DK169952B1 - DNA-sekvens, epidermalt udtrykkelsesmiddel, fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant polypeptid, plasmid og værtscelle, som er transformeret med DNA-sekvensen - Google Patents

Description

i DK 169952 B1

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt DNA-sekvens, som koder for et protein, som er fremmed for gær. Opfindelsen angår endvidere et plasmid omfattende DNA-sekvensen, fremstilling af et rekombinant polypeptid 5 og en værtscelle, som er transformeret med DNA-sekvensen.

Udviklingen af hybrid-DNA-teknologien har muliggjort fremstillingen af polypeptider med vidt forskellig sammensætning. Da alle levende organismer indeholder protei-10 ner og anvender dem til regulering af livsprocesser, vil metoder til duplikering af disse proteiner tilvejebringe enestående muligheder for at undersøge den måde, hvorpå proteinerne fungerer, samt at anvende sådanne proteiner, fragmenter af sådanne proteiner eller analoge heraf til 15 terapi eller diagnose.

Der er gjort mange fremskridt til forbedring af fremstillingshastigheden og mængden af protein, der fremstilles af en celle. De fleste af disse fordele har været knyttet 20 til et større antal delinger, mere effektive promotorer og midler til at reducere mængden af nedbrydning af det ønskede slutprodukt. Det er indlysende, at det vil være meget fordelagtigt at kunne producere og udskille ønskede polypeptider.

25 I mange tilfælde har det ønskede polypeptid ikke nogen terminal methionin-gruppe. Dette skyldes sædvanligvis, at der findes et processtyrende signal i gen-koden for det Ønskede polypeptid, som gen-kilden genkender og spalter 30 ved hjælp af en egnet peptidase. Da gener af særlig betydning i mange tilfælde er heterologe overfor værten, i hvilken genet udtrykkes, sker en sådan proces upræcist og i lavt udbytte i den pågældende vært. I sådanne tilfælde vil det dannede protein, selv om det er identisk med det 35 ønskede peptid for så vidt angår hele sekvensen, afvige ved N-terminus, hvilket kan have en skadelig virkning på den fysiologiske aktivitet.

DK 169952 B1 2

Der er derfor mange grunde til, at det er overordentligt hensigtsmæssigt at fremstille DNA-sekvenser, som kan kode for udskillelsen og modningen af polypeptidet. Hvor der * findes sekvenser for processen, som resulterer i f jernel-5 se af de for det ønskede polypeptid overflødige aminosy- * rer, er der endvidere mulighed for at have mange DNA-sekvenser, enten den samme eller forskellige, i tandem, som kan indkodes på en enkelt transskript.

10 I USA patent nr. 4 336 336 er beskrevet prokaryoter med en ledersekvens, der koder for et ikke-cytoplasmisk protein, som normalt transporteres til eller gennem celleoverfladen, hvorved fusionsproteinet overføres til det periplasmiske rum. I USA patent nr. 4 338 397 er beskre-15 vet prokaryoter, der anvender en ledersekvens, som muliggør sekretion med spaltning af ledersekvensen fra den ønskede polypeptidsekvens. I USA patent nr. 4 338 397, spalte 3 og 4, findes velegnede definitioner, der benyttes i det efterfølgende.

20

Kurjan and Herskowitz, Cell (1982) 30:933-943 beskriver en formodet alfa-faktor-precursor, indeholdende fire tandemkopier af moden alfa-faktor. Her beskrives sekvensen og postuleres en reaktionsmekanisme. Kurjan og Hersko-25 witz, Abstracts of Papers, fremlagt i 1981 ved et møde i Cold Spring Harbor om The Molecular Biology of Yeasts, page 242, et sammendrag med titlen "A Putative alfa-Fac-tor Precursor Containing Four Tandem Repeats of Mature alfa-Factor Precursor”, beskriver sekvensen, der koder 30 for alfa-faktoren og en spacer mellem to sådanne sekvenser. Biair et al., Abstracts of Papers, ibid, page 243, i et sammendrag med titlen: "Syntesis and Processing of

Yeast Pheremones: Identifikation and Characterization of Mutants That Produre Altered alfa-Factors", beskriver 35 effekten af forskellige mutanter til produktion af moden alfa-faktor. DNA-sekvensen ifølge opfindelsen har en gær-ledersekvens, proces-signaler til udformning af præ-pro- DK 169952 B1 3 polypeptidet som et modent polypeptid og et gen, som koder for et polypeptid, der er forskelligt fra vildtype-genet knyttet til den nævnte ledersekvens.

5 DNA-sekvensen ifølge opfindelsen omfatter et gen, der koder for et protein, som er fremmed for gær, og den er ejendommelig ved, at proteinets aminosyresekvens omfatter i det mindste et alfa-faktor-leder-sekvens-fragment, der muliggør sekretion, og som er knyttet til et heterologt 10 polypeptid, hvilket protein også indeholder proces-signaler, der genkendes af gæren, placeret mellem alfa-faktor-leder-sekvens-fragmentet og det heterologe polypeptid, til omdannelse af proteinet til det heterologe polypeptid.

15

Det episomale udtrykkelseselement ifølge opfindelsen er kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-sekvens, der indeholder et gen, som koder for et mammalt protein, fortrinsvis human epidermal vækst-faktor.

20 Værtscellen ifølge opfindelsen er transformeret med en DNA-sekvens af den omhandlede art.

DNA-strukturen ifølge opfindelsen har en sammensætning, 25 som illustreres af tegningen, hvor fig. 1 viser DNA-strukturen pYeEGF-21, fig. 2 viser sekvenserne efter fusion af hEGF til vekto-30 ren, idet a til e viser sekvenserne ved den N-terminale region af hEGF, som afviger fra flere strukturer, og f viser den C-terminale region af hEGF.

Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, 35 der er ejendommelig ved det i krav 12-23 anførte, anvendes gær til produktion af modne polypeptider, hvor sådanne polypeptider kan indhøstes fra et næringsmedium.

DK 169952 B1 4

Polypeptiderne produceres ved anvendelse af en DNA-sekvens , der koder for en gærledersekvens og proces-signaler, knyttet til et ønsket polypeptid, som kan være et * enkelt polypeptid eller flere polypeptider adskilt ved 5 proces-signaler. Strukturen koder for et præ-pro-polypep-tid, som vil indeholde signalerne for udskillelse af præ-pro-polypeptidet, og produktion af polypeptidet, enten intracellulært eller extracellulært for det modne polypeptid.

10

En DNA-struktur, som udtrykker et ønsket polypeptid, omfatter i det mindste en delsekvens med følgende formel: L-((R)r-(CAXYCX)n-Gen*) 15 hvor L er en ledersekvens, der sikrer udskillelsen af po-lypeptidet, R er CGX eller AZZ, kodonerne, som koder for lysin og arginin, idet R betegner ens eller forskellige grupper; 20 r er 2, 3 eller 4, fortrinsvis 2 eller 4; X er et vilkårligt af de fire nucleotider, T, G, C, eller A; Y er G eller C; y er et helt tal fra 1 til 10, sædvanligvis højst 4, til 25 opnåelse af monomere og multimere; Z er A eller G? og *

Gen er et gen forskelligt fra alfa-faktoren, sædvanligvis fremmed for gær-organismen og sædvanligvis et heterologt gen, hensigtsmæssigt et plante- eller animalsk gen; 30 n er 0, 1, 2, 3 eller 4, sædvanligvis 2 eller 3.

*

Pro-polypeptidet har et N-terminalt proces-signal for peptidase-fjernelse af de aminosyrer, som går forud for * aminosyrerne, som koder for Gene .

35

For størstedelens vedkommende vil den omhandlede DNA-sekvens have i det mindste følgende formel: DK 169952 B1 5 L-(R-S-(GAXYCX)n)-Gene*) som koder for et præ-pro-polypeptid, hvor alle symbolerne med undtagelse af L og S har den ovenfor angivne betyd-5 ning, S har samme betydning som R, der kan være et R og et S, og L er en ledersekvens, der sikrer udskillelse af præ-pro-polypeptid. Selvom der kan være flere R og S, således som det fremgår af det efterfølgende, vil der sædvanligvis ikke være fordele ved de yderligere aminosyrer.

10 Der kan anvendes en vilkårlig ledersekvens, som forårsager udskillelse, idet ledersekvenserne generelt indeholder 30-120 aminosyrer, sædvanligvis 30-100 aminosyrer, har en hydrofob region og har en methionin ved N-termi- nus.

15

Hvis n er 0, vil DNA-strukturen have følgende formel: L-((R)r,-Gene*)y 20 som definerer et præ-pro-polypeptid, hvori alle symbolerne har den ovenfor definerede betydning med undtagelse af r', der er 2 til 4, fortrinsvis 2 eller 4.

Af særlig interesse er ledersekvensen af alfa-faktor, som 25 er beskrevet i den ovenfor omtalte reference af Kurjan og Herskowitz, side 937, eller analoge fragmenter deraf, som sikrer effektiv udskillelse af de ønskede polypeptider.

Den i artiklen omtalte DNA-sekvens er ikke væsentlig, idet enhver sekvens, som koder for det ønskede oligopep-30 tid, er tilstrækkelig. Forskellige sekvenser vil være mere eller mindre effektivt gengivet.

Selv om ovennævnte formler foretrækkes, vil det forstås, at der i forbindelse med suppressor-mutanter kan forekom-35 me andre sekvenser, som resulterer i den ønskede funktion. Normalt er suppressor-mutanter ikke så effektive til udtrykkelse, og derfor foretrækkes den ovenfor angiv- DK 169952 B1 6 ne sekvens eller en ækvivalent sekvens, der koder for samme aminosyresekvens. I den udstrækning, at en mutant vil komme fra et andet kodon, udtrykke samme aminosyre, som er udtrykt ved ovennævnte sekvens, er en sådan alter-5 nativ sekvens tilladelig.

Dipeptidet, som indkodes ved hjælp af sekvensen i paran-tesen, vil være en sur aminosyre, såsom aspartinsyre eller glutaminsyre, fortrinsvis glutaminsyre, efterfulgt af 10 en neutral aminosyre, såsom alanin eller prolin, især alanin.

Velegnede DNA-sekvenser, der kan benyttes som kassetter for udtrykkelse, kan hensigtsmæssigt have følgende for-15 mel:

Tr-L((R-S)r„-(GAXYCX)n,-W-(Gene1)d) ) hvor: 20

Tr angiver en DNA-sekvens, der koder for transskriptio-nelle reguleringssignaler, især promotorer og sådanne andre reguleringssignaler som operatører, aktivatorer, stopsignaler, signaler til forøgelse af den ribosomale 25 binding, eller andre signaler der har en transskriptionel eller translationel kontrol at gøre. Tr-sekvensen vil generelt være på mindst 100 bp og ikke over 2000 bp. Særlig velegnede er anvendelsen af Tr-sekvensen, knyttet til ledersekvensen L, således at et DNA-fragment kan anven-30 des, som inkluderer transskriptionelle og translationelle 1 signalsekvenser, knyttet til ledersekvensen endogent med værten. I stedet kan der anvendes andre transskriptionelle og translationelle signaler til at fremkalde forbedret produktion af udtrykkelses-produktet? 35 d er 0 eller 1, og er 1 hvis y er større end 1; DK 169952 B1 7 n' er et helt tal, sædvanligvis 0-3 fortrinsvis 0, 2 eller 3; r" er 1 eller 2; 5 W angiver en terminal deoxyribosyl-3'-gruppe eller en DNA-sekvens, som alene eller når n’ eller forskellig fra 0, i kombination med nucleotidet, hvortil det er knyttet, definerer W et restriktionssted, som har enten kohæsiv 10 ende eller afstumpet ende, hvori W kan have fra 0 til 20 nucleotider i den længste kæde; og de resterende symboler har den ovenfor angivne betydning.

