DK169461B1 - Formulering med langsom frigivelse, dens fremstilling og anvendelse til forøgelse af mælkeproduktion i mælkegivende dyr - Google Patents

Description

i DK 169461 B1

Den foreliggende opfindelse angår en formulering med langsom frigivelse, der er ejendommelig ved det i krav l's kendetegnende del angivne. Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af en sådan formulering, hvilken 5 fremgangsmåde er ejendommelig ved det i krav 2's kendetegnende del angivne, og opfindelsen angår desuden fremgangsmåder til anvendelse af formuleringen med henblik på forøgelse af mælkeproduktion i dyr, forøgelse af væksttilvækst hos dyr samt forøgelse og opretholdelse af forhøjede niveauer 10 i blodet af et biologisk aktivt protein, peptid eller poly-peptid, forbedring af fodernyttevirkning, forøgelse af væksthastighed, forøgelse af muskelstørrelse, formindskelse af kropsfedt og forbedring af forholdet mellem magert kød og fedt i et dyr, og disse fremgangsmåder er karakteriseret i 15 krav 5-10.

Formuleringerne er egnede til parenteral indgivelse til dyr. De biologisk aktive proteiner, peptider eller poly-peptider omfatter væksthormoner, somatomediner, vækstfaktorer og andre biologisk aktive fragmenter eller derivater deraf.

20 Den foreliggende opfindelse angår således bl.a. en fremgangsmåde til forøgelse af mælkeproduktionen hos dyr, især malkekøer, ved hvilken fremgangsmåde køerne indgives parenteralt præparaterne ifølge opfindelsen. Opfindelsen angår desuden en fremgangsmåde til forhøjelse og oprethol-25 delse af forhøjede niveauer af biologisk aktive proteiner, peptider eller polypeptider i blodet hos dyr, ved hvilken fremgangsmåde præparaterne ifølge opfindelsen indgives parenteralt.

Voks og fedtstoffer, som er egnede til brug i de her 30 omhandlede præparater, har generelt smeltepunkter på over 40°C. Vokset anvendt ifølge opfindelsen kan defineres som anført i Hawley's The Condensed Chemical Dictionary, ll.udg., som en lavtsmeltende organisk blanding eller forbindelse med høj molekylvægt, fast ved stuetemperatur og almindeligvis 35 med samme sammensætning som fedtstoffer og olier bortset fra, at det ikke indeholder nogen glycerider. Nogle voksarter er DK 169461 B1 2 carbonhydrider, andre er estere af fedtsyrer og alkoholer. Disse forbindelser omfatter mættede eller umættede, langkædede Cio~c24”fedtsyrer' alkoholer, estere, salte, ethere eller blandinger deraf. De er klassificeret blandt lipideme.

5 Voksarter er termoplastiske, men da de ikke er højpolymerer, regnes de ikke til plastgruppen. Almindelige egenskaber er, at de er vandafvisende, har en glat struktur, er ikke-tok-siske og er fri for uheldig lugt og farve. De er brandbare og har gode dielektriske egenskaber. De er opløselige i de 10 fleste organiske opløsningsmidler og er uopløselige i vand. Hovedtyperne er de følgende: I. Naturlige 1. Animalske (bivoks, lanolin, shellakvoks, kinesisk insektvoks) 15 2. Vegetabilske (karnaubavoks, kandelillavoks, myrte voks, sukkerrørsvoks) 3. Mineralske (a) Fossile eller jordvoksarter (ozokerit, ceresin, montan) 20 (b) jordolievoksarter (paraffin, mikrokrystallinsk) (vokssmuld eller mindre raffineret paraffin) II. Syntetiske 1. Ethyleniske polymerer og polyolether-estere ("Car-bowax", sorbitol) 25 2. Chlorerede naphthalener ("Halowax") 3. Carbonhydrid-type via Ficher-Tropsch-syntese.

Det her omhandlede fedtstof kan defineres som anført i Hawley's The Condensed Chemical Dictionary, ll.udg., som en glycerylester af højere fedtsyrer, såsom stearinsyre og 30 palmitinsyre. Sådanne estere og blandinger deraf er faste ved stuetemperatur og har krystallinsk struktur. Fedt og talg er eksempler herpå. Der er ikke nogen kemisk forskel mellem et fedtstof og en olie, idet den eneste forskel er, at fedtstoffer er faste ved stuetemperatur, og olier er 35 flydende. Udtrykket "fedt" refererer sædvanligvis specifikt til triglycerider, medens "lipid" inkluderer alle.

DK 169461 B1 3

Fedtstoffet er fortrinsvis sammensat af mono-, dieller triglycerylestere af langkædede cio~c24-fec*tsyrer· Mono-, di- eller triglyceriderne er overvejende sammensat af stearater, palmitater, laurater, linoleater, linolenater 5 og rester eller blandinger deraf, idet de med smeltepunkter over 50°C er de mest foretrukne. Glyceryltristearat er det mest foretrukne fedtstof. Desuden kan der også anvendes lipofile salte af fedtsyrer, såsom magnesiumstearat og lignende .

10 Bæremediet kan være et vandigt puffersystem eller oliesystem. Olien kan hidrøre fra animalske eller vegetabilske kilder eller kan være syntetisk. Eksempler på foretrukne olier er neutrale mono-, di- eller triglycerider eller blandinger deraf. En neutral olie er en olie, som 15 ikke indeholder en residualsyre. Eksempler på bæremedier, der er egnet til brug i det her omhandlede præparat, er vandige systemer, såsom puffersaltopløsninger, organiske opløsningsmidler, såsom glycoler og alkoholer, og med vand ikke-blandbare væsker, såsom olier, afhængig af opløselig-20 heden af den aktive bestanddel, der skal indgives.

Biologisk aktive proteiner, peptider og polypeptider, som er egnet til indgivelse i de her omhandlede præparater, er f.eks. væksthormoner, somatomediner, vækstfaktorer og andre biologisk aktive fragmenter og derivater deraf. Eksemp-25 ler på foretrukne proteiner er bovine, ovine, equine, porcine, aviære og humane væksthormoner, og omfattet er sådanne, som er af naturlig, syntetisk, rekombinant- eller biosyntetisk oprindelse. Egnet til iblanding i de her omhandlede præparater er desuden metaller eller metalforbindelser as-30 socieret med biologisk aktive proteiner, peptider og polypeptider, såvel som syresalte, derivater og komplekser og anti-hydratiseringsmidler.

