KR950005423B1 - 동물세포의 배양방법 및 배양장치 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

동물세포의 배양방법 및 배양장치

[도면의 간단한 설명]

제1도는 본 발명의 일 실시예의 배양조내 구조도.

제2도는 제1도의 배양조내의 구비된 가스취입관의 구조도.

제3도는 제1도의 배양조내의 구비된 교반날개의 구조도,

제4도는 액중으로의 가스취입이 일어나는 임계치를 나타낸 도면.

제5도는 가스의 액중으로의 취입이 발생하기시작했을때의 f_c치와 노즐구멍면과 수면의 거리와의 관계를 나타낸 선도.

제6도는 가스취입관의 노즐로부터 배출되는 공기의 액면에서의 수직방향의 선속도와 산소이동속도 계수와 의 관계를 나타낸 선도.

제7도 및 제8도는 취입공기량을 파라미터로 한 교반날개의 회전수와 산소이동속도 계수와의 관계를 나타낸 선도.

제9도, 제10도 및 제11도는 배양시험결과로서 각각 세포농도, 용존산소 및 pH의 경시변화를 나타낸 선도이다.

[발명의 상세한 설명]

[산업상 이용분야]

본 발명은 세포의 증식에 필요한 산소의 공급 및 장치에 관한 것으로, 특히 기계교반식 배양조에서 배양하는데 적합한 동물세포의 배양방법 및 배양장치에 관한 것이다.

[종래 기술]

기계교반식 배양조에서 동물세포를 증식시킬 때 배양조내 상부이 기상부에 존재하는 산소가 액면을 통하여 액상부에 용해됨으로써 필요한 산소가 공급되고 있다.

이때 산소의 이동속도(기상에서 액상으로의 용해속도)는 배양액 용량당 기액체 면적 및 기액 계면의 갱신에 관련된 교반기(날개)의 회전수에 영향을 강하게 받는다. 그러나, 회전수의 증가는 전단력(剪斷力)의 증대로 이어지고, 세포가 손상을 받아 사멸하기 때문에 한계가 있다. 또한, 동물세포 배양용 배양액에 혈청을 사용하기 위하여 통기교반을 행하면 발포가 격심하게 되어 배양조내 용적에 대한 액량비를 작게하지 않으면 안된다. 또한 배양액이 거품이 되어 흘러 넘쳐 계속 배양하기가 불가능하게 된다. 따라서, 미생물의 배양과 같이 대량통기, 강력한 교반에 의하여 산소의 이동속도(기상에서 액상으로의 용해속도)를 상승시킬 수 없기 때문에, 이의 개량을 시도해 왔다.

개량의 시도로서, ① 산소함유 가스를 배양액에 통기시켜 기액체면적을 증가시키는 것과 ② 액면을 교반(교란)하고, 기액계면의 갱신을 촉진하는 것이 있다. ①에 관해서는 문헌1[Ann, New York Acad, sci, vol 413 pp. 361∼364(1983)], ②에 관해서는 문헌2[Biotechnology and Bioengineering, vol ⅩⅩⅧ, pp. 122∼125(1985)]에 기재되어 있다. 그러나, 만족할만한 장치 및 방법은 아직까지 개발되어 있지 않다.

종래 기술에는 상기한 바와같은 결점이 있어, 현재 각처에서 그 개량을 시도하고 있지만, 여전히 다음과 같은 문제점이 존재하고 있다.

① 통기교반방식

배양액에 질소함유가스를 취입하고(통기), 이어서 교반날개로 액을 교반함과 동시에 취입가스를 액내에 분산시키는 것을 목적으로 한다. 이 방법은 가스가 액중에서 기포를 형성하고 체류하기 때문에 기액계면면적이 증가되고, 산소이동 속도가 빠르게 되는 효과가 있다. 그러나, 동물세포 배양에 사용하는 배양액에는 혈청등 단백질 성분이 많아 극히 발포하기 쉬운 성질을 가지고 있다. 또한, 발포는 세포막의 분해를 일으키는 것(문헌 1)으로 알려져 있으며, 세포증식을 방해하는 원인이 된다. 이들에 대한 대책으로서 소포제(계면활성제)의 첨가를 생각할 수 있으나, 미생물세포와 달리,동물세포는 계면활성제에 대한 저항성이 약하여, 증식저해를 일으키기 때문에 사용할 수 없다. 독성이 약하고, 또 유효한 것은 발견되지 않았다.

이에 대해 발포에 의한 손상으로부터 세포를 보오하기 위해 세포를 알긴산나트륨등의 반투명 캅셀에 포괄하고, 그 캅셀을 배지내에 부유키시고, 안내에 산소함유 가스를 취입하여 발포상태에서 배양하는 발명이 있다. 그러나 이 방식에서는 캅셀을 무균적으로 조제할 수 있는 장치가 필요하고, 베양시스템이 복잡하게 된다. 또한, 발포에 따라 배기계에 배지가 들어가므로, 균제거용 필터가 막히는 것을 방지하거나 배관을 청소하는 시설이 요구된다.