15 Af særlig interesse er følgende sekvens

(Tr) -L-(R-S) ,,-(GAXYCS) „GA AGCT

Q Γ XI

hvor alle symbolerne har den ovenfor angivne betydning; 20 a er 0 eller 1 med den betydning, at strukturen har eller ikke har de transskriptionelle og translationelle signaler; 25 den i den punkterede kasse indeholdte nucleotid ikke skal være tilstede, men må kunne tilføres ved tilsætning af et Hindlll spaltet terminus til genskabelse af sekvensen, der koder for et dipeptid; og 30 n" er 0 til 2, hvor mindst et af symbolerne Xs og Ys definerer et nucleotid, således at sekvensen i parantes er forskellig fra sekvensen GAAGCT. 1

Kodningssekvensen for Gene kan sluttes til terminalen T, 35 hvilket medfører, at kodningssekvensen er knyttet til initieringskodonet, og ved produktion vil den første aminosyre være den korrekte aminosyre for det modne polypep- DK 169952 B1 8 tid.

* 3'-Terminus af Gene kan manipuleres meget lettere, og det er derfor ønskeligt at have en struktur, som tillader * 5 indsætningen af Gene i et unikt restriktionssted i sekvensen, som derved vil være indført i rækken med initi-eringskodonet. En sådan sekvens kan symboliseres på følgende måde: 10 (Tr)a-L-(R-S)r„-(GAXYCS)n„-W-(SC)b«Te hvor alle symbolerne har den ovennævnte betydning; SC er stop-kodoner; 15

Te er en termineringssekvens, der er afbalanceret med promotoren Tr og kan omfatte andre signaler, f.eks. poly-adenylering; og 20 b er et helt tal, der generelt vil variere mellem 0 og 4 og sædvanligvis mellem 0 og 3, idet det vil forstås, at *

Gene kan inkludere dets egne stopkodoner.

Typisk for en sekvens med ovennævnte formel er en sådan, 25 hvor W er sekvensen GA og n" er 2.

Særlig hensigtsmæssigt er det, når sekvensen, der koder for terminal dipeptidet, sammen med W definerer en linker eller et forbindelsessted, som muliggør en genskabelse af 30 den terminale sekvens, der definerer dipeptidet af processignalet og koder for de initiale aminosyrer for *

Gene , således at kodonerne er i række med initierings- kodonet af ledersekvensen. Linkeren tilvejebringer en * forskudt eller stump termination, der hensigtsmæssigt de- 35 finerer et restriktionssted i forbindelse med de succes- * sive sekvenser for Gene . Ved ligering af linkeren med jp

Gene , vil kodonerne for Gene sidde i række med initi- DK 169952 B1 9 eringskodonet for ledersekvensen. På denne måde kan kan anvende en syntetisk sekvens, som kan være tilsluttet et restriktionssted i processignalsekvensen til at genskabe processignalet medens der tilvejebringes de initielle ba-* 5 ser af Gene , der koder for de N-terminale aminosyrer.

Ved at anvende en syntetisk sekvens kan den syntetiske linker være specielt udformet til at have et passende restriktionssted nær ved 3'-terminus, og den syntetiske linker vil således tilvejebringe de nødvendige kodoner 10 for 5'-terminus af genet.

I stedet kunne man indføre et restriktions-endonuclease genkendelsessted i medstrøm efter processignalet for at tillade spaltning og fjernelse af overflødige baser og k 15 muliggøre ligering af Gene til processignalet i rækkefølge med initieringskodonet. Således vil det første kodon kode for den N-terminale aminosyre af polypeptid.

*

Hvor T er den første base i Gene , kan man introducere et restriktionssted, hvor genkendelsessekvensen er indført i 20 rækken fra spaltningsstedet. F.eks. kunne en Sau3A-gen-kendelsessekvens indføres umiddelbart efter processignalet, hvilket ville muliggøre spaltning og sammenknytning * af Gene med dets initielle kodon i rækkefølge med leder-begyndelseskodonet.

25

Med restriktions-endonucleaser, som har genkendelsessekvenser fjernet fra og i række fra spaltningsstedet, f.eks. Hgal, kunne W definere en sådan sekvens, der kunne omfatte en del af processignal-sekvenserne. Andre struk-30 turer kan også anvendes, såsom primer-reparation og in vitro mutagenese for at tilvejebringe en hensigtsmæssig k indsætning af Gene i strukturen ved indføring af et passende restriktionssted.

35 Strukturen omfatter en flyttersekvens for indsætning i vektorer, hvilket tilvejebringer det ønskede replika-tionssystem. Som ovenfor angivet kan det i nogle tilfælde DK 169952 B1 10 være ønskeligt at erstatte vild-type promotoren, som er associeret med ledersekvensen, men en anden promotor. I gær kan de med enzymer involverede promotorer i den gly-colytiske bane tilvejebringe høj grad af transskription.

5 Disse promotorer er benyttet til sådanne enzymer som phosphoglucoisomerase, phosphofructokinase, phosphotri-ose-isomerase, phosphoglucomotase, enolase, pyrudruesyre-kinase, glycerylaldehyd-3-phosphat-dehydrogenase og alko-hol-dehydrogenase. Disse promotorer kan indsættes i ræk-10 ken opefter fra ledersekvensen. Vektorer kan fremstilles og kan omfatte promotorer med hensigtsmæssige restriktionssteder i række nedefter fra promotoren for indsætning af sådanne sekvenser som ovenfor beskrevet.