I de her omhandlede præparater· kan der være iblandet stabilisatorer, konserveringsmidler, overfladeaktive midler, 35 salte, puffere eller blandinger deraf. Eksempler på foretrukne stabilisatorer er dehydroeddikesyre, salicylanilid, sor- DK 169461 B1 4 binsyre, borsyre, benzoesyre og salte deraf, samt natriumnitrit og natriumnitrat. Til brug ifølge opfindelsen anvendes de ovenfor anførte stoffer hensigtsmæssigt i mængder på ca.

0,1 til 20% på vægtbasis.

5 Eksempler på foretrukne overfladeaktive midler til brug i de her omhandlede præparater, som indeholder biologisk aktive makromolekyler, er af ikke-ionisk natur, såsom poly-oxyethylensorbitanmonooleat (20 mol ethoxylering), og blok-copolymerer af ethylenoxid og propylenoxid. Til brug ifølge 10 opfindelsen .anvendes der hensigtsmæssigt overfladeaktive midler i mængder på ca. 0,1 til 10,0% på vægtbasis.

Det har overraskende vist sig, at der kan opnås og opretholdes øgede væksthormonniveauer i blod i længere tidsrum, og at der kan opnås øgede vægttilvækster og øget mælke-15 produktion hos mælkegivende dyr ved inj icering af dyrene med de her omhandlede præparater i et egnet bæremedium. Forhøjede niveauer i blodet af biologisk aktive proteiner, peptider og polypeptider betragtes og forbindes almindeligvis med gunstige og/eller terapeutiske virkninger. Virkningerne 20 er f.eks. vægttilvækst, forøget væksthastighed, forøget mælkeproduktion hos mælkegivende dyr og dermed forbundet forøget tilgængelighed af mælk til det behandlede dyrs afkom, forbedret muskelstørrelse, forbedret fodernyttevirkning, formindsket kropsfedt og forbedret forhold mellem magert 25 kød og fedt. Opretholdelse af forhøjede niveauer i blodet er tegn på en langsom frigørelse af den aktive bestanddel.

Når der opretholdes forhøjede niveauer i blodet af den aktive bestanddel, iagttages der almindeligvis egenskaber, såsom forøget mælkeproduktion, væksthastighed, forbedret fodemyt-30 tevirkning og forøgelse i magert kød. Den foreliggende opfindelse angår anvendelsen af de her omhandlede præparater til forbedring af mælkeproduktion, forøgelse af væksthastighed, forbedring af fodernyttevirkningen, forøgelse af magert kød hos dyr, forøgelse og opretholdelse af hormonniveauer i 35 dyrenes blodstrøm.

Ved en foretrukken udførelsesform for opfindelsen DK 169461 B1 5 indarbejdes det biologisk aktive protein, peptid eller poly-peptid i fedt- eller voks-mikrosfærer, som eventuelt også kan indeholde nogle eller alle de ovenfor beskrevne strække-midler, som derpå dispergeres i bæremediet. Mikrosfærerne, 5 fortrinsvis fedt-mikrosfærerne, kan have en diameter på indtil 1000 μιη, idet der til parenteral indgift foretrækkes en gennemsnitsstørrelse på 25-300 μιη. Mikrosf ærer indeholdende indtil ca. 70% biologisk aktivt protein, peptid eller polypeptid udviser en forsinket frigørelse af forskellig 10 varighed afhængig af den aktive bestanddels opløselighed og arten af anvendt voks eller fedt, overfladeaktivt middel, puffer og bæremedium.

Den foreliggende opfindelse angår som nævnt en formulering med langsom frigivelse eller et depotpræparat, som 15 indeholder en blanding af et fedtstof eller et voks eller en blanding deraf og et biologisk aktivt protein, peptid eller polypeptid dispergeret i et farmaceutisk og farmakologisk acceptabelt bæremedium. Der kan forekomme mikrosfærer og belagte proteinpartikler i depotpræparatet. Præparatet 20 kan være proteinet opløst i fedtstoffet eller vokset, eller der kan være en hydrofob vekselvirkning eller binding af den aktive bestanddel til fedtstoffet eller vokset. Til hormonindgivelse anvendes der præparater, som på vægtbasis indeholder ca. 1-30% væksthormon, somatomedin, vækstfaktor 25 eller biologisk aktivt fragment eller derivat deraf fortrinsvis med en gennemsnitspartikelstørrelse på mindre end 20 μιη, ca. 5-60%, fortrinsvis ca. 10-48% fedt, voks eller blanding deraf, og eventuelt indeholdende indtil ca. 15% strække-midler, såsom overfladeaktive midler, stabilisatorer, konser-30 veringsmidler, salte eller puffere eller blandinger deraf med en tilstrækkelig mængde af et farmaceutisk og farmakologisk acceptabelt flydende bæremedium til ialt 100%. Bæremediet er igen det vandige puffersystem eller oliesystem beskrevet ovenfor.

35 Til parenteral indgift af væksthormoner, såsom bovin væksthormon, har mikrosfærer, som på vægtbasis indeholder DK 169461 B1 6 ca. 5-40% af det faste hormon, fortrinsvis med en gennemsnitspartikelstørrelse på mindre end 20 jLim, indeholdende indtil ca. 20% af de øvrige ovenfor beskrevne strækkemidler i ca. 40-95% fedt eller voks eller en blanding deraf, med 5 en gennemsnitspartikelstørrelse på 25-300 μη vist vedvarende frigørelse af hormonet og vedvarende forøgelse i mælkeproduktion hos mælkegivende malkekøer i ca. 2 uger, og sådanne præparater foretrækkes. Disse foretrukne præparater har vist øget mælkeproduktion, som kan sammenlignes med den 10 mælkeproduktion, der opnås ved daglig injektion af bovin væksthormon.

Til indgivelse af præparater indeholdende vandopløselige proteiner, peptider eller polypeptider, såsom bovin væksthormon, foretrækkes der med vand ikke-blandbare væsker, 15 idet der især foretrækkes olier eller flydende fedtstoffer og med vand ikke-blandbare alkoholer og glycoler og blandinger deraf. Bæremedierne vælges således, at de både dis-pergerer og belægger blandingen eller mikrosfærerne og også giver injektionsblandingen en acceptabel viskositet, idet 20 der anvendes HLB-værdier (hydrofil-lipofil-balance) og viskositet som kriterier for deres valg.

