CN103275944B

CN103275944B - 蛋白质

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Publication number: CN103275944B
Application number: CN201310150130.9A
Authority: CN
Inventors: 安加·H·凯利特-史密斯; 赖克·H·洛伦岑; 乔恩·B·索伊; 乔恩·D·米克尔森; 阿诺德·克赖杰
Original assignee: Danisco US Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2003-12-24
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2016-12-07
Anticipated expiration: 2024-12-23
Also published as: ATE462011T1; NZ547085A; HK1106953A1; GB0330016D0; RU2006126715A; ZA200605158B; DE602004026229D1; DK1704236T3; RU2377300C2; RU2377307C2; GB0416023D0; CN103275944A; GB0415999D0; JP2010142243A; CN101676390A; RU2006126654A

Abstract

本发明涉及用于生成糖脂酰基转移酶变体的方法，包括：(a)选择特征为包含氨基酸序列基序GDSX的糖脂酰基转移酶作为亲本酶，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、S；(b)修饰一个或多个氨基酸以生成糖脂酰基转移酶变体；(c)在半乳糖脂底物和任选磷脂底物和/或任选的甘油三酯底物上测试糖脂酰基转移酶变体的转移酶活性和任选水解活性；(d)选择对半乳糖脂的活性比亲本酶升高的酶变体；并任选(e)制备一定量的酶变体。本发明还涉及特征为包含氨基酸序列基序GDSX的脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组、或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸修饰。

Description

蛋白质

本申请为申请号为200480038699.5，申请日为2004年12月23日，发明名称为蛋白质的分案申请。

相关申请的参照

参考了下列相关申请：1999年7月20日提交的美国申请流水号09/750,990；美国申请流水号10/409,391；2003年7月23日提交的美国申请流水号60/489,441；2003年12月24日提交的英国申请GB0330016.7；和2004年1月15日提交的国际专利申请PCT/IB2004/000655。据此将这每一份申请和这每一份申请中引用的每一份文件（“申请引用的文件”）以及申请所引用的文件中参考或引用的每一份文件（无论是在正文中或是在那些申请的整个过程中）以及所述的整个过程中支持先进专利性（patentability advanced）的所有争论收入本文作为参考。本文还引用了多份文件（“本文引用的文件”）。据此将本文引用的每一份文件以及本文所引用文件中引用或参考的每一份文件收入本文作为参考。

发明领域

本发明涉及用于生成酶变体的方法。本发明还涉及新型酶变体以及这些新型酶变体的用途。

技术背景

脂:胆固醇酰基转移酶为人所知已有一些时间（见例如Buckley，Biochemistry，1983，22，5490-5493）。具体而言，已经发现了甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶（GCAT），它像植物和/或哺乳动物卵磷脂:胆固醇酰基转移酶（LCAT）一样，催化磷脂酰胆碱与胆固醇之间的脂肪酸转移。

Upton和Buckley（TIBS，1995年5月20日，178-179）以及Brumlik和Buckley（J.ofBacteriology，1996年4月，2060-2064）讲授了来自嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的一种脂肪酶/酰基转移酶，它能够在水性介质中将酰基转移给醇受体。

已经对嗜水气单胞菌酰基转移酶鉴定了这种酶的推定底物结合结构域和活性位点（见例如Thornton等，1988，Biochem.et Biophys.Acta.959，153-159；以及Hilton和Buckley，1991，J.Biol.Chem.266，997-1000）。

Buckley等人（J.Bacteriol.1996，178(7)，2060-4）讲授了Ser16、Asp116、和His291是维持酶活性所必须保留的必需氨基酸。

Robertson等人（J.Biol.Chem.1994，269，2146-50）讲授了嗜水气单胞菌酰基转移酶的一些具体突变，即Y226F、Y230F、Y30F、F13S、S18G、S18V，它们都不是本发明所涵盖的。

发明概述

本发明是基于含GDSX脂酰基转移酶的特殊变体的发现而建立的，这些变体的转移酶活性比亲本酶升高。具体而言，依照本发明的变体具有比亲本酶升高的使用半乳糖脂作为酰基供体的转移酶活性。这些脂酰基转移酶在本文中称为糖脂酰基转移酶(glycolipidacyltransferase)。依照本发明的变体可以额外具有比亲本酶升高的使用半乳糖脂作为酰基供体的转移酶活性与磷脂转移酶活性比率（GL:PL比）和/或升高的使用半乳糖脂作为酰基供体的转移酶活性与半乳糖脂水解活性比率（GLt:GLh比）。

依照第一个方面，本发明提供了用于生成糖脂酰基转移酶变体的一种方法，包括：(a)选择特征为包含氨基酸序列基序GDSX的脂酰基转移酶作为亲本酶，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S；(b)更改一个或多个氨基酸以生成脂酰基转移酶变体；(c)在半乳糖脂底物，和任选磷脂底物和/或任选甘油三酯底物上测试脂酰基转移酶变体的活性；(d)选择对半乳糖脂的活性比亲本酶升高的酶变体；并任选(e)制备一定量的酶变体。

在另一个方面，本发明提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的一种糖脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶变体相对于亲本序列在（下文限定的）第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改。

在还有一个方面，本发明提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的一种糖脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶变体相对于亲本序列在（下文限定的）第2组(set2)、第4组(set4)、第6组(set6)、或第7组(set7)限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述组是通过结构对比所述亲本序列与本文限定的P10480结构模型而鉴定的，优选是通过如本文所讲授的结构对比P10480晶体结构坐标与1IVN.PDB和/或1DEO.PDB而获得的。

本发明还提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的一种糖脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，且其中酶变体相对于亲本序列在（下文限定的）第2组讲授的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述第2组是如所讲授的对比所述亲本序列与pfam共有序列（SEQ ID No.1）而鉴定的并依照P10480的结构模型更改以确保最佳符合交叠(best fit overlap)（见图55）。

依照还有一个方面，本发明提供了一种糖脂酰基转移酶变体，其中酶变体包含SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、或SEQ ID No.45所示氨基酸序列，只是在（下文限定的）第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述组是通过与SEQ ID No.2序列对比而鉴定的。

在还有一个方面，本发明提供了一种糖脂酰基转移酶变体，其中酶变体包含SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、或SEQ ID No.45所示氨基酸序列，只是在第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述组是通过结构对比所述亲本序列与本文限定的P10480结构模型而鉴定的，优选是通过如本文所讲授的结构对比P10480晶体结构坐标与1IVN.PDB和/或1DEO.PDB而获得的。

依照还有一个方面，本发明提供了一种糖脂酰基转移酶变体，其中酶变体包含SEQID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.12、SEQ IDNo.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ IDNo.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ IDNo.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、或SEQ ID No.45所示氨基酸序列，只是在第2组讲授的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改，所述第2组是如所讲授的对比所述亲本序列与pfam共有序列（SEQ ID No.1）而鉴定的并依照P10480的结构模型更改以确保最佳符合交叠（见图55）。

本发明还提供了依照本发明的糖脂分解酶变体(variantglycolipolyticenzyme)或通过依照本发明的方法获得的一种糖脂分解酶变体用于在制造底物（优选食品）中制备溶血糖脂的用途，例如用依照本发明的或通过依照本发明的方法获得的脂肪分解酶变体处理糖脂(glycolipid)（例如二半乳糖基甘油二酯（DGDG）或单半乳糖基甘油二酯（MGDG））而生成部分水解产物即溶血糖脂（例如二半乳糖基甘油一酯（DGMG）或单半乳糖基甘油一酯（MGMG）。

在还有一个方面，本发明提供了依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪分解酶变体用于在制造底物（优选食品）中制备溶血磷脂的用途，例如用依照本发明的或通过依照本发明的方法获得的脂肪分解酶变体处理磷脂（例如卵磷脂）而生成部分水解产物即溶血磷脂（例如溶血卵磷脂）。

在一个方面，本发明涉及制作食品的一种方法，该方法包括向食品的一种或多种成分中添加依照本发明的或通过依照本发明的方法获得的脂肪分解酶变体。

本发明的另一个方面涉及由生面团制作焙烤产品的一种方法，该方法包括向生面团中添加依照本发明的或通过依照本发明的方法获得的脂肪分解酶变体。

在本发明的另一个方面，提供了依照本发明的或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪分解酶变体在制造基于蛋的产品以生成溶血磷脂中的用途。

在另一个方面，提供了处理蛋或基于蛋的产品的一种方法，包括向蛋或基于蛋的产品中添加依照本发明的脂肪分解酶变体以生成溶血磷脂。

本发明的变体可用于与WO02/065854类似的生产点心诸如方便面的过程。

本发明涉及依照本发明的脂酰基转移酶变体在例如食品中实现优选的技术效果或其组合的用途（诸如本文“技术效果”中所列）。

本发明的还有一个方面提供了使植物油或食用油酶促脱胶的一种过程，包括用依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪分解酶变体处理食用油或植物油从而水解大部分极性脂质（例如磷脂和/或糖脂）。

在另一个方面，本发明提供了包括处理磷脂从而水解脂肪酰基的一种过程，该过程包括将所述磷脂与依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪分解酶变体混合。

在另一个方面，本发明提供了降低食用油磷脂含量的一种过程，包括用依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪水解酶变体处理油从而水解大部分磷脂，并由油分离含有水解后磷脂的水相。

还提供了制备依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪水解酶变体的一种方法，该方法包括用包含编码所述脂肪分解酶变体的核苷酸序列的重组核酸转化宿主细胞，所述宿主细胞能够表达编码脂肪分解酶多肽的核苷酸序列，在核酸表达的条件下培养经转化宿主细胞，并收获脂肪分解酶变体。

在另一个方面，本发明涉及依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪分解酶变体在生物转化极性脂质（优选糖脂）以生成诸如碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯等高价值产品中的用途。

将极性脂质（优选糖脂）生物转化成高价值产品的一种方法，该方法包括将所述极性脂质与依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种脂肪分解酶变体混合。

本发明还涉及依照本发明或通过依照本发明的方法获得的一种固定化脂肪分解酶变体。

权利要求书和下面的注释呈现了本发明的各个方面。

关注本发明所使用的核苷酸序列的其它方面包括：包含本发明序列的一种构建物；包含本发明所使用的序列的一种载体；包含本发明所使用的序列的一种质粒；包含本发明所使用的序列的一种经转化细胞；包含本发明所使用的序列的一种经转化组织；包含本发明所使用的序列的一种经转化器官；包含本发明所使用的序列的一种经转化宿主；包含本发明所使用的序列的一种经转化生物体。本发明还涵盖使用它们来表达本发明所使用的核苷酸序列的方法，诸如在宿主细胞中进行表达；包括用于转移它们的方法。本发明还涵盖用于分离核苷酸序列的方法，诸如由宿主细胞进行分离。

关注本发明所使用的氨基酸序列的其它方面包括：编码本发明所使用的氨基酸序列的一种构建物；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种载体；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种质粒；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种经转化细胞；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种经转化组织；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种经转化器官；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种经转化宿主；编码本发明所使用的氨基酸序列的一种经转化生物体。本发明还涵盖使用它们来纯化本发明所使用的氨基酸序列的方法，诸如在宿主细胞中进行表达；包括转移它们及然后纯化所述序列的方法。

为了易于参考，现在在适当的段落标题下描述本发明的这些和其它方面。但是每一段的讲授不必限于具体的每一段。

组的定义

第1组氨基酸：

（注意，这些是1IVN－图57和图58－中的氨基酸。）

Gly8、Asp9、Ser10、Leu11、Ser12、Tyr15、Gly44、Asp45、Thr46、Glu69、Leu70、Gly71、Gly72、Asn73、Asp74、Gly75、Leu76、Gln106、Ile107、Arg108、Leu109、Pro110、Tyr113、Phe121、Phe139、Phe140、Met141、Tyr145、Met151、Asp154、His157、Gly155、Ile156、Pro158

由第1组中清除高度保守的基序诸如GDSX和催化残基（标有下划线的残基）。为了避免疑惑，第1组限定1IVN模型活性位点中甘油中央碳原子10内的氨基酸残基。

第2组氨基酸：

（注意，氨基酸的编号指P10480成熟序列中的氨基酸。）

Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、和Val290。

第1组和第2组中所选残基的比较表

第3组氨基酸：

第3组氨基酸与第2组相同，但是指杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号要大18，这反映了成熟蛋白质（SEQ ID No.2）与包含信号序列的蛋白质（SEQ ID No.28）中氨基酸编号之间的差异。

杀鲑气单胞菌GDSX（SEQ ID No.28）与嗜水气单胞菌GDSX（SEQ IDNo.2）的成熟蛋白有五个氨基酸不同。它们是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn、Gly318-，其中杀鲑气单胞菌的残基列于前而嗜水气单胞菌的残基列于后（图59）。嗜水气单胞菌蛋白质的长度只有317个氨基酸，缺少第318位的残基。与嗜水气单胞菌蛋白质相比，杀鲑气单胞菌GDSX具有相当高的对极性脂质的活性，诸如对半乳糖脂底物的活性。对所有五个氨基酸位置进行了位点扫描。

第4组氨基酸：

第4组氨基酸是S3、Q182、E309、和-318。

第5组氨基酸：

F13S、D15N、S18G、S18V、Y30F、D116N、D116E、D157N、Y226F、D228N、Y230F。

第6组氨基酸：

第6组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318。

第6组中氨基酸的编号指P10480（SEQ ID No.2）中的氨基酸残基－可以通过与P10480和/或1IVN的同源对比和/或结构对比来确定其它序列主链中的相应氨基酸。

第7组氨基酸：

第7组氨基酸是Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、Ser310、-318、Y30X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Y226X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Y230X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、S18X（其中X选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y）、D157X（其中X选自A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y）。

第7组中氨基酸的编号指P10480（SEQ ID No.2）中的氨基酸残基－可以通过与P10480和/或1IVN的同源对比和/或结构对比来确定其它序列主链中的相应氨基酸。

发明详述

优选的是，亲本脂酰基转移酶包含下列氨基酸序列中的任何一种：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQIDNo.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43或SEQ ID No.45，或是与SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ IDNo.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43或SEQ ID No.45所示序列中的任何一种具有75％或更高同一性的氨基酸序列。

合适的是，依照本发明的亲本脂酰基转移酶包含与SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ ID No.24、SEQ ID No.26、SEQ IDNo.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ ID No.36、SEQ ID No.37、SEQ IDNo.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43或SEQ ID No.45所示序列中的任何一种具有至少80％、优选至少85％、更优选至少90％、更优选至少95％、更优选至少98％同源性的氨基酸序列。

合适的是，所述亲本脂酰基转移酶可以由下列核苷酸序列中的任何一种编码：SEQID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ IDNo.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ IDNo.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.35、SEQ ID No.38、SEQ IDNo.40、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、或SEQ ID No.46，或是由与SEQ ID No.7、SEQ IDNo.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ IDNo.17、SEQ ID No.19、SEQ ID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ IDNo.29、SEQ ID No.31、SEQ ID No.32、SEQ ID No.35、SEQ ID No.38、SEQ ID No.40、SEQ IDNo.42、SEQ ID No.44或SEQ ID No.46所示序列中的任何一种具有至少75％或更高同一性的核苷酸序列编码。

合适的是，所述核苷酸序列可以与SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.13、SEQ ID No.15、SEQ ID No.17、SEQ ID No.19、SEQID No.21、SEQ ID No.23、SEQ ID No.25、SEQ ID No.27、SEQ ID No.29、SEQ ID No.31、SEQID No.32、SEQ ID No.35、SEQ ID No.38、SEQ ID No.40、SEQ ID No.42、SEQ ID No.44、或SEQ ID No.46所示序列中的任何一种具有80％或更高、优选90％或更高、更优选95％或更高、甚至更优选98％或更高同一性。

优选的是，亲本酶在与参考序列（SEQ ID No.2）对比或与P10480结构模型结构对比或与pfam共有序列对比并依照P10480结构模型更改时在第2组、第4组、第6组、或第7组限定的一个或多个氨基酸残基处发生了更改。

合适的是，酶变体可以具有比亲本酶升高的对半乳糖脂的活性与对磷脂和/或甘油三酯的活性比率。

合适的是，依照本发明的方法可以包括：

(i)用半乳糖脂底物测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性，和

(ii)用磷脂底物测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性；并

选择对半乳糖脂的转移酶活性与对磷脂的转移酶活性之比率比亲本酶升高的酶变体。

合适的是，依照本发明的酶变体对半乳糖脂的转移酶活性与对磷脂的转移酶活性之比率可以是至少1、至少2、至少3、至少4、或至少5。

合适的是，依照本发明的方法可以包括：

(i)用半乳糖脂底物测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性，和

(ii)用半乳糖脂底物测试脂酰基转移酶变体的水解活性；并

选择对半乳糖脂的转移酶活性与对糖脂的水解活性之比率比亲本酶升高的酶变体。

合适的是，对半乳糖脂的转移酶活性与对半乳糖脂的水解活性之比率可以是超过1、至少1.5、至少2、至少4、或至少5。

例如实施例8中讲授了用于测定对半乳糖脂和/或磷脂的转移酶和水解活性的测定法。

术语“对半乳糖脂(galactolipid)的活性升高”指在以半乳糖脂作为脂质酰基供体时酶的转移酶活性（半乳糖脂转移酶活性）比亲本酶升高（即更高）和/或半乳糖脂转移酶活性与磷脂转移酶活性之比率比亲本酶升高（GLt:GLt比率）和/或半乳糖脂转移酶活性与半乳糖脂水解活性之比率比亲本酶升高（GLt:GLh比率）。

合适的是，与亲本酶相比，酶变体可以具有升高的半乳糖脂转移酶活性和相同或较低的半乳糖脂水解活性。换言之，合适的是，酶变体可以具有比亲本酶高的半乳糖脂转移酶活性与半乳糖脂水解活性之比率。合适的是，酶变体可以优先将酰基由半乳糖脂转移给酰基受体，而非简单的水解半乳糖脂。

在一个实施方案中，依照本发明的酶可以具有比亲本酶升高的对磷脂的转移酶活性（即磷脂转移酶活性升高）。这种升高的磷脂转移酶活性可能独立于升高的对半乳糖脂的活性。但是，合适的是，酶变体可以具有升高的半乳糖脂转移酶活性和升高的磷脂转移酶活性。

在一个实施方案中，本发明提供了特征为包含氨基酸序列基序GDSX的脂酰基转移酶变体，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S，其中所述变体对磷脂的活性优选磷脂转移酶活性比亲本酶升高，且其中酶变体相对于亲本序列在第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改。

术语“更改”在用于本文时指添加、替代、和/或删除。优选的是，术语“更改”指“替代”。

为了避免疑惑，在替代亲本酶中的氨基酸时，优选用与亲本酶中该位置处最初发现的氨基酸不同的氨基酸替代它，从而生成酶变体。换言之，术语“替代”不打算覆盖用一种氨基酸替代相同氨基酸。

优选的是，亲本酶包含SEQ ID No.2和/或SEQ ID No.28所示氨基酸序列。

优选的是，酶变体包含SEQ ID No.2所示氨基酸序列，只是在第2组、第4组、第6组、或第7组限定的任何一个或多个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改。

在一个实施方案中，优选的是，酶变体相对于亲本序列在第4组限定的至少一个氨基酸残基处包含一个或多个氨基酸更改。

合适的是，酶变体相对于亲本酶包含一个或多个下列氨基酸更改：

S3E、A、G、K、M、Y、R、P、N、T、或G；

E309Q、R、或A，优选Q或R；

-318Y、H、S、或Y，优选Y。

优选的是，GDSX基序中的X是L。由此，优选的是，亲本酶包含氨基酸基序GDSL。

优选的是，用于生成脂酰基转移酶变体的方法还包括一个或多个下列步骤：

1)结构同源性定位，或

2)序列同源性对比。

合适的是，结构同源性定位包括一个或多个下列步骤：

1)对比亲本序列与图52所示结构模型（1IVN.PDB）；

2)选择活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10范围内的一个或多个氨基酸残基（见图53）（诸如第1组或第2组限定的一个或多个氨基酸残基）；并

3)更改所述亲本序列中依照步骤(2)选择的一个或多个氨基酸。

在一个实施方案中，选择的氨基酸残基可以位于活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的9、优选8、7、6、5、4、或3范围内（见图53）。

合适的是，结构同源性定位可以包括一个或多个下列步骤：

1)对比亲本序列与图52所示结构模型（1IVN.PDB）；

2)选择活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10范围内的一个或多个氨基酸残基（见图53）（诸如第1组或第2组限定的一个或多个氨基酸残基）；