15 Den endelig struktur vil være et plasmid, der kan opretholdes stabilt i en vært, især en svamp, såsom gær. Strukturen vil omfatte et eller flere replikationssyste-mer, hensigtsmæssigt to replikationssystemer, der muliggør opretholdelse i en udtrykkelses-vært og klonen i en 20 prokaryot. Desuden vil en eller flere markeringer for udvælgelse være omfattet, hvilket vil muliggøre selektivt tryk for at opretholde plasmidet i værten. Endvidere kan plasmidet være til stede i et højt eller lavt reproduktionsantal, generelt i området 1 til 200. Med plasmider 25 med højt reproduktionsantal vil der generelt være mindst 10, fortrinsvis mindst 20, men sædvanligvis ikke over

150, mere sædvanlig ikke over 100 reproduktionsantal. I

* afhængighed af Gene kan enten høje eller lave reproduktionsantal være ønskelige, afhængigt af virkningen af 30 plasmidet i værten. Hvis tilstedeværelsen af udtrykkel- * sesproduktet af plasmidet kan have en skadelig effekt på værtens levedygtighed, kan et lavere reproduktionsantal være indiceret. * 35 Der kan anvendes forskellige værter, især mutanter med ønskede egenskaber. Det vil forstås, at der i afhængighed af produktionshastigheden for udtrykkelsesproduktet af DK 169952 B1 11 strukturen kan være procesenzymer, der har eller ikke har et passende produktionsniveau. Derfor kan der forekomme en mutant med forøget produktion af procesenzymet, eller forøget produktion af enzymet kan tilvejebringes ved 5 hjælp af episomal element. Generelt kan produktionen af enzymet være af en lavere grad end produktionen af det ønskede udtrykkelsesprodukt.

Hvis man anvender alfa-faktoren for udskillelse og pro-10 duktion, vil det være hensigtsmæssigt at sikre forbedret produktion af procesenzymet dipeptidyl-aminopeptidase A, der viser sig at være udtrykkelsesproduktet af STE13. Dette enzym synes at være specifikt for X-ala- og X-pro-sekvenser, hvor X i dette tilfælde forestiller en amino-15 syre, især dicarboxylsyre-aminosyre.

I stedet kan det forekomme, at intracellulær produktion ikke er ønsket. I så tilfælde vil det være nyttigt at benytte en stel3 mutant, hvor sekretion forekommer, uden at 20 produktet spaltes fra. På denne måde kan produktet i stedet produceres in vitro.

Det er hensigtsmæssigt at anvende værts-mutanter, som gør det muligt at kontrollere udtrykkeisen. F.eks. vil de om-25 handlede sekvenser, hvor et modent protein udtrykkes, have transformanter med langsom vækst, hvilket formentlig skyldes det modne proteins giftighed. Ved at inhibere udtrykkeisen under væksten kan værten således dyrkes til opnåelse af høj tæthed, før man ændrer betingelserne, så 30 udtrykkelse opnås.

En temperaturfølsom SIR mutant kan anvendes til at regulere udtrykkeisen. Mutation i enhver af SIR generne resulterer i en ikke-parret phenotype som følge af udtryk-35 kelsen in situ af de normalt hvilende MATa og MATa sekvenser, der er tilstede ved lokaliteterne HML og HMR.

DK 169952 B1 12 •k

Som allerede angivet vil Gene yderligere have en række sekvenser i tandem, enten ens eller forskellige sekvenser, med indgribende processignaler. På denne måde kan produktet dannet helt eller delvis med det resultat, at 5 der opnås forskellige sekvenser enten af sig selv eller i tandem for efterfølgende proces. 1 mange tilfælde kan det være ønskeligt at benytte forskellige sekvenser, hvor hver af sekvenserne er en underenhed af et særligt proteinprodukt .

10 *

Gene kan kode for ethvert ønsket polypeptid. Polypepti-det kan være så lille som et oligopeptid med 8 aminosyrer eller kan være på 100.000 daltons eller højere. Sædvanligvis vil enkelte kæder være mindre end ca. 300.000 dal-15 tons, mere sædvanligt mindre end 150.000 daltons. Af særlige betydning er polypeptider med 5000 til 150.000 daltons, især mellem 5000 og 100.000 daltons. Typiske polypeptider, som har kommerciel betydning, er hormoner og faktorer såsom væskthormon, somatomediner epidermal 20 vækstfaktor, de endocrine sekretioner, såsom luteinise-ringshormoner, thyroid-stimuleringshormoner, oxytocin, insulin, vasopressin, renin, calcitonin, follicle stimuleringshormoner, prolactin etc.; hematopoietiske faktorer, f.eks. erythropoietin, colon-stimuleringsfaktorer, 25 etc.; lymfokiner; globiner; globuliner, f.eks. immunoglo-buliner; albuminer; interferoner, såsom α", Æ" og r; re-pressorer; enzymer, endorfiner, f.eks. Ø-endorfine, enke-falin, dynorphin etc.

30 Når der er fremstillet plasmider indeholdende DNA-sekven-sen ifølge opfindelsen, kan man derefter indføre et sådant plasmid i en egnet vært. Den måde, hvorpå indførelsen sker, er konventionel, idet der er vidt forskellige måder at indføre DNA på in vært. F.eks. kan fremstilles 35 spheroplaster under anvendelse af metoder beskrevet af Hinnen et al., PNAS USA (1978) 75:-1919-1933 eller Stinch-comb et al., EP 0 045 573 A2. Transformanterne kan DK 169952 B1 13 derefter dyrkes i et passende næringsmedium, og det kan være hensigtsmæssigt at opretholde selektivt tryk på transformanterne. Hvis udtrykkeisen er inducibel, kan væksten af gæren foregå til høj tæthed, hvorefter udtryk-5 kelsen induceres. I sådanne tilfælde, hvor en væsentlig mængde af produktet kan opretholdes i de periplasmiske områder, kan produktet frigives ved behandling af gærcellerne med et enzym, såsom zymolase eller lyticase.