På denne basis anvendes der som bæremedier til de her omhandlede præparater fedtsyreglycerider og blandinger deraf, som er flydende ved omgivelsestemperatur, inklusive 25 syntetiske olier, vegetabilske olier, såsom olivenolie, sesamfrøolie, jordnøddeolie, solsikkefrøolie, sojabønneolie, bomuldsfrøolie, majsolie, farvetisselolie, palmeolie, rapsfrøolie og kokosnøddeolie, animalske olier, såsom fiskeolier, fiskeleverolier, spermacetolier eller fraktioner deraf og 30 blandinger deraf, som har HLB-værdier i området fra 1-5 og viskositeter i området fra 10 cps til 1000 cps som målt med et Brookfield viskosimeter RTV under anvendelse af en spindel nr. 1.

De her omhandlede mikrosfærer kan fremstilles ved at 35 indarbejde den aktive bestanddel, som har den ønskede partikelstørrelse, og andre strækkemidler i et smeltet fedtstof, DK 169461 B1 7 voks eller blanding deraf og derefter forme mikrosfærerne ud fra den resulterende blanding ved anvendelse af en række forskellige teknikker, såsom emulgering eller forstøvning af blandingen, eller ved at bearbejde blandingen af bestand-5 dele og smeltet fedt, voks eller en blanding deraf mekanisk og derefter afkøle den, f.eks. ved anvendelse af en centrifugalskive som beskrevet i international patentansøgning PCT/US85/00827. Alternativt kan blandingen af aktive bestanddele, strækkemidler og fedt, voks og blandinger deraf 10 afkøles, hvorved der fås et fast stof, som derpå bearbejdes ved procedurer som valsning, formaling og lignende.

De her omhandlede blandinger egnet til injektion fremstilles let ved dispergering af proteinet, peptidet eller polypeptidet, strækkemidlerne, fedtstoffet, vokset 15 eller blandinger deraf ved forhøjede temperaturer direkte i bæremediet og efterfølgende afkøling.

De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af opfindelsen.

20 Eksempel 1

Fremstilling af iniicerbare mikrosfærer til parenteral indgivelse af bovin væksthormon.

1. Fremstillingen af bovin væksthormon og additiver i en passende størrelse til indarbejdning i mikrosfærer ved 25 forstøvningstørring kan gennemføres ved at opløse bovin væksthormon i fortyndet ammoniumhydroxidopløsning og derpå tilsætte de ønskede saltopløsninger, såsom natriumbenzoat.

Der tilsættes et ikke-ionisk overfladeaktivt middel, såsom en blokcopolymer af ethylenoxid og propylenoxid, og dette 30 får lov at opløses under konstant forsigtig blanding. Opløsningen forstøvningstørres derpå i et Buehi miniforstøvning-størreanlæg, model nr. 190.

2. Fremstilling af injicerbare mikrosfærer.

Der fremstilles en homogen blanding af aktive be-35 standdele og additiver i det smeltede fedtstof, voks eller blanding deraf, og den fremkomne blanding sprøjtes gennem DK 169461 B1 8 en luft/væskesprøj tedyse forsynet med en opvarmet kappe for at holde den indkommende luft og den smeltede fase ved en temperatur over smeltepunktet. Mikrosfærerne dannes, efterhånden som de smeltede små dråber afkøles og opsamles på en 5 række sigter i det ønskede størrelsesområde fra ca. 45 til 180 μιη og opbevares til senere anvendelse. De mikrosf ærer, som ikke har den ønskede størrelse, opsamles til recirkulering. Alternativt kan den homogene blanding ledes til en centrifugalskive, og de således dannede mikrosfærer opsamles 10 som beskrevet ovenfor, eller den smeltede blanding kan afkøles og valses til den ønskede gennemsnitspartikelstørrelse.

Ved at anvende den ovenfor anførte fremgangsmåde med de i tabel I anførte materialer fås der de i tabel II anførte injicerbare mikrosfære-præparater.

DK 169461 B1 9

TABEL I

Navn Betegnelse

5 Glyceryl-monostearat GMS

Glyceryl-distearat GDS

Glyceryl-tristearat GTS

Glyceryl-trilaurat GTL

Sojaolie Sojaolie 10 Bivoks Bivoks

Karnaubavoks Karnauba

Natriumlaurat NaLaurat

Natriumbenzoat NaBenzoat eller NaBz 15 Natriumcarbonat NaCarb

Natriumhydrogencarbonat BiCarb

Calciumbenzoat CaBenzoat

Polyoxyethylen-sorbitan-monooleat Overil.m. A

(20 mol's ethoxylering, "Tween" 801) 20 Blokcopolymer af ethylenoxid og propylenoxid,

("Pluronic" F682) Overfl.m. B

Glyceryl-dioleat GDO

Polyoxyethylenstearat, 23 mol's POE (23) 25 ethoxylering stearat

Polyethylen-glycol-distearat, PEG 1540

Gennemsnitsmolekylvægt for PEG 1540 distearat

Polyethylen-glycol, gennemsnits-30 molekylvægt 6000 PEG 6000

Polyoxyethylen-sorbitan-monostearat POE (20) sorbitan- monostearat

Med carbonat pufret saltopløsning 35 (pH 9,4) CBS

Polyethylen-glycol PEG

Blanding af kapryl-, kaprin-, laurin- og kapron-triglycerider "Miglyol" 8123 1 farebetegnelse anvendt af ICI Americas, Inc.

2Varebetegnelse anvendt af BASF Wyandotte Corp.

45 3Varebetegnelse anvendt af Dynamit Nobel DK 169461 B1 10

rH

0) Ό Ό

•H

ε +J fM co m — in

> HH OHO

•H fe. fe * o o o o o M w w» v

(0 »C ffl CQ B

φ · · · · · ό ε e ε ε ε (C · · · · ·

H HH Η Η H

<U <W <Η Η Η H

P P P P P P

0)1111111(1)0)110)0)0) >1 I I I I I l>>l l>>> o o o o o o rfp n P ^ > vø Λ vd o •H · ^ * P ·. *.

