JPS5810599A - ヒトインタ−フエロン−β遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト染色体由来のヒトインターフェロン−β遺
伝子〔インターフェロンβの遺伝子の全転写領域に対応
するＤＮＡ（デオキシリボ核酸）〕、諌遺伝子および該
遺伝子の転写の調節に関与するＤＮＡを含むＤＮＡ、な
らびに該ＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡＫ
関する。

本発明者らは、組換えＤＮＡ技術を用い、グラスミドＤ
ＮＡ（たとえば大腸菌由来のプラスミドＤＮＡ）あるい
はファージＤＮＡ（たとえば大腸菌由来のλフアージＤ
ＮＡ　）にヒトインターフェロン遺伝子を挿入した組換
え体ＤＮＡによるインターフェロンの大量増殖を目的に
研究を行つ九。その結果、細菌たとえば大腸菌内で増殖
、増幅させ、最終的にはヒトインターフェロン−βを細
菌九とえば大腸菌に生産させるのに利用することができ
、さらＫＸ＠細胞内たとえばマウス細胞の染色体遺伝子
中に組込み、あるいはウィルスに組み込んで真核細胞内
に取り込ませ、真核細朧たとえばマウス細胞にヒトイン
ターフェロンーβと全く同一の化学構造を有する物質を
生産させるのに利用することのできる新規な組換え体Ｄ
ＮＡを見出し、本発明を完成するに至った。

諌組換え体ＤＮＡはヒトインターフェロン−βの染色体
内遺伝子の少なくとも全転写領域、さらに転写の調節に
関与していると考えられる領域をも含んだ部分を有する
新規な組換え体ＤＮＡであり、本発明者らによって始め
て見出され友ものである。

本発明者らは先にヒトインターフェロン−βのｃＤＮＡ
ｔ−ｍＲＮＡを鋳型として取シ出し九（Ｏｏｎｅ、　１
０、／／〜１ｊ１（／り１０）〕が、本発明ではヒトの
染色体遺伝子から直接ヒトインターフェロン−β遺伝子
ならびに該遺伝子とその転写調節に関与するＤＮＡとを
含んだＤＮＡを取り出すことに成功し良ものである。

以下本発明の詳細な説明する。

本発明はヒト染色体由来のヒトインターフェロン−β遺
伝子、該遺伝子および該遺伝子の転写の調節に関与する
ＤＮＡを含むＤＮＡ、ならびに該ＤＮＡとベクターＤＮ
Ａとの組換え体ＤＮＡに関する。

本発明の組換え体ＤＮＡは、概路次のようにして製造で
きる。

ヒト染色体全ＤＮＡ、例えばヒト胎児肝臓から抽出し友
染色体ＤＮＡを、制限酵素を用いて適当な長さに分断す
る。それをその１ｔ４しくけ適当な長さの部分のみを取
出して電気泳動法などにより濃縮する。これを組換えＤ
ＮＡ技術によってベクターＤＮＡに挿入することによっ
て組換えＤＮＡを得る。この組換えＤＮＡの中カラヒト
インターフェロンーβメツセンジャーＲＮＡに相補性を
示すＤＮＡ（ヒトインターフェロン−βのＣＤＮＡ）を
持つ組換え体ＤＮＡを放射性同位元素で標識したものを
採針として、ヒトインターフェロン−βの染色体遺伝子
を含む本発明の新規組換え体ＤＮＡを探索、採取するこ
とができる。

諌組換え体ＤＮＡの製法についてさらに具体的に説明す
る。

ヒト染色体全ＤＮＡを、ヒト胎児肝臓なとからフェノー
ルなどで抽出する。この抽出ＤＮＡを制＠＃素、例えば
ＨＩＬ＠ｌとＡｊｕ　ｌなどで部分消化するととくより
過当な長さに分断する。

こうして得られるヒト染色体全ＤＮＡの断片ＤＮＡＫ挿
入し、組換え体ＤＮＡを作る。

これをさらにパッケージング法によシ、より感染性の高
いλフアージ粒子にする。このようＫして得たヒト全遺
伝子を含む組換え体の集合は、ヒト遺伝子ライブラリー
とよばれる。

