DK172887B1 - Fremgangsmåde til fremstilling af mucopolysaccharider med høj antithrombotisk virkning - Google Patents

Description

i DK 172887 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af mucopolysaccharider med høj antithrombotisk virkning.

Man ved, at mucopolysaccharid-forbindelser af denne type 5 kan opnås ud fra heparin ved alkoholisk ekstraktion eller depolymerisation af kemisk eller enzymatisk vej.

Disse fremgangsmåder giver blandinger eller fraktioner, der består af mucopolysaccharider (MPS), hvori kæderne indeholder højst ca. 25-30 gentagelsesgrupper og besidder 10 en anti-Xa-aktivitet, målt ved Yin Wessler-titeren (YW), som er større end værdien for heparin, samt en total anti-koaguleringsaktivitet, udtrykt ved USP-titeren, som er lavere end værdien for heparin, idet denne titer endog kan udvise en meget lav værdi, praktisk taget i nærheden 15 af 0.

Disse produkter har interesse, da de udøver en mere specifik aktivitet end heparin på visse trin, som spiller en rolle i koagulationsprocessen.

For en given behandling vil man vælge produktet som 20 funktion af værdien af dets YW-titer og af forholdet mellem dets YW- og USP-titere.

Man har derfor søgt efter metoder, som gør det muligt bekvemt at opnå forbindelser, som svarer til en given profil med hensyn til især deres YW-titer og deres 25 forhold mellem YW- og USP-titere. De gennemførte undersøgelser har ført til konstateringen af, at dersom man arbejder under fastlagte reaktionsbetingelser, er det muligt at isolere sådanne produkter ud fra andre MPS-forbindelser.

30 v DK 172887 B1 2

Den foreliggende opfindelse har således til formål at tilvejebringe en hidtil ukendt fremgangsmåde til fremstilling af mucopolysaccharider med høj antithrombotisk virkning baseret på behandling af et 5 andet MPS-produktf som indeholder disse, hvilken fremgangsmåde muliggør, at man bekvemt kan disponere over produkter med stor anvendelighed.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig derved, at man underkaster MPS-blandinger bestående af en 10 overvejende mængde MPS-kæder med molekylvægt fra ca. 1800 til ca. 8000 dalton, en højere YW-titer og et større forhold mellem titerne YW/USP end heparin, mindst et fraktioneringstrin til selektiv fraseparering af i det mindste størstedelen af kæderne med molekylvægt lavere 15 end ca. 2000 og kæderne, som har en højere molekylvægt, som har en lavere sulfateringsgrad end den gennemsnitlige sulfateringsgrad for kæderne i blandingen; udvinder de for disse kæder befriede fraktioner, hvilke fraktioner har et mindre YW/USP forhold end udgangsmaterialerne, men 20 større end heparin samt en højere USP-titer end udgangsblandingen.

Fraktioneringstrinnet gennemføres fortrinsvis ved hjælp af en blanding a) af vand indeholdende et uorganisk salt, og b) et organisk opløsningsmiddel, valgt blandt sådanne, 25 hvori i det mindste størstedelen af de tilstræbte produkter er selektivt uopløselige og udfældes.

Det relative mængdeforhold mellem uorganisk salt og opløsningsmiddel reguleres i afhængighed af pH i mediet til opnåelse af udfældningen af de tilstræbte MPS-kæder.

30 Ved en foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er det anvendte organiske opløsningsmiddel et alkoholisk opløsningsmiddel, især ethanol.

DK 172887 B1 3

Ved en anden foretrukken udførelsesform er det anvendte uorganiske salt især et med det anvendte organiske opløsningsmiddel blandbart salt, såsom natriumchlorid eller kaliumchlorid.

5 Ifølge en anden foretrukken udførelsesform reguleres pH af reaktionsblandingen til en værdi svarende til en sur pH-værdi, især til pH mindre end 4.

Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen udviser de til fraktioneringen anvendte MPS-blandinger et forhold 10 mellem titrene YW og USP på mindst ca. 10 og en YW-titer på ca. 200 til 250 enheder/mg.

