DK167006B1 - 5-hydroxy-1,4-naftoquinoner, fremgangsmaade til fremstilling deraf samt antifibrotisk praeparat indeholdende en saadan forbindelse - Google Patents

Description

DK 167006 B1

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte 5-liydroxy-1,4-naftoquinoner, fremgangsmåde til fremstilling deraf samt antifibrotisk præparat indeholdende en sådan forbindelse. Forbindelserne omtales hyppigt under 5 samlebetegnelsen fysiologisk aktiv substans P-23924 hvis enkeltindivider er karakteriseret som det vil ses senere i beskrivelsen.

Fra en afhandling af Peter R. Brook et al i J.Chem. Research (S) 1982, side 134-135, kendes forbindelsen 5,7-10 dihydroxy-6-metyl-1,4-naftoquinon. Den er kemisk nær beslægtet med ovennævnte forbindelser med den nedenfor viste almene formel I, men der er ikke i afhandlingen eller i andre publikationer tilskrevet den nogen biologisk virkning.

15 Protokollagenprolylhydroxylase er et enzym som spe cifikt hydroxylerer prolin-delen af protokollagen syntetiseret af ribosomer i dyreceller, og er en vigtig og hastighedsbegrænsende faktor ved biosyntese af kollagen. Blandt de forbindelser som vides at inhibere dets enzymaktivitet er jern-20 chelateringsmidler (fx a , a'-dipyridyl), SH-enzyminhibitorer +4· (fx p-klorkviksølvbenzoat) og visse tungmetaller (fx Cu og Zn++). Fordi disse stoffer ufravigeligt inhiberer biosyntesen af kollagen uspecifikt, bevirker de imidlertid alvorlige bivirkninger og kan ikke bruges som lægemidler. Hvis der kunne 25 findes et stof som ikke ville inhibere biosyntesen af ikke-kollagene proteiner men specifikt inhibere kollagen-biosyntesen, ville et sådant stof kunne anvendes til forebyggelse og behandling af organfibrose ledsaget af en excessiv akkumulering af kollagen såsom art.eriosclerose, levercirrhose, 30 scleroderm, keloid, reumatisk arthritis og pulmonær fibrose.

Under søgning efter et stof med evne til at inhibere pro-tokollagenprolylhydroxylase-aktivitet blandt mikrobielle me-taboliter opdagede nærværende opfindere at en aktinomycet stamme frembringer fysiologisk aktive substanser P-23924A, 3, 35 G, D, E og F, der er hidtil ukendte selektive inhibitorer af kollagen-biosyntese., Disse iagttagelser efterfulgtes af yderli- DK 167006 B1 2 gere undersøgelser, der nu har resulteret i den foreliggende opfindelse.

I overensstemmelse hermed er forbindelserne ifølge opfindelsen ejendommelige ved, at de har den almene formel 5 OH 0 CHoC0NHCHCH„S-CHo. i JL ^

COOH I II i| X

r2

1 2 10 hvor R betegner hydrogen, metyl eller hydroxymetyl, R

3 hydrogen eller metoxy og R hydroxy eller metoxy.

Nogle af de omhandlede forbindelser kan ifølge opfindelsen fremstilles ved en fremgangsmåde, der er ejendorrmelig ved det i krav 4's kendetegnende del angivne, altså ad mikrobiologisk vej.

15 Det antifibrotiske præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved det i krav 5's kendetegnende del angivne.

Nogle af forbindelserne med formel I er navngivet som følger: 3 DK 167006 B1 a ro a a a a a a a a tu (¾ u u u a u o 0 o o o o o

1 I I I I I

ro ro ro ro a a a x co u u u u xx o o o a o

I I I I I I

a a o o r—i ro ro ro cm cm a a a a a a ο ό a u u a

I I I I I I

QJ

co h .< a u q a a <D «3· 'sf <3< <3*

+J CO CM CM tM CM CM

M C> O') ΟΊ (D ΟΪ CT)

O CO CO CO CO CO CO

X CM CM CM CM CM CM

Ml II I I I

o a a a a a a a ω co to to co co

G G C C G G

(0 cd (0 ftJ (0 to

XX XX x +J r« +J XX XX

coco coco coco coco coco coco •H ,Q ·Η ,Q Ή ,£3 ·Η ,Q ·Η ,Q ·Η X3 to 3 c to 3 rn to 3 U to 3 Q to 3 H to 3 a οβιί1 om« o a ·3< o a «31 o a «a- o a ^

i—I CM rH CM H CM r-| CM i—i CM i—I CM

0>co OSco 0>σ> O > <o 0><o Ο > σ> 3 ·Η ·Η CO ·Η ·Η CO ·Η ·Η CO. ·Η ·Η a Ή -Η a ·Η ·Η a > co-pcM co -μ cm co -P cm co +> cm co -P cm co P cm to ><λ: i i >,x i >i^i i >λΧ i i a a a fe (¾ a ^ a a a a ^ a a etc a 4 DK 167006 B1

Desuden vil forbindelserne med den almene formel I undertiden blive omtalt generisk eller individuelt som Fysiologisk Aktive Substanser P-23924 eller for korthedens skyld som P-23924.

5 Den mikroorganisme der anvendes i overensstemmelse med den foreliggende opfindelse vil i det følgende også blive omtalt som en P-23924-producerende stamme.

Som det fremgår af krav 4 er den P-23924-produce-rende stamme Streptomyces sp. nr. 23924, i det følgende for 10 korthedens skyld også benævnt stamme nr. 23924, der blev isoleret fra en jordprøve opsamlet i Ishigakijima, Okinawa-præfekturet, Japan.

Karakteren for denne stamme nr. 23924, bestemt i overensstemmelse med de metoder der er beskrevet i International 15 Journal of Systematic Bacteriology 16_, nr. 3, side 313-340 (1966) er som følger, med mindre andet er angivet er kulturkaraktererne dem der konstateredes efter 14 dages inkubering ved 28°C.

(I) Morfologi 20 -

Monopodialt fra vegetative mycelier udstrækker der sig korte sporulerende filamenter som er spiralformede eller undertiden ufuldstændig spiralformede, åben-løkkede eller hageformede, uden dannelse af kranse. Modne sporekæder udviser i almindelighed 5 til 10 sporer i kæden. Sporerne er enten 25 cylindriske eller elipsoidiske og ligger i størrelse fra 0,4 til 0,7 x 0,7 til 1,2 μπι, med glat overflade.

(II) Kulturkarakterer

Graden af vækst (V), vækst og farve af luftmyceliet ; (LM) og dannelse og farve af opløselige pigmenter (OP) for 30 forskellige medier anføres i det følgende. Hvad angar farvebe-skrivelserne anvendes der de standardfarvekoder som angives i Color Harmyno Manual, fjerde udgave (1958) fra Container Corporation of America.

35 5 DK 167006 B1 (a) Sakkarosenitratagar (V) : dårlig (LM): sparsomt, lyst gråligbrunt (3ge) (OP): intet 5 (b) Glukoseasparaginagar (V) : dårlig (LM): intet (OP): intet (c) Glycerolasparaginagar 10 (V) : ingen (d) Stivelses-uorganisk saltagar (V) : god (LM): rigeligt, pulveragtigt, gråt (3 ih) (OP): gulligbrunt (4 gc) 15 (e) Tyrosinagar (V) : dårlig (LM): sparsomt, gråt (3 ba) (OP): lyst gulligrødt (4 ea) (f) Næringsagar 20 (V) : moderat (LM): intet (OP): intet (g) Gærmaltagar (V) : moderat 25 (LM): sparsomt, gråt (3 fe) (OP): lyst gulligbrunt (4ne)

(h) Havremelsagar N

(V) : moderat ; (LM): sparsomt, lyst gråligbrunt (3 ge) 30 (OP): intet (III) Fysiologiske karakterer

(a) Temperaturområde for vækst: 15-35°C

(b) Gelatinesmeltning (glukosepeptongelatine, 24°C, 3 uger): positiv (svag) 35 (c) Hydrolyse af stivelse: positiv (d) Koagulering og peptonisering af skummetmælk: begge negative 6 DK 167006 B1 (e) Reduktion af nitrat: negativ (f) Produktion af melanoidt pigment:

Tyrosinagar: formodet positiv

Pepton-gær-jernagar: negativ 5 (IV) Assimilation af kulstofkilder (Pridham-Gottliebs agar) L-arabinose + Inositol D-xylose · ++ L-rhamnose - D-glukose ++ Raffinose D-fruktose + D-mannit 10 Sakkarose + Kontrol

Kode: ++ god vækst .

