JPS61158791A - 完全遺伝子の単離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、あるゲノムから機能的に完全な遺伝子を直
接取得することに関する。その遺伝子は遺伝子産物の発
現に適しているものである。

更にこの発明は、単一工程でゲノムから完全遺伝子を剪
断する方法およびこうして得られた遺伝子をクローニン
グする方法に関する。

〔従来技術とその問題点〕

本発明者らは、以下に述べるように単一工程で完全に機
能を有する遺伝子を取得する新規な方法を初めて開発し
た。従って、本発明者らが知シ得ていて、この発明と直
接比較し得るような従来技術というものはない。しかし
、現在では遺伝子をクローニングする手段として、クロ
ーニングのためのＤＮＡ調製には次の３つの方法の１つ
が利用されている。（１）メツセンジャーＲＮＡから相
補的なりＮＡ（ｃＤＮＡ）を調整する（すなわちｍＲＮ
Ａ　ｔ−ＤＮＡにコピーする）、（２）ｆツムＤＮＡを
不規則な断片に剪断する。および（３）制限エンドヌク
レアーゼを用いてゲノムＤＮＡを再生産可能な断片に剪
断する。

一度ＤＮＡ断片を調整すれば、後はそれをウィルスのま
たはグラスミドのベクターに繋げればよい、そこで、そ
のＤＮＡ断片が再生産される。

そのＤＮＡがタンノ々り産物を指令する遺伝子を含む（
はとんどの場合とれはＤＮＡクローニングする商業上の
第一義的な理由であるが）ならば、その遺伝子を含むク
ローンを検出するために目的のクローンによるタンパク
またはタンノ９りの一部を発現（生産）させることが試
みられる。

これらタンパク生産物を検出するために一般的に用いら
れる方法は、そのタンパク生産物に特異的な抗体を結合
させることである。

ｃ　ＤＮＡ手法は、クローニングのためにＤＮＡを調製
するうえでもっとも一般的に使用されているが、次のよ
うな限界がある。（１）はとんど全ての場合遺伝子の一
部しかクローニングされない。

（２）クローニングされた遺伝子断片が、通常タンノ４
りのカルボキシ末端を指令する部分に偏っている。（３
）この手法は、ｍＲＮＡが容易に手に入るかどうかに係
わっているが、そのｍＲＮＡはほとんどの場合ある組織
または生活環の段階でだけ合成されるので得難い。

この発明は、単一工程て完全な遺伝子をクローニングす
ることによりｃＤＮＡの抱える問題に決着を付けた。こ
れによれば完全遺伝子作成に要する時間が節約される。

もちろんその遺伝子は、ｃＤＮＡをクローニングしたの
ちに得られるものであるが、クローニングのＤＮＡを調
製するだめの制限エンドヌクレアーゼ法が取られ、クロ
ーニング工程を繰返す必要がある。クローニングの検出
法がタンノ々りのカルボキシ末端に現われる構造に縛ら
れる場合があるが、完全遺伝子をクローニングするこの
発明の方法ではその問題は生じない。この具体例として
細胞表面抗原が挙げられるが、その場合免疫系はタンパ
クのアミン末端に対する抗体のみを産生ずる。

最後にこの発明の方法によれば、入手し得る生物試料中
にあるｍＲＮＡの量に比例するというよシもゲノム中の
遺伝子のコピー数に直接比例してその遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片が調製される。このような利点からあるタンパク
の遺伝子をクローニングするときの問題が解決を見る。

あるタンノ臂りというのは、限られた量しか存在しない
か、または試料細胞に少量しか産生されない、および感
度のよい検出法でしか検出されないタンパクである。

他の２つの一般的に使用されている手法にはｃＤＮＡ法
の欠点は伴わないが、その代わシそれ独自の欠点がある
。ランダム剪断法にはｍＲＮＡが必要ではないという利
点はあるが、ｃ　ＤＮＡ法同様しばしば遺伝子の一部の
みしかクローニングされない。またこの方法では、使用
されるＤＮＡ断片の大きさが小さいので、遺伝子を見つ
けるために数多くのクローンを調べなければならない。

クローニングのだめのＤＮＡを調製する制限エンドヌク
レアーゼ法は、全体の遺伝子をクローニングするｅＤＮ
Ａ法およびランダム剪断法に対して通常第２の工程を必
要とする。その方法ではクローニング遺伝子を直接用い
ることができるかもしれないが、約１００ｆｉｌの中か
らたった１つの酵素を見出だすために数多くの制限酵素
を試してみなければならないという欠点がある。そのた
った１つの酵素とは、ＤＮＡを正しい位置で剪断し、遺
伝子またはその一部をクローニングベクターが発現させ
られ得る状態にするものである。この理由は、制限酵素
がＤＮＡ中の特定の４ないし６塩基対を特異的に認識し
、認識配列が存在する所はどこでもゲノムＤＮＡを剪断
するという点にある。ＤＮＡ塩基配列は安定なのでこれ
らの剪断部位は一定している。多くの遺伝子が存在する
ため、遺伝子産物を発現させ得る形でＤＮＡ断片を含む
遺伝子を剪断する適当な酵素を見出だすことは不可能で
あろう、またたとえ不可能とはいわなくても難しい。

