DK166233B

DK166233B - Stroemningscytometriapparat

Info

Publication number: DK166233B
Application number: DK187985A
Authority: DK
Inventors: Burton H Sage; Robert F Adrion; Michael W Malpass
Original assignee: Becton Dickinson Co
Priority date: 1984-05-03
Filing date: 1985-04-26
Publication date: 1993-03-22
Also published as: EP0160201B1; AU4098985A; FI82772B; AU573144B2; DK187985A; FI851323A0; FI82772C; US4660971A; EP0160201A3; DK166233C; FI851323L; DK187985D0; DE3577747D1; JPH0431353B2; EP0160201A2; MY100374A; JPS60238762A; CA1242593A

Description

i

DK 166233B

Opfindelsen angår et strømningscytometriapparat til bestemmelse af en eller flere karakteristika ved partikler, der passerer gennem det, og mere specielt angår den et strømningscyto-metriapparat med forbedrede optiske egenskaber.

5

Der findes et antal celle- og partikelanalyseringsapparater, som anvender strømningscytometriteknik, der beror på hydrodynamisk fokuseret fluidumstrømning gennem en passage for bestemmelse af specifikke egenskaber ved de gennemstrømmende 10 celler eller partikler. Strømningsanalyse af partikler har været anvendt ved bestemmelsen af et stort antal karakteristika hos enkeltpartikler. Denne analyse er højst nyttig ved analysering eller bestemmelse af karakteristika hos celler med henblik på indsamling af information, som kan være brugbar in-15 den for research, hæmatologi, immunologi og lignende områder.

Forskeren kan f.eks. være interesseret i at bestemme specifikke egenskaber hos enkeltceller, så at sådanne celler kan klassificeres, identificeres, kvantificeres og måske sorteres med henblik på yderligere undersøgelser eller analyse.

20

Tre instrumenter, som beror på hydrodynamisk fokuseret fluidumstrømningssystemer bliver solgt af Becton, Dickinson and Company. Et apparat kendt som ULTRA-FLO 100® hel-blodpladetæl-leapparatet tæller hurtigt og pålideligt de hele blodplader i 25 hæmatologilaboratoriet. I ULTRA-FLO 100®-systemet passerer en bane af en fortyndet prøve indeholdende blodplader gennem midten af tællekammeråbningen, fordi prøvevæsken bliver fokuseret af en skærm af trykfluidum. Et andet instrument solgt af Becton, Dickinson and Company og beroende på et hydrodynamisk fo-30 kuseret fluidumstrømningssystem er kendt som FACS®-analysato-ren. FACS®-analysatoren analyserer hurtigt celler på grundlag af fluorescens og elektroniske volumenegenskaber. Analysen bliver gennemført ved inføring af celler i suspension i midten af en fokuseret væskestrøm, hvorefter man bringer cellerne til 35 at passere i hovedsagen en af gangen gennem det filtrerede og fokuserede lys fra en højtrykskviksølvdamplampe. Hver celle er individuelt karakteriseret ved dens elektroniske impedansvolu-

DK 166233 B

2 men og ved intensiteten og farven af den fluorescens, der udsendes, når den bliver belyst. Et andet instrument kendt som FACS®-sortereapparatet benytter fluidumstrømningsprincipper, som ligner det i FACS®-analysatoren, men sorterer yderligere 5 cellerne baseret på specifikt detekterede egenskaber. I alle de ovenfor nævnte systemer benyttes en skærmvæske til at fokusere partiklerne eller cellerne, når de passerer gennem passagen, der er i forbindelse med analyserings- eller tællemulighederne. Endvidere anvender FACS®-analysatoren et optisk 10 klart eller transparent væskestrømningskammer, der undertiden omtales som en strømningscelle, gennem hvilket en strøm af celler passerer. Lyset bliver rettet ortogonalt gennem denne strømningscelle for at opfange partiklerne i et brandpunktom-råde deri. Spredt lys eller fluorescens udsendt fra partikler-15 ne kan detekteres og tilvejebringe information om hver enkelt passerende partikel. US-A-4.348.107, US-A-4.240.029, US-A-4.165.484 og US-A-4.110.604 beskriver partikelanalyseringssystemer, i hvilke partiklerne strømmende i en strøm er indhyllet i et skærmfluidum, som fokuserer og indespærrer prø-20 vefluidet med partikler i midten af den strømmende strøm.

