DK170049B1 - Phosphonomethoxyalkylenpurin- og pyrimidinderivater samt farmaceutiske præparater indeholdende sådanne derivater - Google Patents

Description

i DK 170049 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte phosphonomethoxy-alkylenpurin- og pyrimidinderivater samt farmaceutiske præparater indeholdende sådanne derivater.

Infektiøse virussygdomme erkendes som et vigtigt medicinsk problem.

5 Fremskridt overfor infektiøse virussygdomme kræver udvikling af lægemidler med selektiv antiviral aktivitet, medens de forbliver ondartede overfor normale cellelinier. Et antal antivirale midler, der for tiden undersøges og som synes at besidde nogen selektivitet er nucleosid-analoger. Almindeligvis er disse forbindelser strukturelle analoger af 10 de naturligt forekommende nucleosider. Strukturel modifikation i enten purin- eller pyrimidinbasekernen og/eller saccharidkomponenten resulterer i et syntetisk modificeret nucleosidderivat, som, når det indgår i en proces til dannelse af en viral nucleinsyre virker på en sådan måde, at yderligere syntese af vira! nucleinsyre afbrydes. Effektiviteten af 15 disse antivirale midler afhænger af den selektiv omdannelse med virale enzymer, men ikke med værtsenzymer, til den tilsvarende nucleotid-analog, som derefter omdannes til triphosphat, og om inkorporering i viral nucleinsyre forekommer. Et problem ved denne antivirale strategi har været fremkomsten af visse virusstammer, hvor enzymerne er dårlige 20 til at fremme phosphorylering af nucleosid-analogerne. For at omgå dette problem synes intakte nucleotid-analoger potentielt at være temmelig nyttige som antivirale midler til inkorporering i viral nucleinsyre.

I PCT/US84/04748 beskrives hidtil ukendte phosphonsyreanaloger af nucleosidphosphater, som er nyttige som antivirale midler til inkorpo-25 rering i vi ralt DNA. Strukturformlen for disse forbindelser er vist nedenfor

O X R, B

z0ck ji i i3 2 P - C- (CH_) -CH ΖΊ0/ I 2 η I / \

1 Y CH CH

30 I j R2 R1 . . * * I forbindelse 1 betegner B en purin- eller pyrimidinbase, Rj og Rg 35 kompletterer sammen /J-pentofuranosesukker, eller Rj betegner H, og R£ H eller hydroxymethyl, R^ betegner H eller OH, X betegner H, OH eller sammen med Y carbonyl oxygen, eller Y kan også betegne betegner H, og Zj og Zg betegner H eller alkyl. Disse i teknikken kendte forbindelser ad- 2 DK 170049 B1 skiller sig generelt fra forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse ved 1) ether-oxygenbindi ngen til det carbonatom, der er bundet til basen, hvilken binding tjener til at bevare eller efterligne acetal-oxygenbindi ngen i en pentofuranose-sukkerring, og ved 2) phosphatmodi-5 fikationen, som er en phosphonoalkyl ende!. I modsætning hertil består den ikke-cycliske sukkerkomponentanalog i de her omhandlede forbindelser af et fuldstændigt carbonatomskelet op til en phosphonomethoxydel.

På lignende måde beskrives i J. Med. Chem., 1986, 29, 671 syntese og anti-herpes-virusaktivitet af phosphat- og phosphonatderivater af 10 9-[(l,3-dihydroxy-2-propoxy)methyl]guanin med formel 2

OH

15 H

β I

(HO)2P -x— 0H (X-0, CH2) 20 2 Nærmere beslægtede er adeninphosphonsyreanaloger med formel 3 25 Γ 2 <&> pH2 *R2-COR4 30 3 i 4 \r -chor 3

og deres syntese, som beskrives i GB-PA nr. 2.134.907A. A

35 I formel 3 er R2 og Rg H eller fuldender sammen en ribonucleosid-ring, og den ene R^ -gruppe er hydrogen og den anden -CH2P(0)(0Η)2·

Et foretrukkent eksempel på en af disse forbindelser, kendt som (S)-HPMPA, med formel 4 3 DK 170049 B1 Νϋ2 W 8 5 L/Ox^p(oh)2

^0H

4 er beskrevet af DeClercq et al., i Nature, 1986, 323, side 464-467, og 10 tidligere af Holy et al., Nucleic Acids Research, Symposium Series nr.

14, 1984, side 277-278.

Ifølge opfindelsen er der tilvejebragt hidtil ukendte phosphono-methoxyalkylenpurin- og pyrimidinderivater, som har vist sig at være i besiddelse af nyttig antiviral aktivitet. Disse forbindelser afviger fra 15 de naturligt forekommende nucleotider ved at besidde strukturelle ændringer i deres analoge sukkerkomponent, hvilke ændringer også kan være ledsaget af ændring i nucleotidbasedelen. Desuden afviger disse forbindelser fra den naturligt forekommende phosphatstruktur hos nucleotider med hensyn til arten af oxygen-carbon-phosphorbindinger i disse 20 phosphonomethoxyderivater.

Det er konstateret, at forbindeisene ifølge opfindelsen udviser en overraskende antiviral aktivitet sammenlignet med den nært beslægtede, kendte, antivirale forbindelse HPMPA.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er phosphono-25 methoxyalkylenpurin- og pyrimidinderivater med formel I

B

i alk.

i 1 R.-C-alk,-Q i , 2.

alk, 30 \ CH , J 2 0 = f-°R3 OR.

4 hvor — B er guanin, 8-bromguanin, 8-chlorguanin, 8-aminoguanin, 8-hydrazino-guanin, 8-hydroxyguanin, 8-methylguanin, 8-thioguanin, 2-aminopurin, 35 4 DK 170049 B1 2,6-dianrinopurin, 5-methylcytosin, 5-ethylcytosin, 2-N-acetylguanin og 6-0-methoxyethylguani n, al kp al kg og alk^ uafhængigt er en kemisk binding eller C^-alkylen, Q er hydrogen eller hydroxyl, 5 Rj er hydrogen eller Cj^-alkyl, og R3 og R4 uafhængigt er udvalgt blandt hydrogen, Cjg-alkyl, phenyl og phenyl-Cj_4-alkylen, og de tilsvarende salte, zwitterioner og/eller solvater deraf, bortset fra 10 (RS) forbindelser, hvor B er guanin-9-yl, guanin-7-yl, 2-aminopurin-9-yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, al k^ er methylen, al kg er methylen, Q er hydroxyl, alk^ er en kemisk binding, og Rj, R^ og R4 er hydrogen, samt forbindelserne 9-(2-phosphonomethoxy)ethyl)guanin og 9-(2-diethyl -phosphonomethoxy)ethyl)guani n.

15 Den foreliggende opfindelse angår endvidere farmaceutiske præparater til antiviral anvendelse, hvilke præparater er ejendommelige ved, at de indeholder en antiviralt virksom mængde af forbindelser med formel (I) sammen med en farmaceutisk aktiv bærer.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan forekomme som 20 optiske isomerer, og både racemiske og diastereomere blandinger af disse isomerer, som kan forekomme for visse forbindelser, samt de enkelte optiske isomerer, falder alle indenfor rammerne af den foreliggende opfindelse. Medens de racemiske blandinger kan separeres i de individuelle isomerer deraf ved hjælp af kendt teknik, f.eks. ved adskillelse af 25 diastereomere salte dannet med optisk aktive hjælpestoffer, f.eks. syrer eller baser, efterfulgt af omdannelse til opnåelse af de optisk aktive stoffer, kan den foretrukne optiske isomer af en forbindelse ifølge den foreliggende opfindelse i de fleste tilfælde syntetiseres ved hjælp af stereospecifikke reaktioner ud fra en passende stereoisomer af det 30 ønskede udgangsmateriale. Som anført angår den foreliggende opfindelse også farmaceutisk acceptable, ikke-toksiske salte af disse forbindelser. Disse salte kan omfatte sådanne, der er opnået ved kombination af passende kationer, såsom alkalimetal- eller jordal kalimetal ioner eller ammoniumioner eller kvaternære aminoioner med syreaniondel en i 35 phosphonsyregruppen. Derudover kan salte dannes ved syreaddition af visse organiske og uorganiske syrer til basiske centre i purinbasen, især guanin, eller pyrimidinbasen. Det er endeligt åbenbart, at forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse i deres ikke-ioniserede form 5 DK 170049 B1 så vel som zwitterionform og/eller i form af sol vater er omfattet af den foreliggende opfindelses rammer.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse forekommer også i underklasser, idet to brede underklasser er af den art, hvor B er en 5 purin- eller pyrimidinbase. Blandt disse brede underklasser er de foretrukne klasser sådanne, hvor purinbasen er guanin eller substitueret guanin, og hvor pyrimidinbaserne er substitueret cytosin. Den mest foretrukne klasse af forbindelser er den, hvor B er guanin eller substitueret guanin.

10 Foretrukne klasser af sukkerkomponentanaloger, f.eks.

alk- I 1

15 R1 “C-a^-Q

alk3 er sådanne, hvor alk2 er en kemisk binding, og Q er hydrogen, og sådanne, hvor alk2 er er methyl en, og Q er hydroxyl.

20 Forbindelser ifølge den foreliggende opfindelse kan også opdeles i underklasser i overensstemmelse med phosphonatdelens struktur. Disse klasser omfatter diesteren, monoesteren og disyren. Foretrukne underklasser af phosphonatdelen er monoesteren og di syren.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan fremstilles 25 ved de følgende to almene metoder. Forbindelserne, hvor Q er hydrogen, og al kg er en kemisk binding, kan almindeligvis fremstilles i overensstemmelse med synteseskema I, og de forbindelser, hvor Q er hydroxyl, kan almindeligvis fremstilles i overensstemmelse med synteseskema II.

Synteseskema I

6 DK 170049 B1

x B B

1 i B + alk alk. l)base,H_0 alk,

1 -* 1 —M > I

Ri-C-H R.-C-H 2)H™ R.-C-H

1 i I

alk-, alk- alk0 I 3 I 3 I 3

0 o O

C~h2 C-H0 C-Ho 1 I ‘ I “ °- P-OR 0= P-OR-, 0= P-OR, 1 I I 3

0R4 OR4 OH

II la Ib (R3, R4^H) (R3 4- H) 1)Me^SiBr 2) H20 Ψ

B

alk.