〔問題点を解決する手段〕

この発明は、遺伝子の指令領域の先端および後端から１
００塩基未満のところの特定部位で先ず始めにＤＮＡを
剪断することにより従来技術を凌ぐ利点を提供する。そ
れは遺伝子内で無秩序な剪断を起こすことではない。こ
の結果、遺伝子の断片や小さな部分とは異なる完全な遺
伝子を含むＤＮＡ断片が生じる。クローン混合物の中に
適当なりＮＡ断片が生じる頻度は、利用できるｍＲＮＡ
の量というよシもゲノムの遺伝子コピー数およびＤＮＡ
の大きさに依存している。更に、剪断部位が遺伝子の開
始点に接近しているほど、そのＤＮＡが多くの発現ベク
ター内で遺伝子産物の発現に好適となる。また、ある塩
基配列が特異的に剪断されず、むしろＤＮＡ内の構造が
認識されある塩基の長さ内である程度無秩序な剪断が生
じる。それにより、目的のＤＮＡに遺伝子産物を発現さ
せるために正しいフレームを読ませる数多くの発現ベク
ターが抱える問題の解決を見る。この発明は原核生物の
ゲノム同様真核生物のゲノムにも適応でき、因って一般
的な応用が可能である。

従って、機能的に完全な形で単離された遺伝子を取得す
ることがこの発明の１つの目的である。

また別の目的としては、単離された完全遺伝子をクロー
ニングすることである。

更にもう１つの目的は、完全遺伝子または遺伝子断片か
ら遺伝子ライブラリーを提供することである。そのライ
ブラリーは前記の完全遺伝子またはそれの再構成組換え
体に由来する。

また別の目的としては、クローニングされた遺伝子から
遺伝子産物を含む有用な高分子を取得することである。

更に別の面から見るとこの発明の目的は、単一工程で完
全遺伝子を取得することである。その工程とはゲノムＤ
ＮＡをヌクレアーゼおよび変性剤を含む混合物で処理す
ることである。

これらの目的および利点はこの発明によシ達成される。

この発明の特徴は、機能的に完全な遺伝子およびその遺
伝子の単離方法にある。その単離方法は、遺伝子材料を
その遺伝子材料から前記遺伝子を切り出すに足る量の単
鎖ヌクレアーゼおよび変性剤で処理する工程からなる。

この発明を実施するために遺伝子を含むいかなる材料も
使用することができる。ゲノムまたはゲノムＤＮＡは、
前記完全遺伝子が得られるような材料の好例である。完
全遺伝子が得られるＤＮＡは、原核生物または真核生物
、手を加えていないＤＮＡまたは組換え体、天然または
合成若しくは他のいかなる形態であれ、それが完全遺伝
子をその中に含んでいる限りそれらのどれであってもよ
い。

使用に適したヌクレアーゼとしては、市販品として手に
入るヤエナリヌクレアーゼ（例えば、ファルマシアＰ−
Ｌバイオケミカルズ社、ニューシャーシー州、ピスカタ
ウェイ）のような単鎖ヌクレアーゼがある。酵素はＤＮ
Ａを剪断するに足る量にて使用される。例えば、ＤＮＡ
　１μｇ当り酵素１単位を使用する。しかし、反応条件
に応じて０．５ないし２単位ぐらいであって本よい。

酵素活性は業者（例えば、ファルマシアＰ−Ｌパイオケ
ミカルズ社）により規定されたようなものがある。

他のヌクレアーゼとして「ヌクレアーゼ（Ｎｕｅｌｅａ
ｓｅａ）　Ｊ　（リンおよびロパート編、ニューヨーク
州、コールドスプリングハーバ−（１９８２））に記載
されたものがある。そこに記載されているもののうち特
に関心のある記事は［単鎖特異的ヌクレアーゼ（Ｓｉｎ
ｇｌｅ　５ｔｒａｎｄ　５ｐｅｃｉｆ１ｃ　Ｎｕｅｌｅ
ａｓｅｓ　）　Ｊ（シシドおよびアンドウ１６７頁参照
）である。