De fleste nuværende kommercielle strømningscytometriapparater anvender strømningsceller eller -kamre, som har cylinderformede åbninger og prøvepartikelstrømme, som har et cirkulært 25 tværsnit. På grund af denne geometri forekommer der væsentlige optiske aberrationer, som begrænser effekten af både lyssamlingen og exciteringen (i forbindelse med fluorescensvirksomt mærkede partikler). Desuden forstørres disse aberrationer geometrisk, når den numeriske apertur for linsen forøges. I al-30 mindelighed vil følsomheden for strømningscytometriapparatet være højere jo højere den numeriske apertur -er. Aberrationer tjener således til at begrænse den praktiske anvendelighed af linser med høj numerisk apertur. Desuden vil diameteren af prøvestrømningen vokse, når prøvepartikelstrømningshastigheden 35 forøges, hvilket kræver en linse med større brændvidde. Brænd- vidden er omvendt proportional med linsens numeriske apertur, og derfor udelukker stor brændvidde og høj numerisk apertur gensidigt hinanden.

DK 166233 B

3

Det er blevet erkendt, at en stor rektangulær åbning i det transparente væskestrømningskammer ville være fordelagtig med henblik på at optimere lystransmissionen ind i eller ud af den transparente væskestrømningscelle. Sådanne firkantede åbninger 5 er beskrevet i the Journal of Histochemistry and Cytochemi stry, bind 25, nr. 7, siderne 827-835, 1977 af R.A. Thomas m.fl. i en artikel med titlen "Combined Optical and Electronic Analysis of Cells with AMAC Transducers", og i US-A-4,348.107. Det blev imidlertid i US-A-4.348.107 påpeget, at de optiske og 10 mekaniske egenskaber for en parti kel analysator, der benytter en firkantet detektoråbning indesluttet i en kubus, dannet ved at klæbe fire pyramider sammen, har vist sig at være under det optimale.

15 Et strømningscytometriapparat af den art, der er beskrevet i indledningen til krav 1, er kendt fra EP-A-0068.404. Det kendte cytometriapparat har et linseorgan til at samle lys, der er emitteret fra eller spredt af de partikler, der strømmer gennem et transparent væskestrømningskammer. Linsesamlingen er 20 anbragt grænsende op til den ydre overflade af det transparente væskestrømningskammer med et tyndt lag glycerol ved overgangslaget mellem linsesamlingen og strømningskammeret. Denne glycerol er et indekssvarende medium, der er tilvejebragt for at lette lysgennemgangen og minimere lystab. Selv med denne 25 tilvejebringelse mellem linsesamlingen og strømningskammeret, drives der typisk en meget kompliceret trimningsprocedure for at bringe partiklerne, der strømmer i væskestrømmen gennem strømningskammeret, ind i brandplanet for samlelinserne. F.eks. er en triaksialt indstillelig linsemontage tilvejebragt 30 for at etablere den relative aksialsti11ing mellem linsesamlingen og strømningskammeret. Stabiliteten af- en sådan linsemontage er et område, som kræver forbedringer. Desuden er der i de nu kendte og benyttede strømningscytometriapparater ingen mekanisme til at indstille placeringen af den strømmende par-35 tikelstrøm med henblik på at tilvejebringe den endelige fokusering i forhold til det lys, der passerer gennem samlelinserne.

DK 166233B

4

Naturligvis er det kendt at tilvejebringe noniusindsti 11 inger for åbningsstørrelser og mikroskopindstillinger i strømnings-cytometriapparater. F.eks. er sådanne noniusindsti11inger beskrevet i US-A-3.675.768 og US-A-3.924.947. Mikroskopindsti 1-5 linger er beskrevet i MEYERS Lexikon der Technik und der exak- ten Naturwisssenschaften, vol. 2, 1970, side 1745. Denne reference viser endvidere en fjeder, der tvinger linsen i et mikroskop hen imod et stop i linseholderen, så at skader på objektet bliver undgået under uforsigtige bratte indstillinger 10 af mikroskopet.

