DK170171B1 - Glyceropentulosederivater, fremgangsmåde til deres fremstilling og farmaceutiske midler indeholdende dem - Google Patents

Description

i DK 170171 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte glyceropentu-losederivater, en fremgangsmåde til fremstilling heraf og lægemidler, som indeholder disse forbindelser som virksomt stof.

5 Med cytostat i ka skal forstås kemoterapeutisk vi rksomme stoffer, som besidder en hæmmende virkning på cellevæksten. Da især hurtigt voksende celler, såsom dem der forekommer i tumorer og leukæmier, berøres af denne hæmmende virkning, forstår man med cytostatika almindeligvis kemoterapeutika mod 10 kræft (cancerostatika, cardnostatika). Trods omfattende undersøgelser har det hidtil ikke været muligt at angive en entydig virkningsmekanisme for cytostatika. De hidtil kendte og afprøvede cytostatika kan inddeles i de følgende grupper: al-kylerende forbindelser; cytostatiske naturstoffer; antimetabo-15 litter; forbindelser med forskellig konstitution og virkningsmåde. En tungtvejende ulempe hos cytostatika er deres høje toksicitet, og derudover virker også mange cytostatika i sig selv som carcinogener og/eller mutagener.

20 Det er derfor formålet med den foreliggende opfindelse at tilvejebringe cytostatisk virksomme forbindelser med en ringe toksicitet.

Det har overraskende vist sig, at bestemte, hidtil ukendte 25 sukkerderivater med de i det efterfølgende angivne almene formler I og II udviser en høj antiproliferativ-cytostatisk-antimikrobiel virkning ved en meget ringe almen toksicitet.

Den foreliggende opfindelse angår således hidtil ukendte 30 glyceropentulosederivater, .som er ejendommelige ved, at de-. -har ’’de almene formler I og II

35 DK 170171 B1 2 C320R2 H,C --

1 I

ro«/:- ro-ck -i- lo “~c~a E-C-3

5 I O

Π-^-ΟΛλ * rv pr?- Λ— i2, i 2 I—51 Γ'-ο-" 2

I E-C-H

fc) O J (>U

lo I H-c-0R

^-CH2 hvori Rj betyder et hydrogenatom eller en alkylgruppe eller acylgruppe med hver 1 til 7 carbonatomer, R2 og r3 betyder et 15 hydrogenatom eller en acylgruppe R4CO, R betyder et hydrogenatom eller en acylgruppe R5CO, og R4 og R5 betyder en alkylgruppe med 1 til 7 carbonatomer.

En alkylgruppe Ri, R4 eller R5 kan være forgrenet, men er for-20 trinsvis ligekædet; den har fortrinsvis 1 til 4 carbonatomer og er f.eks. methyl, ethyl, propyl eller n-butyl. En acylgruppe Ri er fortrinsvis en acetylgruppe. R4 og R5 er især methyl. Grupperne R2 og R3 kan eventuelt også være forskellige, men er fertrinsvis ens. Forbindelser med formlen I, 25 hvori R^f R2 og ikke samtidig er et hydrogenatom, er også foretrukne.

Særligt foretrukne forbindelser med den almene formel I er: Methyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid (Ri = CH3, R2, R3 = H), n-butyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid (Ri * n-C4Hg, R2, R3 = 30 H), n-butyl-diacetyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid (Ri = n- C4H9, R2* R3 s COCH3), triacetyl-3-deoxy-D-glyceropentulose (R^, R2r R3 = COCH3) og eventuelt 3-deoxy-D-glyceropentulose (3-DGP; R^r R2, R3 = H); særligt foretrukne forbindelser med den almene formel II er Di-(3-deoxy-D-glyceropentulose)-dianhydrid 35 (R = H) og diacetyl-di-3-(deoxy-D-glyceropentulose).-dianhydrid (R = C0CH3).

DK 170171 B1 3

Forbindelsen ifølge opfindelsen med formlen I, hvori Rj, R2 og R3 betyder et hydrogenatom (3-deoxy-D-glyceropentulose; 3-DGP) dannes ved alkalisk behandling af a- eller j8-l,4-forbundne di-eller oligosacchari der, som ved deres reducerende ende inde-5 holder et glucose-, fructose- eller mannosemolekyle (maltose, maltulose, epilactose, lactose, lactulose, cellobiose, oligo-maltosid). Forbindelsen fremkommer ved behandling af disse di-og oligosaccharider med alkali, såsom fortrinsvis f.eks. med hydroxider, carbonater eller sulfitter af alkali- eller jord-10 alkalimetaller, eller med organiske baser, fortrinsvis f.eks.

pyridin eller triethylamin, i et udbytte på ca. 0,5 til 5% i forhold til anvendt saccharid. 3-deoxy-D-glyceropentulose (3-DGP), en hidtil ukendt sukkerart, er som 3-deoxy-ketose isomer med 2-deoxy-ribose, hvilken spiller en væsentlig rolle 15 i arvemassen.