この発明を実施するときに用いる変性剤としては、アミ
ド特に反応混合物中的５％ないし６５襲の濃度範囲のホ
ルムアミドが適している。別の変性剤の例としてそれぞ
れ５０％、３０％および２％までのジメチルスルホキシ
ド、ジメチルホルムアミドおよびホルムアルデヒドが挙
げられる。適当な変性剤がウェル等、グログレス・オプ
・ヌクレイツク・アンド・リサーチ（Ｐｒｏｇ。

Ｎｕｅｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒ＠ｍ、）、２４．１６７（１
９’８０）に記載されている。

反応混合物は、−約４．２〜４．８の緩衝液である。

好ましい緩衝液は、約０．２ＭのＮ＠（：４１１　ｍＭ
のＺｎＳＯ４、および３０ｍＦｉｌｌの酢酸す）　ＩＪ
ウムから成る（ｐＨ４，６）。

遺伝子または発現産物という言葉は、メツセンジャー、
トランスファー、可溶性およびり？ンームＲＮＡ　、ペ
グチド、ポリペプチドまたはタンノ譬り、および前記（
プチドまたはタンノ９りに対して作られた抗体を意味す
る。部分断片、組換え体、またはいかなる形の再構成分
子もこの発明に含まれ、それらはこの発明に従って得ら
れた完全遺伝子に由来するものである。

典型的なりエナリヌクレアーゼ反応は、ゲノムＤＮＡ　
１μを当シ酵素１単位を含む全容１００μｌのｐＨ４，
６の緩衝液（０，２ＭのＮ＠Ｃｔ１１ｍＭのＺｎ８０４
、および３０−の酢酸ナトリウム）中にて２０〜４０分
間、ホルムアミド濃度をいろいろ変えて（好ましくは容
積比で約２０％〜５０％）、約５０℃で進行させる。上
記の反応混合物中にて十分な時間、通常３０分間インキ
エペーシ璽ンする。

続イて、その溶液を約０．０１Ｍのエチレンジアミン四
酢酸（ＥＤＴＡ　）で４倍に希釈し、当該分野でよく知
られているようにフェノールで抽出する。

次に、所望の完全遺伝子を含むＤＮＡ断片を、２容の無
水アルコールで前記ＤＮＡ断片を沈澱させることにより
反応混合物から抽出する。沈澱物を一２０℃にて一晩放
置し、それから冷却遠心機中で１０００Ｏｒｐｍ　（１
２０００Ｐ）にて約３０分間遠心する。完全遺伝子を含
む残渣を水に対して８゜−のエタノールで洗い、上清を
捨て、必要ならば再遠心して真空中で蒸発する。更に、
完全遺伝子に相当する乾燥ＤＮＡを一２０℃にて保存す
るか、適当な緩衝液〔例えば、１ｍＭのＮａＥＤＴＡを
含む１０ｍＭのトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）に溶
かすかして次の工程に用いる。その工程とは、例えばク
ローニング、転写、翻訳、電気泳動等である。またそれ
らを他の遺伝子産物または高分子（タンノ々り、抗体等
）を得るために用いる。

または後の使用のために凍結保存しておく。

完全な形で単離された遺伝子のクローニングは、ヤング
およびディビス〔グロシーディング・オプ・ナシ冒ナル
・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、
　Ａｃａｄ、　８ｃｉ、）米国、８０．１１９４゜（１
９８３）およびサイエンス（８ｃｌ＠ｎｅ＊　）　＋　
２２２　＋７７８（１９８３）　）によシ記載された方
法によシ実施することができる。ここで微生物のまたは
酵母のグラスミド若しくはバクテリオファージ等のよう
な適当ないかなるクローニングベクターを完全遺伝子の
クローニングに使用することができる。好ましいクロー
ニングベクターにはλｇｔｌｌが挙げられる。

単離された遺伝子により指令される産物を産生させるた
めまたはそれを検出するためにその遺伝子を発現ベクタ
ーの中に組込んで、ペプチドまたはタン・ｆりの形で通
常前記遺伝子を発現し得る単細胞微生物に導入すること
が望ましい。

このようにして発現されたペプチドまたは夕ｙノ４りを
、一般には免疫的な方法、電気泳動、アミノ酸配列決定
等の標準的な手法により同定する。科学的視点、商業上
の観点、製薬上の立場等から発現産物（例えば、タンノ
４り）の重要性および意義に応じて、発現産物を更に抗
体（モノクローナルまたは？リクロナール）を調製する
ために用いられる。これら全てはこの発明の範囲と見做
される。

