DK172711B1

DK172711B1 - Fremgangsmåde, kloningsvektor og grampositiv bakteriecelle til fremstilling af et forud bestemt protein, fremgangsmåde til

Info

Publication number: DK172711B1
Application number: DK198101095A
Authority: DK
Inventors: Shing Chang
Original assignee: Chiron Corp
Priority date: 1980-03-10
Filing date: 1981-03-10
Publication date: 1999-06-07
Also published as: NO810803L; DK109581A; EP0036259A2; CA1182408A; ES510011A0; AU6790281A; AU545912B2; FI810722L; ES500201A0; EP0036259A3; IL62327A0; EP0036259B1; ES8307895A1; DE3177067D1; ES8306796A1

Description

i DK 172711 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fremstilling af et forud bestemt protein ved tilvejebringelse af vækstbetingelser i et vækstmedium for grampositive bakterier indeholdende hybrid-kloningsvektorer, der hver har et gen deri for nævnte forud bestemte protein, idet nævnte forud bestemte protein ikke er oprindeligt hjemme-5 hørende i de grampositive bakterier, og idet genet er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at nævnte forud bestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående af et eukaryot insulinsignal-10 peptid, ved hjælp af hvilket nævnte forud bestemte protein udsondres af nævnte grampositive bakterier, og at nævnte forud bestemte protein udvindes fra nævnte vækstmedium.

De nævnte bakterier er fortrinsvis Bacillus subtilis.

Opfindelsen angår endvidere en hidtil ukendt hybrid-kloningsvektor til fremstilling af et forud bestemt protein ved ekspression ved hjælp af B. subtilis, bestående af en vektor, 15 som er i stand til autonom replikation i B. subtilis, hvori der er indsat et gen for nævnte forud bestemte protein, idet nævnte gen er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens.

Kloningsvektoren ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at nævnte fonid bestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående af et eukaryot 20 insulinsignalpeptid, ved hjælp af hvilket nævnte forud bestemte protein udsondres af B. subtilis.

Opfindelsen angår endvidere en hidtil ukendt grampositiv bakteriecelle, som er i stand til at danne et forud bestemt protein ved ekspression, og som består af en værtsmikroorganisme, hvori der er indsat en hybrid-kloningsvektor, som er i stand til autonom 25 replikation i nævnte vært, idet nævnte vektor har et gen deri for nævnte forud bestemte 2 DK 172711 B1 protein, og idet nævnte gen er gen for et forud bestemt protein, som ikke er oprindeligt hjemmehørende i nævnte værtsmikroorganisme, hvilket gen er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens.

5 Bakteriecellen ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at nævnte forudbestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående af et eukaryot insul insignalpeptid, ved hjælp af hvilket nævnte protein udsondres af nævnte bakteriecelle.

Endelig angår opfindelsen en transformant-bakteriekultur, der er klonet fra en eller flere bakterieceller ifølge opfindelsen. Bakteriekulturen er ejendommelig ved, at medlemmer-10 ne af nævnte kultur er i stand til at udtrykke nævnte forud bestemte protein.

Opfindelsen involverer anvendelse af hidtil ukendte ved genetisk manipulation frembragte plasmider. Eksempler på disse organismer er blevet deponeret ved American type Culture Collection, Rockville, Maryland, 20852. De har fået tildelt ATCC-numrene: 31.776. - 31.778. ATCC nummer 31.776 er blevet tildelt plasmid pOG!196, nummer 15 31.777 er blevet tildelt plasmid pOG2165, og nummer 31.778 er blevet tildelt plasmid pOG2110. Deponeringerne har fundet sted i overensstemmelse med Budapesttraktaten.

Fra Biochemical and Biophysical Res.Comm. 91, 1556-1564 (1979) kendes en B.subtilis-celle, der har fået indsat et a-amylasegen fra B. amyloliquefaciens. Amylasen sekreteres angiveligt over cellemembranen. Denne artikel omtaler imidlertid ikke sekre-20 tion af a-amylase fra Bacillus, ligesom der ikke findes nogen omtale af kontrolsekvenser til fremstilling af α-amylase; netop disse to træk er vigtige træk ifølge opfindelsen. Med hensyn til sekretionen ifølge denne artikel er der i øvrigt tale om, at bakterierne, som vokser på agar, lyseres under væksten, og derfor kan det ikke udelukkes, at mekanismen for diffusion af α-amylase ind i mediet netop er lysering.

3 DK 172711 B1

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen anvendes en transportmekanisme bestående af et eukaryot insulinsignalpeptid. Denne mekanisme har vist sig særligt velegnet til at transportere det klonede genprodukt til et sted, hvorfra det kan høstes.

Som det er velkendt, bestemmes den specielle rækkefølge af aminosyrer i et givet pro-5 tein i overensstemmelse med koden, som bæres i genet for dette protein. I den translationsproces, ved hvilken proteiner dannes af DNA via messenger-RNA, placerer grupper af tre nucleotider i DNA’et, kaldet codoner, hver en af tyve mulige aminosyrer i en tilsvarende stilling i proteinkæden.

Med fremkomsten af rekombinant DNA-teknikker kan genetiske ændringer foretages 10 med overlæg ved indføring af en forudbestemt nucleotid-rækkefølge, enten syntetiseret eller isoleret fra én stamme eller art, i den genetiske opbygning af en anden stamme eller art. Den kendte nucleotid-rækkefølge kan vælges til at få stammen eller arten, hvori den indføres, til som en del af translationsprocessen at danne det ved hjælp af den kendte nucleotid-rækkefølge indkodede protein. Når den modificerede stamme eller art går 15 videre med den normale replikationsproces, dvs. den kemiske kopieringsproces, fordobler den så også den indførte rækkefølge eller sekvensen.

Rekombinant DNA-teknikker omfatter isolering af et passende stykke DNA-kæde (en kloningsvektor) og gennembrydning eller overskæring af de to strenge af DNA i kloningsvektoren på det ønskede sted, hvor det fremmede DNA skal indføres. For at gøre 20 dette anvendes der typisk specielle typer af proteiner, kaldet restriktionsenzymer. Disse restriktionsenzymer vil overskære DNA'et ved specielle nucleotid-sekvenser, selv om overskæringen med nogle restriktionsenzymer ikke nødvendigvis vil optræde på det samme sted på de to sammensnoede DNA-strenge. I et sådant tilfælde, hvis to forskellige typer af DNA overskæres på lignende måde, vil de åbne ender være komplementære 25 og vil under passende betingelser holdes sammen med de komplementære ender liggende side ved side. De kan så sammenbindes enzymatisk (med ligase). Dette gør det muligt at rekombinere to DNA-segmenter fra en anden kilde ind i et enkelt DNA-molekyle.

