DK174748B1 - Fermentor til dyrkning af cellekulturer - Google Patents

Description

DK 174748 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fermentor til dyrkning af cellekulturer på mikrobære-stofenheder i en væske, hvilken fermentor omfatter en beholder i hvilken der er anbragt et rørervaerk med en drivaksel, med hvilken cellekulturerne kan holdes i suspension i beholderen, samt en beluftningsindretning, ved hjælp af hvilken der til suspensionen i 5 beholderen kan føres fint fordelt oxygen.

Til dyrkning anbringes cellekulturer almindeligvis på bærestofpartikler, såkaldte mikrobæ-restoffer ("microcarriers"), med hvilke de suspenderes i en væske, der er indeholdt i fermentoren. For at muliggøre cellekulturernes vækst, tilføres oxygen til suspensionen, oftest v 10 i form af luft.

Oprindeligt tilførte man ganske enkelt luften i den nedre del af fermentoren. De opadstigende luftbobler har dog ført til skumdannelse og dermed til ødelæggelse af cellerne på de øvre bærestofpartikler.

15

For at undgå ødelæggelse af cellekulturerne blev en passiv oxygentilførsel til suspensionen derpå forsøgt, idet man havde udformet fermentorbeholderen i keglestubform, således at den overflade af suspensionen, der var udsat for den omgivende luft, blev større. Oxygenoptagelsen er dog utilstrækkelig ved denne fremgangsmåde.

20

Heller ikke tidligere forsøg på at gennemføre oxygentilførslen i adskilte beholdere eller at indblæse oxygenet gennem en si i suspensionen har ført til det ønskede resultat.

Ud fra det sidstnævnte forsøg har man derefter centralt i fermentorbeholderen indbygget 25 en cylindrisk sipladekurv, i hvilken på en aksialt drejende aksel var anbragt prallplader, som har koniske gennemgangsboringer. De koniske gennemgangsboringer er på hver plade ordnet i modsat retning af hinanden, således, at der dannes pumpebevægelser fra den ene koniske boring til den nabostillede koniske boring ved pladernes drejende bevægelser. Det i sipladekurven gennem akslen tilførte oxygen fordeles meget fint og opløses 30 næsten på grund af de dannede forskydningsbevægelser. Den skumdannelse, der kunne iagttages ved de tidligere fremgangsmåder, undgås på denne måde. Oxygenoptagelsen i suspensionen er dog stadigvæk for lille. Desuden er det nu nødvendigt, at det i hver fermentor forhåndenværende rørervaerk drives fra neden. Af den grund skal der føres en hjulaksel gennem beholderens bund, hvorved der opstår tætningsproblemer, og hvorved 35 der især indtræder en ophobning af bærestofpartikler mellem rørerværkets rørerarms midte og beholderbunden, hvilket fører til ødelæggelse af cellekulturer. 1 WO 85/02195 er der beskrevet en proces til beluftning af en biologisk kultur, hvori oxygen bliver tilført via en oxygenpermeabel membran placeret på en omrørerpropel. Ved at 40 tilføre oxygen på den indvendige side af membranen og dreje propellen samtidigt, hævdes det at kulturen bliver effektivt beluftet. Det ses imidlertid at oxygen kun tilføres kulturen ét sted, hvorved oxygenforsyningen - til forskel fra fermentoren ifølge krav 1 - ikke er optimal i alle dele af reaktoren.

DK 174748 B1 2 I WO 87/05322 er der beskrevet en fermentor, som omfatter et iltningssystem, som er afgrænset fra den resterende væske i fermentoren via en si. Ved at vibrere sien med en høj frekvens udgår man at celler og partikler fra væsken i fermentoren bevæger sig igen-5 nem sien og ind i iltningssystemet. Det ses at til forskel fra reaktoren ifølge opfindelsen tilføres oxygenet i centrum af reaktoren, og ikke i udkanten af reaktoren, hvor det højeste oxygenforbrug finder sted. Herved er oxygenforsyningen - til forskel fra fermentoren ifølge krav 1 - ikke optimal i alle dele af reaktoren.

10 I US 4.238.567 er der beskrevet en fermentor i hvilken en beluftningsindretning er placeret adskilt fra rørerværket. På rørerværkets drivaksel er der placeret perforerede plader, som både bidrager til omrøring i væsken og til findeling af den via beluftningsindretningen tilførte oxygen. Da beluftningsindretningen er placeret adskilt fra røreværket der findeler det tilførte oxygen, er oxygenet fordelt ujævnt i reaktoren, til forskel fra fermentoren ifølge 15 krav 1.