様々な条件下でヤエナリのヌクレアーゼ消化の結果を解
析するために、サザン〔ジャーナル・オプ・モレキュ２
−・バイオロジー（Ｊ、　Ｍｏｌ。

Ｂｌｏｌす、旦、５０３（１９７５）　］が開発した標
準的なサザン法を使用する。未標識または放射線標識し
たグローブが使用できる。

「機能的に完全な」という言葉の意味は、遺伝子に固有
（例えば、転写、翻訳等）の全ての機能を指令し、制御
し、若しくは規定し得るという意味である。

〔実施例〕

ゲノムＤＮＡを一連の一定条件下でヤエナリヌクレアー
ゼを用いて剪断し、そして遺伝子断片をサザン法により
解析した。グラスモディウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）
および他の微生物から単離された遺伝子または合成オリ
ゴヌクレオチドをクローニングして、グローブとして使
用した。

４種の異なったＤＮＡをサデン法のための放射線標識プ
ローブとして用いた。ニワトリβアクチンおよびクラミ
ドモナスに対するｃＤＮＡ　を選んだが、それは対応す
る遺伝子が寄生原虫を含めた幅広い範囲の微生物に見つ
かシ〔クリープランド等、セル（Ｃｓｌｌ）、　２０．
９５（１９８０）およびシルア０一ラ等、セル（Ｃ＠ｌ
ｌ）、　２４　、８１　（１９８１）　）、それらが使
用されたという理由による。一連の様々な剪断条件を特
にホルムアミドの濃度という観点にだって調べた。４０
％ないし４５％のホルムアミド中での反応を解析した結
果を第１図に示す。ここではグラスモディウム（Ｐｌａ
ｓ　−ｍｏｄｌｕｍ）およびアカダブルＤＮＡを様々な
濃度のホルムアミド中のヤエナリヌクレアーゼを使って
消化した。Ｐ、７フルシノ４ルム（ｆａｌｅｉｐａｒｕ
ｍ）およびｐ、ｏフライ（ｌｏｐｈｕｒａｅ）のＤＮＡ
を３０〜４０％のホルムアミド中で消化した。そのＤＮ
Ａをアウエゲーグ装置モデル８５０（アクェデーグ会マ
シーンＯシヲック、ニューヨーク州、アウェゴーグ）を
使って２Ｖ／儂で２２時間０．８％のアガｏ　−スノｔ
　’Ａ　泳動Ｋ　ｍ　ケ、ニトロセルロース膜に移し、
そして放射線標識グローブとハイブリダイゼーションさ
せた。

（Ａ）？デフ法によシ、ニワトリβアクチン遺伝子を含
むグラスミドｐＡ１の放射線標識した断片とハイブリダ
イゼーションさせた。１）４０％ホルムアミド中のＰ、
ノウレジ（ｋｎｏｗｌｅｉｉ）　、２）４５％ホルムア
ミド中のＰ、ノウレジ、３〕４５％ホルムアミド中のア
カダブルＤＮＡ　。

（Ｂ）　　サデン法により、クラミドモナスからのβチ
ーウプリン遺伝子を含む放射線標識したＤＮＡグラスミ
ドグローブβ３７とハイブリダイゼーションさせた。１
）４０％ホルムアミド中のＰ、ノウレジ、２）４５％ホ
ルムアミド中のＰ。

ノウレジ、３）４５％ホルムアミド中のアカダブルＤＮ
Ａ　。

（Ｃ）　　サデン法により、ｐ、　　ロフライのヒスチ
ジンに富むタンパクに対応する放射線標識したオリゴヌ
クレオチドとハイブリダイゼーションサセタ。１）３０
％ホルムアミド中のＰ、ロフライＤＮＡ、　　２）　　
３５％ホルムアミド中のＰ、ロフライＤＮＡ　。

（Ｄ）　　サデン法によりＰ、ファルシパルムの周囲ス
ポロゾイト遺伝子の完全指令領域を含むグラスミドｐｍ
Ｐｆ　５とハイブリダイゼーションさせた。

１）３５％ホルムアミド中のＰ、ファルシパルムＤＮＡ
、　　２）　４０％ホルムアミド中のＰ、ファルシノ！
ルムＤＮＡ、４５％ホルムアミド中にて剪断した後Ｐ、
ノウレジのＤＮＡをサザン法により解析したところ、１
．６ｋｂ（キロ塩基）の位置にアクチングローブとハイ
ブリダイゼーシヨンする密度の高い単一断片を示した（
第１図Ｂ）。２．６ｋｂ　（キロ塩基）の位置にデータ
プリングローブとハイブリダイゼーションする密度の高
い単一断片を示した。これらの断片は、対応する産物を
指令するに適した大きさであった。４０％ホルムアミド
反応物中にもグローブに対応する断片を含んでいたが、
よシ太きかった。