Man anvender Yin Wessler-titeren som et mål for anti-Xa-aktiviteten ifølge Yin E.T., Wessler S., Butler J.V. i J. Lab. Clin. med. 1973, 81, side 298-310.

15 De anvendte MPS-forbindelser er med fordel opnået ifølge en fremgangsmåde til partiel depolymerisation af heparin under indvirkning af et kemisk middel, såsom salpetersyrling. Man betjener sig især af en

fremgangsmåde, som er beskrevet i FR

20 offentliggørelsesskrift nr. 2478646 af opfinderen til nærværende opfindelse.

Man anvender på fordelagtig måde en fremgangsmåde til depolymerisation af denne type; men dog baseret på autoregulering af depolymerisationsreaktionen, således 25 som det er beskrevet i FR offentliggørelsesskrift nr.

2503714.

Ifølge det mest almene aspekt af denne autoregulerede depolymerisation omsætter man heparin og salpetersyrling i vandigt medium ved en pH-værdi i størrelsesordenen 2-3, 30 fortrinsvis 2,5, i sådanne mængder, at heparin- koncentrationen er på mindst ca. 8 vægt-%, og at DK 172887 B1 4 salpetersyrlingens molaritet er fra ca. 0,02 til 0,1 M, og efter at denne depolymerisationsreaktion er standset af sig selv ved forbrug af salpetersyrlingsindholdet, udvinder man en MPS-blanding af den type, som lader sig 5 udfælde ved hjælp af et organisk opløsningsmiddel.

Salpetersyrlingen dannes in situ ved tilsætning af en j syre, som med fordel indeholder biologisk acceptable anioner, såsom saltsyre eller eddikesyre, til et : salpetersyrlingderivat, især et salt, et ethersalt, og 10 ganske særlig et alkalimetalsalt eller et 1 jordalkalimetalsalt. Man anvender især natriumnitrit med : en molaritet på 0,03-0,05 M.

Man foretrækker ved iværksættelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen at anvende NaNO^ med koncentrationen 15 0,040-0,046 M, ganske særligt i størrelsesordenen 0,043 M.

MPS-produkterne besidder på grund af den måde, hvorved de er opnåede, i sin reducerende ende et element med 2,5-anhydromanno-strukturen, fortrinsvis valgt blandt 2,5-20 anhydromannose-, 2,5-anhydromannitol- og 2,5- anhydromannon-syregrupperne.

De som udgangsmateriale anvendte MPS-produkter bringes i opløsning i en mængde på 5% vægt/rumfang i vand indeholdende 10 g/liter NaCl.

25 Efter regulering af pH til 3,8 gennemføres fraktioneringen af disse MPS-produkter ved hjælp at et organisk opløsningsmiddel, som muliggør en selektiv udfældelse fra blandingen af de MPS-forbindelser, som besidder de højeste molekylvægte og/eller er de mest 30 sulfaterede.

DK 172887 B1 5

Det organiske opløsningsmiddel består især af et alkoholisk opløsningsmiddel, ganske særligt ethanol.

Elimineringen af kæderne med lav molekylvægt og kæderne, som har en lav sulfateringsgrad, har til følge, at der 5 opnås MPS-fraktioner med højere USP-titer, mens YW-titeren stort set opretholdes.

De ved udfældningen udvundne MPS-blandinger er generelt karakteriseret derved, at de i hovedsagen er dannet af kæder (1) med en gennemsnitsmolekylvægt på 4000-5000 10 dalton, især ca. 4500, (2) besidder en YW-titer på ca.

180 til 200 enheder/mg og et forhold mellem titerne YW/USP mindre end 10, især ca. 6-3, ganske særligt i størrelsesordenen 4.

Disse blandinger består derudover af en overvejende 15 mængde kæder afsluttet med enheder med 2,5-anhydromanno-strukturen, når de som udgangsforbindelser anvendte forbindelser er resultatet af en fremgangsmåde til depolymerisation af heparin med salpetersyrling.

De ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnåede 20 forbindelser er i besiddelse af biologiske aktiviteter, som især gør det muligt for dem på specifik måde at regulere visse trin i blodets koagulation.