4 DK 172711 B1 Når DNA-vektoren én gang er blevet isoleret, og det fremmede stykke indført deri, anbringes rekombinant-DNA’et ind i en egnet værtsorganisme. For at værtsorganismen skal kunne kopiere det indførte DNA, er det nødvendigt, at rekombinant DNA'et indføres i værten på en sådan måde, at det bliver en del af dennes genetiske system.

5 I bakterien Escherichia coli er der f.eks. blevet anvendt to hensigtsmæssige typer af kloningsvektorer. E. coli bakterier har hyppigt, foruden hoved-DNA-kæden eller kromosomet, en eller flere uafhængigt kopierende cirkulære løkker af DNA kendt som plasmi- der. En bestemt virustype, der kendes som lambda-bacteriophag (phag), er også i stand til at inficere E. coli og blive en del af dens genetiske system. Rekombinant DNA-10 teknikker har omfattet anvendelsen af en lang række plasmider eller phager som kloningsvektorer. Dette omfatter isoleringen af plasmider eller phager fra bakterierne, åbningen af det isolerede DNA ved hjælp af restriktionsenzymer, indføringen af et fremmed- eller heterologt stykke DNA i plasmidet eller phagen, gendannelsen af den cirkulære form af plasmid- eller phagstrukturen og returnering af plasmidet eller phagen 15 til E. coli-cellen. Når den først er i værten kopieres det heterologe DNA ikke blot fra generation til generation, men der vil også dannes det protein, som det koder, hvis der eksisterer passende læserammer og promotorer.

Når heterologt DNA med held er blevet rekombineret i en værts mikroorganisme, og mikroorganismen har dannet det klonede genprodukt, skal det ønskede produkt udvindes.

20 For at dette kan finde sted, har det indtil den foreliggende opfindelse været nødvendigt at nedbryde cellerne, som danner det ønskede product, for at høste produktet selv. På grund af at celler naturligt indeholder en lang række forskellige proteiner, kan isoleringsprocessen for det ønskede produkt også være vanskelig eller indviklet. Endelig kan slutproduktet være skadelig for værtscellen, specielt hvis det dannes i en høj koncen-25 tration. I nogle tilfælde kan dette resultere i nedbrydning af cellerne, og i andre tilfælde kan det resultere i, at cellerne aktiverer en defensiv mekanisme til at nedbryde det ønskede produkt.

5 DK 172711 B1

Det meste rekombinant DNA-arbejde er hidtil blevet gennemført med E. coli. E. coli hører til den gramnegative klasse af bakterier, som indeholder to membranlag, der omslutter et periplasmisk rum. Mange af produkterne, der produceres i E. coli, udson-dres i dette periplasmiske område, hvis de i det hele taget udsondres. Nogle få produkter 5 udsondres uden for de levende celler i vækstmedierne. Se f.eks. EP 6694 A2 på side 2 og Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) på side 3730, der hver omhandler sekretion af et sammensmeltet rekombinant protein ind i den transformerede E. coli’s periplasma, men ikke ind i vækstmedierne.

På den anden side er Bacillus subtilis et medlem af den grampositive klasse af bakterier, 10 som kun indeholder ét enkelt lag bakteriemembran. B. subtilis kan således danne en stor mængde protein, som udsondres direkte i vækstmedierne. Selv om den almene fremgangsmåde til genkloning i E. coli kan anvendes til B. subtilis, har forsøg på at fremstille et nyttigt produkt af heterologt gen, klonet ind i B. subtilis, og udsondret i vækstmedierne hidtil været mislukkede. Se f.eks. Yoneda, Biochem. and Biophys. Res. Comm., 15 91 (4) 1556 - 1564 (1979), som omhandler produktion af en fremmed α-amylase i B.

subtilis, men ikke sekretion deraf i vækstmedierne. B. subtilis foretrækkes frem for E. coli på grund af en større effektivitet overfor plasmidformidlet transformation, og fordi den ikke er patogen.

For fagfolk vil yderligere formål med opfindelsen fremgå af den efterfølgende beskrivel-20 se i forbindelse med de medfølgende tegninger, hvori fig. 1 er en skematisk tegning, som giver en partiel strukturel kortlægning af et DNA-fragment, som indeholder genet for β-lactamase opnået fra Bacillus licheniformis, fig. 2 er en skematisk tegning, som viser sammenhængen mellem en række af nucleotid-sekvenseme i fragmentet i fig. 1 og proteinsekvensen, som findes i proteinet, for hvilket 25 fragmentet koder, og også viser de tilsvarende restriktionsenzymgenkendelsessteder, 6 DK 172711 B1 fig. 3 er et billede, som viser det typiske udseende af plader, hvorpå Bacillus subtilis-stammer, der huser rekombinantplasmideme, dyrkes, som pladerne viser sig efter PVA-prøve for β-lactamase-aktivitet, fig. 4 er en skematisk illustration af opbygningen af E. coli plasmid pOG2HO, B.

5 subtilis plasmid pOG1196 og det bifunktionelle plasmid pOG2165,

Fig. 5 er et billede, som viser det typiske udseende af plader, hvorpå forskellige bakterie-stammer, som huser rekombinantplasmideme, dyrkes, som pladerne serud efter PVA-undersøgelse for β-lactamase-aktivitet, og fig. 6 er et diagram over nucleotideme, som omfatter en portion af B. licheniformis Pen 10 P genet.

Meget generelt og i overensstemmelse med en udførelsesform for opfindelsen dannes et forudbestemt protein, som ikke er oprindeligt hjemmehørende i B. subtilis, ved ekspression ved hjælp af B. subtilis. Der tilvejebringes vækstmedier og betingelser til dyrkning afen stamme af B. subtilis, hvori der er blevet indført et plasmid. Der kan ske replika-15 tion af plasmidet i stammen, og plasmidet har et gen deri for det forudbestemte protein.