.μ in - h to o o

H c H '— o W W

Ό O ~ -P H -p +> Ό W -P to Λ «ϊ «3 P < \ (0 O \ 00

0) P P N J2 NI NI

-P 0) 2 C P c β r0 <w (0 0) ro 0) 0) P <HI I I I I Ih^CQOI ipoicq ro 2111111(0(0(011(01(0 Μαο< zss g s H g J Ψ H m « U η

CJ AQ

r . (O Ov M <p in in in - O ffirMt'-oooooininomooo

P > C'JC'OOHHC'JCNHHHHH

X m

•H

S

H

X 0) .. H

•Η ·Η O ·· pH Η σι -P o w w (0 2

g -r-ι tQ CO

O Q Q

tn o u \ s \

CO CO CO CO CO

S S Q E-( Eh

C5 O O O O

P

c

-P

Co pHcMn-^'invor'CO^OHojn·^

(0 Η Η Η Η H

O

K

P

Or DK 169461 B1 11 i—I CD Ό Ό

•H

e

•P

>

•H

-P

* cd

CD

Ti

CO

H

<W

P

<D

>iiiiiiiiiiiii! o I I I I I I I i i < I 1 1 <λ° 5-1 CD ^ — > H »a* . -H · ·- *

-Ρ -P W H H

cd -H C ^

W Ό O -P -P

4J Ti W cd cd P P < N o o

O CD P N N

<W +J CD C C

^— 03 4-1 CD CD

p q_l cq CQ

Htd diicdiiiicoiii«!!

Ha aiiuiiiisiiiiii «

PI P

w a

III I

< CD

E-t P — W o\° 4-1 ω in ιο in in in OK - · *- * " p >coininr^inr^cMinr^t^ot^oin

14 DQ Η Η H rH Η Η CM Η H

-H g «—I H '—'

.. CM

. o\ C\ ··

H H n H

·* ^ ^ 'w1* X cn — •H w H 0) Cd

lj ·· ·γΗ _Q

+i ω σι η 3 cd X w o co g o cd c

> W ·η P

•p g O cd Λ ϋ ω Μ \ \ \ \

W W WWW

EH eh Eh g Η ο ο ο ο ο Ρ c -Ρ <ΰ ρ

cdiovot^oocTcOHcMn'iinvor'CO

QHHHHHCMCMCMCNCMCMCMCMCM

ffi Ρ a DK 169461 B1 12

iH

0) Ό Ό

•rH

E

+J in— n « n c\) ^ μ ^ co > o m HHH Η Μ H 04 'tf rH ftk *>. V S V < V ^ v 4-> o o ooo ooooo (C CQ CQ CQCQCQ ff) O rtj < < (2) ·· ··· «··«·

TS E E EEE £ E E E E

· · ··· ·····

iH i—I rH HHH i—IHiHrHrH

(μ| (|H<M «Η «Η <4-1 U-) <4-4 <4-1 M-) <4-1

M MM Μ Μ M Μ Μ Μ Μ M

φ a) <d ψψα) οι o) φ m α) i >1 >>l >>>l >>>>> O I O O I OOO I ooooo

<λ° (M

ΤΓ — H

<U — in — — — >-· > co r' ίο (N ID Λ -rH · « ****· (-1

4-JlflO OHCOH (C

-rH C —' O

Μ Ό O -P +J4J+J4J -H

<D TS & (0 (0(0(15(0 X! +i Kd V. O 0000 \ — (0 Μ N NNNN Λ

4J h 01 C C C C G M

ni (0 <4-1 o) o α) o) o (0 w a ‘w m m m cq m o 4J di 3(0111(0(0(0(011111(0 mm asiiissssiiiii»· o a <w i w φ

M

H IB

H <H —

M o\P

XI O --

Η M

pa Λί ec <-h >oooininininminininininin

En S CQHHHOOtMCMCMnjMCMOJCMOjn]

*H

M

4J

(0 s

M

c

4J

(0

M

(OoorHcvjn^invon'OooHfO

OnjcnmnMnfnnnrori'S'^rj« tø

M

a DK 169461 B1 13

In o' O' ·*

iH ^ VO

(U CO H

-d >— >— *d -p •Η -P (0

g -—· .—* —-* ^—· d P

cm o- o- o- Is· Q) (0 -pr-IHHrHH HQ)

> - - - - - 0 -P

-Hooooo o in

4J '—' '—- — •w- >— C *H

,* c <2 m <: < o ό <0..... f3

0) g g g g g CO

•d..... d ^ (OrHrHr—liHrH +1 10

H IH IH IH <M -HH

(Η p p p P P X3 p o) ω o) a) tu po

0) > > > > > I I O W I

>OOOOOI I W ft I

o

e*f> CM H

P H CM

> XI Λ Η Η Η H

•Η - PP ------ +JMiditinnNH ^ •HCOO'-''-''-''-

χ) PTJ O -Η -H -P -P -P -P

ιίΟΙ'ΰ^ΰΛβιβίϋιΐί w 4j <; \ \ \ o o o o •P d ΡΛΛΝΝΝΝ

PP 0) p p C C C C

Od <h d d Φ (D O 0) «Η ft IHUUOQCQCQCQ i '—ft dddddddiiii

p ft 2; £5 25 25 & O I I I

H ft

Η I

0)

P) P

W ft PQ m ^ < tø o\° BO ^

P

x æ -H >innnnromomoin

g CQcMfoconnHrocMCMCM

-tf

CM

-—* H \

Η ·· ID

·· cm cm cm — - i

H O' H

— a> -«s* o x æ -η - o -H Q H >t

p O O 0) Η -P

-p \ d -H O' d

d hI W -η Η IP

S B B O O Cd

O ϋ ω d d) <D

\ -ro Η -P

tn o >1 tn

X W X3 O

O \ -pc > to to I) o •h s s -π e

CQ O O Q I

P

c

•M

d p dn’tfinoo'COcnOHog ρ-#^,'ΐ'ί'ί'ί,#ΐΛΐΛΐη ft

P

ft DK 169461 B1 14 i —* i—i o r-- »—s 0) — c o in r*» Ό O O - - —' Ό g CO H +j •h cn I ^ — (0 g ^ C +> +> k (0 <0 rO ro 4J +> +J S-ι 54 0) > rO -H · (0 tO 4-> •H J-ι ~ Λ -—- 0) Q) in -p lOOOco 54 o 4-> -P ·Η a> - - - o - tn tn 54 (0 -P CK O cm x# -Η ·Η 4-1