De er således i særlig grad værdifulde ved fremstillingen af lægemidler, som er anvendelige især til forebyggelsen 25 og behandlingen af thromboser og af vævenes ældning.

Disse lægemidler anvendes i de indgivningsformer og med de posologier, som er sædvanlige for den pågældende type af indikationer.

De således opnåede mucopolysaccharid-forbindelser er 30 ligeledes anvendelige ved fremstillingen af biologiske reaktanter, som er anvendelige i laboratoriet, især som 5 DK 172887 B1 6 referenceforbindelser til sammenligningsbrug ved undersøgelsen af andre produkter, på hvilke man afprøver en antikoagulerende aktivitet, især med hensyn til inhiberingen af faktor Xa.

5 Med hensyn til de produkter, der er opløselige i den ved fraktioneringen anvendte blanding af vand og organisk j opløsningsmiddel, er disse blottet for eller praktisk taget blottet for antithrombotisk aktivitet.

Disse produkter kan udvindes ved gelfiltrering af den 10 opløselige fraktion. Anvendelsen af et behandlingstrin bestående af ionbytningschromatografi gør det muligt at fraseparere forskellige typer af oligosaccharider fra produktet, især hexasaccharidiske kæder, som er i besiddelse af en høj inhiberende aktivitet over for 15 neoangiogenese.

Udvindingen af produkter ud fra fraktionerne gennemføres med fordel f.eks. ved alkoholisk udfældning og lyofilisering.

Andre karakteristika og fordele knyttet til den 20 foreliggende opfindelse vil fremgå af de efterfølgende eksempler 1-4. Eksemplerne 1 og 2 angår fremstillingen af MPS-forbindelser, som er i besiddelse af et forhold mellem titrene YW og USP i størrelsesordenen 4, eksemplerne 3 og 4 viser aktiviteten af produkter opnået 25 henholdsvis i overensstemmelse med eksempel 1 og 2, og eksempel 5 angår opnåelsen af produkter, som er praktisk taget blottet for antithrombotisk aktivitet.

Sil DK 172887 B1 7 EKSEMPEL 1

Fremgangsmåde til opnåelse af MPS-forbindelser, som er i besiddelse af et forhold mellem titrene YW/USP på ca. 4

Man bragte 500 g heparin af injektionskvalitet i form af 5 natriumsaltet i opløsning i 4500 ml demineraliseret vand ved en temperatur på 18 °C.

Forholdet YW/USP for det anvendte heparin var i nærheden af 1, idet disse titere repræsenterede en værdi i størrelsesordenen 160-170.

10 Den således opnåede opløsning blev underkastet kraftig omrøring, og pH-værdien deraf blev sænket til 2,5 ved tilsætning af koncentreret saltsyre. Derpå tilsatte man 15 g natriumnitrit opløst i 300 ml vand. Reaktionsblandingens pH blev reguleret til 2,5 ved hjælp 15 af koncentreret saltsyre, og det samlede rumfang af opløsningen blev bragt op på 5000 ml. Derpå lod man reaktionen fortsætte i 45 minutter, hvorpå man sikrede sig fraværet af tilbageværende nitritioner i reaktionsopløsningen, f.eks. ved hjælp af et 20 indikatorpapir imprægneret med kaliumiodid i forbindelse med stivelse (udvikling af en blåviolet farve i nærvær af Ν0Γ -ioner).

Derpå lod man reaktionen fortsætte til den fuldstændige forsvinden af nitritioner og fravær af reaktion på 25 iodstivelsespapir, idet man gennemførte kontrolanalyse hver tredje eller fjerde minut.

Da disse kontrolanalyser var blevet negative, kunne man betragte reaktionen som værende gennemført. Derpå hævede man pH i opløsningen til 10 ved hjælp af koncentreret 30 natriumhydroxid, og man tilsatte 5 g natriumtetraborhydrid.

DK 172887 B1 8

Opløsningen blev holdt under omrøring i 15 timer.