3)测定依照步骤(2)选择的一个或多个氨基酸残基是否是高度保守的（特别是活性位点残基和/或部分GDSX基序和/或部分GANDY基序）；并

4)更改所述亲本序列中依照步骤(2)选择的一个或多个氨基酸，排除依照步骤(3)鉴定的保守区。

作为上文所述结构同源性定位的替换或联合，可以通过选择由pfam对比（对比2，图56）衍生的与P10480模型和1IVN交叠的特定环区(loop region)（LR）或中间区(intervening region)（IVR）来进行结构同源性定位。下表定义了环区（LR）或中间区（IVR）：

在本发明的有些实施方案中，酰基转移酶变体不仅在第1-4组和第6-7组中任一组限定的一个或多个氨基酸处包含氨基酸更改，而且在一个或多个上文限定的中间区（IVR1-6）（优选在IVR3、5、和6中的一个或多个中，更优选在IVR5或IVR6中）和/或一个或多个上文限定的环区（LR1-5）（优选在LR1、LR2、或LR5中的一个或多个中，更优选在LR5中）中包含至少一个氨基酸更改。

在一个实施方案中，依照本发明的酰基转移酶变体或通过依照本发明的方法获得的酰基转移酶变体可以包含一个或多个氨基酸更改，它不仅是由第2、4、6、和7组中的一个或多个组限定的，而且位于IVR1-6中的一个或多个IVR内（优选IVR3、5、或6内，更优选IVR5或IVR6内）或是LR1-5中的一个或多个LR内（优选LR1、LR2、或LR5内，更优选LR5内）。

合适的是，依照本发明的酰基转移酶变体或通过依照本发明的方法获得的酰基转移酶变体可以包含一个或多个氨基酸更改，它不仅在第1或2组中，而且在IVR3内。

合适的是，依照本发明的酰基转移酶变体或通过依照本发明的方法获得的酰基转移酶变体可以包含一个或多个氨基酸更改，它不仅在第1或2组中，而且在IVR5内。

合适的是，依照本发明的酰基转移酶变体或通过依照本发明的方法获得的酰基转移酶变体可以包含一个或多个氨基酸更改，它不仅在第1或2组中，而且在IVR6内。

合适的是，依照本发明的酰基转移酶变体或通过依照本发明的方法获得的酰基转移酶变体可以包含一个或多个氨基酸更改，它不仅在第1或2组中，而且在LR1内。

合适的是，依照本发明的酰基转移酶变体或通过依照本发明的方法获得的酰基转移酶变体可以包含一个或多个氨基酸更改，它不仅在第1或2组中，而且在LR2内。

同样，在本发明的有些实施方案中，酰基转移酶变体不仅在活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10、优选9、8、7、6、5、4、或范围内的一个或多个氨基酸残基处包含氨基酸更改（见图53），而且在一个或多个上文限定的中间区（IVR1-6）（优选在IVR3、5、和6中的一个或多个中，更优选在IVR5或IVR6中）和/或一个或多个上文限定的环区（LR1-5）（优选在LR1、LR2、或LR5中的一个或多个中，更优选在LR5中）中包含至少一个氨基酸更改。

在一个实施方案中，优选的是，氨基酸更改位于10范围内的一个或多个氨基酸残基处，而且在LR5内。

由此，结构同源性定位可以包括一个或多个下列步骤：

1)对比亲本序列与图52所示结构模型（1IVN.PDB）；

2)选择活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10范围内的一个或多个氨基酸残基（见图53）（诸如第1组或第2组限定的一个或多个氨基酸残基）；和/或选择IVR1-6内的一个或多个氨基酸残基（优选在IVR3、5、或6内，更优选在IVR5或IVR6内）；和/或选择LR1-5内的一个或多个氨基酸残基（优选在LR1、LR2、或LR5内，更优选在LR5内）；并

合适的是，结构同源性定位可以包括一个或多个下列步骤：

1)对比亲本序列与图52所示结构模型（1IVN.PDB）；

2)选择活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10范围内的一个或多个氨基酸残基（见图53）（诸如第1组或第2组限定的一个或多个氨基酸残基）；和/或选择IVR1-6内的一个或多个氨基酸残基（优选在IVR3、5、或6内，更优选在IVR5或IVR6内）；和/或选择LR1-5内的一个或多个氨基酸残基（优选在LR1、LR2、或LR5内，更优选在LR5内）；

合适的是，上文详述的方法中选择的一个或多个氨基酸不仅在活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10范围内（见图53）（诸如第1组或第2组限定的一个或多个氨基酸残基），而且在一个或多个IVR1-6内（优选在IVR3、5或6内，更优选在IVR5或IVR6内）或是在一个或多个LR1-5内（优选在LR1、LR2、或LR5内，更优选在LR5内）。

在一个实施方案中，优选的是，一个或多个氨基酸更改在LR5内。当更改在LR5内时，更改不是第5组限定的。合适的是，一个或多个氨基酸更改不仅在LR5限定的区域内，而且构成第2组、第4组、第6组、或第7组中的一组或多组内的氨基酸。

合适的是，序列同源性对比可以包括一个或多个下列步骤：

1)选择第一种亲本脂酰基转移酶；

2)鉴定具有期望活性的第二种相关脂酰基转移酶；

3)对比所述第一种亲本脂酰基转移酶与第二种相关脂酰基转移酶；

4)鉴定两种序列间不同的氨基酸残基；并

5)更改所述亲本脂酰基转移酶中依照步骤(4)鉴定的一个或多个氨基酸残基。

合适的是，序列同源性对比可以包括一个或多个下列步骤：

1)选择第一种亲本脂酰基转移酶；

2)鉴定具有期望活性的第二种相关脂酰基转移酶；

4)鉴定两种序列间不同的氨基酸残基；

5)测定依照步骤(4)选择的一个或多个氨基酸残基是否是高度保守的（特别是活性位点残基和/或部分GDSX基序和/或部分GANDY基序）；并

6)更改所述亲本序列中依照步骤(4)鉴定的一个或多个氨基酸，排除依照步骤(e)鉴定的保守区。

合适的是，所述第一种亲本脂酰基转移酶可以包含下列氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、或SEQ ID No.45。

合适的是，所述第二种相关脂酰基转移酶可以包含下列氨基酸序列中的一种或多种：SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.12、SEQ ID No.14、SEQ ID No.16、SEQ ID No.18、SEQ ID No.20、SEQ ID No.22、SEQ IDNo.24、SEQ ID No.26、SEQ ID No.28、SEQ ID No.30、SEQ ID No.33、SEQ ID No.34、SEQ IDNo.36、SEQ ID No.37、SEQ ID No.39、SEQ ID No.41、SEQ ID No.43、或SEQ ID No.45。

酶变体相对于亲本酶必须包含至少一个氨基酸更改。在有些实施方案中，酶变体相对于亲本酶可以包含至少2个、优选至少3个、优选至少4个、优选至少5个、优选至少6个、优选至少7个、优选至少8个、优选至少9个、优选至少10个氨基酸更改。

合适的是，依照本发明的方法可以包括另一个步骤，即将酶变体配制到酶组合物和/或食品组合物，诸如面包改良组合物中。

为了对比GDSx多肽序列（亲本序列）与SEQ ID No.2（P01480），可以使用序列对比，诸如成对对比（http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html）。由此，可以确定和更改备选亲本GDSx多肽中就SEQ ID No.2而言与第2组、第4组、第6组、或第7组限定的一个或多个氨基酸对应的等价氨基酸。正如技术人员将容易地领会，在使用emboss成对对比时，标准设置通常就足够了。为了生成覆盖两个序列的全长的对比，可以使用“needle”来鉴定相应的氨基酸残基。然而，也有可能使用“water”而在两个序列之间发现最佳的相似区域。

或者，特别是在亲本GDSx多肽与SEQ ID No.2享有低同源性的情况中，可以通过与P10480结构模型的结构对比来确定备选GDSX多肽中就SEQ IDNo.2而言与第2组、第4组、第6组、或第7组限定的一个或多个氨基酸对应的相应氨基酸，所述P10480结构模型是通过使用（由www.expasy.org/spdbv/获得的）“Deep View Swiss-PDB浏览器”比较由P10480衍生的结构模型与1IVN.PDB和1DEO.PDB的结构坐标而获得的（图53和实施例1）。鉴定的等价残基即是与得到的P010480结构模型中的残基交叠或最密切接近的残基，正如第1组与第2组的比较表（见上文题为“组的定义”的部分）所示。这样，可以比较其它GDSX多肽与1IVN.PDB晶体坐标，并确定第1组的等价残基。

或者，特别在亲本GDSX多肽与SEQ ID No.2享有低同源性的情况中，可以根据由PFAM数据库（PFAM共有序列）得到的对比确定备选GDSX多肽中就SEQ ID No.2而言与第2组、第4组、第6组、或第7组限定的一个或多个氨基酸对应的等价残基，所述PFAM数据库根据对比1（图55）所示结构对比经过修改。基于结构模型的修改可能必须略微移动对比，从而确保最佳符合交叠。对比1（图55）提供了这个方面的指导。

依照本发明的酶变体优选不包含第5组中限定的一个或多个氨基酸更改。

合适的是，可以使用定点诱变来制备酶变体。

或者，可以使用商品化试剂盒诸如Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒随机导入突变。EP0583265涉及优化基于PCR的诱变的方法，它也可以联合使用诱变性DNA类似物，诸如EP0866796中所述。错误倾向PCR技术适用于生成具有优选特征的脂酰基转移酶变体。WO02/06457涉及脂肪酶的分子进化。

获取新序列的第三种方法是使用任何数目的限制酶或诸如DNA酶I等酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新装配成编码功能性蛋白质的全长核苷酸序列（下文称为“改组”）。或者，可以使用一种或多种不同的核苷酸序列，并在重新装配全长核苷酸序列的过程中导入突变。DNA改组和家族改组技术适于生成具有优选特征的脂酰基转移酶变体。适于进行“改造”的方法见EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组还可以联合其它DNA诱变形式，正如US6,180,406和WO01/34835中所述。

由此，有可能在体内或在体外在核苷酸序列中生成大量的定点或随机诱变，并随后通过多种手段对编码的多肽变体筛选改进的功能。

作为一个非限制性实例，还可以将多核苷酸序列的突变或天然变体与野生型或其它突变或天然变体重组，从而生成新的变体。也可以对这些新的变体筛选所编码多肽的改进的功能性。

可能优选选择下列区域用于定位随机诱变和/或改组：IVR3、IVR5、IVR6、LR1、LR2、和/或LR5，最优选LR5。

为了生成变体库，可以使用微生物的真核或原核表达宿主。为了确保变体库内的均匀表达，可能优选低拷贝数目，优选单一事件染色体表达系统。还优选具有高转化频率的表达系统，特别是用于表达大型变体库（>1000个菌落），诸如使用随机诱变和/或改组技术构建的文库。

EP1131416中描述了适于使用真核表达宿主即酵母来生成酶的方法。可能优选微生物的真核表达宿主诸如酵母来表达使用真核酰基转移酶亲本基因生成的变体库。

WO02/14490描述了适于使用芽孢杆菌即枯草芽孢杆菌作为表达宿主来生成酶的方法。可能优选微生物的原核表达宿主诸如芽孢杆菌来表达使用原核酰基转移酶亲本基因例如P10480参考序列（SEQ ID No.2）生成的变体库。

合适的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体保留了至少70％、优选至少80％、优选至少90％、优选至少95％、优选至少97％、优选至少99％与亲本酶的同源性。

合适的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。

在一个优选的实施方案中，脂酰基转移酶变体保留或掺入了在GDSX、GANDY、和HPT模块中发现的至少一个或多个pfam00657共有序列氨基酸残基。

可以使用分子进化工具突变诸如在水性环境中没有或具有低脂酰基转移酶活性的脂肪酶等酶，从而导入或增强转移酶活性，由此生成适用于本发明组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂酰基转移酶变体。

合适的是，用于本发明的脂酰基转移酶可以是与亲本酶相比对极性脂质优选糖脂的酶活性增强的变体。优选的是，这些变体还具有低的或没有对溶血极性脂质的活性。对极性脂质优选糖脂的活性增强可能是水解酶活性和/或转移酶活性或二者组合的结果。

用于本发明的脂酰基转移酶变体对甘油三酯和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性与亲本酶相比可能降低。

合适的是，酶变体可没有对甘油三酯和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性。在将要用于面包房应用、用于处理蛋或基于蛋的产品、和/或用于将油脱胶的酶变体中优选对甘油三酯的低活性。

在一个实施方案中，合适的是，酶变体具有对甘油二酯的高活性，且没有或具有对甘油三酯的低活性。

本文在提及具体的氨基酸残基时，编号是通过对比变体序列与SEQ IDNo.2所示参考序列而获得的。

在一个方面，优选的是，酶变体包含下列氨基酸替代中的一个或多个：

S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或

L17A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

S18A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W或Y；和/或

K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Y30A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或

G40A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

P81A、C、D、E、F、G、H,I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

W111A、C、D、E、F、G、H,I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或

A114C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Y117A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或

LI18A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

P156A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

G159A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Q160A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或

N161A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

P162A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

S163A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或

A164C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

R165A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W或Y；和/或

S166A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y；和/或

Q167A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或

K168A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

V169A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或

V170A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或

E171A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

A172C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或

H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

N181A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y，优选K；和/或

M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Y226A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或

Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V或W；和/或

K284A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

M285A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W或Y；和/或

V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W或Y；和/或

E309A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W或Y；和/或

S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W或Y。

另外/或者，其中可以存在一个或多个C端延伸。优选的是，额外的C端延伸包含一个或多个脂肪族氨基酸，优选非极性氨基酸，更优选I、L、V、或G。由此，本发明还提供了包含一个或多个下列C端延伸的酶变体：318I、318L、318V、318G。

在根据与P10480和/或1IVN的同源对比和/或结构对比的测定，亲本主链中的残基与P10480（SEQ ID No.2）中残基有所不同的情况中，可能希望分别用在P10480中发现的残基替代与P10480（SEQ ID No.2）中的任何一个或多个下列氨基酸残基对应的残基：Ser3、Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Gln182、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290、Glu309、或Ser310。

发现P10480的下列野生型残基是保留好活性所优选的，特别是好的对半乳糖脂的转移酶活性：L17、W111、R221、S3、G40、N88、K22、Y117、L118、N181、M209、M285、E309、M23。由此，优选的是，酶变体包含在P10480中在这些位点中的任何一个或多个处发现的氨基酸残基。

对极性脂质的水解活性升高的酶变体对极性脂质的转移酶活性可能也升高。

对磷脂诸如磷脂酰胆碱（PC）的水解活性升高的酶变体对磷脂的转移酶活性可能也升高。

对半乳糖脂诸如DGDG的水解活性升高的酶变体对半乳糖脂的转移酶活性可能也升高。

对磷脂诸如磷脂酰胆碱（PC）的转移酶活性升高的酶变体对磷脂的水解活性可能也升高。

对半乳糖脂诸如DGDG的转移酶活性升高的酶变体对半乳糖脂的水解活性可能也升高。

对极性脂质的转移酶活性升高的酶变体对极性脂质的水解活性可能也升高。

合适的是，下列位点中的一个或多个可能参与底物结合：Leu17、Ala114、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289、Val290。

依照本发明的酶变体与亲本酶相比可以具有一项或多项下列功能性：

1)与PC相比对半乳糖脂（DG）的相对转移酶活性升高，以%T_DG/T_PC计算（如实施例8所示）

2)对半乳糖脂（DG）的绝对转移酶活性升高（如实施例8所示）

3)使用半乳糖脂作为供体的转移酶活性（T_DG）相对于对半乳糖脂（DG）的水性活性（H_DG）升高（如实施例8所示）

4)对PC的绝对转移酶活性升高（如实施例8所示）

其中DG指半乳糖脂（例如DGDG）（而且在本文中也可以称为GL），而PC指磷脂（例如卵磷脂）。对半乳糖脂的活性升高的变体包括上文1)、2)、和3)类的变体。对半乳糖脂的活性升高的变体对磷脂的活性可能也升高（按照上文4)类）。

1.一个或多个下列残基的更改可能导致与PC相比酶变体对DG的相对转移酶活性（以%T_DG/T_PC计算）升高：

-318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、Q289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Q182。

通常，可能优选下列替代中的一项或多项：

S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，优选M、R、N、G、T、Q、P、Y、S、L、E、W，最优选Q

K22A、E、C、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选A、C、E、或R

Y30A、C、D、H、K、M、N、P、Q、R、T、V、W、G、I、L、S、M、A、R、或E，优选H、T、W、N、D、C、Q、G、I、L、S、M、A、R、或E

G40L、N、T、V、或A

N80N、R、D、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y，优选H、I、Y、C、Q、M、S、W、L、N、R、D、或F

P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选I、M、F、G、V、Y、D、C、或A

K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选H、K、S、或R

N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选I、Y、M、T、Q、S、W、F、V、或P

N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选C、V、A、或F

V112C

Y117A、C、D、E、F、H、T、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、V、或W，优选A、N、E、H、T、I、F、C、P、或S

L118A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y、优选F

V112A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y，优选I、M、F、Y、N、E、T、Q、H、或P

Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，优选F、C、H、I、L、M、P、V、或W

H180K、Q、A、C、D、E、F、G、I、L、M、P、R、S、T、V、W、或Y，优选M、F、C、K、或Q

N181A或V

Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选K

M209L、K、M、A、C、D、E、F、G、H、I、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选I、F、T、D、C、H、L、K、M、或P

L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、C、F、K、P、或Y，优选G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、Y、或F

R211G、Q、K、D、A、C、E、F、H、I、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，优选G、Q、K、D、H、I、M、F、P、S、Y、N、C、L、或W

N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选I、F、P、T、W、H、或A

Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，优选I、T、G、D、R、E、V、M、或S，最优选I、D、R、或E

Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，优选F、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G、R、N、或P，更优选R、T、D、K、N、或P

V290A、C、D、E、H、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y

E309S、Q、R、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、T、V、W、或Y，优选F、W、N、H、I、M、S、Q、R、A、或Y

S310A、P、T、H、M、K、G、C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W、或Y，优选F、Y、C、L、K、A、P、T、H、M、K、或G

-318A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、Y、H、或S

优选的是，下列更改中的一项或多项可能导致与PC相比酶变体对DG的相对转移酶活性（以%T_DG/T_PC计算）升高：

G40L、N、T、V、或A

K82A、C、D、E、F、G、H,I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选H、K、S、或R

Y230A、C、D、E、G、H,I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，优选I、T、G、D、R、E、V、M、或S，最优选D、R、或E

Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，优选F、W、H,I、Y、L、D、C、K、V、E、G、或P，更优选R、T、D、K、或P

下列更改中的一项或多项的更改可能导致与PC相比酶变体对DG的相对转移酶活性（以%T_DG/T_PC计算）升高：

-318Y、H、或S

N215H

L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、或T

S310A、P、T、H、M、K、或G

E309S、Q、A、或R

H180K、T、或Q

N80N、R、或D

V112C

Y30G、I、L、S、M、A、R、或E，更优选Y30M、A、或R

V290R、E、H、或A

Q289R、T、D、或N

K22E

G40L

Y179V或R

M209L、K、或M

L211G、Q、K、或D

Y230V

G40Q、L、或V

N88W

N87R或D

对于有些实施方案，下列替代可能也是合适的：

K22A或C

P81G

N87M

Y117A、N、E、H、或T

N181A或V

Y230I

V290H

N87R、D、E、或M

Q182T

优选的是，为了提高半乳糖脂转移酶与磷脂转移酶活性比率而更改的残基是下列中的一个或多个：-318、N215、L210、E309、H180、N80。

通常，优选下列替代中的一项或多项：

-318Y、H、或S，最优选Y

N215H

L210D、Q、或T

E309Q或R

H180K或Q

N80N、R、或D

2.一个或多个下列残基的更改可能导致变体对DG的绝对转移酶活性升高：

-318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、Q289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、N87、Q182、S3、S310、K82、A309。

具体而言，下列更改中的一项或多项可能导致变体对DG的绝对转移酶活性升高：

-318Y、H、S、A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、或W，优选Y、H、S、或I

N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选H、I、F、P、T、W、或A，最优选H、S、L、R、Y

L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、T、C、F、K、P、或Y，优选D、Q、T、Y、或F

S310A、P、T、H、M、K、G、C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W、或Y，优选F、Y、C、L、K、或P

E309S、Q、R、A、C、D、F、G、H、I、K、L、M、N、P、S、T、V、W、或Y，优选S、Q、R、F、W、N、H、I、M、或Y，最优选S、Q、R、N、P、或A

H180A、C、D、E、F、G、I、K、QL、M、P、R、S、T、V、W、或Y，优选K、Q、M、F、或C，最优选T、K、或Q

N181A或V

N80N、R、D、A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y，优选H、I、Y、C、Q、M、S、W、L、N、R、D、或F，最优选N、R、D、P、V、A、或G