R.-C-H

alk.

0 C-H- I 2

0= P-OH

OH

Ic

A

7 DK 170049 B1 I skema I har B, alk^, al kg, RJ} Rg, Rg og R4 den ovennævnte betydning. Symbolet X betegner en almindelig organisk, syntetisk fraspaltelig rest, såsom chlorid, bromid, iodid, tosylat, mesylat, triflat eller lignende. Det er åbenbart, at al kg er en kemisk binding, og Q er 5 hydrogen i skema I. Under reaktionsforløbet i skema I omdannes basen B til en anion ved behandling med en base, såsom et alkalimetalhydrid, i et ikke-reaktivt opløsningsmiddel, såsom dimethyl formamid (DMF), ved omrøring i ca. 1-3 timer i temperaturområdet fra stuetemperatur til ca.

130°C. Baseanionen alkyleres med et phosphonatdiestermel lemprodukt med 10 formel (II) til opnåelse af di esterproduktet med formel (la). Denne diester kan omdannes til en monoester (Ib) eller en di syre (Ic).

Omdannelsen af diesteren (la) til monoesteren (Ib) kan opnås ved opløsning af (la) i en vandig hydroxidopløsning og henstand ved en temperatur mellem stuetemperatur og 80°C i ca. 1-6 timer. Hvis basen in-15 deholder en syre-labil beskyttelsesgruppe på en reaktiv ringdel af basen foregår omdannelse af (la) til (Ib) alternativt under samtidig fjernelse af beskyttelsesgruppen ved opløsning af den beskyttede forbindelse (la) i fortyndet syre, såsom HC1, og henstand ved en temperatur fra ca. stuetemperatur til ca. 100°C i ca. 1-6 timer.

20 Omdannelsen af di esteren (la) til di syren (Ic) gennemføres let ved behandling af en opløsning af (la) i et ikke-reaktivt opløsningsmiddel, såsom DMF, med overskydende trimethylsilylbromid og omrøring ved ca. stuetemperatur i ca. 4-6 timer. Flygtige forbindelser fjernes ved koncentrering i vakuum til et remanensmateriale, som behandles med vand til 25 opnåelse af det ønskede di syreprodukt (Ic).

I det efterfølgende synteseskema II er Q hydroxy.

Synteseskema II

8 DK 170049 B1

B PG-B

I t alk.. alk.

I X 2 PG-L | X

R,-C - alk -OH ? R-C - alk,-OPG

I 2 1 I 2 aik, alk,

1 I

OH ok

V - IV

o C\ '1 1) 2) X-CH2-P-OR3 V 0R4

R VI

P PG-B

alk. alk.

i I 1

V? - alk2-OH Η +, H o Rrc -alkj-OPG

' si._* I

alk, ^ /7 alk, 1 j 0 o ch9 £h, 1 1 0=P-0R, 0= P-OR,

[ -5 i J

OR. I

4 OR, 4

la III

tf 9 DK 170049 B1

Det vil også være åbenbart for fagmanden, at forbindelserne med formel (I), hvor Q er hydroxy, i nogle tilfælde også kan fremstilles ved metoden ifølge skema I. Et eksempel på en sådan syntese er vist nedenfor som skema III.

5

Synteseskema III

B + X B

! I

CH0 CH0 ,2 ,2

HC-CHo0PG -\ HC-CH-OPG

I 2 / I 2 CH„ CH, i i 0 o 1 1 CH, CH, I 2 i 2 0=P-0R, 0=P-0R, I 3 I 3 OR. OR.

4 4

XII -pG

V

B

CH 1 Å HC-CH.OIi I 2 CH, i 2 0 CH, I 2 0=P-0R, I 3 OR.

4 10 DK 170049 B1

En fordel ved anvendelse af metoden ifølge skema I og III ligger i alsidigheden ved anvendelse af mellemprodukter med formel (II) og (XII). Disse kan kobles med en ønsket base udvalgt blandt en stor gruppe af sådanne baser til opnåelse af forskellige forbindelser med formel (I) via 5 kun et til tre trin.

I ovenstående skema II har B, alkj, al kg, alk3, Rp R3 og R4 den ovenfor angivne betydning. Symbolet PG betegner en organisk, syntetisk beskyttende gruppe, idet foretrukne beskyttelsesgrupper hører til tri-phenylmethylkl assen af beskyttelsesgrupper. Symbolet L er en syntetisk, 10 organisk fraspaltelig gruppe, som kan udvælges blandt gruppen angivet i forbindelse med synteseskema I, fortrinsvis halogenid, især chlorid. I synteseskema II er alk3 enten en kemisk binding eller er identisk med alk2- Skema II omfatter beskyttelse af aminogruppen i purin- eller pyrimidinbasen, eller hydroxygruppen i pyrimidinbasen samt den endestil-15 lede hydroxygruppe, der er bundet til al kg. Almindeligvis udføres denne reaktion til indførelse af beskyttelsesgrupper i reaktions-inerte opløsningsmidler, der almindeligvis indeholder et overskud af et basisk reagens, såsom tri ethylamin, der skal opfange den fraspaltelige gruppes anion og hydrogenion, der frigøres under reaktionsforløbet. Den resulte-20 rende di-beskyttede mellemproduktforbindelse med formel (IV) behandles med et metalhydrid, f.eks. NaH, efterfulgt af omsætning med et phosphonatdiestermel lemprodukt med formel (VI) til opnåelse af mellemprodukt (III). Fjernelse af beskyttelsesgrupperne fra mellemprodukt (III), hvilket foretages ved opvarmning af (III) i et surt medium eller 25 ved mild hydrogenolyse, resulterer i det ønskede diesterprodukt (la).

Det vil også være åbenbart for fagmanden, at dette produkt (la), hvor Q er OH, kan omdannes til en tilsvarende forbindelse, hvor Q er H, ved omdannelse af hydroxygruppen til en fraspaltelig gruppe (f.eks. ved behandling med tosylchlorid eller mesylchlorid) efterfulgt af hydridreduk-30 ti on til et forgrenet al kyl produkt med formel (la), hvor al kg er C14-alkylen, og Q er H.

Omsætningsmellemprodukterne med formel (II), (V) og (VI), der anvendes ifølge synteseskema I og II, er kommercielt tilgængelige eller kan let syntetiseres. Eksempler på syntese af disse mellemprodukter er 35 vist nedenfor i skema IV og V.

DK 170049 B1 π

Skema IV

Mellemproduktsyntese Mellemprodukter med formel (II) 5 o X-(Cj-K- . J-O-CH-P-OR-n 2n-l 21 ό I OR.

Ri 4 ? U hTOr (<τΓ|Ι2η-1) " alkl <f‘alk3 R1 R1 a) n = 2 o 2 iCo/'Ny''° V^1 7 »cd/V'v"1011)))

\_c ^ X (,R^p I

Ri ? v—^ *c0~l'^'o'^'ci J KO Apior ) V"0 ° 2 »^/°Χ/Γ0'3’2 x f \ / k Separation R, \ / hvis

\ TtosCl ' R1 j H

/ \ / V_ "Y^!^

Ri O ^ K, 0 I 1

Skema IV (fortsat) 12 DK 170049 B1 B) n = 3,4

, , ICl (Ro0) _P Q

H> (CH2) Br —ClX\o_ (CHj-BrAJ^ (rO) P '^\3 -(CHj Br CH20 2 n '32 2 n c) n a 5-7 , . Rfesylchlorid , /v H>(CH ) -OH —--> MsO-(CH-) -OH ——-b MsO- (CHJ -O ^\C1 ^ n ' z η ^ ^

O

M^XCHj -0'//V\p foR ) ^

2 n * ^2> 2 (R30)3P

II

Ί»

Skema IV (fortsat) 13 DK 170049 B1

Mellemprodukter med formel XII

0 X - alk^CH-alkj-O-^P (OR3)2

alk 9 I

OPG

XII

Repræsentativt synteseeksempel

ν°^\_/0Η1) V HCT\ j OPG 1) PG'-L 'PG'-O^X f OPG

Λ°^ 2>W(or3> T = o <*3>2

X-A/CFG HO^ ,OPG

( / · <-1 -K' p = o 'x-p = o <^>2 <°r3)2

XII

14 DK 170049 B1

I skema IV er n et helt tal fra 1 til 7, og alle andre symboler har ovennævnte betydning eller er konventionelle, f.eks. Ac = acetyl = CH~C, etc. O

Omsætninger, hvor en endesti 11 et hydroxygruppe skal omdannes til en 5 fraspaltelig gruppe, f.eks. -OH -* OTos, skal kun betragtes som eksempler, idet andre fraspaltelige sulfonatgrupper, f.eks. mesylat og tri flat, kan anvendes i stedet for tosyl at, eller -OH-funktionen kan omdannes til andre typer af fraspaltelige grupper, f.eks. halogenid.

I det viste eksempel til fremstilling af et mellemprodukt med for-10 mel (XII) er PG' en mere labil beskyttelsesgruppe end PG. Dette tillader selektiv fjernelse af PG' i nærvær af PG. Eksempler på sådanne beskyttelsesgruppepar er PG' = di-(p-methoxyphenyl)phenylmethyl, PG = tri-phenylmethyl eller PG' = t-butyld i methyl s i 1yl, PG = benzyl.

15 Skema V

Mel 1emproduktsyntese Mellemprodukter med formel (V) 20 B+ 25 B-(CH2)n~^' OH ^-

V

30

Fremgangsmåden til fremstilling af mellemprodukter med formel (V) omfatter et første trin, som er identisk med trinet vist i skema I: frembringelse af anionen af base B og alkylering. Det resulterende al kylenylacetonidderivat af basen omdannes til det ønskede mellemprodukt 35 med formel (V) ved almindelig syrespaltning af acetoniddelen.

De generelle syntesemetoder til fremstilling af forbindelser med formel (I) omfatter: 15 DK 170049 B1 A. 1) alkylering af en purfn- eller pyrimidinbaseanion med et derivat af et diesterificeret al kylenoxymethylphosphonat-mel lemprodukt med en fraspaltelig gruppe (II) til opnåelse af den tilsvarende basederi vatforbindelse (la), 5 2) omdannelse af (la) til enten (Ib) ved syre- eller basekatalyse ret hydrolyse eller til (Ic) ved behandling af (la) med et overskud af trimethylsilybromid, inddampning til tørhed og behandling af remanensen med vand.