ヒト遺伝子ライブラリーは、その構築のＪ［ｌｌ上はと
んと総てのヒト遺伝子ＤＮＡを含んでおり、はとんど総
ての遺伝子をそこから単離してくることができる。

ヒトインターフェロン−βの染色体内遺伝子の場合には
、後述するように、既に遺伝子周辺の制限酵素による切
断地図が明らかＫなっており、上述のヒト全遺伝子ライ
ブラリーを出発点とする代シに、次のようなヒトインタ
ーフェロン−β遺伝子について、より濃縮された組換え
体の集合を出発点として奄よい。

すなわち、ヒト染色体全ＤＮＡを制限酵素Ｈ１ｎｄｌな
どで完全に消化し、約１０キロベース（以下Ｋｂと略記
する）１１度のＤＮＡをアガロース中の電気泳動法など
によって分幽し、これを上述のようにλファージなどに
組込むことによって、１ｉｎｄｌ切断個所を両端に持つ
約１０ＫｂのＤＮＡのライブラリーを得ることができる
。

ヒトインターフェロン−βの染色体内遺伝子はＨｌｎｌ
　ｌ　Ｋよって生じる約１０Ｋｂｆ）ＤＮＡ中に含まれ
ている。この場合、全遺伝子２イブラリ−に比べ、約１
０倍程度は鍛縮されると考えられる。

上記ベク・ターとして用いたλファージはＣｈａｒｏｎ
系の７アージ、プラスミド例えｄｐＢＲＪＪコ、ｐＣＲ
／　％ｐＭＢり、ｐ８ｃ／などに代えることもできる。

かくして得られたヒト遺伝子ライブラリ７から次のよう
にしてヒトインターフエ四ンーβ遺伝子を含むＤＮＡ断
片を持つ丸紐換え体ＤＮＡを探し出すことができる。

ヒトインターフェロン−βメツセンジャーＲＮＡＫ相補
的な構造（ＯＤＮＡ）をもつ丸紐換え体プラスミドを大
腸菌χ／７７４／ＴｐＩＦＪ／ター１３ＡＴＣＣＪ／７
／２からＣｕｒｒｉ＠ｒとＨ晶ｔ＠ｒの方法［Ａｎａ／
ｙｔ、Ｂ１００ｈ＠ｍ、ｖｏｌ、７ｊ、４１−Ｊ／−４
４＜／（／り７４）〕によって散出す。これをニックト
ランスレージ画ン法（Ｈｏｏｐら、ｃｅｌｌ　／ｊ％４
７／−４１１　（／り７１）〕に従って［ＪＪｐ）で標
識し、これを探針とする。

一方、大腸菌ファージをベクターとして用いた上述の遺
伝子ライブラリーを葦天平板上に展開し、各々のクロー
ンに対応する７アージプラーク中のＤＮＡをＢ＠ｎｔｏ
ｎとｐｌＬＶｉ＠の方法（ｓｃｔｅｎｃｅ、／ｆム／１
０−／１２（／Ｆ７７）〕１１Ｃ従ってフィルター上に
固定する。

このフィルターに対して上記探針を用いてハイブリダイ
ゼーションを行い、ラジオオートグラフィーによシ、ヒ
トインターフェロン−βメツセンジャーＲＮＡに相補的
な構造をもった組換え体に会合するＤＮＡを持ったファ
ージのクローンを判別する。

かくして得たファージを増巾し、ＤＮＡを抽出する。［
ＤＮＡをＩＣ（ｊｏＲｌなどの制限酵素で消化し、アガ
ロースゲル電気泳動で分動する。得られる画分をＢｏｕ
ｔｈｅｒｎの方法（ＪｏＭｏｌ、　Ｂ１１１゜Ｕ％ｊＯ
Ｊ−！／７（／デフｊ）〕でフィルターに固定する。上
記の採針を用いてハイブリダイゼーションを行い、いわ
ゆる３０ｕｔｈｅｔｒｎプロッティング分析（同上文献
）する。このようＫして０ＤＮＡにハイブリダイズする
、例えば／、ＩＫｂの１００ＲＩ断片をもつファージク
ローンを得る。

このファージクローンから、例えばＳｍｉ　ｔｈとＢｉ
ｒｎｓｔｉｅｌらの方法［Ｈｕｃｌｅｉｃ　）、Ｃｌｄ
ｍ　Ｒ１１１１１，ｊｔλＪＩ７−コＪりｔ（ｉり７７
Ｇ）］Ｋよシ、より詳細な制限酵素地図を作成する。