+ svag vækst ingen vækst

Det er klart af foranstående beskrivelse af organismens 15 karakterer at denne særlige stamme hører til slægten Strepto-myces.

Ovennævnte stamme Streptomyces sp. nr. 23924 har været deponeret i Institute for Fermentation, Osaka (IFO), Japan, under accessionsnummeret IFO 14205 siden den 20. september 20 1982, og samme mikroorganisme blev den 1. oktober 1982 deponeret hos Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry og International Trade and Industry (FRI), Japan, under accessionsnummeret FERM P-6739; denne . deponering er omdannet til en deponering 25 under Budapest-traktaten og opbevares hos FRI under accessions-nummeret FERM BP-338.

Det medium der bruges til dyrkning af den P-23924-produ cerende stamme · kan ;være et flydende medium eller et fast medium, og det er i almindelighed fordelagtigt at udføre dyrk-30 ning i rystekultur eller i aerob submers kultur under an- 35 7 DK 167006 B1 vendelse af et flydende medium. Mediet kan være af en hvilken ...» som helst art blot det er egnet til dyrkning af aktinomyceter og derved til frembringelse af P-23924 A, B, C, D, E og/eller F. Som kulstofkilder kan der således fx bruges glukose, lak- i 5 tose, glycerol, stivelse, sakkarose, dextrin, melasse eller organiske syrer såsom eddikesyre eller vinsyre. Som nitrogen-kilder kan der fx bruges pepton, Casaminosyre (fra Difco i •USA), N-Z-Amin A (fra Sheffield i USA) og andre proteinhydro-lysater, gærekstrakt, maltekstrakt, sojabønnemel, majsstøbe-10 vand, aminosyrer som fx asparaginsyre eller glutaminsyre, . eller forskellige ammoniumsalte som fx ammoniumsulfat eller ammoniumklorid. Det er også muligt at tilsætte uorganiske salte som fx forskellige fosfater såsom natriumdihydrogen-fosfat eller kaliummonohydrogenfosfat, metalsalte som fx 15 magniumsulfat, natriumklorid eller ferrosulfat eller tungmetalsalte såsom mangansulfat eller zinksulfat. Med henblik på at fremme stammens vækst kan der tilsættes vitaminer som fx vitamin B-^, kalciumpantothenat, nukleinsyre og béslægtede produkter som fx adenin og uracil. Desuden kan, alt efter den 20 anvendte dyrkningsmetode og de anvendte betingelser, udbyttet af P-23924 A, B, C, D, E og/eller F til tider forøges ved tilsætning af et antiskumningsmiddel såsom en silikon eller et propylenglykolæterderivat (fx "Actocol" fra Takeda Chemical Industries, Ltd., Japan), eller sojaolie til dyrknings-25 mediet.

Mens dyrkningstemperaturen og dyrkningstiden samt mediets pH-værdi og andre dyrkningsbetingelser afhænger af mediets sammensætning, skal det bemærkes at alle disse parametre skal vælges og kontrol-30 leres på en sådan måde at udbyttet af P-23924 A, B, C, D, Ξ og/eller F maksimeres. Det er i mange tilfælde ønskeligt at gennemføre aerob dyrkning ved 20-40°C i 24-240 timer mens mediets pH-værdi holdes omkring 4-9. Udvinding af de fysiologisk aktive substanser P-23924 A, B, C, D, E og/eller F 35 fra dyrkningsmediet kan let gennemføres ved udnyttelse af passende procedurer i en kombination der er tilpasset til substansernes egenskaber. Blandt sådanne procedurer er eks- 8 DK 167006 B1 traktion med et organisk opløsningsmiddel som er neutralt eller svagt surt og ublandbart med vand, fx ætylacetat, butyl-acetat, kloroform, butanol, benzen, toluen, diætylæter, metylenklorid eller metylisobutylketon; adsorptionskromatogra- 5 fering under anvendelse af fx aktivt kul, silikagel eller (R) aluminiumoxyd, gelfiltrering på en "Sephadex" ^ kolonne, ion-bytterkromatografering ved hjælp af ionbytterharpikser og lignende metoder. Ved anvendelse af sådanne procedurer i passende kombination kan P-23924 A, B, C, D, Ξ og/eller F iso-10 leres som krystaller eller krystallinske pulvere.

Forskellige egenskaber af de fysiologisk aktive substanser P-23924 A, B, C, D, E og F som fremstillet i henhold til omstående eksempel 2 er som følger: (1) Fysisk-kemiske egenskaber: 15 a) Smeltepunkter: A 186-188°C, B 200-202°C, C 187-190°C, D 205-207°C, E 174-176°C og F 191-195°C.

b) Elementæranalyse, beregnet:

P-23924 C ; Η N S

20 A 54,75 + 1,0 4,92 + 0,5 3,77 + 0,5 8,09 + 0,5 B 53,74 + 1,0 4,99 + 0,5 3,26 + 0,5 7,29 + 0,5 C 52,43 + 1,0 4,72 + 0,5 3,50 + 0,5 7,82 + 0,5 D 52,58 + 1,0 4,61 + 0,5 3,55 + 0,5 7,84 + 0,5 E 52,18 + 1,0 4,58 + 0,5 3,19 + 0,5 7,55 + 0,5 25 F 51,67 + 1,0 4,75 + 0,5 3,45 + 0,5 7,30 + 0,5 c) Molekylvægt, baseret på massespektrum, og bruttoformel: P-23924 Molvægt Bruttoformel

30 A 393 C18H19N07S

B 423 C19H21N08S

C 409 C18H19N08S

D 409 C18H19N08S

E 409 C18H19N08S

F 439 C19H21N09S

9 DK 167006 B1 d) Specifik optisk drejning: P-23924 [a]j^ ^ metanol c(%) A -91 + 10° 0,50 5 B -90 + 10° 0,51 C -93 + 10° 0,51 D -62 + 10° 0,51 E -86 + 10° 0,50 F -91 + 10° 0,51 10 e) Opløselighed: P-23924 A, B, D og F er letopløselige i dimetylsulfoxyd, dimetylformamid, pyridin og 5%s vandigt natriumhydrogenkarbonat; opløselige i metanol, dioxan og 15 eddikesyre; tungtopløselige eller uopløselige i vand, acetone, kloroform, n-hexan og petroleumsæter. P-23924C er letopløselig i dimetylsulfoxyd, dimetylformamid, pyridin og 5%s vandigt natriumhydrogenkarbonat; opløselig i metanol, dioxan, acetone •og eddikesyre; og tungtopløselig eller uopløselig i 20 vand, kloroform, n-hexan og petroleumsæter.

P-23924 E er letopløselig i dimetylsulfoxyd, dimetyl-formamid, pyridin, 5%s vandigt natriumhydrogenkarbonat og metanol; opløselig i dioxan og eddikesyre;og tungtopløselig eller uopløselig i vand, kloroform, n-hexan og petroleumsæ- 25 ter· f) Ultraviolette og synlige absorptionsspektre: se fig.

1% 1-6. Bølgelængderne i nm og værdierne for E^cm som giver absorptionstoppe straks efter opløsning i de respektive opløsningsmidler er vist i tabel 1. I fig. 1-6 repræsenterer den 2q fuldt optrukne linie - værdierne målt i metanol, den brudte linie med lige store liniestykker ------- værdierne i 0,1 N HCl-90%s vandig metanol og den brudte linie med

ulige lange liniestykker------værdierne målt i 0,1 N

NaOH-90%s vandig metanol.