② 액면교반방식

이 방법은 교반축에 액면을 교란시키기 위한 날개를 설치하여 액면을 교란시켜, 기액접촉 면적이 증가되게 하는 것이다(문헌 2). 표면 통기장치라 불리우는 날개는 저속회전에서는 원래의 효과를 가지나. 높은 상소이동속도를 얻기 위해 고속회전시키는 포립기(泡立機)와 같은 작용을 하게 된다. 거기서 기상부에 산소가스를 주입함으로써 산소의 이동속도를 향상시키려는 시도가 이루어지고 있다.

[발명이 해결하고자 하는 문제점]

이상과 같이, 종래의 기술에서는 조작조건과 배양액의 발포성과의 관계에 대해서는 배려가 불충분하고, 고밀도 배양실현에 대한 커다란 제한인자중의 하나가 된다.

본 발명의 목벅은 배양액을 발포시키지 않고 효율좋게 산소를 액중에 공급할 수 있는 동물세포의 배양방법 및 배양장치를 제공하는 있다.

[문제점을 해결하기 위한 수단]

상기 목적은, 기계교반식 배양조에 있어서 액면상부의 기상공간에 단일 또는 복수개의 기체취입노즐을 액면을 향하여 설치하고, 그 노즐로부터 산소함유가스를 연속적으로 배출하여 액면에 역원뿔형의 홈(凹)를 형성시킴으로써 달성할 수 있다.

제1의 발명의 특성은, 동물세포를 기계교반적 배양조에서 배양함에 있어서 배양액의 교반을 액면의 교란이나 소용돌이 형성을 억제하며서 행하고, 또 취입노즐로부터 산소함유가스를 액면을 향하여 연속적으로 배출하고, 액면의 홈을 형성시키는 동물세포의 배양방법에 있다. 이 경우, 상기 노즐선단으로부터 정지 액면까지의 거리를 hcm로 하고, 가스의 취입량Q(㎤/초)와 노즐선단에서의 가스선속도 V(㎝/초)와의 곱 f_c을 취하고, 이 값을 6.25×10⁵×h²이하가 되도록 조작하는 것이 바람직하다. 따라서, 노즐 구멍지름이 1㎜인 경우를 생각하면, 상기 노즐로부터 배출되는 산소함유가스의 액면에 대하여 수직방향의 액면에서의 선속도를 5m/초 이상 65m/초 이하가 되도록 조절하는 것이 바람직하다.

제2의 발명의 특징은, 동물세포를 기계교반식 배양조에서 배양하는 장치에 있어서, 액면상부의 기상공간에 산소함유 가스를 연속적으로 배출하기 위한 단일 또는 복수개의 기체 취입노즐을 액면을 향하여 설치한 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양창치에 있다.

이 경우, 배양액을 교반하기 위한 교반날개가 중앙부가 제거된 구형판을 1/2회전한 구조가 바람직하다.

제3의 발명의 특징은, 동물세포가 분산된 배양액을 교반기에서 교반하면서 배양조에서 배양함에 있어서, 배양액의 액면을 실질상 평활하게 유지하면서 배양액의 교반을 향하고, 또 다수의 취입구멍을 갖는 흡입노즐로 산소함유 가스를 액면을 향하여 연속적으로 배출하고, 액면에 대수의 홈을 형성시켜 산소가스를 배양액에 용해하는 동물세포의 배양방법에 있다.

제4의 발명의 특징은, 동물세포를 분산한 배양조의 배양액을 기계교반히면서 배양하는 방법에 있어서, 배양액의 발포 및 그 동물세포의 파괴를 방지하면서 배양액을 교반시키는 것과 흡입노즐로부터 산소함유가스를 액면을 향하여 배출하고, 액면에 홈을 형성시키면서 산소가스를 배양액에 용해시키는 것으로 이루어진 동물세포의 배양방법에 있다.

제5의 발명의 특징은, 동물세포의 기계교반식 배양조에서 배양함에 있어서, 배양액의 교반을 액면의 교란이 소용돌이 형성을 억제하면서 행한다. 또한, 취입노즐로부터, 산소함유가스를 액면을 향하여 연속적으로 배출하여, 액면에 홈을 형성하고 홈의 저부로부터 액면을 행하는 배양액의 흐름을 형성하면서 산소가스를 배양액에 용해시키는 동물세포의 배양방법에 있다.