さらに、例えばＭａＸａ３とＧ１１ｂ＠ｒｔらの方法（
ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＊ｃａｄ、Ｂｃｉ、　ＵＳＡ　
７ｊＬ％ｊ≦０−８１１゜（ｌり７７））Ｋよ）ＤＮＡ
の塩基配列を決定する。

このＤＮＡの塩基配列をヒトインターフェロン０ＤＮＡ
［Ｇ＠ｎ＠　／−０，／／−／！（／９１０）〕の塩基
配列と比較すると、得られたクローンがヒトインターフ
ェロン−βメツセンジャーＲＮＡに対応する染色体内遺
伝子、すなわちヒトインターフェロン−βの染色体内遺
伝子を含むことが同定できる。

このヒトインターフェロン−β遺伝子ならびに＃遺伝子
とそれの転写の調節に関与するＤＮＡを含むＤＮＡは上
記で得られた組換え体ＤＮＡの中からＢ＠ｎｔｏｎと１
）ｌＬＶｉｌの方法［Ｂｃｉ＊ｎｃ・、ｔｙｔ、　／１
０−／Ｉコ（ｌり７７）〕や□ｒｕｎｓｔｓｉｎ−Ｈｏ
ｇｎｅａ−の方法［ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　ＡＯＩＬ
ｌｌ、ｓｃｉ、　ＵＳＡソ、Ｊデ４／−Ｊりｔｚ（ｉり
７ｊ））Ｋ従って採取する。

実施例ｔ ヒト遺伝子ライブラリーはＴｏｎ　ＭＩＬｎｉａｔｉｓ
（Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ・ｏｆ　Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から供与を受けたが、これは次の
ようにして作られ友ものである。

ヒト胎児肝臓から染色棒金ＤＮＡをフェノールなど、で
抽出し、制限＃本ＨａｅｌとＡｌｕ　ｌで部分消化する
。こうして得られたＤＮＡ断片の中から鎖長がｉｔ−λ
ｊＫｋｌ程度の７ラグメントをショ糖密度勾配遠心法に
より濃縮し、次に制限酵ＸＥＱＯＲＩの切断箇所を持つ
短鎖合成ヌクレオチドを、介して大腸菌ファージλＣｈ
ａｒｏｎ　弘ＡのアームＤＮＡＫ１１’絖し、感染性の
あるファージＤＮＡ組換え体を作成する。次に、さらに
感染性を高める目的でパッケージング法によす究全な７
ア一ジλ粒子にしである。このようにして作られたヒト
遺伝子ライブラリーは原理的にはほとんどすべてのヒト
遺伝子を含む鎖長／Ｉ−コｊＫ１）のヒ）ＤＮＡを含ん
だ組換え体の集合であると考えられゐ匈 ヒト遺伝子ライブラリーからヒトインターフェロン−β
の遺伝子を含むＤＮＡ断片を持つ組換え体ファージはヒ
トインターフェロン−βの０ＤＮＡの蛋白に翻訳される
部分すべてを持つＣＤＮＡ断片を［ｊＪｐ］で放射標識
したものを採針としてＢｅｎｔｏｎと１）ａｖｉａの方
法［Ｓｃｉ・ｎｅｏ　／９４゜１ｔｏ−ｉｔλ（／り７
７）〕によシ探索した。以下にその詳細を述べる。

先ず、探針として用いるヒトインターフェロン−βのｅ
ＤＮＡの蛋白に翻訳される部分すべてを持つ約０．７７
　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片は次の株にして調製し、放射標識
した。

ヒトインターフェロン−βのＣＤＮＡを含む組換え体プ
ラスミドＴｐＩＦＪ／ター１３を持つ大腸菌Ｚ／７７４
／ＴｐＩＦＪ／ター／ＪＡＴＣＣＪ／７／−からＣｕｒ
ｒｉｅｒとＨｅ５ｔｅｒらの方法［Ａｎａｌｙｔ。