Genet er anbragt og orienteret i plasmidet, således at der er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens. Proteinet er også under kontrol af en transportmekanisme, hvormed proteinet udskilles ved hjælp af værtsstammen. Efter udsondringen udvindes proteinet fra vækstmediet.

20 Når det forudbestemte protein udtrykkes i en gramnegativ bakterie, såsom E. coli, transporteres proteinet igen gennem bakteriemembranen ved hjælp af transportpeptidet.

Proteinet "udsondres" imidlertid her ind i det periplasmiske område i stedet for vækstmediet, da den gramnegative bakterie har en cellevæg foruden dens normale bakteriemembran. Det forudbestemte protein kan udvindes fra det periplasmiske område.

7 DK 172711 B1

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen nødvendiggør anvendelsen af en kloningsvektororganisme, som indeholder en sekvens af nucleotider, som er i stand til at initiere trasnkriptions- og translationsprocessen. Disse nucleotider, som giver en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens, kan være naturligt forekommende i vek-5 toren, kan indføres deri som et særskilt segment af DNA under anvendelse af rekombinant-DNA-teknik eller kan være en del af det heterologe DNA, som indeholder den gen, der er af interesse. Det heterologe DNA, som vil indeholde i det mindste de strukturelle gen for et ønsket proteinprodukt, anbringes i kloningsvektoren for at blive transkriberet og translateret under kontrol af operator, promotor og ribosomal bindings-10 stedfrekvens. Til korrekt translation til det indførte heterologe DNA skal nucleotideme i det indførte DNA være i korrekt aflæsningsramme. Det kan desuden være ønskeligt eller endog nødvendigt, at kloningsvektoren indeholder et tilstrækkeligt antal nucleotider, som er medfødt i værtscellen for at sikre gennemført translation fra operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens i og gennem det indførte heterologe DNA 15 i den korrekte aflæsningsramme.

Ifølge opfindelsen omfatter den anvendte kloningsvektor en sekvens af nucleotider, som omfatter kodoner for en funktionel transportsignalpeptid-sekvens. Transportsignalpeptid-sekvenser er typisk kortere ledersekvenser af aminosyrer på ny fremstil lede proteiner.

Selv om mekanismen, hvormed transportsignalpeptid-sekvensen arbejder, ikke kendes 20 fuldstændigt, antages det, at det transporterede protein udskilles af cellen og fjerner det protein, som hører hertil, fra cytoplasmaet, efterhånden som proteinet fremstilles. Når først transportfunktionener blevet gennemført ved hjælp af transportsignalpeptid-sekvensen, kan transportsekvensen fjernes ved hjælp af naturlige processer.

Ifølge opfindelsen skal det heterologe DNA indføres i kloningsvektoren på et sted, som 25 tillader proteinet, som det indkoder, at blive transporteret i overensstemmelse med transportsignalpeptid-sekvensen, som er kodet ved hjælp af signalkodoneme. Det klonede genprodukt kan således hensigtsmæssigt transporteres til et ønsket sted, hvorfra genproduktet kan høstes. Dette har flere fordele. På grund af, at stedet er uden for 8 DK 172711 B1 cellen, behøver værtscellerne ikke at blive nedbrudt, for at man kan høste genprodukterne, hvorved der åbnes mulighed for kontinuerlig eller uafbrudt fremstilling af genproduktet. Da celler indeholder et stort antal proteiner, gør evnen til at eksportere det klonede genprodukt isoleringen og rensningen af produktet til en langt simplere opgave.

5 Da klonede genprodukter, specielt hvis de fremstilles i en høj koncentration, yderligree kan være skadelige for værtscellerne, betyder muligheden for at høste de klonede genprodukter udenfor cellemembranerne ofte, at produkterne ikke vil beskadige cellerne, ligesom det heller ikke er sandsynligt, at cellerne vil danne et defensivt enzym, som vil nedbryde genproduktet.

10 Det nøjagtige sted, hvor det heterologe DNA skal indføres i kloningsvektoren, vil naturligvis afhænge af, hvorledes transportsignalpeptid-sekvensen fungerer. I nogle tilfælde vil transportsignalpeptid-sekvensen være umiddelbart før det heterologe DNA, enten som en del af genet selv eller ved allerede at have været til stedet i plasmidet. Signalsekvensen selv kan udgøre den nødvendige sekvens af nucleotider til frembringelse af gennem- 15 gående translation af det heterologe DNA. På den anden side kan der være tilfælde, hvor transportsignalpeptidsekvensen skal være placeret andetsteds end umiddelbart forud for det heterologe DNA. I sådanne tilfælde kan det være nødvendigt at danne den ønskede peptidsekvens med nogle yderligere aminosyrer i begyndelsen (kodet ved hjælp af frem-medkodoner) for at tilvejebringe de nødvendige aflæsningsfunktioner.

20 De følgende eksempler belyser andre specifikke tilfælde, hvor opfindelsen kan anvendes, men begrænser på ingen måde den foreliggende opfindelses omfang:

Eksempel 1

Konstruktion af et plasmid til fremstilling af et transporteret forudbestemt protein, der ikke er oprindeligt forekommende i en værtsorganisme.

9 DK 172711 B1

For at tilvejebringe et plasmid til fremstilling af et forudbestemt protein, som ikke er oprindeligt hjemmehørende i en værtsorganisme, blev en plasmidvektor indeholdende B. licheniformis β-lactamase-genet fremstillet og derpå kopieret i både B. subtilis og E. coli. Plasmidet blev fremstillet ved at rense et 3,5 kilobase EcoRi-Sstl-ffagment indehol-5 dende β-lactamase-genet og derpå ligere det med et 2,1 kb langt EcoRi-Sstl-fragment indeholdende replikationsfunktionen af E. coli-plasmidet Ρ0ΡΙΔ6 (beskrevet af Gelfant et al. Proc. the Nat. Acad. Scid. USA, (1978) 75, 5869-5873).

Efter transformation i kompetente E. coli CS412-celler (et r~m*Pr°_ -derivat af C600) og en vækstperiode, der er tilstrækkelig til ekspression (90 min), blev der opnået 10 Ap-resistente transformanter. Der blev fremstillet plasmider fra tre kloner; der blev yderligere karakteriseret et plasmid med betegnelsen pOG2110. Fig. 4 viser placeringen af forventede og observerede restriktionssteder i pOG2110.