Ud fra en blanding af reaktionsprodukter kan 3-DGP udvindes i beriget form eller rent på forskellige, i og for sig kendte måder, f.eks. ved væske-væske-ekstraktion med ethanol, acetone 20 eller acetonitril (disse giver 2-faseblandinger med koncentrerede sukkeropløsninger, hvori den øverste fase er kraftigt beriget med 3-DGP), men også fortrinsvis ved væske-fastkromato-grafi. Hertil er som stationære faser stærkt sure kationbytte-re af tværbundet polystyren som alkali- eller jordalkalisal te, 25 fortrinsvis i Na-, K- eller Ca-form, samt stærkt basiske an-ionbyttere af tværbundet polystyren som salte, fortrinsvis i Cl-, SO4- eller HSOø-form særligt egnede. Ved anvendelse af f.eks. vand som elueringsmiddel fremkommer de ikke-omsatte sukkerarter og deres isomeriseringsprodukter 30 ‘først i eluatet, derefter godt fraskilt 3-DGP.

Ud fra de egnede fraktioner kan der opnås højt renset 3-DGP som farveløs, ikke-krystal1iserende sirup. Da stoffet under vandfri eller vandfattige betingelser er tilbøjelig til dan-35 nelse af dimere anhydrider, er det hensigtsmæssigt at fremstille det og opbevare det som en ca. 50% vandig opløsning. Den vandige opløsning er dog også relativt ustabil og nedbry- DK 170171 B1 4 des langsomt under brunfarvning, forplumring og dannelse af forskellige furanlegemer. Forhøjelse af temperaturen og sænkning af pH-værdien fremskynder denne nedbrydning. Til opbevaring er det derfor hensigtsmæssigt at holde temperaturen på 5 <4eC og pH-værdier på mellem 5 og 6. I sådanne opløsninger foreligger åbenbart en blanding af a- og /3-furanoser og åbenkæ-dede ketosukkerarter.

3-DGP er biologisk aktiv i denne form. I stedet for den frie 10 3-DGP anvendes fortrinsvis mere stabile derivater, nemlig triacylforbindelserne, de tilsvarende glycosider eller deres diacylforbindelser (forbindelser med formlen I, hvori Rj be- . tyder en acyl- eller alkylgruppe, og R2 og R3 betyder et hydrogenatom eller en acylgruppe R4CO), i reglen ikke-krystalli-15 serende, olieagtige forbindelser, eller dianhydridet med formlen II (R = H) eller diacylesteren heraf med formlen II (R = acyl), hvorved det i reglen drejer sig om forbindelser, der let krystalliserer.

20 Glycosiderne dannes overordentlig let ud fra opløsningerne af 3-DGP i de tilsvarende alkoholer i nærværelse af meget ringe mængder af syre eller ionbytter i H+-form som katalysator allerede efter kort tids behandling ved stuetemperatur. Lige så let indtræder hydrolyse af glycosiderne i vandig opløsning, 25 således at der under fysiologiske betingelser kan forventes en ækvivalens med frit 3-DGP.

Dianhydridet med formlen II (R = H) kan let dannes ved behandling af moderat sure 3-DGP-opløsninger med vandsugende 30 midler, såsom f.eks. vandfrit natriumsulfat eller calciumsulfat, eller ved inddampning af vandige eller organiske opløsninger af 3-DGP og henstand af det vandfri produkt. Dianhy- * dridet (med formlen II) kan på lignende måde som glycosiderne let spaltes i vandig opløsning til monomerer. *

Acylforbindelserne med formlerne I og II, hvori Rj, r2 og R3 henholdsvis R betyder en acylgruppe, kan fremstilles ud fra 35 DK 170171 B1 5 forbindelserne med formlen I, hvori Ri er hydrogen eller en alkylgruppe (glycosider), eller ud fra dianhydridet med formlen II, hvori R er et hydrogenatom, på i og for sig kendt måde, f.eks. ved omsætning med eddikesyreanhydrid i pyridin.

5

Den foreliggende opfindelse angår også en fremgangsmåde til fremstilling af de omhandlede forbindelser med de almene formler I eller II, hvori Rj, R2» R3» R4, R5 og R har de ovennævnte betydninger, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig 10 ved, at man behandler a- eller /5-1,4-forbundne di- eller oli-gosaccharider, som ved deres reducerende ende indeholder et glucose-, fructose- eller mannose-molekyle, med uorganiske eller organiske baser, ud fra den resulterende reaktionsblanding isolerer 3-deoxy-D-glyceropentulose 15 (3-DGP) med formlen I, hvori , R2 og R^ betyder et hydrogenatom, og om ønsket på i og for sig kendt måde overfører 3-DGP til ren triacylforbindelse (formlen I, = acyl, R2r R3 = R^CO), dens glycosid (med formlen I, R^ = alkyl), diacylglycosid (med formlen I, R^ = alkyl, R2, R3 = R4C0), 20 dianhydrid (med formlen II, R = h) eller diacyldianhydrid - .(med formlen II, R = RcC0).