제6의 발명의 특징은, 동물세포가 분산된 배양액을 수용하는 배양조와, 그 배양액을 교반하는 교반기 및 그 배양액의 액면에 산소가스를 공급하는 수단을 갖는 배양장치에 있어서, 액면상부의 기상공간에, 산소함유가스를 액면을 향하여 연속적으로 배출하기 위한 기체흡입노즐을 설치한 동물세포의 배양장치에 있다.

제7의 발명의 특징은 동물세포가 분산된 배양액을 수용하는 배양조와 그 배양액을 교반하는 교반기 및 그 배양액의 액면에 산소가스를 골급하는 수단을 갖는 배양장치에 있어서, 액면상부의 기상공간에, 산소함유가스를 액면을 향하여 거의 수직으로 배출하기 위한 기체흡입 노즐을 설치한 동물세포의 배양장치에 있다.

제8의 발명의 특징은, 동물세포가 분산된 배양액을 수용하는 배양조와 그 배양액을 교반하는 교반기 및 그 배양액의 액면에 산소가스를 골급하는 수단을 갖는 배양장치에 있어서, 산소함유가스를 액면을 향하여 거의 수직으로 배출하기 위한 기체흡입 노즐과 그 노즐로부터 배출압력을 제어하여 그 액면에 홈을 형성하는 제어수단을 갖는 동물세포의 배양장치에 있다.

제9의 발명의 특징은, 배양조의 배양액에 분산된 동물세포를 기계교반하면서 배양하는 방법에 있어서, 배양액의 발포 및 그 동물세포의 파괴를 방지하면서 배양액을 교반시키는 것과 취입노즐로부터 산소함유가스를 액면을 향하여 수직방향으로 5m/초∼65m/초(단, 노즐의 취입경을 1㎜로 하여 계산된 경우의 액면에서의 신속도)의 속도에서 배출하고, 액면에 홈을 형성시키면서 산소가스를 배양액에 용해시키는 것으로 이루어지는 동물세포의 배양방법에 있따.

이하, 본 발명을 도면을 사용하여 더욱 상세히 설명한다.

제1도에 배양조(1)는 교반날개(3)에 의하여 배양액을 교반하는 기계교반식 조이다. 교반날개(3)는 교반모터(4)의 구동축에 설치되고, 그 교반모터(4)에 의하여 회전된다. 또한 교반날개(3)의 회전은 자기방식도 좋으나 특별히 한정되지는 않는다. 조내에서 액면의 산소함유가스를 배출하는 가스취입관(2), pH센스(6), 용존산소센스(7) 및 온도센서(8)가 설치되어 있다. 또한, 항온수조(5)는 배양조(1)를 가온하기 위한 것이다. 급기구(11) 및 배기구(12)에 설치된 균제가용필터(13)는 구멍의 지름이 0.2∼0.45㎛이고, 산소함유가스중의 잡균을 제거함과 동시에 배기구(12)로부터의 잡균진입을 방지하는 것이다. 또한, 배기에 따른 배양액중의 물의 증발을 억제하므로, 배양온도의 포화증기압에 가까운 값으로 증기압을 조정한 산소함유가스를 배양조(1)에 공급한다. 이를 위하여 필터 재질은 결로(結露)에 의한 막힘이 적은 테프론 등의 소수성재질을 사용한다.

제2도는 가수취입관(2)의 일례이다. 가스취입관(2)은, 완충관(2a), 취입노즐(2b) 및 송기(送氣)관(2c)으로 구성된다. 산소함유가스는, 송기관(2c)을 통하여 완충관(2a)으로 들어가고, 완충관(2a)의 하부에 설치된 각각의 취입노즐(2b)로부터 균일압력하에 연속적으로 배출된다. 취입노즐(2b)의 가스배출면은 액면을 향하게 돠나 바람직하게는 정지액면에 평행하게 하면 좋다. 또, 취입노즐(2b)의 구멍지름 및 가스배출간의 액면까지의 거리는, 배출되는 산소함유가스에 의하여 액면에 역원뿔형의 홈을 형성할 수 있는 조건히면 좋다. 노즐구멍 지름이 1㎜인 경우에는 배출되는 산소함유가스의 액면에서의 수지방향에 대한 선속도를 5m/초 이상이 되도록 하면, 액면에 역원뿔형의 홈을 형성할 수 있다. 취입노즐(2b)의 수는 특별히 한정되는 것은 아니고, 산소이동속도가 최대로 얻어지는 수로 설정하면 좋다. 복수개의 취입노즐(2b)을 설치할 경우, 액면의 홈이 결치지 않도록 평면적으로 위치를 결정하면 좋다.

그런데, 액표면의 교반이 많은 경우, 취입노즐(2b)로부터 배출된 산소함유가스에 의하여 액내에 가스를 취입하여 발포를 일으킨다.

또한, 액표면에 깊은 소용돌이가 형성될 경우, 취입노즐(2b)의 액면까지의 거리가 멀게되어 액면에 홈이 형성되지 않는다. 따라서 바람직한 액면은 교란이 적은 평면한 것이 좋다.