For at muliggøre replikation af pOG2110 i B. subtilis blev der frembragt en bifunktional replikon under anvendelse af pOG2110 og B. subtilis plasmidet pOGl 196. Konstruktio-15 nen af pOGl 196 er sammenfattet i fig. 4.

I begyndelsen blev der fremstillet et chimeret plasmid (pCS832) indeholdende de komplette sekvenser af plasmider pC194 (CmR) og pUBHO (kmR) ved at ligere de to Mbol-fragmenter af pC 194 med detBamHI-fordøjede pUBl 10. Det resulterende plasmid medførte Cm-genet fra PC194 og Km (Nm)-genet fra pUBl 10. Det har en størrelse på 20 7,5 kilobaser. Der blev opnået en spontan udslettelsesmutant (plasmid pCS1006) fra en af under-klonerne. Den havde mistet HpalT-placeringen hidrørende fra pC194, og som man ved er placeret i pC194 replikationsområdet (Chang og Cohen, Molec. Gen. Genet., (1979) 168, 111-115). Den bevarede stadigt replikationsfunktionen af pUBllO og de to resistensmarkører. Ved at recirkulere det største Hpall-fragment (3,6 kilobaser) 25 af PSC1006, blev der opnået plasmid pOGl 196. Dette plasmid giver kun Cm-mod-standsdygtighed og besidder replikationsfunktionen afledt af plasmid pUBl 10. Planen over pOG1196 er vist i fig. 4.

10 DK 172711 B1 E. coli-plasmid pOG2110 og B. subtilis-plasmid pOGl 196 indeholdt henholdsvis to og tre PvuII-steder. Lige store mængder af PvuII-fordøjet pOG2110 og pOGl 196-plasmid DNA blev ligeret og anvendt til at transformere E. coli stamme CS412. Cm-modstands-dygtige kloner blev udvalgt. Alle var også Ap-modstandsdygtige. Det sammensatte 5 plasmid pOG2165, der blev isoleret fra en af de Cm-modstandsdygtige Ap-modstands-dygtige transformanter, blev undersøgt yderligere. En plan over dette 7,5 Kb lange plasmid er vist i fig. 4. Plasidet pOG2165 kopieres i både E. coli og B. subtilis og giver hver vært både Cm- og Ap-modstandsdygtighed.

B. subtilis og E. coli celler, som rummer plasmid pOG2165, er modstandsdygtige 10 overfor ampicillin, som et resultat af dannelsen af B. licheniformis β-lactamaseenzymet.

Dette kan påvises ved hjælp af PVA-pladeprøven udviklet af Sherratt og Collins, J.

Cem. Microbiol., (1973) 76,217-230. De fra en sådan prøve opnåede positive resultater er vist i fig. 5.

Når pOG2165 propageres i B. subtilis BD224, syntetiseres både den membranbundne 15 og den udskilte form af den heterologe β-lactamase. Den ved hjælp af denne stamme dannede mængde varierer og afhænger af de anvendte vækstbetingelser. pOG2165 kan også propageres i B. subtilis stamme QB127 (Kunst et al.. Bio. Chemie. (1974) 56, 1418-1490). QB127 er en bakteriestamme med sacUh-mutationen, som forårsager overproduktion af adskillige exoenzymer, såsom levansucrase, α-amylase og ekstra-cellulære 20 proteaser. Koncentrationen af β-lactamase påvist i kulturer af QB127 (pQ2165) svarer til de koncentrationer, som er påvist i BD224 (pOG2165)-kulturer under de samme betingelser.

Det bifunktionelle plasmid pOG2165 selv har unikke steder for restriktionsenzymer SstI,

HindITT, PstI og Bglll. Indførelse af DNA i Bglll- og Pstl-positioneme fører til en 25 aktivering af B. licheniformis β-lactamase-genet og giver en let genkendelig fænotype til identifikation af kloner, som bærer indskud.

DK 172711 B1

II

Når den nøjagtige aflæsningsramme af DNA-sekvensen, der skal indføres, kendes, er det muligt at danne et fusionsprotein, som indholder ledresekvensen og de første 71 aminosyrerester af β-lactamase-exoenzymet ved kloning i Bgill stedet. Fusionsprotein fremstillet på denne måde udsondres af Bacilluscelleme på grund af tilstedeværelsen af 5 ledersekvensen ved aminoterminalen. Disse træk gør pOG2165 til en nyttig vektor for kloning og effektiv ekspression af heterologe gener og den efterfølgende udsondring af genproduktet i B. subtilis og E. coli.

Når på den anden side den nøjagtige aflæsningsramme af DNA-sekvensen, der skal indføres er kendt, og indføringen sker ved pstl-stedet, dannes et sammensmeltet protein, 10 som vil akkumulere i værtsorganismen. Da Pstl-genkendelsesstedet er anbragt i den første del af nucleotidsekvensen, som koder for signalpeptidet, omskrives eller transkri-beres kun en del af denne sekvens, før den heterologe gensekvens mødes. Selv om fusionsproteinet udtrykkes, er denne del af signalpeptidet utilstrækkelig til at opnå det normale signalpeptids sekretionsfunktion. Som et resultat heraf akkumulerer produkter 15 af gener indført ved Pstl-stedet i værtsorganismen.

En del af nucleotidsekvensen, som omfatter B. licheniformis Pen P genet er vist i diagramform i fig. 6. β-lactamasepromoter-området er anbragt mellem nucleotideme 1 og 221. Den nøjagtige placering kendes ikke. Nucleotideme, som koder for aminosyreme, omfatter signalpeptidet som begynder med nucleotid 222 og ender med nucleotid 323.

20 Som et resultat heraf er signalpeptidet sammensat af 34 aminosyrer. Pstl-genkendelsesstedet er anbragt mellem nucleotid-positioneme 259 og 264 eller ved aminosyreme 13-15 på signalpeptidkæden. Indføring af heterolog DNA i denne Pstl-position vil føre til dannelsen af et sammensmeltet protein sammensat af det heterologe DNA-produkt og de første 14 aminosyrer af signalpeptidkæden. Et sådant sammensmeltet protein vil blive 25 udtrykt men ikke transporteret gennem bakteriemembranen. Vellykket udsondring kræver sammensmeltning med enten hele signalpeptidet eller sammensmeltning med mindst de første 26 aminosyrerester i signalpeptidkæden.

12 DK 172711 B1

Eksempel 2 B. licheniformis danner en stor mængde β-lactamase i den udskilte form (exo-enzym).