Ｂｉｒｃｈｅｎ、　Ｚｊ、’４ＣＪ／−＄４ｃ／（／り
７４）ＩＫよってＴｐＩＦ　Ｊ　／ター／３プラスミド
ＤＮＡを精製し、制限酵ｇＨｉｎａ１％Ｂｇｌｌ　、　
Ｈｈａｌで消化する。得られた消化物中、最も鎖長の長
い０．　ｊ　７　Ｋ　ｂのＤＮＡ断片が目的とするＤＮ
Ａ断片であるが、これをＴａｂａｌｃとｐ’ｘａｖ・１
１の方法（ＮｕｃｘｅｔｃＡｃｉｄａ　　Ｈｅ５ｅａｒ
ａｈ　　ｊ、　　コ３２／−２ＪＪ２（／り７ｔ）〕に
よシシアガロ−スミ泳動法で他の断片と分離し精製する
。これをニックトランスレージ曹ン法〔九とえばＲＯＯ
Ｐら、Ｃｅ１１１１．４７／−４１！（ｌり７ｒ）ＩＫ
より〔”ｐ〕で放射標識する。すなわちＤＮＡ（ｏ、ｊ
Ｐｆ）をｊ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣＩ（ｐＨ７ｆ）
、ｊｍＭ　ＭｙＣｌｘ、１０ｍＭβ−メルカプトエタノ
ール、５２Ｍ　ｄＧ’ｌ’Ｐ１／　ｊ　ＯｐＭ　ｅＬＴ
ＴＰ。

／　ｎｆ　Ｄ　Ｎ　ａｓｅ　ｌ　（ＷＯｒｔｈｉｎｇｔ
ｏｎ社製）、［ＪＪｐ〕−α−ｄＣＴＰ（１００μＣ１
、コ０００−ＪＯＯＯＣ１／ｍｍｏｊ、　ＲＣＣＡｍｅ
ＴＳｈｌＬＢ社製）、／ｊｕｎｉｔＤ　Ｎ　Ａ　ｐ（１
１７Ｂｌ！１ｒｌＬＩ＠　ｌ　（ＢＯ％ｒｉｎｇ＠ｒ　
ＭＩＬｒｉｍ社製）を含む３０声ノの水溶液中で７３℃
、参時間インキエベートした。ついでＩＤＴＡを添加し
終濃度コＯｍＭとし、４ｊ’Ｃ１１ｏ分間インキュベー
トし酵素を失活させる。次にフェノールで除蛋白し九後
、３ｅｐｈａｄ＠ｘ　Ｇ−ｊＯ（ＰｈａｒＢａｃｉａ　
ＦｉｎｓＣｈｅＨ１ｃａ１社製）カラムクロマトグラフ
ィーで脱塩し、探針に供する。このようＫして得られた
［　ＪＪ　ｐ　］で放射標識され九〇ＤＮＡ断片はｉｏ
’ａｐｍｉｔ程度の放射活性を持つ。

以上述べ良方法により、ヒトインターフェロン−βＣＤ
ＮＡの断片を放射標識して調製したＤＮＡ断片を探針と
してヒト遺伝子ライブラリーからヒトインターフェロン
遺伝子を含むＤＮＡ断片を持つ組換え体７アージを次の
ようにして探索する。

まず、寒天プレート（Ｂａｉｅｎｏｅ　ＪＯＪ、／λ７
ター／λＩＩＩ（／り７１）〕上に先のファー９１粒子
をまきファージプラークを形成させる。このプラークの
密度は直径／ｒａｔのプレート７枚あえｆｉ／社販売）
を重層し、方向づけのためにマークをつけ、参℃で約２
０分間放置し、ファージを吸着させる。プレートは参℃
に保存しておき、ニトロセルロース紙を室温で約２０分
間風乾する。これを０．　／　Ｎ　ＮａＯＨ％／、ｊＭ
　ＮａＣｊの水溶液中に約２０秒間浸し、ファージＤＮ
Ａを変性させる。次Ｋ　Ｏ，Ｊ　Ｍ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣ
Ｉ　（ｐＨ７亭）、コｘｓｓｃ（ｓｓｃとは０．　／　
ｊ　Ｍ　ＮａＣｊ、ｏ、ｏｉｚＭクエン酸ソーダを含む
水溶液を言う。コＸ５ＳＣとはその２倍の濃度のものを
言う。）中で約２０秒間中和し、さらにＪｘｓｓｃ中で
２０秒間処理する。室温で１時間風乾後、１０℃で３時
間風乾し、変性した７アージＤＮＡをニトロセルロース
紙上に固定する。

このようにして作成したニトロセルロース紙上のファー
ジＤＮＡに対し、先に述べたようにして放射標識された
ヒトインターフェロン−β０ＤＮＡを探針としてハイブ
リダイゼーションを次のように行った。