US-A-3.675.768 beskriver et apparat til klassificering, tælling og adskillelse af mikroskopiske partikler. I det kendte apparat er linsesamlingen til fokusering af lyset i et fokuse-15 ringsområde fast forbundet med en væg i et kammer, i hvilket partiklerne bliver indført. Imidlertid er der ingen mulighed for at indstille fokuseringsområdet til siden i forhold til en strøm af partikler.

20 Følgelig er det formålet med opfindelsen at anvise et strøm- ningscytometriapparat, som beskrevet i indledningen til krav 1, og som forbedrer egenskaberne ydeevne, nøjagtighed og pålideligheden af lystransmissionen. Dette formål bliver løst med et apparat af den art, der er beskrevet i den indledende del 25 af krav 1 ved tilvejebringelse af trækkene i den kendetegnende del af dette krav.

Et strømningscytometriapparat ifølge nærværende opfindelse har et transparent væskestrømningskammer og organer for tilveje-30 bringelse af en strøm gennem strømningskammeret af partikler, der skal analyseres. Apparatet har endvidere, en exciterings-lyskilde og linseorganer til fokusering af lyset fra lyskilden til et område i strømningskammeret gennem hvilket partiklerne passerer. En eller flere egenskaber ved partiklerne, afhængigt 35 af det lys som rammer partiklerne, bliver analyseret af analy satororganer. Forbindelse mellem linseorganerne og strømningskammeret er tilvejebragt og opretholdt af organer, som stabi

DK 166233B

5 liserer det brændpunktområde, gennem hvilket partiklerne passerer.

I en foretrukken udførelsesform for strømningscytometriappa-5 ratet beskrevet ovenfor findes et transparent væskestrømningskammer, som har en passage med et rektangulært tværsnit.

ExciteringslyskiIden sender lys i hovedsagen ortogonalt mod strømmen af partikler. En linse er tilvejebragt til fokusering 10 af lyset fra lyskilden i et område inde i passagen. Denne linse kan også benyttes til at opsamle lys, som bliver udsendt fra eller spredt af partiklerne. En fjeder eller en lignende mekanisme er tilvejebragt til forspænding af linsen til berøring med strømningskammeret som en sammensat enhedskonstruk-15 tion for i hovedsagen at eliminere relativ bevægelse imellem dem og derved stabilisere det fokuseringsområde, hvorigennem partiklerne passerer. En dyse er omfattet i apparatet til tilvejebringelse af en strøm af partikler gennem passagen. Denne dyse har i den foretrukne udførelsesform et rektangulært tvær-20 snit. En manuelt betjenbar noniusindsti11ing er operativt for bundet med dysen med henblik på at indstille partikelstrømmens placering i passagen for derved at optimere fokuseringen af lyset på partiklerne i strømmen.

25 I overensstemmelse med principperne i nærværende opfindelse er der tilvejebragt et antal fordele og forbedringer i et strøm-ningscytometriapparat. Tilvejebringelsen af en relativt stiv forbindelse mellem kollektorlinsen og strømningskammeret, såvel som indstillingen af partikelstrømmen, forenkler signifi-30 kant opretningsproceduren, som bringer partiklerne i prøve strømmen ind i fokuseringsplanet for kollekiorlinsen og gør denne procedure mindre kritisk. Som et resultat ikke blot optimerer disse forbedringer fokuseringen af lyset på partiklerne, der strømmer i strømmen, men stabiliserer også fokuse-35 ringsområdet, gennem hvilket partiklerne passerer. Eftersom arbejdsafstandstolerancer med objektiver med høj numerisk apertur er af størrelsesordenen ± 10 mikron, er der normalt

