DK169519B1 - Analogifremgangsmåde til fremstilling af spiro-(fluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dioner eller farmaceutisk acceptable salte deraf - Google Patents

Description

i DK 169519 B1

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af spiro-(fluoren-9,4,-imidazolidin)-2l, 5'-dioner eller farmaceutisk acceptable salte deraf, hvilke forbindelser har den almene formel I

5 ««Y

hvor X er hydrogen, fluor, methylthio, methylsulfinyl eller methylsulfonyl og Y er fluor, methylthio, methyl sulfinyl eller 15 methylsulfonyl. De omhandlede forbindelser har aldoseredukta-seaktivitet og er nyttige til anvendelse inden for medicinkemien ved behandling af komplikationer, som opstår af diabetes mellitus, såsom grå stær og neuropati.

20 I diabetes mellitus er visse væv udsat for høje glucoseniveau-er. I øjets linse, nerver, nyre, retina og andre væv findes enzymet aldosereduktase. Sidstnævnte er hovedsagelig ansvarlig for reduktion af aldoser såsom glucose til en polyol så-__ som sorbit og galactose til galactit på bekostning af NADPH.

Akkumuleringer af polyoler såsom sorbit i diabetiske individer forårsager og/eller står i forbindelse med diabetiske komplikationer, herunder komplikationer af lentikular, retinal, neuronal og renal karakter. Disse komplikationer er i 30 almindelighed kendt som henholdsvis diabetisk grå stær, reti- nopati, neuropati og nefropati. Forhøjet mængde polyol såsom sorbit eller galactit i øjelinsen fører til grå stær og tab af linsens gennemsigtighed. Forhøjet mængde polyol såsom sorbit i de perifere nerver generer normal nervefunktion.

Aldosereduktasevirkning på forhøjet mængde glucose og/eller 3 5 2 DK 169519 B1 galactose er også medvirkende til at forårsage fortykkelse af vaskulaturens basalmembran som sådan i de retinale kapillarer og visse nyrevæv. Aldosereduktaseinhibitorer hæmmer virkningen af aldosereduktase. Aldosereduktaseinhibi-5 torer forhindrer derfor produktionen af polyoler, som di rekte eller indirekte fører til dannelse af grå stær, reduceret nerveledning/funktion og nogen diabetisk patofysio-logi af vaskulaturen.

Amerikansk patent nr. 3.821.383 beskriver 1,3-dioxo-lH-10 benz[d,3]isoquinolin-2(3H)-eddikesyre og derivater deraf som aldosereduktaseinhibitorer. Forskningen efter effektive antidiabetiske midler til at forhindre eller standse kroniske komplikationer såsom grå stær, neuropati og retinopati har endvidere vist, at specielle spiro-hydantoinforbindelser 15 er nyttige som aldosereduktaseinhibitorer.

Amerikansk patent nr. 4.117.230 beskriver en række spiro-hydantoinforbindelser, der indbefatter 6-fluor- og 6,8-di= chlorderivaterne af spiro- chroman-imidazolidindioner.

Amerikansk patent nr. 4.130.714 beskriver forøget aktivitet 20 af specielle højredrejende spiro-hydantoinforbindelser såsom d-spiro- (6-fluor-chroman-4,4 ' -imidazolidin) -2',5' -dion og d-spiro (6'-fluor-imidazolidin-4,4 '-thiochroman) -2,5 '-dion til forhindring af kroniske udvalgte diabetiske komplikationer.

25 De amerikanske patenter nr. 4.181.728 og 4.181.729 beskriver henholdsvis spiro-polycykliske imidazolidindionderivater og phenyl- eller phenoxysubstituerede spiro-imidazolidindion-derivater, der er nyttige til at hæmme den enzymatiske reduktion af aldoser, forhindre eller reducere skadelige og 30 uønskede akkumuleringer af polyoler i linsen og nerverne.

Methylthio- og methylsulfinyl-(også kaldet methylsulfoxyl) 3 DK 169519 B1 substituerede spiro-chroman-imidazolidindioner, der er genstand for en samtidig indleveret ansøgning, er også nyttige som aldosereduktaseinhibitorer. Hed hensyn til svovlholdige derivater i den foreliggende opfindelse kan et methylsulfinyl-5 derivat af spiro-(fluoren-9/4,-imidazolidin)-2',S'-dion bioomdannes in vivo til det tilsvarende mere aktive methylthio-derivat. Der kan være en omdannelse af sulfoxidet til sulfi= det med thioredoxinafhængige reduktaser og/eller beslægtede glutaredoxiner. Omvendt kan methylthioderivatet oxideres 10 af cytochrom indeholdende oxidoreduktaser til det tilsvarende methylsulfinylderivat. Disse indbyrdes omdannelser kan være stereospecifikke med hensyn til chiraliteten af det fremkomne sulfoxid. Andre sulfoxid- eller sulfinyllægemidler såsom Sulindac er blevet påvist at undergå disse bioomdannelser 15 som en funktion af mellemliggende metabolisme af lægemidlet.

Det antages derfor, at de in vitro mindre aktive methylsulfi= nylderivater vil udvise mere end den forventede in vivo aktivitet på grund af denne mellemliggende metabolisme.

2o Det har vist sig, at de hidtil ukendte forbindelser med form lerne 30 hvor x er hydrogen, fluor, methylthio, methylsulfinyl eller methylsulfonyl, og y er fluor, methyl thio, methylsulfinyl eller methylsulfonyl og farmaceutisk anvendelige salte deraf med farmakologisk acceptable kationer kan anvendes som aldose-35 reduktaseinhibitorer til regulering og forhindring af sorbit- niveauer i lårnerven og linsen hos diabetikere og til at reducere sorbitniveauer i linsen hos glucosemiske individer med deraf følgende regulering af diabetiske komplikationer, herunder diabetisk grå stær, neuropati, retinopati og nefro-pati.

4 DK 169519 B1

De farmaceutisk acceptable metalsalte kan fremstilles af de tilsvarende ikke-neutraliserede derivater under anvendelse af sædvanlige metoder. Behandling af et derivat med en vandig opløsning af det ønskede farmaceutisk acceptable metal= 5 hydroxid eller anden metalbase og inddampning af den frem komne opløsning til tørhed, i reglen under reduceret tryk, vil give saltet. Disse forbindelser er enestående sammenlignet med den kendte teknik derved, at de indeholder et tricyklisk ringsystem, som er stift og plant, i forbindelse med en heterocyklisk ring.

Den væsentlige forøgelse i aktivitet og styrke af de førnævnte tetracykliske spiro-hydantoinderivater sammenlignet med kendte forbindelser ved afprøvninger in vitro og in 15 vivo er uventet. Den kendte teknik indicerer ikke en sådan uventet forøgelse i aktiviteten og styrken af sådanne plane, stive tetracykliske spiro-hydantoinderivater. Endvidere er forbindelserne mere aktive in vitro og in vivo end materiale, der findes i den kendte teknik, og forventes at have egen- 20 skaber, som vil give nyttig human aktivitet og styrke in vivo. Flere af de kraftige symmetrisk substituerede derivater kræver endvidere ikke opspaltning, da de er achirale.

Det vil forstås, at disse tetracykliske spiro-hydantoinderiva-2 5 ter vil indeholde et asymmetri-centrum, hvis substitutions- mønsteret på ringene A og C ikke er symmetriske. Det er kendt for denne klasse molekyler, at en opspaltet forbindelse er kraftigere end en ikke-opspaltet forbindelse. En 2-fluor- substitution gør f.eks. molekylet asymmetrisk ved 9-stillin-30 gen i fluorenringen (det samme carbonatom kan også betegnes at være i stilling 4' i spiro-hydantoinringen D). En 2,7-difluor-, 3,6-difluor- etc. substitution resul terer i et symmetrisk molekyle,og derfor kræves der ingen opspaltning for at få en forøgelse i aktivitet og styrke.

Det har også vist sig, at tetracykliske spiro-xanthen-imid= azolidiner såsom spiro-(2,7-difluorxanthen-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion og spiro-(xanthen-9,41-imidazolidin)-21,5'-dion 35 5 DK 169519 B1 er uventet mindre aktive som aldosereduktaseinhibitorer og ikke ikke er så kraftige som de omhandlede tilsvarende tetracykliske fluorenforbindelser.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del anførte.

Udgangsmaterialerne for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse kan dannes ved at bringe en mono- eller di-10 aminofluoren til at reagere med fluorborsyre og natriumnitrit til dannelse af et mono- eller di-diazoniumfluorboratsalt, som efter dekomponering giver et mono- eller di-fluorfluoren, som derpå oxideres til ketonen, en mono- eller di-fluorfluor-enon, med oxygen under basiske betingelser. Alternativt kan 15 denne oxidation udføres ved en mere sædvanlig oxidationsmetode såsom med kaliumpermanganat i pyridin. Udgangsmaterialernes fremstilling kan illustreres som følger:

NeNOi \cz/\zJ X = F<H el.-NHj ^ * = F,Hel.N?BF4-

^ , Y fj 'y O», Tri ton B

/r\ KMn04

u (D

30

Z s H el. F

35 - X _ 6 DK 169519 B1

Ifølge dette generaliserede skema vil 2-amino fluor en give 2-fluorfluorenon. Denne keton vil ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen ved behandling med overskud af ammoniumcarbonat og kaliumcyanid i en alkohol, alkohol-og-vand eller acetamid 5 som opløsningsmiddel i en trykreaktor ved forhøjet temperatur give dl-spiro-(2-fluorfluoren-9,4'-imidazolidin)-2', 5'-dion. Et specielt eksempel på fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan illustreres som følger:

P

O «N-^·

KCN

(nh4),co, . \ /rF

δ y=i ©

Trin 1 i fremstillingen af udgangsmaterialet udføres hen-10 sigtsmæssigt i et vandigt opløsningsmiddel i kulden. Temperaturen er afgørende og skal reguleres til mindre end 10 °C, men over 0°C for at få et maksimalt resultat. I trin 2 skal de-komponeringen af diazoniumfluorboratsaltet udføres i et indifferent højtkogende opløsningsmiddel såsom xylener.