Ｐ、ロフライのヒスチジンに富むタンパク（ｌ（ＲＰ）
〔キレジャン、ジャーナル・オプ・バイオロゾシ百ナル
・アカデミツク・サイエンス（Ｐｒｏｅ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃ’ａｄ、　Ｓｃｉ、）　ＵＳＡ、　８
０．　１８６７　（１９８３）　）が記載しているよう
にヒスチジンコドンの３組塩基が５つ繋がった配列から
なる放射線標識されたオリゴヌクレオチドを用いて調べ
た。Ｐ、ロフライからのＤＮＡ　（精度９５％以上）を
、３０％、３５％および４０％のホルムアミド中のヤエ
ナリヌクレアーゼで消化した。３０％および３５％の反
応物を解析したところ、２．２　ｋｂの位置にバンドが
確認された（第１図Ｃ）。これは、ワラツク〔グロシー
ディング・オプ・ナショナル・アカデミツク・サイエン
ス（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃ１ｄ。

ａｃｔ、　）　ＵＳＡ、８０．１８６７（１９８３））
により記載されたｍＲＮＡと同じ大きさであｆｉ、ＨＰ
Ｒを指令し、オリゴヌクレオチドプローブとハイプリダ
イデータＷ／した。再びヤエナリヌクレアーゼを用いて
１遺伝子の大きさの断片に剪断した。

周囲スＩロゾイド（ＣＳ　）タンパク遺伝子を、グロー
ブとしてクローンｐｍＰｆ　５を用いて調べた。

そのクローンはディン等〔サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ
　）　ｚ　８月号、１０頁、１９８４年〕が記載してい
る遺伝子の完全指令領域を含む。サデン法によると、３
５％ホルムアミド反応では１．３　ｋｂの位置に１本の
主要バンドおよび少々大きめの位置に１本の密度の低い
バンドが認められた。続いて、これら３つの断片をクロ
ーニングした。これらに関する塩基配列のデータを以下
に示すが、上記のディン等の論文にも記載されている。

ヤエナリヌクレアーゼによる剪断位置を決定するために
、ヤエナリヌクレアーゼ消化により生じた断片をクロー
ニングして塩基配列を決定した。これは、第１図りに示
した３５％および４０％ホルムアミド中のヤエナリヌク
レアーゼ反応から得た等量のＤＮＡアリコートを集めて
実施し、それらを発現ベクターλｇｔ　１１に組込んで
完了した。クローンを含む二十万個の挿入片ヲ、ｐ、　
　ファルシノ！ルムのＣＳタンパクに特異的なモノクロ
ーナル抗体を用いて免疫的にスクリーニングした（上記
ディン等）。３５個の陽性クローンの中から７個を詳し
く解析した。第１図りに示したようにサデン法解析によ
υ検出された断片は全てこの群に見出だされた。３個の
クローンは２．３ｋｂ断片を含んでいた（３５％ホルム
アミド反応、第１列）。まだ３個は１．３ｋｂ断片を、
１個は１．３５ｋｔ、断片を含んでいた（４０チホルム
アミド反応、第２列）。続いて２．３ｋｂ断片のＤＮＡ
配列を決定した（上記ディン等）。

３５僑ホルムアｉド反応から得られた２、３ｋｂ断片は
、遺伝子の開始部位までの５′側約８０　ｈｐおよび３
′側から後の約１０００　ｂｐを有してい念。他のクロ
ーンの５′および３′末端双方の配列を決定し、２．３
ｋｂ断片の配列と比較した（第２図）。第２図は、Ｐ、
ファルシノぐルムの周囲プロトシイトタン／４’り（Ｃ
８Ｐ）遺伝子におけるヤエナリヌクレアーゼ剪断部位を
示す地図である。指令領域を四角で囲み、非指令領域を
実線で示した。３５チホルムアミド中での剪断部位１を
矢印で示した。４０％ホルムアミド中での主要な剪断部
位Ｃを大きな矢印で示した。４０チホルムアミド中での
主要でない剪断部位すを小さな矢印で示した。ヤエナリ
ヌクレアーゼで処理したＰ、ファルシノ々ルムのＤＮＡ
挿入片を含むバクテリオファージλの遺伝子ライブラリ
ーは、以下に記するようにλｇｔ　１１ベクターの中で
構成されている。

Ｃ８Ｐ遺伝子を含むクローンをモノクローナル抗体を使
って免疫的て選択した。いくつかのクローンの末端の両
側までのＤＮＡの一次配列を示す。

配列の各線の後に付した数は、Ｃ８Ｐ遺伝子の全配列中
のこのヌクレオチドの位置を配列の下線部は、クローン
ａ　（ｐｍＰｆｌ）　：クローンｂ　（ｐｍＰｆｌ５）
；りＣ１−７１！　（ｐｍＰｆ５．８．１３）の末端の
配列解析から得られたものである。３個の１．３ｋｂ断
片は、遺伝子の開始部位から１０または１１　ｂｐを、
遺伝子の３′末端から２７または３５　ｂｐを有する。