DK 166233B

6 tilstrækkelig plads i strømningskammerets passage til at gennemføre denne indstilling ved fysisk flytning af partikelstrømmen i passagen. Sådanne fysiske flytninger ville blive kompliceret ved indstilling af dyseelementet, som styrer par-5 tiklerne ind i strømningskammeret. I kraft af geometrien i denne bevægelse kan den fordelagtigt opnås til gunst for indstillingen, dvs. en stor bevægelse af dysen vil forårsage en lille bevægelse af partikelstrømmen i passagen. Dette forbedrer stabiliteten og nøjagtigheden ved indstillingen. Ydermere 10 løser en rektangulær åbning eller passage i den foretrukne ud førelsesform kombineret med en partikelstrøm af rektangulært tværsnit de to problemer, der er rejst ovenfor med hensyn til fokuseringsdybde og aberrationer, der påvirker brugen af linser med høj numerisk apertur. Med en rektangulær partikelstrøm 15 kan tykkelsen af strømmen indstilles til at svare til den reducerede fokuseringsdybde ved en linse med høj numerisk apertur. Tykkelsen af strømmen og dernæst strømningshastigheden i strømmen til opnåelse af prøvens volumetriske strømningshastighed kan bestemmes. Med en stor rektangulær åbning eller 20 passage eksisterer der mellem linsen og partikelstrømmen en plan snarere end en cylindrisk berøringsflade. Den sfæriske aberration, indført af den plane overflade, kan således korrigeres i linsen. Eftersom strømningskammeret i nærværende opfindelse er i direkte berøring med linsen, er dets position i 25 forhold til linseoverfladen kendt, og korrektionen kan reelt foretages i praksis.

Opfindelsen beskrives i det følgende nærmere ved hjælp af et eksempel på en foretrukken udførelsesform under henvisning til 30 tegningen, hvor fig. 1 skematisk viser hovedfunktionselementerne i strømnings-cytometriapparatet ifølge opfindelsen, 35 fig. 2 skematisk og i forstørret målestok et tværsnit gennem et udsnit af den foretrukne indretning af strømningskammeret og linsesamlingen ifølge opfindelsen samt partikelstrømmen og lysvejen derigennem,

DK 166233 B

7 fig. 3 perspektivisk i forstørret målestok et brudstykke af den foretrukne udformning af dysen og passagen gennem strømningskammeret ifølge opfindelsen, og 5 fig. 4-6 snit gennem det foretrukne strømningskammer ifølge opfindelsen visende den indstillelige positionering af partikelstrømmen derigennem.

Med speciel henvisning til fig. 1 er der vist en skematisk 10 fremstilling af det foretrukne apparat 10, der viser strøm- ningscytometriprincipperne og mere specifikt under anvendelse af et skærmfluidum i forbindelse med en partikelstrøm i et hydrodynamisk fokuseret fluidumstrømningssystem. Det er klart, at nærværende opfindelse er brugbar i et stort antal tilfælde 15 i forbindelse med bestemmelsen af en eller flere karakteristi ka ved partikler eller celler, der strømmer i en transporterende strøm. Følgelig kan nærværende opfindelse benyttes f.eks. til måling af lysspredning, partikelvolumen, fluorescens eller en hvilken som helst anden optisk parameter til 20 identifikationsklassifikation eller kvant ifi kation af partikler i et prøvemedium.

Apparatet 10 omfatter en lagerbeholder 12 til opbevaring af væske 14, der i suspension indeholder partikler 17, som skal 25 undersøges eller analyseres i overensstemmelse med nærværende opfindelse. En partikelfri skærmvæske 15 opbevares i en beholder 16. Begge de ovenfor nævnte beholdere kan være passende tryksatte ved hjælp af en gastrykkilde eller lignende (ikke vist), gennem ledninger 11 henholdsvis 13. Væskerne 14 og 15 30 bliver ført til en dyseenhed 18 gennem rørledninger 19 henholdsvis 20. To dyser, 21 og 22, er indbefattet i dyseenheden 18 og bliver forsynet med væske fra beholderne 12 henholdsvis 16, så at væsken 14 indeholdende partiklerne i suspension kan indføres som en jetstrøm i en koaksial søjle eller strøm. Til 35 dette formål bliver den partikel indeholdende væske 14 fra dys en 21 indsprøjtet i dysen 22 i midten af den flydende strøm af skærmvæske 15, så at det resulterer i en kontinuerlig koaksial væskestrøm.