Endelig er der i DE 35 04 748 C2 beskrevet en fermentor af den ovenfor anførte art, i hvilken beluftningsindretningen består af et luftrør med et filter og et porøst luftudladningslegeme, som direkte udmunder i suspensionen. Det porøse udmundingslegeme er anbragt 20 mellem beholdervæggen og rørerværkets ydre omløbsbane, noget nærmere den sidstnævnte. En sådan direkte indførsel af oxygenet i suspensionen er praktisk taget kun mulig, når cellerne er indkapslet. I den kendte fermentor anvendes der derfor kugleformede kapsler med en semipermeabel membran, indenfor hvilke cellerne befinder sig. Med celler, der er indeholdt i kapsler, kan rørerværket drives med et så højt omdrejningstal, at de 25 gasbobler, der er indført direkte i suspensionen, slås i stykker, og oxygenet derved udrøres ensartet i suspensionen. Ved fermentoren ifølge DE 35 04 748 er beluftningsindretningen kun af denne grund anbragt excentrisk udenfor rørerværket, idet der ikke er plads til beluftningsindretningen i midten af beholderen på grund af det deriværende rørerværk.

30 Den foreliggende opfindelse har til formål at tilvejebringe en fermentor, i hvilken også meget følsomme cellekulturer kan bringes i intensiv vækst med på simpel måde indbyggelige midler.

Dette formål er opfyldt med en fermentor af den ovenfor anførte art, hvilken fermentor er 35 ejendommelig ved, at beluftningsindretningen har en svingaksel, der i beholderen er anbragt excentrisk i forhold til rørerværkets aksel i en zone med stor omrøringshastighed og nær kanten af beholderen, og ved at den indeholder en si, som omkranser svingakselen og som danner et hulrum, som fyldes med væske og i hvilken der indføres oxygen via svingakselen, hvilken si forhindrer passagen af bærestofenheder ind i beluftningsindretningen.

40

Ved fermentoren ifølge den foreliggende opfindelse tilføres den oxygenholdige gas via en sibelufter, altså indirekte, til suspensionen. Der er ingen cellekulturer i det hullegeme, der er dannet af sien, hvorfor der ikke er risiko for en skumdannelse. Ved den excentriske anordning af sibelufteren eller sibelufterne i nærheden af beholderkanten forøges oxygen- 3 DK 174748 B1 indførslen i suspensionen i overraskende stor målestok. På det sted, hvor sibeluftningsan-ordningen befinder sig, er den suspension, der er sat i rotation af rørerværket nemlig i en tilstand med højere væskehastighed, således at den væske, der er beriget med oxygen, hurtigt skylles ud af hullegemesien og blandes med den øvrige suspension. Dermed und-5 gås det problem, der tidligere optrådte med sibeluftere, nemlig at der indenfor sien meget hurtigt indtrådte en oxygenmætning, således at der selv ved forhøjet oxygentilførsel til sien ikke kunne opnås forøget oxygenindførsel. Ifølge opfindelsen er der altså opnået en udnyttelse af den ved omrøring i retning mod beholderkanten tiltagende bevægelseshastighed i suspensionen til at forstærke den indirekte oxygenindførsel over en si, hvilket lyk-10 kes, selvom rørerværket på grund af cellekulturernes følsomhed kun må drives ganske langsomt.

Hensigtsmæssigt gås der frem på den måde, at der på en med et vibrationsdrev forbundet svingaksei arrangeres prallplader, der har flere koniske gennemgangsboringer, over hinan-15 den i sien, og at svingakselen er hul til tilførslen af oxygenet. På denne måde sikres en særlig intensiv oxygenindførsel uden skumdannelse.

Siens porestørrelse skal ligge på ca. 100 pm.

20 Ved større fermentorer kan der anbringes to eller flere beluftningsindretninger fordelt over beholdervolumenet.

På gunstig måde undgås derved tætningsproblemer, da rørerværkets drivaksel går ind fra oven i beholderen.

25

Oxygenpartialtrykket i suspensionen kan konstant overvåges ved, at der i beholderen er anbragt en sensor til måling af oxygenpartialtrykket.

på denne måde kan der også udvirkes en nøje regulering af oxygenoptagelsen, idet sen-30 soren kan være forbundet med en reguleringsanordning for oxygenafgivelsen.