ニトロセルロース紙をＪＸ８ＳＣ’中でＡ　ｊ　℃、３
０分間処理し、ＪＸＳ８Ｃに０．コチポリビニルビロリ
ドン（牛丼化学社製）、０．λ嗟つシ血清アルブミン（
岩井化学社製）、０．コ嚢フィコ−＃　（Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ　Ｆｉｎ・Ｃｈｅｍｉｃａ１社製）を加え九溶液
中で４１Ｇ、４０分間処理する。さらに／　Ｍ　ＮａＣ
ｊ、　ＪｒｏｌｎＭ　Ｔｒｉｍ　−ＨＣｊ　（ｐＨ１，
０）、／　ＯｍＭ　ＢＤＴＡ　％０．　／　’Ｉｋ　Ｓ
ＤＳ、　１００μり／ｄの超音波処理し１熱涙性した大
腸菌ＤＮＡを含む中７゛ 溶液１Ｉｌｌ（ハイブリダイゼーション溶液）ＡＡｊ”
ｃ、、ｔｏ仕分間処理をすることによジノ・イブリゼー
ションのための前処理とする。

一方、放射標識された探針のＤＮＡを２ｌ℃、１０分間
の処理をすることにより熱変性させてν〈。次に、前処
理し九ニトロセルロース紙ト、この黒変性した探針のＤ
ＮＡとを上記ハイブリダイゼーション溶液中、４ｊ’Ｃ
でインキユベートシ、ハイブリダイゼーションを行う、
／、２−１１時間後、ニド四セルロース紙を取り出し、
まずコｘｓｓｃで２回洗い、ＱＪ　ｘ　Ｓ　８０％ｏ、
ｉ＊８ＤＳを含む溶液中で４１℃、４０分間の処理を一
回行い、最後に１０℃で１時間風乾させ、Ｘ線フィルム
を用いてラジオオートグラフィーを行う。

参℃に保存しておいた殊天板と、ラジオオートグラムと
を重ねあわせることにより探針と会合した部分の７７−
ジをか１！堆や、さらに上記の操作を繰返し行うことに
より、インターフェロン−１ＯＤＮＡＫ金合するＤＮＡ
を持つ組換え体ファージを単一りｐ−ンに壕で精製する
。

このようにして、約１００万儂のファーシブ２−りをス
クリーニングすることにより１１個のクローンを得た。

次に各り１：ｌ−７ｆ）組換え体Ｄ　Ｎ　Ａ　１ｋＭａ
ｎｉａｔｉｇの方法［Ｃｓ１ｌ、ｌＪ、　４１７−７０
／（／９７１））によシ調製し、以下の解析に用いた。

まず、各クローンの組換え体ＤＮＡを制限酵素ＥＯＯＲ
１で切断し、アガロースゲル電気泳動により生じたＤＮ
Ａ断片の鎖長を測定する。すべてのクローンのＤＮＡの
消化物はベクターであるファージλＣｈａｒｏｎ　ｕ　
Ａのアームに由来するλｏ　Ｋｂ、　ｉｉ　ＫｂのＤＮ
Ａ断片を持つが、それ以外にヒト染色体内ＤＮＡに由来
するいくつかのＤＮＡ断片を持つ。この解析によｇｉｉ
個のクローンは３種類に分類された。さらに上述のスク
リーニングのときに用いたヒトインターフェロン−βＣ
ＤＮＡを探針としてサザンハイプリダイゼーシｌン（Ｂ
Ｏ，ｔｈ＠ｒｎ　、　Ｊ、　ｕｏｌ、Ｂ１１１、ぴ、！
０Ｊ−１／７（／デフｊ）〕を行なうことによ）、たと
えばｘｃｏＨ１消化によシ得られたどの長さのＤＮＡ断
片がヒトインターフェロンｃＤＮＡＫ会合するかという
ことが同定された。

すなわち各ファージクローンのＤＮＡをＩＣＱＯＲＩで
消化し、アガロースゲル電気泳動を行う。泳動後ゲルを
切り出し、Ｏ，ｔＮＮ＆ＣＩＨ％／Ｍ’Ｎ＆’Ｃ１を含
む水溶液中、室温で３０分間処癲することによりＤＮＡ
ｔｉｃ性する。さらに０．　ｊ　Ｎ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　（１）Ｈ７０）、／、　ｊ　Ｍ　ＮａＣｊを含む水溶
液中で同様の処理を２回くり返し行い、ゲルを中和する
。ゲルをコ０ｘｓｓｃをしみ込ませた一紙上Ｋｔき、ゲ
ルの上にニトロセルロース紙を置き、さらにその上にＦ
紙、紙タオルの順に重層し、ゲル中の変性したＤＮＡを
ニトロセルロース紙に吸着させる。／２−／１時間彼ニ
トロセルロース紙をゲルからはがし、１０℃で３時間風
乾することにより５Ｉ）ＮＡをニトロセルロース紙上に
固定する。以下は上述したファージのスクリーニングＫ
ｌｉして行ったと全く同様にしてハイブリダイゼーショ
ンを行なう。