액면의 교란이나 소용돌이의 형성은 주로 교반날개(3)의 형성에 좌우되므로, 적절한 것을 선정할 필요가 있다, 제1도에 나타낸 중앙부를 벗어난 구형(矩形)의 교반날개(3)는 액면의 교란이나 소용돌이의 형성을 억제할 수 있는 일례가 있다.

이하, 장치에 관련한 동물세포의 배양조직에 대하여 제1도를 사용하여 기술한다.

동물세포는 고체표면에 부착 생육하는 것과, 부유상태에서 증식할 수 있는 것으로 크게 구분할 수 있다. 전자의 경우 마이크로캐리어법, 즉, 덱스트란 등의 마이크로비드에 세포를 부착시키고, 그 비드를 부유시킴으로써 부유상태에서 배양할 수 있다. 따라서, 부유배양에 관한 본 발명은 상기 두 종류의 동물세포에 대하여 사용할 수 있다.

배지는 배지공급구(9)로부터 배양조(1)에 무균적으로 투입한다. 배지는 가스취입관(2)을 설치하는데 필요한 최소한 공간(액면으로부터 노즐배출면까지의 거리도 포함)을 남기고 투입할 수 있으나, 적합한 투입률은 40∼70%이다. 배양은 배지공급구(9)로부터 종세포를 접종하여 개시한다. 배양액의 온도는, 온도센서(8)의 신호에 의하여 온도제어계가 작동하는 항온수조(5)로 유입되는 온수의 온도 및 유량이 조절되어 소요범위로 제어된다. 배양초기에는 5% 정도의 탄산가스를 함유하는 산소함유가스가, 액면에 홈을 형성하지 않는 유량으로 가스취입관(2)으로부터 배양조(1)의 기상부로 유입된다. 증식에 필요한 산소는, 그 기상부로부터 액면을 거쳐 공급된다. 세포농도가 낮은 밀도에서는 용존산소농도가 증식에 제한인자가 되는 수준은 아니다. 이때의 교반날개(3)의 회전수는 세포를 충분히 균일하게 분산할 수 있는 수치이면 좋다. 그리고 세포의 증식에 따라 산소소비량이 증가하고 용존산소농도가 증식의 제한인자가 되는 수준에 까지 저하된 시점에서 산소취입가스에 의하여 액면에서의 홈 형성이 개시된다. 즉, 산소센서(7)로부터의 산소를 받은 용존산소 제어계에 의하여 산소함유가스의 취입량의 조절밸브를 열고, 액표면에서 수직방향으로서 선속도가 5m/초이상이 되도록 취입량을 증가시킨다. 증가의 타이밍은 10∼30분간마다 용존산소농도의 수준을 판정하여 그 제한인자가 되는 수준이하인 시점으로한다. 또한, 높은 수준의 용존산소농도는 오히려 증식을 저해한다. 따라서, 용존산소농도를 증식의 제한인자가 되는 값 및 증식저해를 일으키는 값의 사이에 있도록 취입량을 제어한다. 상기 범위내에서 용존산소농도를 상기 조작으로 제어하면 세포농도의 증가와 함께 산소함유가스의 취입량을 서서히 증가시킨다. 그러나, 가스취입관에 취입한 가스량과 노즐선단에 있어서의 가스 선속도와의 곱인 f_c가 6.25×10⁵×h²보다 크게되면, 노즐지름이 1㎜인 경우에는 가스취입관(2)의 취입노즐(2b)로부터 배출된 산소함유가스의 액면에 있어서의 수직방향의 선속도가 65m/초보다 커지게되고, 액내에 기포가 들어가 배양액의 발포를 일으킨다. 즉, 취입가스량에는 한계가 있다. 따라서 산소함유가스의 취입량이 한꼐치보다 클 경우에는 산소함유가스의 산소분압을 높게하는 것이 좋다.

그리고 세포농도가 1×10⁶개/㎖이상의 고밀도에서는, 노폐물이 축적되고, 또 영양원이 부족하게 된다. 이때문에 배양액 취출구(1)로부터 배양액을 취출하여 세포를 무균적으로 분리한다. 그리고 그 세포를 새로운 배지와 함께 배지공급구(9)로부터 배양조(1)로 이송한다. 이 조작은 간헐적 또는 연속적이어도 좋다. 또한, 세포의 분리방법에 있어서는 특별한 한정되지는 않는다. 그러나 이 조작만으로는 pH치가 최적치 이하가 된다. 이것을 세포농도의 증가에 따라 탄산가스의 발생량 및 발생속도가 증가하고, 용존산소가스 농도가 증가하기 때문이다. 본 발명에서는 탄산가스의 액상과 기상과의 교환이 양호하게 행해진다. 따라서 pH센서(6)의 신호를 받은 pH계에 의해 산소함유가스와 탄산가스의 혼합비를 변환시킨다. 즉, pH치가 최적치 이하기 되었을 때에 탄간가스의 혼합비를 내린 산소함유가스를 취입함으로서 액상의 탄산가스를 기상으로 배출항여 pH치를 상승시킬 수 있다. 이때, 탄산가스의 혼합비의 저하 비율은 0.1∼5%로서 서서히 행하면 좋다. 또한, 락트산의 축정량이 많을 경우, 중탄산나트륨 등의 알칼리제의 첨가를 병용하면 효과적이다.