V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y，优选I、M、F、Y、N、E、T、Q、H、或P

Y30G、I、L、S、A、E、C、D、H、K、M、N、P、Q、R、T、V、或W，优选H、T、W、N、D、C、或Q

V290A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y

Q289A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，优选R、E、G、P、N、或R

K22A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选C

Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，优选F、C、H、I、L、M、P、或W，更优选E、R、N、V、K、S

M209A、C、D、E、F、G、H、I、L、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选R、N、Y、E、或V

R211A、C、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、K、D、R、S、T、V、W、或Y，优选H、I、M、F、P、S、Y、N、C、L、或W，最优选R

S310C、D、E、F、I、L、N、Q、R、V、W、或Y，优选F、Y、C、L、K、或P

S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，优选M、R、N、A、G、T、Q、P、Y、或S，最优选Q或N

K82A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选H、K、S、E、或R

P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选I、M、F、V、Y、D、C、或A

N87A、C、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、D、E、S、T、V、W、或Y，优选L、G、或A

Y117A、N、E、H、T、C、D、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、V、或W，优选I、F、C、P、或S

N87A、C、F、G、H、I、K、L、P、Q、S、T、V、W、或Y，优选I、Y、T、Q、S、W、F、V、或P

Q182A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，优选D或K

Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，优选W、H、Q、L、P、或C，最优选T或G

D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选C

G40L

Y226I

通常，优选下列替代中的一项或多项：

-318Y、H、或S

N215H

L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、或T

S310A、P、T、H、M、K、或G

E309S、Q、或R

H180K或Q

N80N、R、或D

V112C

Y30G、I、L、S、M、A、R、或E，更优选Y30M、A、或R

V290R、E、H、或A

Q289R或N

K22E

G40L

Y179V

M209L、K、或M

L211G、Q、K、或D

对于有些实施方案，下列替代可能也是合适的：

K22A或C

P81G

N87M

Y117A、N、E、H、或T

N181A或V

Y230I

V290H

N87R、D、E、或M

Q182T

优选的是，为了提高对半乳糖脂底物（DGDG）的转移酶活性而更改的残基是下列中的一个或多个：-318、N215、L210、E309、H180、N80。

通常，优选下列替代中的一项或多项：

-318Y、H、或S，最优选Y

N215H

L210D、Q、或T

E309Q或R

H180K或Q

N80N、R、或D

3.一个或多个下列残基的更改可能导致酶变体对DG的转移酶活性T_DG相对于水解活性H_DG升高：

Y230、S310、H180、Q289、G40、N88、Y179、N215、L210、N80、Y30X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、N87、M209、R211、S18X（其中X明确选自A、C、D、E、F、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、W、或Y）

优选的是，下列更改中的一项或多项可能导致酶变体对DG的转移酶活性T_DG相对于水解活性H_DG升高：

Y230A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、或W，优选W、H、Q、L、P、或C

S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、T、V、W、或Y，优选F、Y、C、L、K、或P

Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、或W，优选F、C、H,I、L、M、P、或W

H180A、C、D、E、F、G,I、K、L、M、P、Q、R、S、V、W、或Y，优选M、F、或C

Q289A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、R、S、V、W、或Y，优选F、W、H、I、Y、L、D、C、K、V、E、G、或P

G40A、C、D、E、F、H、I、K、M、N、P、R、S、T、W、或Y，优选I、P、W、或Y

N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、或Y，优选I或H

N87A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、S、T、V、W、或Y，优选I、Y、T、Q、S、W、F、V、或P

通常，优选下列替代中的一项或多项，这些酶变体（对半乳糖脂和/或磷脂）的水解活性可能降低和/或对半乳糖脂的转移酶活性可能升高：

Y179E、R,N、或Q

N215G

L210D、H、R、E、A、Q、P、N、K、G、R、T、W,I、V、或S

N80G

Y30L

N87G

通常，优选下列替代中的一项或多项，这些酶变体（对半乳糖脂和/或磷脂）的水解活性可能降低，而对半乳糖脂的转移酶活性保持显著：

Y179E、R、N、和Q

N215G

L210D、H、R、E、A、Q、P、N、K、G、R、T、W、I、V、和S

N80G

Y30L

N87G

H180I和T

M209Y

R211D、T、和G

S18G、M、和T

G40R和M

N88W

N87C、D、R、E、和G

4.一个或多个下列残基的更改可能导致酶变体对磷脂的绝对转移酶活性升高：

S3、D157、S310、E309、Y179、N215、K22、Q289、M23、H180、M209、L210、R211、P81、V112、N80、L82、N88、N87

可能提供对磷脂的转移酶活性升高的酶变体的具体实施方案可能选自下列中的一项或多项：

S3A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，优选N、E、K、R、A、P、或M，最优选S3A

D157A、C、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选D157S、R、E、N、G、T、V、Q、K、或C

S310A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，优选S310T

-318E

E309A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、T、V、W、或Y，优选E309R、E、L、R、或A

Y179A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W，优选Y179D、T、E、R、N、V、K、Q、或S，更优选E、R、N、V、K、或Q

N215A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选N215S、L、R、或Y

K22A、C、D、E、F、G、H、I、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选K22E、R、C、或A

Q289A、C、D、E、F、G、H,I、K、L、M、N、P、R、S、T、V、W、或Y，优选Q289R、E、G、P、或N

M23A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选M23K、Q、L、G、T、或S

H180A、C、D、E、F、G、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选H180Q、R、或K

M209A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选M209Q、S、R、A、N、Y、E、V、或L

L210A、C、D、E、F、G、H、I、K、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选L210R、A、V、S、T、I、W、或M

R211A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V、W、或Y，优选R211T

P81A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选P81G

V112A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、W、或Y，优选V112C

N80A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选N80R、G、N、D、P、T、E、V、A、或G

L82A、C、D、E、F、G、H、I、M、N、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选L82N、S、或E

N88A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选N88C

N87A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V、W、或Y，优选N87M或G

下列残基中的一个或多个的更改可能导致酶变体对磷脂的绝对转移酶活性升高：

S3N、R、A、或G

M23K、Q、L、G、T、或S

H180R

L82G

Y179E、R、N、V、K、或Q

E309R、S、L、或A

5.其修饰导致对半乳糖脂底物（DGDG）的转移酶活性升高且半乳糖脂转移酶与磷脂转移酶活性比率升高的残基包括下列中的一个或多个：

-318、N215、L210、S310、E309、H180、N80、V112、Y30X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、V290、Q289、K22、G40、Y179、M209、L211、K22、P81、N87、Y117、N181、Y230X（其中X选自A、C、D、E、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、R、S、T、V、或W）、Q182

通常，优选下列替代中的一项或多项：

-318Y、H、或S

N215H

L210G、I、H、E、M、S、W、V、A、R、N、D、Q、或T

S310A、P、T、H、M、K、或G

E309S、A、Q、或R

H180K或Q

N80N、R、或D

V112C

Y30G、I、L、S、M、A、R、或E，更优选Y30M、A、或R

V290R、E、H、或A

Q289R或N

K22E

G40L

Y179V

M209L、K、或M

L211G、Q、K、或D

对于有些实施方案，下列替代可能也是合适的：

K22A或C

P81G

N87M

Y117A、N、E、H、或T

N181A或V

Y230I

V290H

N87R、D、E、或M

Q182T

优选的是，为了提高对半乳糖脂底物（DGDG）的转移酶活性和/或提高半乳糖脂转移酶与磷脂转移酶活性比率而更改的残基是下列中的一个或多个：-318、N215、L210、E309、H180、N80。

通常，优选下列替代中的一项或多项：

-318Y、H、或S，最优选Y

N215H

L210D、Q、或T

E309Q或R

H180K或Q

N80N、R、或D

6.发现P10480的下列野生型残基是保持好的活性特别是好的对半乳糖脂的转移酶活性所优选的：

W111、R211、N181、S3、L17、G40、N88、Y117、L118、N181、K22、M209、M285、M23

优选的是，在酶变体中保留这些残基。

在构建GDSX酰基转移酶变体以提高对半乳糖脂底物的转移酶活性时，其中亲本酶在与P10480序列位置W111、R211、N181、S3、L17、G40、N88、Y117、L118、N181、K22、M209、M285、M23对应的位置具有与P10480不同的残基，所述变体可以优选在相应位置包含替代，以包含在P10480序列中发现的氨基酸残基。

L17是优选的疏水性氨基酸残基。

7.下列组合可能提高对半乳糖脂底物（DGDG）的转移酶活性和/或提高半乳糖脂转移酶活性与磷脂转移酶活性比率：

N215H及-318Y

N215H及L210D、Q、或T

-318Y及L210D、Q、或T

N215H及-318Y及L210D、Q、或T

上述组合还可以任选包含C端氨基酸添加，诸如-318Y、H、或S，优选-318Y。

上述组合还可以任选包含下列更改：

合适的是，下列组合中的一项或多项可能提高对半乳糖脂底物（DGDG）的转移酶活性和/或提高半乳糖脂转移酶活性与磷脂转移酶活性比率：

E309A、Q、或R

N215H及-318Y、H、或S，优选Y

L210D、Q、或T及-318Y、H、或S，优选Y

N215H及E309A、Q、或R

L210D、Q、或T及E309A、Q、或R

-318Y及E309A、Q、或R

上述组合还可以任选包含位置Q182处的替代，优选Q182K。

下列组合可能提高对半乳糖脂底物（DGDG）的转移酶活性和/或提高半乳糖脂转移酶活性与磷脂转移酶活性比率，和/或提高半乳糖脂转移酶与水性活性之比率：

N215H及N80G

-318Y及N80G

L210D或Q及N80G

N215H及N88N

-318Y及N88N

L210D或Q及N88N

N215H及Y30L

-318Y及Y30L

L210D或Q及Y30L

N215H及N87G

-318Y及N87G

L210D或Q及N87G

N215H及Y179E、R、N、或Q

-318Y及Y179E、R、N、或Q

L210D或Q及Y179E、R、N、或Q

如上所述，本文在提及具体的氨基酸残基时，编号是通过对比变体序列与SEQ IDNo.2所示参考序列而获得的。

为了避免疑惑，在讲授位于一个具体位点的一个具体氨基酸时，例如L118，它指位于SEQ ID No.2中编号118的残基处的具体氨基酸。然而，在不同亲本酶中位于位点118的氨基酸残基可能不是亮氨酸。

由此，在讲授位于残基118处的氨基酸的替代时，尽管可以参照L118，技术人员可以容易地领会，当亲本酶不是SEQ ID No.2所示时，所替代的氨基酸可能不是亮氨酸。因此，在替代不具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的亲本酶中的氨基酸序列时，新的（替代）氨基酸有可能与SEQ ID No.2中讲授的相同。例如，当位于所述第118位残基的氨基酸不是亮氨酸，因而与SEQID No.2中第118位残基的氨基酸不同时，可能就是这种情况。换言之，例如第118位残基，如果亲本酶在该位置具有亮氨酸以外的氨基酸，那么可以依照本发明用亮氨酸替代该氨基酸。

术语“脂酰基转移酶”在用于本文时指具有酰基转移酶活性的酶（通常依照国际生物化学和分子生物学联合会命名委员会的酶命名规则（1992）归入E.C.2.3.1.x），由此酶能够将酰基由脂质转移给一种或多种受体底物，诸如下列中的一种或多种：固醇、stanol、碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚基、甘油。

优选的是，脂酰基转移酶能够将酰基由脂质转移给至少一种固醇和/或stanol，例如胆固醇。

优选的是，依照本发明和/或用于本发明方法和/或用途的脂酰基转移酶变体能够将酰基由（本文限定的）脂质转移给下列酰基受体底物中的一种或多种：固醇、stanol、碳水化合物、蛋白质或其亚基、或甘油。

对于有些方面，依照本发明的“酰基受体”可以是含有羟基（-OH）的任何化合物，诸如例如多价醇，包括甘油；固醇；stanol；碳水化合物；羟酸，包括果酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、和抗坏血酸；蛋白质或其亚基，诸如例如氨基酸、蛋白质水解产物、和肽（部分水解的蛋白质）；及其混合物和衍生物。优选的是，依照本发明的“酰基受体”不是水。

在一个实施方案中，酰基受体优选不是甘油一酯和/或甘油二酯。

在一个方面，优选的是，酶变体能够将酰基由脂质转移给固醇和/或stanol。

在一个方面，优选的是，酶变体能够将酰基由脂质转移给碳水化合物。

在一个方面，优选的是，酶变体能够将酰基由脂质转移给蛋白质或其亚基。合适的是，蛋白质亚基可以是下列中的一种或多种：氨基酸、蛋白质水解产物、肽、二肽、寡肽、或多肽。

合适的是，在蛋白质或蛋白质亚基中，酰基受体可以是下列蛋白质或蛋白质亚基成分中的一种或多种：丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸。

当蛋白质亚基是氨基酸时，合适的是，氨基酸可以是任何合适的氨基酸。合适的是，氨基酸可以是例如丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、或半胱氨酸中的一种或多种。

在一个方面，优选的是，酶变体能够将酰基由脂质转移给甘油。

在一个方面，优选的是，酶变体能够将酰基由脂质转移给羟酸。

在一个方面，优选的是，酶变体能够将酰基由脂质转移给多价醇。

在一个方面，除了能够将酰基由脂质转移给固醇和/或stanol，脂酰基转移酶变体还能够将酰基由脂质转移给下列中的一种或多种：碳水化合物、蛋白质、蛋白质亚基、或甘油。

优选的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体所作用的脂质底物是下列脂质中的一种或多种：磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱、三酰甘油酯(triacylglyceride)、心磷脂、甘油二酯、或糖脂，诸如例如二半乳糖基甘油二酯（DGDG）或单半乳糖基甘油二酯（MGDG）。更优选的是，依照本发明的酶变体作用于DGDG和MGDG中的一种或二者。优选的是，依照本发明的酶变体对二半乳糖基甘油一酯（DGMG）或单半乳糖基甘油一酯（MGMG）没有活性（或具有有限的活性）。由此，优选的是，脂质底物不是DGMG或MGMG中的一种或二者。该脂质底物在本文中可以称为“脂质酰基供体”。术语卵磷脂在用于本文时涵盖磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酰丝氨酸、和磷脂酰甘油。

术语“半乳糖脂”在用于本文时指一种或多种DGDG或DGMG。

术语“磷脂”在用于本文时指卵磷脂，包括磷脂酰胆碱。

术语“极性脂质”在用于本文时指磷脂和/或半乳糖脂，优选磷脂和半乳糖脂。

对于有些方面，优选的是，脂酰基转移酶变体所作用的脂质底物是磷脂，诸如卵磷脂，例如磷脂酰胆碱。

对于有些方面，优选的是，脂质底物是糖脂，诸如例如DGDG或MGDG。

优选的是，脂质底物是食品脂质，即食品的脂质成分。

对于有些方面，优选的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体不能或基本上不能作用于甘油三脂和/或1-甘油一酯和/或2-甘油一酯。

合适的是，脂质底物或脂质酰基供体可以是一种或多种下列物质中存在的一种或多种脂质：脂肪，包括猪油、牛脂、和黄油；油，包括油棕榈油、葵花籽油、大豆油、红花油、棉籽油、落花生油、玉米油、橄榄油、花生油、椰子油、和油菜籽油榨取或衍生的油。来自大豆、油菜籽、或蛋黄的卵磷脂也是合适的脂质底物。脂质底物可以是燕麦脂质或其它含有半乳糖脂的基于植物的材料。

在一个方面，脂质酰基供体优选蛋黄中的卵磷脂（诸如磷脂酰胆碱）。

对于本发明的有些方面，脂质可以选自脂肪酸链长度为8-22个碳的脂质。

对于本发明的有些方面，脂质可以选自脂肪酸链长度为16-22个碳、更优选16-20个碳的脂质。

对于本发明的有些方面，脂质可以选自脂肪酸链长度不超过14个碳的脂质，合适的是选自脂肪酸链长度4-14个碳、合适的是4-10个碳、合适的是4-8个碳的脂质。

合适的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体可能展示下列脂肪酶活性中的一种或多种：糖脂酶活性（E.C.3.1.1.26）、三酰甘油脂肪酶活性（E.C.3.1.1.3）、磷脂酶A2活性（E.C.3.1.1.4）、或磷脂酶A1活性（E.C.3.1.1.32）。术语“糖脂酶活性”在用于本文时涵盖“半乳糖酯酶活性”。

合适的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体可能具有下列活性中的至少一种或多种：糖脂酶活性（E.C.3.1.1.26）和/或磷脂酶A1活性（E.C.3.1.1.32）和/或磷脂酶A2活性（E.C.3.1.1.4）。

对于有些方面，依照本发明的脂酰基转移酶变体可能至少具有糖脂酶活性（E.C.3.1.1.26）。

合适的是，对于有些方面，依照本发明的脂酰基转移酶变体可能能够将酰基由糖脂和/或磷脂转移给下列受体底物中的一种或多种：固醇、stanol、碳水化合物、蛋白质、或甘油。

对于有些方面，优选的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体能够将酰基由糖脂和/或磷脂转移给固醇和/或stanol，从而形成至少一种固醇酯和/或stanol酯。

对于有些方面，优选的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体能够将酰基由糖脂和/或磷脂转移给碳水化合物，从而形成至少一种碳水化合物酯。

对于有些方面，依照本发明的脂酰基转移酶变体能够将酰基由糖脂和/或磷脂转移给蛋白质，从而形成至少一种蛋白质酯（或蛋白质脂肪酸缩合物）。

对于有些方面，优选的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体能够将酰基由糖脂和/或磷脂转移给甘油，从而形成至少一种甘油二酯和/或甘油一酯。

对于有些方面，优选的是，依照本发明的脂酰基转移酶变体不展示三酰甘油脂肪酶活性（E.C.3.1.1.3）。

在有些方面，脂酰基转移酶变体可能能够将酰基由脂质转移给固醇和/或stanol。由此，在一个实施方案中，依照本发明的“酰基受体”可以是固醇或stanol或是二者的组合。

在一个实施方案中，优选的是，固醇和/或stanol可以包含下列结构特色中的一项或多项：

1)3-β羟基或3-α羟基；和/或

2)顺式位置的A:B环或反式位置的A:B环或是C5-C6是不饱和的。

合适的固醇酰基受体包括胆固醇和植物甾醇，例如α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇、菜油甾醇、5,6-二氢甾醇、菜子甾醇、α-菠菜甾醇、β-菠菜甾醇、γ-菠菜甾醇、δ-菠菜甾醇、岩藻甾醇、dimosterol、子囊甾醇、serebisterol、表甾醇、anasterol、hyposterol、chondrillasterol、链甾醇、海绵甾醇、多孔甾醇、clionasterol（γ-谷甾醇）、固醇糖苷、以及其它天然或合成的同质异构形式和衍生物。

在本发明的一个方面，合适的是，超过一种固醇和/或stanol可以担当酰基受体，合适的是，超过两种固醇和/或stanol可以担当酰基受体。换言之，在本发明的一个方面，合适的是，可以生成超过一种固醇酯和/或stanol酯。合适的是，当酰基受体是胆固醇时，一种或多种其它固醇或者一种或多种stanol也可以担当酰基受体。由此，在一个方面，本发明提供了用于原位生成胆固醇酯及至少一种固醇酯或stanol酯的组合的方法。换言之，本发明有些方面的脂酰基转移酶可以将酰基由脂质转移给胆固醇及至少一种其它固醇和/或至少一种stanol。

在一个方面，优选的是，固醇酰基受体是下列中的一种或多种：α-谷甾醇、β-谷甾醇、豆甾醇、麦角甾醇和菜油甾醇。

在一个方面，优选的是，固醇酰基受体是胆固醇。在脂酰基转移酶变体的酰基受体是胆固醇的情况中，食品中游离胆固醇的数量与暴露于脂酰基转移酶变体前的食品相比和/或与未用脂酰基转移酶变体处理的等价食品相比减少了。

合适的stanol酰基受体包括phytostanol，例如β-phytostanol(sitostanal)或ss-phytostanol。

在一个方面，优选的是，固醇和/或stanol酰基受体是胆固醇以外的固醇和/或stanol。

在有些方面，依照本发明制作的食品可用于降低血清胆固醇和/或降低低密度脂蛋白。血清胆固醇和低密度脂蛋白都与某些人类疾病有关，诸如例如动脉粥样硬化和/或心脏病。由此，设想依照本发明制作的食品可用于降低这些疾病的风险。

由此，在一个方面，本发明提供了依照本发明的食品用于治疗和/或预防动脉粥样硬化和/或心脏病的用途。这是可以将食品考虑作为类药剂营养品（neutraceutical）的一个方面。

