendigt og tørres dernæst i vakuum. Det tørrede DNA , der I

I 30 . repræsenterer det intakte hele (komplette) gen, kan dernæst I

I enten lagres ved -20°C eller opløses i en egnet puffer, f.eks. I

I lOmM tris-HCl, pH 7,5, der indeholder ImM NaEDTA, og anvendes I

I til efterfølgende trin, f.eks- kloning, transkription, trans- I

I lation, elektroforese og lignende eller til tilvejebringelse I

I 35 af andre genprodukter eller makromolekyler (proteiner, anti- I

I stoffer og lignende) eller lagres nedfrossen til senere an- I

I vendelse som ønsket. I

9 I

DK 175350 B1 I

Kloning af et isoleret helt gen kan opnås med enhver egnet I

teknik, f.eks. som beskrevet af Young og Davis i Proc. Natl. I

Acad. Sci., USA, 80:1194, 1983 og I

Science, 222:778, 1983, og begge publikationer inkorporeres I

5 her ved denne henvisning. Enhver egnet kloningsvektor, f.eks. I

et mikrobielt plasmid eller et gærplasmid eller en bakteriophag I i' og lignende kan anvendes til at klone det hele gen. En fore- I

trukken kloningsvektor er Xgtll. I

jo for at teste eller for at producere produktet eller produkterne, I

der kodes af det isolerede gen, introduceres genet kunstigt I

i en ekspressionsvektor, fortrinsvis en enkeltcellet organisme, I der er i stand til at udtrykke genet, sædvanligvis i form I

af et peptid eller protein. Det således udtrykte polypeptid I

jg eller protein identificeres som regel ved hjælp af standard- I

teknikker, såsom immunologiske procedurer, eletrophorese, I

aminosyresekventering og lignende. Afhængig af vigtigheden I

og signifikansen af ekspressionsproduktet (f.eks. et protein) i videnskabelig, kommerciel, farmaceutisk eller anden henseende I 2o kan ekspressionsproduktet anvendes videre til at fremstille I antistoffer (mono- eller polyklone) eller lignende, og alt I dette anses for værende dækket af den foreliggende opfindelse.

I For at analysere resultater af mung-bønne-nucleasedigestion I 25 under forskellige kontrollerede betingelser er der anvendt I standard Southern-aftryks-analyse som beskrevet af Southern, I J. Mol Biol. 98:503, 1975, som inkorporeres her ved denne I henvisning. Både umærkede og radioaktivt mærkede sonder kan I anvendes.

I 30 I Betegnelsen 'funktionelt intakt' betyder, at genet er i stand I til at kode, kontrollere eller dirigere alle de funktioner, I som er iboende i et gen, f.eks. transkription, translation I og lignende.

I 35 I Alle nedenfor nævnte publikationer eller patentskrifter in- I korporeres her.

I DK 175350 B1 I 10

Som et illustrativt eksempel på den foreliggende opfindelse blev genomt DNA kløvet med mung-bønne-nuclease under en serie af kontrollerede betingelser og genprodukterne analyseret

ved Southern blot analyse.Klonede gener, der blev isoleret I

® fra Plasmodium og andre organismer, eller syntetiske oligo- I

nucleotider blev anvendt som sonder. I

Fire forskellige DNA'er blev anvendt som radioaktivt mærkede I

sonder i Southern-aftryks-analyse, cDNA'er til kyllinge B-actin I

1° og Chlamydomonas tubulin. De blev valgt, fordi de er blevet I

I anvendt til at finde tilsvarende gener i en bred vifte af I

organismer, omfattende parasitiske protozoer, Cleveland, et I

I al. Cell 20, 95.(1980) og Silflow, et al. Cell 24 , 81 (1981). I

I En række forskellige kløvningsbetingelser, især med hensyn I

15 til forskellige formamidkoncentrationer, blev undersøgt. Analysen af reak- j I