0) DJ - -w- -w- -— Ό Ό I

*0 O O O — C

(C—.OOOO4JOO10 r-ι m o o o r\j t0OO4-i «wcgvocovow^i^.,#.,-) 54 ^ (0 Λ <dwoooh<i)0054

>OWWW04J«WO

o ft ft ft ft ft in ft ft cm <x> ~u 0) > -r-l · 4J tn

•H C - 5) O O 4-1 0) Ό K

10 4J < S tn ns u -P 54 O) M ro <h o a i-ι »w a rtiiiii iii

^-54 ft I I I I I III

a Η I H Q) 54 P3 8 Η 44 — om in o\o <0 «-E4 54 44 32

-H >00000 OOO

JS cQHcmncmoj naron

•H

54 4J cm cm cm cm cm cm cm cm

(OSSSSS E2S £30 0 0 0 0 OOO

• 54

C

4J

rO

54 (On-’tfinvor- co σ> o p in in in in in in in « 8 54 ft DK 169461 B1 15

Eksempel 2

Effektivitet af irri icerbare mikrosfaerer i forskellige bæremedier.

Virkningsfuldheden af forskellige injicerbare præpara-5 ter af mikrosfaerer i forskellige bæremedier bestemmes ved at anvende en analyse med en hypofysektomiseret rotte. Den hypofysektomiserede rotte producerer ikke sit eget væksthormon og er modtagelig for injiceret bovin væksthormon. Den målte reaktion er væksten over et tidsrum, såsom 10 dage.

10 Hver enkelt af de hypofysektomiserede albinorotter (Taconic Farms, Sprague Dawley-stamme) injiceres med en tilstrækkelig mængde mikrosfære-præparat fremstillet som beskrevet i eksempel 1, således at det opnås en 10-dages dosis på 800 μg (80 /xg/dag) bovin væksthormon i 0,2 ml bære-15 medium som anført i den følgende tabel III.

TABEL III Bæremedium

Navn Betegnelse

20 Glyceryldioleat gDO

Saltopløsning SAL

Kaprin/Kapryl-triglycerider C/C

Sojaolie Sojaolie

Diethylsuccinat DES

25 Aluminiummonostearat-gel Gel

"Carbowax" (fortykkelsesmiddel) THX

Prøvemetode.

Inden afprøvningen vejes dyrene, og de dyr, der skal 30 anvendes til prøven, udvælges på basis af legemsvægt. Kun de dyr, hvis legemsvægt er en standardafvigelse fra den gennemsnitlige legemsvægt for gruppen, vælges. Den resulterende gruppe deles derpå tilfældigt i behandlingsgrupper bestående af otte rotter pr. gruppe ved hjælp af en rando-35 miseringsprocedure frembragt af en computer. Forsøgsdyrene overføres derpå til et rent bur, og der anbringes fire rotter DK 169461 B1 16 i hvert bur. På den første forsøgsdag vejes forsøgsdyrene, og de dyr, som har en for stor vægttilvækst eller for stort vægttab (±5 g) udskiftes. Derefter anvendes dyrene til forsøget og behandles.

5 Ved afslutningen af den 10 dage lange forsøgsperiode registreres den samlede vægttilvækst for hvert dyr, og derefter bestemmes den gennemsnitlige vægttilvækst pr. rotte for hver behandling. Resultaterne af disse forsøg, som er opsummeret i den følgende tabel IV, viser effektiviteten af 10 det injicerbare præparat af mikrosfærer med forskellige bæremedier.

DK 169461 B1 17

TABEL IV

VIRKNINGSFULDHED AF INJICERBARE MIKROSFÆRER I FORSKELLIGE BÆREMEDIER

5 Mikrosfære- præparat 10-Dages iflq. eks. 1 Bæremedium Vækst (gram) 48 GDO 19,5 32 GDO 17,9 10 18 SAL 19,4 16 GDO 18,5 12 C/C 19,8 16 GDO 15,5 12 SAL 16,6 15 27 SAL 17,4 16 C/C 14,0 16 GDO/DES (4:1) 13,7 32 Sojaolie 15,6 39 Sojaolie 16,0 20 8 8% Gel/Sojaolie 14,0 34 8% Gel/Sojaolie 8,0 42 Sojaolie 12,6 43 Sojaolie 8,0 34 0,5% THX/Sojaolie 17,0 25 37 0,5% THX/Sojaolie 14,0 36 0,5% THX/Sojaolie 13,6 33 0,5% THX/Sojaolie 16,8 35 0,5% THX/Sojaolie 14,5 negative kontroller* 0,7±3,15 30 * Gennemsnitsvækst for 22 negative kontrolgrupper (ingen behandling) DK 169461 B1 18

Eksempel 3

Bedømmelse af væksthormon-mikrosfære-præparater til malkekoer.

Mælkegivende køer opdeles i grupper på 3-8 dyr. Under 5 hele forsøget fodres alle køerne med den samme mængde majsensilage, lucernehø og mælkekoncentrat tilstrækkeligt til at give 25 kg til 30 kg mælk pr. dag. Køerne behandles ikke i 2 uger, og den daglige mælkeproduktion og det bovine væksthormonniveau i blodet registreres for hver gruppe af dyr.

10 Forsøgs- eller kontrolformuleringerne anført i den følgende tabel V indgives derpå i forsøgsperioden. Væksthormonniveauet i blodet hos dyrene bestemmes ved gængse RIA-teknikker pero-disk, og mælkeproduktionsniveauerne registreres dagligt. Resultaterne af disse forsøg, som er opsummeret i tabel VI 15 og VII, viser effektiviteten af de her omhandlede præparater til forøgelse af mælkeproduktion og til forøgelse og opretholdelse af forhøjede væksthormonniveauer i blodet.

is DK 169461 B1 Φ ω Cp ri « 0) fl)

Μ Ό tP tP

O ' <tf (0 ' 'tf " <tf (0 QCOOHOHOOHOHTi CM _

K CT'CT'tT'lT’OO

>-Ht0ldc0ldCMl0l0lCl0H

CQ Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό Ό

Di -Η *H

g &i tn &> tP _ g g tP g g £ in g g g ^ o in o o 3 cm in cm in in in in -H Hen in cm n co cm *d 0) g