Det ikke omsatte natriumtetraborhydrid blev destrueret ved sænkning af pH til 3,0 ved hjælp af koncentreret saltsyre. Opløsningen blev underkastet omrøring i 15 5 minutter, hvorpå pH igen blev reguleret til 7,0 ved hjælp af koncentreret natriumhydroxid.

I Reaktionsprodukterne blev udvundet ved tilsætning af 10 liter ethanol. Efter 48 timers henstand blev produktet ! fradekanteret, og man fjernede supernatanten.

! 10 Bundfaldet blev genopløst i 10 liter demineraliseret 1 vand. Man tilsatte 100 g natriumchlorid og sænkede pH af opløsningen til 3,8 ved hjælp af koncentreret saltsyre.

' Rumfanget blev reguleret til nøjagtig 10 liter ved hjælp af demineraliseret vand, og man tilsatte under kraftig . 15 omrøring 10 liter ethanol. Man lod henstå i 48 timer.

Derpå afsugede man med en hævert supernatanten, som blev bortkastet. Bundfaldet blev udvundet, vasket med ethanol, " formalet og tørret under vakuum.

Man opnåede 230 g af et produkt med følgende 20 karakteristika: USP-titer = 52 internationale enheder/mg

Yin/Wessler-titer = 225 internationale enheder/mg

Gennemsnitsmolekylvægt = 4000-5000 dalton.

EKSEMPEL 2 25 Fremgangsmåde til opnåelse af MPS-fraktioner med høj YW-titer og USP-titer i et indbyrdes forhold på ca. 4

Man opløste 5000 g heparin af injektionskvalitet i 45 liter demineraliseret vand ved 18 °C.

is DK 172887 B1 9

Man gik frem analogt med eksempel 1, idet man multiplicerede mængderne af reaktanter med 10, dvs.: - idet man tilsatte 150 g natriumnitrit i opløsningen i 3 liter vand, 5 - idet man regulerede reaktionsblandingens rumfang til 50 liter, - idet man udfældede ved hjælp af 100 liter ethanol, - idet man genopløste i 90 liter vand, - idet man tilsatte 1000 g natriumchlorid, 10 - idet man regulerede det endelige rumfang til 100 liter, - idet man endelig tilsatte 100 liter ethanol.

På denne måde opnåede man 2230 g af et produkt, som havde følgende karakteristika: USP-titer * 54 internationale enheder/mg 15 Yin/Wessler-titer = 232 internationale enheder/mg

Gennemsnitsmolekylvægt = 4000-5000 dalton.

Reaktionsprodukterne blev udvundet ved tilsætning af 10 liter ethanol, henstand i 48 timer, dekantering og fjernelse af supernatanten.

20 Bundfaldet blev genopløst i 9 liter demineraliseret vand.

Man tilsatte 100 g natriumchlorid, hvorpå man sænkede pH i opløsningen til 3,8 ved hjælp af koncentreret saltsyre.

Rumfanget blev reguleret til nøjagtig 10 liter ved hjælp af demineraliseret vand, og man tilsatte under kraftig 25 omrøring 10 liter ethanol. Man lod henstå i 48 timer. Supernatanten blev opsuget med hævert og bortkastet.

DK 172887 B1 10

Bundfaldet blev udvundet, vasket med ethanol, formalet og tørret under vakuum.

Man opnåede 230 g af et reaktionsprodukt, som udviste følgende karakteristika: 5 USP-titer = 52 internationale enheder/mg i Yin/Wessler-titer = 225 internationale enheder/mg * Gennemsnitsmolekylvægt = 4000-5000 dalton.

, I det efterfølgende eksempel 3 rapporteres farmakologiske forsøgsresultater, som er blevet gennemført med 10 reaktionsproduktet fra eksempel 1.

I EKSEMPEL 3

Undersøgelse in vitro af aktiviteten af reaktionsprodukterne fra eksempel 1 På de vedlagte figurer 1-4 er vist de kurver, som er 15 opnået ved at undersøge in vitro variationerne med hensyn til koaguleringstiden fremkaldt i humant blodplasma af voksende doseringer af et kommercielt tilgængeligt heparin-produkt og reaktionsproduktet fra eksempel I.