15 Omdannelse af fluorfluoren til ketonen i trin 3 opnås ved reaktion af et tetraalkyl- eller arylalkyl-trialkylammonium-hydroxid i et aprot basisk opløsningsmiddel såsom vandig pyridin med fluorfluorenen for at lette oxidation med oxy= gen. Oxygenet kan være atmosfærisk oxygen, men bedre resul-20 tater opnås ved at boble ren oxygen ind i reaktionsblandingen, hvilket udelukker kuldioxid, for at udvikle fluorfluore= nonen. Det fremkomne ketonprodukt kan renses ved destillation i vakuum. Ligesom i trin 1 er forholdet mellem reak- 7 DK 169519 B1 tionsdeltagerne til dannelsen af ketonen ikke afgørende, når blot der anvendes et overskud af oxidationsmiddel 5 ud over de ækvimolære mængder. Det foretrækkes at anvende et overskud af tetraalkyl- eller arylalkyltrialkylammonium= hydroxid for at lette en hurtigere oxidation. Temperaturen under denne eksoterme oxidation holdes fortrinsvis ved eller under pyridinets tilbagesvalingstemperatur.

io

Forholdet mellem reaktionsdeltagere er vigtigt ved syntesen af spiro-hydantoinproduktet ud fra fluorfluorenonen ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen. De bedste resultater fås, når molforholdet eller ækvivalenterne af kaliumcyanid og am- JL o moniumcarbonat er l,5x til 3x og 2x til 5x i overskud over den teoretiske mængde. Det foretrukne opløsningsmiddel er absolut ethanol, og reaktionen udføres ved forhøjede temperaturer under tryk. Andre polære opløsningsmidler, som ikke er ketoner eller estere, såsom acetamid eller ethanol fortyndet 20 „ med vand kan anvendes. Rensning kan opnås ved fortynding af reaktionsblandingen med syre, fortrinsvis fortyndet saltsyre, og opsamling af det rå bundfald af spiro-hydantoin. Den baseopløselige og dimethylformamidopløselige spiro-hydantoin kan renses ved en række behandlinger med aktiveret trækul, fil- 25 trering og genudfældninger.

Følgende fremstillinger L, Μ, P, Q, R, S, T og U belyser fremgangsmåden ifølge opfindelsen. 1 35 8 DK 169519 B1

Fremstilling L.

5 dl-spiro-(2-fluorfluoren-9,41-imidazolidin)-2',51-dion har formlen 15

Fluorborsyre (3000 ml, 48 - 50%) fortyndes med vand (1500 ml) og afkøles. 2-aminofluoren (Aldrich Chemical Co.) (543,7 g, 3 mol) i tetrahydrofuran (1500 ml) blev portionsvis under omrøring sat til den afkølede fluorborsyreopløsning (4500 ml).

20

Et lyserødt-brunt fast stof dannedes under tilsætningen. Blandingen blev omrørt, indtil den blev homogen og blev så afkølet til ca. 5°C med tøris i et acetonebad. En mættet vandig opløsning af natriumnitrit (300 g med vand til dannelse af 600 cm^ opløsning) blev tilsat dråbevis ved 3 - 8°C.

25

Efter tilsætningen blev blandingen omrørt i 1 time. Det uopløselige grønne produkt bley opsamlet ved filtrering og vasket med 5% fluorborsyre (3 x 200 ml), methanol (300 ml) , o Π 15% methanol i ether (5 x 200 ml), ether (5 x 200 ml) og derpå lufttørret natten over til dannelse af diazoniumsaltet (809 g, 97%), smeltepunkt 133 - 135°C under dekomponering. Diazoniumsaltet (800 g) blev suspenderet i xylener (3000 ml) under omrøring. Blandingen blev opvarmet til kogning. Da 9 temperaturen blev 100 C, udvikledes nitrogengas, og denne ud vikling døde hen, da temperaturen blev 135°C. Den kogende blanding blev filtreret varm gennem en Celite pude (et filter- 9 DK 169519 B1 hjælpestof af diatoméjord), og puden blev vasket med varme xylener (3 x 200 ml). De forenede filtrater blev inddampet i vakuum under varme til tørhed. Remanensen blev opløst i kogende hexaner (3000 ml), derpå filtreret gennem en filter-5 pude af Celite og Norite (neutraliseret trækul) og vasket med varme hexaner (400 - 600 ml) . De forenede hexanfiltrater blev så afkølet med tøris. Det fremkomne hvide bundfald blev opsamlet ved filtrering. Det samlede produkt blev vasket med kolde hexaner (200 ml), sugetørret og ovntørret ved 50°C 10 til dannelse af 2-fluorfluoren (380 g, 71,7%) med et smelte punkt på 97,5 - 98,0°C). Et andet produktudbytte blev opsamlet ved koncentrering af hexanmodervæsken, afkøling og opsamling af bundfaldet som før (totalt samlet udbytte 416 g).

15 2-fluorfluoren (824,7 g, 4,48 mol) blev opløst i pyridin (4 liter) og omrørt. En 40% opløsning af Triton B (100 ml benzyltrimethylammoniumhydroxid, 40% i pyridin efter den almene fremgangsmåde ifølge U.Sprinzak, J.Arner.Chem.Soc. 80 (1958), 5449)) blev tilsat, og oxygen blev boblet ind i den 20 kraftigt omrørte opløsning. Denne eksoterme reaktion løb i 20 timer, hvorefter en yderligere portion af Triton B-opløsningen (50 ml) blev tilsat under fortsat omrøring og oxygentilsætning i yderligere 24 timer. Den fremkomne mørkegrønne reaktionsblanding blev behandlet med Norite (100 g, 25 neutraliseret trækul), omrørt i 30 minutter og filtreret gennem en Celite pude (filterhjælpestof af diatoméjord) . Filterpuden blev så vasket med pyridin (1 liter). De forenede filtrater blev koncentreret til et lille rumfang i vakuum under varme. En 5% opløsning af saltsyre i vand 30 (1 liter) blev tilsat,og pyridinen blev azeotroperet i vakuum under varme. Denne proces blev gentaget, indtil ialt 6-8 liter vand var fordampet. Det kornede produkt blev filtreret og vasket med vand (4 liter) og lufttørret.

Det gul-orange produkt blev smeltet og destilleret gennem 35 et destillationsapparat med lang boring og kort vej (kogepunkt 167 - 170°C, 1,5 mm Hg) til dannelse i et afkølet 10 DK 169519 B1 * forlag af den klart gule 2-fluorfluorenon (600 g) med et smeltepunkt på 113 - 115°C, m/e+‘ 198 for C^H^FO.

2-fluorfluorenon (300 g, 1,52 mol), ammoniumcarbonat (420 g) 5 og kaliumcyanid (120 g, 1,84 mol) blev suspenderet i absolut ethanol (1,2 liter) i et 2 liter Parr trykreaktionsapparat af rustfrit stål. Den tillukkede beholder blev opvarmet til 95 - 100°C med mekanisk omrøring i 42 - 46 timer. Indholdet af den 2 liter beholder blev overført til vand (4 liter) .

10

Den gullige vandblanding blev gjort sur ved langsom tilsætning af koncentreret saltsyre (500 ml) til en pH-værdi på 2. Det fremkomne bundfald blev opsamlet ved filtrering, vasket med vand (4 liter) og sugetørret. Det fugtige faste stof blev delvis opløseliggjort med IN natriumhydroxid (1,5 liter) under omrøring. De uopløselige stoffer blev fjernet ved filtrering gennem et Celite filterhjælpestof og en pude af neutraliseret trækul til dannelse af en klar opløsning. Puden blev vasket med IN natriumhydroxid (1,0 li-ter). De forenede filtrater blev syrnet som før med koncentreret saltsyre (ca. 200 ml) til pH 2. Det hvide bundfald blev opsamlet ved filtrering, vasket med vand (4 liter) , sugetørret og vasket med ether (4 x 300 ml) . Det fugtige faste stof blev så tørret ved 100°C i 12 timer til dannelse af dl-spiro- (2-fluorfluoren-9,4' -imidazolidin) -2',51 -dion (301 g, 74,3%), og 284 g af dette produkt blev opløst i dimethylformamid (600 ml) ved 40°C. Norite (40 g, neutraliseret trækul) blev sat til opløsningen, og blandingen blev omrørt ved 45°C i 40 minutter. Blandingén blev filtreret 30 gennem en Celite pude, og filtratet blev fortyndet med vand (2 liter) . Det faste stof blev opsamlet ved filtrering og vasket med vand (500 ml) . Det fugtige faste stof blev opløst i IN natriumhydroxid (1 liter) og behandlet med Darco G-60 (Fisher Scientific-aktiveret trækul til kromato-35 graf i) og omrørt i 35 minutter ved 30°C. Blandingen blev filtreret gennem en omhyggeligt tilberedt Celite pude og vasket med IN natriumhydroxidopløsning (500 ml) og vand (1 li 11 DK 169519 B1 ter). De forenede filtrater (2,5 liter) blev neutraliseret med koncentreret saltsyre til pH 6,5. Det hvide bundfald blev opsamlet ved filtrering og vasket med vand, lufttørret og ovntørret ved 100°C i 24 timer til dannelse af (273 g) dl-spiro-(2-fluorfluoren-9,41-imidazolidin)-21,5'-dion.