在另一个方面，本发明提供了包含依照本发明的食品的药物。

在另一个方面，本发明提供了治疗和/或预防人类或动物患者疾病的方法，该方法包括对患者施用有效量的依照本发明的食品。

合适的是，食品中可能天然存在固醇和/或stanol“酰基受体”。或者，可以向食品中添加固醇和/或stanol。在向食品中添加固醇和/或stanol的情况中，可以在添加依照本发明的脂酰基转移酶之前、同时、和/或之后添加固醇和/或stanol。合适的是，本发明可以涵盖在添加依照本发明的酶变体之前或同时向食品中添加外源固醇和/或stanol，特别是植物固醇/植物stanol。

对于有些方面，可以在依照本发明添加脂酰基转移酶变体之前或同时将食品中存在的一种或多种固醇转变成一种或多种stanol。可以采用适于将固醇转变成stanol的任何方法。例如，可以通过例如化学氢化来进行转变。可以在添加依照本发明的脂酰基转移酶变体之前或同时实施转变。合适的是，WO00/061771中讲授了用于将固醇转变成stanol的酶。

合适的是，本发明可用于在食品中原位生成phytostanol酯。phytostanol酯穿过脂膜的溶解性提高、生物利用度提高、且健康利益提高（见例如WO92/99640）。

在本发明的有些实施方案中，stanol酯和/或固醇酯可以是增香剂和/或质地改良剂(texturiser)。

在一个实施方案中，本发明提供了通过用依照本发明的酶变体处理油而在食用油（诸如植物油，诸如例如大豆油）中生成植物固醇酯和/或stanol酯和溶血卵磷脂但不形成游离脂肪酸的方法。在这种情况中，可以通过脱胶过程清除由此生成的溶血卵磷脂。可以采用任何脱胶过程，诸如一种或多种已知的脱胶过程。如果需要，可以通过除臭来清除任何游离脂肪酸。注意，通过除臭过程不能清除油中生成的任何stanol/固醇酯。由此，所生成的食用油包含固醇酯和/或stanol酯，它们可能具有有益的营养和/或类药剂营养(nutriceutical)作用，诸如降低血液胆固醇水平。

可以对其执行此方法的合适的油格外包含卵磷脂和固醇/stanol。合适的是，在处理时油是粗制的油。合适的是，食用油可以是下列中的一种或多种：玉米胚芽油、棉籽油、亚麻籽油、棕榈油、花生油、油菜籽油、大豆油、葵花籽油、和小麦胚芽油。

对于本发明的有些方面，依照本发明的脂酰基转移酶变体可以利用碳水化合物作为酰基受体。碳水化合物酰基受体可以是下列中的一种或多种：单糖、二糖、寡糖、或多糖。优选的是，碳水化合物是下列中的一种或多种：葡萄糖、果糖、脱水果糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、半乳糖、木糖、木糖寡糖、阿拉伯糖、麦芽糖寡糖、塔格糖、microthecin、ascopyrone P、ascopyrone T、cortalcerone。

合适的是，食品中可能天然存在碳水化合物“酰基受体”。或者，可以向食品中添加碳水化合物。在向食品中添加碳水化合物的情况中，可以在添加依照本发明的脂酰基转移酶变体之前、同时、和/或之后添加碳水化合物。

碳水化合物酯在食品中可以作为有价值的乳化剂发挥功能。由此，在酶发挥将酰基转移给糖的功能的情况中，本发明涵盖在食品中原位生成第二种乳化剂。

在有些实施方案中，脂酰基转移酶变体可以利用固醇和/或stanol及碳水化合物二者作为酰基受体。

能够将酰基转移给碳水化合物以及固醇和/或stanol的脂酰基转移酶变体的利用对于包含蛋的食品是特别有利的。具体而言，蛋和蛋制品中糖特别是葡萄糖的存在常常看作是不利的。蛋黄可能包含可多达1％的葡萄糖。通常，可以用葡萄糖氧化酶处理蛋或基于蛋的产品，从而清除部分或所有的葡萄糖。然而，依照本发明，可以通过将糖“酯化”而形成糖酯，从而容易的清除不需要的糖。

对于本发明的有些方面，依照本发明的脂酰基转移酶变体可以利用蛋白质作为酰基受体。合适的是，蛋白质可以是在食品中例如在乳制品和/或肉制品中发现的一种或多种蛋白质。只是作为例示，合适的蛋白质可以是在凝乳或乳清中发现的蛋白质，诸如乳球蛋白。其它合适的蛋白质包括来自蛋的卵清蛋白、麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、嘌呤二氢吲哚(puroindoline)、来自谷类的脂转移蛋白、和来自肉类的肌球蛋白。

优选的是，可以使用下列标准来鉴定依照本发明的亲本脂酰基转移酶：

(1)酶具有可以定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的最初酯键的酰基部分转移给酰基受体，从而形成新的酯；和

(2)酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S。

优选的是，GDSX基序中的X是L。由此，优选的是，依照本发明的酶包含氨基酸序列基序GDSL。

GDSX基序由四个保守氨基酸组成。优选的是，基序中的丝氨酸是脂酰基转移酶的催化性丝氨酸。合适的是，GDSX基序的丝氨酸可以位于与Brumlik和Buckley（Journal ofBacteriology，1996年4月，Vol.178，No.7，p2060-2064）中讲授的嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-16对应的位置。

为了确定蛋白质是否具有依照本发明的GDSX基序，优选将序列与pfam数据库的隐藏Markov模型序型(profile)（HMM序型）进行比较。

pfam是蛋白质结构域家族的数据库。pfam包含排列好的每个家族的多重序列对比，以及用于在新序列中鉴定这些结构域的序型隐藏Markov模型（序型HMM）。关于pfam的介绍见Bateman A等，2002，Nucleic Acids Res.30：276-280。隐藏Markov模型在致力于蛋白质分类的许多数据库中得到采用，综述见Bateman A和Haft DH，2002，Brief Bioinform3：236-245。

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& list_uids=12230032&dopt=Abstract

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed& list_uids=11752314&dopt=Abstract

关于隐藏Markov模型的详细解释和它们在pfam数据库中是如何应用的见DurbinR、Eddy S、和Krogh A，1998，Biological sequence analysis;probabilistic models ofproteins and nucleic acids.Cambridge University Press，ISBN0-521-62041-4。Hammer软件包可以由华盛顿大学（St Louis，USA）获得。

或者，可以使用Hammer软件包来鉴定GDSX基序，其说明书见Durbin R、Eddy S、和Krogh A，1998，Biological sequence analysis;probabilistic modelsof proteins andnucleic acids.Cambridge University Press，ISBN0-521-62041-4及其参考文献，以及该说明书中提供的HMMER2序型。

可以通过例如目前位于下列网站的几个服务器访问PFAM数据库。

http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/index.shtml

http://pfam.wustl.edu/

http://pfam.jouy.inra.fr/

http://pfam.cgb.ki.se/

数据库提供了能够输入蛋白质序列的搜索工具。使用数据库的默认参数，就将对蛋白质序列分析是否存在Pfam结构域。GDSX结构域是数据库中已经确定的结构域，因此它在任何检索序列中的存在都将受到识别。数据库将对检索序列报告其与Pfam00657共有序列的对比。

可以通过下列方式获得包括杀鲑气单胞菌或嗜水气单胞菌在内的多重对比：

1)手工

遵循上文所述流程，获得目的蛋白与Pfam00657共有序列的对比，并获得P10480与Pfam00657共有序列的对比；

或

2)通过数据库

在鉴定了Pfam00657共有序列之后，数据库提供选项以显示检索序列与Pfam00657共有序列种子对比(seed alignment)的对比。P10480是该种子对比的一部分，以GCAT_AERHY表示。检索序列和P10480二者都将在同一个窗口中得到显示。

嗜水气单胞菌参考序列：

嗜水气单胞菌GDSX脂肪酶的残基在NCBI文件P10480中进行了编号，本文中的编号就是该文件中给出的编号，在本发明中用于在优选实施方案中确定本发明脂酰基转移酶中存在的具体氨基酸。

进行了Pfam对比（图33和图34）：

可以识别下列保守残基，而且在优选实施方案中它们可以存在于本发明组合物和方法所使用的酶变体中；

模块1－GDSX模块

hid hid hid hid Gly Asp Ser hid

28 29 30 31 32 33 34 35

模块2－GANDY模块

hid Gly hid Asn Asp hid

130 131 132 133 134 135

模块3－HPT模块

His

309

其中“hid”指选自下组的疏水残基：Met、Ile、Leu、Val、Ala、Gly、Cys、His、Lys、Trp、Tyr、Phe。

优选的是，可以将本发明组合物/方法所使用的亲本和/或变体脂酰基转移酶与Pfam00657共有序列进行对比。

优选的是，与pfam00657结构域家族的隐藏Markov模型序型（HMM序型）的正匹配指示存在依照本发明的GDSL或GDSX结构域。

优选的是，在与Pfam00657共有序列对比时，本发明组合物/方法所使用的亲本和/或变体脂酰基转移酶具有GDSX模块、GANDY模块和HPT模块中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个。合适的是，亲本和/或变体脂酰基转移酶可以具有GDSX模块和GANDY模块。或者，亲本和/或变体酶可以具有GDSX模块和HPT模块。优选的是，亲本和/或变体酶包含至少GDSX模块。

优选的是，在与Pfam00657共有序列对比时，与嗜水气单胞菌多肽参考序列即SEQID No.26相比，本发明组合物/方法所使用的亲本和/或变体酶具有下列氨基酸残基中的至少一个、优选超过一个、优选超过两个、优选超过三个、优选超过四个、优选超过五个、优选超过六个、优选超过七个、优选超过八个、优选超过九个、优选超过十个、优选超过十一个、优选超过十二个、优选超过十三个、优选超过十四个：28hid、29hid、30hid、31hid、32gly、33Asp、34Ser、35hid、130hid、131Gly、132Hid、133Asn、134Asp、135hid、309His。

pfam00657是区分具有此结构域的蛋白质与其它酶的独特鉴别物。

pfam00657共有序列在图1中显示为SEQ ID No.1。它衍生自对第6版数据库pfam家族00657的鉴定，在本文中也可称为pfam00657.6。

可以使用pfam数据库的较新版本更新共有序列。

例如，图33和图34显示了第11版数据库的00657家族的pfam对比，在本文中也可称为pfam00657.11。

在来自数据库两个版本的pfam家族00657中都发现存在GDSX、GANDY和HPT模块。可以使用更新版本的pfam数据库来鉴定pfam家族00657。

(1)酶具有可以定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将脂质酰基供体的最初酯键的酰基部分转移给酰基受体，从而形成新的酯；

(2)酶包含氨基酸序列基序GDSX，其中X是下列氨基酸残基中的一种或多种：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M、或S；和

(3)酶包含His-309或者在与图2（SEQ ID No.2或SEQ ID No.36）所示嗜水气单胞菌脂肪分解酶中His-309对应的位置包含组氨酸残基。

优选的是，GDSX基序中的氨基酸残基X是L。

在SEQ ID No.26中，前18个氨基酸残基构成信号序列。全长序列即包含信号序列的蛋白质中的His-309等同于蛋白质成熟部分即不含信号序列的序列中的His-291。

优选的是，依照本发明的亲本脂酰基转移酶包含下列催化性三联体：Ser-16、Asp-116、和His-209，或者在与图2（SEQ ID No.2）所示嗜水气单胞菌脂肪分解酶中Ser-16、Asp-116和His-209对应的位置或者在与图28（SEQID No.26）所示全长序列中Ser-34、Asp-134和His-309对应的位置分别包含丝氨酸残基、天冬氨酸残基和组氨酸残基。如上所述，在SEQID No.26所示序列中，前18个氨基酸残基构成信号序列。全长序列即包含信号序列的蛋白质中的Ser-34、Asp-134和His-309等同于蛋白质成熟部分即不含信号序列的序列中的Ser-16、Asp-116和His-291。在pfam00657共有序列中，如图1（SEQ ID No.1）所示，活性位点的残基对应于Ser-7、Asp-157和His-348。

优选的是，可以使用下列标准鉴定依照本发明的亲本脂酰基转移酶：

(1)酶具有可以定义为酯转移活性的酰基转移酶活性，由此将第一种脂质酰基供体的最初酯键的酰基部分转移给酰基受体，从而形成新的酯；和

(2)酶至少在与图2（SEQ ID No.2）所示嗜水气单胞菌酶对应的位置包含Gly-14、Asp-15、Ser-16、Asp-116和His-191，它们又对应于图28（SEQID No.26）中的位置Gly-32、Asp-33、Ser-34、Asp-134、和His-309。

合适的是，依照本发明的亲本脂酰基转移酶可以由一种或多种下列属的生物体获得，优选就是这样获得的：气单胞菌属（Aeromonas）、棒杆菌属（Corynebacterium）、Novosphingobium属、喜热裂孢菌属(Termobifida)、链霉菌属（Streptomyces）、糖酵母属（Saccharomyces）、乳球菌属（Lactococcus）、分支杆菌属（Mycobacterium）、链球菌属（Streptococcus）、乳杆菌属（Lactobacillus）、脱亚硫酸菌属（Desulfitobacterium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、弧菌科（Vibrionaceae）、木杆菌属（Xylella）、硫化叶菌属（Sulfolobus）、曲霉属（Aspergillus）、裂殖糖酵母属（Schizosaccharomyces）、利斯特氏菌属（Listeria）、奈瑟氏球菌属（Neisseria）、中慢生根瘤菌属（Mesorhizobium）、雷尔氏菌属（Ralstonia）、黄单胞菌属（Xanthomonas）和假丝酵母属（Candida）。

合适的是，依照本发明的亲本脂酰基转移酶可以由一种或多种下列生物体获得，优选就是这样获得的：嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、杀鲑气单胞菌（Aeromonassalmonicida）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、龟裂链霉菌（Streptomycesrimosus）、分支杆菌属（Mycobacterium）、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）、瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）、脱卤脱亚硫酸菌（Desulfitobacterium dehalogenans）、芽孢杆菌（Bacillus sp）、空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）、弧菌科（Vibrionaceae）、苛养木杆菌（Xylella fastidiosa）、硫磺矿硫化叶菌（Sulfolobus solfataricus）、啤酒糖酵母（Saccharomyces cerevisiae）、土曲霉（Aspergillus terreus）、粟酒裂殖糖酵母（Schizosaccharomyces pombe）、无害利斯特氏菌（Listeriainnocua）、单核细胞增生利斯特氏菌（Listeria monocytogenes）、脑膜炎奈瑟氏球菌（Neisseria meningitidis）、百脉根中慢生根瘤菌（Mesorhizobium loti）、茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）、地毯草黄单胞菌（Xanthomonas axonopodis）、Corynebacterium efficens、Novosphingobium aromaticivorans、褐色喜热裂孢菌(Termobifida fusca)、和近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）。

在一个方面，本发明的亲本脂酰转移酶是可获得，优选获得自嗜水气单胞菌或杀鲑气单胞菌中的一种或多种。

在一个方面，优选的是，依照本发明的亲本脂酰基转移酶可以是卵磷脂:胆固醇酰基转移酶（LCAT）或其变体（例如通过分子进化构建的变体）。

合适的LCAT在本领域是已知的，而且可以由例如下列生物体中的一种或多种获得：哺乳动物、大鼠、小鼠、鸡、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、植物（包括拟南芥(Arabidopsis)和稻(Oryza sativa)）、线虫、真菌、和酵母。

优选的是，在执行依照本发明的方法时，在所生成的产品（即食品）中游离脂肪酸没有增加或基本没有增加。

术语“转移酶”在用于本文时可以与术语“脂酰基转移酶”互换使用。

术语“半乳糖脂酰基转移酶活性”在用于本文时指酶催化酰基由半乳糖脂供体转移至（除水以外的）受体分子诸如例如甘油的能力。

同样，术语“磷脂转移酶活性”在用于本文时指酶催化酰基由磷脂供体转移至（除水以外的）受体分子诸如例如甘油的能力。

术语“半乳糖脂转移酶活性与磷脂转移酶活性比率升高”在用于本文时指与亲本酶相比酶变体能够以比磷脂转移酶更高的比率催化半乳糖脂转移酶。这可能意味着半乳糖脂转移酶活性和磷脂转移酶活性二者都比亲本酶升高，或是与亲本酶相比半乳糖脂转移酶活性升高而磷脂转移酶活性降低。两种活性之间的最终关系才是重要的。

合适的是，脂酰基转移酶如本文所定义的催化下列反应中的一项或多项：酯交换、酯转移、醇解、水解。

术语“酯交换”指酶促催化的脂质供体与脂质受体之间的酰基转移，其中脂质供体不是游离的酰基。

术语“酯转移”在用于本文时指酶促催化的由（除游离脂肪酸以外的）脂质供体至（除水以外的）酰基受体的酰基转移。

在用于本文时，术语“醇解”指通过与醇ROH反应而酶促切割酸衍生物的共价键，使得一种产物与醇的H结合而另一种产物与醇的OR基团结合。

在用于本文时，术语“醇”指含有羟基的烷基化合物。

在用于本文时，术语“水解”指酶促催化由脂质至水分子OH基团的酰基转移。由水解引起的酰基转移需要分离水分子。

术语“半乳糖脂水解活性”在用于本文时指酶通过将酰基由半乳糖脂转移给水分子OH基团而催化半乳糖脂水解的能力。

类似的，术语“磷脂水解活性”在用于本文时指酶通过将酰基由磷脂转移给水分子OH基团而催化磷脂水解的能力。

术语“半乳糖脂转移酶活性与半乳糖脂水解活性比率”在用于本文时指与亲本酶相比酶变体能够以比半乳糖脂水解更高的比率催化半乳糖脂转移。这可能意味着半乳糖脂转移酶活性和半乳糖水解活性二者都比亲本酶升高，或是与亲本酶相比半乳糖脂转移酶活性升高而半乳糖脂水解活性降低。两种活性之间的最终关系才是重要的。

术语“游离脂肪酸没有增加或基本没有增加”在用于本文时指优选的是依照本发明的脂酰基转移酶具有100％转移酶活性（即100％将酰基由酰基供体转移至酰基受体，而没有水解活性）；然而，酶可能将脂质酰基供体中存在的少于100％的酰基转移给酰基受体。在这种情况中优选的是，酰基转移酶活性占到酶总活性的至少5％、更优选至少10％、更优选至少20％、更优选至少30％、更优选至少40％、更优选至少50％、更优选至少60％、更优选至少70％、更优选至少80％、更优选至少90％、且更优选至少98％。可以通过如下方案测定％转移酶活性（即转移酶活性占酶总活性的百分率）：

用于测定％酰基转移酶活性的方案

可以在与CHCl₃:CH₃OH的酶促反应后，对添加了依照本发明的脂酰基转移酶的食品进行萃取，并分离含有脂质物质的有机相，通过依照下文详述流程的GLC进行分析。根据GLC分析（以及HPLC分析，如果必要的话），测定游离脂肪酸和一种或多种固醇/stanol酯；碳水化合物酯、蛋白质酯；甘油二酯；或甘油一酯的数量。以相同方式对没有添加依照本发明的酶的对照食品进行分析。

计算：

根据GLC（以及任选的HPLC分析）的结果，可以计算游离脂肪酸和固醇/stanol酯和/或碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或甘油二酯和/或甘油一酯的增量：

Δ％脂肪酸=％脂肪酸（酶）-％脂肪酸（对照）；

Mv脂肪酸=脂肪酸的平均分子量；

A=Δ％固醇酯/Mv固醇酯（其中Δ％固醇酯=％固醇/stanol酯（酶）-％固醇/stanol酯（对照），而Mv固醇酯=固醇/stanol酯的平均分子量）－当酰基受体是固醇和/或stanol时适用；

B=Δ％碳水化合物酯/Mv碳水化合物酯（其中Δ％碳水化合物酯=％碳水化合物酯（酶）-％碳水化合物酯（对照），而Mv碳水化合物酯=碳水化合物酯的平均分子量）－当酰基受体是碳水化合物时适用；

C=Δ％蛋白质酯/Mv蛋白质酯（其中Δ％蛋白质酯=％蛋白质酯（酶）-％蛋白质酯（对照），而Mv蛋白质酯=蛋白质酯的平均分子量）－当酰基受体是蛋白质时适用；

D=甘油二酯和/或甘油一酯的绝对值/Mv甘油二/一酯（其中Δ％甘油二酯和/或甘油一酯=％甘油二酯和/或甘油一酯（酶）-％甘油二酯和/或甘油一酯（对照），而Mv甘油二/一酯=甘油二酯和/或甘油一酯的平均分子量）－当酰基受体是甘油时适用。

以总酶活性的百分率的形式来计算转移酶活性：

*－根据需要删除。

下表列出了属于术语“非极性”、“极性-不带电荷”、“极性-带电荷）的氨基酸，以及属于术语“脂肪族”和“芳香族”的氨基酸。术语“极性”指“极性-不带电荷”和“极性-带电荷”两类氨基酸。