10 Produktet kan indhøstes på i og for sig kendt måde, idet proteinet renses ved kromatografi, elektroforese, dialyse, opløsningsmiddelekstraktion etc.

Ifølge den foreliggende opfindelse kan der tilvejebringes 15 sekretion af vidt forskellige polypeptider, således at der kan opnås et forbedret produktudbytte, forenklet rensning, minimal nedbrydning af det ønskede produkt og forenklet produktion, udstyr og teknisk udformning. Endvidere kan udnyttelsen af næringsmidler baseret på pro-20 duktivitet forbedres stærkt, således at mere økonomisk og effektiv produktion af polypeptider kan opnås. Endvidere har anvendelsen af gær mange fordele med hensyn til at undgå enterotoxiner, der kan forekomme i forbindelse med prokaryoter, og anvendelse af kendt teknik, som har været 25 udviklet for gær gennem lange tider, herunder metoder til isolation af gærprodukter.

Opfindelsen skal i det efterfølgende illustreres nærmere ved hjælp af nogle eksempler.

30

Eksperimentelle eksempler

Der fremstilles en syntetisk sekvens af human epidermal vækstfaktor (EGF), baseret på den aminosyresekvens, som 35 er rapporteret af H. Gregory og B.M. Preston Ing. J. Peptide Protein Res. 9, 107-118 (1977), og som har følgende sekvens: DK 169952 B1 14

51 AACTCCGACTCCGAATGTCCATTGTCCCACGACGGTTACTGTTTGCACGACGGTGTTTGT 3' TTGAGGCTGAGGCTTACAGGTAACAGGGTGCTGCCAATGACAAACGTGCTGCCACAAACA

Γ

ATGTACATCGAAGCTTTGGACAAGTACGCTTGTAACTGTGTTGTT'GGTTACATCGGTGAA 5 TACATGTAGCTTCGAAACCTGTTCATGCGAACATTGACACAACAACCAATGTAGCCACTT

*

AGATGTCAATACAGAGACTTGAAGTGGTGGGAATTGAGATGA

TCTACAGTTATGTCTCTGAACTTCACCACCCTTAACTCTACT, 10 hvor 5' angiver den promotor-tilgrænsende ende af sekven sen. Sekvensen var indsat i EcoRI-sædet på pBR328 til at producere et plasmid p328EGF-l og klonet.

Tilnærmelsesvis 30 ug af p328EGF-l blev omsat med EcoRI, 15 og tilnærmelsesvis 1 ug af det forventede 190 basepar

EcoRI-fragment blev isoleret. Dette blev efterfulgt af omsætning med restriktionsenzymet Hgal.

To syntetiske oligonucleotid-forbindelsesled Hindlll-Hgal 20 og Hgal-Sall blev derpå ligeret til 159 base-par Hgal fragment. Hgal-HindiII leddet havde følgende sekvens:

AGCTGAAGCT

CTTCGATTGAG

25

Denne linker genskaber alfa-faktor-processignaler, afbrudt af HindiII-digestion og forbinder Hgal-enden ved 5'-enden af EGF-genet til Hindlll-enden af pAB112.

30 Hgal-Sall linkeren havde følgende sekvens:

TGAGATGATAAG

ACTATTCAGCT

35 Denne linker har to stop-kodoner og forbinder Hgal-enden ved 3'-enden af EGF-genet til Sall-enden af pAB112.

DK 169952 B1 15

Det dannede 181 basepar-fragment rensedes ved præparativ gel-elektroforese og ligeres til 100 ng pAB112, som forud var helt omsat med enzymerne HindiII og Sall. Overraskende forekom en deletion, hvor kodonet for de 3. og 4. ami-5 nosyrer af EGF, asp og ser, var udeladt, idet resten af EGF opretholdtes.

pAB112 er et plasmid indeholdende et 1,75 kb EcoRI fragment med gær-alfa-faktor genet klonet ved EcoRl-sædet af 10 pBR322, hvori Hindlll- og Sall-stederne er udeladt (pABll). pAB112 afledtes fra plasmid ρΑΒΙΟΙ, som indeholder gær-alfa-faktorgenet som et partialt Sau3A-fragment klonet ved BamHi-sædet af plasmid YEp24, ρΑΒΙΟΙ opnåedes ved screening af en gær-genomisk database i YEp24 med en 15 syntetisk 20-mer oligonucleotid-prøve (3'-GGCCGGTTGGTTACATGATT-5')-homolog til den kendte alfa-faktor kodningsregion (Kurjan og Herskowitz, Abstracts 1981 Cold Spring Harbor meeting on the Mole cular Biology of Yeasts page 242).

20

Den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli HB101 cellerne og plasmid pAB201 blev opnået. Plasmidet pAB201 (5 ug) blev omsat helt med enzymet EcoRI, og de dannede fragmenter blev: 25 a) fyldt op med DNA-polymerase i Klenow-fragment, b) ligeret til et overskud af BamHI-forbindelser, og 30 c) omsat med BamHi. 1,75 kbp EcoRI-fragment blev isoleret ved præparativ gel-elektroforese og ca. 100 ng af fragmentet blev ligeret til 100 ng pCl/1, som forud var omsat helt med restriktionsenzymet BamHi og behandlet med alkaliphosphatase.

Plasmid pCL/1 er et derivat af pJDB219, Breggs, Nature (1978) 275:194, hvori regionet svarende til bakteriel 35 DK 169952 B1 16 plasmid pMB9 i pJDB219 er erstattet af pBR322 i pCl/1.