D

Fremgangsmåden gennemføres fortrinsvis i vandigt medium. .Reaktionstemperaturen er fortrinsvis mellem stuetemperatur og 25 100eC.

Til undersøgelse af deres antiproliferative-cytostatiske-antimikrobielle egenskaber testes de omhandlede forbindelser med formlerne I og II ved hjælp af en human ovarialc-30 arcinom-ce11eku1tur (HOC-7), hvor der som testsystem blev med draget det såkaldte "human tumour cloning assay" (HTCA), et system hvori den klonale vækst af ondartede enkeltceller selektivt registreres i halvfaste medier (jf. S. Hamburger, Science 197 (1977), 461), Herved viste forbindelserne en over-35 raskende høj antiproliferativ-cytostatisk-antimikrobiel virk ning.

DK 170171 B1 6

Ved toksicitetsundersøgelse (mus, oral) viste det sig, at de omhandlede forbindelser med formlerne I og II ikke udviste nogen tydelig akut toksicitet.

På grund af deres bemærkelsesværdige antiproliferative-cyto-5 statiske-antimikrobielle virkning og det gunstige toksicitets- * undersøgelsesresultat udviser de omhandlede forbindelser et usædvanligt bredt farmakologisk indeks (koefficient af effektiv dosis ED og toksicitet LD50). Desuden blev der fastslået en baktericid virkning.

10 Den foreliggende opfindelse angår endvidere et lægemiddel, som er ejendommeligt ved, at det indeholder en eler flere af forbindelserne med de almene formler I og/eller II og sædvanlige farmaceutiske bærerstoffer og/eller fortyndingsmidler. Ud over de sædvanlige farmaceutiske konfektionerings(bærer)- og/eller 15 fortyndingsmidler kan disse lægemidler ud over forbindelserne med formlerne I og/eller II eventuelt indeholde yderligere virksomme stoffer til understøttelse af terapien, såfremt disse tilsammen med forbindelserne ifølge opfindelsen ikke udviser nogen uønskede bivirkninger. Egnede, hensigtsmæssige 20 afgiftsforme, doserings- og anvendelsesmåder for f.eks. oral administration, topisk administration, administration ved infusion, administration ved injektion osv., svarer i det væsentlige til de kendte betingelser for anerkendte antipro-liferativt/cytotoksisk virkende midler, hvorved der dog på 25 grund af den bedre terapeutiske bredde (væsentligt ringere toksicitet) hos forbindelserne ifølge opfindelsen kommer højere doseringer og/eller en hyppigere indgivelse på tale.

Forbindelserne kan indgives en eller flere gange dagligt. Den mest hensigtsmæssige mængde og indgivelseshyppighed retter sig derved især efter sygdomsområdet og sygdommens alvorlighed og efter patientens almene tilstand. * I de efterfølgende tabeller 1 til 3 er angivet Rp-værdier for forbindelserne ifølge opfindelsen, de anvendte DC-løbemidler og HPLC-systemer til undersøgelse heraf.

DK 170171 B1

Tabel i 7

Tyndtlagskromatografi (DC) Løbe- 5 "Hdler— Rp-værdier 3-DGP i r 1 0,49 3-DGP 2 0,29 3-DGP 4 MT*

Methyl-DGP 4 0,42 og 0,55* 10 Ethyl-DGP 4 .

1 H 0,67 i-propyl-DGP 4 0,90 n-butyl-DGP 4 1,0+, løbestrækning 76 mm n-buty1-DGP-di acetat 3 0,73 og 0,64++ 15 Di-DGP-dianhydrid 2 0,35

Di-DGP-dianhydrid 4 0,25+ DGP-4-nitrophenylosazon 5 0,21

Di-DGP-dianhydrid-diacetat 4 0,64 3-DGP-tri acetat 4 0,74 20 ._____ + Rr-værdi for n-butyl-DGP = 1,0; løbestrækning 3 x 10 cm ++ Løbestrækning 2 x 10 cm +++ se tabel 2 25

Der blev anvendt følgende DC-løbemidler og HPLC-systemer: 1 35

Tabel 2 DK 170171 B1 8 DC-løbemidler

5 Nr. (DC-færdigplader kieselgel 60 F254 10x20 cm MERCK

_Best, nr. 5729) _____ 1 Methyl ethylketon/iseddike/methanol 10 60 20 20 2 Methyl ethylketon/vand 92,5 7,5 15 _ 3 Methylethylketon/toluen 20 80 20 4 Methylethylketon/toluen 50 50 25 5 Benzen/tetrahydrofuran/iseddike 75 20 5

Sporreagens: 200 mg 1,3-naphthalendiol i 50 ml methanol 30 + 50 ml svovlsyre 20%; 10 minutter 100°C

-3-DGP oq derivaterne deraf fremkommer som blågrønne pletter.