Ved flere beluftningsindretninger kan disse være fakultativt slukkelige, hvorved der er tilvejebragt en enkel reguleringsmulighed for oxygentilførslen.

Reguleringen kan nemlig foretages ved, at beluftningsindretningerne alt afhængig af det 35 målte oxygenpartialtryk kan slås til eller fra.

% Nedenfor belyses opfindelsen nærmere ved en tegning som udførelseseksempel:

Fig. 1 viser skematisk i et vertikalt snit én udførelsesform af fermentoren ifølge opfindel-40 sen,

Fig. 2 viser fermentoren fra fig. 1 i snit II, og Fig. 3 viser en detalje III fra fermentoren fra fig. 1.

5 4 DK 174748 B1

Fig. 1 viser en fermentor 1 med en foroven lukket beholder 2, i hvilken cellekulturer holdes i suspension på bærestofpartikler 3, såkaldte mikrobærestoffer, i en væske 4. Det drejer i dette udførelseseksempel om kunststofsmåkugler som bærestofpartikler.

Fermentoren 1 opviser et rørerværk 5 med en rørerarm 6, en drivaksel 7 og en motor 8. Drivakslen 7 falder sammen med omrøringsakselen, om hvilken den af rørerværket 5 fremkaldte drejestrømning forløber.

10 Derudover omfatter fermentoren 1 i det her viste udførelseseksempel fire beluftningsind-retninger 9.

Som det særligt tydeligt fremgår af fig. 2, er beluftningsindretningerne 9 anbragt excentrisk i forhold til omrøringsakselen (drivaksel 7) med indbyrdes afstand. Beiuftningsindret-15 ningeme 9 er anbragt tæt ved kanten af beholderen 2.

Som det særligt tydelige fremgår af fig. 1 og fig. 3, er beluftningsindretningerne titdannet som såkaldte slbeluftere. Til dette formål opviser en sådan beluftningsindretning 9 en til et cylindrisk hullegeme tildannet si 10, i hvilken flere prallplader 11 er anbragt over hinan-20 den. Prallpladerne 11 er forbundet med hinanden via en svingaksel 12, som er anordnet aksialt i forhold til sien 10, Svingakselen 12 er anbragt med sin øvre ende i et vibrationsdrev 13, som sætter svingakselen i aksial retning i højfrekvente svingninger. Svingakselen 12 overfører disse vibrationer til prallpladerne 11.

25 Som det tydeligt fremgår af fig. 3, opviser de enkelte prallplader flere koniske gennemgangsboringer 14 og 15. Gennemgangsboringerne 14 og 15 er således anbragt, at nabostillede boringer 14 og 15 er rettet mod hinanden, dvs. den ene gennemgangsboring 14 snævrer ind foroven, medens den nabostillede gennemgangsboring 15 snævrer ind forneden.

30

Svingakselen 12 er hul indvendig og åben nedadtil. Oxygen, der ved hjælp af beluftnings-indretningen 9 skal blandes i væsken, går ind i pilens retning gennem svingakselen 12's indre og går ud ad den nedre udgang. De opadstigende luftbobler fordeles fint gennem prallpladerne. Af oversigtsmæssige grunde er luftventilerne og lufttilførselsindretningen 35 ikke vist.

Siens 10's porestørrelse ligger ved det her viste udførelseseksempel på ca. 100 pm.

I beholderen 2 er anbragt en sensor 16 til måling af oxygenpartialtrykket i suspensionen.

40 Vibrationsdrevene 13, motoren 8 og sensoren 16 er forbundet via reguleringsledninger 17, 17', 17", ..., samt 18 og 19 med en reguleringsanordning 20. Med reguleringsanordningen 20 kan motoren 8, vibrationsdrevene 13 og de ikke viste luftventiler kobles til og fra til tilledning af luft gennem svingakslerne 12. Desuden kan antallet af de i drift værende beluft- 5 DK 174748 B1 ningsindretninger reguleres alt afhængig af det oxygenpartialtryk, der måles af sensoren 16.

Nedenfor er anført et udførelseseksempel på fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved hjælp S af den ovenfor beskrevne fermentor.