10 B. 1) beskyttelse af den reaktive ringdel i basen, f.eks. aminogruppen i adenin eller guanin, og en endestillet hydroxyl gruppe i udgangs-diol-forbindelsen (V) med syntetiske, organiske beskyttelsesgrupper, der er i besiddelse af de nødvendige steriske og elektroniske karakteristika, der er hensigtsmæssige for den nødvendige selektivitet med hensyn til bin-15 ding til opnåelse af det di-beskyttede mellemprodukt IV, 2) omdannelse af den resterende hydroxygruppe til en oxyanion ved behandling af (IV) med et alkalimetalhydrid efterfulgt af alkylering med et derivat af et diesterificeret methylphosphonatmellemprodukt med en fraspaltelig gruppe (VI) til opnåelse af mellemproduktet (III), 20 3) fjernelse af de beskyttende grupper fra mellemprodukt (III) til tilvejebringelse af phosphonatdiesteren (la), og 4) samme metode som for A.2).

Fysiologisk acceptable salte af forbindelser med formel (I) ifølge 25 den foreliggende opfindelse fremstilles ved metoder, der er kendte i teknikken. Saltene omfatter ammoniumsalte og salte af fysiologisk acceptable metaller, især Li+, K+, Na++, Ca++ og Mg++, og er hidtil ukendte forbindelser og udgør et yderligere aspekt af den foreliggende opfindelse. Metalsalte kan fremstilles ved omsætning af et metal hydroxid med en 30 forbindelse med formel (I) ifølge den foreliggende opfindelse. Eksempler på metalsalte, som kan fremstilles på denne måde er salte indeholdende Li+, Na+ og K+. Et mindre opløseligt metalsalt kan udfældes fra opløsningen af et mere opløseligt salt ved tilsætning af en passende metalforbindelse. Syresalte kan fremstilles ved omsætning af en forbindelse 35 med formel (I) ifølge opfindelsen med en uorganisk eller organisk syre, f.eks. HC1, HBr, HgSO^, eller organiske sulfonsyrer eller lignende.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse, herunder de fysiologisk acceptable salte deraf, besidder ønskværdig antiviral akti- 16 DK 170049 B1 vitet. De udviser aktivitet overfor DNA-vira, f.eks. Herpes Simplex virus I, Herpes Simplex virus II, cytomegalovirus, Varicella Zoster virus og også mod retrovira. Til anvendelse overfor virusinfektioner kan forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse formuleres til 5 farmaceutiske præparater. Sådanne præparater består af en eller flere forbindelser med formel (I) sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer.

E.W. Martin i Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. udgave_(Mark Publishing Company, 1975) beskriver typiske bærere og fremstillingsmetoder.

10 Forbindelserne kan administreres topisk eller systemisk. Systemisk administrering omfatter administrering af oral, rektal og parenteral (f.eks. intramuskulær, intravenøs, subkutan eller nasal) vej. Almindeligvis viser det sig, at der ved oral administrering af en forbindelse ifølge opfindelsen skal anvendes en større mængde af det reaktive middel 15 til frembringelse af samme virkning som parenteral administrering af en mindre mængde. I overensstemmelse med god klinisk praksis foretrækkes det at administrere de pågældende forbindelser i et koncentrationsniveau, som frembringer virksomme antivirale virkninger uden at forårsage skadelige eller uheldige bivirkninger. Terapeutisk administreres de 20 omhandlede forbindelser som farmaceutiske præparater indeholdende en virksom antiviral mængde af en forbindelse med formel (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf og en farmaceutisk acceptabel bærer som nævnt ovenfor. Farmaceutiske præparater til udførelse af en sådan behandling indeholder en større eller mindre mængde, f.eks. fra 95 til 25 0,5% af mindst én forbindelse ifølge den foreliggende opfindelse i kombination med den farmaceutiske bærer, som omfatter ét eller flere faste, halvfaste eller flydende fortyndingsmidler, fyldstoffer og formuleringshjælpestoffer, som er ikke-toksiske, inerte og farmaceutisk acceptable. Sådanne farmaceutiske præparater udformes fortrinsvis som enhedsdosis-30 former, dvs. fysisk diskrete enheder indeholdende en forudbestemt mængde af lægemidlet svarende til en brøkdel eller et multipleum af den dosis, som er beregnet til frembringelse af den ønskede terapeutiske reaktion. Andre terapeutiske midler kan også være til stede. Farmaceutiske præparater, der tilvejebringer fra ca. 1 til 50 mg af den aktive ingrediens 35 pr. enhedsdosis foretrækkes, og de fremstilles konventionelt som tabletter, pastiller, kapsler, pulvere, vandige eller olieagtige suspensioner, sirupper, eliksirer og vandige opløsninger. Foretrukne orale præparater er udformet som tabletter eller kapsler og kan indeholde 17 DK 170049 B1 konventionelle excipienser, såsom bindemidler (f.eks. sirup, acacia, gelatine, sorbitol, traganth eller polyvinyl pyrrolidon), fyldstoffer (f.eks. lactose, sukker, majsstivelse, calciumphosphat, sorbitol eller glycin), smøremidler (f.eks. magnesiumstearat, talkum, polyethylenglycol 5 eller siliciumdioxid), disintegreringsmidler (f.eks. stivelse), og be-fugtningsmidler (f.eks. natriumlaurylsul fat). Opløsninger eller suspensioner af en forbindelse med formel (I) med konventionelle farmaceutiske vehikler anvendes til parenterale præparater, såsom en vandig opløsning til intravenøs injektion, eller en olieagtig suspension til intramus-10 kulær injektion. Sådanne præparater med den ønskede klarhed, stabilitet og egnethed til parenteral anvendelse opnås ved opløsning af fra 0,1-10 vægt% af den aktive forbindelse i vand eller et vehikel bestående af en polyvalent, aliphatisk alkohol, såsom glycerin, propylenglycol og polyethylenglycol eller blandinger deraf. Polyethylenglycolerne består af en 15 blanding af ikke-flygtige, sædvanligvis flydende, polyethylenglycoler, som er opløselige i både vand og organiske væsker og som har en molekylvægt i området fra 200 til 1500.

Med hensyn til den biologiske aktivitet af forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse er det åbenbart, at disse forbindelser be-20 sidder antivirale egenskaber, som gør dem særligt egnede til anvendelse ved bekæmpelse af virusinfektioner. Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse kan således anvendes ved en fremgangsmåde til behandling af virusinfektioner i pattedyr, der behøver en sådan behandling, hvilken behandling omfatter systemisk eller topisk administrering til et 25 sådant pattedyr af en virksom dosis af en forbindelse med formel (I) eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf. På basis af afprøvning har det vist sig, at en virksom dosis må forventes at være fra ca. 0,01 til ca. 30 mg/kg legemsvægt, fortrinsvis ca. 1 til ca. 20 mg/kg legemsvægt.

Til klinisk anvendelse må det forventes at forbindelserne ifølge den 30 foreliggende opfindelse vil kunne administreres på samme måde som referencelægemidlet acyclovir. Til klinisk anvendelse skal dosis og doseringsmåden imidlertid indrettes omhyggeligt i hvert tilfælde efter grundig professionel bedømmelse og under hensyntagen til patientens alder, vægt og tilstand, administreringsvejen samt arten og alvorligheden af 35 sygdommen. Almindeligvis vil en daglig dosis omfatte fra ca. 150 til ca.

750 mg, fortrinsvis 250-500 mg, af en forbindelse med formel (I) administreret 1-3 gange dagligt. I nogle tilfælde kan en tilstrækkelig terapeutisk virkning opnås ved lavere doser, medens højere doser vil være 18 DK 170049 B1 nødvendige i andre tilfælde.

Forbindelserne ifølge den foreliggende opfindelse samt fremstillingen deraf belyses i det følgende nærmere. For de kernemagnetiske resonansspektre (NMR) angives kemiske skift (δ) udtrykt i ppm overfor 5 tetramethylsilan (TMS) som standardreference. Det relative område angivet for de forskellige skift i proton-NMR-spektraldata svarer til antallet af hydrogenatomer af en særlig funktionel type i molekylet. Arten af skiftene med hensyn til multiplicitet angives som bred singlet (bs), singlet (s), multiplet (m), dublet (d), dublet af dubletter (dd), trip-10 let (t) eller kvartet (q). De anvendte forkortelser er DMS0-dg (perdeu-terodimethylsul foxid), CDDU (deuterochloroform) og er konventionelle.

Det infrarøde spektrum (IR) omfatter kun absorptionsbølgenummer (cm ) med identifikationsværdi for funktionelle grupper. Til IR-bestemmelserne anvendtes kaliumbromid (KBr) som fortyndingsmiddel. Alle forbindelser 15 gav tilfredsstillende elementæranalyse.

I. Syntese af mellemprodukter A. Forbindelser med formel (V) 20

B-(CH2) —^ 00 ^ n \___OH

V

25 Eksempel 1 9-(S)-(2,3-dihydroxy)propylquanin

En 250 ml 3-halset, rundbundet kolbe forsynet med gastilledning ovntørredes, skylledes med argon og natriumhydrid (1,82 g, 0,045 mol, 60 vægt% i olie) overførtes til kolben. Natriumhyridet vaskedes to gang med 30 50 ml tør pentan (CaH2), én gang med tør THF (Na/benzophenon) og dække-des med tørt dimethyl formamid (250 ml, destilleret fra P20g). 2-amino-6-benzyloxypurin (10,00 g, 0,041 mol, fremstillet ud fra 2-aminopurin-6-yl-trimethylammoniumchlorid) tilsattes på en gang og opløsningen opvarmedes ved 60°C i 1 time. Isopropyliden-D-glycerol-y-tosylat (11,86 g, 35 0,041 mol, Fluka) tilsattes så på en gang efterfulgt af en katalytisk mængde (1 g) natriumiodid, og den resulterende blanding opvarmedes i 12 timer ved 60°C. Derefter afkøledes opløsningen og de flygtige materialer fjernedes under formindsket tryk. Tyndtlagschromatografisk analyse af 19 DK 170049 B1 råblandingen viste tilstedeværelse af N-9-isomeren (Rf = 0,7 i 10% methanol/methylenchlorid) og N-7-isomeren (Rf = 0,3 i samme). Chromato-grafi over silicagel under eluering med ethylacetat gav 10 g af N-9-iso-meren som en gummi og 2 g af den krystallinske N-7-isomer, smp. 184-5 186°C (samlet udbytte 80%. forhold mellem N-9:N-7 er 5:1).