« 9 35 DK 170171 B1

Tabel 3 9 HPLC-systemer 5 System 1 System 2 Søjle SHOOEX S 801 Vertex-Hypersie APS 3 μηι 8 x 500 mm 4,0 x 250 mm

Elueringsmiddel Calciumazid i H2O Acetonitril- 10 phosphatpuffer 0,02% pH 5,1 0,01 mol/1 pH 7,0 80+20 Væskehastighed ml/minut 0,9 1,2

Detektor RI RI

15 Ti 1 før ingsvolumen μΐ 20 20

Temperatur °C 60 Stuetemperatur 20 Retentionstider ca. minutter: 3-DGP 26,80 (fig. 4) 3,29 (fig. 5)

Dianhydrid (II, R = H) 25,54 --- 25

De efterfølgende eksempler belyser'opfindelsen nærmere. -På tegningen viser: fig. 1 et IR-spektrum af forbindelsen ifølge eksempel 6; 30 fig. 2 et HNMR-spektrum af forbindelsen ifølge eksempel 6; fig. 3 IR-spektret af forbindelsen ifølge eksempel 2; fig. 4 et HPLC-elueringsdiagram i system 1 for 3-DPG; fig. 5 et HPLC-diagram i system 2 for 3-DPG; og fig. 6 et HPLC-diagram i system 1 for dianhydridet V.

35

Eksempel 1 DK 170171 B1 10

Fremstilling af 3-DGP ud fra lactose S 52,63 g 1actose-monohydrat, svarende til 50,0 g vandfrit lactose, blev opløst i 25 g vand ved 100eC, der blev tilsat c 0,65 g vandfrit natriumsulfit, og blandingen blev holdt ved 100eC i 20 min. og derefter hurtigt afkølet til stuetemperatur, podet med ca. 1 mg lactosemonohydrat, og efter ca. 24 10 timer blev krystallerne af ikke-omsat lactose frasuget fra moderluden under eftervask med lidt iskoldt vand.

Filtratet indeholdt 9,5 g saccharid i 36,4 g opløsning. Det blev afsaltet under ionbytter med blandet leje, og den op-15 nåede, neutrale opløsning blev inddampet til 20 g i vakuum.

Produktet blev påsat en glassøjle (med en indre diameter på 26 mm, med kappeopvarmning til 60°C, med en længde på 100 cm, fyldt med ca. 500 ml kationbytter "LEWATIT MDS" 1368 (stærk 20 sur polystyrenmatriks, fremstillet af Bayer AG, Leverkusen, i natriumform)) og elueret med vand. Efter et stoffrit forløb på 175 ml blev en fraktion på 110 ml opsamlet, hvilken fraktion indeholdt hovedmængden af lactose og ledsagende saccharider.

En yderligere fraktion på 150 ml indeholdt hele 3-DGP med 25 ringe mængder af ledsagende saccharider.

3-DGP-fraktionerne fra ialt 10 reaktionsforløb blev samlet, inddampet i vakuum til ca. 20 g og påny kromatograferet over det samme system. 3-DGP-fraktionen indeholdt nu kun spormæng-30 der af ledsagende sukkerarter. Fraktionen blev inddampet i vakuum til 10 g.

Vandindhold ifølge Karl Fischer: 49,2¾ ♦

HPLC-analyse (system 1) gav: 48,9% 3-DGP

35 0,8% galactose 1,1% andre sukkerarter Specifik drejning: -22,1° (c = 3,0 i vand) DK 170171 B1 11

Dette produkt blev anvendt til det i eksempel 8 beskrevne forsøg med cellekulturer.

Strukturopklaring; 5

Det hidtil ukendte stof reducerer Fehlings opløsning, men ikke brom i svagt surt miljø. Det drejer sig altså om en ketose. Den giver reaktion ifølge Keller-Ki1iani (H. Kiliani, Ar. 234, (1986), 273) og ifølge Dische (Z. Dische, Mikroch. 8, 10 (1930), 4-32) på deoxysukker. Specifik drejning [a]20o = -22,1° (c = 3,0 i vand). Den forbruger 1 mol perjodat pr. mol, dvs. den besidder altså kun 1 diolgruppe. Det krystal 1 i serede ' nitrophenylosazon viser sig som forventet med smeltepunkt (2 5 3e C) og ved grundstofanalyse som identisk med det for 15 3-deoxy-xylose beskrevne produkt (S. Mukherjee og A.R. Todd,