４０％ホルムアミド反応から得られた主要でない１．３
５ｂｐ断片を含む１個のクローンの塩基配列が決定され
た。この断片は遺伝子の先端から５２ｂｐのところで、
後端から６０　ｂｐのところで剪断される。これらクロ
ーンの末端配列は、ヌクレアーゼにより剪断される配列
を示す（第２図）。剪断される５′または３′末端に訃
ける配列の相同性は明らかではない。剪断部位はｄＡ、
　ｄＴに富んでいるが、その部位のｄＡ　、　ｄＴ量は
、遺伝子の両外側に位置する剪断されない周辺部位のそ
れと大差はない。更に、ある領域の５′末端のｄＡ　、
　ｄＴの量は３′末端のそれとさしたる違いはない。

注目すべきことは、剪断が天然状態にあるＤＮＡの構造
に依存しているということである。

大腸菌中で合成されそれから単離されたＤＮＡ配列ヲク
ローニングしても、プラスモデイウムから得られたゲノ
ムＤＮＡと同じ剪断産物が生じる。

クローニングされたグラスモデイウムのりゼソーム遺伝
子をホルムアミド中で剪断すると、小さい方のリボソー
ムＲＮＡ　、　５．８８　ＲＮＡおよび大きｈ方のＩＪ
　／ソームＲＮＡを指令する領域に対応する一定の大き
さの断片を生じる。第３図はクローニングされたプラス
ミドｐＰｂｓＬ７．８の地図を示す、それは、小さい方
のｒＲＮＡ全体、５．８８　ＲＮＡ、訃よびＥｃｏＲ１
剪断部位に挿入された２、２ｋｂの大きい方のｒ　ＲＮ
Ａを指令する領域を有するＰ、ペルグヘイ（ｂｅｒｇｈ
ｓｉ）から得られたｇｅｏＲＩのＤＮＡ断片を含む。第
３図に訃いて、左から右に、Ｐ、ペルグヘイの小さい方
のｒＲＮＡ　、　５．８　Ｓ　ＲＮＢ　、ｂよび２．２
ｋｂの大きい方のｒ　ＲＮＡを指令する領域を示す。（
Ａ）Ｐ、ペルグヘイのす、％’ソーム遺伝子をクローニ
ングした断片中のヤエナリヌクレアーゼ部位。ｐＰｂｓ
Ｌ７．８　ＤＮＡのアリコート０．５μｉ　ｔ−Ｅｃｏ
ＲＩ（第１行）、ヤエナリヌクレアーゼおよびＥｃｏＲ
Ｉで連続的に（第２行）、またはヤエナリヌクレアーゼ
単独（第３行）で処理した。続いて反応で得られた産物
を、１８時間２ｖ／ｃ１ｎにて１．２暢アがロースの電
気泳動に掛け、ＤＮＡを臭化エチジウムで染色して肉眼
で見えるようにした。（Ｂ）クローニングされたＤＮＡ
およびゲノムＤＮＡ　ヲヤエナリヌクレアーゼにより剪
断して得られた消化産物の比較。ｐＰｂｓＬ７．８のＤ
ＮＡ　（第１行）、λＰｂ２７のＤＮＡ　（第２行）を
ここで記載しているようにヤエナリヌクレアーゼで消化
した。

ゲノムＤＮＡ（５μｍりを４０％ホルムアミド（第３行
）および４５％ホルムアミド（第４行）中にてヤエナリ
ヌクレアーゼを使って消化した。産物を、小さい方のｒ
　ＲＮＡサブユニット【対する遺伝子のみを含む放射線
標識したプラスミド（ｐＰｂｓＬ５．６）グローブを使
ってサザン法によシ比較シた。第１行において６．７ｋ
ｂの位置に現われたバンドは、サデン法に由来するｐＢ
Ｒ３２２とこのグローブとをハイツリダイデーシ、ンさ
せて得られ九結果である。第３図のデータは、クローニ
ングされた制限断片を制限ヌクレアーゼまたはヤエナリ
ヌクレアーゼで剪断して得られた産物を示す。クローニ
ングされたりゴソーム遺伝子のヤエナリヌクレアーゼ剪
断産物は、第３図ＢＩＣｆ？ｌ、−ｈて全ゲノムＤＮＡ
から得られたものと直接比較できる。グラスモディウム
由来の主要断片は全て同じ大きさである。これが示唆す
る所は、ヤエナリヌクレアーゼがこのクローニングされ
たグラスモディウムＤＮＡをほぼ定量的に剪断し、ゲノ
ムＤＮＡと同じ大きさの産物が生ずるということである
。クローニングＤＮＡとゲノムＤＮＡ双方が同様に反応
するということは、ＤＮＡは前もってグラスモディウム
のヌクレアーゼによシ剪断されていないとｂうことを意
味する。従って、剪断はＤＮＡの構造に依存するといえ
る。他の生物からのＤＮＡも同様に解析した。