GLC分析

配备了WCOT熔融石英柱12.5m x 0.25mm ID x 0.1μ膜厚度5％苯基-甲基-硅树脂（购自Chrompack的CP Sil 8 CB）的Perkin Elmer Autosystem 9000 Capillary GasChromatograph即毛细管气相层析自动系统

运载气体：氦

注射器：PSSI冷分流注射（初始温度50℃，加热至385℃），体积1.0μl

检测仪FID：395℃

样品制备：将30mg样品溶于9ml含有内部标准物十七烷（0.5mg/ml）的庚烷:Pyridin（2:1）。将300μl样品溶液转移到曲颈瓶(crimp vial)中，添加300μl MSTFA（N-methyl-N-trimethylsilyl-trifluoraceamid），并于60℃反应20分钟。

计算：由标准物2（甘油一/二/三酯）测定甘油一/二/三酯和游离脂肪酸的响应因子(response factor)，由纯的参比物质（称量10mg纯的物质）测定胆固醇、胆固醇棕榈酸酯和胆固醇硬脂酸酯的响应因子。

技术效果

本发明在蛋制品特别是蛋黄酱(mayonnaise)中可以提供下列意想不到的技术效果中的一项或多项：在巴氏杀菌过程中改进热稳定性；改进感官特性；改进稠度。

磷脂转移酶活性升高特别是磷脂与固醇和/或stanol诸如胆固醇之间的转移酶活性升高的酶变体在用于生产溶血磷脂和/或食用油的酶促脱胶和/或生产乳化特性和/或健康利益改进的蛋制品的方法中可能是特别有用的。

对于在酶促脱胶方法中的用途，优选对胆固醇的绝对磷脂转移酶活性升高的变体。

合适的是，本发明在蛋或蛋制品中可以提供下列意想不到的技术效果中的一项或多项：乳液稳定性改进；乳液的热稳定性改进；气味改进；臭味降低；增稠特性改进；稠度改进。

本发明在生面团和/或焙烤产品中可以提供下列意想不到的技术效果中的一项或多项：生面团或焙烤产品（例如面包和/或蛋糕）的比体积(specific volume)改进；生面团稳定性改进；面包皮得分改进(improved crust score)（例如面包皮更薄和/或更脆）；面包屑得分改进(improved crumb score)（例如面包屑分布更加均匀和/或结构更加精细和/或更加柔软）；外观改进（例如表面光滑，没有泡或洞，或者基本上没有泡或洞）；陈旧变慢；软度升高；气味改进；味道改进。

合适的是，本发明在食品中可以提供下列意想不到的技术效果中的一项或多项：外观改进；口感改进；稳定性改进，特别是热稳定性改进；味道改进；软度改进；弹性改进；乳化改进。

合适的是，本发明在乳制品诸如例如冰激凌中可以提供下列意想不到的技术效果中的一项或多项：口感改进（优选口感更像奶一样）；味道改进；融化改进。

下表列出了与在食品制作中使用本文定义的脂酰基转移酶有关的具体

技术效果：

合适的是，本发明在干酪中可以提供下列意想不到的技术效果中的一项或多项：干酪中的油失作用(oiling-off effect)减少；干酪产量升高；气味改进；臭味降低；“滑腻的”味道降低。

一方面，本发明部分基于通过使用脂酰基转移酶可以提高食品诸如干酪的产量的认识。另外/或者，还可以改进食品的气味、质地、氧化稳定性、和/或保存期。另外/或者，可以降低食品的胆固醇水平或提高植物甾醇/stanol酯的含量。

一方面，本发明可以提供含有本文定义的脂酰基转移酶的食品添加组合物。

另一方面，本发明可以提供含有本文定义的脂酰基转移酶的化妆品组合物。

另外，本发明可以提供本文定义的酰基转移酶用于生产化妆品组合物的。

优点

与亲本酶相比，本发明的转移酶变体具有下列有利特性中的一项或多项：

1)对极性脂质的活性升高和/或与甘油三脂相比对极性脂质的活性升高；

2)对半乳糖脂（糖脂）的活性升高，诸如二半乳糖基甘油二酯（DGDG）和/或单半乳糖基甘油二酯（MGDG）中的一种或多种；

3)对半乳糖脂（糖脂）的活性与磷脂和/或甘油三脂的活性之比率升高。

优选的是，本发明的转移酶变体对二半乳糖基甘油二酯（DGDG）和/或单半乳糖基甘油二酯（MGDG）的活性升高。

优选的是，本发明的转移酶变体对DGDG和/或MGDG的活性升高而对DGMG和/或MGMG的活性降低。

本发明的转移酶变体对甘油三脂的活性也可升高。

本发明的转移酶变体对磷脂（诸如卵磷脂，包括磷脂酰胆碱）的活性也可升高。

本发明的转移酶变体对甘油三脂和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性可降低。

术语极性脂质指通常在生面团中发现的极性脂质，优选半乳糖脂和磷脂。

在用于制作生面团或焙烤产品时，本发明的转移酶变体在生面团和/或焙烤产品中可能导致下列意想不到的技术效果中的一项或多项：生面团或焙烤产品（例如面包和/或蛋糕）的比体积改进；生面团稳定性改进；面包皮得分改进（例如面包皮更薄和/或更脆）；面包屑得分改进（例如面包屑分布更加均匀和/或结构更加精细和/或更加柔软）；外观改进（例如表面光滑，没有泡或洞，或者基本上没有泡或洞）；陈旧变慢；软度升高；气味改进；味道改进。

分离的

一方面，优选的是，本发明所使用的多肽或蛋白质是分离形式的。术语“分离的”指序列至少基本上不含至少一种序列在自然界中天然与之相连且在自然界中发现天然与之相连的其它成分。

纯化的

一方面，优选的是，本发明所使用的多肽或蛋白质是纯化形式的。术语“纯化的”指序列处于相对较纯的状态－例如至少约51％纯、或至少约75％纯、或至少约80％纯、或至少约90％纯、或至少约95％纯、或至少约98％纯。

克隆编码依照本发明的多肽的核苷酸序列

可以由生成具有本文定义的具体特性之多肽或适于更改之多肽的任何细胞或生物体分离编码所述多肽的核苷酸序列。本领域众所周知用于分离核苷酸序列的多种方法。

例如，可以使用来自生成多肽的生物体的染色体DNA或信使RNA来构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果多肽的氨基酸序列是已知的，那么可以合成经标记寡核苷酸探针并用于由自生物体制备的基因组文库鉴定编码多肽的克隆。或者，可以将含有与另一种已知多肽基因同源的序列的经标记寡核苷酸探针用于鉴定编码多肽的克隆。在后一种情况中，使用较低严谨度的杂交和清洗条件。

或者，可以如下鉴定编码多肽的克隆：将基因组DNA片段插入表达载体（诸如质粒），用由此得到的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将经转化细菌涂布在含有受多肽抑制的酶的琼脂上，从而容许表达多肽的克隆得到鉴定。

又或者，可以通过已经建立的标准方法通过人工合成来制备编码多肽的核苷酸序列，例如Beucage S.L.等人，1981，Tetrahedron Letters22：1859-1869描述的磷脒(phosphoroamidite)法或Matthes等人，1984，EMBO J.3：801-805描述的方法。在磷脒法中，对寡核苷酸进行合成（例如在自动化DNA合成仪中）、纯化、退火、连接、并克隆到合适的载体中。

核苷酸序列可以是混合的基因组与合成来源、混合的合成与cDNA来源、或混合的基因组与cDNA来源，它们是依照标准技术通过连接合成的、基因组的、或cDNA来源（根据需要）的片段而得到的。每一个连接片段对应于完整核苷酸序列的各个部分。还可以使用特异引物通过聚合酶链式反应（PCR）来制备DNA序列，例如US4,683,202或Saiki P K等人，Science1988，239：487-491所述。

核苷酸序列

本发明还涵盖编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列。术语“核苷酸序列”在用于本文时指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变体、同系物、片段、和衍生物（诸如它的一部分）。核苷酸序列可以是基因组、合成、或重组来源的，可以是双链，或是代表有义链或反义链的单链。

术语“核苷酸序列”在涉及本发明时包括基因组DNA、cDNA、合成DNA、和RNA。优选的是，它指DNA，更优选编码序列的cDNA。

在一个优选的实施方案中，当本身编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列在其天然环境中与其同样处于天然环境的天然相关序列相连时，本发明不覆盖这样的天然核苷酸序列。为了便于提及，我们将此优选实施方案称为“非天然核苷酸序列”。在这个方面，术语“天然核苷酸序列”指处于其天然环境且与其同样处于天然环境的天然相关完整启动子可操作连接时的完整核苷酸序列。由此，可以通过核苷酸序列在其天然生物体中表达本发明的多肽，但是其中核苷酸序列没有处在生物体内其天然相关启动子的控制之下。

优选的是，多肽不是天然多肽。在这个方面，术语“天然多肽”指处于其天然环境且通过其天然核苷酸序列表达时的完整多肽。

通常，使用重组DNA技术来制备编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列（即重组DNA）。然而，在本发明的一个备选实施方案中，可以使用本领域众所周知的化学法合成整个或部分核苷酸序列（见CaruthersMH等人，1980，Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等人，1980，NucAcids Res Symp Ser225-232）。

分子进化

一旦分离得到编码酶的核苷酸序列，或者鉴定得出编码酶的推定核苷酸序列，可能希望更改选择的核苷酸序列，例如可能希望对序列进行突变，从而制备依照本发明的酶。

可以使用合成寡核苷酸导入突变。这些寡核苷酸含有期望突变位点侧翼的核苷酸序列。

Morinaga等人，Biotechnology，1984，2：646-649公开了一种合适的方法。Nelson和Long，Analytical Biochemistry，1989，180：147-151描述了将突变导入编码酶的核苷酸序列的另一种方法。

除了定点诱变（诸如上文所述）以外，可以随机导入突变，例如使用商品化试剂盒，诸如购自Stratagene的GeneMorph PCR诱变试剂盒或购自Clontech的Diversify PCR随机诱变试剂盒。EP0583265涉及优化基于PCR的诱变的方法，它也可以联合使用诱变性DNA类似物，诸如EP0866796所述。错误倾向PCR技术适于生成具有优选特征的脂酰基转移酶变体。WO02/06457涉及脂肪酶的分子进化。

获取新序列的第三种方法是使用任何数目的限制酶或诸如DNA酶I等酶将不同的核苷酸序列片段化，并重新装配成编码功能性蛋白质的全长核苷酸序列。或者，可以使用一种或多种不同的核苷酸序列，并在重新装配全长核苷酸序列的过程中导入突变。DNA改组和家族改组技术适于生成具有优选特征的脂酰基转移酶变体。适于进行“改组”的方法见EP0752008、EP1138763、EP1103606。改组还可以联合其它DNA诱变形式，正如US6,180,406和WO01/34835中所述。

由此，有可能在体内或在体外在核苷酸序列中生成大量的定点或随机诱变，并随后通过多种手段对编码的多肽筛选改进的功能。可以使用例如insilico和exo介导的重组方法（见WO00/58517、US6,344,328、US6,361,974）来进行分子进化，其中所生成的变体保留与已知酶或蛋白质的很低同源性。由此获得的这些变体可能具有与已知转移酶的显著结构类似性，但是它们具有很低的氨基酸序列同源性。

上述和类似分子进化方法的应用容许在没有关于蛋白质结构或功能的任何现有知识的条件下鉴定和选择具有优选特征的本发明酶变体，且容许生成不可预测的但有利的突变或变体。分子进化在本领域中用于优化或改变酶活性的应用有许多例子，包括但不限于下列中的一项或多项：优化在宿主细胞或在体外的表达和/或活性、提高酶活性、改变底物和/或产物特异性、提高或降低酶或结构稳定性、改变在优选环境条件（例如温度、pH、底物）中的酶活性/特异性。

正如本领域技术人员清楚知道的，使用分子进化工具，可以改变酶，从而改进酶的功能。

合适的是，本发明所使用的脂酰基转移酶可以是变体，即与亲本酶相比可以包含至少一处氨基酸替代、删除或添加。酶变体保留与亲本酶的至少25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97％、99％同源性。合适的亲本酶可以包括具有酯酶或脂肪酶活性的任何酶。优选的是，亲本酶对应于pfam00657共有序列。

在一个优选的实施方案中，脂酰基转移酶变体保留或掺入了至少一个或多个在GDSX、GANDY、和HPT模块中发现的pfam00657共有序列氨基酸残基。

可以使用分子进化工具对酶诸如在水性环境中具有或没有脂酰基转移酶活性的脂肪酶进行突变以导入或增强转移酶活性，由此生成适用于本发明组合物和方法的具有显著转移酶活性的脂酰基转移酶。

合适的是，本发明所使用的脂酰基转移酶可以是对极性脂质（优选磷脂和/或糖脂）的酶活性比亲本酶升高的变体。优选的是，这些变体没有或还具有对溶血极性脂质的低活性。对极性脂质、磷脂、和/或糖脂的活性升高可以是水解活性和/或转移酶活性或二者组合的结果。

本发明所使用的脂酰基转移酶变体对甘油三脂、和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性可比亲本酶降低。

合适的是，酶变体可没有对甘油三脂和/或甘油一酯和/或甘油二酯的活性。

或者，本发明所使用的酶变体对甘油三脂的活性可升高，和/或对下列中的一种或多种的活性也升高：极性脂质、磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱、糖脂、二半乳糖基甘油一酯、单半乳糖基甘油一酯。

脂酰基转移酶变体是已知的，而且这些变体中的一种或多种可适用于依照本发明的方法和用途和/或依照本发明的酶组合物。仅作为范例，下列参考文献中描述的脂酰基转移酶变体可以依照本发明使用：Hilton和Buckley，J Biol.Chem.1991年1月15日，266(2)：997-1000；Robertson等人，J.Biol.Chem.1994年1月21日，269(3)：2146-50；Brumlik等人，J.Bacteriol1996年4月，178(7)：2060-4；Peelman等人，Protein Sci.1998年3月，7(3)：587-99。

氨基酸序列

本发明还涵盖具有本文定义的具体特性之多肽的氨基酸序列。

在用于本文时，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在有些情况中，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。

可以由合适的来源制备/分离氨基酸序列，或者可以人工合成，或是可以使用重组DNA技术来制备。

合适的是，可以通过标准技术由本文讲授的分离多肽获得氨基酸序列。

用于由分离多肽测定氨基酸序列的一种合适方法如下：

可以将纯化的多肽冷冻-干燥，并且可以将100μg冷冻-干燥的材料溶于50μl8M尿素与0.4M碳酸氢铵的混合液pH8.4。可以使溶解的蛋白质于50℃变性并还原15分钟，随后覆盖氮并添加5μl45mM二硫苏糖醇。冷却至室温后，可以添加5μl100mM碘乙酰胺，使得半胱氨酸残基于室温在黑暗中在氮中衍生15分钟。

可以向上述反应混合液中添加135μl水和溶于5μl水的5μg内切蛋白酶Lys-C，并于37℃在氮中消化24小时。

可以通过反相HPLC在VYDAC C18柱（0.46x14cm；10μl；The Separation Group，California，USA）上分离由此产生的肽，使用溶剂A：0.1％溶于水的TFA和溶剂B：0.1％溶于乙腈的TFA。在N端测序前，可以将选择的肽在Develosil C18柱上使用相同的溶剂系统再次进行层析。可以使用Applied Biosystems476A测序仪依照制造商的指示（AppliedBiosystems，California，USA）使用脉冲液相快速循环进行测序。

序列同一性或序列同源性

本发明还涵盖与具有本文定义的具体特性之多肽的氨基酸序列或编码这种多肽的任何核苷酸序列具有一定程度序列同一性或序列同源性的序列（下文称为“同源序列”）的用途。在本文中，术语“同源”指某一实体与主题氨基酸序列和主题核苷酸序列具有一定同源性。在本文中，术语“同源性”可以等同于“同一性”。

同源氨基酸序列和/或核苷酸序列应当提供和/或编码保留酶的功能活性和/或提高酶活性的多肽。

在本文中，认为同源序列包括与主题序列可以是至少75、85、或90％相同、优选至少95或98％相同的氨基酸序列。通常，同系物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管同源性也可以看成是相似性（即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基），在本发明的内容中优选将同源性表述成序列同一性。

在本文中，认为同源序列包括与编码本发明多肽的核苷酸序列（主题序列）可以是至少75、85、或90％相同、优选至少95或98％相同的核苷酸序列。通常，同系物将包含与主题序列相同的编码活性位点的序列等。尽管同源性也可以看成是相似性（即具有相似化学特性/功能的氨基酸残基），在本发明的内容中优选将同源性表述成序列同一性。

可以目测进行同源性比较，或者更常用的是借助易于获得的序列比较程序。这些商业性计算机程序能够计算两种或多种序列之间的％同源性。

可以对毗邻序列计算％同源性，即将一种序列与其它序列进行对比，并将一种序列中的每一个氨基酸与其它序列中的相应氨基酸直接进行比较，每次一个残基。这称为“无缺口”对比。通常，只对较短数目的残基进行这种无缺口对比。

尽管这是一种非常简单且可靠的方法，然而它未能考虑例如在其它方面相同的成对序列中一个插入或删除将引起后面的氨基酸残基无法进行对比，由此可能导致在进行整体对比时％同源性大大降低。因此，大多数序列比较方法设计成在考虑到可能的插入和删除的情况下生成最佳对比，不过度处罚整体同源性得分。这是通过在序列对比中插入“缺口”以设法使局部同源性最大化而实现的。

然而，这些更加复杂的方法给对比中发生的每个缺口赋予“缺口罚分”，使得对于相同数目的相同氨基酸而言，具有尽可能少的缺口的序列对比（反应了两种比较序列之间的较高相关性）将获得比具有更多缺口的其它序列对比更高的得分。通常使用“仿射缺口代价(Affine gap costs)”，即对缺口的存在处以较高代价，而对缺口中的每一个后续残基处以较小罚分。这是最常用的缺口评分系统。高缺口罚分当然将以较少缺口生成优化对比。大多数对比程序容许更改缺口罚分。然而，在使用这种软件进行序列比较时，优选使用缺省值(default value)。例如在使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的缺省缺口罚分(default gappenalty)是缺口-12且每个延伸为-4。

因此，最大％同源性的计算首先需要生成最佳对比，其中要考虑缺口罚分。适用于进行这种对比的一种计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包（Devereux等人，1984，Nuc.Acids Research，12：387）。可以进行序列比较的其它软件的实例包括但不限于BLAST软件包（见Ausubel等人，1999，Short Protocols in Molecular Biology，第4版，第18章）、FASTA（Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.403-410）、和GENEWORKS比较工具套。BLAST和FASTA都能进行离线和在线搜索（见Ausubel等人，1999，7.58-7.60）。然而，对于有些应用，优选使用GCG Bestfit程序。还可以使用称为BLAST2Sequences的一种新工具来比较蛋白质和核苷酸序列（见FEMS Microbiol Lett1999，174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett1999，177(1)：187-8，及tatiana＠ncbi.nlm.nih.gov）。

尽管最终的％同源性可以根据同一性进行测量，然而对比过程自身通常不是基于“全是或全非”成对比较。而是，通常使用尺度相似性评分矩阵根据化学相似性或进化距离给每对比较赋予得分。常用的这种矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵－BLAST程序套的缺省矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公开的缺省值或定制的符号比较表（如果提供的话）（进一步的细节见用户手册）。对于有些应用，优选使用GCG软件包的公开缺省值，或者在其它软件的情况中，使用缺省矩阵，诸如BLOSUM62。

或者，可以使用以与CLUSTAL（Higgins DG和Sharp PM，1988，Gene73(1)：237-244）类似的算法为基础的DNASIS^TM（Hitachi Software）中的多重对比特征来计算％同源性。

一旦软件生成了最佳对比，就有可能计算％同源性，优选％序列同一性。软件通常作为序列比较的一部分来执行它，并生成一个数值结果。

序列还可以具有生成沉默改变并导致功能等同物的氨基酸残基删除、插入、或替代。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或两亲性本质进行审慎的氨基酸替代，只要保留物质的次要结合活性。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；而具有不带电荷的极性头基团（具有相似亲水值）的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、和酪氨酸。

可以进行保守替代，例如依照下表。第二列同一块中、优选第三列同一行中的氨基酸可以互相替代。

本发明还涵盖可以发生的同源替代（替代和替换在本文中都用于指用备选氨基酸交换现有氨基酸），即相似替代，诸如碱性替代碱性、酸性替代酸性、极性替代极性等。也可以发生非同源替代，即由一类残基变成另一类，或者牵涉非天然氨基酸，诸如鸟氨酸（下文称为Z）、二氨基丁酸鸟氨酸（下文称为B）、正亮氨酸鸟氨酸（下文称为O）、吡啶丙氨酸(pyriylalanine)、噻吩丙氨酸、萘丙氨酸、和苯甘氨酸。