Denne blanding blev anvendt til at transformere E. coli HB191 celler. Transformanter blev udvalgt som ampicillin-resistente, og deres plasmider analyseredes ved restrik-5 tionsendonuclease. DNA fra en udvalgt klon (pYEGF-8) blev * fremstillet og anvendt til at transformere gær AB103 celler. Transformanter blev udvalgt efter deres leu+ phenotype.

10 50 ml kulturer af gærstammen AB103 (a, pep 4-3, leu 2-3, leu 2-112, ura 3-52, his 4-580) transformeret med plasmid pYEGF-8 blev dyrket ved 30 °C i et leu-medium til mætning (optisk densitet ved 600 nm på 5) og underkastet rystning ved 30 °C i yderligere 12 timer. Celle-supernatanter blev 15 opsamlet ved centrifugering og analyseret på nærværelse af human EGF under anvendelse af fibroblast-receptor-kom-petetionsbindingsprøven. Prøven for EGF er baseret på evnen til for både muse- og humant EGF at konkurrere med 125 I-mærkede muse EGF for bindingssteder på human for- 20 huds-fibroblaster. Standardkurver kan opnås ved måling af effekterne for stigende kvantiteter af EGF på binding af 125 en standardmængde af I-mærkede muse EGF. Under disse betingelser er 2 til 20 ng EGF let målelig. Detaljer om 125 binding af I-mærkede epidermal vækstfaktor for humane 25 fibroblaster er beskrevet af Carpenter et al., J. Biol.

Chem. 250, 4297 (1975). Under anvendelse af denne prøve har det vist sig, at dyrkningsmediet indeholder 7 + 1 mg humant EGF pr. liter.

30 Til yderligere karakterisation blev humant EGF i superna-tanten renset ved adsorption til en ion-bytterharpiks Biorex-70 og elueret med 10 mM HC1 i ethanol. Efter for-dampning af saltsyren og ethanolet blev EGF opløst i vand. Dette materiale migrerer som en enkelt hovedprote-35 infraktion af molekylvægt ca. 6000 i 17,5% SDS-geler, tilnærmelsesvis det samme for autentisk muse EGF (molvægt svarende til 6000). Dette viser, at alfa-faktor-lederse- DK 169952 B1 17 kvensen er passende afskåret under sekretionsprocessen. Analyse ved høj opløselighedsvæskekromatografi (mikrobon-dapak Cl8, Waters kolonne) indiceret, at produktet migre-rer med en retentionstid svarende til autentisk muse EGF-5 standard. En protein-rækkefølge bestemt ved Edman-ned-brydning viste dog, at N-terminus opretholdt glu-ala-se-kvensen.

Et antal andre sekvenser blev fremstillet under anvendel-10 se af forskellige konstruktioner for sammenbinding af hEGF til alfa-faktor-sekretorisk ledersekvens således, at der dannes forskellige processignaler og sted-mutagenese.

I fig. 2a til e. ses sekvensen af fusionen ved en N-ter-minelle region af hEGF, hvilken sekvens afviger for ad-15 skillige strukturer, f. viser sekvenserne ved C-terminal-regionen af hEGF, der er ens for alle strukturerne. Syntetiske oligonucleotid-linkere, der anvendes ved disse strukturer, er indsat i rammer.

20 Disse fusioner blev fremstillet som angivet i det følgende. Struktur (a) blev fremstillet som ovenfor beskrevet. Struktur (b) blev fremstillet på tilsvarende måde med den ændring, at linker 2 blev anvendt i stedet for linker 1. Linker 2 modificerer alfa-faktor-processignalet ved ind-25 sætning af endnu et processted (ser-leu-asp-lys-arg)

umiddelbart forud for hEGF-genet. Det dannede gær-plasmid kaldes pYaEGF-22. Struktur (c), hvori dipeptidyl-amino-peptidase-modningsstedet (glu-ala) er blevet fjernet, blev opnået ved in vitro mutagenese af sekvens (a). Pstl-30 Sall-fragment indeholdende alfa-faktorledersekvens-hEGF

fusion blev klonet i phage M13 og isoleret i en enstrenget form. En syntetisk 31-mer af sekvensen 5'-TCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCCG-31 blev syntetiseret, og 70 picomol blev anvendt som primer til syntese af den an-35 den streng fra 1 picomol af ovennævnte formel ved hjælp af Klenow-fragment fra DNA-polymerase. Efter indfyldning og ligering ved 14 °C i 18 timer blev blandingen behand- DK 169952 B1 18 let med S^-nuclease (5 enheder i 15 minutter) og overført til E. coli JM101 celler. Bakteriophag indeholdende DNA-sekvenser, hvori regionen, der koder for (glu-ala), var fjernet, blev placeret ved filterpladehybridisering under 32 4 5 anvendelse af -P-mærkede primer som prøve. RF DNA fra positive plader blev isoleret, omsat med PstI og Sall og det dannede fragment indsat i pAB114, som forud var omsat fuldstændig med Sall og partielt med Pstl og behandlet med alkaliphosphatase.

10

Plasmidet pAB114 blev fremstillet på følgende måde: plasmid pAB112 blev omsat helt med Hindlll og derefter genligeret ved lav (4 ug/ml) DNA-koncentration, og plasmidet pAB113 blev opnået, hvori 63 bp HindIII-fragmenter var 15 udeladt fra alfa-faktor strukturgenet, så der kun blev efterladt en enkelt kopi af moden alfa-faktor kodningsregion. Et BamHl-sæde blev sat til plasmid pABll ved spaltning med EcoRI, idet der blev fyldt op ved de overhængende ender med Klenow-fragment af DNA-polymerase, ligering 20 af BamHI-forbindelsesled, spaltning med BamHI og relige-ring til opnåelse af pAB12. Plasmid pAB113 blev omsat med EcoRI, de overhængende ender blev fyldt op, og der blev ligeret BamHI-linker. Efter omsætning med BamHI blev 1500 bp fragmentet gelrenset og ligeret til pAB12, som var om-25 sat med BamHI og behandlet med alkali-phosphatase. Plasmid pABI14, som indeholder et 1550 bp BamHI-fragment, indeholdende alfa-fraktor-genet, blev opnået. Det dannede plasmid (pAB114 med indhold af den ovennævnte sekvens fremstilles derefter med BamHI og ligeres til plasmid 30 pCl/1.