Soc. 94 (1947), 969-973). Rp-værdi i løbemiddel 5:0,21. Da me- thylglycosidet (I, Rj s CH3, R2, R3 = H), n-butyl(1)-glyco- sidet (I, Ri = n-C^g, R2, R3 = H) og dianhydridet (II, R = H) ikke forbruger noget perjodat, er en hydroxyIgruppe i den gly-20 cosidiske gruppe nærliggende, n-butylglycosidet (I, Rj =

n-C4Hg, R2, R3 = H) kan omsættes med eddikesyreanhydrid i py-ridin til en di acetylforbindelse (I, R^ = n-C4Hg, R2, R3 = COCH3), hvilken kan destilleres i højvakuum. Kogepunkt: 90°C

(0,002 Torr = 0,26 Pa). Forsæbning med NaOH gav en molekylvægt 25 på 272,5 (beregnet for C13H2206: 274,319). IR-spektret (f i g.

1) og masse- og NMR-spektret {f i g. 2) bekræftiger den angivne struktur.

Grundstof analyse (C13H22O6) 30 fundet: 56,61% C, 7,93% H, 35,6% 0 beregnet: 57,0% C, 8,09% H, 35,0%0 HPLC se tabel 3 DC se tabel 1 35 DK 170171 B1 12

Eksempel 2

Fremstilling af Di-(3-deoxy-D-glyceropentulose)-dianhydrid (II, R = H) · 5 5 g af det i eksempel 1 opnåede produkt, som indeholdt 2,445 g 3-DGP, blev vidtgående inddampet i vandstrålevakuum ved ca. ς 50eC badtemperatur, og den resterende sirup blev optaget i 10 ml methyl ethyl keton og påny inddampet, og den samme proces blev gentaget flere gange. Til sidst blev tørresten opvarmet 10 endnu en time i vakuum ved 100°C. Efter flere ugers henstand i vakuum indtrådte spontan krystallisation til en tæt krystalgrød. Ved omkrystallisering fra 1-butanol og methanol opnåedes 0,8 g farveløse krystaller med et smeltepunkt på 148-149eC.

15 Specifik drejning[a]20p = -12,0° (c = 2,3 i vand)

Grundstofanalyse: fundet: 51,35% C, 6,83% H, 41,26% 0 20 beregnet: 51,72% C, 6,94% H, 41,34% 0 (for C10Hi6°6) IR-spektret er vist i fig. 3.

Stoffet reducerer ikke Fehlings opløsning og forbruger ikke 25 perjodat i neutral opløsning.

Diacetylforbindelsen (II, R = acetyl), som kan opnås med eddikesyreanhydrid/pyridin, er ligeledes et godt krystalliserende stof.

30 DC se tabel 1.

Eksempel 3

C

35 DGP-udbytte ud fra lactose med forskellige reaktionsdeltagere

Hver 52,63 g 1actosemonohydrat, som svarede til 50 g vandfrit lactose, blev som i eksempel 1 opløst i 25 g vand ved 100°C, DK 170171 B1 13 og der blev tilsat 25 ml af opløsningen af reaktionsdeltagerne (koncentration er angivet i tabel 4), og temperaturen blev holdt ved 100°C i 20 min. Efter hurtig afkøling blev DGP-indholdet i reaktionsblandingen beregnet i % i forhold til an-5 vendt, vandfrit lactose ved hjælp af HPLC-system 1. Resultaterne fremgår af den følgende tabel 4.

Tabel 4

10 Reaktionsdeltager Koncentration g/100 ml % dannet DGP

N32S03 5 0,96

Na2C03 4 0,17

NaOH 1,5 2,01 15 Triethylamin 0,25 ml + 0,25 ml H2O 0,34

Pyridin 0,25 ml 0,13

Eksempel 4 20 DGP-udbytte ud fra forskellige di- og oligosaccharider I dette eksempel blev der gået frem på samme måde som i eksempel 3. I stedet for lactose blev der anvendt 50 g (tørmasse) af forskellige di- og. oligosaccharider. Som reaktionsdeltager 25 blev der tilsat hver 25 ml af en natriumhydrbxidopløsning 1,5 g/100 ml.

Resultaterne er vist i den følgende tabel 5.

30 35

Tabel 5 DK 170171 B1 14

Anvendt saccharid_% dannet DGP_ ? 5 Lactulose 2,07

Maltose 1,54 c

Epilactose 1,34 01igomaltosid+ 1,51

Cellobiose 1,75 10 + Glucosefri, ud fra stivelsessyre ved fældning med methanol Μη ca. 2300

Eksempel 5 15

Fremstilling af n-butyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid

Til 5 g af det i eksempel 1 opnåede produkt, som indeholdt 2,445 g DGP, blev sat 5 ml n-butanol, og reaktionsblandingen 20 blev inddampet i vakuumrotationsfordamper til ca. udgangsvolumenet. Processen blev gentaget endnu 3 gange til fjernelse af alt vand, og volumenet blev suppleret med n-butanol til 25 ml og omrørt ved stuetemperatur i 10 min. efter tilsætning af 0,5 g fint pulveriseret, stærk sur kationbytter i H+-form 25 ("DU0LITE Microionex H"). Efter filtrering og tilsætning af 50 μΐ pyridin blev alt opløsningsmiddel afdestilleret i vakuum.