还可以用非天然氨基酸进行替换。

氨基酸序列变体可以包含合适的间隔基团，它可以插入序列的任何两个氨基酸残基之间，除了氨基酸间隔物诸如甘氨酸或β-丙氨酸残基以外，还包括烷基，诸如甲基、乙基、或丙基。变异的另一种形式牵涉类肽（peptoid）形式的一个或多个氨基酸残基的存在，这是本领域技术人员充分理解的。为了避免疑惑，“类肽形式”用于指氨基酸残基变体，其中α-碳取代基位于残基的氮原子上而非α-碳原子。用于制备类肽形式的肽的方法在本领域是已知的，例如Simon RJ等人，PNAS，1992，89(20)：9367-9371；以及Horwell DC，TrendsBiotechnol.1995，13(4)：132-134。

本发明所使用的或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列可以在其中包含合成的或修饰的核苷酸。本领域知道许多对寡核苷酸的不同类型修饰。这些修饰包括甲基膦酸酯（methylphosphonate）和硫代磷酸酯（phosphorothioate）主链和/或在分子的3'和/或5'端添加吖啶或多赖氨酸链。出于本发明的目的，应当理解可以通过本领域可利用的任何方法修饰本文所述核苷酸序列。可以为了增强核苷酸序列的体内活性或寿命而进行这些修饰。

本发明还涵盖与本文所述序列或其任何衍生物、片段、或衍生物互补的核苷酸序列的用途。如果序列与其片段互补，那么该序列可用作探针，用于在其它生物体中鉴定相似编码序列等。

可以以多种方式获得与本发明序列不是100％同源但属于本发明范围的多核苷酸。可以通过例如探查由一群个体例如来自不同人群的个体制备的DNA文库来获得本文所述序列的其它变体。另外，可以获得其它病毒/细菌或细胞同系物，特别是在哺乳动物细胞（例如大鼠、小鼠、牛、和灵长类细胞）中发现的细胞同系物，而且这些同系物及其片段一般能够与本文序列表中所示序列发生选择性杂交。可以通过由其它动物物种制备cDNA文库或基因组DNA文库并在中等至高严谨度条件下用包含所附序列表中任一种序列的完整或部分序列的探针探查这些文库来获得这些序列。类似考虑应用于获得本发明多肽或核苷酸序列的物种同系物和等位基因变体。

还可以使用简并PCR获得变体和株系/物种同系物，其中所用引物的序列设计成靶向变体和同系物中编码本发明序列中的保守氨基酸序列的序列。可以通过例如对比来自几个变体/同系物的氨基酸序列来预测保守序列。可以使用本领域已知的计算机软件来进行序列对比。例如广泛使用GCGWisconsin PileUp程序。

简并PCR所使用的引物将包含一个或多个简并位置，而且将用于比用针对已知序列的单一序列引物克隆序列时更低的严谨条件。

或者，可以通过已鉴定序列的定点诱变来获得这些多核苷酸。这在例如为了多核苷酸序列将要在其中表达的特定宿主细胞而需要沉默密码子序列改变来优化密码子偏爱性时可能是有用的。为了导入限制性多肽识别位点或改变由多核苷酸编码的多肽的特性或功能，可能还需要其它序列改变。

本发明的多核苷酸（核苷酸序列）可用于生成引物，例如PCR引物，用于进行备选扩增反应的引物，探针，例如使用放射性或非放射性标记物通过常规方法用显现标记物标记的探针，或者可以将多核苷酸克隆到载体中。这些引物、探针、和其它片段的长度将是至少15个、优选至少20个、例如至少25个、30个、或40个核苷酸，而且同样由本文所使用的本发明术语多核苷酸所涵盖。

可以重组、合成、或通过本领域技术人员可利用的任何手段来生成依照本发明的多核苷酸，诸如DNA多核苷酸和探针。还可以通过标准技术对它们进行克隆。

一般而言，将通过合成手段来生成引物，牵涉逐步制造期望的核酸序列，每次一个核苷酸。使用自动化技术实现这一目的的技术在本领域是易于获得的。

通常使用重组方法例如PCR（聚合酶链式反应）克隆技术来生成较长的多核苷酸。这将牵涉制造期望克隆的脂质靶向序列区域侧翼的一对引物（例如约15至30个核苷酸），使引物与由动物或人类细胞获得的mRNA或cDNA接触，在扩增期望区域的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增的片段（例如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合液），并回收扩增的DNA。引物可以设计成包含合适的限制酶识别位点，从而能够将扩增的DNA克隆到合适的克隆载体中。

杂交

本发明还涵盖与本发明的序列互补的序列或是能够与本发明的序列或其互补序列发生杂交的序列。

术语“杂交”在用于本文时应当包括“一条核酸链与一条互补链通过碱基配对而结合的过程”，以及在聚合酶链式反应（PCR）技术中进行的扩增过程。

本发明还涵盖能够与本文讨论的主题序列或其任何衍生物、片段、或衍生物的互补序列发生杂交的核苷酸序列的用途。

本发明还涵盖能够与本文讨论的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列。

杂交条件是以核苷酸结合复合物的溶化温度（Tm）为基础的，正如Berger和Kimmel（1987，Guide to Molecular Cloning Techniques，Methods inEnzymology，Vol.152，Academic Press，San Diego，CA）中讲授的，而且赋予限定的“严谨度”，正如下文所解释的。

最高严谨度通常发生于约Tm-5℃（比探针的Tm低5℃）；高严谨度发生于比Tm低约5℃至10℃；中等严谨度发生于比Tm低约10℃至20℃；而低严谨度发生于比Tm低约20℃至25℃。正如本领域技术人员将理解的，最高严谨度的杂交可用于鉴定或检测相同核苷酸序列，而中等（或低）严谨度的杂交可用于鉴定或检测相似或相关多核苷酸序列。

优选的是，本发明涵盖能够在高严谨度条件或中等严谨度条件下与编码多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列，所述多肽具有本文定义的具体特性。

更优选的是，本发明涵盖能够在高严谨度条件（例如65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15MNaCl、0.015M柠檬酸钠pH7.0}）下与编码多肽的核苷酸序列发生杂交的序列的互补序列，所述多肽具有本文定义的具体特性。

本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列（包括本文讨论的那些序列的互补序列）发生杂交的核苷酸序列。

本发明还涉及能够与本文讨论的核苷酸序列（包括本文讨论的那些序列的互补序列）发生杂交的序列的互补核苷酸序列。

本发明的范围还包括能够在中等至最高严谨度条件下与本文讨论的核苷酸序列发生杂交的多核苷酸序列。

在一个优选的方面，本发明覆盖能够在严谨条件（例如50℃和0.2xSSC）下与本文讨论的核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。

在一个更优选的方面，本发明覆盖能够在高严谨条件（例如65℃和0.1xSSC）下与本文讨论的核苷酸序列或其互补序列发生杂交的核苷酸序列。

多肽的表达

可以将本发明所使用的或用于编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列掺入重组复制载体。载体可用于在相容宿主细胞中和/或由相容宿主细胞复制和表达所述核苷酸序列（以多肽的形式）。可以使用控制序列来控制表达，包括启动子/增强子和其它表达调控信号。可以使用原核启动子和在真核细胞中发挥功能的启动子。可以使用组织特异的或刺激特异的启动子。还可以使用嵌合启动子，它包括来自两种或更多上文所述不同启动子的序列元件。

根据使用的序列和/或载体，由宿主重组细胞通过表达核苷酸序列而生成的多肽可以是分泌的，或者是包含在细胞内的。编码序列可以设计成含有信号序列，它指导实质编码序列分泌穿过特定原核或真核细胞膜。

表达载体

术语“表达载体”指能够在体内或在体外进行表达的构建物。

优选的是，将表达载体掺入生物体的基因组。术语“掺入”优选覆盖稳定的掺入基因组。

本发明的或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列可以存在于载体中，其中核苷酸序列可操作连接调控序列，使得调控序列能够通过合适的宿主生物体提供核苷酸序列的表达，即载体是表达载体。

可以如下文所述将本发明的载体转化到合适的宿主细胞中，从而提供具有本文定义的具体特性之多肽的表达。

载体的选择常常取决于它将要导入的宿主细胞，例如质粒、粘粒、病毒、或噬菌体载体。

载体可以含有一种或多种选择标记基因，诸如赋予抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、或四环素抗性。或者，可以通过共转化来进行选择（如WO91/17243中所述）。

可以在体外使用载体，例如用于生成RNA或用于转染或转化宿主细胞。

由此，在另一个实施方案中，通过将核苷酸序列导入复制载体，将载体导入相容宿主细胞，并在促使载体复制的条件下培养宿主细胞，本发明提供了制备本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列的方法。

载体还可以包含使得载体能够在所讨论宿主细胞中进行复制的核苷酸序列。这些序列的实例有质粒pUC19、pACYC177、pUB110、pE194、pAMB1、和pIJ702的复制起点。

调控序列

在有些应用中，本发明所使用的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列可以可操作连接调控序列，它能够通过诸如选择的宿主细胞提供核苷酸序列的表达。例如，本发明覆盖包含本发明核苷酸序列且其与这种调控序列可操作连接的载体，即载体是表达载体。

术语“可操作连接”指位置毗邻，其中所述组件的相互关系容许它们以其计划方式发挥功能。与编码序列可操作连接的调控序列的连接方式使得能够在与控制序列相容的条件下实现编码序列的表达。

术语“调控序列”包括启动子和增强子和其它表达调控信号。

术语“启动子”采用本领域常用含义，例如RNA聚合酶结合位点。

还可以选择异源调控区，例如启动子、分泌前导序列、和终止子区，从而实现编码具有本文定义的具体特性之酶的核苷酸序列的表达提高。

优选的是，本发明的核苷酸序列可以可操作连接至少一个启动子。

适于指导核苷酸序列在细菌、真菌、或酵母宿主中转录的启动子的实例在本领域是众所周知的。

构建物

术语“构建物”（与诸如“偶联物”、“盒”、和“杂合物”等术语同义）包含依照本发明使用的编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列且其直接或间接与启动子相连。间接相连的实例在本发明的启动子和核苷酸序列之间提供合适的间隔区，诸如内含子序列，诸如Sh1内含子或ADH内含子。术语“融合”在本发明中也是如此，包括直接或间接相连。在有些情况中，该术语不覆盖编码通常与野生型基因启动子相连的蛋白质之核苷酸序列的天然组合，以及当它们都处于其天然环境中时。

构建物甚至可以包含或表达容许选择基因构建物的标记。

对于有些应用，优选的是，构建物包含至少一种本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列且其可操作连接启动子。

宿主细胞

术语“宿主细胞”在涉及本发明时包括包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列或上文所述表达载体且用于重组生产具有本文定义的具体特性之多肽的任何细胞。

由此，本发明的另一个实施方案提供了经本发明的核苷酸序列或表达具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。将要选择与所述载体相容的细胞，可以是例如原核（例如细菌）、真菌、酵母、或植物细胞。优选的是，宿主细胞不是人类细胞。

合适的细菌宿主生物体的实例有革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。

根据编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列的本质和/或进一步加工所表达蛋白质的愿望，真核宿主可能是优选的，诸如酵母或其它真菌。一般而言，酵母细胞比真菌细胞更加优选，因为它们易于操作。然而，有些蛋白质或是难以由酵母细胞分泌，或是在有些情况中难以正确加工（例如在酵母中过度糖基化）。在这些情况中，应当选择不同的真菌宿主生物体。

使用合适的宿主细胞，诸如酵母、真菌、和植物宿主细胞，可以提供翻译后修饰（例如肉豆蔻酰化、糖基化、截短、lapidation、以及酪氨酸、丝氨酸、或苏氨酸磷酸化），这可能是赋予本发明重组表达产物以最佳生物学活性所需要的。

宿主细胞可以是蛋白酶缺陷的或蛋白酶减除的菌株。

生物体

术语“生物体”在涉及本发明时包括能够包含依照本发明的核苷酸序列或编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物的任何生物体。

合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母、或植物。

术语“转基因生物体”在涉及本发明时包括包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列和/或由其获得的产物和/或其中启动子能够容许编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列在生物体内表达的任何生物体。优选的是，将核苷酸序列掺入生物体的基因组。

术语“转基因生物体”不覆盖处于其天然环境中的天然核苷酸编码序列，此时它们处于其天然启动子的控制之下，而后者同样处于其天然环境中。

因此，本发明的转基因生物体包括包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列、本文定义的构建物、本文定义的载体、本文定义的质粒、本文定义的细胞、或其产物中的任何一种或组合的生物体。例如，转基因生物体还可以包含编码具有本文定义的具体特性之多肽的核苷酸序列且其处于异源启动子的控制之下。

宿主细胞/生物体的转化

如上所述，宿主生物体可以是原核或真核生物体。合适的原核宿主的实例包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。

关于原核宿主转化的讲授在本领域有很好的记录，例如见Sambrook等人（Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，1989，Cold Spring HarborLaboratory Press）。如果使用原核宿主，那么核苷酸序列可能需要在转化前进行合适的修改，诸如清除内含子。

在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。

可以使用本领域知道的多种方法转化丝状真菌细胞，诸如包括以已知方式形成原生质体，转化原生质体，随后再生细胞壁的过程。EP0238023描述了使用曲霉作为宿主微生物体。

另一种宿主生物体可以是植物。关于转化植物的一般技术的综述见Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol1991，42：205-225）和Christou（Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27）的论文。关于植物转化的其它讲授见EP-A-0449375。

下面的部分介绍了关于转化真菌、酵母、和植物的一般教导。

经转化的细菌

宿主生物体可以是细菌，诸如链霉菌、枯草芽孢杆菌、或大肠杆菌。WO04/064537中公开了适于在大肠杆菌中进行异源表达的方法。WO02/214490中公开了适于在芽孢杆菌中进行异源表达的方法。合适的细菌宿主生物体的实例是革兰氏阳性细菌物种，诸如芽孢杆菌科（Bacillaceae），包括枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（Bacilluslicheniformis）、迟缓芽孢杆菌（Bacillus lentus）、短芽孢杆菌（Bacillus brevis）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）、嗜碱芽孢杆菌（Bacillusalkalophilus）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、灿烂芽孢杆菌（Bacillus lautus）、巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）、和苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）；链霉菌属物种，诸如鼠灰链霉菌（Streptomycesmurinus）；乳酸菌物种，包括乳球菌属（Lactococcus）诸如乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）、乳杆菌属（Lactobacillus）包括路氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri）；明串珠菌属（Leuconostoc）；片球菌属（Pediococcus）；和链球菌属（Streptococcus）。或者，可以选择属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）包括大肠杆菌或假单胞菌科（Pseudomonadaceae）的革兰氏阴性细菌物种的菌株作为宿主生物体。

经转化的真菌

宿主生物体可以是真菌，诸如丝状真菌。合适的这种宿主的实例包括属于Thermomyces属、支顶孢属（Acremonium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、毛霉属（Mucor）、链孢霉属（Neurospora）、木霉属（Trichoderma）、诸如此类的任何成员。

讲授丝状真菌转化的综述见US-A-5741665，它声明用于转化丝状真菌和培养真菌的标准技术在本领域是众所周知的。关于应用于粗糙链孢霉（N.crassa）的技术的综述见例如Davis和de Serres，Methods Enzymol1971，17A：79-143。

关于转化丝状真菌的其它技术的综述见US-A-5674707。

在一个方面，宿主生物体可以是曲霉属的，诸如黑曲霉（Aspergillus niger）。

还可以通过遵循例如Martinelli S.D.、Kinghorn J.R.编的《Aspergillus:50years on.Progress in industrial microbiology》（vol29，Elsevier Amsterdam1944，p641-666）中Turner G（1944）著的“Vectors for genetic manipulation”的讲授来制备依照本发明的转基因曲霉。

关于丝状真菌中的基因表达的综述见Punt等人，2002，Trends Biotechnol 2002年5月，20(5)：200-6；Archer和Peberdy，Crit Rev Biotechnol1997，17(4)：273-306。

经转化的酵母

在另一个实施方案中，转基因生物体可以是酵母。

关于异源基因在酵母中表达的原理的综述见例如Methods Mol Biol 1995，49：341-54和Curr Opin Biotechnol1997年10月，8(5)：554-60。

在这个方面，可以使用酵母作为异源基因表达的载体，诸如啤酒糖酵母或巴斯德毕赤酵母氏酵母（见FEMS Microbiol Rev2000，24(1)：45-66）。

关于在啤酒糖酵母中表达异源基因和分泌基因产物的原理的综述见EHinchcliffe和E Kenny，1993，“Yease as a vehicle for the expression ofheterologous genes”，Yeast，Vol.5，Anthony H Rose和J Stuart Harrison编，第2版，Academic Press有限公司。

关于酵母的转化，已经开发了数种转化方案。例如，可以通过遵循Hinnen 等人，1978，Proceedings of the National Academy of Science of the USA，75：1929；Beggs,JD，1978，Nature，London，275：104；和Ito,I等人，1983，JBacteriology，153：163-168的讲授来制备依照本发明的转基因糖酵母。

可以使用多种选择标记来选择经过转化的酵母细胞，诸如营养缺陷标记和显性抗生素抗性标记。

可以由生物技术相关酵母物种选择合适的酵母宿主生物体，诸如但不限于选自毕赤氏酵母属（Pichia）、汉逊氏酵母属（Hansenula）、克鲁维氏酵母属（Kluyveromyces）、Yarrowinia、糖酵母属（Saccharomyces）（包括啤酒糖酵母S.cerevisiae）、或裂殖糖酵母属（Schizosaccharomyce）（包括粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyce pombe)）的酵母物种。

可以使用甲基营养酵母物种巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris）作为宿主生物体。

在一个实施方案中，宿主生物体可以是汉逊氏酵母属的物种，诸如多形汉逊氏酵母（H.polymorpha）（如WO01/39544中所述）。

经转化的植物/植物细胞

适于本发明的宿主生物体可以是植物。关于一般技术的综述可以见Potrykus（Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol1991，42：205-225）和Christou（Agro-Food-Industry Hi-Tech，1994年3月/4月，17-27）的论文或WO01/16308。例如，转基因植物可能以升高的水平生成植物甾醇酯和phytostanol酯。

因此，本发明还涉及用于生成植物甾醇酯和phytostanol酯水平升高的转基因植物的方法，包括用本文定义的脂酰基转移酶（特别是包含本文定义的脂酰基转移酶的表达载体或构建物）转化植物细胞并由经转化植物细胞培育植株的步骤。

分泌

通常希望表达宿主将多肽分泌到培养基中，由此可以更加容易地回收酶。依照本发明，可以根据期望的表达宿主来选择分泌前导序列。杂合信号序列也可用于本发明的内容。

异源分泌前导序列的典型实例有来自真菌淀粉葡糖苷酶（AG）基因（glaA－18和24个氨基酸的两种形式，例如来自曲霉属）、α-因子基因（酵母，例如糖酵母属、克鲁维氏酵母属、和汉逊氏酵母）、或α-淀粉酶基因（芽孢杆菌属）的分泌前导序列。

检测

本领域已知用于检测和测量氨基酸序列表达的多个方案。实例包括酶联免疫吸附测定法（ELISA）、放射免疫测定法（RIA）、和荧光激活细胞分拣术（FACS）。

本领域技术人员知道多种标记物和偶联技术，它们可用于多种核酸和氨基酸测定法。

许多公司，诸如Pharmacia Biotech（Piscataway，NJ）、Promega（Madison，WI）、和US Biochemical Corp（Cleveland，OH），供应这些流程的商品化试剂盒和方案。

合适的报道分子或标记物包括那些放射性核素、酶、荧光、化学发光、或显色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性粒子、诸如此类。讲授这些标记物的用途的专利包括US-A-3,817,837、US-A-3,850,752、US-A-3,939,350、US-A-3,996,345、US-A-4,277,437、US-A-4,275,149、和US-A-4,366,241。

同样，可以如US-A-4,816,567中所述生成重组免疫球蛋白。

融合蛋白

可以以融合蛋白的形式生成具有本文定义的具体特性的多肽，例如以便于它的提取和纯化。融合蛋白配偶体的实例包括谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、6xHis、GAL4（DNA结合和/或转录激活结构域）、和β-半乳糖苷酶。在融合蛋白配偶体与目的蛋白序列之间包含蛋白水解切割位点从而能够切除融合蛋白序列也是方便的。优选的是，融合蛋白将不会妨碍蛋白序列的活性。

关于大肠杆菌中的基因融合表达系统的综述见Curr.Opin.Biotechnol.1995，6(5)：501-6。

在本发明的另一个实施方案中，可以将具有本文定义的具体特性的多肽的氨基酸序列与异源序列相连，从而编码融合蛋白。例如，为了对肽库筛选能够影响实质活性的试剂，编码这样的嵌合物可能是有用的，即它表达受到商品化抗体识别的异源表位。