[작용]

상기 노즐로부터 액면을 향하여 산소함유가스를 연속적으로 배출시키고, 액면에 역원뿔형의 홈을 형성시키는 것은, 홈에 의한 기액계면적을 증가시키는 것과, 배출가스가 역원뿔형의 홈의 저부로부터 액면을 향하여 흐르는 것을 강제적으로 만드는 것이 되어 기액계면의 갱신율이 높아지게 되는 작용에 의해 산소이동속도를 향상시킬 수 있다. 이때 노즐로부터 배출되는 산소함유가스의 액표면에서의 운동에너지를 액표면을 누르는 정도로 하면, 액표면의 장력을 파괴하여 액상으로서 산소함유가스가 유입하지 못하게 된다. 즉, 배양액의 발포를 억제할 수 있게 된다.

이상의 작용에 의하여 배양액의 발포를 억제하고 산소이동속도를 향상시킬 있다.

[실시예]

실시예 1

본 발명에 의한 산소함유 가스취입기구를 갖는 배양조에 있어서의 용존산소계를 사용한 가스 아웃법에 의하여 수계에서의 산소이동 용량계수를 구하였다.

사용된 배양조의 구조는, 제1도에 나타낸 바와 같으며, 내용적은 5ℓ이다. 조의 본체는 파이렉스 가스제로 외경 160㎜, 높이 270㎜이다, 가스취입관은 14ψ의 관을 외경 78㎜의 원형 도우넛형의 용충관하부에 노즐구멍지름이 1㎜인 취입노즐 6개의 60°간격으로 노즐구멍면이 수평으로 설치된 구조이다. 또한, 교반날개는 제3도에 나타낸 2종류를 공시하였다. 교반날개 A는 폭 80㎜, 높이 100㎜의 판으로, 폭 50㎜, 높이 60㎜에서 중앙부를 제거한 구형판을 1/2회전한 구조이다. 교반날개 B는 폭 80㎜, 높이 100㎜의 구형판을 1/2회전한 구조이다. 양날개 모두 조의 저부로부터 20㎜의 위치에 저부가 오도록 교반측에 설치하였다. 또한, 가스취입관이나 교반날개의 재질은 SUS 316을 사용하였다.

상기 구조의 배양조에 증류수 2.5ℓ를 넣고, 가스취입관은 노즐구멍면이 수면으로부터 20㎜가 되도록 설치하였다. 먼저 질소가스액중에 통기하여 용존산소농도를 제로 부근까지 내리고, 이어서 조의 기상부를 공기로 치환한 후, 소정의 조건에서 교반 및 노즐로부터의 공기의 배출을 개시하였다. 용존산소계로 용존산소농도 증가의 경시변화를 구하고, 동 데이터로부터 산소 이동용량계수를 구하였다.또한, 측정온도는, 37±1℃로 하고, 또한 취입공기는 미리 상기 온도의 포화증기압으로 조정한 것을 사용하였다.

제6도는 각 흡입량에 있어서의 노즐로부터 배출된 공기의 액면에서의 수직방향의 선속도와 산소이동 용량계수를 나타낸 것이다. 교반날개는 A를 이용하고, 회전수는 80rpm으로 일정하게 하였다. 또한 공기의 통기량은 0∼22ℓ/분으로 하였다. 노즐로부터 배출하는 공기의 액면에서의 수직방향의 선속도는, 물을 빼낸조에서 열선 유량계에 의해 노즐 배출면으로 부터 20㎜에서의 유속을 측정한 값을 사용하였다. 책면에서의 홈은 그 선속다가 5m/초 이상에서 형성되고, 이와 동시에 산소이동용량 계수가 증가하였다. 또한 그 선속도가 5m/초 이하에서의 산소이동용량 계수는 종래법, 즉 조의 상부 기상부로부터 액면을 통하여 산소가 이동할 경우의 값이 었다. 또한 노즐구멍 지름이 1㎜인 것은 그 선속도 65m/초 이상에서 산소이동용량 계수가 급격히 증가하였다. 이것은 기포의 액내에로의 취입이 원인이었다. 따라서, 혈청을 10% 혼합하여 발포테스트를 행한 결과, 그 선속도가 65m/초 이상에서는 현저한 발포를 일으키는 것을 알았다.