35 10 DK 167006 B1 o o o in o oooino o o o in

'“'g cn μ* m* cm η σ> i* f n h moocMH

+I+1+I+I+I +I+I+I+I+I +I+I+I+I

i—i H

W r- oo m ό η* <d n h* o cn. o h m cm " cn h in cm id o H in Η o cn h h* co η μ* cm H oo η* h* cm H m r- cm h Ό — — — — — — — — — — — — — — tn

U C

K ~ h x; & <U cd ω cn tn — o — o o

1-1 CM CM CM CM H CM CM CM CM H CM CM CM H

® tn ® +I+I+I+I+I +I+I+1+1+I +1+I+I+1 h M-t I-Hoinvoo H O ID ID O CO CD CD o CM id CD O CM CM ID CD O CM Η m CO H* (1)

CM CM CM cn M* CM CM CM CO H* CM CM CM LO CO

-“v ooooo o o in o o oinotn

£ 00 Μ* M* CM H 00 Η* H* CM H in CM H

<x> u

Hr.H +I+I+I+I+I +I+I+I+I+I +I+I+I+I

W

" η o μ cf oo cn o rH o r' cm co in co

CT\ CT\ CM iH O OOCnnrHO 00 rH CM

^ η o ^ cl H i— m m1 cm rH er h cm H

pq tn ----- — — — — — — — — —

C

æ

H

Ή CD rj Λ tn ω 03 cm

H H —-0—0 O

® CM N (Μ N ri CM CM CM CM ri CM CM CM Π · i® +I+I+I+I+I +I+I+I+I+I +I+I+I+I -ri

C-* IH

O CM 00 00 O O rH 00 00 O ΙΟ Γ- M* O

CM ID ID O CM CM CO ID O CM H C") CO Η* φ CM CM CM n ej CM CM CM CO H CM CM CM in 03 o m ο o o in o in o o tn in

^ oi ^ in H (3i m< in h in Γ" cm H

„6 +I+I+I+I +I+I+I+I +I+I+I+I

<JP Ό

c* 1-1 IO ri CO (31 ef CM ID (O in H 00 H

M co cm in cm H h* r- ro o oo er n

' CO er er ri (33 ef er H in *D CM H

Φ — — — — — — — — — — — — < t3 tn _ ^

C Xi .C

$ 03 03 H

H — o — O o

Si CMCMCMH CM CM CM H CMCMCMH

tn tn +I+I+I+I +I+I+I+I +I+I+1+I ή

Ol l|_j W O CO O O Η H* O O <D 00 Γ' o CM Ό h CM CM CO CM H CO Hi φ (M CM CM er CMCMCMH* CM CM CM LO C/3 _ / / tn tn

T, / -H -H H

2 / A c ta c ό

η/ /Η Η (0 O (0 H

2/ / *T3 η υ>Η Φ > H 3 ' / v o koso Λ/-Η C 03 C 03 G 03

// I £ Φ 2 o\o ctf 2 (Ao (C

// g ™ +J ΗΟ-Ρ Ho+J || // h e Φ ·< cn Φ *r σ\ Φ // q,-h S o i g o i g d;

V Q C___ CD

1 1 DK 167006 B1 ooooo o o o o o o o o o

οι ·ϊ ^ o) Η ΟΊ^^ΟΊΗ id Γ·~ co H

g

ov o + I +1 +1 +1 +1 +I+I+I+I+I +I+I+I+I

i—I i—! Μ id σ H m Η cn ^ co o r-~ oo o r·' tn

(o h oo o οι m t-~ oo o o <3* ro m H

co ro ro cn oo co ro cn iH in cn >—i r fc C Λ ^ gi! Λ Λ t—i tn to cn cl) ^ in — in —- o · vo

t7> CN CN CN CN <—I CNCNCNCNiH CNCNCNCN

® +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1+1 tn

m --H

CN CN 00 00 O H CN Γ- Γ'» in CN ID O CN 4-1 CN ID ID O CN CN ID ID O H CN CO t"- O' CN CN CN CO -¾1 CN CN CN CO O' CN CN CN in (1) ω ^ o o in o o o o m o in in in £ σ o o h cn nt m h m id cn h # u ,

r-c η +1 +1 +1 +1 +I+I+I+I +I+I+I+I

+j w (0 — η η in oo σι H in r» co ro H cn cn in cn co cn id i—) o cn n~ co ro cn

4J <U co (O <ί H 00 O O r-l lo (N H

o ω £>

IH w C

« I—i +S. - H 0) si Xi tn cn to in i—i t—c — o - o o Q) S CN CN CN t—I CN CN CN H CN CN CN r-H · ^

"cd +I+I+I+I +I+I+I+I +I+I+1+I

EH +1

HCOHO Η O H O 10 CO Γ' O

(N ID h (N CN ID Is (N t—I CO 00 ^ 0)

CN CN CN O1 CN CN CN O' CN CN CN in M

Λ o in o o o m o o inoino

CO N1 Μ H CO CN ri O' ID tn rH

o\o o + i +1 +1 +1 +I+I+I+I +I+I+I+I

. '""w""1 o σ cn cn id σ oo ιο Η σ' — ιοιηοο ιο m o σι <o Γ' co oo o' cn η h ej cn ej in in Q) ^ ^ —· Q *0 C ΤΗ O o o QJ CN CN CN H CN CN CN Ή CNCNCNCN O1 (H +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 + I +1 +1 +1 +1 m o r-ι id o oHiDO id σ o Q)

^ CN Ϊ— O CN CN O CN H CO σ O' W

CN (N CO CN CN CO O' CN CN CN LO

77 cn Cn % / / Ό Ό S / / c « c S/ /η h ni o ns

™//ω H u > H «0 > H

7/ / $ o m o 20 X / Ό C in ci tnc ^ / , -H cd <z ov <ti 2 o\o cd

//iil + HO-P HO+J

//¾¾ CU - cn (L) -σα> / Ά c S o I g o i g l__o c ___--- 12 DK 167006 B1 g) Infrarøde absorptionsspektre: de infrarøde spektre målt ved kaliurabromidskive-metoden er vist i fig. 7-12. De vigtigste bølgetal som giver absorptionsmaxima er som følger:

i) P-23924A

5 3300, 2930, 1710, 1665, 1640, 1620, 1570, 1540, 1500, 1460, 1420, 1380, 1335, 1280, 1240, 1200, 1180, 1110, 1040, 1000, 970, 900, 860, 800 10 Se fig. 7.

ii) P-23924B

3300, 2950, 1725, 1705, 1660, 1630, 1590, 1540, 1460, 1420, 1370, 1330, 1300, 1270, 1210, 15 1190, 1170, 1130, 1100, 1060, 1020, 980, 950, 890, 860, 790, 760, 700

Se fig. 8.

iii) P-23924C

20 3400, 3070, 2940, 1720, 1680, 1635, 1600, 1540, 1490, 1460, 1420, 1380, 1350, 1310, 1250, 1220, 1180, 1120, 1100, 1040, 990, 930, 880, 820, 800, 25 705

Se fig. 9.

iv) P-23924D

3400, 3300, 2960, 1720, 1670, 1635, 1610, 1540, 1440, 1380, 30 1340, 1300, 1260, 1220, 1205, 1130, 1100, 1060, 1000, 900, 870, 820, 800, 780, 690

Se fig. 10.

v) P-23924E

35 3550, 3300, 3080, 2950, 1725, 1660, 1640, 1610, 1570, 1540, 1490, 1455, 1420, 1380, 1325, 13 DK 167006 B1 1300, 1240, 1210, 1180, 1120, 1080, 1040, 1010, 940, 920, 860, 820, 800, 770, 700

Se fig. 11.

5 vi) P-23924F

3300, 1720, 1680, 1660, 1630, 1600, 1530, 1490, 1460, 1420, 1380, 1335, 1310, 1260, 1220, 1190, 1130, 1100, 1030, 1000, 10 980, 955, 870, 700

Se fig. 12.

h) Farvereaktioner: alle species af P-23924 A, B, C, D, E og F giver positive ferriklorid-, Rydon-Smith- og alkoholisk magniumacetat-reaktioner og negative ninhydrin- og Ehrlich-15 reaktioner.

i) Beskrivelse: alle species af P-23924 A, B, C, D, E og F er sure og fedtopløselige substanser der optræder som krystaller, krystallinske pulvere eller pulvere som har gul, / gulorange eller orangegul farve.

