DK1704236T3

DK1704236T3 - Proteiner

Info

Publication number: DK1704236T3
Application number: DK04806537.9T
Authority: DK
Inventors: Kreij Arno De; Anja Hemmingsen Kellet-Smith; Rikke Høegh Lorentsen; Jørn Dalgaard Mikkelson; Jørn Borch Søe
Original assignee: Dupont Nutrition Biosci Aps
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2018-01-08
Also published as: NZ547085A; RU2377307C2; DE602004026229D1; RU2377300C2; GB0330016D0; HK1106953A1; GB0416023D0; GB0415999D0; ZA200605158B; CN101676390A; RU2006126715A; CN103275944A; ATE462011T1; CN103275944B; JP2010142243A; RU2006126654A

Claims

PROTEINER

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et variantglycolipidacyltransferaseenzym, hvilken fremgangsmåde omfatter: (a) udvælgelse af et moderenzym, der er et lipidacyltransferaseenzym, kendetegnet ved, at enzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, hvor X er én eller flere af følgende aminosyrerester L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S; (b) modificering af én eller flere aminosyrer for at fremstille en variantlipidacyltransferase; (c) test af variantlipidacyltransferasen for transferaseaktivitet, og eventuelt hydrolytisk aktivitet, på et galactolipidsubstrat, og eventuelt et phospholipidsubstrat og/eller eventuelt et triglyceridsubstrat; (d) udvælgelse af et variantenzym med en forbedret aktivitet mod galactolipider sammenlignet med moderenzymet; og eventuelt (e) fremstilling af en kvantitet af variantenzymet; hvor fremgangsmåden endvidere omfatter ét eller flere af følgende trin: strukturel homologikortlægning eller sekvenshomologi-alignment; hvor den strukturelle homologikortlægning omfatter ét eller flere af følgende trin: (a) aligning af en modersekvens med en strukturel model af aminosyresekvensen SEQ ID NO 2 (P10480) opnået ved strukturel alignment af krystalstrukturkoordinater af SEQ ID NO 2 med 1IVN.PDB (vist i figur 52); (b) udvælgelse af én eller flere aminosyrer inden for en 10A sfære centreret på det centrale carbonatom af glycerolmolekylet i det aktive site; (c) bestemmelse af, hvorvidt én eller flere aminosyrerester udvalgt i overensstemmelse med trin (b) er bevarede i høj grad; og (d) modificering af én eller flere aminosyrer udvalgt i overensstemmelse med trin (b), med udelukkelse af bevarede regioner, der er identificeret i overensstemmelse med trin (c) i modersekvensen; og hvor sekvenshomologi-alignmentet omfatter ét eller flere af følgende trin: (i) udvælgelse af en første moderlipidacyltransferase; (ii) identificering af en anden beslægtet lipidacyltransferase med en ønskelig aktivitet; (iii) aligning af den første moderlipidacyltransferase og den anden beslægtede lipidacyltransferase; (iv) identificering af aminosyrerester, der er forskellige i de to sekvenser; (v) bestemmelse af, hvorvidt én eller flere aminosyrerester udvalgt i overensstemmelse med trin (iv) er bevarede i høj grad; og (vi) modificering af én eller flere af aminosyreresteme identificeret i overensstemmelse med trin (iv), med undtagelse af bevarede regioner, der er identificeret i overensstemmelse med trin (v) i modersekvensen, og hvor følgende aminosyrerester identificeret ved alignment med SEQ ID NO 2 er modificeret sammenlignet med en modersekvens: S18 M eller T; Y30 G, I, L, S, E, Μ, A eller R; G40 L, R, M, Q eller V; N80 R, D, P, G eller E; N87 R, D, E, M, C eller G; N88W; Y179 V, E, R, N eller Q; H180, T, K, Q eller I; M209 Y, L, K eller M; L210 N, D, H, R, E, A, Q, P, K, G, T, W, I, V, S eller M; R211 G, Q, K, D eller T; N215 H, L, G, V, R eller Y.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, hvor fremgangsmåden omfatter test af variantlipidacyltransferasen for: (i) transferaseaktivitet fra et galactolipidsubstrat, og (ii) transferaseaktivitet fra et phospholipidsubstrat; og udvælgelse af et variantenzym, der, når det sammenlignes med moderenzymet, har et forbedret forhold af transferaseaktivitet fra galactolipider sammenlignet med phospholipider.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 2 hvor forholdet af transferaseaktivitet fra galactolipider sammenlignet med phospholipider er mindst 3.
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, der omfatter test af variantlipidacyltransferasen for: (a) transferaseaktivitet fra et galactolipidsubstrat og (b) .hydrolytisk aktivitet på et galactolipidsubstrat; og udvælgelse af et variantenzym med et forbedret forhold af transferaseaktivitet fra galactolipider sammenlignet med dets hydrolytiske aktivitet på glycolipider, sammenlignet med moderenzymet.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, hvor det forbedrede forhold af transferaseaktivitet på galactolipider sammenlignet med hydrolytisk aktivitet på galactolipider er mindst 1,5.
6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor moderenzymet omfatter en aminosyresekvens vist som SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 4, SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 12, SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO 20, SEQ ID NO 22, SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 33, SEQ ID NO 34, SEQ ID NO 36, SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 39, SEQ ID NO 41, SEQ ID NO 43 eller SEQ ID NO 45 eller en aminosyresekvens, der har mindst 70 % identitet dermed.
7. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor moderenzymet er et enzym, der omfatter aminosyresekvensen vist som SEQ ID NO 2 og/eller SEQ ID NO 28.
8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 5, hvor moderlipidacyltransferaseenzymet er kodet for af en hvilken som helst af følgende nukleotidsekvenser: SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44 eller SEQ ID NO 46 eller en nukleotidsekvens, der har mindst 75 % eller større identitet med en hvilken som helst af sekvenserne, der er vist som SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 9, SEQ ID NO 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO 13, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 19, SEQ ID NO 21, SEQ ID NO 23, SEQ ID NO 25, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29, SEQ ID NO 31, SEQ ID NO 32, SEQ ID NO 35, SEQ ID NO 38, SEQ ID NO 40, SEQ ID NO 42, SEQ ID NO 44 eller SEQ ID NO 46.
9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, hvor X’et af GDSX-motivet er L.
10. Variantglycolipidacyltransferaseenzym kendetegnet ved, at enzymet omfatter aminosyresekvensmotivet GDSX, hvor X er én eller flere af følgende aminosyrerester L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M eller S, hvor variantenzymet omfatter en aminosyresekvens, hvilken aminosyresekvens er vist som SEQ ID NO 2, SEQ ID NO 3, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28 eller SEQ ID NO 30 eller er kodet for af en hvilken som helst af følgende nukleotidsekvenser: SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 27, SEQ ID NO 29 eller SEQ ID NO 31, bortset fra én eller flere aminosyremodifikationer ved en hvilken som helst eller flere af aminosyreresteme defineret S18, M eller T; Y30 G, I, L, S, E, Μ, A eller R; G40 L, R, M, Q eller V; N80 R, D, P, G eller E; N87 R, D, E M, C eller G; N88W; Y179 V, E, R, N eller Q; H180 T, K, Q eller I; M209 Y, L, K eller M; L210 N, D, H, R, E, A, Q, P K, G, T, W, I, V, S eller M; R211 G, Q, K, D eller T; N215 H, L, G, V, R eller Y, hvor nummereringen er den, der er opnået fra alignment af variantsekvensen med referencesekvensen vist som SEQ ID NO 2.
11. Variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge krav 10, hvor variantenzymet har et forbedret forhold af aktivitet på galactolipider end enten phospholipider og/eller triglycerider, når det sammenlignes med moderenzymet.
12. Variantglycolipidacyltransferase ifølge et hvilket som helst af kravene 10-11, hvor variantenzymet har en større galactolipidtransferaseaktivitet sammenlignet med dets hydrolytiske galactolipidaktivitet sammenlignet med moderenzymet.
13. Anvendelse af et variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 i et substrat til fremstilling af et lyso-glycolipid, for eksempel digalactosylmonoglycerid (DGMG) eller monogalactosylmonoglycerid (MGMG) ved behandling af et glycolipid (f.eks. digalactosyldiglycerid (DGDG) eller monogalactosyldiglycerid (MGDG)) med det lipolytiske variantenzym ifølge kravene 10-12 for at fremstille det delvise hydrolyseprodukt, dvs. lyso-glycolipidet.
14. Anvendelse ifølge krav 13, hvor substratet er en fødevare.
15. Fremgangsmåde til fremstilling af en fødevare, hvilken fremgangsmåde omfatter tilsætning af et variantlipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 til én eller flere af fødevarens ingredienser.
16. Fremgangsmåde til fremstilling af et bagt produkt ud af en dej, hvilken fremgangsmåde omfatter tilsætning af et variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 til dejen.
17. Anvendelse af et variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 i en fremgangsmåde til behandling af æg eller æggebaserede produkter for at fremstille lysophospholipider.
18. Fremgangsmåde til enzymatisk degummiering af vegetabilske eller spiselige olier, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af den spiselige eller vegetabilske olie med et variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 for således at hydrolysere størstedelen af de polære lipider (f.eks. phospholipid og/eller glycolipid).
19. Anvendelse af et variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 i en fremgangsmåde til reduktion af indholdet af et phospholipid i en spiselig olie, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af olien med det lipolytiske variantenzym for således at hydrolysere størstedelen af phospholipidet, og separering af en vandig fase, der indeholder det hydrolyserede phospholipid fra olien.
20. Anvendelse af et variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12 i biokonversion af polære lipider (fortrinsvis glycolipider) for at fremstille produkter af høj værdi, såsom carbohydratestere og/eller proteinestere og/eller proteinunderenhedsestere og/eller en hydroxysyreester.
21. Immobiliseret variantglycolipidacyltransferaseenzym ifølge et hvilket som helst af kravene 10-12.