DK 166233B

8

Dyserne 21 og 22 styrer den aksiale to-komponent-strøm af partikler 17 og skærmvæske til et transparent, fortrinsvis optisk klart væskestrømningskammer 25. Strømningskammeret 25 ses tydeligere i fig. 2 i forbindelse med fig. 1. Når den koaksiale 5 strøm af partikler og skærmvæsken strømmer gennem strømnings kammeret 25, er strømmen indeholdende partikler kontinuerlig. Skønt det ikke er nødvendigt af hensyn til nærværende opfindelse, kan det være ønskeligt at danne adskilte små dråber 26 indeholdende partikler af interesse, efter at strømmen passe-10 rer gennem strømningskammeret 25. Med henblik herpå kan små dråber 26, af hvilke nogle kan indeholde partikler 17 dannes af den kontinuerligt strømmende væskestrøm, fortrinsvis ved vibrering af dyseenheden 18. For at fuldende dette træk kan en transducer 28 og en drivforstærker 29 være tilvejebragt til at 15 vibrere dyseenheden 18 i en aksial retning. En sådan vibration modulerer den strømmende væskestrøm til at afbryde dens kontinuerlige strømning og bevirker, at der dannes adskilte små dråber 26. Disse små dråber kan så opsamles i en eller flere beholdere 30.

20 I fig. 3 i forbindelse med fig. 2 er vist den foretrukne konstruktion af væskestrømningskammeret 25. Det kan ses, at strømningskammeret 25 har prismatisk konstruktion og er rektangulært i den udførelsesform, der bliver beskrevet. Andre 25 firkantformer kan anvendes i strømningskammeret. Følgelig in kluderer strømningskammeret 25 ydre overflader 32, som er i hovedsagen flade eller plane. Imidlertid er der udformet en recess 33 i væggen af strømningskammeret, så at linsesamlingen kan anbringes så tæt som muligt ved de partikler, der strømmer 30 gennem strømningskammeret. Strækkende sig gennem strømnings kammeret findes en passage 34, som kan have et stort antal geometriske former. Imidlertid foretrækkes det, at tværsnittet af passagen 34 er rektangulært eller måske endog kvadratisk med henblik på at opnå de ønskede fordele og formål, som nævnt 35 ovenfor. Følgelig tjener passagen 34 som en åbning gennem hvilken den bi-komponente, koaksiale strøm indeholdende pai— tikler 17 strømmer. For så vidt som denne åbning er til stede

DK 166233 B

9 i nærværende opfindelse, kan man forlade sig på brugen af det velkendte Coulter-princip. Ifølge dette princip vil der, når en ikke-ledende partikel passerer gennem en åbning indeholdende et elektrisk ledende medium, ske en forøgelse af den elek-5 triske modstand i åbningen. Ved at påføre et elektrisk potentiale over åbningen, er det muligt at måle modstandsforøgelsen som en elektrisk puls. En proportional korrelation er blevet påvist mellem volumenet af den partikel, der passerer gennem åbningen og amplituden af den elektriske puls, der bliver 10 målt, når partiklen passerer åbningen. I den udførelsesform, der er blevet beskrevet, er elektroderne ikke vist, men mekanismen til udøvelse af Coulter-princippet er velkendt for fagfolk på området.