. 5

En prøve af produktet, som var omkrystalliseret af ethanol, gav et smeltepunkt på 315°C under dekomponering, HRMS-analyse for beregnet 268,0648, iagttaget 268,0659, usikkerhed 1,1 mrryu/4,1 ppm) for C15HgFN202: beregnet 67,15% 10 C, 3,38% H, 10,45% N, 7,08% F, iagttaget 67,24% C, 3,56% H, 10,42% N, 7,22% F, iagttaget 67,17% C, 3,42% H, 10,41% N, 6,98% F, iagttaget 67,29% C, 3,47% H, 10,50% N, 7,27% F, iagttaget 67,26% C, 3,35% H, 10,41% N, 7,03% F. IR-spektrum: 3270 cm-1, N-H-strækning af 11° imid, 3170 cm \ N-H-strækning -i ? -1 15 af imid, 3050 cm , Sp , C-H-strækning, 1775 cm , C=0-stræk- ning af imid, 1715 cm"”1, C=0-strækning af imid og amid, 1610, 1590, 1495 og 1455 cm”1, uds traskkende bølge typer for aromatisk kulstof i planet, 1422 cm 1, N-H-bøjning i planet af II°-cyklisk amid, 868, 830 og 752 cm-1, deformation ude 20 af planet af aromatisk C-H. NMR-spektrum: delta 11,3 ppm: bred singlet, IH, imidproton, 8,7 ppm: bred singlet, IH, amidproton, 7,9 ppm: multiplet, 2H, aromatiske protoner, 7,4 ppm: multiplet, 5H, aromatiske protoner.

25 Fremstilling M.

Spiro- (2,7-difluorf luoren-9,4 ' -imidazolidin) -2^51 -dion har formlen 30 - 12 DK 169519 B1 og kan fremstilles af 2,7-difluorfluoren, som kan fås fra Alfred Bauer Library of Rare Chemicals. Alternativt kan 2.7- difluorfluoren fremstilles efter følgende fremgangsmåde: Til 2,7-diaminofluoren (Aldrich Chemical Co.) (4,98 g, 5 25,4 mmol) i tetrahydrofuran (90 ml) blev sat vand (25 ml) og fluorborsyre (48 - 50%, 50 ml). Der dannedes en tyk pasta af fluorboratet. Under omrøring og afkøling (5°C) blev en mættet vandig opløsning af natriumnitrit (5 g) tilsat dråbevis, idet temperaturen blev holdt på 5 - 10°C. Efter tilsæt-1Q ningen blev blandingen omrørt i 10 minutter og filtreret og vasket med 5% fluorborsyre, methanol og derefter ether. Det tørrede produkt, bis-diazoniumsaltet, dekomponerede ved 127°C. Saltproduktet blev så blandet med kogende xylener (50 ml) og opvarmet i 30 minutter til dannelse af et mørkt 15 tjæreagtigt materiale (5,1 g). Tjæren blev isoleret og tritureret med ether. Etheren blev afdampet, og produktet, 2.7- difluorfluoren, blev omkrystalliseret af ethanol, 3,9 g, smeltepunkt 80 - 82,5°C. 2,7-difluorfluorenen (2 g, 10 mmol) blev opløst i pyridin (30 ml) ,og kaliumpermanganat (1,58 g) 20 blev tilsat og omrørt ved stuetemperatur natten over. Reak tionsblandingen blev fortyndet med vand og derefter syrnet med 5% HC1. Det faste stof blev filtreret og vasket med vand. Det faste stof blev suspenderet i 100 ml vand, og en opløsning af mættet natriurabisulfit og koncentreret saltsyre 25 (7,27 g NaHS03, 6,90 g koncentreret HC1) blev tilsat, og blandingen blev omrørt i 30 minutter. Det faste stof blev samlet ved filtrering og derefter opløst i ether og filtreret igen. Det ether-ekstraherede ketonprodukt, 2,7-difluor= + fluorenon (0,9 g), gav m/e * 216.

30 2.7- difluorfluorenon (43,2 g, 0,2 mol), KCN (16,93 g, 0,26 mol), ammoniumcarbonat (40,59 g, 0,52 mol) og alkohol blev bragt til at reagere ved 90 - 110°C i 71 timer. Oparbejdningen af hydantoinen var i overensstemmelse med fremstilling 35 L. Omkrystallisation af det sure uopløselige produkt af methanol og acetone blev efterfulgt af en opløseliggørelse i bas.e og syreudfældning, som gav spiro-(2,7-difluorfluoren- 13 DK 169519 B1 9 ,4'-imidazolidin)^',5'-dion (32,8 g, 0,115 mol), m/e+* for C^,-HgF2N202, smeltepunkt 327 - 329°C under dekomponering. Beregnet: 62,94% C, 2,82% H, 13,28% F, 9,79% N, fundet: 62,78% C, 2,86% H, 13,05% F, 9,62% N.

5 Fremstilling P.

dl-spiro-(2-methylthiofluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion har formlen 10 ..

og kan fremstilles som følger: 20 Ketonen, 2-methylthiofluorenon, blev fremstillet ved at su spendere natriumhydrid (14,4 g af en 50 vægt% mineraloliedispersion, 0,30 mol) i vandfri dimethylformamid (400 ml).

Til denne omrørte suspension under en argon-atmosfære blev sat methylmercaptan som en gas. Efter at opløsningen 25 var mættet med methylmercaptan, og natriumhydridet havde reageret, blev den gule 2-fluorfluorenon (30 g, 0,15 mol) tilsat i én portion. Den fremkomne røde opløsning blev opvarmet i 4 timer til 60 - 80°C. Vand (50 ml) blev tilsat, og opløsningsmidlet blev fjernet under opvarmning og reduce-30 ret tryk. Den røde rest blev opløst i ethylacetat (500 ml) og ekstraheret med 0,1N natriumhydroxid (3 x 200 ml). Disse ekstraktioner blev fulgt af vask med 0,1N saltsyre (200 ml) og vand (3 x 200 ml). Den gul-orange ethylacetatopløsning blev så behandlet med aktiveret trækul og vandfrit natrium= sulfat. Efter filtrering blev ethylacetatopløsningen inddam-O o pet under reduceret tryk og opvarmning til dannelse af et orange stof, der blev tritureret med varme hexaner (200 ml) DK 169519 Bl 14 og derpå fik lov at afkøle. Ketonen blev opsamlet ved filtrering (31,1 g, 91%), og produktet havde et smeltepunkt på 85°C (rapporteret 84 - 85°C af J.A.Parry & K.D.Warren, J.Chem. Soc. 1965, 4049-4054). PMR (CDC13, TMS): delta 2,4 (3H, methyl singlet), delta 6,95-7,7 (7H, aromatisk multiplet), m/e+* 226 for C14H1()OS.

S

Ketonen (22,6 g, 0,10 mol), KCN (13 g, 0,20 mol), ammonium= carbonat (30 g) og absolut ethanol (ca. 120 ml) blev opvarmet i en 200 cm trykreaktor af rustfrit stål i 15 timer til 105°C. Efter afkøling blev indholdet vinder omrøring hældt 10 3 på is (200 cm ) og 5N saltsyre (100 ml). Den fremkomne orange suspension blev så opsamlet ved filtrering på sintret glas. Derefter blev IN natriumhydroxid (250 ml) filtreret under omrøring gennem det opsamlede faste stof. Det klare orange filtrat blev så udfældet med koncentreret saltsyre og opsamlet. Det lufttørrede bundfald blev opløst i varm dimethyl= formaraid (100 ml) . Opløsningen blev behandlet med Darco G-60 (aktiveret trækul, forhandlet af Fischer Scientific Products, til kromatografi, 4 g) og filtreret ved hjælp af 3 filterhjælpestoffet Celite. Vand (400 ml) og is (100 cm ) 20 blev sat til filtratet og udfældede et urent hvidt fast stof.

Det opsamlede bundfald blev så genopløst i IN natriumhydroxid og behandlet som før med Darco G-60, Efter syrning blev det fremkomne hvide bundfald samlet og vasket grundigt med vand og tørret ved 100°C i en vakuumovn til dannelse af dl-spiro-(2-methylthiofluoren-9,4'-imidazolidin)-21,51 - dion (18,6 g, 63%) med et smeltepunkt på 299 - 300°C under dekomponering. HRMS for cigHi2N202S: t>ere9net 296,0619, iagttaget 296,0626, usikkerhed 0,7 mmp/2,4 ppm. PMR (DMSO-30 d6, TSP): delta 2,47 (3H, methyl), delta 7,0-8,8 (9H, aromatisk og hydantoin multiplet). Elementær analyse: beregnet 64,85% C, 4,08% H, 9,45% N, 10,82% S, fundet 64,89% C, 4,12% H, 9,44% N, 10,95% S.

35 DK 169519 B1 15

Fremstilling Q.

Spiro-[2-(R,S)-methylsulfinylfluoren-9-(R,S)-4'-imidazolidin] -. 5 2',5'-dion har formlen o « CH--S.

og den uopspaltede diastereomere blanding af de fire stereo= isomere [(R,R)(R,S)-,(S,S)(S,R)-isomere] kan fremstilles som følger:

Hydantoinproduktet fra fremstilling P (3,0 g, 10 mmol) blev suspenderet i 50% acetone og vand (100 ml),og natriummeta= 20 perjodat (2,25 g, 10,5 mmol) bley tilsat. Denne blanding blev omrørt ved omgivelsernes temperatur i 72 timer, hvorefter 100 ml IN saltsyre blev tilsat, og suspensionen blev filtreret og vasket grundigt med vand. Det fremkomne faste stof blev opløst i IN NaOH (25 ml) , filtreret, og filtratet blev 25 syrnet med koncentreret saltsyre. Filtrering og vask med vand gav et hvidt produkt (2,6 g, ved tørring ved 100°C) med

et smeltepunkt på 284 - 286°C under dekomponering. HRMS

for beregnet 312,0568, iagttaget 312,0565, usikkerhed 0,3 πιιημ/1,0 ppm. PMR (DMSO-d6, TSP) : delta 2,84 30 (3H, methyl singlet), (9H, lavt felt, aromatisk og hydantom multiplet).

Fremstilling R.

dl-spiro-(2-methylsulfonylfluoren-9,4'-imidazolidin)-21,5'-dion har formlen 35 16 DK 169519 B1 og kan fremstilles som følger: 10

Hydantoinproduktet fra fremstilling P (3,0 g, 10 mmol) blev suspenderet i 50% acetone og vand (100 ml), og natriummeta= perjodat (6,42 g, 30 mmol) blev tilsat. Denne blanding blev opvarmet under tilbagesvaling og omrøring i 15 timer, hvor- 15 3 efter der blev tilsat 100 ral IN saltsyre og 100 cm is.