20 j) Kernemagnetiske resonansspektre: NMR-spektrene bestemt i dimetyl-dg sulfoxyd ved 400 MHz er vist i fig. 13-18. Ka-rakteristike signaler er vist i det følgende.

(i) P-23924A

δ DMSO-dg ppm: 1,86 (3H, s), 2,09 (3H, d, J=l,6Hz), 25 2,71 (IH, dd, J=8,8, 13,6Hz), 2,91 (IH, dd, J=5,0, 13,6Hz), 3,66 (IH, d, J=12,9Hz), 3,78(lH, d, J=12,9Hz), 3,96(3H, s), 4,47 (IH, dt lignende, J=5,0, 8,3, 8,8Hz), 6,89 (IH, g, J=l,6Hz), 7,09 (IH, s), 8,18 (IH, d, J= 8,3Hz), 12,-40 ( 1H, s) 30 Se fig. 13.

(ii) P-23924B

δ DMSO-dg ppm: 1,86 (3H, s), 1,95 (3H, s), 2,70 (IH, dd, J=8,8, 13,7Hz), 2,89 (IH, dd, J=4,9, 13,7Hz), 3,65 (IH, d, J=13,1Hz), 3,77 (IH, d, J=13,lHz), 3,95 35 (3H, s), 4,03 (3H, s), 4,47 (IH, dt lignende, J=4,9, 8,1, 8,8Hz), 7,11 (IH, s), 8,18 (IH, d, J=8,lHz), 12,59(IH, s)

Se fig. 14.

14 DK 167006 B1

(iii) P-23924C

δ DMSO-dg ppm: 1,85 (3H, s), 2,71 (IH, dd, J=8,8, 13,7Hz), 2,91 (IH, dd, J=4,9, 13,7Hz), 3,66 (IH, d, J=12,9Hz), 3,77 (IH, d, J=12,9Hz), 3,88 (3H, s), 5 3,95 (3H, s), 4,47 (IH, dt lignende, J=4,9, 8,1, 8,8Hz), 6,26 (IH, s), 7,15 (IH, s), 8,18 (IH, d, J=8,1 Hz), 12,73 (IH, s)

Se fig. 15.

(iv) P-23924D

10 δ DMSO-dg ppm: 1,85 (3H, s), 1,94 (3H, s), 2,73 (IH, dd, J=8,8, 13,5Hz), 2,92 (IH, dd, J=4,8, 13,5Hz), 3,64 (IH, d, J=12,8Hz), 3,76 (IH, d, J=12,8Hz), 4,00 (3H, s), 4,48 (IH, dt lignende, J=4,8, 8,1, 8,8Hz), 7,03 (IH, s), 8,17 (IH, d, J=8,lHz), 12,79 (IH, s) 15 Se fig. 16.

(v) P-23924E

δ DMSO-dg ppm: 1,85 (3H, s), 2,71 (IH, dd, J=8,5, 13,7Hz), 2,90 (IH, dd, J=4,9, 13,7Hz), 3,67 (IH, d, J=13,1Hz), 3,79 (IH, d, J=13,lHz), 3,98 (3H, s), 20 4,47 (2H, d, J=2,2Hz), 4,47 (IH, dt lignende, J= 4,9, 8,1, 8,5Hz), 5,47 (IH, s), 6,82 (IH, t, J=2,2Hz), 7,15 (IH, s), 8,18 (IH, d, J=8,lHz), 12,29 (IH, s)

Se fig. 17.

(vi) P-23924F

25 δ DMSO-dg ppm: 1,85 (3H, s), 2,70 (IH, dd, J=8,8, 13,7Hz), 2,90 (IH, dd, J=4,9, 13,7Hz), 3,67 (IH, d, J=13,1Hz), 3,80 (IH, d, J=13,lHz), 3,97 (3H, s), 4,10 (3H, s), 4,36 (2H, d, J=3,7 Hz), 4,47 (IH, dt lignende J=4,9, 8,3, 8,8 Hz), 4,93 (IH, bred t), 7,16 (IH, s), 30 8,20 (IH, d, J=8,3 Hz), 12,70 (IH, s)

Se fig. 18.

k) Rf-værdier på tyndlagskromatogrammer: Rf-værdierne på silikagelplader ("Merck"® , Vesttyskland, artikel nr.

5729) og reversfase HPTLC-plader (RP-8, "Merck" '-', artikel 35 nr. 13725) er som følger: 15 DK 167006 B1

Tabel 2 P-21924

Opløsningsmiddel I -—-—_____- ------

A B C D E F

5--- (1) silikagel- eddikisyifefr"7 °'39 °'42 °'30 °'19 °'12 °'22 i-propanol/eddike- 10 syre 96:4 0,45 0,48 0,29 0,57 0,45 0,39 (2) revers-fase plade, metanol/ vand 7:3 0,61 0,55 0,69 0,60 0,75 0,72 15

Da der ikke kendes nogen anden forbindelse med de ovenfor angivne egenskaber anses P-23924 A, B, C, D, E og F for at være hidtil ukendte stoffer.

Baseret på de beskrevne fysisk-kemiske egenskaber fore-20 slås følgende strukturformler for P-23924 A, B, C, D, E og F

OH O

CH^CONHCHCH^SCH-v^^V^^A./'1* hi 25 1 Γ Π 1 COOH *1 _ r3 i 1 2 3

Forbindelse r _R R__ 30 P-23924A CH3 H OCH3 P-23924B CH3 OCH3 OCH3 P-23924C H OCH3 OCH3

P-23924D CH3 OCH3 OH

35 P-23924E CH2OH H OCH3 P-23924F CH2OH OCH3 OCH3 1-6 DK 167006 B1

Biologiske egenskaber af P-23924 er som følger: a) Protokollagen-prolylhydroxylase-inhiberende aktivitet: denne inhiberende aktivitet bedømtes ved hjælp af den metode der er angivet af R.E. Rhoads (Methods in Enzymology XVII B, 5· 306/ 1971) under anvendelse af et partielt renset enzympræparat afledet af kyllingefostre i overensstemmelse med de af K.I. Kivirriko et al og J. Halme et al. (Journal of Biological Chemistry 242, 4007 (1967) og Biochimica et Biophysica Acta 198/ 460, 1967) angivne metoder og, som substrat, (Pro-Pro-10 Gly)j.*4H20, fremstillet af Tanpakushitsu Kenkyu Shoreikai (Protein Research Foundation Society), Osaka, Japan. Den koncentration af P-23924 der behøves til en 50%s inhibering af 100 μg (som protein) af nævnte partielt rensede enzympræparat var som følger:

15 P-23924A: 6,7 x 10_5M

P-23924B: 9,5 x 10_5M P-23924C: 5,7 x 10~5M P-23924D: 2,7 x 10_4M Ρ-23924Ϊ2: 2,1 x 10"5M 20 P-23924F: 2,1 x 10_5M

Disse resultater viser at P-23924 har stærk inhiberende aktivitet mod protokollagenprolylhydroxylases aktivitet.

b) Undertrykkende virkning på kollagen-biosyntese: 25 I overensstemmelse med den metode som er angivet af T. Ishimaru et al i Biochemical Pharmacology 3_1, 915 (1982) 17 DK 167006 B1 blev P-23924 indgivet intraperitonealt til 3 uger gamle SD-hunrotter en gang om dagen i 6 på hinanden følgende dage, og kollagen-indholdet og det ikke-kollagene proteinindhold i uterus sammenlignedes med det tilsvarende indhold hos kon-5 troldyr. Som vist i tabel 4 bevirkede P-23924 selektiv og signifikant undertrykkelse af kollagen-biosyntesen.

I resumé må det således siges at forbindelserne med formel I har protokollagenprolylhydroxylase-inhiberende virkning og selektiv undertrykkende virkning på bio-10 syntese af kollagen.