I beholderen 2 er væsken 4, som indeholder cellekulturer på bærestofpartikler 3. Rører-, værket 5 sættes i bevægelse, således at rørerarmen 6 drejer mod urets retning, og bære- stofpartikleme 3 holdes i suspension i væsken 4 (jvf. fig. 2).

Om omrøringsakselen (drivaksel 7) i rørerværket 5 dannes en strømningshvirvel. 1 fig. 2 er antydet denne strømningshvirveis strømningsprofil. Det kan ses, at der i nærheden af beholderen 2‘s kant optræder en væsentlig højere strømningshastighed end i midten af beholderen 2, hvor strømningshastigheden er negligibel. Til beluftning af suspensionen i fer-15 mentoren 1 indføres oxygen via beluftningsanordningerne 9, og det i området med den største strømningshastighed for den ovenfor omtalte strømningshvirvel.

Til indføring af oxygen i suspensionen sættes alt afhængigt af det ønskede partialtryk én eller flere beluftningsanordninger 9 i drift. De ikke viste luftventiler lader altså luft eller 20 oxygen strømme ind igennem svingakselen i det indre af sien 10. Prallplademe 11 bevæges ved hjælp af vibrationsdrevet 13 i op- og nedadgående retning. I sien 10's indre er der kun væske 4, men ingen bærestofpartikler 3. Inde i sien kan der derfor optræde store forskydningsstrømninger, uden at cellekulturerne på bærestofpartiklerne 3 ødelægges. Disse høje forskydningsstrømninger fremkaldes ved prallpladernes højfrekvente op- og nedadgå-25 ende bevægelse og af den pumpestrømning, der fremkaldes gennem de koniske gennemgangsboringer 14 og 15. Den luft, der kommer ind via beluftningsindretningen 9, fordeles godt på denne måde. Luftboblerne "hakkes" i så små dele, at luften opløses i væsken 4.

Den således i væsken 4 opløste luft blandes hurtigt ind i suspensionen udenfor beluftningsindretningen 9, fordi beluftningsindretningerne ligger i et område med en forholds-30 mæssig kraftig strømning.

På denne måde kan der altid opnås en optimal oxygenperfusion.

Claims (9)

1. Fermentor til dyrkning af cellekulturer pi mlkrobærestofenheder i en væske, hvilken fermentor omfatter en beholder (2) i hvilken der er anbragt et rørerværk (5) med en 5 drivaksel (7), med hvilken cellekulturerne kan holdes i suspension i beholderen, samt en beluftningsindretning (9), ved hjælp af hvilken der til suspensionen i beholderen kan føres fint fordelt oxygen, kendetegnet ved, at beluftningsindretningen (9) har en svingaksel (12), der i beholderen er anbragt excentrisk i forhold til rørerværkets aksel i en zone med stor omrø-10 ringshastighed og nær kanten af beholderen (2), og den indeholder en si (10), som om- , kranser svingakselen og som danner et hulrum, som fyldes med væske og i hvilken der indføres oxygen via svingakselen (12), hvilken si forhindrer passagen af bærestofenheder ind i beluftningsindretningen.

2. Fermentor ifølge krav 1, kendetegnet ved, at der er anbragt prallplader (11) med flere koniske gennemgangsboringer (14, 15) i sien (10) over hinanden på en med et vibrationsdrev (13) forbundet svingaksel (12), og at svingakselen (12) er tildannet i hul form med henblik på tilføring af oxygenet. 20

3. Fermentor ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at sien (10) har en porevidde på ca. 100 pm.

4. Fermentor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, 25 kendetegnet ved, at der er anbragt to eller flere beluftningsindretninger (9) fordelt hen over volumenet i beholderen (2).

5. Fermentor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-4, kendetegnet ved, at drivakslen (7) i rørerværket (5) går fra oven ned i beholderen 30 (2).

6. Fermentor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at der i beholderen (2) er anbragt en sensor (16) til måling af oxygenpartialtrykket i suspensionen. 35

7. Fermentor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, kendetegnet ved, at sensoren (16) er forbundet med en reguleringsanordning (20) til regulering af oxygenafgivelsen fra beluftningsanordningen (9). 40

8- Fermentor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-7, kendetegnet ved, at ved flere beluftningsindretninger (9) kan disse fakultativt kobles fra.

9. Fermentor ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, 7 DK 174748 B1 kendetegnet ved, at beluftningsanordningerne (9) alt afhængig af det målte oxygenpartialtryk kan kobles til og fra.