下面将参考附图和实施例描述本发明，仅作为范例。

附图描述

图1显示了来自第6版数据库的pfam00657共有序列（SEQ ID No.1）。

图2显示了由生物体嗜水气单胞菌获得的氨基酸序列（SEQ ID No.2）（P10480；GI:121051）。此氨基酸序列是可以作为依照本发明的亲本酶的参考酶。

图3显示了由生物体杀鲑气单胞菌获得的氨基酸序列（SEQ ID No.3）（AAG098404；GI:9964017）。

图4显示了由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列（SEQ ID No.4）（基因库编号：NP_631558）。

图5显示了由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的氨基酸序列（SEQ ID No.5）（基因库编号：CAC42140）。

图6显示了由生物体啤酒糖酵母获得的氨基酸序列（SEQ ID No.6）（基因库编号：P41734）。

图7显示了选定序列与pfam00657共有序列的对比。

图8显示了SEQ ID No.3与SEQ ID No.2的成对对比，显示93％的氨基酸序列同一性。信号序列标以下划线。+指示差异。标出了含有活性位点丝氨酸16的GDSX基序以及活性位点天冬氨酸116和组氨酸291（见阴影区）。氨基酸后的编号已减去信号序列。

图9显示了编码由生物体嗜水气单胞菌获得的依照本发明的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ ID No.7）。

图10显示了编码由生物体杀鲑气单胞菌获得的依照本发明的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ ID No.8）。

图11显示了编码由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的依照本发明的脂酰基转移酶（基因库编号NC_003888.1:8327480..8328367）的核苷酸序列（SEQ ID No.9）。

图12显示了编码由生物体天蓝色链霉菌A3(2)获得的依照本发明的脂酰基转移酶（基因库编号AL939131.1:265480..266367）的核苷酸序列（SEQ ID No.10）。

图13显示了编码由生物体啤酒糖酵母获得的依照本发明的脂酰基转移酶（基因库编号Z75034）的核苷酸序列（SEQ ID No.11）。

图14显示了由生物体雷尔氏菌获得的氨基酸序列（SEQ ID No.12）（基因库编号：AL646052）。

图15显示了编码由生物体雷尔氏菌获得的依照本发明的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ ID No.13）。

图16显示了氨基酸序列SEQ ID No.14。Scoe1NCBI蛋白质编号CAB39707.1GI:4539178保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。

图17显示了编码Scoe1NCBI蛋白质编号CAB39707.1GI:4539178保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.15。

图18显示了氨基酸序列SEQ ID No.16。Scoe2NCBI蛋白质编号CAC01477.1GI:9716139保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。

图19显示了编码Scoe2NCBI蛋白质编号CAC01477.1GI:9716139保守假定蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.17。

图20显示了氨基酸序列SEQ ID No.18。Scoe3NCBI蛋白质编号CAB88833.1GI:7635996推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。

图21显示了编码Scoe3NCBI蛋白质编号CAB88833.1GI:7635996推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.19。

图22显示了氨基酸序列SEQ ID No.20。Scoe4NCBI蛋白质编号CAB89450.1GI:7672261推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。

图23显示了编码Scoe4NCBI蛋白质编号CAB89450.1GI:7672261推定分泌蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.21。

图24显示了氨基酸序列SEQ ID No.22。Scoe5NCBI蛋白质编号CAB62724.1GI:6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]。

图25显示了编码Scoe5NCBI蛋白质编号CAB62724.1GI:6562793推定脂蛋白[天蓝色链霉菌A3(2)]的核苷酸序列SEQ ID No.23。

图26显示了氨基酸序列SEQ ID No.24。Srim1NCBI蛋白质编号AAK84028.1GI:15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]。

图27显示了编码Srim1NCBI蛋白质编号AAK84028.1GI:15082088GDSL-脂肪酶[龟裂链霉菌]的核苷酸序列SEQ ID No.25。

图28显示了氨基酸序列SEQ ID No.26－来自嗜水气单胞菌的脂酰基转移酶（ATCC＃7965）。

图29显示了编码来自嗜水气单胞菌的脂酰基转移酶（ATCC＃7965）的核苷酸序列SEQ ID No.27。

图30显示了来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种（Aeromonas salmonicidasubsp.Salmonicida）的脂酰基转移酶的氨基酸序列SEQ ID No.28（ATCC＃14174）。

图31显示了编码来自杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的脂酰基转移酶（ATCC＃14174）的核苷酸序列SEQ ID No.29。

图32显示了可以利用（美国）国家生物技术信息中心（NIH，MD，USA）的基本局部对比搜索工具服务和完整的基因组数据库来鉴定气单胞菌基因的同系物。在数据库搜索中使用GDSX基序，鉴定了可能编码具有脂肪分解活性的酶的许多序列/基因。鉴定了来自链霉菌属、黄单胞菌属、和雷尔氏菌属的基因。例如，将青枯病雷尔氏菌与杀鲑气单胞菌（satA）基因进行对比。成对对比显示23％同一性。活性位点丝氨酸位于氨基末端，而催化残基组氨酸和天冬氨酸能够鉴定。

图33显示了Pfam00657.11[00657家族，第11版数据库]共有序列（下文称为Pfam共有序列）及多种序列与Pfam共有序列的对比。箭头指示活性位点残基，下划线指示[Upton C和Buckley JT（1995）Trends Biochem Sci20:179-179]指出的三个同源盒。Pfam共有序列中的大写字母指示许多家族成员中的保守残基。-符号指示Pfam共有序列的隐藏Markov模型预计会发现插入残基但是并非如此，而是缺口的位置。.符号指示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。所示序列是图16、18、20、22、24、26、28、和30所示氨基酸序列。

图34显示了Pfam00657.11[00657家族，第11版数据库]共有序列（下文称为Pfam共有序列）及多种序列与Pfam共有序列的对比。箭头指示活性位点残基，下划线指示[Upton C和Buckley JT（1995）Trends Biochem Sci20:179-179]指出的三个同源盒。Pfam共有序列中的大写字母指示许多家族成员中的保守残基。-符号指示Pfam共有序列的隐藏Markov模型预计会发现插入残基但是并非如此，而是缺口的位置。.符号指示在Pfam共有序列中没有对应残基的残基。所示序列是图2、16、18、20、26、28、和30所示氨基酸序列。发现所有这些蛋白质对脂质底物都有活性。

图35显示了用于实施例7中的嗜水气单胞菌脂酰基转移酶基因诱变的融合构建物的氨基酸序列SEQ ID No.30。标有下划线的氨基酸是木聚糖酶信号肽。

图36显示了编码包含木聚糖酶信号肽、来自嗜水气单胞菌的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ ID No.31）。

图37显示了编码来自链霉菌的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ ID No.32）。

图38显示了来自链霉菌的脂酰基转移酶的多肽序列（SEQ ID No.33）。

图39显示了来自喜热裂孢菌属(Termobifida)的脂酰基转移酶的多肽序列（SEQID No.34）。

图40显示了编码来自喜热裂孢菌属的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ IDNo.35）。

图41显示了来自喜热裂孢菌属的脂酰基转移酶的多肽序列（SEQ ID No.36）。

图42显示了来自Corynebacterium efficens的脂酰基转移酶GDSx300aa的多肽序列（SEQ ID No.37）。

图43显示了编码来自Corynebacterium efficens的脂酰基转移酶GDSx300aa的核苷酸序列（SEQ ID No.38）。

图44显示了来自Novosphingobium aromaticivorans的脂酰基转移酶GDSx284aa的多肽序列（SEQ ID No.39）。

图45显示了编码来自Novosphingobium aromaticivorans的脂酰基转移酶GDSx284aa的核苷酸序列（SEQ ID No.40）。

图46显示了来自天蓝色链霉菌的脂酰基转移酶GDSx268aa的多肽序列（SEQ IDNo.41）。

图47显示了编码来自天蓝色链霉菌的脂酰基转移酶GDSx268aa的核苷酸序列（SEQID No.42）。

图48显示了来自除虫链霉菌（Streptomyces avermitilis）的脂酰基转移酶GDSX269aa的多肽序列（SEQ ID No.43）。

图49显示了编码来自除虫链霉菌的脂酰基转移酶GDSx269aa的核苷酸序列（SEQID No.44）。

图50显示了来自链霉菌的脂酰基转移酶的多肽序列（SEQ ID No.45）。

图51显示了编码来自链霉菌的脂酰基转移酶的核苷酸序列（SEQ ID No.46）。

图52显示了活性位点含有甘油的1IVN.PDB晶体结构的带状图。该图是使用DeepView Swiss-PDB浏览器制作的。

图53显示了使用Deep View Swiss-PDB浏览器对活性位点含有甘油的1IVN.PDB晶体结构的侧视图－距离活性位点甘油10内的残基着黑色。

图54显示了使用Deep View Swiss-PDB浏览器对活性位点含有甘油的1IVN.PDB晶体结构的顶视图－距离活性位点甘油10内的残基着黑色。

图55显示了对比1。

图56显示了对比2。

图57和58显示了1IVN与P10480的对比（P10480是嗜水气单胞菌酶的数据库序列），该对比是由PFAM数据库获得的，且用于模型构建过程。

图59显示了一种对比，其中P10480是嗜水气单胞菌的数据库序列。该序列用于模型构建和位点选择。注意，描绘的是完整蛋白质，成熟蛋白（等同于SEQ ID No.2）由第19位残基开始。A.sal指杀鲑气单胞菌（SEQ ID No.28）GDSX脂肪酶、A.hyd指嗜水气单胞菌（SEQID No.26）GDSX脂肪酶。共有序列在所列序列之间存在差异的位置含有*。

图60显示了典型的一组384个克隆，野生型对照位于0.9PC与0.8DGDG的交叉点。

图61显示了三个关注区域。第一个区域含有比率R升高但对DGDG的活性降低的突变体。第二个区域含有比率R升高且DGDG活性升高的突变体。第三个区域含有PC或DGDG活性升高但比率R没有升高的克隆。

实施例

实施例1：嗜水气单胞菌GDSx脂肪酶在1IVN上的建模

以FASTA格式由PFAM数据库获得嗜水气单胞菌GDSX脂肪酶氨基酸序列（P10480）与大肠杆菌Tioesterase氨基酸序列（1IVN）和棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶氨基酸序列（1DEO）的对比。将P10480与1IVN的对比连同1IVN.PDB晶体结构坐标文件输入自动化3D结构建模器（位于www.expasy.org的SWISS-MODELLER服务器）（图52）。使用（由www.expasy.org/spdbv/获得的）Deep View Swiss-PDB浏览器将为P10480得到的模型与1IVN.PDB和1DEO.PDB的晶体结构坐标进行结构对比（图53）。根据1DEO.PDB和1IVN.PDB的结构对比对由PFAM数据库获得的氨基酸对比（对比1－（图53））进行修改。该备选氨基酸对比称为对比2（图56）。

1IVN.PDB结构含有甘油分子。认为该分子位于活性位点中，因为它接近催化残基。因此，可以选择接近活性位点的残基，它们由于接近活性位点因此很可能对底物结合、产物释放、和/或催化作用产生影响。在1IVN.PDB结构中，选择活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的10范围内的所有氨基酸（第1组氨基酸）（见图53和图54）。

由P10480序列选择下列氨基酸：(1)P10480中与对比1的第1组氨基酸对应的所有氨基酸；(2)P10480中与对比2的第1组氨基酸对应的所有氨基酸；(3)由P10480与1IVN的交叠区选择P10480模型中距离1IVN的甘油分子12内的所有氨基酸。这三组结合起来构成第2组氨基酸。

将序列P10480与“AAG09804.1 GI:9964017甘油磷脂胆固醇酰基转移酶[杀鲑气单胞菌]进行对比，并选择AAG09804中与第2组氨基酸对应的残基，产生第3组氨基酸。

第1、2、和3组

第1组氨基酸：

（注意，这些是1IVN－图57和图58－中的氨基酸。）

第2组氨基酸：

（注意，氨基酸的编号指P10480成熟序列中的氨基酸。）

Leu17、Lys22、Met23、Gly40、Asn80、Pro81、Lys82、Asn87、Asn88、Trp111、Val112、Ala114、Tyr117、Leu118、Pro156、Gly159、Gln160、Asn161、Pro162、Ser163、Ala164、Arg165、Ser166、Gln167、Lys168、Val169、Val170、Glu171、Ala172、Tyr179、His180、Asn181、Met209、Leu210、Arg211、Asn215、Lys284、Met285、Gln289和Val290。

第1组和第2组中所选残基的比较表

第3组氨基酸：

第3组氨基酸与第2组相同，但是指杀鲑气单胞菌（SEQ ID No.28）编码序列，即第3组中的氨基酸残基编号要大18，这反映了成熟蛋白质（SEQ ID No.2）与包含信号序列的蛋白质（SEQ ID No.28）中氨基酸编号之间的差异。

杀鲑气单胞菌GDSX（SEQ ID No.28）与嗜水气单胞菌GDSX（SEQ ID No.26）的成熟蛋白有五个氨基酸不同。它们是Thr3Ser、Gln182Lys、Glu309Ala、Ser310Asn、Gly318-，其中杀鲑气单胞菌的残基列于前而嗜水气单胞菌的残基列于后（图59）。嗜水气单胞菌蛋白质的长度只有317个氨基酸，缺少第318位的一个残基。与嗜水气单胞菌蛋白质相比，杀鲑气单胞菌GDSX具有相当高的对极性脂质的活性，诸如对半乳糖脂底物。对所有五个氨基酸位置进行了位点扫描。

第4组氨基酸：

第4组氨基酸是S3、Q182、E309、S310和-318。

第5组氨基酸：

第6组氨基酸：

第7组氨基酸：

可以由晶体结构获得二级结构分类。这意味着能够将每个氨基酸归入α-螺旋或β-折叠的一部分。图57显示了1DEO、1IVN、和P10480（嗜水气单胞菌数据库）的PFAM对比。每行序列下添加的是结构分类。

PFAM数据库包含低序列同一性的蛋白质比对。因此，这些对比不是很好。尽管对比算法（HAMMER序型）非常适于识别保守基序，然而该算法在详细水平上不是很好。因此，在PFAM对比与结构对比之间发现差异也就不算意外了。正如技术人员容易知道的，可以在结构数据的基础上修改PFAM对比。这意味着可以对交叠的那些结构元件进行对比。

图55显示了1DEO、1IVN、和P10480的最初PFAM对比。向对比中添加的是来自1DEO和1IVN晶体结构的二级结构信息。图56中的对比2显示了手工修改的对比，其中二级结构元件之间的匹配得到了改进。根据1DEO与P10480之间或1IVN与P10480之间的保守残基，还修改了P10480的对比。为了容易的区分序列模块，对比2中的序列标识符具有额外的m（1DEOm、1IVNm、P10480m）。

对比3是1和2的混合，给出了每个模块的对比。

实施例2：位点扫描文库的构建

依照制造商Stratagene的指示使用Quick Change Multi Site-DirectedMutagenesis Kit即快速改变多重定点诱变试剂盒。对于每个文库，设计含有一个NNK或NNS（核苷酸缩写）密码子的简并引物。引物设计是使用可以由Stratagene网站获得的工具进行的。使用分析引物形成发卡或引物二聚体可能性的标准分析工具进一步确认了引物质量控制。

该方法的主要概念是：使用非链置换高保真DNA聚合酶诸如Pfu-Turbo和一条引物，线性扩增DNA模板。这与PCR反应中的常规指数扩增过程是不同的。这种线性扩增过程确保了低错误频率。产物是单链非甲基化DNA和双链半甲基化DNA。如果模板是由合适的宿主生物体获得的，那么模板是双链甲基化DNA。这意味着可以用DpnI核酸内切酶消化模板DNA，而不消化产物DNA。因此，在将DNA转化到合适的宿主中后，含有非诱变质粒的转化子只有很低的频率。

实施例3：由位点扫描文库选择获胜者

描述了两种备选方案：对文库测序后分析独特的氨基酸，或是分析文库后对获胜者测序。

选择获胜者的第一种方法：对文库测序后分析独特的氨基酸。

通过将选择盒替换成卡那霉素选择盒，由pDP66S（Penninaga等，Biochemistry，1995，3368-3376）衍生用于在大肠杆菌中生成位点扫描文库/变体并在枯草芽孢杆菌中表达突变体的转化/表达穿梭载体。通过替换P32启动子下游的cgt基因，在该载体中插入酰基转移酶变体基因。该载体使用P32启动子在枯草芽孢杆菌中驱动酰基转移酶变体基因的表达。

使用《Molecular Biological Methods for Bacillus》（C.R.Harwood和S.M.Cutting编，1990，John Wiley&Sons Ltd.，Chichester，UK）第3章描述的转化方法，将表达载体转化到nprE-、aprA-枯草芽孢杆菌DB104（Kawamura和Doi，J.of Bacteriology，1984年10月，p442-444）。

使用含有一个NNK密码子的简并寡聚物构建位点扫描文库，其中K代表G或T，而N代表A、C、G、或T。这意味着通过使用NNK引物的扩增反应而构建的一组克隆（也称为“位点扫描文库”）原则上含有32种独特的密码子（4x4x2=32种组合选项）。假设不存在偏倚，那么以95％的可能性32种密码子中的每一种至少挑到一次所需的克隆数目是95。这可以使用下面的公式来计算。

公式1：n={log(1-c)}/{log(1-f)}

其中n指克隆数目，c指置信区间的小数数值，例如95％置信区间的小数数值是0.95而99％置信区间的小数数值是0.99，f指每一种个体密码子发生的频率，对于NNK引物就是1/32或0.03125。解答n的公式得出94.36或95个克隆。如果认为95％置信区间太低，或是在文库构建过程的一个或多个步骤中不能避免偏倚，那么可以决定对更多的克隆进行检测或测序。例如，在公式1中，如果n设为384，f设为1/32或0.03125，那么置信区间c就比99％大得多。甚至如果60％的克隆含有相同的突变或野生型密码子，那么363个克隆将以99％的置信度获得所有32种密码子。由此，可以得出结论，384个克隆将以99％的置信度含有所有32种密码子，每种密码子至少出现一次。

进行菌落PCR（即对细菌菌落或细菌液体培养物进行PCR反应，从而由细菌内的质粒扩增片段，随后对片段中已经诱变的部分进行测序，这是一种已经建立的流程）。因为可以获得菌落PCR、测序、和序列纯化的预制材料（也称为试剂盒），所以可以对96个一组的菌落日常进行菌落PCR。几个商业公司提供这整个流程的服务，诸如AGOWA GmbH（Glienickerweg185，D-12489，Berlin，Germany）。

在分析了96个测序反应后，为这组96个序列中可以找到的每一种密码子选择一个代表性的个体克隆。随后，对于代表突变体的每一种克隆，接种5ml添加50mg/L卡那霉素的LB培养基（酪蛋白酶促消化产物，10g/L；低钠酵母提取物，5g/L；氯化钠，5g/L；惰性成片助剂(tableting aid)，2g/L），并于33℃以205rpm培养6小时。将0.7ml此培养物用于接种50ml添加50mg/L卡那霉素和高麦芽糖淀粉水解产物溶液（60g/L）的SAS培养基（K₂HPO₄，10g/L；MOPS（3-吗啉代丙烷磺酸），40g/L；氯化钠，5g/L；防沫剂（Sin260），5滴/L；脱脂大豆粉，20g/L；Biospringer106（100%dw YE），20g/L）。于33℃以180rpm继续培养40小时后，通过以19000rpm离心30分钟分离培养物上清液。将上清液转移到干净的管中，并直接用于检测。

选择获胜者的第二种方法：筛选文库后对获胜者进行测序。

尽管可以选择对384个克隆进行测序，然而也可以在测序前对它们进行检验并选择改良的变体。

在筛选如此多的样品时，应当考虑许多问题。虽不详尽，尽管有可能选择对一种底物的活性有所改变的变体，然而384份培养物之间表达水平的差异可能是巨大的，甚至在使用384孔微量滴定板的情况中，导致背景较高。因此，测量两种活性并根据比率变化选择获胜者是一种优选的方法。例如，如果两种活性具有一定比率R，那么不管酶存在的绝对数量，两种活性之间的比率将始终是R。R值的变化指示相对于一种活性，发生了改变另一种活性的突变。

图60显示了由位点扫描文库获得的数据集。对所有克隆测试了对磷脂酰胆碱（PC）和二半乳糖基甘油二酯（DGDG）的活性。展示R值没有变化的所有克隆（可能是已突变的或是未突变的）将以一定的误差幅度位于一条直线上。不管这些克隆，图61显示了三个关注组。

图61的第一个区域含有R显著高于野生型（未突变）但总体DGDG活性较低的所有克隆。第二个区域含有R值和DGDG活性都比野生型高的突变体。第三个区域含有R值没有升高但DGDG或PC活性显著升高的克隆。