I tionerne i 40% og 45% formamid er vist i fig. 1. Southern I

I blot analyse af Plasmodium knowlesi DNA efter kløvning i 45% I

I formamid viser et enkelt fremherskende fragment ved 1,6 kb I

I (kilo-baser), der hybridiserer til actinsonden (fig. 1A) og I

I 20 et ved 2,6 kb, der hybridiserer til tubulinsonden (fig. IB). I

Disse fragmenter har en tilstrækkelig størrelse til at kode ! I

I for de tilsvarende produkter. 40% formamidreaktionerne indehol- I I

der også fragmenter, som er homologe med sonden, men som er j I

større. I

I 25 I

I Undersøgelse af området, der omgiver det histidinrige protein I

I (HRP) i Plasmodium lophurae, udført af Kilejian. J. Biol. I

I Chem. 249, 4650 (1974), blev udført ved anvendelse af et radioak-, I

I tivt mærket oligonucleotid bestående af en sekvens på fem I

I 30 . tandem-histidin-kode-tripletter som beskrevet af Wallach Proc. I

I Natl. Acad. Sci. USA 80, 1867 (1983). DNA fra P. lophurae I

I (mere end 95% rent) blev digesteret med mung bean nuclease I

I i 30%, 35% og 40% formamid. Analyser af 30% og 35% reaktionerne I

I viste et bånd ved 2,2 kb (fig. 1C). Dette er samme størrelse I

I 35 som det mRNA, der er beskrevet af Wallach Proc. Natl. Acad. I

I Sci. USA 80, 1867 (1983), og som koder for HRP og hybridiserer I

I til oligonucleotidsonden. Igen har mung-bønne-nucleasen udskåret I

I et fragment af gen-størrelse. Circumsporozoit-proteingenet I

I blev undersøgt ved anvendelse af klon pmPf5 som en sonde, I

DK 175350 Β1 I

11 I

der indeholder hele det kodende område af genet som beskrevet I

af Dame et al. i Science, august 10, 1984, hvilken publikation I

inkorporeres heri i sin helhed ved denne henvisning. X Southern I

-blot-analyser sås kun ét bånd ved 2,3 kb i 35% formamidreak- I

5 tionen. Et større bånd på 1,3 kb og et mindre med en lidt I

større størrelse sås i 40% formamidreaktionen. Alle disse I

tre fragmenter blev dernæst klonet. Sekvensdata for disse I

er beskrevet nedenfor og i Dame et al, se ovenfor. I

10 For at bestemme punktet for mung-bønne-nucleasekløvning blev I

de ved mung-bønne-nucleasedigestion frembragte fragmenter I

klonet og sekvensbestemt. Dette opnåedes ved at kombinere I

lige mængder DNA fra 35% og 40% formamid mung-bønne-nuclease-reak I

tionerne, vist i fig. ID, og sammenføje disse i ekspressions- I

15 vektoren \gtll. 200.000 kloner indeholdende indsatte fragmenter I

blev undersøgt immunologisk med monoklone antistoffer, der I

I er specifikke for circumsporozoit-proteinet fra P. falciparum I

I {Dame et al, ovenfor). 7 af 35 positive kloner blev analyse- I

I ret i detaljer. Fragmenterne, påvist ved Southern-blot-analyse I

I 20 i fig. ID, fandtes alle i denne gruppe. Tre kloner indeholdt I

I et 2,3 kb fragment (35% formamidreaktion, bane 1). Tre indeholdt I

I et 1,3 kb fragment, og én indeholdt et 1,35 kb fragment {40% I

I formamidreaktion, bane 2). DNA sekvensen af 2,3 kb fragmentet I

I blev dernæst bestemt {Dame et al, ovenfor). 2,3 kb fragmentet I

I 25 fra 35% formamidreaktionen har et kløvningspunkt omkring 80 I

I bp 5' før start af genet og et kløvningspunkt ca. 1000 bp I 3' efter genet. Både 5'- og 3'-enderne af andre kloner blev I sekvensbestemt og sammenlignet med sekvensen af 2,3 kb frag- mentet (fig. 2). De tre 1,3 kb fragmenter har kløvningspunkter I 30 w enten 10 eller 11 bp fra genets start og kløvningspunkter I enten 27 eller 35 bp fra 3' enden af genet. Man har sekvensb I stemt én klon, som indeholder et mindre 1,35 kb fragmentbånd I fra 40% formamidreaktionen. Dette fragment skæres 52 bp før I genet og 60 bp efter. Sekvenser ved enderne af disse kloner I 35 repræsenterer sekvenser, som nucleasen har undgået (fig. 2).