一定の大きさの断片を生ずる剪断は、高等真核生物から
のＤＮＡ　ｉｃ　＞いても一般的に見られる現象であっ
た。吸虫網の原虫マンンン住血吸虫（８ｅｈｉｍｏｔｏ
ｓｏｍａ　ｍａｎａｏｎｌ）のＤＮＡと同様に、アクチ
ンま九はデーウプリングローブとハイツリダイデーシ、
ンする単一の小断片を生じるＤＮＡもある。このことは
この発明が幅広く応用されることを示している。

更に、この発明によシ単離された遺伝子を、遺伝子ライ
ブラリーとして保存できる。例えば、λｇｓ　１１ライ
ブラリーを次のように作成する。

グラスモディウムＤＮＡ（５〜１０μｇ）を、３０チ、
３５チ、４０％ま九は４５％ホルムアミド中にてここで
記載したようにヤエナリヌクレアーゼを使って消化する
。４つの反応のそれぞれから反応物を取シ、０．０１　
Ｍ　ＥＤＴＡで４倍に希釈し、フェノール処理し、２．
５容のエタノールで沈澱させる。各ＤＮＡのアリコート
を、アクチンまたはチ、ウプリンに対応するＤＮＡグロ
ーブを使いサザン法に従って解析した。プローブに対応
する遺伝子犬の断片を含む反応物からＤＮＡを集め、λ
ｇｔ　１１に結合させる材料断片とした。Ｐ、ファルシ
ノルムライブラリーのために３５％および４０％ホルム
アミドの反応産物を集めた。この場合ＤＮＡをフレノウ
断片で処理したが、他のライブラリーを作成するときは
この工程を除くことができる。ＥａｏＲＩ　リンカ−（
ＢＲＩ、）の平滑末端゛を処理した断片に繋げた。Ｅ（
ＩＯＲＩで消化した後、遊離のりシカ−をセファロース
４Ｂを詰めた１、５Ｘ２０ａ１１のカラムを使って大き
な断片から分けた。λｇｔ　１１同士で結合し虎ものは
Ｅ（ＩＯＲＩで消化した。Ｐ、ファルシノ櫂ルム断片を
、調製して訃いたλｇｔ　１１　ＤＮＡ１ＣＴ　４］）
ＮＡリカー　−１！’　（ＢＩ、Ａ）を使って販売元が
進める条件下にて１２℃で一晩績合させた。結合済みの
反応精製物を生体外で感染性ファージに７４ツケイゾン
グした。実験開始時のゲノムＤＮＡ　３μＩから、４Ｘ
ＩＯ個のパツケイージングが観察された。このことは、
ＸｇｚｌおよびＩＰＴＧｔ−補ったＬＢ寒天上に生育す
るＲＹ１０９０細胞上のλｇｔ　ｉ　ｉのβがラクトシ
ダーゼ遺伝子中に入込んだその遺伝子を検出することだ
よって計算できる。、Ｐ、ノウレジのＤＮＡライブラリ
ーも、同じ方法で作成した。只この際、４０チおよび４
５％ホルムアミド中でヤエナリヌクレアーゼにより剪断
した産物を用いた。

この発明の利点の一つは、はとんど完全な遺伝子断片を
含む組換え体ライブラリーを作成することができるとい
うことである。この時ライブラリー中のいかなる遺伝子
の発現もゲノム内のコピー数に直接関係している。この
ことは、目的のタンノーりが容易に手に入らない条件を
考慮すると極めて重要である。というのもその様なタン
パクが微生物の生活環の特定の時期に産生され、大量に
入手できないからである。

完全遺伝子の単離、そのクローニング、それらの操作を
した後にタンパクを産生させること、およびそのタンノ
々りを用いて抗体（モノクｅｉ　−ナル抗体またはポリ
クローナル抗体）を産生させること等は、今やこの発明
だより可能となったが、これらによシパイオテクノロジ
ーの分野で新し一展望が開けることとなろう。その様な
ことは、完全に機能を有する遺伝子を簡単に効率よく単
一反応でゲノムから直接単離できなかりたという理由で
今まで不可能であった。