Det dannede gær-plasmid kaldes pYaEGF-23. Strukturen (d), hvori der var genereret et nyt Knpl-sted, blev fremstillet som beskrevet for sekvensen (c) med den ændring, at 35 den 36-mer oligonucleotid-primer af sekvensen 5'-GGGTACCTTTGGATAAAAGAAACTCCGACTCCGAAT-3' blev brugt.

Det dannede gær-plasmid er kaldt pYaEGF-24. Strukturen DK 169952 B1 19 (e) blev afledt ved omsætning af plasmidet der indeholder sekvens (d) med Kpnl og Sall i stedet for forbindelsesled 1 og 2. Det dannede gær-plasmid er kaldt pYaEGF-25.

5 Gærceller transformeret med pYaEGF-22 blev dyrket i 15 ml kulturer. Ved de angivne densiteter eller tider blev kulturen centrifugeret, og den ovenstående væske blev udvundet og holdt på is. Celleklumperne blev vasket i lysisbuffer (0,1 triton X-100, 10 mM NaHPO^, pH 7,5) og søn-10 derbrudt (5 min. med 1 min. intervaller under mellemliggende afkøling på is) i et rumfang lysis-buffer og et rumfang glaskugler. Efter centrifugering blev supernatan-ten opsamlet og holdt på is. Mængden af hEGF i dyrkningsmediet og celleekstrakterne blev målt under anvendelse af 15 fibroblast-receptorbindings-kompetetionsprøven. Standard kurver blev udarbejdet af målinger af effekterne af stigende mængder af muse EGF på binding af standardmængder 125 -1-mærkede muse EGF.

20 Proteinerne blev udvundet af dyrkningsmediet ved absorp tion på Bio-Rex 70 harpiks og eluering med 0,01 saltsyre i 80% ethanol og renset ved højtryksvæskekromatografi (HPLC) på en omvendt fase Cl8 kolonne. Kolonnen blev elu-eret med en strømningshastighed på 4 ml/min med en lineær 25 gradient på 5% til 80% acetonitril indeholdende 0,2% trifluoreddikesyre i 60 min. Proteiner (200-800 picomol) blev afskåret ved amino-terminal-enden ved Edman nedbrydningsmetoden under anvendelse af gas-fase protein-sequencer Applied Biosystems model 470A. Det normale PROTFA-30 program blev anvendt ved alle analyser. Dithiothreitol sattes til S2 (ethylacetat: 20 mg/liter) og S3 (butyl-chlorid: 10 ml/liter) umiddelbart før anvendelsen. Alle prøver blev behandlet med IN HC1 i methanol ved 40 °C i 15 min. til omdannelse af PTH-aspartinsyre og PTH-glut-35 aminsyre til deres methylestere. Alle PTH-aminosyre-iden-tifikationerne blev udført ved reference til retentionstider på en IBM CN HPCL-kolonne under anvendelse af kend- DK 169952 B1 20 te blandinger af PTH-aminosyre som standard.

Sekretion fra pYaEGF-22 gav et 4:1 molforhold af nativ N- c terminus hEGF til glu-ala-termineret hEGF, medens sekre-5 tion fra pYaEGF-23-25 kun gav nativt N-termineret hEGF. f.

Udbytter af hEGF varierede fra 5 til 8 ul/ml, målt enten som protein eller ved en receptor-bindingsprøve.

Stammen JRY188 (MAT sir3-8 leu2-3 leu2-112 trpl ura3 his4 10 rme) blev transformeret med pYaEGF-21 og leucin-prototro-fer udvalgt ved 37 °C. Mættede kulturer blev derefter fortyndet 1/100 i frisk medium og dyrket i leucin-selek-tivt medium ved tolerante (24 °C) og ikke-tolerante (36 °C) temperaturer og kultur-supernatanten blev prøvet for 15 tilstedeværelse af hEGF som ovenfor beskrevet. Resultaterne fremgår af efterfølgende tabel:

Reguleret syntese og sekretion af hEGF i transformert gær sir2 temperatur-sensitive mutanter 20 -

Temperatur Transformant O.D.650 hEGF ^g/ml) 36 °C 3a 3,5 0,010 5.4 0,026 25 3b 3,6 0,020 6.4 0,024 24 °C 3a 0,4 34 1.3 145 30 2,1 1075 4,0 3250 3b 0,4 32 1.4 210 2 2,2 1935 35 4,2 4600 21 DK 169952 B1

Disse resultater viser, at hybrid-alfa-faktor/EGF-genet udtrykkes under par-type-regulering selv om det er tilstede i form af et stort antal kopier i plasmidet.

5 Det er muligt at fremstille hidtil ukendte DNA-sekvenser, som kan indsættes i vektorer til opnåelse af udtrykkelse af polypeptider, der har en N-terminalledersekvens og et eller flere processignaler til at sikre sekretion af po-lypeptidet samt til at producere et modent polypeptidpro-10 dukt, der er fri for overflødig aminosyre. Således kan man gå et polypeptid med en identisk sekvens sammenlignet med naturligt forekommende polypeptid. Da polypeptidet desuden kan produceres i gær, kan der indføres glycogrup-per, således at produkterne kan fås identiske med natur-15 ligt forekommende produkter. Da produkterne er udskilte, kan der endvidere opnås væsentlig forbedrede udbytter baseret på celleformering, og fremstillingen og rensningen er stærkt forenklet.