15 Stående i forbindelse med passagen 34 findes et udvidet hulrum 35, som dysen 21 fortrinsvis hænger ned i. Hulrummet 35 har sidevægge 36, som er i hovedsagen parallelle med de langsgående vægge 38 i passagen 34; en skråt afskåret overgangsoverflade 39 strækker sig mellem sidevæggene 36 i hulrummet og side-20 væggene 38 i passagen. Således er der dannet en tragt af disse vægge og overflader, som letter strømningen af partikler gennem passagen i hovedsagen en af gangen. Endvidere har i den foretrukne udførelsesform ifølge opfindelsen dysen 21, hvor igennem partiklerne strømmer, en ydre åbning 40, som er geome-25 trisk forenelig med tværsnittet i passagen 34. Efter disse retningslinier har den ydre åbning 40 fortrinsvis et rektangulært tværsnit, som også fremmer målene og formålene nævnt ovenfor. Selv om strømningskammeret 25 er fremstillet således, at det er transparent for lyspassage gennem det, foretrækkes 30 det, at det valgte materiale til strømningskammeret også har optisk klarhed. Selv om der er et stort antal.af-sådanne materialer, som kan benyttes, f.eks. forskellige typer af glas, foretrækkes det, at strømningskammeret bliver fremstillet af smeltet kvarts.

De optiske elementer, der inkluderer lysveje og lysdetektion, er vist tydeligere i figurerne 1 og 2, hvortil der nu henvi- 35

DK 166233 B

10 ses. Det er klart, at tegningerne heri kun skematisk viser de optiske træk ved nærværende opfindelse med vægt lagt på forbedringerne heri. For en mere detaljeret forklaring af typen af optiske systemer, som kan anvendes i et typisk strømnings-5 cytometriapparat, henvises der til et eller flere af de ovenfor nævnte patentskrifter. I overensstemmelse dermed kan lyskilden 50 typisk være en laser til frembringelse af kohærent lys med en enkelt bølgelængde eller kan måske være en inkohæ-rent lyskilde, der tilvejebringer lys over en bredere bølge-10 længde, såsom en kviksølv- eller xenondamplampe. Lys fra lyskilden 50 bliver rettet hen imod det transparente strømningskammer 25 på tværs af partikelstrømmens retning med henblik på at opfange partiklerne, når de passerer derigennem. Fortrinsvis bliver lyset fra lyskilden 50 rettet i hovedsagen ortogo-15 nalt eller vinkelret på aksen repræsenterende strømmen af partiklerne 17. En linsesamling 51 er tilvejebragt med henblik på at fokusere lyset i et fokuseringsområde 52 på tværs af passagen 34 i det transparente strømningskammer, som vist i fig.

2. Linsesamlingen 51 kan benyttes til at opsamle lys, der bli-20 ver udsendt af eller spredt af partiklerne 17. For at tilvejebringe et optimalt fokuseringsområde, er linsesamlingen 51 fortrinsvis placeret således, at den forreste linseflade 54 er anbragt direkte imod og i berøring med den udvendige overflade 37 af udtagningen 33 i strømningskammeret. Et meget tyndt lag 25 af indekssvarende medium, såsom glycerol kan være påført på berøringsfladen mellem linsefladen 54 på linsen 55 og strømningskammeroverfladen 37 for at tilvejebringe en effektiv lysgennemgang og eliminere enhver uønsket indre transmissionsvirkning.

30

Med henblik på at sikre en relativt stiv forbindelse mellem linsen 55 og strømningskammeret 25 for at danne en i hovedsagen sammensat enhedskonstruktion til eliminering af relativ bevægelse derimellem, er linsen 55 forspændt hen imod strøm-35 ningskammeret 25 ved hjælp af en spiralfjeder 60. Den fjederbelastede indvirkning af linsen imod strømningskammeret letter denne relativt stive forbindelse mellem disse elementer og bi-

DK 166233 B

11 drager til stabilisering af fokuseringsområdet 52 gennem hvilket partiklerne passerer. Den specielle stabilisering kan henføres til den relative aksiale placering mellem strømningskammeret og linsesamlingen. Hedens spiralfjederen 60 er et middel 5 til at opnå dette ønskelige træk, er det klart at andre mekanismer, der kan udtænkes af fagfolk på området, falder inden for rammerne af nærværende opfindelse. Uanset hvilken specifik mekanisme der benyttes, vil muligheden for at tilvejebringe et veldefineret fokuseringsområde bliver forøget i overensstem-10 melse med nærværende opfindelse, så længe den relative bevægelse mellem linsen og strømningskammeret bliver elimineret eller væsentlig reduceret.