ヤエナリヌクレアーぜを使りた手法により、グラスモデ
ィウム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）　ｓマンソン住崩吸虫
（Ｓｃｈｉｓｏｔｏｓｏｍａ　ｍａｎｓｏｎｌ）　ｈよ
びコレラ菌（Ｖｌｂｒｆｏ　ｃｈｏｌｅｒａ）のような
微生物から機能を有する完全遺伝子を兄事に単離し得る
ことが分ったが、この事実はこの現象が一般的なもので
あシ互いに関連しているということをほのめかしている
。

【図面の簡単な説明】

ｆａ１図は、ヤエナリヌクレアーゼ消化によシダツムＤ
ＮＡから生じ念ＤＮＡ断片を解析した電気泳動写真図。 第２図は、Ｐ、ファルシノヤルムのＣ８Ｐ遺伝子中のヤ
エナリヌクレアーゼ剪断部位を示す図。 第３図は、プラスミドｐＰｂｓＬ７．８への挿入断片を
示す図であり、４５％ホルムアミドを含む制限条件下で
生じるヤエナリヌクレアーゼによる３箇所の剪断部位と
様々な制限部位を表わしている。 出願人代理人　　弁理士　鈴　江　武　彦図面の浄書（
内容に変更なし） 迫　１日 〜　　　　　　　吟ｑ ｘ　　　　　　　　　　　−ｆ　　　　　酬？　　　　
　　　　　　囚　へ ｐｐｂｓＬ７ｓ　　　ＦＩＧ、３ ｋｂ １、事件の表示 特願昭６０−１６９６４２号 ２、発明の名称 完全遺伝子およびその剪断並びにクローニング法３、補
正をする者 事件との関係　特許出原人 アメリカ合衆国 ４、代理人 昭和６０年１０月２９日 ７、補正の内容 （１）　　明細書第３０頁笛１５行目ないし１６行目で
「を解析した電気泳動写真図。」とあるを「の電気泳動
図。」と補正する。 （２）　　第１図乃至第３図を別紙の通り補正する。 （内容に変更なし）

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. （１）機能的に完全な形で単離された遺伝子。
2. （２）材料のゲノムから直接得られる特許請求の範囲第
   １項記載の遺伝子。
3. （３）クローニングされた特許請求の範囲第２項記載の
   遺伝子。
4. （４）遺伝子産物の発現に適した特許請求の範囲第３項
   記載の遺伝子。
5. （５）前記遺伝子産物が、メッセンジャー、トランスフ
   ァー、可溶性またはリボソームＲＮＡである特許請求の
   範囲第４項記載の遺電子。
6. （６）前記遺伝子産物が、１つ以上の前記ＲＮＡに指令
   されるポリペプチドである特許請求の範囲第５項記載の
   遺伝子。
7. （７）前記遺伝子産物が、前記ポリペプチドから得られ
   る抗体で、それに対して特異性を有する特許請求の範囲
   第６項記載の遺伝子。
8. （８）材料のゲノムを、それから完全遺伝子を取出すに
   足る量の単鎖ヌクレアーゼおよび変性剤を含む反応混合
   物中にて制御された条件下で処理することを特徴とする
   材料のゲノムから完全遺伝子を単離する方法。
9. （９）前記ゲノムがデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である
   特許請求の範囲第８項記載の方法。
10. （１０）前記遺伝子を前記ゲノムから直接単一工程で単
    離する特許請求の範囲第９項記載の方法。
11. （１１）前記ヌクレアーゼがヤエナリのヌクレアーゼで
    ある特許請求の範囲第１０項記載の方法。
12. （１２）前記変性剤がホルムアミドである特許請求の範
    囲第１１項記載の方法。
13. （１３）ヌクレアーゼの量が、ＤＮＡ１μｇ当り約０．
    ５ないし約２ヌクレアーゼ単位の範囲に亘る特許請求の
    範囲第１２項記載の方法。
14. （１４）ホルムアミドの量が、反応混合物の容積に対し
    て約５ないし約６５％の範囲に亘る特許請求の範囲第１
    ３項記載の方法。
15. （１５）ヌクレアーゼの量が１単位であり、ホルムアミ
    ドの量が約３０ないし約４５％の範囲に亘る特許請求の
    範囲第１４項記載の方法。
16. （１６）前記ＤＮＡをｐＨ約４．６の緩衝液中にて約５
    ０℃で３０分間処理し、前記遺伝子を反応混合物中から
    単離する特許請求の範囲第１５項記載の方法。
17. （１７）更に前記遺伝子のクローニングを含む特許請求
    の範囲第１６項記載の方法。
18. （１８）複数の発現ベクターの中にクローニングされた
    複数の機能的に完全な形で単離された遺伝子を含む遺伝
    子ライブラリー。
19. （１９）完全遺伝子の断片、組換え体または再構成物で
    ある特許請求の範囲第３項記載の遺伝子。