18 DK 167006 B1 -+3--------- 0 0 0 ø , Ή x

i Ή X

X O C o σ o Η σ uo

Dl y-rl I I rH rH CO ·Η Η

C 0 -H 0 -P

s-ι λ: o

0 X U

Xi Η Oi

•H

-----

C

H

C

dP 0 ø ø

rH

rH I I CO CO rH CM "S' CO

O ro ^ co ro co ro « ø I -Hg σι uo uo ro cn o co p- C O ro H* -—- h1—' ro ^ ro^ uo--' 0 "0 - ' - - U0 - CM - iH - uo - uo -uo

ØrH Ul O O O O O O OO 'O O O O OO

000 +1 +1 +|- +1 * +|- +|- +|- +1 - H ,ø P h «3« root"-ocnoinocMO p- o iH *ø ø p- o mvcovHvinvinv OC+J - - *· (li O-ι '•(li k&i ' fri 'fri

« -H 0 H CM CM —' (N '— CM -— CM— CM ^ CM

•si·_______ H I 0 tn 0 O H g P~ ro uo H ' ro σ ro

Xi p O - o o co in in in in to q^^cj co Γ'- ** v ·> v «.

E-« *0 3 * iH rH i—} r-i · rH rH rH

-HØM o, +| +| +| +| -fi +| +| Ή-HØ +| -tf i— cm iH ro ro o ø ø -P ro p- co σ o co p- cm -P -H ø σ ' — — — — — — 00 - o in ^ in in in

En -P -H CO rH i—IrHiHrHr-HrH

cn øi c ø- <cr uo co uo co co ro •P-P +[ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1

4-1 Øl in CM ro O CO CM CM H

0 8! p- p' p- p- Γ' ‘ p- P' p- K >

X

X ^ ^ ^ ^ ; ~ ^ • Øi Øl Øl Øi Øi Øl Øi Øi,X ø Øl 0 0

H 0. ZLX ZLX P.X 0-\ ZLX ZLX

Or in m\ m\ m\ in ø in\ in\ 0 — -g wøi -tji -p ε s e ε s iH co. cn cn cn ca O ca co.

0 P- I rH C^iH P-iH P-UO P- rH P-iH

-—' U) —' rH iH iH — rH -— rH — rH '— rH -

Η I CM I øl I I I I I

—- rH '— rH 0 rH fø i—I CQ ri Q ri Q iH pc] rH py O O -H O -M* 0 ^ O'T 0 -M* 0-^r 0 H-

rH 0 rH -H rH -H CM -H CM -H CM -H CM -H CM -H CM

0 Oø O Φ ΌΌσΌσΌσΌσΌσ'Οσ Οι Ρ 4-1 Pø 0 ø ro øro øro øro øro øro

01 41 m 4-1 P 0 P CM P CM P CM PCM pCM PCM

P 0 C4-) XJ4JI-PI-PI4JI4JI4JI

P O dP 00 00fl|WfL,0fl|0(l,0Cu0(p U «in « O CQ«iH-iSi+Si+iSi+Si+iS +

< ffl U

19 DK 167006 B1

Fodnoter svarende til asteriskerne i tabel 4 er som følger: x Inhiberingsgrad i % = — x 100

XX

Ikke-kollagent protein = samlet proteinindhold - 5 kollagenindhold.

XXX

Østradiol-178 opløstes i 5%s ætanol/fysiologisk saltopløsning.

I disse forsøg brugtes rotter i grupper på 10 individer. 1 g Den akutte toxicitét, udtrykt som LD^Q-værdier af P-23924 hos rotter indgivet ad intraperitoneal vej er som følger .

P-23924A: 100-200 mg/kg, P-23924B: 50-100 mg/kg, 15 P-23924C: 100-200 mg/kg P-23924D: over 400 mg/kg, P-23924E: ca. 50 mg/kg, P-23924F: 50-100 mg/kg.

Det gøres derfor gældende at P-23924 har lav toxicitét. 20 San nævnt foran har P-23924 foruden protokollagenprolylhydroxy- lase- inhiberende virkning også en selektiv kollagenbiosyntese-under-trykkende virkning og har lav toxicitét, og denne stofgruppe er derfor nyttig som inhibitorer af fibrose i dyriske væv og som biokemiske reagenser m.v.

25 P-23924 er derfor værdifuld som profylaktisk/terapeutisk middel mod organfibrose hos pattedyr som fx kaniner, rotter, mus, hunde, katte og mennesker, og kan indgives til sådanne dyr og mennesker til forebyggelse og/eller behandling af fx pulmonær fibrose, levercirrhose, nephrosclerose, arterioscle-30 rose, scleroderma, myelofibrose og kronisk arthritis.

Dosis af P-23924 varierer med sygdommens art, individets tilstand, individets art og indgiftvejen og lignende parametre. Til forebyggelse/behandling af organfibrose indgives omkring 0,2-20 mg/kg, fortrinsvis omkring 2-20 mg/kg om dagen i en en-35 kelt dosis eller indtil 3 deldoser.

P-23924 kan administreres oralt eller parenteralt som sådant eller i kombination med farmaceutisk acceptable bærestoffer excipienter eller fortyndingsmidler i sådanne dosis- 20 DK 167006 B1 former som pulvere, granuler, tabletter, kapsler, injektionspræparater og andre sædvanlige farmaceutiske præparater.

Ved fremstilling af præparater til oral indgift kan 5 der bruges passende mængder af bindemidler som fx hydroxy- propylcellulose, eller macrogol; desintegreringsmidler som fx stivelse eller kalcium-karboxymetylcellulose; excipienter som fx laktose eller stivelse og smøremidler som fx magniumstearat og talkum.

10 Ved fremstilling af præparater til parenteral eller ikke- oral indgift, fx til fremstilling af injektionspræparater, kan der bruges isotoniserende midler som fx glukose, D-sorbitol, D-mannitol og/eller natriumklorid; konserveringsmidler som fx benzylalkohol, klorbutanol, metyl-p-hydroxybenzoat eller pro-15 pyl-p-hydroxybenzoat; og pufferstoffer som fx fosfatpuffer eller natriumacetatpuffer.

P-23924 kan også bruges som biokemiske reagenser, fx som inhibitor af kollagen-biosyntese i dyreceller under dyrkning, eller som specifik inhibitor af protokollagenprolyl-20 hydroxylase-aktivitet.

• På tegningen viser: fig. 1-6 ultraviolette og synlige absorptionsspektre af de fysiologisk aktive substanser P-23924 A, B, C, D, E og F.

25 fig. 7-12 infrarøde absorptionsspektre af dis se substanser og fig. 13-18 kernemagnetiske resonansspektre for disse stoffer.

; De følgende eksempler tjener til nærmere belysning af 30 forbindelserne ifølge opfindelsen og deres fremstilling samt præparater ifølge opfindelsen. Når der i beskrivelsen refereres til dyrkningsmedier er alle procenter udtrykt som v/r (vægt/ rumfang, dvs. forholdet mellem vægtenheder af faststof og rumfangsenheder af væske er som mellem g og ml).