Lys, der bliver spredt, udsendt af eller på anden måde forbun-15 det med partiklerne, der passerer gennem det belyste fokuseringsområde i strømningskammeret, bliver så detekteret af lysdetektoren 62. Denne lysdetektor kan være en velkendt fotomul-tiplikatorindretning, som konverterer lyssignaler til elektriske pulser, så at informationer fra det detekterede lys kan 20 analyseres elektrisk. Hvis lyskilden 50 er en buelampe, vil lysdetektoren 62 i praksis typisk være anbragt på samme side af linsesamlingen som lyskilden. F.eks. kan anvendes en sidebelysningsform. Hvis på den anden side lyskilden 50 er en laser, kan en linse med lav numerisk apertur indskydes mellem 25 strømningskammeret og lysdetektoren i den opstilling, der er vist i fig. 1.

Selv om lysdetektoren 62 er vist i fig. 1 som værende på linie med lyset fra lyskilden 50, er denne form typisk i strømnings-30 cytometriapparater, når mån detekterer spredt lys. Til at detektere fluorescens er lysdetektoren 62 typisk orienteret vin kelret på retningen for det indfaldende lys.

En elektrisk puls forbundet med detekteret lys kan fødes til 35 elektronikken 64 i strømningscytometriapparatet, hvorpå oplysninger med relation hertil kan ses på en skærm 65, lagres i en computer (ikke vist) eller fødes tilbage til apparatet til yderligere analyse.

DK 166233 B

12

Idet man regner med den faste forbindelse mellem linsen og strømningskammeret, bliver fokuseringen af lyset i fokuseringsområdet i strømningskammeret, hvorigennem partiklerne passerer, udført ved indstilling af positionen af dysen 21. Et 5 sådant indstillingstræk er vist i figurerne 4-6. F.eks. er i fig. 4 dysen 21 vist som værende rettet ind i hovedsagen langs med den langsgående akse i passagen 34. I tilfælde af, at den optiske intensitet i fokuseringsområdet 52 er noget forskudt fra den langsgående akse i passagen 34, kan dysen 21 indstiΙ-ΙΟ les, som vist i figurerne 5 og 6. Selv om alle detaljerne ved monteringsmåden for dysen ikke er vist, viser figurerne 5 og 6 skematisk, at en drejelig stang 70 er forbundet med dysen 21. Ved at benytte gevind eller lignende vil drejning af fingerhjulet eller knappen 71 forårsage en sideforskydning af dysen 15 21 i den ene eller den anden retning i forhold til den langs gående akse i passagen 34. På denne måde bliver den ydre åbning 40, gennem hvilken partiklerne 17 udtræder, fysisk flyttet, således at de får placeringen af partikelstrømmen til at blive forskudt fra den langsgående akse i passagen, når parti-20 kelstrømmen strømmer igennem denne. Idet man husker, at partikelstrømmen stadig er afskærmet af et skærmfluidum, når den strømmer gennem passagen, forårsager en relativ stor sideforskydning af dysen 21 en relativ lille flytning af partikelstrømmen i passagen. Således muliggør den manuelt betjenbare 25 noniusindsti11 ing tilvejebragt af stangen 70 og fingerhjulet 71 ikke blot finindstilling til fokuseringsformål, men forøger også stabiliteten og nøjagtigheden af indstillingen. Det ligger også inden for opfindelsens rækkevidde at anvise en enhedskonstruktion ved at udforme strømningskammeret 25 og det 30 sidste linseelement 55 i linsesamlingen af samme transparente materiale for at sikre placeringen af det ønskede fokuseringsområde i passagen i strømningskammeret.