다음에, 교반날개의 차이에 의한 효과를 검토하기 위하여, 제3도에 나타낸 교반날개 A와 B에서 산소이동속도 계수를 측정하였다. 제7도는 교반날개(A), 제8도는 교반날개(B)의 경우이다. 전자는 산소이동속도가 교반날개의 회전수에 비례하여 증가한데 대하여, 후자에서는 80rpm에서 최대가 되고, 그 이하에서는 감소하였다. 이 차이는 전자에서는 교반수의 회전수가 증가해도 액면의 교란도 적고 평활한데 대하여 후자에서는 소용돌이를 형성하기 때문인 것임을 알았다. 즉, 노즐 취출면으로부터 액면까지의 거리가 소용돌이에 의하여 멀어지는 액면에서의 공기의 선속도가 늦어지기 때문이다. 이 결과로부터 교반날개는 회전에 의하여 소용돌이가 발생하지 않는 것을 선정하지 않으면 안된다는 것을 알았다.

그런데, 산소이동속도를 향상시키는 방법으로서, 산소 부화(富化)가스를 이용하면 좋다. 그래서 산소 49%의 산소부하가스를 사용하여 산소이동용량 계수를 측정하였다. 측정조건은 교반날개 A를 사용하여 회전수를 80rpm으로 일정하게 하였다. 또 산소부하가스의 통기량은 12.5ℓ/m로 하였다. 측정효과를 제5도에 나타낸다. 공기를 사용했을 경우에 비하여 1.5배 정도 향상되는 것을 알았다. 본 발명과 산소부하 가스를 조합하는 것에도 보다 높은 산소이동용량계수가 얻어져 효과적이다.

실시예 2

실시예 1에서 사용한 장치에 있어서, 노즐구멍지름을 0.3, 0.4, 1.0, 2.5 및 5㎜로 했을 경우의 각각의 조건에서의 산소이동용량 계수를 구하였다.

측정조건은 다음과 같다. 각 노즐은 가스취입관에 6개를 노즐구멍면이 수면으로부터 20㎜가 되도록 설치하였다. 조내의 증류수의 투입량은 2.5ℓ, 또한 교반날개(A)를 사용하여 회전수를 80rpm으로 일정하게 하였다. 또한, 측정온도는 37±1℃로 하고, 측정방법은 실시예 1과 마찬가지로 가스아웃법을 사용하였다.

측절결과는 제4도에 나타낸 바와 같다. 도면에 있어서 f_c는, 다음에 설명한 바와 같이 가스취입관에 취입한 가스량과 노즐선단에 있어서의 가스 선속도와의 곱이다.

기계설계편람(기계설계편람 편집위원회 편, 마르젠 가부시기기이샤 발행, 소화 33년(1958) 6월 25일)1504페이지에 평판에 분류가 직각으로 닿는 경우의 평판에 걸리는 힘 F는 ①식과 같다.

F=(γ/g)Qv ①

γ는 유체의 단위체적의 중량, g는 중력가속도, Q는 유량, v는 분류의 속도를 나타낸다.

노즐로부터 분출한 가스의 액면을 누르는 힘은 상기 식으로부터 취입가스 유량과 노즐선단에 있어서의 가스 선속도와의 곱에 비례하는 것으로 생각할 수 있다. 여기서 각 조건에 았어서의 노즐 1개당 취입가스유량 g(㎠/초) 및 노즐선단에서의 가스 선속도 v(㎝/m)를 계산하고, 취입가스의 액면을 누르는 힘 f_c를 구하였다, 즉, 노즐 1개당 취출가스의 v액면을 누르는 힘(f)는 ②식으로 나타낼 수 있다.

f=k×q×v ②

k : 비례상수

따라서, F_G는 ③식이 된다.

F_G=6×f ③

그런데 q는 ④식

q=Q_G/6 ④

(Q_G: 가스취입관에 취입한 가스량)이므로 F_G는 ⑤식이 된다.

F_G=k×Q_G×v ⑤

(⑤식에 있어서, Q_G×v를 f_G로 하였다)

제4도에 의하면, 노즐구멍 지름이 변화해도, f_G가 동일하면, 산소이동용량 계수(h-1)는 거의 동일한 것으로 판명되었다. 즉, 취입가스의 액면을 누르는 힘이 동일하면 노즐구멍지름을 변화시켜도 동일한 산소이동용량계수가 얻어진다는 것을 알았다. 또, 각 노즐구멍지름도 f_G값이 2.5×10⁶[(㎝/초)²]에서는 액중에 가스를 취입하는 것이 관찰되었다. 이 결과로 부터, 미리 임의의 노즐을 사용하여 산소이동용량 계수와 f_G값과의 관계를 구해두면, 노즐지름을 변화시켰을 경우에 있어서 액면에서의 선속도를 측정하지 않아도, f_G값을 계산하는 것으로서 산소이동용량 계수를 구할 수 있다.