Φ Ό P iH

(B O in in in in CQ Λ - »

\ p CM CM CM CM

W O i \ \ \ \

s tu i Η Η Η H

P

0) *—. .—. —>

O HH H

λ: \ \ \ Q) g \ 'tf \ tf \ ^ ^ P ~—-S'-' - '—" Η *H H 0) H Q) Φ Η Φ

(0 τ) O -H O ·Η -H O -H

g φ >i Η Η Η >iH

g Η O Η O O HO

Η Φ tP (0 tP (0 CO ΪΡ CO

•H p CQ -Η -η H -o CQ -ro -H *rv CQ

-p fBCQSOSOCQO S O CQ

CQU=C0=C0OCQ = W U

> -P λ λ

μΙ) g CO CO CO CO

HQ) - - CO > X co co 'tf co <3 C -Η Γ"» t-~ t"

En cd P w w -P w co co co

P (0 I Eri E-ι I Q Eri I

Φ s I O O I o o i tr> c -H \ u u Φ o

Η -P

P <0 g w

P -H

O H -- ~ --

Η -H CM CM CM

»Q Η Η H

(0 * * *

4-1 H O O O

(/] Q) w \ «σ CQ CQ cq

Η Φ · · \ J

Φ Ή g g ~ g

o\° TS g · · CM

Ό HH \ λ H

4J-rri-p H <M H CM «1-1 10 g > P P Ύ ^ %

Pin-H φ φ Λ * φ cd CP -P > > i-l O > D C ,¾ O O <0 ' o ffi-H(0 \ \ O < \ P P Φ — —- *H · Λ ΟΦΤί ΙΟ Ό CQ g Ό i > cd - * \

Q) P I—I Η Η ,Q Η H

p φ CM ^ ^ P <M ·—

(BMP N N C0PN

CM C Φ CQ CQ U Φ CQ

W O > I Cd (0 IC0>(0 I

O W O I S S ISOS I

P

* •H in in in in SS*·*· *· *

> I -tf «tf I 'tf 'tf I

CQ I CM CM I CM CM I

J_j

S < CQ O QH (P O

DK 169461 B1 20 Q) W O'

•H - (O

W O t" O Ti O

0 D D> & 0> od O' 3 3 3 og 3 fe Ό Ό Ό Ό

> -H

CQ θ' o> O' ε ε ο> ε ε Ε ιη ο ο Ο r- ιη ιη ιη •η η η (Ί h Ό Φ ε (1) Ό Ρ μ Κ Ο ιη ιη CQ .c V ».

\ 5-1 CN <Ν ιη CO Ο \ \ I \ S fe Η Η I Η Ρ Q) Φ Η X \ ο) ε \ \ ^ X 3 ε ε τ—I 1Η ι—( 0) ιΗ 0) · (ti Ό Ο ·Η Ο -Η ι-Η _ ε tu ί>ι η κΝ η a . \ ε ιΗ ο η ο ο ΐ η ω θ' 3 O' 3 -Ρ ™ -Η Ρ -Η -ο ·Η η 01 Η _2+> « S Ο S Ο CQ 3

Τ' CQECQEWUW

“S _ ~ r\ c ω ω

0) - - I

> X η η -Η I

^ C ·η ο- c- CQ ιη ^3 Ρ'-' ~ \ 01 Η j -PWW co fe \ w tip (ti EH B I B 0 O' O' go) fe O O io>'— ^ < S' ^-5 \ u u 0) o

rP -P

3 3 ε w

P -H

o rH ^ ^ fe -P CO eg ja η h

3--P ip O O

ω qj w w

\ Ό W CQ

Η Ό q) -π ε e

<#P Ό E

Ό ιΡ H

.p ·Η 4J fe fe

3 E > P P

Ρ ω ·Ρ Q) 0) 3 O' -P > >

0 C X Ο O

(B 1H 3 \ \ Ρ Ρ Φ ~ 0 <D Ό vo vo 1 > 3 - d) P r—( Η «Ρ P <D fe —

« IQ P N N

fe C 3 CQ CQ

10 O > 3 3 II

O fe O fe fe II

P

fe •h in in S W - m > p· ι - CQ cm eg 1C- fe fe H b fe DK 169461 B1 21

TABEL VI

Gennemsnitlige mælkeproduktionsforøgelser fra forsøg med malkekøer.

5 % Forøgelse i mælkeproduktion sammenlig- net med ikke-doserede kontrolkøer_

Formulering nr._ Uge 1 Uae 2 Uae 3 Uge 4 A 10,5 13,9 12,3 14,7 10 B 16,4 21,1 19,2 20,8 C 17,8 19,4 17,3 19,3 D 9,2 16,7 15,6 15,8 E 8,4 7,3 16,0 4,0 F 6,7 4,5 13,8 9,8 15 G 9,6 19,3 9,5 3,7 H 7,4 14,0 6,0 4,0 I 11,1 10,6 4,1 6,3 J 14,2 13,1 20,1 24,5 K 17,7 4,9 3,6 0,1 DK 169461 B1 22

TABEL VII

Gennemsnitlig plasma-BVH-koncentration (ng/ml ved radioim-munoanalyse) ved forsøg med malkekøer.

5 Tid forløbet _Formulering nr._

(Daae^ A* B C D* E F

-24 hr 1,3 1,3 1,5 1,2 1,0 1,1 0 hr 1,4 1,2** 1,4** 1,1 1,0** 1,1** 10 3 hr 6,1 2,0 3,3 20,0 25,6 1,1 6 hr 5,2 6,9 8,5 7,2 50,1 1,2 1 dag 2,6 30,8 37,6 1,5 13,5 13,8 2 dage 2,4 9,7 20,1 3,7 7,2 8,4 5 dage 2,8 6,7 9,2 3,9 8,2 5,8 15 7 dage 2,9 7,3 9,9 7,4 8,2 6,9 9 dage 3,4 7,2 9,8 7,8 8,5 7,3 12 dage 3,7 6,4 8,5 3,8 2,9 1,8 14 dage 2,7 4,3** 5,6** 4,0 2,4** 1,5** 16 dage 3,2 14,2 21,2 5,5 45,7 15,7 20 19 dage 3,9 9,9 11,2 7,2 9,6 9,0 21 dage 3,2 14,7 12,9 6,4 8,1 7,5 23 dage 2,4 9,5 8,0 6,3 7,8 6,1 26 dage 2,5 7,8 8,4 5,4 5,4 3,7 28 dage 2,2 4,6 6,1 4,9 5,0 2,8 25 DK 169461 Bl 23 TABEL VII (fortsat)

Gennemsnitlig plasma-BVH-koncentration (ng/ml ved radioim-munoanalyse) ved forsøg med malkekøer.