Udskillelse af dette protein antages at være resultatet af indvirkningen mellem bakterie-membranen og aminosyreledersekvensen, som letter transporten af proteinet gennem 5 signalbakteriemembranbarrieren. β-lactamase-genet blev klonet og indført i plasmider, som kunne kopieres i B. subtilis. Plasmideme blev så overført i B. subtilis værterne, hvilket resulterer i udskillelsen af β-lactamase. Dette udgør den første ekspression af et heterologt gen i B. subtilis og transporten af gen-produkterne ind i dyrknings- eller vækstmedier fra B. subtilis-celleme.

10 For at klone β-lactamase-genet fra B. licheniformis-stammen blev totalkromosom DNA fraB. licheniformis-stamme749/C isoleret og fordøjet med EcoRI-restriktion endonuclease. Kromosom DNA isoleret fra B. licheniformis 749/C blev fremstillet ifølge Marmur (J. ogMolec. Biol. (1961)2, 208-18). E. coli-plasmidet pSCIOl isoleres fra celler under anvendelse af den klarede lysat-fremgangsmåde ifølge Kupersztoch og Helinski (Bio-15 chem. Biophys. Res. Commun. (1973) 54, 1451-59). 3 ^g kromosom DNA og 2 μg pSCIOl DNA blev fordøjet med endonuclease EcoRJ og ligeret med T4 DNA-ligase som beskrevet (Hershfield, et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1974) 71, 3455-59) og transformeret til kompetente celler af E. coli stamme CS412 (et r^ni^Pro- -derivat af C600) under anvendelse at protokollen ifølge Cohen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci., 20 USA, (1972) 69, 2110-14).

Transformanter, der er modstandsdygtige overfor ampicillin ved 10 μg/m\, blev udvalgt, og en af transformanteme, som bærer rekombinantplasmidet betegnet pTB2, blev karakteriseret yderligere. Plasmid pTB2 bærer et 4,2 kp (kilobasepar) EcoRI fragment på pSCIOl-vektoren. Dette plasmid giver værten tetracyklin-(markøren på pSCIOl) og 25 ampicillin-modstandsdygtighed, hvilket viser, at β-Iactamase-genproduktet fremstilles som et funktionelt enzym, der nedbryder ampicillin i medierne.

13 DK 172711 B1 β-lactamase-genet er anbragt på det ovennævnte 4,2 kilobasepar lange EcoRI-fragment. Efterfølgende analyse af dette fragment under anvendelse af forskellige restriktionsenzymer og genkloning tillader deduktion af strukturen af genet for dette enzym, som delvis kortlagt og vist i fig. 1. Den primære sekvens af β-lactamasen fra B. licheniformis-5 stamme 749/C er tidligere blevet bestemt (R. I. Meadway, pH.D., Thesis, University of Edinburgh, 1969). Fra den kendte aminosyresekvens svarer Gly-Pro (stilling 116-117) sekvensen til nucleotidsekvensen GGN-CCN, som igen er genkendelsessekvensen for endonuclease Sau96I (GGNCC). Trp-Pro (stilling 222-223)-sekvensen kodes ligeledes ved hjælp af nucleotid-kodoner TGG-CCN, hvori center-tetranucleotidsekvensen GGCC 10 genkendes og spaltes ved hjælp af endonuclease Haem (se Roberts, i DNA Insertion Elements, Plasmids, and Episomes, 1977, ed. Bukari, Shapiro and Adhya, Cold Spring Harbor Lab., p. 757).

Det 4,2 kb lange klonede fragment blev analyseret ved hjælp af en række endonucleaser som angivet i fig. 2 under anvendelse af de af leverandøren anførte betingelser (New 15 England Biolabs, Inc., Beverly, MA 01915, 1978 katalog). Det fordøjede DNA blev analyseret på agarose-celler, som beskrevet af Sharp, et al. (Biochemistry (1973), 12, 3055-63), og på acrylamid-geler (Maxam and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1973) 73, 3942-46). De kortlagte data er sammenfattet i fig. 2. Sau961-stedet og Haelll-stedet blev anbragt i 2,3 kilobase PvuII-fragmentet, som indeholder den 20 komplette β-lactamase-gensekvens. Disse to steder er adskilt af 320 nucleotider, som stemmer overens med proteinsekvensdataene (106 aminosyrer borte).

Efter identifikation af nucleotidsekvensen, som indeholder β-lactamasegenet, blev genet klonet ind i B. subtilis under anvendelse af forskellige Bacillus-plasmider og under anvendelse af et hybrid B. subtilis-E. coli-plasmid. Plasmider omfatter pUBllO og 25 pC221 afledte plasmider. B. subtilis-stammerne, der rummer rekombinantplasmideme, bliver modstandsdygtige overfor ampicillin samt giver en positiv β-lactamasereaktion på PVA-pIader (se fig. 3). β-lactamase-aktivitet blev yderligere påvist i kulturer efter fjernelse af bakterieceller. Denne aktivitet viser helt klart den vellykkede ekspression af 14 DK 172711 B1 det heterologe gen i B. subtilis såvel som transport af proteinet gennem bakteriemembranen ind i kulturen eller vækstmedierne.

EcoRi-fragmentet, som indeholder β-lactamase-genet blev klonet på B. subtilis-plasmid-vektoreme pUBllO (Gryczan og Dubnau, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1978) 75, 5 1428-1432) og pC221 (Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, (1977) 74, 1680-82) ved de respektive EcoRI-steder under anvendelse af den fremgangsmåde, som ovenfor er beskrevet i forbindelse med E. coli. 2,3 kilobase PvuII-fragmentet indeholdende β-lactamase-genet er ligeledes også blevet klonet på pUBllO ved PvuII-stedet og Tacl-stedet.

10 Ligerede DNA-præparater blev anvendt til at transformere B. subtilis stamme BD224 (recE4, trpC2, thr5) ved hjælp af Chang og Cohen-metoden (Molec. Gen. Genet., (1979) 168, 111-115). Transformanter, der er modstandsdygtige overfor ampicillin på regenerationsplader, blev udvalgt og afprøvet. Dannelsen af β-lactamase påvises ved hjælp af to metoder. Den ene er en sentitiv pladeprøve udviklet af Sherratt og Collins 15 (J. Gen. Microbiol., (1973) 76, 217-230), den anden er den iodometriske prøve beskre vet af Ross og O'Callaghan, (Meth. in Enzymology, (1975) 43, 69-85). B. subtilis-kloner, der er modstandsdygtige overfor ampicillin, gav positive resultater ved begge undersøgelser, β-lactamase-aktiviteten blev desuden også bestemt i kulturen efter fjernelse af cellerne, hvilket viser, at β-lactamasen ikke blot blev fremstillet, men også ekspor-20 teret i B. subtilis.