실시예 3

실시예 2에서, 노즐구멍면과 정지수면과의 거리를 변화시켰을때의 취입가스의 액중으로의 취입이 발생하기 시작하는 f_G값을 구하였다.

제5도에 그 결과를 나타내었다. f_G는 액중으로의 가수취입이 발생하기 시작했을 때의 f_G값이다. 노즐구멍면과 수면과의 거리는 10㎜, 20㎜ 및 40㎜로 하였다.

도면에서 가스의 액중으로의 취입이 시작되는 f_G값은. 노즐 구멍면과 수면과의 거리의 제곱에 반비례하는 것으로 판명되었다. 따라서, 도면에서 노즐구멍면과 정지수면과의 거리를 h㎝로 하면 가스의 액중으로의 취입이 발생하지 않고 f_G값은 6.25×10⁶×h²이하로 하면 좋을 것임을 알 수 있다.

실시예 4

실시예 1에서 사용한 배양조에서 배양시험을 행하였다. 또한, 비교예로서 종래법으로 배양시험을 행하였다.

공시세포는, JTC-1(쥐의 복수간압 유래의 균주화 세포로 부유성)을 사용하였다. 또한, 배지는 DM-160(극동제약제)에 신생의 송아지 혈청 10%를 혼합한 것을 사용하였다. 배지의 투입량은 2.5ℓ로 하였다. 교반날개는 제3도의 A형을 사용하고, 가스취입관의 노즐취출면을 액면으로부터 20㎜로 하였다.

배양조건은 다음과 같다. 교반날개의 회전수는 80rpm으로 일정하게, 배양온도는 36±1℃로 제어하였다. 산소함유가스는, 공기와 탄산가스의 혼합가스로 하고, 미리 온도 37℃의 온수에 스파징(sparging)하여 포화증기압으로 된 것을 사용하였다. 그리고 0.45μ의 균제거용 필터를 통하여 조내에 공급하였다. 배양초기에는 그 혼합가스를 액면에 홈을 형성시키지 않은 통기량 0.2ℓ/분으로 통기하였다.

또한, 탄산가스 초기의 농도는 5v/v%로 하였다. 취입 산소함유가스에 의한 액면에서의 홈 형성의 개시는 용존산소농도가 2ppm 이하가 된 시점으로 하였다. 그 이후, 용존산소농도가 2ppm이 되도록 산소함유가스의 취입량을 제어하였다. 탄산가스의 혼합비율 감소는 세포농도 1.5×10⁶개의 시점에서 행하였다. 또한 비교예에서서는 탄산가스농도 5v/v%의 공기혼합가스를 통기량 0.2ℓ/분으로 일정하게 통기하였다. 또, 노폐물의 제거 및 영양원의 공급을 행하기 위하여 도중 배지 교환을 행하였다. 그 교환율은 100%로 하였다. 배양결과를 제9도, 제10도, 제11도에 나타내었다. 제9도에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서는 세포는 비교예(종례법)과 동일한 증식속도에서 증가하여 비교예가 세포농도 3 ×10⁶/㎖ 정도에서 한계점이 도달하게 되는데 대하여 1.2×10⁷/㎖까지 거의 지수적으로 증식되었다. 배양기간을 통한 pH치는 제11도에 나타낸 바와 같이, 양지 모두 6.9∼7.5의 범위이고, 본 균주에서는 pH치는 증식의 제한인자가 되지는 않는다. 따라서, 상기한 차이는 다음의 이유에 의한다.

비교예의 용존산소농도는 제10도에 나타낸 바와같이 세포농도가 1.4 ×10⁶/㎖이상에서 거의 제로가 되어, 증식의 제한 인자가 되고 있다. 이것에 대하여 본 발명에서는 실시예 1에서 나타낸 바와 같이 높은 산소이동속도가 얻어지므로 배양종료까지 용존산소농도를 1.8∼2.6ppm으로 할수 있고, 증식에 필요한 산소를 충분히 공급할 수 있기 때문이다.

또한, 배양기간을 통하여 현저한 발포는 없으며, 배양종료시의 세포 생존율은 85%로 배양개시시의 88%와 비교하여 커다란 감소는 없었다.

이상으로부터 본 발명에 의하여 산소함유 가스로서 공기를 이용한 경우에도 세포를 종래법의 3배 강도의 고밀도에서 배양할 수 있는 검일을 확인할 수 있었다.