如果关注对DGDG的活性升高的变体，那么第二个区域含有最感兴趣的变体，而第三个区域也含有感兴趣的变体。显示水解活性大大升高的第三个区域的变体可能伴随着转移酶活性降低。

有一件事值得注意，如果命中了一个决定特异性的残基，那么20种可能氨基酸中的大部分能够产生非常不同的R值。然而，如果文库具有针对某一个氨基酸的很大偏倚（例如60％是酪氨酸），那么所有那些变体仍将位于一条直线上。

实施例4：384孔微量滴定板中对PC和DGDG活性的测定法

起始材料

●EM培养基

●含转化子的平板

●含野生型的平板

●384孔板

●菌落挑取器

●Waco NEFA-C试剂盒

●384孔板中的PC和DGDG溶液

第1部分－挑取菌落

●将菌落挑到装有EM培养基的384孔板中

●跳过4个孔并接种含有非突变主链的菌落

●于30℃以200rpm的摇动速率培养过夜

第2部分－在底物上保温

●将过夜培养平板以2500rpm离心20分钟

●由每个孔取10μl上清液转移到2个空的384孔板中

●向一个板中加入5μl12.5mM DGDG，向另一个板中加入5μl12.5mMPC

●将两块板于37℃保温2小时，开始时摇动以混匀，然后停止摇动

●继以NEFA C流程

第3部分－NEFA-C流程

●加入10μl A溶液

●于37℃以300rpm保温10分钟

●加入20μl B溶液

●于37℃以300rpm保温10分钟

●于550nm读板

底物组成－单位mM

25mM PC或DGDG

10mM CaCl₂

60mM Triton X100

15mM NaN₃

20mM Briton Robinson pH5.0

实施例5：选择的变体

酶活性的测定

为了测定对各种底物的酶活性，将4μl酶溶液与11μl底物于37℃保温60分钟。随后使用WACO NEFA-C试剂盒测定游离脂肪酸的含量。向15μl酶+底物混合液中添加75μl NEFA溶液A，并于37℃保温15分钟。随后添加150μlNEFA溶液B并保温15分钟。随后于550nm测量样品的光密度（OD）。

作为对照，由每种变体取4μl酶溶液与11μl HEPES缓冲液于37℃保温60分钟。随后如上所述测定游离脂肪酸的含量。由每种底物的观测值扣除该对照样品的OD值，得到经过校正的活性。

使用了四种不同的底物，其组成一般是30mg脂质、4.75ml50mMHEPES缓冲液pH7、42.5μl0.6M CaCl₂、200μl10％不含H₂O₂的Trition X-100。30mg脂质是磷脂酰胆碱（PC）、PC与胆固醇的9:1混合物、二半乳糖基甘油二酯（DGDG）、或DGDG与胆固醇的9:1混合物。

改良变体的选择

对PC的活性改良的变体

选择在与PC保温后显示OD相对于野生型酶升高的那些变体作为具有改良磷脂酶活性的变体。

对DGDG的活性改良的变体

选择在与DGDG保温后显示OD相对于野生型酶升高的那些变体作为对DGDG的活性改良的变体。

对DGDG的特异性改良的变体

对DGDG的特异性即对DGDG的活性与对磷脂酰胆碱（PC）的活性之间的比率。选择显示DGDG与PC比率比野生型高的那些变体作为对DGDG的特异性改良的变体。

以PC作为酰基供体的转移酶活性改良的变体

将酶与PC或PC与胆固醇混合物保温后形成的游离脂肪酸的数量差异指示相对于水解活性数量的转移酶活性数量。转移酶活性不会引起游离脂肪酸的形成。转移酶偏爱性即使用PC作为底物时形成的游离脂肪酸与使用PC与胆固醇混合物作为底物时形成的游离脂肪酸的比率。选择显示转移酶偏爱性升高且显示对PC的活性比野生型高的那些变体作为具有改良转移酶活性的变体。

以DGDG作为酰基供体的转移酶活性改良的变体

将酶与DGDG或DGDG与胆固醇混合物保温后形成的游离脂肪酸的数量差异指示相对于水解活性数量的转移酶活性数量。转移酶活性不会引起游离脂肪酸的形成。转移酶偏爱性即使用DGDG作为底物时形成的游离脂肪酸与使用DGDG与胆固醇混合物作为底物时形成的游离脂肪酸的比率。选择显示转移酶偏爱性升高且显示对DGDG的活性比野生型高的那些变体作为具有改良转移酶活性的变体。

选择的变体

对于上述四种选择标准中的每一种，选择了许多变体。此实施例中的“野生型”酶指杀鲑气单胞菌（SEQ ID No.28）。

对PC的活性改良的变体

	PC
		Thr3Asn	158.0
Thr3Gln	151.5
		Thr3Lys	141.5
Thr3Arg	133.0
		Glu309Ala	106.0

Thr3Pro	101.5
		Thr3Met	96.0
野生型	86.5

对DGDG的活性改良的变体

	DGDG
		Gln182Asp	66.5
Glu309Ala	60
		Tyr230Thr	59
Tyr230Gly	57.5
		Tyr230Gly	51
Thr3Gln	44.5
		野生型	43.5

对DGDG的特异性改良的变体

	R_DGDG/PC	PC	DGDG
				Gln182Asp	1.02	65.5	66.5
Tyr230Gly	0.79	72.5	57.5
				Tyr230Gly	0.78	65.0	51.0
Tyr230Thr	0.75	78.5	59.0
				Tyr230Val	0.71	58.0	41.0
Asp157Cys	0.69	48.0	33.0
				Glu309Pro	0.58	73.5	42.5
Glu309Ala	0.57	106.0	60.0
				Gly318Ile	0.53	69.5	36.5
Tyr230Arg	0.50	63.5	32.0
				Tyr230Met	0.50	64.5	32.5
野生型	0.50	86.5	43.5

以PC作为酰基供体的转移酶活性改良的变体

以DGDG作为酰基供体的转移酶活性改良的变体

	R_{DGDG+Cho/DGDG}	DGDG
			Tyr230Thr	1.10	59
Gln182Asp	1.39	67
			Tyr230Gly	1.55	58
Glu309Ala	1.78	60
			野生型	1.78	44

实施例6：转移酶测定法磷脂:胆固醇

可以用DGDG取代磷脂，从而提供针对半乳糖脂的转移酶测定法。也可以在同一测定法中使用其它受体，例如甘油、葡萄糖、羟酸、蛋白质、或麦芽糖。

在Wheaton玻璃杯中称量300mg磷脂酰胆碱（Avanti＃441601）:胆固醇（SigamC8503）9:1混合物。添加10ml50mM HEPES缓冲液pH7.0，并于40℃搅动，使底物分散。

将0.5ml底物转移到4ml瓶中，并置于40℃加热模块中。添加0.050ml转移酶溶液，还以相同方式分析0.050ml水作为对照。将反应混合液于40℃摇动4小时。然后将样品冻干，并通过GLC进行分析。

计算：

根据GLC分析计算游离脂肪酸和胆固醇酯的含量。

如下计算酶活性：

转移酶/水解比率=％转移酶活性/％水解活性

其中：

Δ％胆固醇酯=％胆固醇酯(样品)-％胆固醇酯(对照)

Δ％脂肪酸=％脂肪酸(样品)-％脂肪酸(对照)

转移酶测定法半乳糖脂:胆固醇

在Wheaton玻璃杯中称量300mg二半乳糖基甘油二酯（DGDG）（纯度>95％半乳糖脂，所用DGDG是由小麦脂质纯化得到的。购自Sigma D4651的DGDG也适于使用）:胆固醇（Sigam）9:1混合物。添加10ml 50mM HEPES缓冲液pH7.0，并于40℃搅动，使底物分散。

计算：

根据GLC分析计算游离脂肪酸和胆固醇酯的含量。

如下计算酶活性：

转移酶/水解比率=％转移酶活性/％水解活性

其中：

Δ％胆固醇酯=％胆固醇酯(样品)-％胆固醇酯(对照)

Δ％脂肪酸=％脂肪酸(样品)-％脂肪酸(对照)

实施例7：嗜水气单胞菌脂酰基转移酶（SEQ ID No. 26）的变体

使用购自Stratagene（La Jolla，CA92037，USA）的Quick Change^TMMulti-SiteDirected Mutagenesis kit试剂盒遵循Stratagene提供的指示导入突变。

位于Tyr256的变体显示对磷脂的活性升高。

位于Tyr256和Tyr260的变体显示对半乳糖脂的活性升高。

位于Tyr265的变体显示以半乳糖脂作为酰基供体的转移酶活性升高。

上述编号指示在如下序列中的位置：来自嗜水气单胞菌的酶，其氨基酸序列如SEQID No.26所示。核苷酸序列如SEQ ID No.27所示。

实施例8：筛选来自杀鲑气单胞菌的甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶GCAT的突变体

使用磷脂酰胆碱或二半乳糖基甘油二酯作为供体且使用胆固醇作为受体，对来自杀鲑气单胞菌甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶GCAT点突变的突变体筛选转移酶活性，其目的是选择对二半乳糖基甘油二酯的活性比磷脂酰胆碱更好的突变体。

使用二半乳糖基甘油二酯（DG）和磷脂酰胆碱（PC）作为供体且使用胆固醇作为受体，对GCAT突变体筛选转移酶活性。

以9:1的比例称量DG（纯度大于95％二半乳糖基甘油二酯，所用DGDG是由小麦脂质纯化得到的。购自Sigma D4651的DGDG也适于使用）和胆固醇（Sigma C8503），溶于氯仿，并蒸干。

为了制备底物，将3％DG:胆固醇散布于50mM HEPES缓冲液pH7。

将0.250ml底物转移到带有螺口盖的3ml玻璃瓶中。添加0.025ml来自突变型GCAT培养物的上清液，并于40℃保温2小时。还制备了用水代替酶的参考样品。将反应混合液在沸水浴中加热10分钟以终止酶反应。

添加2ml99％乙醇，并进行胆固醇分析和游离脂肪酸分析。

胆固醇测定法

将100μl在0.1M TRIS-HCl缓冲液pH6.6+0.5％ Triton X 100（SigmaX-100）中含有1.4U/ml胆固醇氧化酶（SERVA Electrophoresis GmbH产品目录编号17109）、0.4mg/mlABTS（Sigma A-1888）、6U/ml过氧化物酶（Sigma6782）的底物于37℃保温5分钟。添加5μl胆固醇样品并混匀。将反应混合液继续保温5分钟，并于405nm测量OD。根据对0.4mg/ml、0.3mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml、和0mg/ml胆固醇标准溶液的分析，计算胆固醇含量。

游离脂肪酸测定法

使用NEFA C试剂盒（WAKO Chemicals GmbH）测量样品中的游离脂肪酸。

将75μl NEFA试剂A于37℃保温10分钟。添加15μl酶样品并混匀。将反应混合液保温10分钟。添加150μl NEFA试剂B，混匀，继续保温10分钟，并于540nm测量OD。由0.4、0.3、0.2、0.1、0.05、和0mM脂肪酸标准溶液计算游离脂肪酸。

以相同方式测量使用磷脂酰胆碱作为供体的转移酶测定法，但是使用磷脂酰胆碱（Avanti＃441601）代替DG（DGDG）。

转移酶活性表述为％酯化的胆固醇，它是由参考样品中的游离胆固醇与酶样品中的游离胆固醇之间的差异计算的。

水解活性表述为％生成的游离脂肪酸，它是由酶样品中的游离脂肪酸与参考样品中的游离脂肪酸之间的差异计算的。

对DG与PC的相对转移酶活性以％T_DG/T_PC计算。

突变体对DG的转移酶活性T_DG与水解活性H_DG比率如下计算：

其中386是胆固醇的分子量，而280是脂肪酸的分子量。

突变体。

可以通过统计学来分析由上述实施例得到的数据，从而鉴定关键位点和/或提供期望活性特征（诸如T_DG与T_PC比率升高）的具体氨基酸替代并排序。例如，提出了如下稳固建模(robust modeling)：

用经过检查的响应最大值（0，T_PC）和最大值（0，T_DG）执行关于T_PC和T_DG的信息。此项研究的目的是根据ln(1+T_DG)-ln(1+T_PC)得分（优选正的数值），既包括绝对数值范围又包括与对照（天然的）相比的相对数值范围，确定用于鉴定T_DG≥T_PC的设置。优选设置是根据二元响应（事件、无事件）确定的，其中事件定义为关于得分的优选响应。使用以不含先前信息的经验数据结构为基础的具有补充log-log链环的二项式GLIM模型分析二元响应。关于如何进行统计分析的细节见如下参考文献：SAS Institute公司的User's Guide，Version 6，4.Ed，Vol.2（Cary,NC，SAS Institute公司，1989）中的proc LOGISTIC。

实施例9：杀鲑气单胞菌甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶GCAT改良突变体的选择

此实施例中的“亲本”酶是杀鲑气单胞菌（SEQ ID No.28）。

依照实施例8中略述的实验，在来自杀鲑气单胞菌的GCAT中筛选得出32个位置（230Tyr、182Lys、3Thr、157Asp、310Thr、318Gly、309Glu、17Leu、111Trp、117Tyr、179Tyr、118Leu、215Asn、22Lys、290Val、289Gln、285Met、18Ser、23Met、180His、284Lys、181Asn、209Met、210Leu、211Arg、40Gly、81Pro、112Val、80Asn、82Lys、88Asn、87Asn）。

根据筛选结果和三条选择标准，选择了表1所列的下列突变体。

表1

实施例10：用于突变杀鲑气单胞菌甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶GCAT的具体目的氨基酸区域的选择

根据pfam对比（对比2；图56）和P10480模型与1IVN的交叠，选择围绕1IVN活性位点中甘油分子的区域中的所有氨基酸，并用于定义具体目的区域（环）。

（编号指P10480成熟序列（SEQ ID No.2）中的氨基酸）：

Thr20-Arg41（环1，L1）

Ile77-Leu89（环2，L2）

Leu118-Asp127（环3，L3）

Gly146-Val176（环4，L4）

Glu208-Trp287（环5，L5）

相应的命名了中间区（IVR）：

Ala1-Asp19（IVR1）

Phe42-Lys76（IVR2）

Asp90-Tyr117（IVR3）

Ala128-Asn145（IVR4）

Ser177-Ala207（IVR5）

Asp288-His317（IVR6）

下表概括了优选用于突变杀鲑气单胞菌的甘油磷脂:胆固醇酰基转移酶GCAT的位置的定位。此结果是以实施例8-10中略述的实验为基础的。

将上述说明书中提及的所有发表物收入本文作为参考。本领域技术人员清楚的知道本发明所述方法和系统的各种修改和变体，且不违背本发明的范围和精神。尽管已经联系具体的优选实施方案描述了本发明，应当理解所主张的发明不应当过度限制于这些具体实施方案。事实上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员而言显而易见的用于执行本发明的所述模式的各种修改意图属于下列权利要求的范围之内。

Claims

1.用于生成糖脂酰基转移酶变体的方法，包括：(a)选择特征为包含氨基酸序列基序GDSX的脂酰基转移酶作为亲本酶，其中X是下列氨基酸残基中的一个或多个：L、A、V、I、F、Y、H、Q、T、N、M或S；(b)更改一个氨基酸以生成脂酰基转移酶变体；(c)在半乳糖脂底物，和任选磷脂底物和/或任选甘油三酯底物上测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性，和任选水解活性；(d)选择对半乳糖脂的活性比亲本酶升高的酶变体；并任选(e)制备一定量的酶变体；

其中所述方法还包括下列步骤：结构同源性定位或序列同源性对比；

其中结构同源性定位包括下列步骤：

a)将亲本序列与通过P10480晶体结构坐标与1IVN.PDB进行的结构对比而获得的P10480结构模型相对比；

b)选择活性位点中以甘油分子中央碳原子为中心的范围内的一个或多个氨基酸残基；

c)测定依照步骤(b)选择的一个或多个氨基酸残基是否是高度保守的；和

d)更改所述亲本序列中依照步骤(b)选择的一个或多个氨基酸，排除依照步骤(c)鉴定的保守区；

其中序列同源性对比包括下列步骤：

i)选择第一种亲本脂酰基转移酶；

ii)鉴定具有期望活性的第二种相关脂酰基转移酶；

iii)对比所述第一种亲本脂酰基转移酶与所述第二种相关脂酰基转移酶；

iv)鉴定两种序列间不同的氨基酸残基；

v)测定依照步骤(iv)选择的一个或多个氨基酸残基是否是高度保守的；和

vi)更改所述亲本序列中依照步骤(iv)鉴定的一个或多个氨基酸残基，排除依照步骤(v)鉴定的保守区，

其中生成的糖脂酰基转移酶变体的一个下列氨基酸残基与亲本序列相比被更改：S18M或T；Y30G、I、L、S、E、M、A或R；G40L、R、M、Q或V；N80R、D、P、G或E；N87R、D、E、M、C或G；N88W；Y179V、E、R、N或Q；H180T、K、Q或I；M209Y、L、K或M；L210N、D、H、R、E、A、Q、P、K、G、T、W、I、V、S或M；R211G、Q、K、D或T；N215H、L、G、V、R或Y，其中氨基酸残基的编号是通过对比变体序列与SEQID No.2参考序列而获得的，并且其中所述亲本序列获自杀鮭气单胞菌(Aeromonassalmonicida)并且由SEQ ID NO.29的核苷酸序列编码。

2.依照权利要求1的方法，其中所述方法包括：

i)用半乳糖脂底物测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性，和

ii)用磷脂底物测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性；并

3.依照权利要求2的方法，其中对半乳糖脂的转移酶活性与对磷脂的转移酶活性之比率至少是3。

4.依照上述权利要求任一项的方法，包括：

a)用半乳糖脂底物测试脂酰基转移酶变体的转移酶活性，和

b)用半乳糖脂底物测试脂酰基转移酶变体的水解活性；并

选择对半乳糖脂的转移酶活性与对糖脂的水解活性比率比亲本酶升高的酶变体。

5.依照权利要求4的方法，其中对半乳糖脂的转移酶活性与对半乳糖脂的水解活性比率至少是1.5。

6.依照权利要求1-3和5任一项的方法，其中亲本酶由SEQ ID No.28所示氨基酸序列组成。

7.依照权利要求1-3和5任一项的方法，其中GDSX基序中的X是L。

8.特征为包含氨基酸序列基序GDSL的糖脂酰基转移酶变体，其中所述酶变体相对于亲本序列在N80的氨基酸残基处包含氨基酸更改N80D，所述亲本序列是包含氨基酸基序GDSL的脂酰基转移酶，其中，氨基酸残基的编号是通过对比变体序列与SEQ ID No.2所示参考序列而获得的，所述亲本脂酰基转移酶由核苷酸序列SEQ ID No.29编码。

9.依照权利要求8的糖脂酰基转移酶变体，其中酶变体为SEQ ID No.28所示氨基酸序列，只是在下述氨基酸残基处包含氨基酸更改：N80D；其中，氨基酸残基的编号是通过对比变体序列与SEQ ID No.2所示参考序列而获得的。

10.依照权利要求8-9任一项的糖脂酰基转移酶变体，其中所述酶变体对半乳糖脂与磷脂和/或甘油三酯的活性比率比亲本酶升高。

11.依照权利要求8-9任一项的糖脂酰基转移酶变体，其中所述酶变体对半乳糖脂的转移酶活性与对半乳糖脂的水解活性比率比亲本酶高。

12.依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体用于在底物中制备溶血糖脂的用途，通过所述糖脂酰基转移酶变体处理糖脂生成部分水解产物。

13.依照权利要求12的用途，其中底物是食品。

14.制作食品的方法，所述方法包括向食品的一种或多种成分中添加依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体。

15.由生面团制作焙烤产品的方法，所述方法包括向生面团中添加依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体。

16.依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体在处理蛋或基于蛋的产品以生成溶血磷脂的过程中的用途。

17.使植物油或食用油酶促脱胶的方法，包括用依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体处理食用油或植物油从而水解大部分极性脂质。

18.依照权利要求17的方法，其中所述极性脂质是磷脂和/或糖脂。

19.依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体在用于降低食用油磷脂含量的过程中的用途，所述过程包括用所述糖脂酰基转移酶变体处理油从而水解大部分磷脂，并由油分离含有经水解磷脂的水相。

20.依照权利要求8-11任一项的糖脂酰基转移酶变体或通过依照权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体在生物转化极性脂质以生成碳水化合物酯和/或蛋白质酯和/或蛋白质亚基酯和/或羟基酸酯中的用途。

21.依照权利要求20的用途，其中所述极性脂质是糖脂。

22.依照权利要求8-11任一项的或通过权利要求1-7任一项的方法获得的糖脂酰基转移酶变体，其中所述糖脂酰基转移酶变体是固定的。