En opløsning af (S)-2',3'-0-isopropyliden-6-0-benzyl-9-(2,3-di-hydroxy)propyl guanin (5,0 g, 0,0139 mol) i 80% vandig eddikesyre (80 ml) opvarmedes på et dampbad i 1 timer. De flygtige materialer fjernedes så i vakuum, og fra den resterende remanens afdampedes 4 volumener 100 ml 10 absolut ethanol efterfulgt af 2 volumener 100 ml toluen. Det opnåede hvide faste materiale rekrystalli seredes fra vand og tørredes ved 5 mm i 12 timer til opnåelse af 2,8 g (89%) 9-(S)-(2,3-dihydroxy)propylguanin som et hvidt faststof, smp. over 260°C.

h NMR (360 MHz, DMS0-dg) 8: 10,57 (s, IH), 7,58 (s, IH), 6,44 15 (brs, 2H), 5,05 (d, J=5 Hz, IH), 4,77 (t, J=5 Hz, IH), 4,07 (d, J=ll Hz, IH), 3,77 (2 overlappende m, kompleks 2H), 3,35 (m, kompleks, IH), 3,27 (m, kompleks, IH).

13C NMR (90 MHz, DMS0-dg) 156,90, 153,47, 151,32, 138,36, 116,38, 69,77, 63,51, 46,10.

20 UV (0,1 N vandigt HC1) λ max 253 (e = 12,305), λ max 272 (e = 8,495), (0,1 N vandigt NaOH) λ max 256 (e = 10,096), λ max 267 (e = 10,614).

[αΐβ5 - -45°, [a]H6 = -540 (c = 0,5, DMS0).

IR (KBr): 3180 (br, s), 3100 (s), 1695, 1650, 1605 cm"1.

25 Analyse for C8H11N5°3:

Beregnet: C: 42,66, H: 4,92, N: 31,09.

Fundet: C: 42,42, H: 4,91, N: 30,40.

B. Forbindelser med formel (XII) 30

. . O

X^N| ° (0R3)2 OPG 35

XIX

20 DK 170049 B1

Eksempel 2 2-benzyl oxymeth.yl -3-di ethyl phosphonomethoxy-1-(p-tol uensul fonyl ox.y) -propan

En opløsning af 5-hydroxymethyl-2,2-dimethyl-l,3-dioxan (H.A.

5 Bates, 0. Farina, M. Tong, J. Org. Chem. 1986, 51, 2637, 3,0 g, 20,5 mmol) i 25 ml tør DME under argon sattes via en kanyle til en opslæmning af NaH (0,740 g, 80% dispersion i olie, 24,6 mmol) i 60 ml tør DME afkølet til 0°C. Den resulterende grå opslæmning omrørtes ved stuetemperatur i 1/2 time, afkøledes derefter til 0°C og behandledes med en opløsning 10 af benzylbromid (4,56 g, 26,7 mmol) i 20 ml DME. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur natten over og omsætningen standsedes derefter med 100 ml HgO. Det vandige lag frasepareredes og ekstraheredes med 2 portioner ethyl acetat. De kombinerede organiske lag vaskedes så med en mættet natriumchlori dopiøsning, tørredes over MgSO^, filtreredes 15 og koncentreredes til tilvejebringelse af en gul olie. Rensning ved kolonnechromatografi på silicagel (ethylacetat/hexan) gav 3,51 g (72%) 5-benzyloxymethyl-2,2-dimethyl-l,3-dioxan som en klar farveløs væske.

En blanding af 5-benzyloxymethyl-2,2-dimethyl-l,3-dioxan (3,40 g, 14,4 mmol) og nogle få krystaller af p-toluensulfonsyre,monohydrat i 100 20 ml methanol omrørtes ved stuetemperatur i 20 timer. Methanol en fjernedes i vakuum og den resterende olie rensedes ved kolonnechromatografi på silicagel (ethylacetat) til opnåelse af 2,25 g (80%) 2-benzyloxymethyl- 1,3-propandiol som en farveløs klar væske.

NaH (0,87 g, 80% dispersion i olie, 29,1 mmol) vaskedes tre gange 25 med tør pentan, tørredes i vakuum og suspenderedes derefter i 60 ml tør THF. En opløsning af 2-benzyloxymethyl-l,3-propandiol (5,70 g, 29,1 mmol) i 5 ml THF tilsattes derefter dråbevist i løbet af 20 minutter og reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1,5 timer til opnåelse af en hvid opslæmning, t-butyldimethylsilylchlorid (4,38 g, 29,1 mmol) 30 tilsattes derefter portionsvist i løbet af 3 minutter og reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i yderligere 2 timer. Derefter fortyndedes blandingen med 150 ml ethyl acetat og vaskedes med 10% vandigt natriumcarbonat og saltvand, tørredes over MgSO^, filtreredes og koncentreredes til opnåelse af en farveløs olie. Rensning ved kolonnechro-35 matografi på silicagel (ethylacetat/hexan) tilvejebragte 7,41 g (82%) 2-benzyloxymethyl-3-t-butyldimethylsilyloxy-l-propanol som en klar farveløs væske.

21 DK 170049 B1

En opløsning af 2-benzyloxymethyl-3-t-butyldimethylsiloxy-l-propanol (5,05 g, 16,3 mmol) i 10 ml tør THF sattes dråbevist i løbet af 10 minutter til en opslæmning af NaH (0,59 g, 80% dispersion i olie, 24,4 mmol) i 70 ml tør THF ved 0°C under argon. Efter afslutning af 5 tilsætningen fjernedes isbadet, og reaktionsblandingen omrørtes i 45 minutter ved stuetemperatur. En opløsning af diethylphosphonomethyltri-fluormethansulfonat (5,85 g, 19,5 mmol, A.F. Kluge Org. Synthesis 1985, 64, 80, D.P. Phil!ion, S.S. Andrew, Tetrahedron Letters, 1986, 27, 1477) i 10 ml tør THF tilsattes derefter i løbet af 5 minutter. Efter 3 timer 10 ved stuetemperatur opvarmedes reaktionsblandingen ved 50°C i 2 timer og afkøledes derefter til stuetemperatur. Derefter standsedes omsætningen ved tilsætning af 50 ml HgO, fortyndedes med CHgCl2 og vaskedes med HgO og en mættet natriumchloridopløsning, tørredes over MgSO^, filtreredes og koncentreredes. Den rå olie rensedes ved kolonnechromatografi på 15 silicagel (EtOH/EtOAc) til tilvejebringelse af 2,55 g 2-benzyloxymethyl- l-t-butyldimethylsiloxy-3-(diethylphosphonomethoxy)propan som en farveløs olie. *H NMR antyder, at forbindelsen har en renhed på 80%. Den største forurening er uomsat diethylphosphonomethyltriflat.

Tetrabutylammoniumfluorid (8,3 ml, 1 M i THF, 8,3 mmol) sattes 20 dråbevist til en opløsning af 2-benzyloxymethyl-l-t-butyldimethylsiloxy- 3-(diethylphosphonomethoxy)propan (2,55 g, 5,5 mmol) i 20 ml THF ved stuetemperatur. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 1,5 timer, og koncentreredes så i vakuum til opnåelse af 5,6 g af en gul olie. Rensning ved kolonnechromatografi på silicagel (3-5% ethanol i 25 ethyl acetat) tilvejebragte 1,72 g (31% ud fra 2-benzyloxymethyl-3-t-butyldimethyl si 1oxy-1-propanol) 2-benzyloxymethyl-3-di ethylphosphono-methoxy-1-propanol som en klar farveløs olie.

En opløsning af 2-benzyloxymethyl-3-diethylphosphonomethoxy-l-propanol (0,25 g, 0,72 mmol) i 5 ml CHgCl2 afkøledes til 0°C og be-30 handledes med tri ethylamin (0,22 g, 2,16 mmol). En opløsning af p- toluensulfonylchlorid (0,151 g, 0,79 mmol) i 2 ml CH2C12 tilsattes derefter og reaktionsblandingen opvarmedes gradvist til stuetemperatur.

Efter 14 timer ved stuetemperatur fortyndedes blandingen med CH2C12 og vaskedes med 2 portioner 10% vandig HC1 og en mættet natriumchlorid-35 opløsning, tørredes over MgSO^, filtreredes og koncentreredes til opnåelse af en orangefarvet olie. Rensning ved kolonnechromatografi på silicagel (1-3% ethanol i tørt ethylacetat) tilvejebragte 0,295 g 2-benzyloxymethyl-3-diethylphosphonomethoxy-l-(p-toluensulfonyloxy)propan 22 DK 170049 B1 som en bleggul olie.

h NMR (200 MHz, CDC13) 8: 7,79 (d, 0=8,4 Hz, 2H), 7,21-7,39 (m, 7H), 4,41 (brs, 2H), 4,06-4,21 (m, 6H), 3,71 (d, J=9 Hz, 2H), 3,60 (AB quartet, 2H), 3,48 (AB quartet, 2H), 2,44 (brs, 3H), 2,31 (septet, J=5,8 5 Hz, IH) og 1,32 (t, J=7 Hz, 6H).

13C NMR (50 MHz, CDCI3): 144,7, 137,9, 132,9, 129,8, 127,9, 127,6, 127,4, 73,2, 70,9 og 70,7, 68,3, 67,2, 67,1 og 63,8, 62,5 og 62,3, 39,7, 21,7 og 16,6 og 16,5.

IR (film): 3100, 3080, 3040, 3000, 2920, 2880, 1600, 1500, 1480, 10 1460, 1395, 1360, 1260, 1200, 1180, 1100, 1060, 1040, 980, 840, 820, 800, 750, 710 og 680 cnf^.