このようにしてクローン化された１種類のヒト染色体遺
伝子断片のうち４ＩＳｍが／、　ｔ　Ｋ　ｂの”ｃｏＲ
ＩＫよって生ずるＤＮＡ断片（以下”ｃｏＲ１断片とい
う）を含み、この／、　Ｉ　Ｋ　ｂの”ｃｏＲ１断構°
造を持つ讐いることが明らかになった。他の／種ｌｌの
クローンについては、この／、ｒＫｂのＫａｏＲ１断片
の途中から始まるＤＮＡ断片を含んでいることが明らか
になった。

ｉｉ個のクローンのうち／、　ｔ　Ｋ　ｂのＥｃｏＲＩ
断片を生ずるものの７つで鼠るλＨＩＦＮ−β、　−／
λ／と名づけられたクローンについては、さらにＨｌｎ
ｄ　ｌ、　ＢａｍＨ’Ｉ、ｎｇｌｌ、Ｐ＠ｔｌなどの制
限酵素を用いて同様の実験をｉう゛ことにより、制限酵
素による切断地図を作成したンこれを路１図ａに示す− 性を示すｔｔ　Ｋ　）のＩｃｏＲＩ断片について詳細に
検討を加える目的で、このｔＩＫｂのＫａｏＲＩ断片を
プラスミドｐＢＲＪＪコをベクターとして再びクローン
化した。この方法を以下に示讐。

λＨＩＦＮ−β、−／Ｊ／　ＤＮＡ　／ｌ’ｆを制隈酵
累ｆｆ１ｃｏＲＩで消化した後、０．１Ｍリン酸カリウ
ム１Ｉｋｌｌｌｉ液（ｐＨＬす）、４　ｍＭ　ＭｙＣｌ
ａ、４ｍＭメルカプトエタノ−／ｌ／、／ｍＭＡＴＰ、
／ｍＭＴＴＰを含むＪＯ〜の水溶液中で！ユニットのＤ
ＮＡＭａ？・１ｍ社製）を用いて、１ｏｏＲＩ切断箇所
を修復する。フェノールで除蛋白した後、ターミナルト
ランスフェラーゼを３０〜の反応液（ＤＮＡ　／声ｔ：
カコジル酸カリ（Ｉ）Ｈ７乙）０、　／参Ｍ；トリス０
．　ＯＪ　Ｍ　；ジチオスレイトール０．１　ｍＭ　；
　ＣａＣ２，／ｍＭ　；　ｄｃＴＰ　／ｍＭ　：コユニ
ットのターミナルトランスフェラーゼ〕中で３７℃、Ｉ
ｊ分間反応させ、各］１ｊｃｏＲＩ断片の３Ｍ両端に約
１００個のデオキシシチジン鎖を嬌デオキシグアニン鎖
を延長して作つ九ベクターを準備しておく。このように
して得られ九ヒト染色体遺伝子ＤＮＡのＥｃｏＲＩ切断
片０．０！Ｉ’ｆとｐＢＲＪ２２ＤＮＡＯ，０Ｊ１１ｆ
とを０．７Ｍ　Ｎａｃｚ。

ｊｏｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ（ＰＨ７７）、ｊｆｆｉＭ］
１ｉＤＴＡよりなる溶液中で４１”ｃ、−分間、参ｊ℃
、７時間、３７℃、１時間、室温、１時間インキュベー
トして会合させる。これに］Ｃｎ・亀らの方法［Ｊ、　
Ｍｏｊ、　Ｂｉｏｌ、ｑ　、　４４りｊ−！０り（／り
７ｊ）〕に従って大腸菌χ１７７４を形質転換させる。