20 25 30 35

Claims (24)

1. DNA-sekvens til indsætning i gærceller, hvilken DNA-5 sekvens omfatter et gen, der koder for et protein, som er * fremmed for gær, kendetegnet ved, at proteinets aminosyresekvens omfatter i det mindste et alfa-fak-tor-leder-sekvens-fragment, der muliggør sekretion, og som er knyttet til et heterologt polypeptid, hvilket pro-10 tein også indeholder proces-signaler, der genkendes af gæren, placeret mellem alfa-faktor-leder-sekvens-fragmen-tet og det heterologe polypeptid, til omdannelse af proteinet til det heterologe polypeptid.

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere indeholder en gær-promotor ved 5'-enden.

3. DNA-sekvens ifølge krav 1 eller 2, k en deteg-20 net ved, at det heterologe polypeptid er et mammalt protein.

4. DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at den har formlen: 25 •k 5'-Tr-L-Sp-Gene -Te-3' hvor Tr er en gær-promotor-sekvens, L koder for i det mindste et alfa-faktor-leder-sekvens-fragment, der mulig-30 gør sekretion fra gær, Sp er en spacer-sekvens, der koder for processignaler, der genkendes af gær, til omdannelse af precursor-polypeptidet, som er udkodet af L-Sp-Gene , «fe til dannelse af polypeptidet, som er udkodet af Gene , 9 * idet Gene koder for et for gær fremmed polypeptid, og Te 35 er en transskriptions-termineringssekvens, såsom et transskriptionelt termineringssignal, der er afbalanceret med Tr. DK 169952 B1

5. DNA-sekvens ifølge krav 4, kendetegnet ved, at Tr udgør en gær-alfa-faktor-promotor-sekvens.

6. DNA-sekvens ifølge krav 4 eller 5,ke nd eteg-5 net ved, at Sp indeholder sekvensen 5,-R1-R2-3' direkte knyttet til sekvensen Gene , R^ er et kodon for lysin eller arginin, R2 er et kodon for arginin, men koder ikke for et processignal for dipeptidylaminopeptidase A.

7. DNA-sekvens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at Sp er 5'-R^-R2-3', hvor R^ og R2 har den i krav 6 angivne betydning.

8. DNA-sekvens ifølge krav 4, 5 eller 6, k e n d e - * 15 tegnet ved, at Gene koder for et mammalt protein, fortrinsvis humman epidermal vækst-faktor.

9. Episomalt udtrykkelseselement, kendetegnet ved, at det omfatter en DNA-sekvens som angivet i krav 8 20 og et replikationssystem, som tilvejebringer stabil opretholdelse i en gær-vært.

10. Plasmid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det består af pYEGF8, ATCC nr. 20658. 25

11. Plasmid ifølge krav 9, kendetegnet ved, at det består af pYaEGF23, ATCC nr. 40079.

12. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant po-30 lypeptid, kendetegnet ved, at man tilvejebringer en gærvært, der er transformeret med en DNA-sekvens, som koder for et protein, der er fremmed for gær, hvilken protein omfatter i det mindste et alfa-faktor-leder-se-kvens-fragment, der muliggør sekretion og er knyttet til 35 et heterologt polypeptid, hvilket protein også indeholder processignaler, der genkendes af gæren, mellem alfa-faktor- leder- sekvens -fragmentet og det heterologe polypeptid DK 169952 B1 til omdannelse af proteinet til det heterologe polypeptid, at den nævnte transformerede gærvært dyrkes i et dyrkningsmedium under betingelser, hvor proteinet, der er fremmed for gær, udtrykkes i væsentlig grad og omdannes 5 til det nævnte heterologe polypeptid, som derpå udvindes i af dyrkningsmediet.

13. Fremgangsmåde til fremstilling af et rekombinant po-lypeptid ifølge krav 12 i en gærkultur under udskillelse 10 af polypeptidet i dyrkningsmediet, kendetegnet ved, at man dyrker en gærkultur, i hvis celler der er indført plasmider omfattende en DNA-sekvens som angivet i krav 4, under betingelser, hvor precursor-polypeptidet, som DNA-sekvensen koder for, udtrykkes i væsentlig grad 15 og udskilles i dyrkningsmediet, hvorpå det dannede heterologe polypeptid udvindes.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at Tr i den i krav 4 anførte formel er en gær-alfa- 20 faktor-promotor-sekvens.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at plasmidet indeholder den i krav 6 anførte DNA-sekvens. 25

16. Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at plasmidet indeholder den i krav 7 anførte DNA-sekvens.

17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13-16, * kendetegnet ved, at Gene koder for et mammalt polypeptid, fortrinsvis en epidermal vækstfaktor. ^

18. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13-16, 35 kendetegnet ved, at gæren er en AB103-stamme, ATCC 20658. DK 169952 B1

19. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid er et mammalt protein.

20. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet 5 ved, at gær-alfa-faktoren er en saccharomyces alfa-faktor.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at det heterologe polypeptid transformeres intracel- 10 lulært eller extracellulært til dannelse af et modent po-lypeptid, såsom væksthormon, somatomedin, epidermal vækstfaktor, insulin, renin, calcidonin, albumin eller interferon.

22. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 13, 15 eller Jc 17, kendetegnet ved, at det af Gene kodede polypeptid transformeres intracellulært eller extracellu-lært til dannelse af et modent polypeptid, såsom væksthormon, somatomedin, epidermal vækstfaktor, insulin, 20 renin, calcidonin, albumin eller interferon.

23. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 12-22, kendetegnet ved, at gæren er en AB103-stamme, ATCC 20658.

24. Værtcelle, transformeret med en DNA-sekvens ifølge ethvert af kravene 1, 4, 6 eller 7. 30 35