I Der er ikke nogen åbenbar sekvenshomologi hverken 5' eller I 3' i forhold til kløvningerne. Skønt kløvningspunkterne er I dA.dT rige, har de ikke mere dA.dT end omgivende områder både I DK 175350 B1 H i og uden for genet, som ikke skæres. Ydermere er 5' regionen H for et givet kløvningspunkt ikke mere dA.dT rig end 3' sekvensen H for et kløvningspunkt.

5 Det bør bemærkes, at kløvning afhænger af strukturen af det H nøgne DNA. En klonet DNA sekvens, der er syntetiseret i og H isoleret fra E. coli, giver samme kløvningsprodukter som genomt H DNA fra Plasmodium. Mung-bønne-nucleasekløvning af klonede, ribosomale Plasmodium gener, i formamid giver fragmenter med H jq defineret størrelse, som svarer til de kodende områder for H det lille ribosomale RNA, 5,8S RNA og det store ribosomale RNA. Fig. 3 viser et kort for et klonet plasmid, pPbSL7.8, som indeholder et EcoRl DNA fragment fra P. berghei med den kodende region for hele det lille rRNA, 5,8S RNA'et og 2,2 H kb af det store ribosomale gen, som afbrydes af et EcoRl kløv- 1 s ningspunkt. Data'ene i fig. 3A viser produkterne ffra kløvning af det klonede restriktionsfragment med enten en restriktions- nuclease eller mung-bønne-nuclease. Mung-bønne-nucleasekløvning- H sprodukter af klonede ribosomale gener sammenlignes direkte med dem fra totalt genomt DNA i fig. 3B. De foretrukne Plas- H modium afledte fragmenter har alle den samme størrelse. Dette antyder, at mung-bønne-nucleas kløver disse klonede Plasmodium H DNA'er næsten kvantitativt og giver de samme produkter som gencmt DNA. Den kendsgerning, at både klonede og genome DNA'er reagerer H identisk, indikerer, at DNA'et ikke tidligere er skåret med Plasmodium 25 nucleaser. Kløvning afhænger derfor af strukturen af DNA klonen. DNA fra ] andre orgasnianer blev også analyseret. Kløvning, son giver fragmenter med defineret størrelse, var ikke ualmindelige, selv i DNA fra højere eukaryote organismer (fig. 1A, bane 3). Nogle DNA'er, såsem det fra den I parasitiske trerøtode Schisotoscma mansoni, gav enkelte, små fragmenter, 30 , sem hybridiserede til enten actin- eller tubulinsonder. Dette indikerer en I bredere anvendelighed af den foreliggende opfindelse.

I Isolerede intakte gener ifølge den foreliggende opfindelse kan selvfølgelig I bevares son en genbank eller et genbibliotek. Et eksempel på et Xgtll I 3 5 I bibliotek konstrueres som følger. Plasmodium DNA (5-10 \\q) digesteres med mung-bønne-nuclease sem her beskrevet i 30%, 35%, 40% eller 45% formamid.

I Reaktionsproduktet fra hver af de fire reaktioner fortyndes fire gange I med 0,01M EDTA, phenoliseres og fældes i 2,5 volumener ethanol. En prøve ' Ί" -., -- r·^ '; V - ·. , .. Λ-^wi i.Mu.iinijjjajm DK 175350 B1 13 af hvert DNA analyseres ved Southern blot analyse ved anvendelse af en DNA sonde, der er hcmolog med enten act in eller tubulin. DNA’et fra reaktionerne, der indeholder fragmenter i 'genstørrelse*, son er homologe med sonden, samles og anvendes som et lager af fragmenter til at ligere S i Xgtll. 35%- og 40%-formamidreaktionsprodukterne til P. falciparum biblioteker samles. I dette tilfælde blev DiR'et behandlet ned Klenow-fragment, men ved fremstillingen af andre biblioteker kan dette trin elimineres.