C. Forbindelser med formel (II) 15

O

fl X-(CnI[2n-l) -°- CH2-p- (OR3>2

K

20 V

:,t<· hvor

H

(CnR2n-l) = Calkj-c-al)^] R- 1 25 1

Eksempel 3 30 l-methansulfon.ylox.y-2-(di ethyl phosphonomethoxy)ethan

En opløsning af acetylchlorid (43,2 g, 550 mmol) i 100 ml tør ether sattes dråbevist i løbet af 1 time ved stuetemperatur under nitrogen til en opløsning af 1,3 dioxolan (37,1 g, 500 mmol) i 300 ml ether indeholdende nogle få krystaller zink(II)chlorid. Reaktionsblandingen omrørtes 35 ved stuetemperatur i yderligere 2 timer og koncentreredes så i vakuum. Produktet rensedes ved destillation (0,6 mmHg, 56-58°C) til tilvejebringelse af 67,9 g (89%) l-acetoxy-2-(chlormethoxy)ethan som en klar farveløs olie (W.P. Foye, J.M. Kaufmann, Y.H. Kim, J. Heterocyclic Chem.

23 DK 170049 B1 1982, 19, 497).

En blanding af l-acetoxy-2-(chlormethoxy)ethan (67,8 g, 444 mmol) og triethylphosphit (81,3 g, 490 mmol) opvarmedes ved 105-110°C i 12 timer. Kraftig gasudvikling iagttoges indledningsvis. Reaktionsbiandin-5 gen afkøledes så til stuetemperatur og råmaterialet rensedes ved destillation (0,9 mmHg, 130-134°C) til opnåelse af 76,9 g (68%) l-acetoxy-2-(diethylphosphonomethoxy)ethan som en farveløs væske.

15 ml koncentreret saltsyre sattes på en gang til en opløsning af l-acetoxy-2-(diethylphosphonomethoxy)ethan (76,5 g, 300 mmol) i 600 ml 10 absolut ethanol og den resulterende blanding opvarmedes ved 55°C i 12 timer. Reaktionsblandingen afkøledes derefter til stuetemperatur og koncentreredes i vakuum. Den resulterende klare væske kunne anvendes uden yderligere rensning eller oprensedes ved destillation (1,5 mmHg, 128-132°C) til opnåelse af 52,1 g (82%) 2-diethylphopshonomethoxy-l-ethanol.

15 En opløsning af 2-diethylphosphonomethoxy-l-ethanol (40,7 g, 192 mmol) i 500 ml CHgCl2 afkøledes til 0°C, og derefter tilsattes tri-ethylamin (29,1 g, 288 mmol) på en gang, efterfulgt af dråbevis tilsætning af methansulfonylchlorid (26,4 g, 230 mmol) i løbet af 20 minutter. Reaktionsblandingen holdtes ved 0°C i \ time og udhældtes derefter i 20 vand. Den vandige fase ekstraheredes med to portioner CH^C^, og de kombinerede organiske faser tørredes over MgSO^, filtreredes og koncentreredes til opnåelse af 54,4 g (98%) l-methansulfonyloxy-2-(diethyl-phosphonomethoxy)ethan som er klar, svagt orangefarvet olie. Mesylatet kunne anvendes uden rensning eller oprensedes ved kolonnechromatografi 25 på silicagel (5% methanol i CHgClg).

*H NMR (200 MHz, CDC13) 6: 4,46-4,50 (m, 2H), 4,26 (kvintet, J=6,8 Hz, 4H), 3,92-3,99 (m, 4H), 3,20 (s, 3H) og 1,40 (t, J=7 Hz, 6H).

Eksempel 4 30 1-brom-4-(diethylphosphonomethoxy)butan

Til en omrørt opløsning af 49,5 g (323 mmol) l-brom-4-butanol og 27,8 ml 37% formaldehyd ved 0°C tilførtes langsomt vandfri hydrogen-chloridgas. Temperaturen holdtes ved -5°C under den langsomme tilførsel som strakte sig over 6 timer. Reaktionsblandingen fortyndedes derefter 35 med 500 ml EtgO og vaskedes 2 gange med 200 ml isvand. Den organiske opløsning tørredes (MgSO^) og inddampedes. Remanensen destilleredes (55-60°C/0,2 mm) til opnåelse af 29 g (45%) l-brom-4-(chlormethoxy)butan som en farveløs olie.

24 DK 170049 B1 h NMR (CDC13) 8: 5,51 (s, 2H), 3,71 (t, 2H), 3,49 (t, 2H), 1,98 (m, 2H), 1,80 (m, 2H).

Til en opslæmning af 6,26 g (149 mmol) 57% NaH og 300 ml n-pentan ved 0°C sattes 17,14 g (124 mmol) diethylphosphit og blandingen omrørtes 5 i 1 time ved 0°C. Derefter afkøledes blandingen til -70°C, og 25 g (124 mmol) l-brom-4-(chlormethoxy)butan tilsattes, og reaktionsblandingen opvarmedes til 0°C og omrørtes i 1 time. Derefter filtreredes blandingen og inddampedes. Remanensen rensedes ved Si02-chromatografi til opnåelse af 26 g (70%) l-brom-4-(diethylphosphonomethoxy)butan som en farveløs 10 olie.

h NMR (CDCI3) 8: 4,18 (m, 4H), 3,77 (d, 2H), 3,61 (t, 2H), 3,45 (t, 2H), 1,95 (m, 2H), 1,79 (m, 2H), 1,35 (t, 6H).

Eksempel 5 15 1-(di ethylphosphonomethoxy)-5-(methansulfonyloxy)pentan

Til en opløsning af 85,0 g (0,904 mol) 1,5-pentandiol og 30,3 g (0,30 mol) triethylamin i 350 ml tørt CH2C12 ved -20°C sattes dråbevist en opløsning af 28,5 g (0,25 mol) methansulfonylchlorid i 100 ml CH2C12 i løbet af 2 timer under nitrogenatmosfære. Opløsningen omrørtes i 2 20 timer ved -20°C og derefter ved -4°C i 18 timer. Reaktionsblandingen vaskedes med H20, 1 N HC1, HgO, tørredes så og inddampedes. Den olie-agtige remanens chromatograferedes på en si li cage!kolonne under eluering med EtOAc-CH2Cl2 (2:8). Efter kombinering af passende fraktioner opnåedes 25,7 g (56,5%) 5-hydroxypentylmethyl sul fonat som en farveløs 25 olie.

h NMR (CDC13) 8: 4,25 (t, J=6,2 Hz, 2H), 3,65 (t, J=5,4 Hz, 2H), 3,03 (s, 3H), 2,35 (s, IH) og 1,75-1,85 (m, 6H).

En blanding af 5-hydroxypentylmethyl sul fonat (18,2 g, 0,1 mol) og trioxan (3,6 g, 0,036 mol) i dichlorethan (30 ml) mættedes under afkø-30 ling (-10°C) med tørt HC1 i løbet af 2¾ time. Den resulterende blanding tørredes (MgSO^) og filtreredes og opløsningsmidlet afdampedes i vakuum.

Der opnåedes en hvid olie (24 g), som ikke kunne destilleres på grund af dekomponering, men som omsattes som urenset chlormethoxymellemprodukt.

lH NMR (CDC13) 8: 5,51 (s, 2H), 4,28 (t, J=5 Hz, 2H), 3,68 (t, 35 J=5,8 Hz, 2H), 3,02 (s, 3H) og 1,40-1,80 (m, 6H).

Natriumhydrid (6,16 g, 0,154 mol som en 50% oliedispersion, der forvaskedes med n-pentan) opslæmmedes i 100 ml n-pentan. Opløsningen afkøledes til 0°C og en opløsning af 20,34 g (0,147 mol) diethylphosphit i 25 DK 170049 B1 10 ml n-pentan tilsattes dråbevist i løbet af 20 minutter. Opslæmningen afkøledes til -78°C. Til denne kolde opslæmning sattes en opløsning af uomsat 5-chlormethoxy-l-methansulfonoxypentan (31,0 g, 0,134 mol) i 120 ml THF under kraftig omrøring. Efter afslutning af tilsætningen opvarme-5 des blandingen til -15°C i 2-3 timer. Den fortyndedes med 500 ml ethyl -acetat, vaskedes med H20, tørredes over MgSO^ og inddampedes til tørhed.

Den resulterende olie chromatograferedes gennem en sil icagelkolonne (10% EtOAc-CH2Cl2) til opnåelse af 22,5 g af en farveløs olie (47%).

*H NMR (CDC13) 8: 4,3 (m, 6H), 3,8 (d, 2H), 3,6 (t, 2H), 3,0 s, 3H) 10 og 1,4-1,8 (m, 12H).

II. Syntese af produkter

Eksempel 6 15 9-(2-(diethylphosphonomethoxy)eth,yl)guanin (la)

En blanding af 2-N-acetylguanin (6,47 g, 33,5 mmol), 2-(diethyl-phosphonomethoxy)-l-iodethan (9,80 g, 30,4 mmol) og kaliumcarbonat (8,41 g, 60,9 mmol) i 350 ml tørt DMF opvarmedes ved 100°C i 4 timer. Reaktionsblandingen afkøledes derefter til stuetemperatur og eventuelt uop-20 løseligt materiale fjernedes ved filtrering. Filtratet koncentreredes i vakuum til opnåelse af en viskos, gul olie, som rensedes ved kolonne-chromatografi på silicagel (5-10% methanol i CH2C12). Rekrystallisation af kombinerede fraktioner indeholdende det ønskede produkt fra ethyl-acetat gav ialt 1,50 g (13%) 2-N-acetyl-9-(2'-(diethylphosphonometh-25 oxy)ethylguanin som et hvidt krystallinsk faststof, smp. 140,5-141,5°C.

Analyse for C^H22Ng0gP*l/2H20:

Beregnet: C: 42,42%, H: 5,85%, N: 17,67%.

Fundet: C: 42,33%, H: 5,60%, N: 17,99%.

2-N-acetyl-9-(2-(diethylphosphonomethoxy)ethyl)guanin (1,42 g, 3,68 30 mmol) opløstes i 50 ml 40% vandig methylamin og opløsningen omrørtes ved stuetemperatur i 45 minutter. Reaktionsblandingen koncentreredes i vakuum og inddampedes 3 gange med toluen til opnåelse af et gummi agtigt, hvidt faststof. Det rå materiale omrørtes i 1 time i varmt ethyl acetat, afkøledes derefter til stuetemperatur og produktet opsamledes ved fi 1 -35 trering til opnåelse af 1,9 g 9-(2-diethylphosphonomethoxy)ethyl)guanin.

*H NMR (200 MHz, DMS0-dg) 8: 10,4-10,7 (brs, IH); 7,65 (s, IH), 6,46 (brs, 2H), 4,14 (t, 0=7 Hz, 2H), 3,99 (kvintet, J=6 Hz, 4H), 3,78- 3,89 (m, 4H), 1,20 (t, J=7 Hz, 6H).