得られ九テトラサイクリン耐性株の中から、ＷＯＯ個の
耐性株を選び各々のＤＮＡをニトロセルロース紙上に固
定する（　Ｇｒｕｎａｔ・１ｎ−Ｈ（＋ｇｎｅｓ−法、
ｐｒＯＣ，Ｎａｔｌ、　Ａｅａ東Ｓ　Ｏｉ、　ＵＳＡ１
％Ｊり６／−３２４！（／り７り〕。このニトロセルロ
ース紙上で上記ファージのスクリーニングあるいはサザ
ンハイプリダイゼーションのときに行なつ九のと同様の
方法（ハイブリダイゼーション溶液中に熱アルカリ処理
して断片化し、さらに熱変性したｐＢＲＪＪλＤＮＡを
ＪＯμｔ／−の濃度で加えた。）で、同じ探針（インタ
ーフェロン−βｅＤＮＡ）を用いてハイブリダイゼーシ
ョンを行い、／、ＩＫｂの１ｃｏＲＩ断片を持つ組換え
体プラスミドをもつ大腸菌株を同定゛し喪。

このようにして得九大腸曹からヒトインターフェロン−
βＣＤＮＡＫ金合する組換え体ＤＮＡを含む／、　Ｉ　
Ｋ　ｍ）のＫｃｏＲＩ断片を持つ組換え体プラスミドＤ
ＮＡを前記ＣｕｒｒｉｅｒとＨ＠５ｔｅｒノ方法で調製
し、以下の解析に供し九。

このヒト染色体ＤＮＡに由来する／、　Ｉ　Ｋ　ｔ）の
１！ｉＣ□Ｈ１断片がヒトインターフェロン−βのメツ
−・、ンジャーＲＮＡに相補的なりＮＡを含んでいるこ
とは、以上で明らかであるが、そのことをさらにはつき
シさせる目的で、制限−巣による切断地図を、組換え体
プラスミドのＤＮＡあるいはその一部を／ＩＩＩ［ある
いはコ種類以上の制限一本で切断する方法によシ、ｉ九
はＪ１末端をポリヌクレオキナーゼを用いて［ＪＪｐ］
で標識し九断片を制限酵素で部分消化する方法［ＢＨｌ
ｔｈとＢｉｒｎｓｔｉ＠１、Ｎｕｃｌｅｉａ　Ａａｌｄ
ｓ　Ｒ・−Ｌ％λＪｔ７−λＪりＩ（／デフ４）〕によ
シ生じ九ＤＮＡ断片の鎖長をアガロース電気泳動などＫ
よシ測定することにより作成したｅ（絡１図ｂ％ｄ）第
１図Ｃにインターフェロン−β０ＤＮＡの対応する部分
を示し九が（白枠は蛋白コーディング領域を示す）、０
ＤＮＡと全く同一の制限酵素切断地図を示す部分がある
ことが発見された。

以上の事実から、ここで得られたヒト染色体ＤＮＡ由来
の／、ＩＫｂ　ＫｃｏＲＩＤＮＡ断片上に、ヒトインタ
ーフェロン−βメツセンジャーＲＮＡ（すなわちＣＤＮ
Ａ）と全く同一の配列のあること、すなわちこの／、ｆ
Ｋｂ　ＥｃｏＲｉ　ＤＮＡ断片がヒトインターフェロン
−βの染色体内遺伝子（第１図すの黒い帯）を含んでい
ることが明らかになつ九。

さらに他の多くの真核細胞の遺伝子中に存在スルインタ
ービーニングシークエンス（介在配列）カヒトインター
フェロンーβの遺伝子に関して存在しないことが明らか
Ｋなつ九。得られ九／、　ｔ　ｘ　ｂ　ＫｃｏＲＩ断片
中に含まれているインターフェロン−β遺伝子が介在配
列を持っていないということは、この遺伝子ＤＮＡを用
いて、介在配列を切シ出すメカニズムのない、例えば犬
ＩＩｊＪｍなどの原核生物にインターフェロン蛋白を合
成させることが可能であることを示している。

上記のことを決定的に証明する目的で、この／、Ｉ　Ｋ
ｂＥＣＯＲ＋　断片の塩基配列をＭａｘａｍ　とＧ１１
ｂｅｒｔの方法（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ、　
Ｓｃｉ、　ＵＳＡ７μ、！６Ｏ−ｊＡ＄（／り７７）〕
により決定した。その結果をｗ、２図に示す。