I de forsøg, som svarer til resultaterne vist på fig. 3 20 og 4, har man anvendt plasma befriet for blodplader og med formindsket og meget lille indhold af faktor XI.

Af disse figurer fremgår variationerne af thrombin-tiderne udtrykt i sekunder (fig. 1), af cephalin-kaolin-tiderne (fig. 2), af koagulation i nærvær af koncentreret 25 thromboplastin (fig. 3) og af fortyndet thromboplastin (fig. 4), som blev fremkaldt af de afprøvede produkter, dvs. af reaktionsproduktet fra eksempel 1 (kurverne al, a2, a3 og a4) og af heparin (kurverne bl, b2, b3 og b4) afbildet som funktion af de anvendte respektive dosis.

Γ 1 « 11 DK 172887 B1

Thrombin-tiderne og cephalin-kaolin-tiderne udgør begge to typer af målinger, som frem for alt reflekterer virkningen af de respektive undersøgte præparater på inhiberingen af aktiveret faktor II og af den globale 5 koagulering. Studiet af kurverne i fig. 1 og 2 viser, at MPS ifølge opfindelsen udøver en klart mere reduceret virkning end virkningen af heparin på inhiberingen af aktiveringen af prothrombin og med hensyn til den globale koagulering. Fig. 3 og 4, som er repræsentative for 10 fænomener mere direkte knyttet til sekvensen af de enzymatiske reaktioner, som er karakteristiske for den på ydre forhold beroende koagulation (især det relative fravær af faktor Xla), udviser den fordelagtige virkning af MPS fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen 15 i forhold til heparin.

Det nedenfor beskrevne eksempel 4 angår forsøgsresultater in vivo på kaniner med MPS fra eksempel 2.

EKSEMPEL 4

Undersøgelse af den antithrombotiske aktivitet af produk-20 tet fra eksempel 2 på kaniner

Indgift af 500 enheder YW til kaninen fremkalder en betydelig anti-Xa-aktivitet, medens den samlede antikoagulerende aktivitet forbliver relativt svag.

To timer efter indgift var YW-aktiviteten i 25 størrelsesordenen 0,88 enheder/ml, medens cephalin-kaolin-tiden var på 0,09 internationale enheder/ml.

Forsøg in vitro og in vivo viser således den klart mere selektive virkning af MPS fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, især med hensyn til inhibering af 30 faktor Xa, i sammenligning med heparin.

» DK 172887 B1 12 EKSEMPEL 5

Fremgangsmåde til opnåelse af MPS-fraktioner, som er praktisk taget befriet for antithrombotisk aktivitet

Man anvender den opløselige fraktion fra eksempel 1.

5 Denne fraktion indeholder kæder med 2-14 gentagelsesgrupper.

Et yderligere alkoholisk fraktioneringstrin på denne j fraktion fører til opnåelse af et bundfald, som frasepareres, og til en opløselig fraktion, ud fra 10 hvilken man udvinder blandingen y. Denne blanding består hovedsageligt af kæder indeholdende 6-8 gentagelsesgrupper, og den udviser en YW-titer lavere end I 70 og en USP-titer lavere end 5.

Idet man underkaster blandingen y et gelfiltreringstrin i 1 15 overensstemmelse med klassiske fremgangsmåder, udvinder man hexasaccharidiske blandinger z. Disse forbindelser er næsten fuldstændigt blottet for global antikoagulerende aktivitet og for YW-aktivitet.

EKSEMPEL 6 20 Aktivitet af blandingerne y og z på neoangiogenese

Man gennemførte forsøg in vitro med hensyn til anti-angiogenese-aktivitet på chorio-allantoin-membranen fra 6 dage gamle kyllingefostre ved dyrkning i petriskåle.

Man dannede piller ved sammenblanding af 5 pg 25 hydrocortison og 10 μΐ methylcellulose, hvorpå man tilsatte blandingerne y og z i doser stigende fra 5 pg til 100 pg. De således dannede piller blev tørret og derpå anbragt på chorio-allantoin-membraner, hvortil de klæbede. Ved hvert forsøg anvendte man 4 æg.