Kloningen af heterologe gener i B. subtilis og den funktionelle ekspression af disse gener som intracellulære proteiner er tidligere blevet vist af Keggins, et al., Proc. Natl. Acad.

Sci., USA, (1978) 75, 1423-1427). I denne undersøgelse er de klonede gener imidlertid gener, som koder for enzymer, der normalt findes intracellulært i vildtype B. subtilis.

25 Den heldige ekspression af gener, som ikke er oprindeligt hjemmehørende i B. subtilis, og en vellykket udskillelse af produkterne af disse gener blev ikke vist.

15 DK 172711 B1

Arbejdet på β-Iactamase-genet, som vises i dette eksempel, er det første bevis på, at en ny funktion, nemlig β-lactamaseproduktion kan indføres i B. subtilis under anvendelse af genkloningsteknik. Dette eksempel udgør desuden det første bevis for, at et fremmed genprodukt kan bringes til at passere gennem B. subtilis-membranbarieren og blive 5 udskilt som et exo-protein. β-lactamasen, som er et kommercielt nyttigt produkt, fremstilles ved hjælp af en stamme, som ikke ellers danner dette enzym.

Eksempel 3 B. llicheniformis β-lactamase-genet, som er beskrevet i eksempel 2, blev også indført i plasmider, som er i stand til at blive kopieret i E. coli. Disse plasmider blev transfor-10 meret ind i E. coli-værteme under anvendelse af fremgangsmåder, som er identiske med de i eksempel 1 beskrevne for B. subtilis. E. coli-celler, som rummer plasmideme, er modstandsdygtige over for ampicillin som resultat af produktion af B. licheniformis β-Iactamaseenzymet. Dette er påvist ved hjælp af PVA-prøven, der er udviklet af Sherratt og Collins, J. Gen. Microbiol., (1973 76, 217-230.

15 Når plasmider, der bærer B. licheniformis β-lactamase-genet, propageres i E. coli, transporteres den udsondrede form at enzymet ikke ind i dyrkningsmediet, som det sker i B. subtilis. Da E. coli har en cellevæg, som omgiver den begrænsende bakteriemembran, transporteres det heterologe proteinprodukt til det periplasmiske rum, som adskiller cellevæggen fra bakteriemembranen, β-lactamase-exo-enzymet fik lov til at akkumu-20 lere i det periplasmiske rum og blev derpå udvundet ved hjælp af passende metoder.

Eksempel 4 β-lactamase-genet i B. licheniformis er ikke den eneste kilde for en signalpeptidsekvens, der kan fungere i B. subtilis eller E. coli. Som angivet ovenfor transporteres mange proteiner (specielt i eukaryote celler) gennem membraner. Selv om den nøjagtige amino-25 syresekvens af "signalområdet" kan og i virkeligheden vil variere blandt forskellige 16 DK 172711 B1 transporterede proteiner, er de foldede strukturer af disse områder, der kan forudsiges ifølge Chou og Fasmans regler (ann. Rev. Biochem. (1978) 47, 251-276), meget lignende. Betingelserne for at en transportsignalpeptidsekvens kan opfyldes med ikke-Bacillus-signalpeptider, er at signalsekvensen, som indkoder DNA-fragment, er korrekt placeret 5 i forhold til en Bacillus-promotor og ribosomal bindingsstedsekvens.

En sådan eukaryot transport-signalsekvens, der kan anvendes i forbindelse med et ønsket genprodukt, er signalet eller sekvensen, som går forud for insulin-B-kæden. (De forskellige insulinkæder A, B og C opbygges som et enkelt polypeptid og samles og behandles i det endoplasmiske reticulum på vej til at blive eksporteret af cellen). I insulin-præse-10 kvensen er der imidlertid intet hensigtsmæssigt restriktionssted umiddelbart efter signal-peptidsekvensen, der kan anvendes til at forbinde det med et klonet gen af heterolog DNA. De sidste fem nucleotider af signalsekvensen i insulin er ikke desto mindre AGGCT, og det første nucleotid af insulin-B-kæden er T. Disse seks nucleotider sammen (AGGCTT) afviger ved et enkelt nucleotid fra AAGCTT, som er i genkendelsesse-15 kvensen or restriktionsenzymet HindHI. Enzymet skærer mellem de to A'er. Hvis det heterologe DNA blev klonet eller adskilt under anvendelse af det samme enzym, Hin-dlTI, eller anvendelse af en halv Hindm sted-bifunktionel binder, vil sekvensen blive gengivet, når det heterologe DNA indføres.

Det enkelte nucleotid G, kan ændres til et A til frembringelse af Hindlll-stedet ved hjælp 20 af fremgangsmåden, der er beskrevet af Bahl i US patentnummer 4.351.901. Ved nævnte fremgangsmåde bliver nucleotidet, der skal ændres, eksponeret og sekvensen rekonstrueret. Denne ændring resulterer ikke i nogen ændringer af signalsekvensens næstsidste aminosyre.

DNA-ligeringen kan gennemføres som beskrevet af Hershfield et al. (Proc. Natl. Acad.

25 Sci., USA, (1974) 71,3455-3459). Omvendt transkriptase kan anvendes som en DNA-polymerase, således som det er beskrevet af Bahl et al. (Proc. Natl.Acad. Sci., USA, 17 DK 172711 B1 (1977) 74, 966-970). Transformation kan forløbe som beskrevet af Cohen et al. (Proc.

Natl. Acad. Sci., USA (1973) 70, 3240-3244).