그런데, 본 발명에서는 용존산탄가스의 액상과 기상의 치환이 양호하게 행해진다. 이것은 액면에서의 홈 형성을 개시한 시점의 pH의변화로 나타낸다. 비교예에서는 pH치가 저하하는데 대하여 본 발명에서는 상승하였다. 즉, 본 발명에서는 산소함유가스를 액면에 배출하여 액면에 홈을 형성함으로써 액상-기상간의 기체에 물질이동을 촉진하여 액상의 탄산가스를 양호하게 기상으로 배출할 수 있기 때문이다. 또한, 탄산가스 생성속도가 높은 고밀도 배양에서도, 본 발명에서는 액상-기상간의 기체의 물질이동속도를 높일 수 있으므로, 탄산가스 농도가 낮은 산소함유 가스를 이용하는 것으로 액상으로부터 기상으로의 탄산가스를 배출할 수 있다. 이를 위하여 제11도에 나타낸 바와 같이 용존탄소가스의 축적에 따른 pH치의 저하를 억제할 수 있었다.

[발명의 효과]

본 발명에 의하면 기계교반식 배양조에 있어서 조 상부의 기상과 배양액의 액상사이에서 기체의 물질이동을 배양의 발포를 억제함으로써 촉진할 수 있다.

Claims (14)

1. 배양액을 액면의 교란이나 소용돌이 형성을 억제하면서 교반하고, 하나 이상의 취입노즐로부터 산소함유 가스를 액면으로 연속적으로 배출하는, 기계교반식의 배양조에서 동물세포를 배양하는 방법으로서, 취입노즐선단에서 액면까지의 거리 h(㎝)를 곱한, 산소함유 가스의 유속과 노즐선단에서의 가스 선속도와의 f_c값이 2.5×10⁵(㎝/sec|²)이하이고, 액면상에 하나 이상의 홈이 형성된 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
2. 제1항에 있어서, 상기한 가스를, 구멍지름이 1㎜인 취입노즐로부터 배출되는 산소함유 가스의 액면에 대해 수직방향의 선속도가 5m/s이상 65m/s이하가 되도록 배출하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 동물세포를 교반기로 분산시키고, 배양액면을 평활하게 유지시키면서 배양액을 교반하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
4. 제3항에 있어서, 상기한 교반기가 중앙부에 제거된 구형판을 1/2회전한 교반날개를 가지는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
5. 제1항 내지 제4항중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 배양액을 액면의 교란이나 소용돌이 형성을 억제하면서 교반하고, 상기한 홈의 저부로부터 액면을 향하여 배양액의 흐름을 형성시키면서 산소가스를 배양액에 용해시키는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
6. 제1항 내지 제4항중의 어느 한 항에 있어서, 상기한 산소함유 가스를 액면상에 역 원뿔형의 홈을 형성될 수 있는 조건하에 상기한 액면을 향하여 배출하고, 상기 배양액으로부터 분출되는 기포를 억제하면서 상기 배양액에 산소를 용해시키는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
7. 제6항에 있어서, 상기한 산소함유 가스의 유속을 상기한 동물세포의 증식 제한요인이 될 수 있는 용존산소농도치 이상으로 용존산소농도를 얻을 수 있도록 시간의 경과에 따라 증가시키는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
8. 제7항에 있어서, 상기한 f_c값이 2.5×10⁵(㎝/sec²)인 수준에 상기한 유속이 가까워질때, 상기한 산소함유 가스중의 산소함량이 증가되는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
9. 동물세포를 분산하는 배양액을 수용하는 배양조(1)와, 그 배양액을 교반하는 교반기(3) 및 산소함유 가스를 액면을 향하여 연속적으로 배출하는 하나 이상의 가스취입노즐(2b)이 액면 상부에 설치된, 산소가스를 배양액의 액면에 공급하는 수단(2) 및 하나 이상의 액면상에 홈이 형성하도록 노즐로부터 배출압력을 제어하는 제어수단을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
10. 제9항에 있어서, 상기한 가스취입노즐(2b)이 액면을 향하여 산소함유가스를 거의 수직으로 배출하는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
11. 제9항에 있어서, 상기한 교반기(3)가 중앙부가 제거된 구형판을 1/2회전한 교반날개를 가지는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
12. 제5항에 있어서, 상기한 산소함유 가스를 액면상에 역원뿔형의 홈이 형성될 수 있는 조건하에 상기한 액면을 향하여 배출하고, 상기 배양액으로부터 분출되는 기포를 억제하면서 상기 배양액에 산소를 용존시키는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
13. 제12항에 있어서, 상기한 산소함유 기스의 유속을 상기한 동물세포의 증식 제한산소농도치 이상으로 용존산소농도를 얻을수 있도록 시간의 경과에 따라 증가시키는 것을 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.
14. 제13항에 있어서, 상기한 f_c값이 2.5×10⁵(㎝/sec²)인 수준에 상기한 유속이 가까워질때, 상기한 산소함유 가스중의 산소함량이 증가되는 것을 특징으로 하는 동물세포의 배양방법.

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