この／、ｌ’Ｋｂ　ＥｃｏＲｌ断片は大腸菌に挿入し、
米国アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに
Ｅｅｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＣＪ４Ａ　ＡＴＣ
ＣＪ／りＯｊとして寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図ａは、λＨＩＦＮ　−Ｂ／　−／　、２　／にク
ローン化された／ｊＫｂ染色体ＤＮＡ切片の制限酵素地
図を示す。図中断続線はＣｈａｒｏｎ　夢Ａからのベク
ターＤＮＡの腕を示す。 第１図すおよびｄは、ヒト染色体ＤＮＡに由来する／、
　ｆ　Ｋ　ｂのＥｃｏＲ１断片の制限酵素地図を示す。 図中無い帯はメツセンジャーＲＮＡがそこから転写され
ることを示す。 第１図Ｃは、ヒト染色体ＤＮＡ中のインターフェロン−
Ａｃ　ＤＮＡに対応する部分を示す。図中白枠は蛋白コ
ーティング領域を示す。 第１　［１ｓ　ｔｄ、配列決定の始点と方向を示す。図
中矢印は分析した各面分の配列の方向および広がりを示
す。 第１図中の記号は、下記文献に記載された制限酵素を示
す。 ＥｃｏＲｌ　　：　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｍｏ１．Ｂｉｏ
ｌ、７Ｊ７（／り７４Ａ）Ｂｑｌｌ　：　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　Ｊ、／７４（７（／？７
ｊ）Ｈｌｎｄｌ　　：　　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏ’１．、
ヱＪ、ＪＪ／（／り７１）Ｂ電ジ、１１コ〔Ｉ巳［１：
　　Ｊ、ＭｏＬＢｉｏＬ、　工１：ｉ：；ｊ１１、１２
３（／　タフ　ｊ）Ｐ８ｔ　　ｌ　　：　　Ｎｕｃｌｓ
ｉｃ　Ａｃ′−ａｓ　　Ｒｅａ　、Ｊ、Ｊ４ＩＪ（／り
７６）Ｐｖｕｉｌ　　：　　Ｇｏｎｅ　　Ｉｆ、３コタ
ーＪＩＩＪ（／Ｐ１０）Ｈｉｎｆｌ　　：　　Ｊ、Ｍｏ
ＬＢｉＯｌ、、／１０％λり７（／り７７）Ａｌｕ　ｌ
　：　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、　１０２、／！７（／
Ｐ７４）Ｈａｓ　ｌ　　：　　ｌ　Ｖｉｒｏｌ、、１０
，４７コ（／り７コ）Ｔａｑ　　ｌ　　：　　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、８ｃｉ、ＵＳＡ、７ＬＪｐ＊（
ｙり７７）Ａｖａ　ｌ　　：　　Ｂｉｏｃｈｓｍ、Ｊ、
、　ノーＬｔ１３／７（／り７６）Ｈｌｎｌ　　：　　
（）ｑｎｑ　ｔ、３２ター３参３（１９１０）ＥｃｏＲ
ｌ　　：　　Ｎａｔｕｒｅ　　Ｎｅｗ　Ｂｉｏｌ、、Ｊ
＄五、７（／り７３）第λ図ＩＦｉ、／、　Ｉ　Ｋｂ　
ＥｃｏＲｌ断片の塩基配ミリを示す。図中子ｌ〜＋ｊ６
１はヒトインターフェロン−βの蛋白質をコードする部
分を示し、−７３〜−７５の矢印は転写開始部位を示し
、下線はＴＡＴＡボックスを示す。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）　　ヒト染色体由来のヒトインターフェロン−β
   遺伝子。
2. （２）ヒト染色体由来のヒトインターフェロン−β遺伝
   子および該遺伝子の転写の調節に関与するＤＮＡを含む
   ＤＮＡ０
3. （３）　　ヒト染色体由来のヒトインターフェロン−β
   遺伝子および該遺伝子の転写の調節に関与するＤＮＡを
   含むＤＮＡとベクターＤＮＡとの組換え体ＤＮＡ。
4. （４）該ベクターＤＮＡが大腸菌由来のλファージ、Ｃ
   ｈａｒｏｎ系ファージ、グラスミドｐＢＲｊＪ、２゜ｐ
   ＣＲ／１ｐＭＢりおよびｐ　８　Ｃ／から選ばれる特許
   請求の範囲纂Ｊ項記載の組換え体ＤＮＡ０