Eksempel 5

Selv om den ovenfor i eksempel 4 beskrevne fremgangsmåde er teknisk anvendelig, er 5 det en eukaryot ledersekvens, og fremgangsmåden kan således kun anvendes i forbindelse med almindelig forskning. En mere gunstig vej fra et kommercielt synspunkt er typisk i forbindelse med en prokaryot (bakteriel) vært. Selv om der kun kendes nogle få signalsekvenser i forbindelse med prokaryote systemer, er en sekvens, som er udmærket karakteriseret, sekvensen fra TEM β-Iactamase. (Sutcliffe, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 10 (1976) 75, 3747-3741). Denne sekvens er ideel til vedhæftning til et klonet gen, bortset fra at der ikke er noget hensigtsmæssigt restriktionssted på stedet for præsekvensopar-bejdning. Det nærmeste restriktionssted ved signalsekvensen er et Mbol-sted, som ville resultere i vedhæftning af 16 fremmede aminosyrer til det klonede genprodukt.

Endedelen af signalsekvensen, som er TTTGCT, kan ikke desto mindre ændres ved 15 hjælp af en af de ovenfor beskrevne metoder til TTTGAT. Når sidstnævnte sekvens læses sammen med de første få efterfølgende nucleotider af TEM β-lactamasegenet, eksisterer der et restriktionssted for Cell (TGATCA). Dette resulterer i ændring af slutaminosyren fra Ala til Asp og i vedhæftning af en ekstra aminosyre til genproduktet, enten Glu eller His afhængig af, hvad det først vedhæftede nucleotid af det heterologe 20 DNA er.

For at gennemføre den foregående ændring i nucleotider kan der anvendes den ovenfor beskrevne metode, hvori et kort fragment syntetiseres. Der er sammenstillende restriktionssteder i den ene retning fra signalsekvensen (Thai) og et restriktionssted Mbol, som nævnt ovenfor, i den anden retning. Der eksisterer et taq-sted endnu længere væk i den 25 sidstnævnte retning. Restriktionsbetingelser kan følges for Thai, som beskrevet af McConnell, et al., Nucleic Acid Res. (1978) 5, 1729-1739; for Mbol af Gelinas, et al., 18 DK 172711 B1 J. Mol. Biol. (1977) 114, 169-179, eller Taql af Sato, et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1977) 74, 542-546). Det skal bemærkes i forbindelse med Mbol, at DNA fremstilles i værtscellen GM119, der mangler deoxyadenosinmethylase (for at undgå methy-lering af områder og hindre Mbol-skæring). I denne sidstnævnte forbindelse se Marinus 5 og Morris, Mutat. Res. (1975) 28,15-26. Restriktionsnucleasen SAU 3A, et isoschizom af Mbol, kan alternativt anvendes med DNA isoleret fra en hvilken som helst vært.

Det vil derfor ses, at opfindelsen tilvejebringer en fremgangsmåde og et vektor til den kontrollerede akkumulering af heterologt klonede genprodukter. Produkterne overføres og transporteres uden for værtscellen, hvilket gør det muligt, at udvindingen af produktet 10 forløber med minimale restriktioner og undgår sandsynligheden for nedbrydning eller destruktion af enten værtscellen eller genproduktet selv.

19 DK 172711 B1

REFERENCER

1. Bahl, C.P., Wuf R.r Stawinsky, J. and Narang, S.A., Proc.

Nat. Acad. Sci., USA, (1977) 74, 966-970.

5 2. Chang, A. and Cohen, S., Molec Gen. Genet., (1979) 168, 111-115.

3. Chou, P.Y. and Fasman, G.D., Ann. Rev. Biochem., (1978), 47, 251-276.

10 4. Cohen, S.N. and Chang, A.C.Y., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1972), 69, 2110-2114.

5. Cohen, S.N., Chang, A.C.Y., Boyer, H.W. and Helling, R.B., 15 Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1973) 70, 3240-3244.

6. Ehrilich, S.D., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1977) 74, 1680-1682 .

20 7. Gelinas, R.E., Myers, P.A. and Roberts, R.J., J. Molec.

Biol., (1977) 114,169-179.

8- Gelfand, D., Shepard, H., O'Farrell, P. and Polisky, B.,

Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1978) 75, 5869-5873. 1

Grycazn, T.J., and Dubnau, D·, Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1978) 75, 1428-1432.

20 DK 172711 B1 10. Hershfield, V., Boyer, H.W., Yanofsky, C., Lovett, M.A. and Helsinki, D.R., Proc. Nat. Acad. Sci., DSA, (1974) 71, 3455-3459 .

11. Keggins, K.M., Lovett, P.S. and Duvall, E.J., Proc. Nat.

5 Acad. Sci., USA, (1978) 75, 1423-1427.

12. Kunst, F., Pascal, M., Lepesant-Kejzlarova, J., Lepesant, J., Billault, A. and Dedonder, R., Bio. Chemie., (1974) 56, 1481-1490 .

13. Kupersztoch, Y. and Helinski, D., Biochem. Biophys. Res.

10 Cominun., (1973) 54, 1451-1459.

14. Marinus, M.G. and Morris, N.R., Mutat. Res., (1975) 28, 15-26.

15. Marmur, J., J. Molec. Biol., (1961) 3, 208-218.

16. Maxam, A. and Gilbert, W., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 15 (1973) 73, 3942-3946.

17. McConnell, D.J., Searcy, D.G. and Sutcliffe, J.G., Nucleic Acids Res., (1978) 5, 1729-1739.

18. Meadway, R.J. Ph.D. Thesis, University of Edinburgh,(1969).

19. Roberts, R.J., in DNA Insertion Elements, Plasmids and 20 Episomes, (1977), Editors, Bukhari, A.I., Shapiro, J.A., and

Adhya, S.L., Cold Spring Harbor Laboratory, side 757-768.

20. Ross, G.W. and 0:Callaghan, C.H., Meth. Enzymol., (1975) 43, 69-85, 21. Sato, S., Hutchison, D.A. Ill and Harris, J.I., Proc. Nat.

25 Acad. Scid. USA, (1977), 74, 542-546.

21 DK 172711 B1 22. Sharp, P.A., Sugden, B. and Sajnbrook, J., Biochem., (1973) 12, 3055-3063.

23. Sher.'jtt, D.J. and Collins, J.F., J. Gen. Microbiol., (1973), 76, 217-230.

5 24. Sutcliffe, J.G., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, (1978) 75, 3737-3741.