Selv om udførelsesformen, der er beskrevet her, tilvejebringer 35 en sideindsti11 ing af strømningsdysen i forhold til den faste position af strømningskammeret, er det også indenfor opfindelsens rækkevidde at optimere intensiteten af fokuseringsområdet

Claims

1. Strømningscytometriapparat af den art, der har et transparent væskestrømningskammer (25), organer (12, 21) til frem- 30 bringelse af en strøm gennem strømningskammeret af partikler (17), der skal analyseres, en exciteringslyski Ide (50), linse organer (55) i direkte berøring med strømningskammeret (25) til fokusering af lyset fra lyskilden i et område (52) inden i strømningskammeret, gennem hvilket partiklerne passerer og til 35 opsamling af det lys, der har været tilknyttet partiklerne, og organer (62, 64) til bestemmelse af en eller flere karakteristika ved partiklerne i relation til det lys, som rammer par- DK 166233 B 14 tiklerne, kendetegnet ved, at det omfatter stabiliseringsorganer for tilvejebringelse og opretholdelse af relativ stabilitet mellem linseorganerne (55) og strømningskammeret (25) for at stabilisere den relative aksialsti11ing af 5 strømningskammeret og linseorganerne, og indstillingsorganer (70, 71) til indstilling af den relative position af strømmen af partikler (17) i forhold til strømningskammeret (25).

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at sta-10 bi 1iseringsorganerne har en fjeder (60), som forspænder linseorganerne hen imod strømningskammeret.

3. Apparat ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at stabiliseringsorganerne endvidere omfatter et tyndt lag in- 15 dekstiIpasningsmiddel ved overgangslaget mellem linseorganerne (55) og strømningskammeret (25) for at lette lystransmissionen.

4. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-3, kendetegnet ved, at stabiliseringsorganerne endvidere sammen- 20 kobler linseorganerne (55) og strømningskammeret (25) til en sammensat enhedskonstruktion for i hovedsagen at eliminere relativ bevægelse mellem linseorganerne (55) og strømningskammeret (25).

5. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-4, kende tegnet ved, at linseorganerne og strømningskammeret er bygget ud i et af samme materiale.

6. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-5, kende-30 tegnet ved, at indsti11 ingsorganerne (70, 71) inkluderer en manuelt betjenbar noni usi ndsti 11 i ng til f-inindsti lling af placeringen af partikelstrømmen, når denne strøm af partikler passerer gennem fokuseringsområdet (52) for derved at optimere fokuseringen af lyset på partiklerne. 35

7. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-5, kendetegnet ved, at indstillingsorganerne inkluderer en manu- 15 DK 166233 B elt betjent noniusindsti11ing til finindstilling af placeringen af strømningskammeret (25), når strømmen af partikler passerer gennem fokuseringsområdet (52) for derved at optimere fokuseringen af lyset på partiklerne. 5

8. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-7, kendetegnet ved, at væskestrømningskammeret (25) har en passage (34), hvorigennem strømmen af partikler strømmer, hvilken passage har mindst én del med rektangulært tværsnit. 10

9. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-8, kendetegnet ved, at organerne til frembringelse af strømmen af partikler (17) omfatter en dyse (21).

10. Apparat ifølge krav 9, kendetegnet ved, at dy sen (21) har et rektangulært tværsnit.

10 Således tilvejebringer nærværende opfindelse forbedrede optiske træk ved et strømningscytometriapparat, som benytter lysenergi som den mekanisme, der udleder information om visse karakteristika ved bevægende partikler, celler eller lignende. Trækkene ved nærværende opfindelse forbedrer stabiliteten og 15 nøjagtigheden af indstillingen med henblik på at fokusere lyset på partiklerne, medens det også eliminerer eller minimerer optiske aberrationer i kraft af geometrien af passagen gennem hvilken partiklerne strømmer og dysen eller lignende indretninger, hvorfra partikelstrømmen bliver indført i strømnings-20 kammeret. Især afgrænser og stabiliserer berøringen mellem strømningskammeret og linsen og den tværgående 1inse-/celleindstil 1ingsmekanisme beskrevet ovenfor tilsammen den tredimensionale relative placering af strømningskammeret og linsen.

25 Patentkrav.

11. Apparat ifølge et eller flere af kravene 1-10, kendetegnet ved, at strømningskammeret er fremstillet af 20 smeltet kvarts. 25 30 35