Suspensionen blev filtreret og vasket grundigt med vand og lufttørret, yderligere tørring i vakuumovn ved 100°C gav et hvidt fnugget produkt (3,1 g) med et smeltepunkt på O Π 309 - 311°C under dekomponering. HRMS for cigH12N2°4S: beregnet 328,0518, iagttaget 328,0527, usikkerhed 0,9 mmja/ 2,7 ppm. PMR (DMS0-d6), TSP): delta 3,30 (3H, methyl singlet), (9H, lavt felt, aromatisk og hydantoin multiplet).

25

Fremstilling S.

dl-spiro-(1-fluorfluoren-9,41-imidazolidin)-2',5'-dion har formlen 30 „ cg" 17 DK 169519 B1 og kan fremstilles som følger: 1-fluorfluorenon blev fremstillet af 1-aminofluorenon (Pfaltz & Bauer, Inc.) ved fremgangsmåden ifølge T.L.Fletcher & M.J.

5 Namkung, Chemistry and Industry, 11.februar 1961, side 179- 180, og gav et ketonprodukt med smeltepunktet 109 - 110°C, m/e+* 198 for C^HyFO.

1-fluorfluorenon (3,96 g, 20 mmol), KCN (1,95 g, 30 mmol), 1° ammoniumcarbonat (4,8 g) og 100% ethanol (100 ml) blev bragt til at reagere, og et produkt (2,8 g) blev opsamlet som ved fremstilling L, hvilket produkt havde et smeltepunkt på 338 -341°C under dekomponering. HRMS for : beregnet 268,0648, iagttaget 268,0653, usikkerhed 0,5 mmju/1,9 ppm.

15

Fremstilling T.

dl-spiro-iS-fluorfluoren^^'-imidazolidin)^' ,5'-dion har 20 formlen 30 og kan fremstilles som følger: 3-fluorfluorenon blev fremstillet af 3-aminofluorenon ved fremgangsmåden ifølge T.L.Fletcher & M.J.Namkung, Chemistry and Industry, 11.februar 1961, side 179-180, og T.L.Fletcher 3 5 m.fl., J.Org. Chem. 25 (1960), 1342, og gav ketonproduktet med et smeltepunkt på 129°C, m/e+' 198 for Ο^Η^ΡΟ. Frem- 18 DK 169519 B1 stillingen af spirohydantoinen var iøvrigt som i fremstilling L, udbytte 3,1 g af det fremkomne produkt med et smeltepunkt på 328 - 332°C under dekomponering. HRMS for beregnet 268,0648, iagttaget 268,0653, usikkerhed 0,5 mrnju/ 5 1,9 ppm.

Fremstilling U.

^ o dl-spiro- (4-f luorf luoren-9,4 ' -imidazolidin) -2 ', 5' -dion har formlen ^ 20 og kan fremstilles som følger: 4-fluorfluorenon blev fremstillet af 4-aminofluorenon (Pfaltz & Bauer, Inc.) ved fremgangsmåden ifølge T.L.Fletcher & M.J. Namkung, Chemistry and Industry, 11.februar 1961, side 179-25 180, og gav ketonproduktet med et smeltepunkt på 160 - 162°C, m/e+* 198 f or:j C-^H^FO. Fremstillingen af spirohydantoinen var iøvrigt som i fremstilling L (udbytte 3,0 g), og det fremkomne produkt havde et smeltepunkt på 330 - 333°C.

HRMS for C^HgF^C^: beregnet 268,0648, iagttaget 268,0660, 3Q usikkerhed 1,2 πιιημ/4,5 ppm.

Fremstilling af dl-spiro- (1,7-dif luor f luoren-9,4' -imidazolidin) -2^51 -dion, dl-spiro- (2,5-dif luorf luoren-9,4 1 -imidazolidin) -2^51 -dion, 35 dl-spiro- (2,6-difluorfluoren-9,4 '-imidazolidin) -2^51 -dion, 19 DK 169519 B1 spiro- (2-fluor-7-methylthio£luoren-9,41-imidazolidin) -2',5'-dion og spiro-(2-fluor-7-methylsulfinylfluoren-9,4 1 -imidazolidin) -2' ,5'-dion: 5 dl-spiro-(1,7-difluorfluoren-9, 4 '-imidazolidiri) -2 ’ ,5 '-dion kan fremstilles af 1-fluorfluoren.

dl-spiro-(2,5-difluorfluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion kan fremstilles af 4-fluorfluoren.

10 dl-spiro- (2,6-difluorfluoren-9,4' -imidazolidin) -2 ',51 -dion kan fremstilles af 3-fluorfluoren.

Disse fluoren-forstadier, 1-fluorfluoren, 4-fluorfluoren 15 og 3-fluorfluoren, kan fremstilles ved Schiemann-reaktionen af de tilsvarende aminer, 1-aminofluoren, 4-aminofluoren og 3-aminofluoren, efter fremgangsmåden ifølge T.L.Fletcher & M.L.Namkung, Chemistry and Industry, 11.februar 1961, side 179-180. De fremkomne 1-fluorfluorenr,4-fluorfluoren-.og 20 3 -fluorfluoren-derivater kan nitreres i 7-stillingen under anvendelse af den almene nitreringsmetode, der er nævnt i Org.Synthesis, koil., bind 2, 447 (1943). De fremkomne nitroderivater, l-fluor-7-nitrofluoren, 4-fluor-7-nitro= fluoren og 3-fluor-7-nitrofluoren, kan reduceres under an-25 vendelse af den almene reduktionsmetode, der er nævnt i

Org.Synthesis, koil., bind 5, 30 (1973) til dannelse af henholdsvis 7-amino-l-fluorfluoren, 2-amino-5-fluorfluoren og 2-amino-6-fluorfluoren. Under anvendelse af den almene fremgangsmåde ifølge T.L.Fletcher & M.L.Namkung, Chemistry 30 and Industry, 11.februar 1961, side 179-180, kan disse aminer omdannes via de tilsvarende diazoniumtetrafluorboratsalte til 1,7-difluorfluoren, 2,5-difluorfluoren og 2,6-difluor= fluoren. Disse difluorfluorener kan oxideres til de tilsvarende ketoner under anvendelse af den almene metode ifølge 35 U.Sprinzak, J.Amer.Chem.Soc. 80 (1958) eller ved fremgangs måder nævnt heri under fremstilling L eller M til dannelse af: DK 169519 B1 20 1,7-difluorfluorenon,2,5-difluorfluorenon, 2,6-difluorfluore= non. Som ved fremstilling L og M kan disse ketoner omdannes til de tilsvarende spiro-hydantoiner: dl-spiro- (1, 7-difluorfluoren-9,4 '-imidazolidin) -2 ' ,5 ’-dion, dl-spiro-(2,5-difluorfluoren-9,41-imidazolidin)-2',5'-dion og dl-spiro-(2,6-difluorfluoren-9,4'-imidazolidin)-21,5'-dion.

dl-spiro-(2-fluor-7-methylthiofluoren-9,4 '-imidazolidin)-2'-5'-dion kan fremstilles af 2,7-difluorfluorenon. 2,7- 10 difluorfluorenonen bringes til at reagere som ved fremstilling P med undtagelse af, at der anvendes ét ækvivalent af natriummethylthiolatet (fremstillet af natriumhydrid og methylmercaptan). Den fremkomne 2-fluor-7-methylthiofluore= non omdannes syntetisk som i fremstilling L eller P til den 15 ønskede racemiske spiro-(2-fluor-7-methylthiofluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion.

Den diastereomere blanding af fire stereoisomere af spiro-(2-fluor-7-methylsulfinylfluoren-9,4'-imidazolidin)-2', 5'-

,OQ

dion kan fremstilles efter fremstilling Q, hvorved racemisk spiro-(2-fluor-7-methylthiofluoren-9,4'-imidazolidin) -2',5'-dion oxideres med natriummetaperjodat til dannelse af den diastereomere blanding af fire stereoisomere af spiro-(2-fluor- 7-methylsulfinylfluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion.

25

Forbindelserne A (sammenligning) og L, Μ, P, Q, R, S, T og U blev afprøvet for deres evne til at hæmme aldosereduktase-enzymaktivitet ved fremgangsmåden ifølge P.F. Kador, L.O.

3 0 Merola & J.H. Kinoshita, som beskrevet i Documents Oph- thamologica 18 (1979), 117. Resultaterne er vist i tabel I, II og III.

35 TABEL I.

21 DK 169519 B1

S

ICgQ -human aldosereduktase-hæmningsaktivitet.

Forbindelse IC^q imo^ær^ 5 · -6 A Spiro-(fluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion 1,2 x 10 L (dl-2-fluor) 9,1 x 10~8 —8 M (2,7-difluor) 5,2 x 10 afcajc ·— 7

Sarges opspaltede 6,4 x 10 10 Jt ICgg = koncentration af lægemiddel, som hæmmer 501 af enzymaktiviteten.

= Sarges opspaltede forbindelse = d-spiro-(6-fluorchroman-15 4,4’-imidazolidin)-21,5'-dion.

TABEL II.

IC^q -rotte-aldosereduktase-hæmningsaktivitet.

20 Forbindelse iCgg(molær L (dl-2-fluor) 1,5 x 10 ^ M (2,7-difluor) 4,4 x 10 8 P (dl-2-methylthio) 4,2 x 10 7 25 q (dl-2-methylsulfinyl) 1,7 x 10 8 R (dl-2-methylsulfonyl) 5,0 x 10 8 S (dl-l-fluor) 5,9 x 10"7 U (dl-4-fluor) 4,6 x 10"7 fåsfk -7

Sarges racemiske 4,3 x 10 -7 30 Sarges opspaltede 1,5 x 10 *ICgQ = koncentration af lægemiddel, som hæmmer 501 af enzymaktiviteten .

sfcxjc 35 = Sarges racemiske forbindelse = dl-spiro-(6-fluorchrOman- 4, 4 ' -imidazolidin)-2',51-dion.