35

Eksempel 1

Der brugtes en kultur af Streptomyces sp. nr. 23924 (IFO 14205, FERM BP-338) til podning af 400 ml af et flyden DK 167006 Bl 21 de medium indeholdende 2,01 glukose, 1,0% glycerol, 0,5% råt sojabønnemel, 0,5% majsstøbevand, 0,3% "Polypepton" (Daigo Nutritive Chemicals, Japan), 0,3% natriumklorid og 0,5% kalciumkarbonat i hver sin af fem 2 liter store Saka-5 guchi-kolber. Dyrkning ved 28°C på en frem- og tilbagegående ryster i 2 dage gav ca. 2 liter af en kultursuppe. Denne kultursuppe overførtes til en 200 liter stor tank indeholdende 100 liter af samme medium som beskrevet ovenfor, og der dyrkedes ved 28°C i 2 dage under luftning og omrøring. 60 liter 10 af det således vuridne flydende kulturmedium overførtes til en 2000 liter stor gæringstank indeholdende 1200 liter af et flydende medium indeholdende 4% opløselig stivelse, 2% affedtet sojabønnemel, 0,1% natriumtiosulfat, 0,05% magniumsulfat, 0,05% dikaliumhydrogenfosfat og 0,03% kaliumklorid (pH 6,0), 15 og der dyrkedes ved 24°C i 5 dage under luftning og omrøring. Til 1150 liter af den på denne måde vundne gæringssuppe sattes der 15 kg "Toko Perlite" nr. 34 (Toko Perlite Kogyo, Japan) og blandingen filtreredes pa en filterpresse der i forvejen var overtrukket med 34 kg "Hyflo" ®-"Supercel" (filterhjælpemiddel fra 20 Johns-ManviIle Products, USA) for at fjerne mycelier og faste materialer. Der vandtes ca. 1000 liter af et filtrat. Mycelierne og de faste materialer vaskedes med 150 liter vand og filtreredes på ny til frembringelse af ca. 150 liter vaskevæsker .

25 Filtratet og vaskevæskerne forenedes, reguleredes til pH 3,0 med svovlsyre og underkastedes modstrømsekstraktion i en Podbielniak ekstraktor model 6150 (Podbielniak, USA) under anvendelse af 1/2 rumfang ætylacetat. Den resulterende ekstrakt, ca. 430 liter, genekstraheredes med 1/2 rumfang 30 l%s vandigt natriumhydrogenkarbonat hvorved der vandtes 215 liter af en ekstrakt. Denne ekstrakt reguleredes til pH 3,0 med svovlsyre, ekstraheredes på ny med 1/2 rumfang ætylacetat, vaskedes to gange med 1/2 rumfang vand og koncentreredes under nedsat tryk.

35 Koncentratet, 400 ml, førtes gennem en silikagelkolonne (4,6 x 65 cm; fra "Merck" ® i Vesttyskland), og efter passage af 500 ml ætylacetat udførtes der eluering med 3 liter l%s oxalsyre/ætylacetat.

22 DK 167006 B1

De aktive fraktioner, ca. 3 liter, forenedes, vaskedes med to gange 500 ml vand og koncentreredes til tørhed under nedsat tryk. Den faste remanens opløstes i ca. 300 ml dimetyl-sulfoxyd. Opløsningen fortyndedes med 30 ml vand og indførtes 5 i en præparativ væskekromatograf (fra Waters Associates, USA), Prep LC/system 500A forsynet med en Prep PAK-500/C^g kolonne. Der udførtes eluering med 3 liter metanol/vand 1:1, 5 liter metanol/vand 3:2 og 2 liter metanol i nævnte rækkefølge. Elu-atet opsamledes i fraktioner på 500 ml. Der vandtes fraktio-10 ner rige på P-23924A, C, D og E (fraktionerne nr. 2-8, 3,5 liter) og fraktioner rige på P-23924B (fraktionerne nr. 9-13, 2,5 liter). Ved henståen ved stuetemperatur gav de P-23924 B-indeholdende fraktioner orangegule krystaller af P-23924B i en mængde på ca. 2,3 g. Disse krystaller fraskiltes ved 15 filtrering og moderluden koncentreredes under nedsat tryk til ca. 1 liter. Koncentratet ekstraheredes med tre portioner ætylacetat på hver 1/3 rumfang, og de forenede ekstrakter tørredes over 50 g vandfrit natriumsulfat og koncentreredes til ca. 30 ml. Til koncentratet sattes der 200 ml n-hexan 20 hvorved der vandtes et råt orangegult krystallinsk pulver af P-23924B i en mængde på ca. 7,1 g. Det rå pulver omkrystalliseredes fra metanol og gav ca. 3 g krystaller af P-23924B.

Fraktionerne rige på P-23924A, C, D og E koncentreredes til ca. 100 ml, kromatograferedes på en silikagelkolon-25 ne (4,0 x 42 cm) og elueredes med 2 liter l%s oxalsyre/ætyl-acetat. Eluatet opsamledes i fraktioner på 100 ml hvorved der udvandtes fraktioner som var rige på P-23924A og D (fraktionerne nr. 2-7, 600 ml) og fraktioner rige på P-23924C og E (fraktionerne nr. 8-14, 700 ml).

30 De førstnævnte fraktioner, 600 ml, vaskedes med vand og koncentreredes til tørhed. Den faste remanens opløstes i 50 ml metanol. Opløsningen fortyndedes med 50 ml vand og indførtes i samme præparative væskekromatograf som nævnt ovenfor. Der udførtes eluering med 5,5 liter metanol/vand 1:1. Elua-35 tet opsamledes i 500 ml store fraktioner og tre fraktioner (1,5 liter) fra fraktionerne nr. 13-15 forenedes og koncentreredes til ca. 700 ml under nedsat tryk. Koncentratet eks- 23 DK 167006 B1 traheredes med 3 x 200 ml ætylacetat og de forenede ekstrakter afvandedes over 30 g vandfrit natriumsulfat og koncentre-redes til ca. 30 ml under nedsat tryk. Til koncentratet sattes der 200 ml n-hexan, hvorved der vandtes et råt orange-5 gult pulver indeholdende P-23924A og D i en mængde på 1,7 g.

Det rå pulver opløstes i 100 ml kloroform/eddikesyre 4:1 og kromatograferedes på en silikagelkolonne (3,5 x 52 cm). Der udførtes eluering med 400 ml kloroform/eddikesyre 4:1 og 1 liter kloroform/eddikesyre 7:3. Eluatet opsamledes i fraktio-10 ner på 10 ml hvorved der vandtes fraktioner rige på P-23924A

(fraktionerne nr. 25-29) og fraktioner rige på P-23924D (fraktionerne nr. 36-136).

De førstnævnte fraktioner, 50 ml, koncentreredes til tørhed under nedsat tryk og opløstes i 200 ml metanol. Opløs-15 ningen fortyndedes med 200 ml vand og underkastedes på ny kromatografering ved hjælp af samme præparative væskekromatograf som ovenfor. Der opsamledes fraktioner rige på P-23924A og de koncentreredes under nedsat tryk, ekstraheredes med ætyl-acetat og koncentreredes efter dehydratisering til frembrin-20 gelse af et råt pulver af P-23924A i en mængde på ca. 250 mg.

Det rå pulver omkrystalliseredes fra metanol til frembringelse af ca. 100 mg orangegule krystaller af P-23924A.

De fraktioner, 1 liter, som var rige på P-23924D koncentreredes til tørhed under nedsat tryk og den faste remanens 25 opløstes i ca. 500 ml ætylacetat. Opløsningen vaskedes med tre gange 200 ml vand. Ætylacetatlaget tørredes over 50 g vandfrit natriumsulfat og opløsningsmidlet afdestilleredes under nedsat tryk. Til det resulterende koncentrat, ca. 30 ml, sattes der 200 ml n-hexan, hvorved der vandtes et råt 30 pulver af P-23924D i en mængde på ca. 0,7 g. Det rå pulver opløstes i 25 ml kloroform/eddikesyre 4:1 og kromatograferedes på en silikagelkolonne (3 x 45 cm). Der udførtes eluering med kloroform/eddikesyre 4:1. De på denne måde opsamle-de fraktioner som var rige på P-23924D, 400 ml, koncentrere-35 des til 80 ml under nedsat tryk og koncentratet fortyndedes med 100 ml vand og ekstraheredes med tre portioner ætylacetat på hver 1/3 rumfang. De forenede ekstrakter vaskedes med vand, dehydratiseredes og befriedes for ætylacetatet.

DK 167006 B1 24 -

Det på denne måde vundne rå pulver, ca. 500 mg, om-krystalliseredes fra metanol/eddikesyre 1:5 til frembringelse af et krystallinsk orangegult pulver af P-23924D i en mængde på ca. 330 mg.