EcoRl koblere (BRL) stump-endesammenføjes med de behandlede fragmenter.

Efter digestion med EcoRl fjernes frie koblere fra større fragmenter ved 10 anvendelse af en 1,5 x 20 cm Sepharose 4B kolonne. Agt 11 selv sammenføjes og digesteres med EcoRl. P. falciparum-fragmenteme sammenføjes med det fremstillede Xgtll-DNA natten over ved 12°C med T4 DNA-ligase (BRL) under betingelser, der anbefales af leverandøren. Reaktionsprodukteme fra sammenføjningen pakkes i infektiøse fager in vitro (Branega Biotec).

15 Fra oprindeligt3 ug udgangsgenom-DNA høstes 4 x 10^ paknin ger ved påviselig brydning af B-galactosidasegenet i Xgtll på RY1090, der vokser på LB-agarytilsat Xgal og IPTG. Der er også lavet et DNA“bibliotek af P. knowseli på denne måde med undtagelse af, at der anvendes produkterne fra mung.'-bønne-20 nucleasekløvning i 40% og 45% formamid.

En af fordelene ved den foreliggende opfindelse er at rekom-binantbibliotekerne kan fremstilles således, at de fortrinsvis indeholder komplette genfragmenter. Tilstedeværelsen af 25 ethvert gen i biblioteket relaterer sig så direkte til dets kopital i genomet. Dette er af speciel vigtighed med hensyn til de betingelser, hvor vigtige proteiner ikke er let til- . . % tilgængelige, fordi sådanne proteiner produceres under et bestemt stadie i en organismes livscyklus, eller fordi de 30 . ikke er tilgængelige i tilstrækkelig mængde.

Isolering af intakte gener, kloning heraf og produktion af protein fra klonede, isolerede gener og anvendelse af proteinet til produktion af antistoffer (mono- eller polyklone) , 35 som altsammen nu er gjort mulig med den foreliggende opfin delse, åbner op for et nyt perspektiv i bioteknologi. Sådant var ikke hidtil muligt af den simple årsag, at intakte .funktionelle gener ikke kunne isoleres direkte et genom i en, simpel, effektiv enkelttrinsreaktion.

I DK 175350 B1

I 14 I

Den kendsgerning at mung-bonne-nucleaseteknikken har vist sig at I

være succesrig til tilvejebringelse af funktionelt intakte, I

I komplette/isolerede gener fra sådanne organismer som Pias- I

modium, Schistosoma mansoni og Vibrio cholerae i overens- I

5 stemmelse med den foreliggende opfindelse/ viser, at fæno- I

menet er generelt og ikke et isoleret. I

H Det forstås, at de her beskrevne eksempler og udførelsesfor- I

I mer udelukkende tjener illustrative formål, og at forskellige I

I 10 modifikationer eller ændringer i lyset heraf vil være mulige I

for fagfolk og vil være inkluderede i ånden i denne ansøgning I

samt inden for rækkevidden af de medfølgende krav. I

I 15 I

I 20 I

I 25 I

I 30 i

I 35 I

Claims (7)

15 DK 175350 B1 I Patentkrav

1. Fremgangsmåde til isolering af intakt, helt gen fra en eukaryot kilde omfattende I behandling af genomt DNA fra kilden under kontrollerede betingelser med mungbøn- I 5 ne-nuclease og formamid i en mængde tilstrækkelig til frigivelse af genet fra kilden.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor genet isoleres direkte fra kilden ved en reak- I tion i et enkelt trin. I 10 3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor mængden af nuclease ligger fra omkring 0,5 I til omkring 2 enheder nuclease pr. pg DNA..

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor mængden af formamid ligger fra omkring 5 I rumfangs% til omkring 65 rumfangs% af reaktionsblandingen. I 15

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor mængden af nuclease er 1 enhed og form- I amid ligger fra omkring 30 % til omkring 45 %.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor DNA behandles ved omkring 50 °C i om- I 20 kring 30 minutter i en pufferopløsning ved en pH på omkring 4,6 og genet isoleres fra I reaktionsblandingen.

7. Fremgangsmåde ifølge krav 1, yderligere omfattende kloning af genet. I 25