22 DK 169519 B1 jtsfe* = Sarges opspaltede forbindelse = d-spiro-(6-fluorchroman-4,4' -imidazolidin) -2^51 -dion.

Det er bemærkelsesværdigt, at forbindelserne L og M er lige 5 så aktive eller mere aktive over for human aldosereduktase end rotte-aldosereduktase og derfor mere selektive over for human aldosereduktase end rotte-aldosereduktase, når de sammenlignes med Sarges opspaltede forbindelse. Disse midler vil udvise mere aktivitet hos mennesker end Sarges opspal-10 tede forbindelse. Sarges opspaltede forbindelse udviser kun 1/4 så meget aktivitet over for human aldosereduktase sammenlignet med aktiviteten over for rotte-aldosereduktase.

Det er klart, efter analyse af både in vitro og in vivo styrkedata beskrevet i den foreliggende ansøgning, at for-bindeiserne L og M vil udvise signifikant større relative styrker hos mennesker over for diabetiske komplikationer, der står i relation til aldosereduktase. Dette fremgår af sammenlignende undersøgelser beskrevet heri af diabetiske og galaktosæmiske rotter og undersøgelser af enzymhæmning 20 in vitro hos mennesker. Både det racemiske 2-fluor(L)- og 2,7-difluor(M)-derivat er 7x og 12x mere aktive over for human aldosereduktase end Sarges opspaltede forbindelse.

Sarges opspaltede forbindelse har vist sig at være lige så aktiv over for rotte-aldosereduktase som det racemiske 2-25 fluorderivat og halvt så aktiv som 2,7-difluorderivatet in vitro, men både 2-fluor- og 2,7-difluorderivatet viste sig uventet og signifikant mere aktivt in vivo end Sarges-forbindelsen ved rotte-undersøgelser. 1 35 TABEL III.

23 DK 169519 B1

In vitro aldosereduktase-hæmning.* 5 0 _4 —5 —6 —7 _o molær 10 10 10 10 10 Art 5 ------------------------------------------------------------ A 89 84 49 13 - Menneske L 100 88 81 53 18 M 81 71 64 35 2Q * I henhold til fremgangsmåderne ifølge P.F.Kador & N.E.

Sharpless, Biophysical Chemistry 8 (1978), 81-85, P.F.

Kador, L.O.Merola & J.H.Kinoshita, Documenta Ophthamolo-gica 18 (1979), 117.

15 In vivo bedømmelser: A. Virkningen af dl-spiro-(2-fluorfluoren-9,4'-imidazolidin)- 2,,5'-dion og spiro-(2,7-difluorfluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion på forhindring eller forhaling af grå stær hos 20 rotter blev undersøgt under anvendelse af den uopspaltede dl-spiro-(6-fluorchroman-4,4'-imidazolidin)-2',5'-dion, baseret på amerikansk patent nr. 4.117.230. Forbindelserne blev inkorporeret i præparater i formalet Purina Rodent Laboratory-kost nr. 5001, indeholdende 30% galactose.

25 84 rotter blev opdelt i følgende 7 grupper (6 behandlede grupper med forskellig indtagelse af forbindelsen og en ubehandlet galactose-kontrol) med forskellige mængder indtagen forbindelse, som vist i tabel IV.

30 35 TABEL IV.

24 DK 169519 B1

Doseringer af forsøgsforbindelse.

Mg indtagelse/

Forbindelse kg legemsvægt/dag 5 L (2-fluor) racemisk 4 mg/kg/dag L (2-fluor) racemisk 8 mg/kg/dag M (2,7-difluor) 4 mg/kg/dag M (2,7-difluor) 8 mg/kg/dag

Sarges racemiske 4 mg/kg/dag 10 Sarges racemiske 8 mg/kg/dag

Galactose, kontrol

Galactose-kontrolgruppen (12 rotter, 24 øjne) blev fodret med formalet Purina Rodent Laboratory-kost nr. 5001 indeholdende 30 vægt% galactose. De 6 forsøgs-forbindelsesgrupper 15 (12 rotter, 24 øjne pr. gruppe) blev fodret med samme 30% galactose-kost med undtagelse af, at kosten var sammensat således , at den gav de viste mg/kg/dag af forsøgsforbindelsen (se tabel IV).

Det er kendt, at unge hanrotter, der fodres med en 30% galac= 20 tose-kost (som ovenfor beskrevet) vil udvikle lentikulære ændringer i løbet af flere dage, som prædikativt skrider frem irreversibelt med tiden til grå stær. Aldosereduktase-hæmningsforbindelser, der er aktive in vivo, vil forhale eller forhindre galactose-induceret udvikling af grå stær. Ved 25 disse in vivo forsøg var de undersøgte aldosereduktase- hæmningsforbindelser sammensat i 30% galactose-foder for at bedømme deres in vivo aktivitet mod grå stær. De 168 rotteøjne på de 84 rotter blev iagttaget for følgende tilstande gennem en periode på 32 dage.

25 DK 169519 B1

Beskrivelse;

Normal Normal linse, ingen vakuoler

Tid til begyndende Vakuoler begyndende netop at dannelse af vise sig omkring linseperimeter 5 grå stær

Tid til vakuole:: Vakuolisering klart synlig på forreste linseoverflade

Tid til snefnug Små uigennemsigtige "pletter" 10 synlige med det blotte øje foruden vakuoler

Tid til nuklear grå stær Nuklear grå stær, indre linse helt uigennemsigtig.

Iagttagelser blev foretaget på dagene 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30 og 32.

Alle rotteøjne i behandlingsgruppe L (2-fluor) og M (2,7-di= fluor) var asymptomatiske efter 32 dage. Alle rotteøjne i Sarges-grupperne udviklede snefnug-lignende uigennemsigtigheder uden noget tegn på tidligere vakuoledannelse. Gennem-20 snitstiden til snefnug-lignende uigennemsigtigheder var 15,7 dag for Sarges racemisk 4 mg/kg-gruppen og 19,7 dag for Sarges racemisk 8 mg/kg-gruppen. Denne forskel er statistisk signifikant (p <0,05). Rotteøjne i galactosekontrol-gruppen fulgte det sædvanlige mønster for dannelse af grå 25 stær. Gennemsnitstiden til snefnug var 11,5 dag. Dette var statistisk (p <0,05) signifikant lavere end gennemsnittet for hver af Sarges-grupperne.

"Tiden til grå stær" er opsummeret i tabel V.

_ DK 169519 B1 26 TABEL V.

Tid til grå stær.

Standard—

Behandling Interval (dage) Middel (dag) afvigelse 5 Sarges racemat 4 mg/kg/dag 12-22 15,68 2,68

Sarges racemat 8 mg/kg/dag 14 - 30 19,68 4,68 "Tiden til grå stær" er i gennemsnit 4 dage mindre for Sarges racemisk 4 mg/kg/dag-forbindelsen end for Sarges racemisk 8 mg/kg/dag-forbindeisen. Denne forskel er statistisk signifikant på 95%-sandsynlighedsniveauet.

Rotteøjne i galactose-kontrolgruppen fulgte det sædvanlige mønster for dannelse af grå stær. Tiderne til hver type 15 grå stær-aktivitet er opsummeret i tabel VI.

TABEL VI.

Tider til grå stær for galactose-kontrol.

Standard-

Stadium Interval (dage) Middel (dag) afvigelse 20 Tid til tidlige vakuoler 3-4 3,58 0,50

Tid til vakuoler 4-10 6,00 2,00

Tid til snefnug 8-18 11,50 2,30 25 . Tid til nuklear grå stær 16 - 32 24,04 6,52

Alle rotteøjne undtagen 3 (12,5%) udviklede nuklear grå stær senest dag 32. Tiden til nuklear grå stær ansættes til 35 dage for disse 3 rotter ved beregningen af middeltallet og standard-afvigelsen.

DK 169519 Bl 27 På dag 32 blev 3 rotter udvalgt og aflivet tilfældigt fra grupperne behandlet med racemisk 2-fluorderivat i en mængde af 4 mg/kg/dag, det racemiske 2-fluorderivat i en mængde af 8 mg/kg/dag, 2,7-difluorderiyatet i en mængde af 4 mg/kg/dag, 5 2,7-difluorderivatet i en mængde af 8 mg/kg/dag og Sarges racemiske forbindelse i en mængde af 4 og 8 mg/kg/dag, og dulcrtmængderne (galactit og galactose) i linserne blev målt.

De gennemsnitlige galactitmængder for Sarges racemiske i en mængde af 4 mg/kg/dag og Sarges racemiske derivat i en mængde 10 af 8 mg/kg/dag var henholdsvis 9,238 og 9,107 og er stati stisk (p <0,05) signifikant større end gennemsnittet for det racemiske 2-fluorderivat i en mængde af 4 mg/kg/dag og det racemiske 2-fluorderivat i en mængde af 8 mg/kg/dag, henholdsvis 6,274 og 5,074, og gennemsnittet for 2,7-difluor-15 derivatet i en mængde af 4 og 8 mg/kg/dag,henholdsvis 2,560 og 1,399. De gennemsnitlige galactitmængder for begge doser af 2,7-difluorderivatet er statistisk (p <0,05) mindre end gennemsnittet for hver af doserne af den racemiske 2-fluorforbindelse. Både det racemiske 2-fluor- og 2,7-difluor-20 derivat hæmmer udviklingen af grå stær. 2,7-difluorderiva tet er kraftigere virkende end 2-fluorforbindelsen. Der iagttages en relation mellem dosisreaktionen af 4 · og 8 mg racemisk 2-fluorforbindelse.