DK 172887 B1 13

Efter 48 timers inkubering undersøgte man tilstedeværelsen af avaskulære zoner. Man iagttog et betydeligt fald i antallet af vaskulære zoner. Disse resultater er opnået på bemærkelsesværdig måde med så lidt 5 som 6 pg af de afprøvede forbindelser.

EKSEMPEL 7

Indvirkning af den hexasaccharidiske blanding z på et melanom af typen B 16 mus

Man gennemførte forsøgene på mus C57 BL/6, som var bærere 10 af melanomer B 16.

Behandlingen blev gennemført over en periode på 15 dage.

Man indgav til hver mus ved subkutan injektion to gange om dagen 0,15 mg af hexasaccharidblandingen z og af cortisonacetat med varierende doser, som faldt under 15 behandlingsperioden fra 250 mg/kg/dag til 40-50 mg/kg/dag. Ved afslutningen af den 15 dages periode konstaterede man en standsning af væksten og udviklingen af tumorerne.

Man iagttog ligeledes en gunstig regression af disse 20 tumorer.

Claims (9)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af mucopolysaccharider (MPS) med høj antithrombotisk virkning, kendete g-; net ved, at man underkaster mucosaccharidblandinger 5 bestående af en overvejende mængde MPS-kæder med molekylvægt 1800-8000 dalton, en højere YW-titer og et større forhold mellem titerne YW/USP end heparin, mindst et fraktioneringstrin til selektiv fraseparering af i det ! mindste størstedelen af kæderne med molekylvægt lavere 10 end 2000 og kæderne med en højere molekylvægt, som har en lavere sul fateringsgrad end den gennemsnitlige sulfateringsgrad for kæderne i blandingen, og udvinder de for disse kæder befriede fraktioner, hvilke fraktioner har et mindre YW/USP-forhold end udgangsblandingen, men I 15 større end heparin, samt en højere USP-titer end udgangsblandingen.

= 2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet I ved, at man gennemfører fraktioneringen ved hjælp af en blanding af vand indeholdende et uorganisk salt og af - 20 organisk opløsningsmiddel, hvori i det mindste størstedelen af de ønskede mucopolysaccharider er selektivt uopløselige.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man gennemfører fraktioneringen ved hjælp af et 25 organisk opløsningsmiddel, som muliggør en selektiv udfældning af MPS med kæder med middelmolekylvægt 4000-5000 dalton, især i størrelsesordenen 4500, og som har et YW/USP-forhold mindre end ca. 10, fortrinsvis ca. 6 til ca. 3, især i nærheden af 4, samt en YW-titer på ca. 180-1. 30 200 enheder pr. mg.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at det anvendte organiske opløsningsmiddel er et alkoholisk opløsningsmiddel, især ethanol. as m DK 172887 B1

5. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det anvendte uorganiske salt er et med det ' anvendte organiske opløsningsmiddel blandbart salt, såsom natriumchlorid eller kaliumchlorid.

6. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 2-5, ken detegnet ved, at man indstiller reaktionsblandingens pH til en værdi svarende til et surt pH, især til en pH-værdi lavere end 4.

7. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-6, k e n-10 detegnet ved, at de til fraktioneringen anvendte MPS-blandinger udviser et YW/USP-forhold på mindst ca. 10 og en YW-titer på ca. 200-250 enheder/mg.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at man bringer 5% (vægt/volumen) MPS-blandinger i 15 opløsning i vand indeholdende 20 g/liter NaCl, indstiller pH til 3,8, gennemfører fraktioneringen ved tilsætning af et rumfang ethanol og udvinder det således dannede bundfald.

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1-8, k e n-20 detegnet ved, at de som udgangsforbindelser anvendte MPS-blandinger i den reducerende ende har et led med 2,5-anhydromanno-struktur, fortrinsvis valgt blandt 2,5- anhydromannose-, 2,5-anhydromannitol- og 2,5-anhydromannonsyregrupperne.