Claims

22 DK 172711 B1
1. Fremgangsmåde til fremstilling af et forud bestemt protein ved tilvejebringelse af vækstbetingelser i et vækstmedium for grampositive bakterier indeholdende hybrid- 5 kloningsvektorer, der hver har et gen deri for nævnte forud bestemte protein, idet nævnte forud bestemte protein ikke er oprindeligt hjemmehørende i de grampositive bakterier, og idet genet er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående 10 af et eukaryot insulinsignalpeptid, ved hjælp af hvilket nævnte forud bestemte protein udsondres af nævnte grampositive bakterier, og at nævnte forud bestemte protein udvindes fra nævnte vækstmedium.
2. Fremgangsmåde ifølge krav I,kendetegnet ved, at nævnte bakterier er Bacillus subtilis.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at nævnte gen for nævnte forud bestemte protein er under kontrol af β-lactamase operatoren, promotoren og den ribosomale bindingssted-sekvens.
4. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er β-lactamase.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er et pattedyrprotein.
6. Fremgangsmåde ifølge krav 1,kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er et pattedyrhormon. 23 DK 172711 B1
7. Fremgangsmåde til fremstilling af et forud bestemt protein, som ikke er oprindeligt hjemmehørende i Bacillus subtilis, ved tilvejebringelse af vækstbetingelser i et vækstmedium for Bacillus subtilis-bakterier indeholdende kloningsvektorer, der hver har et gen deri for nævnte forud bestemte protein, idet nævnte gen er placeret og orienteret således 5. nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens, og udvinding af nævnte forud bestemte protein som et produkt af nævnte Bacillus subtilis-bakterier, kendetegnet ved, at nævnte gen for nævnte forud bestemte protein yderligere er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en transportmekanisme bestående af et eucaryot insulinsignalpeptid, ved 10 hjælp af hvilket nævnte forud bestemte protein udsondres af nævnte Bacillus subtilis-bakterier, og at nævnte forud bestemte protein udvindes fra nævnte dyrkningsmedium.
8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at nævnte gen for nævnte forud bestemte protein er under kontrol af β-lactamase-operatoren, promotoren og den ribosomale bindingssted-sekvens.
9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er β-lactamase.
10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er et pattedyrprotein.
11. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte 20 protein er et pattedyrhormon. 1 Hybrid-kloningsvektor til fremstilling af et forud bestemt protein ved ekspression ved hjælp af B. subtilis, bestående af en vektor, som er i stand til autonom replikation i B. subtilis, hvori der er indsat et gen for nævnte forud bestemte protein, idet nævnte gen er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en opera- 25 tor, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens, kendetegnet ved, at nævnte 24 DK 172711 B1 forudbestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående af et eu-caryot insulinsignalpeptid, ved hjælp af hvilket nævnte forud bestemte protein udsondres af B. subtil is.
13. Kloningsvektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den omfatter et plasmid 5 valgt blandt: pUBllO (ATCC nr. 37.015), pOG2165 (ATCC nr. 31.777), pOG2110 (ATCC nr. 31.778), pOG1196 (ATCC nr. 31.776) og deraf afledte plasmider.
14. Kloningsvektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at nævnte gen for nævnte forud bestemte protein er under kontrol af β-lactamase-operatoren, promotoren og den ribosomale bindingssted-sekvens.
15. Kloningsvektor ifølge krav 12,kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er β-lactamase.
16. Kloningsvektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er et pattedyrprotein.
17. Kloningsvektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte 15 protein er et pattedyrhormon.
18. Kloningsvektor ifølge krav 13,kendetegnet ved, at plasmidet er valgt blandt pOG2110, pOGl 196 og pOG2165.
19. Kloningsvektor ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den eucaryote insulinsignalsekvens er signalet eller sekvensen, der går forud for insulin-B-kæden.
20. Fremgangsmåde til at sætte en B. subtilis-mikroorganisme i stand til at danne et forud bestemt protein ved ekspression ved dannelse af en kloningsvektor, som er i stand til autonom replikation i B. subtilis og har et gen deri for nævnte forud bestemte protein, 25 DK 172711 B1 idet nævnte forud bestemte protein ikke er oprindeligt hjemmehørende i B. subtilis, og idet nævnte gen er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående 5 af et eukaryot insulinsignalpeptid, ved hjælp af hvilket nævnte forud bestemte protein udsondres af B. subtilis, og at nævnte vektor indføres i B. subtilis.
21. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at nævnte gen for nævnte forud bestemte protein er under kontrol af β-lactamase-operatoren, promotoren og den ribosomale bindingssted-sekvens.
22. Fremgangsmåde ifølge krav 20, kendetegnet ved, at nævnte protein er β- lactamase.
23. Gram-positiv bakteriecelle, som er i stand til at danne et forud bestemt protein ved ekspression, og som består af en værtsmikroorganisme, hvori er indsat hybrid-kloningsvektor, som er i stand til autonom replikation i nævnte vært, idet nævnte vektor har et 15 gen deri for nævnte forud bestemte protein, og idet nævnte gen er gen for et forud bestemt protein, som ikke er oprindeligt hjemmehørende i nævnte værtsmikroorganisme, hvilket gen er placeret og orienteret således i nævnte vektor, at det er under kontrol af en operator, promotor og ribosomal bindingssted-sekvens, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er under kontrol af en transportmekanisme bestående af 20 et eukaryot insulinsignalpeptid, ved hjælp af hvilket nævnte protein udsondres af nævnte bakteriecelle.
24. Bakteriecelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at den er B. subtilis.
25. Bakteriecelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at nævnte kloningsvektor omfatter DNA-sekvensen fra et plasmid valgt blandt pUBllO, pOG2165, pOG2110, 25 pOGl 196 og deraf afdelte plasmider. 26 DK 172711 B1
26. Bakteriecelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at nævnte gen eller nævnte forud bestemte protein er under kontrol af β-lactamase-operatoren, promotoren og den ribosomale bindingssted-sekvens.
27. Bakteriecelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte 5 protein er et pattedyrprotein.
28. Bakteriecelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er et pattedyrhormon.
29. Bakteriecelle ifølge krav 23,kendetegnet ved, at nævnte forud bestemte protein er β-lactamase.
30. Bakteriecelle ifølge krav 23, kendetegnet ved, at nævnte bifunktionelle plasmid har unikke steder for restriktionsenzymer SStI, HindHi, PstI og Bglll.
31. Transformant-bakteriekultur klonet fra en eller flere bakterieceller ifølge krav 23, kendetegnet ved, at medlemmerne af nævnte kultur er i stand til at udtrykke nævnte forud bestemte protein. 15