B. Der blev udført undersøgelser af in vivo dosis-reaktionen 25 for at afprøve in vivo aktiviteten af følgende forbindelser ved intubation (pr. oral) i galactocæmiske rotter på den tidligere beskrevne 30%-galactose-kost: sk L - dl-spiro-(2-fluorfluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion, 30 M - spiro(2,7-difluorfluoren-9,4'-imidazolidin)-2',5'-dion og

Sarges dl-spiro-(6-fluorchroman-4,4'-imidazolidin)-2',5'-dion. Λ Forbindelse L og Sarges racemiske er racemiske.

28 DK 169519 B1

Stamsuspensioner af forsøgsforbindelserne og alle fortyndinger af forbindelser blev fremstillet med 0,03%"Tween" 80.

Forsøgsmetoder;

Sunde Charles River CD hanrotter (udavlet albino stammende 5 fra Sprague-Dawley), 20 - 30 dage gamle, uden iagttagelige øjendefekter og i vægt liggende fra 35 til 45 g, blev akklimatiseret til forsøgsbetingelser (i karantæne) i 2 dage før begyndelsen af undersøgelsen.

Rotter blev enkeltvis henført til én af 23 grupper efter 10 et tilfældigt skema. 2 rotter, der hørte til samme behand lingsgruppe med hensyn til lægemiddel og kost, blev holdt i bur. Behandlingsgrupper og kontrolgrupper bestod af seks (6) rotter hver uden nogen erstatning i tilfælde af død og blev inddelt som følger:

Antal Lægemiddel- Doser/ Antal 15 Gruppe rotter dosis dag dage (mg/kg)

Sarges racemiske A 6 40,000 1 14

Sarges racemiske B 6 12,600 1 14

Sarges racemiske C 6 4,000 1 14 20 Sarges racemiske D 6 1,260 1 14

Sarges racemiske E 6 0,400 1 14

Sarges racemiske F 6 0,126 1 14

Sarges racemiske G 6 0,040 1 14 2-fluor (L) A 4 6 40,000 1 14 25 2-fluor (L) B 4 6 12,600 1 14 2-fluor (L) C 4 6 4,000 1 14 2-fluor (L) D 4 6 1,260 1 14 2-fluor (L) E 4 6 0,400 1 14 2-fluor (L) F 4 6 0,126 1 14 30 2-fluor (L) G 4 6 0,040 1 14 (forts.) i ------ ---- 29 DK 169519 B1

Antal Lægemiddel- Doser/ Antal Gruppe rotter dosis dag dage

Difluor (Μ) A 6 40.000 1 14

Difluor (Μ) B 6 12,600 1 14 5 Difluor (M) C 6 4,000 1 14

Difluor (M) D 6 1,260 1 14

Difluor (Μ) E 6 0,400 1 14

Difluor (M) F 6 0,126 1 14

Difluor (M) G 6 0,040 1 14 20 Positiv 6 0,000 1 14 galactocasmisk bærerkontrol xx

Positiv 6 0,000 0 14 galactosaanisk kontrol 25 * Racemisk

Denne gruppe fik en gennemsnitsdosis af bærer beregnet på legemsvægt. t

Linser i alle øjne blev undersøgt med et håndbetjent ophthal-moskop på de tidligere stadier af udviklingen af grå stær 20 og en lommelygte til stadierne snefug-agtig, snefug og nuklear grå sstær. Linsebedømmelse skete hver dag i de første 10 dage af undersøgelsen og derefter hveranden dag indtil undersøgelsesdag 14.

Undersøgelsen skete for at bestemme den relative effektivitet 25 og styrke af dl-2-fluor- og 2,7-difluorforbindelserne udtrykt • ved lige store mængder af forsøgslægemidlet pr. kg legemsvægt i forhold til Sarges dl-spiro-(6-fluorchroman-4,4*-imid= 30 DK 169519 B1 azolidin)-2*,5'-dion, den positive grå stær-kontrol.

Den relative styrkebestemmelse blev foretaget med 7 lægemiddel-niveauer over halve log- dosis-intervaller. Reaktionen (procent dannet grå stær og/eller tid til dannelse af grå 5 stær) blev afsat som funktion af mg/kg og/eller mol/kg.

Antagelser om forsøgsmetoder:

Undersøgelsen var rettet mod undertrykkelse og/eller fjernelse af begyndelsesstadierne af udvikling af grå stær karakteristisk ved kun vakuoler eller snefnugagtige uigennemsigtigheder.

10 Det blev derfor antaget, at undertrykkelse og/eller fjernelse af vakuoler eller linse-uigennemsigtigheder med forsøgslægemidlerne påvirker transporten, absorptionen og/eller metabolismen af galactose på en sådan måde, at det forhindrer påfølgende osmotiske forstyrrelser, der normalt fører til vævs-15 degeneration og fremskreden grå stær. Fremskreden grå stær defineret som stadierne 2 - 4 i Sipple-klassifikationen blev antaget at være af sekundær betydning i forhold til ætiologien af hindring af grå stær.

I tilfælde af et andet stadium af grå stær end dannet vakuole, 20 såsom snefnugagtige uigennemsigtigheder, blev denne grå stær talt på samme måde som vakuole ved præsent dannelse af grå stær.

Undersøgelser viser, at 90% af unge rotter (50 g) fodret med en 30% galactose-kost vil udvikle vakuole grå stær inden for 25 5-7 dage. Denne undersøgelse gav denne forventede virkning i kontrolgrupperne.

Eksperimentelle fremgangsmåders

Alle dyr blev fodret med Purina Laboratory-kost og vand ad li- 31 DK 169519 B1 bitum i de to akklimatiseringsdage. Alle lægemidler blev doseret oralt ved intubation under anvendelse af en dyre-fodringsnål (Popper and Sons) gauge 18 eller 20, fastgjort til en 1· eller 3 ml sprøjte. Når først doserings-5 tidsskemaet var fastlagt, blev skemaet fulgt gennem hele undersøgelsen for at kompensere for eventuelle døgnvariationer.

Dyrene blev holdt på en 12 timers dag/nat-cyklus. Temperaturen og fugtigheden blev bestemt hver dag på skemaets doseringstid 10 (1:00 p.mj .

Dyrene blev vejet hveranden dag, og indstillinger af doseringsmængder for at kompensere for vægtforøgelse blev foretaget hver dag før doseringstiden. Al føde blev rutinemæssigt holdt tilbage fra alle dyregrupperne i 4 timer (9:00 15 a.m.) før lægemiddeldosen og givet tilbage 2 timer (3:00 p.m.) efter dosen. løvrigt blev tilstrækkelige mængder kost- og diætblanding opretholdt i fødetragten til, at dyrene kunne æde ad libitum. Der var 2 dage med lægemiddeldosering, hvor dyrene forblev på Purina Laboratory-kost (dag 1 og 2).

30% galactose-kostblandingen blev givet til dyrene 2 timer 20 efter dosen på dag 3, som var dag 1 i undersøgelsen.

Øjenundersøgelse og bedømmelse:

Alle øjne blev undersøgt med et håndbetjent ophthalmoskop og/eller lommelygte på de tidspunkter, der er anført i den eksperimentelle afdeling.

25 Det har ved tidligere undersøgelser vist sig, at udvidelse af øjet med et pupil-udvidende middel (d.v.s. Mydriacyl) ikke er nødvendigt for at give en nøjagtig bedømmelse på grund af den halv-transparente karakter af rottens iris.

På de tidlige stadier (d.v.s. bedømmelserne -, - og +) blev 32 DK 169519 B1 linserne iagttaget ved at reflektere ophthalmoskop-strålen fra retinaen tilbage gennem linsen og iris. Under anvendelse af denne teknik fremkommer vakuoler som mørke, næsten uigennemsigtige partier. På de senere uigennemsigtigheds-stadier 5 (bedømmelserne SL, S og N) blev linserne iagttaget med det blotte øje ved hjælp af en lommelygte.

Hvert øje fik en af følgende bedømmelser:

Bedømmelse Beskrivelse - Normal linse, ingen vakuoler - Vakuoler begynder netop omkring linseperimeteren + Vakuoler dækker mere end 1/3 af linsens overflade S Linsen fuldstændigt uigennemsigtig, 15 små uigennemsigtige "pletter" synlige i linsen N Nuklear grå stær, hvidt krystallinsk materiale til stede i linsens midte SL Små uigennemsigtige "pletter" synlige uden tilstedeværelse af vakuoler 20 (snefnugagtig).

Statistisk analyse:

Procenten af øjne med vakuoler (grå stær) og/eller tid til vakuoledannelse blev analyseret for hver behandlings/koncen-trationsgruppe. Da dataene var tilstrækkelige, blev styrken 25 af 2,7-difluor- og racemisk 2-fluor-forbindelsen i forhold til kontrol bedømt ved en probit-analyse eller på andre passende måder.

Desuden blev forekomsten af ikke-dannelse (vakuoler, snefnug, og nuklear grå stær) bestemt på udvalgte tidspunkter under undersøgelsen og anvendt til at sammenligne lægemidler og 33 DK 169519 B1 koncentrationer. Dette blev gjort i en bestræbelse på at identificere et optimalt slutpunkt for denne type undersøgelse.