Der forblev 3,40 g af en lysegul, olieagtig væske, som var letopløselig i vand, alkoholer og lavere ketoner. Tyndtlags-kromatografi se tabel 1.

30

Eksempel 6

Fremstilling af n-butyl-l,4-diacetyl-3-deoxy-D-glyceropentu- * los id 35 3,40 g af det i eksempel 4 fremstillede n-butylglycosid blev opløst i 100 ml pyridin, hvorefter der blev tilsat 10 ml eddi- DK 170171 B1 15 kesyreanhydrid, og blandingen fik lov at henstå i 24 timer ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen blev derefter hældt i en liter isvand under omrøring, og den udfældede farveløse olie blev eftervasket med vand flere gange og tørret i vakuum over 5 P2°5*

Udbytte: 3,67 g.

Produktet kunne destilleres i højvakuum på 0,002 mm Hg ved ca. 80 ° C.

10

Specifik drejning [a]20g * -37,7° (c = 0,5; chloroform) Tæthed 20/4: 1,86

Grundstofanalyse: C H 0 15 for C13H22O6 beregnet: 56,61 7,93 35,6 fundet: 57,0 8,09 35,0 IR-spektrum se fig. 1.

HNMR-spektrum se fig. 2.

20 Tyndt 1agskromatografi se tabel 1.

Eksempel 7

Fremstilling af 3-DGP-tri acetat (Rj: acyl] 25 3,16 g di-DGP-diacetat blev opløst i 10 ml 0,ln HC1 i iseddike, og 0,5 ml eddikesyreanhydrid blev tilsat, og blandingen blev holdt ved 40°C i 120 minutter. Efter tilsætning af 200 μΐ triethylamin blev blandingen inddampet i vakuum. Der resterede 30 en gul olie, 5,15 g. Den blev opløst i 5 ml toluen og sat på en søjle med 200 ml kiselgel 60 MERCK (230 - 400 mesh), og der blev elueret først med 200 ml toluen, derefter med 200 ml toluen-ethylacetat 80+20 og med 200 ml toluen-ethylacetat 60+40. I fraktionen 310-360 ml fremkom hovedstoffet. Det blev 35 inddampet i vakuum.

Farveløs olie. Udbytte: 3,62 g.

Eksempel 8 DK 170171 B1 16

Rp-værdi se tabel 1.

5 Biologisk undersøgelse.

i

Den i eksempel 1 fremstillede 3-D6P samt DGP-DA fra eksempel 2 blev undersøgt i henseende til deres antiproliferative-cyto-statiske-antimikrobielle egenskaber ved hjælp af en human 10 ovarialcarcinom-cellekul tur (H0C-7), hvor der som testsystem blev fremdraget det såkaldte "human tumour cloning assay" (HTCA), et system, hvori den klonale vækst af ondartede enkeltceller selektivt konstateres i halvfaste medier (jf. S. Hamburger, Science 197 (1977), 461).

15

Metode

En vandig opløsning af henholdsvis 3-DGP og DGP-DA blev undersøgt i følgende fortyndingsrække.

20

Testkon- Fortyn- Fortyn- % pg/ml koncen- ding i ding i i tration rør_Petriskåle_Petriskåle_ 25 C 1:5 1:10 0,5 5000 D 1:10 1:20 0,25 2500 E 1:50 1:100 0,05 500 F 1:100 1:200 0,025 250 F1 1:125 1:250 0,02 200 30 F2 1:165 1:330 0,015 152 F3 1:250 1:500 0,01 100 G 1:500 1:1000 0,005 50 H 1:1000 1:2000 0,0025 25 I 1:5000 1:10000 0,0005 5 35 J 1:10000 1:20000 0,00025 2,5 hvorved der medfulgte både en negativkontroltilsætning (i form af HgCl2) og en tilsætning med opløsningsmiddel (Aqua bidest).

DK 170171 B1 17

Kulturerne blev inkuberet ved 37°C, 5% CO2# 100% luftfugtighed i 21 dage, hvorefter kultursystemerne blev oparbejdet, hvorved de voksende kolonier (Kloner) blev talt under mikroskop.