5 Formulering Tid Formulering

Tid forløbet nr._ forløbet nr._

(Dage) J* K (Daoe^ G* Η I

-24 hr 2,3 5,2 -24 hr 3,0 5,3 3,1 0 hr 4,1 7,3** 0 hr 2,9 3,8** 3,5** 10 1 hr 12,2 34,5 3 hr 15,0 4,6 3,8 2 hr 15,3 57,2 6 hr 10,4 3,7 4,7 4 hr 15,8 127,8 1 dag 5,1 10,2 31,5 6 hr 12,7 102,7 2 dage 4,7 7,8 24,5 1 dag 4,4 107,7 3 dage 4,2 6,2 8,4 15 2 dage 4,0 33,3 4 dage 4,8 6,7 9,2 3 dage 4,1 15,3 5 dage 4,3 6,5 9,7 4 dage 4,7 13,1 6 dage 6,1 8,0 11,2 6 dage 5,7 15,8 7 dage 6,2 9,6** 13,1 8 dage 6,0 17,6 8 dage 6,0 18,0 11,9 20 11 dage 6,7 34,5 10 dage 6,5 16,8 13,1 13 dage 7,9 18,6 11,8 17 dage 5,2 16,5 11,0 20 dage 5,7 17,3 12,6 *Note: Blodprøver udtages inden den daglige injektion 25 ** Injektioner indgives om morgenen på disse dage, efter at blodprøven er taget.

DK 169461 B1 24

Eksempel 4

Langsom frigørelse af præparater ifølge opfindelsen i får.

Ved at anvende praktisk taget samme fremgangsmåde som beskrevet i eksempel 3 indgives præparaterne fremstillet 5 i eksempel l og anført i den følgende tabel VIII til grupper af får (3 dyr pr. gruppe) . Dyrene doseres med 3 mg BVH mikro-sfæreækvivalenter pr. kg legemsvægt. Der udtages dagligt blodprøver over en 30 dages periode, og disse analyseres for BVH-niveauet som beskrevet tidligere. Resultaterne af 10 disse forsøg, som er opsummeret i den følgende tabel VIII, viser effektiviteten af de her omhandlede præparater til opretholdelse af forhøjede væksthormonniveauer i blodet over et længere tidsrum.

DK 169461 B1 25 t—1 g O na in ro m o > rg n cm C cm <m cm H cm in Λ Λ α) •η ο to Ό Ό Η <D - g Λ ν (Τ' Ό •Η C Η CM Η (Μ η Ο Ο Ο Ο (tf Ρ Ο Η CM Η Η Η

•p (0 Η A

Li fC > Λ •to §

S

Η > ^ C ^ tJ· g ro ρ w cm P5g £ H K1 ^ «tfVO ID N N N N Ό Η 0 « > > &3 må ® 3 2 5 ω ro η 2 5 cu a> g -[—I J> "v o oo oooooo ζ e-HD ο o ^ in η h in m o g G G cm m h h (0 g ω to „ a § in o • o co o H & IT) 01

G G

-p -H -pH cm cm

tT> G O' G H H

ffi ω a ω ω co g > © > © 3 HH HH E = -H O ft = O SP Η 0) ¢) Η Ό go go 0 -η -Η 0 φ ^-Ρ w -Ρ >ι Η Η >ι g OH OH Η 0 Ο Η Q) W <0 Η tO CT3t0 θ' Ρ (Ρω (Ρ ω Ο ·Η ·η ·η Ο ·Η (8 ο\° ο\ο Ω g Ο Ο Q g m ιη·Η in-HO=wtoo = -Ρ 3 Ρ (Ο Ο (8 ρ η ^ in in μ (Μ <ί Ν ^ (Ρ η ΗΗ Ηηηηηη DK 169461 B1 26

iH

ε \

O

C n o o o

Kl N H CN VO'tfHH

Λ Λ Λ Φ •Η & ιΰ Ό Ό ιΗ Φ — Ε Λ \ θ’ Ο

•Η C

(OP Ο -Ρ (ϋ Η ο ο 5, ίθ> λη\ο η ηηηη •ίο §

^ S

Η -Η ® -Ρ $ ί3 c η ^ , 1 !Γ! (0 Ρ ΓΜ Ν Ν Ν Ν τ 05 ε λ ^ ι ιιιι g-, ω Η « ν *3* ^ <ί <n φ *5 ^ > α! Η J-ι η> Η 2 Jj 3 SS » § Η > 5 φ ο) ε j 2 *η > X Ο ο β ·η ο σ> σ> ι ιιιι g *g seen« ι ιιιι 1< (0 & ε ω (0 ft

rH

0 >ι 1-| O’ •Η • 3 , \ ~

•Η φ φ (—I φ rH

Ό -Η -Η ·· ·Η ··

ΦιΗιΗγΗγΗιΗΕ S — S

ε ο ο ^ ο —' Φ (0 to <0 h ·η ·η Μ ·π Ν « Ο Ο Η Ο Η CQ W CO CO CQ 00 -Ρ (0 Ρ to ρ co co invor^n φ η ·& r)> <# Ρ ft DK 169461 B1 27

Eksempel 5

Virkningsfuldheden af en blanding af bovin væksthormon ifølge opfindelsen i malkekøer.

Der fremstilles en blanding af bovint væksthormon 5 indeholdende natriumbenzoat (7% w/w) og en blokcopolymer af ethylenoxid og propylenoxid (0,5% w/w) ved forstøvningstørringsmetoden beskrevet i eksempel 1.1.