34 DK 169519 B1 I I dtP -- II * I I O O O 00 O O o o o o o o w

I H I in O -P

II Η M

II o 1 I Ή i CM I o o o O O O Γ" O O OOO '

I Η I H O

I I H

I I I I

I o I o o o ooo o o o ro o o

Ir-Il 00 I I I I i i i i l σι i o o o ooo o o o r— o o

I I H

I I I I I I

I CO I OOO O O O O O O CO o o • I ||

'u I II

o II

3 I I Γ' I o o o ooo o o o ooo

i—I I II

• IH I I I

tø -H I I I

ϋ Ό I I I

Q) I I I vo I OOO ooo ooo ooo

Γ'· I II

tø * I tn I I

ø cm I cd I I

tø — I Q I I

• 1^1 I I in I ooo ooo ooo ooo

h I ø s I I I

Η I > I II

>1 tn I II

I 4K O 1 I I

H j i i^rlooo ooo ooo ooo

Hl <D -—. I I I

n I M M I I I

< I tø O I I I

& I H ø i i i g H I I ro I OOO OOO ooo ooo o) m i i i

Oli II

cd CM I I I

Ml II

^ I I CM 1 ooo ooo ooo ooo

tø tø I II

0) -ri I I I

tn g i i i

M <D I I I

cd O I ι η I ooo ooo ooo ooo

co cd I II

Ml II

'-'I II

I I

1 o I ooo ooo ooo ooo

I I

|| ID ID lo

| VO VO ΙΟ OOO CM CM CM

^ J *»·»*· K ·* S o. «·

tø Λί I OOO CM CM CM HHH

Η \ I ^ HHH

tø tn I

q-5 ! I 0) CD (D 0) 1,¾ ,¾ x ,¾ I tø tø tø tø

IH Η Η H

I g g g g

ΙΦ-ΚΜ <D M <1) M 0) M

Η I O K O O-KO OKO OKO

(Died ø cd K 3 cd K ø id K 3

iJ I ή Η Μ Η Μ Η Μ H

rd i Mm m<m Mm Mm

Η I tø O H tø O H tø o H tø O H

gi 0) 3 Ό <D ø Ό Φ 0 'ϋ <U 0 *0 (DitnHl tn η i tn Η i tn Η i tn i M m r' M m r- M m M m ΓΗ l cd l * cd i id i cd i

(4 1 10 CM CM CO CM CM CO CM CM CO CM CM

35 DK 169519 B1 I I d° j 1^1 o o o o ro lo o oj

Ir-Il O O O CO I'' O Ol , O* i IIHH Η H Hl Ρ Η Φ ! j ri r-t I (UH in II I Λ (1) <ϋ

I es I ro ro o ro ro r-· o O ] 5-1¾ -P

j H } oo CO cocoio o oj -g £· 3 I o(d φ 'd J I i a>a φ

I o I ro r- o ro o r~ o ro I H

I i—i 1 oo o oo o o o co g G Φ i| Η I 0 Φ 01 I w ij 0 i G -d

II I - H

I σι I oo cn o co o r- o ro I 5hW nJ

i i m m in o o co 0)

il H I *0 H G

I O <D

II I A Φ I co I o cn o O o r- o ro I 61¾ ^ I ΐιη'Φ if) ΐίΐ ιο o 00 I HO Φ

Η I -P -P

i tn-P 6 II I Η H o I r-> I ro oo o ro ro lo o co I wg ω I i ro ro ro cn lo loI δω il I (DG *»

I I I G (d G

II I G 5-1 O

I U) I ro o o ro ro 00 ro r^l Φ-Ρ H

II ro roro ro H

co i i 'il ti 1 (d I I 3 Λ “

Oli I LO

I m I o o o o o o o ol PH

|| I QJ *rt "

SS I Η -P OJ

II I Η I

|| I (1) Q) Λ I^IOOO OOO O O I G £ II I H P> S i I φ Φ Ό

I I Η H

I I I 0 CQ H

I ro I ooo ooo o o I G G O

II I Λί Φ N

i cd ω m l i i · > g || I Ρ -Η ·Η

I CN I ooo ooo o o I ft! Φ H B

II I 4J Dl -H

I ω H P I

I Η Φ II I »id (DH -i I H I OOO OOO o ° ! hL ^ d J- II I Di >i Φ ^

i -P L

I -P G £

II i ω B Q) JO

I o I ooo ooo o ol GOtQ S · II I G ω G o 5-1

Il I fd -H 5-1 (D

_ I I Ό to Η Λ N

Di I OOO I φ O H

cn X I CN CN CN I 03 5-1 <+-! ^ Η \ I *3* «3* ^1* HHH ΙΦΦΦ 0 Ai tu tn i - - - BG p o S I OOO OOO I -HG* tH co Q £ I I φ m φ Dl m p

I I G Φ ω G i *W

I Η I -π 'G G -H o ΙΟ) φ O I ·& Φ G ~ ?H · S v Ρ φ I Ρ Ρ Ό O O ,¾ IW rt -Ρ ωΐ+>8ΦΦΡ+>ω

I ·Η -ri G o 1 G -P ft Ρ -Η Η -H

ig g o .ρίΦωωΟι Pti ε I Φ 5η Φ 5η Λ! « I ο G ω ω -Η Φ η ι ο « ο ο« ο ι ! Ρ °ί° ί° 5° % Η Φ I Φ « Ρ id * G Φ £ r η Η I? 5 2 H^-s φ | £ Η Μ Η W (dl Ρίϋ-PHrd-H 5η >. όι pm pm ο tu ι cn -η I ω ο ·η ω ο η -Ρ > ! „ „ „

J JJ g I φ G Ό φ £ Ό ο Ρ I II II II

rqp ΦΐϋΐΗΐ σ» η ι (d φι cq ο Di ι ρ m r- Ρ m η ρ

< m ft) ι (di G i »g W „ S

jp w vG ι cn CN CN cn CN CN O CQIcJP ΊΚ *1 36 DK 169519 B1

De samme data som i tabel VII kan illustreret på anden måde: TABEL VIII.

% rotteøjne (n = 12) med i det mindste dannede vakuoler.

Dag

Sarges ______7_______8______9_______“____12_____ racemiske: 40.000 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 12.600 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,3% 4.000 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 16,7% 50,0% 1.260 0,0% 0,0% 8,3% 16,7% 83,3% 100,0% 100,0% 0,400 33,3% 33,3% 50,0% 58,3% 83,3% 83,3% 100,0% 0,126 33,3% 33,3% 41,7% 75,0% 100,0% 100,0% 100,0% 0,040 0,0% 8,3% 50,0% 66,7% 100,0% 100,0% 100,0%

Racemisk 2-fluor (L): 40.000 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 12.600 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 4.000 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 1.260 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,400 0,0% 8,3% 41,7% 41,7% 66,7% 83,3% 100,0% 0,126 33,3% 33,3% 50,0% 50,0% 50,0% 83,3% 83,3% 0,040 33,3% 50,0% 83,3% 83,3% 100,0% 100,0% 100,0% 2,7-difluor (M): 40.000 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 12,600 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 4.000 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 1,260 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,400 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,126 8,3% 25,0% 66,7% 66,7% 66,7% 66,7% 75,0% 0,040 50,0% 66,7% 83,3% 83,3% 91,7% 100,0% 100,0% (forts.) 37 DK 169519 B1 TABEL VIII (forts.)

Dag 6 7 8 9 10 12 14 Β26ΓΘΓ*1* kontrol 33,3% 50,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0%

Ubehandlet kontrol 16,7% 58,3% 83,3% 83,3% 83,3% 100,0% 100,0%

Ved iagttagelse dag 12 er logaritmen af .relative styrker for øj -ne med vakuoler eller mere fremskreden grå stær med deres 95% konfidensgrænser:

Log., (95% konfidens- _ styrke grænser) 2-fluor ---------------------------- (L) i forhold til Sarges racemiske 0,6605 (0,3889 - 0,9346) 2.7- difluor (M) i forhold til Sarges racemiske 1,1114 (0,8501 - 1,3852) 2.7- difluor (M) i forhold til 2-fluor * (L) 0,4473 (0,1898 - 0,7144)

Antilogaritmerne af de relative styrker med deres 95% konfi-5 densgrænser er:

Relativ (95% konfidens-* styrke grænser) 2-fluor ---------------------------- (L) i forhold til Sarges racemiske 4,58 (2,45 - - 8,60) 2.7- difluor (M) i forhold til Sarges racemiske 12,92 (7,08 - 24,28) 2.7- difluor (M) i forhold til 2,80 (1,55 - 5,18) 2-fluor * (L) = racemisk.

38 DK 169519 B1 C. Polyolakkumulering i diabetisk rottelinse og lårnerver:

Som en yderligere prøve på effektiviteten af racemisk 2-fluor- og 2,7-difluorforbindelse versus Sarges opspaltede forbindelse blev der foretaget iagttagelse af in vivo hæmnin-5 gen af polyolakkumulering i lårnerven og linsen hos rotter med streptozotocin-induceret diabetes. Grundlaget og teknikken for forsøget er beskrevet i "Polyol Accumulation in Nervous Tissue of Rats with Experimental Diabetes and Galac-tosaemia", M.A.Steward, W.R.Sherman, Mary M.Kurien, G.I.Moon-0 sammy & M.Wisgerhof, Journal of Neurochemistry 14 (1967) , 1057-1066.

Ved forsøget blev 8 Sprague-Dawley hanrotter, der vejede ca.

150 g, fastet natten over og fik en injektion af streptozo= tocin den næste dag. Dosen var 9-10 mg/100 g dyrevægt 15 i en sur nitratstødpude, der var fortyndet i normalt saltvand.

Injektionen blev givet i eller nær ved halevenen.

De respektive aldosereduktase-inhibitorer (Sarges opspaltede, racemisk 2-fluor- og 2,7-difluorforbindelse) blev givet til 4 af rotterne efter 4, 8 og 24 timer. Dosen på 0,15 mg/ 20 100 g dyr blev givet oralt i ca. 5 μΐ vand. Hver inhibitor blev blandet i en grov suspension af vand i en morter. En portion af denne blanding blev så udtaget under anvendelse af en automatisk pipette og givet til hvert dyr.

Dagen efter streptozotocin-injektionen blev dyrenes blodgluco= 25 se bestemt under anvendelse af glucoseoxidase-peroxidase- metoden. Efter 27 timer blev alle dyrene dræbt, og linserne og lårnerverne blev udtaget, vejet og homogeniseret. Disse homogenater blev så analyseret for sorbitindhold under anvendelse af GLC-metoden. Forsøgsgruppen (som fik inhibitoren), 3 o blev sammenlignet med kontrollerne (der ikks fik inhibitor), og den procentiske hæmning blev bestemt. Hver værdi repræsenterer sammenligning af 4 værdier for kontrol og 4 for forsøg.

39 DK 169519 B1

Resultaterne af forsøgene er vist i tabel IX.