5 Som virkning af den undersøgte opløsning blev en kolonioverlevelse <50% af kontrollen defineret.

Resultat

Opløsningsmiddelkontrol: VII: Kolonioverlevelse 92% 10 = ingen hæmning af kolonivækst

Negativkontrol: VI: Kolonioverlevelse 0%

Linearitetskontrol: r = 0,968 Teststofkoncentration: D6P

C-F: Kolonioverlevelse 0% = virkning 15 Fl: 0,08% = virkning F2 : 10% = virkning F3: 44% = intermediær virkning G-J: 65 - 84% = ingen virkning 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 35

Teststofkoncentration: DGP-DA

2 C: Kolonioverlevelse 30% = virkning 3 D: 50%= intermediærvirkning 4 E: 57% = intermediær virkning 5 F-J: 61-89% = ingen virkning 6 7

Resultatet viser en skarp skillelinie mellem sensitivitet og 8 resistens hos den undersøgte ovarialcarcinomlinie, hvor der i 9 det sensitive område kunne påvises en høj antiproliferativ- 10 cytostatisk-antimikrobiel virkning.

11

Med de i eksempel 1 beskrevne derivater af 3-DGP (methylglyco-sid, n-butylglycosid, diacyl-n-butyl-glycosid) kan der ligeledes under lignende testbetingelser opnås en entydig antiproli-ferativ-cytostat i sk-ant imikrobiel virkning.

DK 170171 B1

Eksempel 9 18

Konservering ifølge DAB 9, VIII, NI

5 Forbindelserne ifølge opfindelsen udviser en baktericid virkning, hvilket fremgår af de efterfølgende angivne forsøgsre- 1 sultater:

Præparat: di-deoxy-glyceropentulose-dianhydrid 0,3%, 1% og 3%.

10

Undersøgelsen blev gennemført med følgende kim:

Escherichia coli ATCC 8739 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 15 Staphylococcus aureus ATCC 6538 Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404 20 25 2

V

35 2 5 DK 170171 B1 19 to to lo is (c in to in o o o o o o o o

rHIHi-H t-4 H ri ri H

O

σ xxx xxx xx L (0 0) 73 O 04 LO 00 lO O CM ΙΛ

UJ +J ΟΗΟβΙΗ O CO O O) (O O O O r-l LO

1n CQh-O * * * * - * · ~ i U ikC d) H r-l r-l Tt LO r-t LO CM Tt ττ co io oo to lo tom o o o o o o o o

Η Η Η H HH Η H

Φ XXX XXX XX

L· U

O) to O O) O r-l LO O CO o o o o o o o o

1 C LU 4-> 73 CO to 00 CM to CO 00 LO

(Q νμ *** »

^ (U 00 COrHli) ^ H CO rH CO

CO ID to CM LO to into to t—t o o o o o o o o O r-l r-l r-l r-l t—I pH rH r-l at ^ x o x x o x o x x oooxx

jq i. d X

co a> co o ·» io o o 10 r-

tU 1— LU -P 73 O CO r-i O CM CJt 05 CO CM

CO 4- » ·.«.» * » * »·.

^ (J H r-l r-l CO T t *7 CO LO T t

I at LO LO LO to LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO LO

£- tn in ooooo ooooo o o o o o

<D c ^ H l—l i—i i-4 i-4 1*4 i-4 i-4 i-4 i—I 1-4 ι*4 ι-4 τ4 H

tj at at 25 r- C tf) 73 xxxxx xxxxx xxxxx e 3 >— c \ at > η μ o h o to to to c*· looocnot LU 73 σ σ Μ Μ ^ M to t- Ο) CM CM 00 ΙΟ CO C* ri rt m at si at » ^ ^ ^ --------

^ > tf) .Ω r-l r-l CO CO CO O ri 1 CO CM O H CO CO CM

• co de de

O - r-l CO

. Λ C O

30 o V 1 in in tn at in c · in c · in c e · s σ σ 3 co σ 3 co tf) OOt O 3 at O 30)0 •r- 3 I_ -1- C_ £- S- ·<- U t_ C -i- t_ C L 3 O O 0)3130) 0)3330) IB β β r- οι β β i“ Ol B 10 i“ D) O) ·γ- (0 CD -i- ·γ* CO *r* -r- (0 -r-

L. r- · · C i— · · C P" · · C

oc O ΟΌΓ · O 73 -C · O Ό £ · ^ 4J 0 3 CL 73 · O 3 a 73 · O 3 CL 73 · in ni o c a atffica at to c o.

0) · in -»-> m tn · tn +> to tn · in -w co cn I- UJ O. (O O < UJ CL W O < LU IL (O o <

Eksempel 10 DK 170171 B1 20

Konservering ifølge DAB 9, VIII NI.