26 DK 170049 B1 13C NMR (50,3 MHz, DMSO-dg): 156,7, 153,4, 151,1, 137,5, 116,3, 70,5, og 70,2, 65,4 og 62,2, 61,7 og 61,6, 42,1 og 16,2 og 16,1.

IR (KBr): 3200 (br), 3160, 3000, 1700, 1620, 1545, 1480, 1380, 1255, 1180, 1100, 1060, 1030, 900, 820, 795 cm'1.

5 Analyse for Cjg^ø^OjjP.l/^HgO:

Beregnet: C: 40,68%, H: 5,98%, N: 19,77%.

Fundet: C: 40,61%, H: 5,74%, N: 19,79%.

Eksempel 7 10 9-(2-(phosphonomethoxy)ethyl)guanin (Ic)

Bromtrimethylsilan (2,77 g, 18,1 mmol) sattes dråbevist i løbet af 2 minutter til en opløsning af 9-(2'-(diethylphosphonomethoxy)ethyl)-guanin (0,625 g, 1,80 mmol) i 15 ml tørt DMF ved stuetemperatur under argon i en foliedækket kolbe. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetem-15 peratur i 4 timer, og derefter fjernedes flygtige materialer i vakuum til opnåelse af en viskos, gul olie. Remanensen behandledes med 5 ml vand, hvilket gav omgående dannelse af et hvidt faststof. Yderligere 5 ml vand tilsattes efterfulgt af 10 ml acetone, hvorefter præcipitatet opsamledes ved filtrering. Det rå produkt rensedes ved rekrystallisation 20 fra vand/ethanol til opnåelse af 0,483 g 9-(2-(phosphonomethoxy)ethyl)-guanin som hvide krystaller, smp. >260°C.

h NMR (200 MHz, DMSO-dg) δ: 10,55 (brs, IH, ombyttelig), 7,70 (s, IH), 6,45 (brs, 2H, ombyttelig), 4,00-6,00 (br, m, ombyttelig), 4,12 (t, J=7 Hz, 2H), 3,80 (t, J=7 Hz, 2H) og 3,59 (d, J=8,8 Hz, 2H).

25 13C NMR (50,3 MHz, DMSO-dg): 157,0, 153,6, 151,3, 138,3, 116,1, 70,6 og 70,4, 68,0 og 64,8 og 42,6.

Analyse for CgH^NgOgP^H^:

Beregnet: C: 29,54%, H: 4,96%, N: 21,54%.

Fundet: C: 29,56%, H: 5,05%, N: 21,67%.

30

Eksempel 8 9-(2-(monoethylphosphonomethoxy)ethyl)quanin (Ib) 9-(2-(diethylphosphonomethoxy)ethyl)guanin (0,198 g, 0,57 mmol) opløstes i 15 ml 1 N natriumhydroxidopløsning og blandingen omrørtes ved 35 stuetemperatur i 1 time. Derefter forsyredes opløsningen med 10% vandig saltsyre til pH 1 og koncentreredes i vakuum. Resterende salte fjernedes ved reversfase kolonnechromatografi (C18 adsorbent, eluering med vand) til opnåelse af 0,150 g 9-(2-(ethylphosphonomethoxy)ethyl)guanin som et 27 DK 170049 B1 hvidt krystallinsk faststof, smp. 192,5-193,5°C.

*H NMR (200 MHz, DMSO-dg) 8: 10,6 (brs, IH), 7,69 (s, IH), 6,48 (brs, 2H), 4,12 (t, J=5,2 Hz, 2H), 3,89 (kvintet, J=7,2 Hz, 2H), 3,81 (t, J=5,2 Hz, 2H), 3,68 (d, J=8,6 Hz, 2H) og 1,15 (t, J=7,2 Hz, 3H).

5

Eksempel 9 9-(3-hydroxy-2-(phosphonomethoxy)propyl)quanin (Ic)

En suspension af 9-(2,3-dihydroxy)propylguanin (5,0 g, 0,022 mol) i tørt dimethyl formamid behandledes med 30 g (0,097 mol) p-anisyl diphenyl -10 chlormethan, 40 ml triethylamin og 0,5 g Ν,Ν-dimethylaminopyridin, og den resulterende blanding opvarmedes i 12 timer ved 80°C. Derefter afkøledes opløsningen, methanol (50 ml) tilsattes og de flygtige stoffer fjernedes i vakuum ved 70°C og 5 mm. Remanensen deltes mellem ethyl -acetat og vand, og de kombinerede ethyl acetatlag tørredes (MgSO^) og 15 koncentreredes i vakuum. Den resterende mørke olie chromatograferedes på silicagel under eluering med 1:1. ethylaceatrhexaner til opnåelse af 4,5 g (27%) af bis-monomethoxytrityl forbi ndel sen som et svagt orangefarvet skum, smp. 104-106°C (dek.).

En opløsning af ovennævnte bis-(monomethoxytrityl)forbindelse (3,0 20 g, 0,0039 mol) i tørt THF (30 ml) behandledes på én gang med NaH (0,311 g, 0,0041 mol, 60 vægt% i olie, Aldrich). Opløsningen omrørtes i 15 minutter ved stuetemperatur, behandledes så med tosyloxymethyldiethyl-phosphonat (1,50 g, 0,0046 mol, A. Holy, I. Rosenberg, Collect. Czech.

Chem. Commun. 1982, 47, 3447), og den resulterende blanding omrørtes i 25 12 timer ved stuetemperatur. Tyndtlagschromatografisk analyse af den rå blanding viste fravær af udgangsalkoholen (Rf = 0,4 i 1:1 ethylacetat:-hexaner) og nærvær af et enkelt polært produkt (Rf = 0,1 i samme).

Methanol (10 ml) tilsattes og de flygtige stoffer fjernedes i vakuum.

Den resterende olie opløstes i ethylacetat, overførtes til en silicagel-30 kolonne (ca. 3 x 300 cm) og elueredes med rent ethylacetat. Produktet opnåedes i 40 fraktioner, som kombineredes og koncentreredes i vakuum, hvilket gav 3,2 g 2-(N-(monomethoxytrityl)-9-((2-diethylphosphono-methoxy)-3-(monomethoxytrityloxy)propyl)guanin (90%) som et farveløst skum, smp. 78-80°C.

35 En opløsning af dette bis-(monomethoxy)trityldiethylphosphonat (1,5 g, 0,0016 mol) i 80% vandig eddikesyre (50 ml) opvarmedes forsigtigt på et dampbad i ½ time. Tyndtlagschromatografisk analyse viste fravær af udgangsphosphonatet, og tritanol-biprodukt og diethyl-HPMPG var de 28 DK 170049 B1 eneste tilstedeværende forbindelser. Det faste materiale, der opnåedes efter triturering tørredes ved inddampning med toluen og tørredes yderligere i vakuum i 2 timer. Det således opnåede råprodukt (la) (smp. 87-90°C) behandledes med 5 ml bromtrimethylsilan i tørt dimethyl formamid 5 (10 ml). Den resulterende lysegule blanding henstod ved stuetemperatur i 5 timer. De flygtige stoffer fjernedes så i vakuum, og vand (5 ml) efterfulgt af acetone (5 ml) tilsattes, og den uklare opløsning holdtes ved -20°C i 1 time. Det faststof, der dannedes opsamledes ved sugefiltrering, vaskedes med acetone og rekrystalli seredes fra vand/acetone til 10 opnåelse af 9-(3-hydroxy-2-(phosphonomethoxy)propyl)guanin som et offwhite faststof, smp. 185-190°C (dek.).

*H NMR (360 MHz, DMSO-dg) S: 7,72 (s, IH), 6,47 (brs, 2H), 4,15 (B del, ABq, J=3,5, 14 Hz, IH), 3,98 (A del, ABq, J=7, 14 Hz, IH), 3,67 (m, kompleks, IH), 3,62 (m, 5 linier, 2H), 3,37 (m, kompleks, 2H), 3,37 (m, 15 kompleks, 2H).

13C NMR (90 MHz, DMSO-dg): 156,72, 153,67, 151,31, 138,25, 115,83, 80,45 (Jc_0_c_p=10 Hz), 69,86, 66,39, 64,61 (ΰς p=160 Hz), 43,28.

Eksempel 10 20 8-brom-9-(2/-(phosphonomethox,y)ethy1 )quanin (Ic)

Brom (1 ml) sattes til 100 ml vand og blandingen omrørtes kraftigt ved stuetemperatur, indtil alt brom var opløst (15 minutter).

9-(2'-(diethylphosphonomethoxy)ethyl)guanin (0,360 g, 1,04 mmol) opløstes så i 10 ml H20 og behandledes dråbevist med den vandig brom-25 opløsning, indtil farven af Br2 forblev. Reaktionsblandingen henstod ved 0°C i 1 time og koncentreredes så til opnåelse af en mørkegul viskos gummi. Rensning udførtes ved kolonnechromatografi på silicagel (MeOH-CH2C12) til opnåelse af 0,31 g 8-brom-9-(2'-(diethylphosphonomethoxy)-ethyl)guanin som et orangefarvet pulver.

30 *H NMR (DMS0-d6) 8: 6,58 (brs, 2H), 4,12 (t, J=5 Hz, 2H), 3,95 (kvintet, J=7 Hz, 4H), 3,74-3,85 (m, 4H) og 1,17 (t, J=7 Hz, 6H).

13C NMR (50,3 MHz, DMSO-dg): 155,4, 153,7, 152,4, 120,9, 116,6, 69,7 og 69,5, 65,7 og 62,5, 61,8 og 61,6, 43,1 og 16,2 og 16,1.

Bromtrimethylsilan (0,47 g, 3,1 mmol) sattes dråbevist i løbet af 5 35 minutter ved stuetemperatur og under argon til en opløsning i 3 ml DMF af 8-brom-9-(2'-(phosphonomethoxy)ethyl)guanin (0,13 g, 0,31 mmol) i en foliedækket kolbe. Reaktionsblandingen omrørtes ved stuetemperatur i 4 timer og derefter fjernedes opløsningsmidlet og overskydende sil an i 29 DK 170049 B1 vakuum. Den resulterende orangefarvede olie behandledes med H20 og acetone til tilvejebringelse af et fint, bleggult faststof, som opsamledes ved filtrering. Faststoffet rensedes ved rekrystalli sering fra HgO/EtOH til opnåelse af 8-brom-9-(2,-(phosphonomethoxy)ethyl)guanin som 5 21 mg svagtgule krystaller.