5 på den anden side vaskedes de fraktioner som var rige på P-23924C og E (fraktionerne nr 8-14, 700 ml), der - opsamledes ved den ovenfor beskrevne silikagelkromatografering-, med vand og uenydratiseredes, hvorpå ætylacetatet af destillere des. Remanensen opløstes i 50 ml metanol. Opløsningen fortyn-10 dedes to gange med vand og indførtes i en præparativ væske-' kromatograf (samme kolonne som ovenfor). Der udførtes eluering med metanol/vand 1:1. Eluatet opsamledes i fraktioner på 200 ml. Der vandtes fraktioner rige på P-23924E (fraktionerne nr. 10-13, 800 ml) og fraktioner rige på P-23924C (fraktioner-15 ne nr. 14-18, 1 liter).

De fraktioner som var rige på P-23924E koncentreredes under nedsat tryk, ekstraheredes med tre portioner ætylacetat på hver 1/3 rumfang og koncentreredes efter dehydratisering til ca. 20 ml. Til koncentratet sattes der 200 ml n-hexan, 20 hvorved der vandtes et råt orangegult pulver af P-23924E i en mængde på ca. 120 mg. Det rå pulver opløstes i 30 ml kloro-form/metanol 3:2 og kromatograferedes på en silikagelkolonne (3 x 45 cm). Der udførtes eluering med kloroform/metanol 3:2.

De på denne måde vundne fraktioner som var rige på P-23924E 25 koncentreredes til 10 ml. Til koncentratet sattes der 10 ml ætylacetat og 50 ml n-hexan, hvorved der vandtes et krystal-linsk orangegult pulver af P-23924E i en mængde på ca. 30 mg.

De fraktioner, 1 liter, som var rige på P-23924C kon- . centreredes til tørhed under nedsat tryk og den faste rema-30 nens opløstes i 15 ml kloroform og kromatograferedes på en silikagelkolonne (3,0 x 45 cm). Der udførtes eluering med kloroform/eddikesyre 4:1 til udvinding af fraktioner som var rige på P-23924C. Disse fraktioner koncentreredes til tørhed hvorved der vandtes et råt pulver af P-23924C i en mængde 35 på ca. 150 mg. Det rå pulver opløstes i 70 ml ætylacetat og opløsningen vaskedes med 3 x 20 ml vand og dehydratiseredes over 2,5 g vandfrit natriumsulfat. Ætylacetatopløsningen kon- 25 DK 167006 B1 centreredes til ca. 10 ml under nedsat tryk.

Til koncentratet sattes der 25 ml n-hexan hvorved der vandtes ca. 85 mg orangegule krystaller af P-23924C.

På den ovenfor beskrevne måde, dvs. fremgangsmåder med 5 ekstraktion af kultursuppen med ætylacetat, genekstraktion med l%s vandigt natriumhydrogenkarbonat, ekstraktioner med ætylacetat i eddikesyre, vask med vand og koncentrering vandtes der 200 ml af et koncentrat.

Dette koncentrat førtes gennem en silikagelkolonne 10 (4,6 x 65 cm; fra "Merck" ®) og der udførtes eluering med to liter ætylacetat og derpå med 7 liter ætylacetat indeholdende 1% oxalsyre. De aktive fraktioner, 2 liter, der i hovedsagen indeholdt P-23924F, opsamledes, vaskedes med to gange 300 ml vand og koncentreredes derpå under nedsat tryk til en fast 15 remanens. Den faste remanens opløstes i 80 ml kloroform/eddi-kesyre 9:1. Opløsningen førtes gennem en silikagelkolonne (3,4 x 54 cm) og der udførtes eluering med 1,2 liter kloroform/ eddikesyre 9:1, 1,2 liter kloroform/eddikesyre 8:2 og 1,2 liter kloroform/eddikesyre 7:3 i nævnte rækkefølge. De aktive 20 fraktioner, ca. 1,5 liter, der hovedsagelig indeholdt P-23924F, opsamledes og koncentreredes under nedsat tryk til en fast remanens. Den faste remanens opløstes i 400 ml metanol/vand 1:1 hvorpå den således vundne opløsning indførtes i et system til præparativ væskekromatografi, Prep LC/system 500A forsynet 25 med en Prep PAK-500/Clg kolonne. Eluering udførtes med 5 liter metanol/vand 3:2. De fraktioner som hovedsagelig indeholdt P-23924F opsamledes og koncentreredes under nedsat tryk til frembringelse af 1,3 g råt pulver af P-23924F. Det rå pulver underkastedes omkrystallisation med metanol/vand 8:2 hvorved 30 der vandtes ca. 500 mg gulorange krystaller af P-23924F.

Eksempel 2 60 liter af en podekultur opnået på den i eksempel 1 25 beskrevne måde overførtes til en 2000 liter stor gæringstank indeholdende 1200 liter af et flydende medium indeholdende 4% opløselig stivelse, 1% dekstrin, 2% affedtet sojabønnemel, 0,1 % natriumtiosulfat, 0,05% ferrosulfat-heptahydrat, 0,05% 26 DK 167006 B1 dikaliumhydrogenfosfat og 0,03% kaliumklorid (pH 6,0), og kulturen dyrkedes ved 24°C i 6 dage under luftning og omrøring. Kultursuppen, ca. 1100 liter, filtreredes, ekstrahere-des med ætylacetat, genekstraheredes med natriumhydrogen-5 karbonat og ekstraheredes påny med ætylacetat på samme måde som i eksempel 1. Denne ekstrakt koncentreredes til 700 ml.' Koncentratet kromatograferedes på en silikagelkolonne (5,4 x 65 cm). Efter passage af 3 liter ætylacetat udførtes der eluering med 10 liter 1% oxalsyre/ætylacetat. Der udvandtes 10 eluatfraktioner rige på P-23924A, B og D (2,6 liter) og fraktioner rige på P-23924C og E (4,2 liter) samt P-23924F (3,0 liter) .

Førstnævnte fraktioner vaskedes med vand og efter dehy-dratisering afdestilleredes ætylacetatet. Remanensen opløstes 15 i 200 ml metanol. Til den resulterende opløsning sattes der 200 ml dimetylsulfoxyd og 200 ml vand. Denne opløsning indførtes i en præparativ væskekromatograf, Prep LC/system 500A forsynet med en Prep PAK-500/C^g kolonne. Der udførtes eluering med metanol/vand 1:1. Herved opsamledes der eluatfrak-20 tioner rige på P-23924A og D (2,5 liter) og fraktioner rige på P-23924B (3,1 liter).

Førstnævnte fraktioner underkastedes påny kromatografe-ring ved hjælp af samme væskekromatograf som ovenfor. De på denne måde vundne fraktioner koncentreredes og ekstraheredes 25 med ætylacetat. Denne ekstrakt dehydratiseredes og koncentreredes til 50 ml. Koncentratet førtes gennem en silikagelkolonne (4,5 x 70 cm) idet der udførtes eluering med 1,5 liter diklormetan/eddikesyre 9:1, 5,0 liter diklormetan/eddikesyre 8:2 og 2 liter diklormetan/eddikesyre 7:3 i nævnte rækkefølge. 30 Der opsamledes eluatfraktioner (1 liter) rige på P-23924A og fraktioner (1,2 liter) rige på P-23924D.

Førstnævnte fraktioner vaskedes med 3 x 300 ml vand og diklormetanlaget koncentreredes til tørhed. Den faste remanens opløstes i 200 ml metanol og fortyndedes med 200 ml 35 vand. Fortyndingen underkastedes præparativ væskekromatografi under samme betingelser som ovenfor. Der opsamledes fraktioner rige på P-23924A, de koncentreredes til fjernelse af metanolen og ekstraheredes med tre portioner på hver 1/3 rum- 27 DK 167006 B1 fang ætylacetat. Ekstrakterne forenedes, dehydratiseredes og koncentreredes til tørhed. Remanensen.opløstes i metanol. Ved henståen gav opløsningen krystaller af P-23924A i en mængde på 300 mg.

5 Den P-23924D-indeholdende opløsning (1,2 liter) koncentre redes under nedsat tryk. Koncentratet, 3 0 ml, kromatograferedes på en silikagelkolonne (3,5 x 50 cm) og elueredes med 1 liter •diklormetan/eddikesyre 9:1, 1 liter diklormetan/eddikesyre 8:2 og 1 liter diklormetan/eddikesyre 7:3 i nævnte rækkefølge.