Den således fremstillede blanding (7,28 g) sættes til en omrørt opløsning af glyceryltristearat (19,5 g) i en 10 4/1 w/w blanding af en blanding af capryl-, caprin-, laurin- og capron-triglycerider (•'Miglyol" 812) 3/sojaolie (71 ml) ved 75-80eC. Blandingen omrøres ved 75-80°C, indtil den er homogen, hvorpå den afkøles. Det fremkomne præparat, som på vægtbasis indeholder 6,96% bovin væksthormon, 0,51% natrium-15 benzoat, 0,03% overfladeaktivt middel (blokcopolymer) og 73,0% bæremedium indgives til mælkegivende køer ved fremgangsmåden beskrevet i eksempel 3. Resultaterne af disse forsøg, som er opsummeret i den følgende tabel IX, viser effektiviteten af disse præparater til forøgelse af mælkepro-20 duktionen i længere tidsrum.

TABEL IX

Gennemsnitlige mælkeproduktionsforøgelser sammenlignet med ikke-doserede kontrolkøer.

25 % Forøgelse % Forøgelse

Uge 1_ Uge 2_ 15,7 12,0

Claims (10)

1. Formulering med langsom frigivelse, kendetegnet ved, at den indeholder væksthormon, somatomedin, vækstfaktor eller biologisk aktivt fragment eller derivat 5 deraf dispergeret i fedtstof eller voks eller en blanding deraf dispergeret i et farmaceutisk og farmakologisk acceptabelt flydende bæremedium, idet dog, når væksthormonet er okse-somatotropin, og det flydende bæremedium er en olie, voks ikke er til stede, og idet, når derivatet er et metal-10 kompleks af et væksthormon, det flydende bæremedium ikke er en olie.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af en formulering ifølge krav 1, kendetegnet ved, at ca. 1 til ca. 30% væksthormon, somatomedin, vækstfaktor eller biologisk 15 aktivt fragment eller derivat deraf, ca. 5 til ca. 60% fedtstof eller voks eller blanding deraf, 0 til ca. 15% overfladeaktivt middel, konserveringsmiddel, stabilisator, salt, puffer eller blanding deraf og olie indtil ialt 100% opvarmes til opnåelse af en homogen blanding, hvorpå blandingen af-20 køles til omgivelsernes temperatur til dannelse af formuleringen.

3. Formulering ifølge krav 1, kendetegnet ved, at væksthormonet er bovint, porcint eller aviært væksthormon .

4. Formulering ifølge krav 3, kendetegnet ved, at den på vægtbasis indeholder ca. 5 til ca. 27% bovint væksthormon, ca. 10 til ca. 48% glyceryltristearat, 0 til ca. 0,2% mikrobiologisk konserveringsmiddel og 0 til ca. 1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel og en neutral mono-, di-30 eller triglyceridvæske eller blandinger deraf indtil ialt 100%.

5. Fremgangsmåde til forøgelse af mælkeproduktion i mælkegivende dyr, kendetegnet ved, at dyret paren-teralt indgives en biologisk aktiv formulering med langsom 35 frigivelse, som er fremstillet ved opvarmning af ca. 1 til ca. 30% væksthormon, somatomedin, vækstfaktor eller biologisk DK 169461 B1 29 aktivt fragment eller derivat deraf, ca. 5 til ca. 60% fedtstof eller voks eller blandinger deraf, 0 til ca. 15% overfladeaktivt middel, konserveringsmiddel, stabilisator, salt, puffer eller blanding deraf og olie indtil ialt 100% til 5 opnåelse af en homogen blanding, og afkøling af blandingen til omgivelsernes temperatur til dannelse af formuleringen.

6. Fremgangsmåde til forøgelse af mælkeproduktion i dyr ifølge krav 5, kendetegnet ved, at formuleringen på vægtbasis indeholder ca. 5 til ca. 27% bovint 10 væksthormon, ca. 10 til ca. 48% glyceryltristearat, 0 til ca. 0,2% mikrobiologisk konserveringsmiddel og 0 til ca. 1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel og en neutral mono-, dieller triglyceridvæske eller blandinger deraf indtil ialt 100%.

7. Fremgangsmåde til forøgelse af vægttilvækst hos dyr, kendetegnet ved, at dyret parenteralt indgives en biologisk aktivt formulering med langsom frigivelse, som er fremstillet ved opvarmning af ca. 1 til ca. 30% væksthormon, somatomedin, vækstfaktor eller biologisk aktivt 20 fragment eller derivat deraf, ca. 5 til ca. 60% fedtstof eller voks eller blandinger deraf, 0 til ca. 15% overfladeaktivt middel, konserveringsmiddel, stabilisator, salt, puffer eller blanding deraf, samt olie til ialt 100% til opnåelse af en homogen blanding, og afkøling af blandingen 25 til omgivelsernes temperatur til dannelse af formuleringen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at formuleringen på vægtbasis indeholder ca. 5 til ca. 27% bovint væksthormon, ca. 10 til ca. 48% glyceryltristearat, 0 til ca. 0,2% mikrobiologisk konserveringsmiddel 30 og 0 til ca. 1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel og en neutral mono-, di- eller triglyceridvæske eller blandinger deraf til ialt 100%.

9. Fremgangsmåde til forhøjelse og opretholdelse af forhøjede niveauer i blodet af et biologisk aktivt protein, 35 peptid eller polypeptid, forbedring af fodernyttevirkning, forøgelse af væksthastighed, forøgelse af muskelstørrelse, DK 169461 B1 30 formindskelse af kropsfedt og forbedring af forholdet mellem magert kød og fedt i et dyr, kendetegnet ved, at dyret parenteralt indgives en biologisk aktiv formulering med langsom frigivelse, som er fremstillet ved opvarmning 5 af ca. 1 til ca. 30% væksthormon, somatomedin, vækstfaktor eller biologisk aktivt fragment eller derivat deraf, ca. 5 til ca. 60% fedtstof eller voks eller blanding deraf, 0 til ca. 15% overfladeaktivt middel, konserveringsmiddel, stabilisator, salt, puffer eller blanding deraf og olie til 10 ialt 100% til opnåelse af en homogen blanding, og afkøling af blandingen til omgivelsernes temperatur til dannelse af formuleringen.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, at formuleringen på vægtbasis indeholder ca. 5 15 til ca. 27% bovint væksthormon, ca. 10 til ca. 48% glyceryl-tristearat, 0 til ca. 0,2% mikrobiologisk konserveringsmiddel og 0 til ca. 1% ikke-ionisk overfladeaktivt middel og en neutral mono-, di- eller triglyceridvæske eller blandinger deraf til ialt 100%.