*H NMR (200 MHz, DSM0-dg) S: 10,6 (brs, IH), 6,63 (brs, 2H), 4,10 (t, J=5 Hz, 2H), 3,79 (t, J=5 Hz, 2H) og 3,57 (d, J=8 Hz, 2H).

13C NMR (50,3 MHz, DMS0-dg): 155,4, 153,8, 152,4, 120,8, 116,7, 69,3 og 69,2, 68,2 og 65,0 og 42,9.

10

Eksempel 11 9-(3-(monoeth,ylphosphonomethox.y)propyl)guanin (Ib)

En opløsning af 9-(3-diethylphosphonomethoxy)-6-0-(methoxyethyl)-guanin (la, 417 mg, 1 mmol) i 10 ml 3 N HC1 opvarmedes ved 85°C i 3,5 15 timer. Opløsningsmidlet fjernedes under anvendelse af højvakuum til opnåelse af 400 mg af det glasagtige monoesterprodukt.

!H NMR (D20) S: 7,95 (s, IH), 4,38 (t, 2H), 4,15 (kvintet, 2H), 3,85 (d, 2H), 3,70 (t, 2H), 2,25 (m, 2H) og 1,30 (t, 3H).

20 Eksempel 12 9-(4-phosphonomethox.y)but,yl)adenin (Ic)

Til en opslæmning af 0,962 g (22,8 mmol) 57% NaH i 150 ml distilleret DMF sattes i en portion 3,363 g (24,9 mmol) adenin. Blandingen opvarmedes ved 80°C i 1 time og afkøledes derefter til 30°C, og 6,30 g 25 (20,7 mmol) 4-(diethylphosphonomethoxy)-l-brombutan tilsattes og blandingen opvarmedes til 60°C og omrørtes i 2 timer. Opløsningsmidlet fjernedes så under højvakuum og remanensen tritureredes 3 gange med 100 ml CHgC^ og filtreredes. De kombinerede filtrater inddampedes og rensedes ved SiOg-chromatografi til opnåelse af 4,9 g (66%) af produktet (la) som 30 et hvidt krystallinsk materiale, smp. 67°C.

*H NMR (CDClg) S: 8,25 (s, IH), 7,80 (s, H), 6,50 (s, 2H), 4,10 (m, 6H), 3,67 (d, 2H), 3,52 (t, 2H), 1,91 (m, 2H), 1,53 (m, 2H), 1,23 (t, 6H).

UV λ max (MeOH): 261 mm (e = 14,155).

35 Analyse for ci4H24N5°40:

Beregnet: C: 47,02%, H: 6,77%, N: 19,60%.

Fundet: C: 46,81%, H: 6,83%, N: 19,69%.

30 DK 170049 B1

Til en opløsning af 3,3 g (9,2 mmol) af produktet (la) i 75 ml destilleret DMF sattes 13 ml (90 mmol) bromtrimethylsilan. Opløsningen omrørtes ved 20°C i 5 timer og koncentreredes så i vakuum. Remanensen krystalliseredes fra 30 ml H20 til opnåelse af 2,5 g (90%) produkt (Ic) 5 som et hvidt, krystallinsk materiale, smp. 238°C.

*H NMR (D2) 8: 8,02 (s, IH), 8,00 (s, IH), 4,13 (t, 2H), 3,66 (m, 4H), 1,84 (m, 2H), 1,67 (m, 2H).

UV λ max (MeOH): 261 (e = 13,824).

Analyse for CigH^NgO^P: 10 Beregnet: C: 39,87%, H: 5,35%, N: 23,25%.

Fundet: C: 39,46%, H: 5,08%, N: 23,17%.

Eksempel 13 9-(4-(phosphonomethoxy)butylquanin (Ic)

15 Til en opslæmning af 560 mg (70 mmol) LiH i 200 ml destilleret DMF

sattes 8,0 g (41 mmol) 6-0-(methoxyethyl)guanin (J. Kjellberg, M. Liljenberg, N.G. Johannson, Tetrahedron Lett. 1986, 27, 877). Blandingen omrørtes ved 20°C i 1,5 timer, og derefter tilsattes 12,6 g (41,5 mmol) 4-(diethylphosphonomethoxy)-l-brombutan i 5 ml DMF og blandingen 20 opvarmedes til 60°C i 4,5 timer. Reaktionsblandingen afkøledes så til 10°C og behandledes dråbevist med fortyndet HC1 til pH 8. Derefter fjernedes opløsningsmidlerne under højvakuum og den rå remanens rensedes ved SiOg-chromatografi til opnåelse af 4,2 g af det 0-6-beskyttede guaninprodukt (la) som en lysegul olie.

25 !H NMR (CDC13) 8: 7,65 (s, IH), 4,92 (s, 2H), 4,66 (t, 2H), 4,15 (m, 6H), 3,81 (m, 4H), 3,62 (t, 2H), 3,45 (s, 3H), 1,96 (m, 2H), 1,62 (m, 2H), 1,35 (t, 6H).

En opløsning af 3,0 g (7,0 mmol) 6-0-(methoxyethyl)-9-(4-diethyl-phosphonomethoxy)butyl)guanin-mel lemprodukt (la) i 30 ml 6 N HC1 tilba-30 gesvaledes i 5,5 timer. Opløsningsmidlet fjernedes derefter under højvakuum og den glasagtige remanens opløstes i 3 ml H20 og fortyndedes med acetone indtil den blev uklar. Efter omrøring natten over opnåedes 1,6 g (73%) af det krystallinske produkt (Ic), smp. 240°C.

*H NMR (D20) 8: 7,813 (s, IH), 4,07 (t, 2H), 3,59 (m, 4H), 1,89 (m, 35 2H), 1,61 (m, 2H).

UV λ max (H20): 271 {e = 8494).

31 DK 170049 B1

Analyse for CjgHjgNgOgP:

Beregnet: C: 37,85%, H: 5,08%, N: 22,07%.

Fundet: C: 38,26%, H: 5,00%, N: 21,45%.

5 Eksempel 14 l-(4-phosphonomethoxy)butyl)thymin (la)

Til en opslæmning af 0,634 g (15 mmol) 57% NaH i 80 ml destilleret DMF sattes på en gang 2,07 g (16,4 mmol) thymin. Blandingen opvarmedes til 80°C i 1 time. Reaktionsblandingen afkøledes derefter til 60°C og 10 der tilsattes 4,15 g (13,7 mmol) 4-diethylphosphonomethoxy-1-brombutan og blandingen opvarmedes til 90°C i 1 time. Derefter fjernedes opløsningsmidlet under højvakuum, remanensen tritureredes 3 gange med 100 ml CHgClg og fraktionerne kombineredes og filtreredes. Remanensen rensedes ved SiOg-chromatografi til opnåelse af 2,2 g (46%) produkt (la) som en 15 farveløs olie.

*H NMR (CDC13) 5: 7,01 (s, IH), 4,07 (m, 4H), 3,52 (t, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,69 (m, 2H), 1,55 (m, 2H), 1,25 (t, 6H).

Til en opløsning af 2,0 g (5,75 mmol) diethylphosphonat (la) i 50 ml destilleret DMF sattes 7,6 ml bromtrimethylsilan. Opløsningen omrør-20 tes i 16 timer ved 20°C og opløsningsmidlerne fjernedes så under højvakuum. Den glasagtige remanens krystalliseredes fra H20-acetone til opnåelse af 810 mg (48%) hvidt krystallinsk produkt (Ic), smp. 140°C.

*H NMR (D20) 5: 7,46 (s, IH), 3,73 (t, 2H), 3,64 (d, 2H), 3,58 (t, 2H), 1,82 (s, 3H), 1,69 (m, 2H), 1,56 (m, 2H).

25

Ved anvendelse af ovennævnte eksempler, som kan modificeres på passende måde til fremstilling af et ønsket mellemprodukt eller en ønsket produktstruktur, hvilke modifikationer vil være nærliggende for fagmanden, kan der fremstilles andre eksempler på forbindelser omfattet 30 af den foreliggende opfindelse. Som det fremgår opnås monoesterforbin-delsen (Ib) og di syreforbindelsen (ic) let ud fra diester-forstadiet (la). Yderligere eksempler på forbindelser med formel (Ib) og (Ic), som fremstilles ved metoderne beskrevet i det foreliggende, er vist i tabel I og II. De tilsvarende (Ia)-analoge fremgår også implicit heraf.

35 DK 170049 B1 32 to ^ 'T h · £ 2 1 S 2 S 2 « ajsisssså

gjN<s<NM H fS

CO! U rt ft) tri *-« eil E a w w n w

S

1 a oafu—o o( w g η s « w w i

OJ

8 : ° i f f i i ί i · .O _ « J) 1 s ίΓ „r «l_o—«—o« ·< i B i i i i 1 ri X ^ « Λ * J* * cs H <sj M m PJ W tri

i X uf B n (S ,n D

tt Η ι o υ υ o o w < ' O'

Cl

H

Ό α

•H

fl Λ

Ti * S w ^ fteg «I o O o O o O § ·£ ® l S, c

Cn <υ *"* II il

O I

(tf Λ S 10 ^ CN f0 10 £ rt

3 Η Η N C* N

33 DK 170049 B1 - M « - U <D N · O ^ ·* — — <Ti I 0) Η ΙΛ « I ‘ '

ft J Irt N O

g Oi <7i (s S

W Η Η M W

tf

r rC

Λ

M

g O =acu—S *

I tf| W W W S

ΓΊ 8

‘ CH W W » W

0 - λΓ >T C*

_ h 5 R

φ « < I I I u

-Q <S

« ^ I X

*— HH

tf - o — c —c* * il « « « *

H

5 tf ώ f 8” tf B" .

«I O O O & c δ s S S 5 S o w 34 DK 170049 B1 III. Biologisk afprøvning Eksempel 54

Afprøvning og vurdering af forbindelser overfor Herpes virus 5 A. PIague-reduktionsforsøg

Stammer af Herpes simplex virus (HSV) dyrkedes og titeredes ved 37°C i vero-celler (nyreceller fra afrikansk grøn abe) og anvendtes til 10 virus-arbejde før 10. passage.