10 De udvundne fraktioner rige på P-23924D (1,4 liter) koncentre-. redes til tørhed under nedsat tryk. Den faste remanens opløstes i 200 ml metanol og fortyndedes med 200 ml vand. Fortyndingen underkastedes præparativ væskekromatografering under samme betingelser som foran og der udvandtes fraktioner rige 15 på P-23924D (2,7 liter). Metanolen afdestilleredes under nedsat tryk. Koncentratet, 1,5 liter, ekstraheredes med tre portioner ætylacetat på hver 1/3 rumfang. Ekstrakten dehydratiseredes og koncentreredes til ca. 25 ml. Ved henståen gav koncentratet krystaller af P-23924D i en mængde på ca. 1 g.

20 De P-23924B-indeholdende fraktioner (3,1 liter) gav ved henståen ved stuetemperatur krystaller af P-23924B. Disse krystaller opsamledes og omkrystalliseredes fra metanol til frembringelse af ca. 3 g P-23924B.

De foran nævnte P-23924C- og P-23924E-indeholdende frak-25 tioner (4,2 liter) vaskedes med tre gange 1 liter vand og de-hydratiseredes over 30 g vandfrit natriumsulfat hvorpå ætylacetatet afdestilleredes. Remanensen opløstes i 200 ml metanol og fortyndedes med 200 ml vand. Fortyndingen underkastedes væskekromatografering under samme betingelser som foran og 30 der udvandtes fraktioner rige på P-23924E (1,8 liter) og fraktioner rige på P-23924C (2,4 liter). De P-23924E indeholdende fraktioner (1,8 liter) koncentreredes til ca. 50 ml under nedsat tryk. Koncentratet kromatograferedes på en kolonne (3,5 x 52 cm) af "Sephadex ^LH-20 (Pharmacia, Sverige), idet kolon-35 nen var pakket som en suspension i metanol og der elueredes med metanol. Fraktioner indeholdende P-23924E alene, 200 ml, forenedes og Koncentreredes til 20 ml under nedsat tryk. Til koncen- 28 DK 167006 B1 tratet sattes der 20 ml ætylacetat og 200 ml n-hexan, hvorpå der vandtes et orangegult krystallinsk pulver af P-23924E i en mængde på ca. 700 mg.

De P-23924 C indeholdende fraktioner, 2,4 liter, kon-5 centreredes under nedsat tryk. Koncentratet, 1,2 liter, eks-traheredes med tre portioner ætylacetat på hver 1/3 rumfang og aetylacetatlaget dehydratiseredes over 20 g vandfrit natriumsulfat hvorpå ætylacetatet afdestilleredes. Remanensen opløstes i metanol. Den resulterende opløsning gav ved hen-10 ståen rå krystaller af P-23924C. De rå krystaller omkrystalliseredes fra metanol og gav krystaller af P-23924C i en mængde på 1,5 g.

De foran nævnte aktive fraktioner, 3,0 liter, der hovedsagelig indeholdt P-23924F, vaskedes med vand og tørredes.

15 Ætylacetatet afdampedes og den således vundne remanens opløstes i 100 ml kloroform/eddikesyre 9:1. Opløsningen førtes gennem en silikagelkolonne (3,4 x 54 cm) og der udførtes elue-ring med 1 liter kloroform/eddikesyre 9:1, 1 liter kloroform/ eddikesyre 8:2 og 1 liter kloroform/eddikesyre 7:3.

20 De aktive fraktioner, 1,8 liter, der hovedsagelig in deholdt P-23924F opsamledes og koncentreredes til tørhed. Remanensen opløstes i 400 ml af metanol/v and 1:1. Den på denne måde vundne opløsning indførtes i en præparativ væske-kromatograf, Prep LC/system 500 A forsynet med en Prep PAK-25 500/C^g kolonne. Der udførtes eluering med 3,0 liter metanol/ vand 3:2. De aktive fraktioner, 2,4 liter, som hovedsagelig indeholdt P-23924F, opsamledes og koncentreredes hvorpå der udfældede sig rå krystaller af P-23924F. Omkrystallisation af de rå krystaller fra metanol/vand 3:2 gav 2,5 g krystal-30 ler af P-23924F.

29 DK 167006 B1

Eksempel 3 Tablet 1) P-23924A, B, E eller F 100 mg 2) Laktose 47 mg 5 3) Majsstivelse 40 mg 4) Hydroxypropylcellulose-L 12 mg 5) Magniumstearat 1 mg 200 mg/tablet 1Q En blanding af disse ingredienser tabletteres på den konventionelle måde (vådmetoden).

Eksempel 4 Kapsel 15 1) P-23924C 100 mg 2) Laktose 135 mg 3) Majsstivelse 60 mg 4) Magniumstearat 5 mg 2o * 300 mg/kapsel

Ovennævnte ingredienser 1), 2), 3) og 4) (halvdelen af ovennævnte mængde) blandes og granuleres ved den konventionelle metode. Til granulerne sættes den resterende mængde af ingrediens 4). Blandingen pakkes i en gelatinekapsel 25 nr. 1 (i overensstemmelse med tiende udgave af den japanske farmakopé).

Eksempel 5 30

Kapsel 1) P-23924D 300 mg 2) Laktose 135 mg 3) Majsstivelse 60 mg 35 4) Magniumstearat 5 mg 500 mg/kapsel 30 DK 167006 B1

De ovennævnte ingredienser 1), 2), 3) og 4) (halvdelen af den angivne mængde) blandedes og granuleredes ved den konventionelle metode. Til granulerne sættes den resterende mængde af ingrediens nr. 4). Blandingen pakkes i en 5 gelatinekapsel nr. 00 (i overensstemmelse med 10. udgave af den japanske farmakopé).

Claims (5)

1. 5 CH 0 CONHCHCH« S-CH ___JL JL ^R1 s 3 I 2 2YW i C00H I H li R3 R2 1 2 10 hvor R betegner hydrogen, metyl eller hydroxymetyl, R hydrogen eller metoxy og R3 hydroxy eller metoxy.
2. 2. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved at forbindelsen er fysiologisk aktiv substans. P- 23924C, dvs. en forbindelse med den i krav 1 viste alme- · 1 2 3 15 ne formel I hvor R er et hydrogenatom og R og R hver eh metoxygruppe.
3. 3. Forbindelse ifølge krav 1, kendetegnet ved at forbindelsen er fysiologisk aktiv substans P- 23924B, dvs. en forbindelse med den i krav 1 visté alme- 1 2 3 20 ne formel I hvor R er en metylgruppe og R og R hver en metoxygruppe, eller fysiologisk aktiv substans P-23924D, dvs. en forbindelse med den i krav 1 viste al- 1 2 mene formel I hvor R er en metylgruppe, R en metoxy- 3 gruppe og R en hydroxygruppe, eller fysiologisk aktiv 25 substans P-23924E, dvs. en forbindelse med den i krav 1 viste almene formel I hvor R er en hydroxymetylgruppe, 2 3 R et hydrogenatom og R en metoxygruppe, eller fysiologisk aktiv substans P-23924F, dvs. en forbindelse med den i krav 1 viste almene formel I hvor R^ er hydroxymetyl 2 3 30 og R og R hver en metoxygruppe.
4. 4. Fremgangsmåde til fremstilling af fysiologisk aktiv substans P-23924A, B, C, D, E og/eller F, med den i krav 1 angivne almene formel, kendetegnet ved at man dyrker mikroorganismen Streptomyces sp. nr. 23924 35 (FERM BP-338) i et medium så at mikroorganismen danner og DK 167006 B1 akkumulerer fysiologisk aktiv substans P-23924 A, B, C, D, E og/eller F, hvorpå man udvinder den eller de fysiologiske aktive substanser fra den resulterende kultursup-pe.
5. 5. Antifibrotisk præparat, kendetegnet ved at det indeholder fysiologisk aktiv substans P-23924 som defineret i et hvilket som helst af kravene 1-3.