5 Analogt med eksempel 9 blev den baktericide virkning af DGP

undersøgt. *

Præparat: DGP-vandig sirup 0,3%, 1% og 3%,

Charge: 91621 10

Undersøgelsen blev gennemført med følgende kim:

Escherichia col i ATCC 8739 Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Staphylococcus aureus ATCC 6538 15 Candida albicans ATCC 10231 Aspergillus niger ATCC 16404 20 25 1 35 DK 170171 B1 21

Tabel 7 KBE/ml ved

undersøgel- KBE KBE KBE

Testorga- sens begyn- efter efter efter 5 nismer__Kone, delse__1 dag__3 dage 10 dage E. coli l,lxl06 6,7xl05 3f9xl05 l,7xl06

Pseud, aerug. 2,2x105 l,9xl05 8,4xl03 0

Staph, aureus 0,3% Ι,δχΙΟ5 2,8xl05 Ι,δχΙΟ5 0

Cand .

albicans 9,1x105 4,8xl05 4,9xl06 3,3xl06 10 Asp. niger 1,9x10* 5,5xl03 1,3x10* 2,4x10* E.coli 1,2X106 5,9x105 5,4x105 <102

Pseud, aerug. 2,2x105 7,2x10* 0 0

Staph, aereus 1% 1,7x105 l,3xl05 3x10* 0

Cand.

albicans 1,3x106 4,3xl06 9xl06 3,9xl06 15 Asp. niger 1,7x10* 6xl03 1,3x10* 1,0x10* E. COli 1,2x106 4,4X105 2,8xl03 0

Pseud.

aeruginosa 2,2x105 15 0 0

Staph, aureus 3% 1,4χ105 4,5x10* 0 0 20 Cand.

albicans Ι,ΙχΙΟ5 3,8xl06 1,1x10' 4,0xl06

Asp. niger 1,1x10* 4xl03 4,5x10* 3,6x10* 25 1 35

Claims (10)

1. Glyceropentulosederivater, kendetegnet ved, at 5 de har de almene formler I og II C3 03. S,'C j 2Uit2 . 21 V*—1 R°f o 10 b-c-h I 0 _ h-c-or. cs c., I J I 2 i HC- -CS ' CH 2 p^-0^ S-C-H ^ 15 (1} o I ^ H-C-OR i C22 hvori Ri betyder et hydrogenatom eller en alkylgruppe eller 20 acylgruppe med hver 1 til 7 carbonatomer, R2 og R3 betyder et hydrogenatom eller en acylgruppe R4CO, R betyder et hydrogenatom eller en acylgruppe R5CO, og R4 og R5 betyder en alkylgruppe med 1 til 7 carbonatomer.

2. Forbindelser med formlerne I og II ifølge krav 1, ken detegnet ved, at Ri er et hydrogenatom eller en acyl- eller alkylgruppe med hver 1 til 4 carbonatomer.

3. Forbindelser med formlerne I og II ifølge krav 1 eller 2, 30 kendetegnet ved, at R4 eller R5 er en alkylgruppe med 1 til 4 carbonatomer. 4. 3-Deoxy-D-glyceropentulose (formlen I, Ri, R2, R3 = H). Λ

5. Methyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid (formlen I, Rj = CH3, R2r R3 = H). 23 DK 170171 B1 6. n-Butyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid (formlen I, Rj= n-C4Hg, R2, R3 = H). 7. n-BJtyl-diacetyl-3-deoxy-D-glyceropentulosid (formlen i, r^ = n-C4H9, R2, R3 = COCH3) ·

8. Di -(3-deoxy-D-g1yceropentulose)-dianhydrid (formlen II, R = H).

9. Diacety!-di-(3-deoxy-D-glyceropentulose)-dianhydrid (formlen II, R m COCH3).

10. Triacetyl-3-deoxy-D-glyceropentulose (formlen I, R^, R2,

10 R3 «= COCH3) .

11. Fremgangsmåde til fremstilling af forbindelserne med formlerne I og II ifølge krav 1, hvori r1# R2, R3, R4, R5 og R har de i krav 1 angivne betydninger, kendetegnet ved, at man behandler a- eller /3-1,4-forbundne di- eller oligosac- 15 charider, som ved deres reducerende ende indeholder et glucose-, fructose- eller mannosemolekyle, med uorganiske eller organiske baser, ud fra den resulterende reaktionsblanding isolerer 3-deoxy-D-glyceropentulose (3-DGP) med formlen I, hvori Ri, R2 og R3 er et hydrogenatom, og om ønsket på i og for sig 20 kendt måde overfører 3-DGP til en triacylforbindelse (formlen I, Rj = acyl, R2, R3 = R4C0) , dens glycosid (formel I, R^ = alkyl), dens diacylglycosid (formel I, R± = alkyl, R2, R3 = R4CO), dens dianhydrid (formel II, R = H) eller dens diacyl-dianhydrid (formel II, R = R5CO). 1 30

12. Farmaceutisk middel, kendetegnet ved, at det indeholder en eller flere af forbindelserne med de almene formler I og/eller II ifølge ethvert af kravene 1-10 og sædvanlige farmaceutiske bærerstoffer og/eller fortyndingsmidler.