Celler dyrkedes og opbevaredes i Earle's minimum essentielt medium (EMEM), Gibco Laboratories, suppleret med 0,75% natriumbicarbonat, 2 mM

1-glutamin, Pen.-strep, og 5-10% føtalt kalveserum.

Titeren af HSV-stammer bestemtes ved en piaque-titreringsmetode 15 (Roizman & Roane, "Virology", 15:75-79, 1951). Vævkul turpetriskåle med 24 brønde podedes med celler og anvendtes til forsøg ved ca. 75% monolag. Volumener (0,1 ml) af logaritmiske fortyndinger af virusstammen podedes i brøndene, idet hver fortynding podedes i 3 brønde og absorberedes i 1 time under uregelmæssig omrystning. Derefter fjernedes podestof-20 fet og 1 ml 5-10% EMEM indeholdende 0,3% humant immunserumglobulin tilsattes. Efter inkubation i 48 timer ved 37°C i en 5% CO^ atmosfære fjernedes det overliggende medium, og cellelagene farvedes med Giemsa-farve. Antallet plaques taltes, gennemsnittet af hver tredobbelt bestemmelse beregnedes og antallet af plaque-dannende enheder pr. ml beregne-25 des.

Forbindelserne afprøvedes for aktivitet overfor Herpes simplex stammer under anvendelse af en frisk fremstillet stamopløsning af hver forbindelse. Passende fortynding af hver forbindelse foretoges i 10% EMEM før anvendelse. Den antivirale virkning af hver forbindelse be-30 stemtes under anvendelse af piaque-reduktionsforsøget beskrevet ovenfor. Vævskulturplader med 24 brønde og med ca. 75% cellemonolag podedes kort sagt med ca. 50 plaque-dannende enheder af HSV pr. 0,1 ml, og nævnte virus adsorberedes i 1 time under periodisk omrystning. Efter fjernelse af podestoffet tilsattes 1 ml 10% EMEM indeholdende dobbeltfortyndinger 35 af et passende lægemiddel under anvendelse af 3 brønde for hver fortynding. Tre brønde/plade modtog intet lægemiddel og anvendtes som viruskontrol. Efter inkubation i 48 timer ved 37°C i 5% COg atmosfære fjernedes det overliggende medium, cellerne farvedes som beskrevet ovenfor 35 DK 170049 B1 og plaques taltes. Gennemsnittet af hver tredobbelte bestemmelse beregnedes og antallet af plaques i nærvær af hver lægemiddelfortynding beregnedes.

Den antivirale styrke af lægemidlet beregnedes ved ID5q, den kon-5 centration af lægemiddel, der er nødvendig til reduktion af antallet af plaques med 50% af antallet i viruskontrol kulturer.

B. Ko!orimetrisk farveoptagelsesforsøg

Til primær screening anvendtes et kolorimetrisk farveoptagelses-10 forsøg (C. McLaren et al., "Antiviral Research", 3:323, 1983) under anvendelse af hurtigtvoksende vero-celler. I korthed anbragtes celler, forbindelse og virusfortyndinger samtidigt på vævskulturplader med 96 brønde under anvendelse af ovennævnte celler, vira og medium. Efter inkubation i 48 timer ved 37°C i en 5% COg atmosfære fjernedes det over-15 liggende medium og cellelagene farvedes med 0,04% neutral rød opløsning. Efter inkubation i 30 minutter ved 37°C vaskedes cellelagene og farven elueredes med 0,05 M natriummonophosphat i 47% methanol og den optiske densitet bestemtes ved en bølgelængde på 540 nm.

En 50% inhiberingsdosis (IDgg) for hvert lægemiddel bestemtes ved 20 lineær regressionsanalyse.

Eksempel 55

Afprøvning og vurdering af forbindelser overfor human cytomegalovirus Den humane cytomegalovirus (HCMV) stamme (AD169) dyrkedes og titre-25 redes ved 37°C i humane embryolungeceller (diploid) MRC-5, og anvendtes til antiviral forsøget.

Forbindelserne afprøvedes for aktivitet overfor HCMV under anvendelse af ovennænvte metode til plaque-reduktionsforsøg.

30 Eksempel 56

Afprøvning og vurdering af forbindelser overfor Murine retrovira

Forbindelserne vurderedes for antiviral virkning overfor Murine leukæmi vi russtammer (MuLV) under anvendelse af UV-XC-plaques-forsøg (Rowe et al., "Virology", 42:1136, 1970).

35 MuLV-stammerne dyrkedes i ferale museceller (SC-1) og benyttedes til antivirale tests under anvendelse af UV-XC-plaque-forsøg. SC-1-cel-ler dyrkedes som monolag i vævskulturplader med 4 brønde og podedes med ca. 50-100 plaque-dannende enheder af MuLV i 0,5 ml 5% EMEM indeholdende 36 DK 170049 B1 20 jLtg/ml DEAE/dextran. Efter adsorption i 1 time fjernedes podestoffet og 5 ml 5% EMEM indeholdende tredobbelte fortyndinger af et passende lægemiddel tilsattes. 5 dage senere UV-bestråledes kulturerne med en ultraviolet lampe, og rotte-XC sarcomaceller sattes til kulturerne. 3-4 5 dage efter UV-bestråling farvedes cellekulturerne med Giesma-farve og plaquene taltes. Antiviral aktivtet udtryktes som formindskelse af det gennemsnitlige antal UV-XC-plaques, der taltes i de lægemiddel behandlede, virusinficerede kulturer sammenlignet med det gennemsnitlige antal plaques optalt i ubehandlede, vi rusinficerede kontrol kul turer.

10 Nogle repræsentative antivirale forsøgsdata er anført i tabel IV.

% 37 DK 170049 B1

Tabel IV

Anti vi rale forsøgsresultater af nogle repræsentative forbindelser med formel (I) 5

Plaque-

Farveoptagelse antalsformlndskelse Mulv

Bef. forb. HSV-1 flSV-2 HSV-1 HSV-2 "

Acyclovir 0.5 1.0 0.3 1.5 N.T

9-(l,3-Dihydroxy- propoxymethyl) gutnin 1.2 a’-Azido-a’- deoxythymidin N.T. N.T. N.T. N.T. 0.0001 (S)*9*(3*Hydroxy- -2-phosphono- methoxy)propyl ftd«nln 15.1 > 25 13.8 35.8 0.13 2.0

Forbindelse med formel I

Eks. 7 <0.6 N.T. 0.1 0.36 <0.08 0.0009

Eks. 8 12 8 4.8 5.1 0.23 0.56

Eks*. 9 25 30.0 9.8 21.6 2.1

Eks. 15 8.7 10.4 3.0 3.3

Eks. 22 6.0 0.04

Eks. 34 <0.032

Eks. 45 1.5 3.8 1.6 1.2 0.05

Eks. 46 9.7 9.9

Eks· 47 74.9 34.8 1.72 N.T. = Ikke-afprøvet

Claims (8)

1. Phosphonomethoxyalkylenpurin eller -pyrimidi nderivat med den almene formel (I) B alk. i i R.-C-alk„-Q kik, 10 k 3 J CHo J 4 0"f"0R3 or4 15 hvor B er guanin, 8-bromguanin, 8-chlorguanin, 8-aminoguanin, 8-hydrazino-guanin, 8-hydroxyguanin, 8-methylguanin, 8-thioguanin, 2-aminopurin, 20 2,6-diaminopurin, 5-methylcytosin, 5-ethylcytosin, 2-N-acetylguanin og 6-0-methoxyethylguanin, al kp alk2 og alk^ uafhængigt er en kemisk binding eller Cj ^-alkylen, Q er hydrogen eller hydroxyl, Rj er hydrogen eller Cj^-alkyl, og

25 R3 og R^ uafhængigt er udvalgt blandt hydrogen, Cj_g-alkyl, phenyl og phenyl-Cj_4-alkyl en, og de tilsvarende salte, zwitterioner og/eller solvater deraf, bortset fra (RS) forbindelser, hvor B er guanin-9-yl, guanin-7-yl, 2-aminopurin-9-30 yl, 2,6-diaminopurin-9-yl, alkj er methylen, alk2 er methylen, Q er hydroxyl, alk3 er en kemisk binding, og Rp R3 og R^ er hydrogen, samt forbindelserne 9-(2-phosphonomethoxy)ethyl)guanin og 9-(2-(di ethyl -phosphonomethoxy)ethyl)guanin.

2. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at alkj er methyl, alk3 er en kemisk binding, og (a) Rj er hydrogen, alk2 er methylen, og Q er hydrogen, eller (b) Rj er methyl, alk2 er en kemisk binding, og Q er hydrogen. 39 DK 170049 B1

3. Forbindelse ifølge krav 1-2, KENDETEGNET ved, at B er 2,6-di-aminopurin eller 2-aminopurin.

4. Forbindelse ifølge krav 1-2, KENDETEGNET ved, at Rj og Q er 5 hydrogen.

5. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at R3 og R4 er hydrogen.

5 38 DK 170049 B1

6. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at en af R3 og R^ er hydrogen og den anden er Cj_g-alkyl.

7. Forbindelse ifølge krav 1, KENDETEGNET ved, at den er 9-(3-(phosphonomethoxy)propyl)guanin, 9-(4-(phosphonomethoxy)butyl)guanin, 8- 15 brom-9-(2-(phosphonomethoxy)ethyl)guanin, 9-(1-methyl-2-(phosphonomethoxy) ethyl )guanin, 9-(2-(phosphonomethoxy)-l-propyl)guanin, 9-(2-hydroxy-methyl-3-(phosphonomethoxy)propyl)guanin, 8-methyl-9-(2-phosphonometh-oxy)ethyl)guanin, 9-(4-hydroxy-3-(phosphonomethoxy)butylJguanin, 9-(2-(monoethylphosphonomethoxy)ethyl)guanin, 9-(2-(monomethylphosphonometh- 20 oxy)ethyl)guanin, 9-(2-(mono-n-propylphosphonomethoxy)ethyl)guanin eller 9-(2-(monoi sopropylphosphonomethoxy)ethyl)guanin.

8. Farmaceutisk præparat til antiviral anvendelse, KENDETEGNET ved, at det indeholder en virksom antiviral mængde af en forbindelse ifølge 25 krav 1 sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer. 30 35