TABEL IX. '

In vivo hasinning af polyolakkumulering i lårnerve og linse hos 5 streptozotocin-induceret diabetisk rotte.

mg/deciliter, %''hæmning gennemsnitlig --------------

Forbindelse blodglucose Nerve Linse 10 Sarges opspaltede 298 - 17 77% 83%

Racemisk 2-fluor (L) 425 - 39 96% 92% 2,7-difluor (M) 349 ~ 32 90-95% 95% * ;.8 dyr blev anvendt til hver undersøgelse, 4 kontrol, 4 15 forsøg.

** d-spiro-(6-fluorchroman-4,41-imidazolidin)-2',5'-dion.

D. Nerveledningsundersøgelse i diabetiske rotter:

Formålet er at bedømme effektiviteten af den racemiske 2-fluorforbindelse (L), en aldosereduktase-inhibitor, til hæm-2° ning af udvikling af grå stær og mangelfuld nerveledning i diabetiske rotter.

Metoder og materialer:

Diabetes blev induceret i han-albinorotter ved intravenøs injektion af 50 mg/kg streptozotocin. Den diabetiske tilstand blev bekræftet ved måling af blodglucose-niveauet i hvert 25 dyr før og efter injektion. Diabetiske dyr blev tilfældigt opdelt i 3 grupper som følger: (1) Kontrol behandlet med bærer, (2) 8 mg/kg af den racemiske 2-fluorforbindelse (L) og (3) 16 mg/kg af Sarges racemiske.

40 DK 169519 B1

En fjerde gruppe bestod af ikke-diabetiske og på anden måde normale rotter, som forblev ubehandlede. Behandlinger blev givet én gang om dagen ved oral udskylning og fortsatte til dagen før dræbning af dyret.

5 Hvert dyr blev vejet ugentligt. Begge linser fra hvert dyr blev undersøgt med ophthalmoskop periodisk; og eventuelle grå stær-ændringer blev bedømt og noteret. Efter 15 uger blev hvert dyr anæstetiseret ved anvendelse af pentobarbotal, og nerveledningshastighederne af lårnerven blev målt. Efter 10 at et dyr var dræbt, blev lårnerven og andre væv og organer udtaget, vejet og frosset til fremtidig biokemisk analyse.

Resultater: Ændringer i retning af grå stær blev bedømt efter en skala fra 0 til 4. 0 betegner en normalt udseende linse uden æn- 10 dringer, og 4 betegner dannelse af uigennemsigtighed i hele linsen. Linserne fra rotterne i den ubehandlede normale kontrolgruppe udviste ingen synlige ændringer og forblev optisk klare. Af de 32 linser (16 rotter), der fandtes efter de 15 uger hos de med bærer behandlede diabetiske rotter, havde 15 27 en bedømmelse på 4, 3 en bedømmelse på 3 og 2 en bedømmelse på 2 med hensyn til ændringer i retning af grå stær. Hver linse udviste således maksimal eller næsten maksimal uklarhed. Racemisk 2-fluorforbindelse (L) var effektiv til at forhindre uigennemsigtighed af linsen hos diabetiske rotter.

20 Af 30 linser (15 rotter) i gruppen behandlet med Sarges race- miske var alle normale. Begge forbindelser var således effektive til at forhindre grå stær hos diabetiske rotter i en mængde af 8 mg/kg af den racemi ske 2-fluorforbindelse og i en mængde af 16 mg/kg af Sarges racemiske forbindelse.

25 Kurven over elektrisk aktivitet fra lårnerven som reaktion på elektrisk stimulering af nerven udviste to vendetangenter 41 DK 169519 B1 og to toppe, der sandsynligvis repræsenterer forskellige nervefibergrupper. Virkningen af behandling på hver af de fire ejendommeligheder bestemmes og alle overvejes, men behandlingsvirkninger synes at være størst på den første 5 vendetangent. Sammenlignet med de normale ubehandlede kon troller var ledningshastighederne bestemt for de med bærer behandlede diabetiske rotter som følger: Første vendetangent 83% af normal, første top 82% af normal, anden vendetangent 80,6% af normal, anden top 76,4% af normal. Beskadigelsen !0 af nerveledningen, som den manifesterer sig i en reduktion i ledningshastigheden, lå således fra 17% til 23,6% og kan tilskrives den diabetiske tilstand af disse dyr. Hos de diabetiske rotter behandlet med den racemiske 2-fluorforbindelse (L) var nerveledningshastighederne af det. normale som følger: 15 Første vendetangent 93,3%, første top 88,2%, anden vendetan gent 87,4%, anden top 85,0%. Hos disse dyr var beskadigelsen derfor fra 6,7 til 15%, hvilket repræsenterer en forbedring ved behandling på 34 - 61%. Hos de diabetiske rotter behandlet med Sarges racemiske var nerveledningshastighederne som 20 procent af normal som følger: Første vendetangent 88,6%, før ste top 83,9%, anden vendetangent 82,4%, anden top 79,1%.

Dette repræsenterer en beskadigelse, der ligger fra 11,4 til 20,9% og viser en forbedring sammenlignet med kontrol på 9 - 33%. Både den racemiske 2-fluorforbindelse (L) og Sarges 25 racemiske frembringer derfor nogen gavnlig virkning til for bedring af nerveledningshastigheden og vender den tilbage mod det normale. Den racemiske 2-fluorforbindelse (L) giver imidlertid i halvdelen af dosen af Sarges racemiske en større forbedring. Statistisk analyse viser, at kun forbedringen med 30 den racemiske 2-fluorforbindelse (L) er signifikant ved sammen ligning med de ubehandlede diabetiske rotter.

Det skal forstås, at medens visse foretrukne udførelsesformer for ..opfindelsen er blevet illustreret og beskrevet, vil for-

Claims (18)

1. 5 DK 169519 B1 skellige ændringer deraf være indlysende for fagfolk. Patentkrav.
2. 1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af en spiro-(fluoren- 9,4'-imidazol idi η)-21,5 '-dion eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf med den almene formel I 5 jMf 20. hvor X er hydrogen, fluor, methylthio, methylsulfinyl eller methyl-sulfonyl, og Y er fluor, methylthio, methylsulfinyl eller methylsulfonyl, 25 kendetegnet ved, at man a) omsætter en forbindelse med den almene formel II hvor X og Y har har de ovenfor angivne betydninger med et 35 overskud af kaliumcyanid og ammoniumcarbonat i et velegnet opløsningsmiddel under tryk ved en forhøjet temperatur, eller DK 169519 B1 b) til fremstilling af forbindelser med formel I, hvor X og/-eller Y er S(0)CH3 eller S(02)CH3, oxiderer en forbindelse med den almene formel I, hvor X og/eller Y er CH3sf med et oxidationsmiddel i et passende opløsningsmiddel, 5 4 hvorefter man om ønsket omdanner den ved fremgangsmåde la eller lb vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt.
3. 2. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formel III O ^—NH 15 ““νλο \ hi h,c \ 5—{ j 20 går ud fra en forbindelse med den almene formel IV o /sVljVF W
4. 25 HjC VsssX hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt. 30
5. 3. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formlen V ^"0-0 v 35 )“T DK 169519 B1 går ud fra en forbindelse med den almene formel VI o H>C \_/\zzpJ hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til 10 et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt.
6. 4. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formlen VII 15 °)-hh HN Jk. vn går ud fra en forbindelse med den almene formel VIII 25 H \ )—\ / vm 30 hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt.
7. 5. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, 3 5 at man til fremstilling af en forbindelse med formlen IX DK 169519 B1 O. NH IX s /^yjT^S \ går ud fra en forbindelse med den almene formel. X 10 o 0-0 F hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til 2Q et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt.
8. 6. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med den almene formel XI 25 0 \~NH HNvJ^o XI 0--0 F 3. går ud fra en forbindelse med den almene formel XII DK 169519 B1 O F hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbin-10 delsen fra et vundet salt.
9. 7. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formlen XIII IS y—m XI11 går ud fra en forbindelse med den almene formel XIV F ° XIV 30 hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt.
10. 8. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, 3S at man til fremstilling af en forbindelse med formlen XV “ r ^_ ____ . DK 169519 B1 O ^—NH XV 5 F 10 går ud fra en forbindelse med den almene formel XVI O F hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt. 20
11. 9. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formlen XVII O 25 ^ y—NH HN xvii går ud fra en forbindelse med den almene formel XVIII 35 DK 169519 Bl O F XVIII hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt. 10
12. 10. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formlen XIX 1S Vnh F h/L XIX går ud fra en forbindelse med den almene formel XX F S \i4VF hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til 30 et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbindelsen fra et vundet salt.
13. 11. Fremgangsmåde ifølge krav la), kendetegnet ved, at man til fremstilling af en forbindelse med formlen XXI 35 DK 169519 B1 ov ^—NH ®\λθ XXI ’m) F går ud fra en forbindelse med formlen XXII 10 o XXI1 F hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbin-20 delsen fra et vundet salt.
14. 12. Fremgangsmåde ifølge krav lb), kendetegnet ved, at mindst én af grupperne X og Y er et fluoratom.
15. 13. Fremgangsmåde ifølge krav lb) til fremstilling af en for bindelse med formlen XXIII O j—NH on HN
16. 30. XXIII H,C \ p-^ / 35 eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved, at man går ud fra en forbindelse med den almene formel XXIV DK 169519 B1 O ^—NH XXIV 5 /sYXTVF HjC \ 7-\ / hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbin-10 delsen fra et vundet salt.
17. 14. Fremgangsmåde ifølge krav lb) til fremstilling af en forbindelse med formlen XXV 15 °y-NH HNV XXV o HjC eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, kendetegnet ved, at man går ud fra en forbindelse med den almene formel XXVI
18. 25 O ^—HH HN JL xxvi hi/^Ch3 » hvorefter man om ønsket omdanner den vundne forbindelse til et farmaceutisk acceptabelt salt deraf eller frigør forbin-35 delsen fra et vundet salt.