DK164485B - Polymerholdige medikamenter, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende mindst et saadant medikament - Google Patents

Polymerholdige medikamenter, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende mindst et saadant medikament Download PDF

Info

Publication number
DK164485B
DK164485B DK003386A DK3386A DK164485B DK 164485 B DK164485 B DK 164485B DK 003386 A DK003386 A DK 003386A DK 3386 A DK3386 A DK 3386A DK 164485 B DK164485 B DK 164485B
Authority
DK
Denmark
Prior art keywords
gly
phe
leu
ala
polymer
Prior art date
Application number
DK003386A
Other languages
English (en)
Other versions
DK3386D0 (da
DK3386A (da
DK164485C (da
Inventor
Jindrich Kopecek
Pavla Rejmanova
Jiri Strohalm
Karel Ulbrich
Blanka Rihova
Vladimir Chytry
John B Lloyd
Ruth Duncan
Original Assignee
Ceskoslovenska Akademie Ved
Cancer Res Campaign Tech
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ceskoslovenska Akademie Ved, Cancer Res Campaign Tech filed Critical Ceskoslovenska Akademie Ved
Publication of DK3386D0 publication Critical patent/DK3386D0/da
Publication of DK3386A publication Critical patent/DK3386A/da
Publication of DK164485B publication Critical patent/DK164485B/da
Application granted granted Critical
Publication of DK164485C publication Critical patent/DK164485C/da

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6883—Polymer-drug antibody conjugates, e.g. mitomycin-dextran-Ab; DNA-polylysine-antibody complex or conjugate used for therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/811—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an inorganic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/81—Carrier - bound or immobilized peptides or proteins and the preparation thereof, e.g. biological cell or cell fragment as carrier
    • Y10S530/812—Peptides or proteins is immobilized on, or in, an organic carrier
    • Y10S530/815—Carrier is a synthetic polymer
    • Y10S530/816—Attached to the carrier via a bridging agent

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Addition Polymer Or Copolymer, Post-Treatments, Or Chemical Modifications (AREA)

Description

DK 164485 B
Den foreliggende opfindelse angår polyraermedikamenter, der omfatter a) et bioaktivt middel, og b) en inert syntetisk polymerbærer, som er kombineret med det bioaktive middel via en bionedbrydelig afstandsenhed, og syntese heraf.
5 Mange af de medikamenter med lav molekylvægt, der anvendes i kemoterapien, trænger hurtigt ind i alle typer celler på grund af vilkårlig diffusion gennem cellemembranen. Denne mangel på selektivitet formindsker deres tilgængelighed ved det ønskede målvæv og forårsager somme tider uønskede bivirkninger. Optagelsen i cellen er hurtig, så 10 at den terapeutiske virkning ikke strækker sig over et tidsrum.
Ydermere kan glomerulær filtrering hurtigt fjerne medikamenterne fra blodstrømmen.
Den covalente binding af bioaktive molekyler med lav molekylvægt til opløselige polymerbærere forhindrer både glomerulær filtrering og 15 cellulær absorption ved simpel diffusion. Optagelsen er begrænset til celler, der kan virke ved en substratselektiv mekanisme, der kaldes pinocytose, hvorved et område af den begrænsende cellemembran opsluger makromolekylet og derefter løsrives indad til dannelse af en fri intracellulær vesikel, der indeholder det omsluttede materiale.
20 Denne forskel i optagelsesmekanisme frembyder en potentiel metode til at lede medikamenter specifikt til de celler, hvor deres terapeutiske virkning er påkrævet.
Der er en yderligere forskel på de to typer molekylers videre skæbne.
Små molekyler, som trænger ind ved diffusion, har tendens til at 25 finde vej til alle dele af cellen, hvorimod makromolekyler efter pinocytose transporteres i deres intracellulære vesikler direkte til den lysosomale del af cellen, hvor en række hydrolytiske enzymer er tilgængelige.
Pinocytisk optagelse af et polymermedikament, hvori medikament-bæ-30 rerbindingen kan underkastes af lysosomal hydrolyse, frembyder derfor en mekanisme til kontrolleret intracellulær afgivelse af et bioaktivt molekyle, som fører til, at det dukker op i målcellens cytoplasma. De teoretiske betragtninger i forbindelse med udformningen af sådan et
DK 164485 B
2 medikamentsystem er gennemgået i en artikel af J. Kopecek med titlen "Synthesis of tailormade soluble polymeric carriers" i "Recent Advances in Drug Delivery Systems" (Plenum Press, 1984).
Ved udformningen af sådan et system skal to kriterier opfyldes. For 5 det første skal der findes en medikament-bærerbinding, som undergår kontrolleret lysosomal hydrolyse, men som er i stand til at modstå virkningen af enzymer i blodstrømmen. For det andet skal medikamentafgivelsessystemet kunne føre til specik optagelse i de målceller, hvor den terapeutiske virkning er påkrævet, med minimal optagelse i 10 andre celler.
Selv om pinocytose-processen frembyder en vis grad af selektivitet over for makromolekyler, en selektivitet, som kan optimeres ved at variere molekylvægten, kan der opnås større målselektivitet ved inkorporering af en specifik "målfindingsdel" i makromolekylet.
15 Celler har specifikke receptorer og celleantigener på overfladen, som "genkender" og samvirker med visse typer molekylære enheder, som kaldes specifikke determinanter. Høj cellespecificitet kan opnås ved i polymermedikamentet at inkorpore en determinant, som genkendes af den type celler, hvori den terapeutiske virkning er påkrævet.
20 Et medikamentafgivelsessystem, som ville tillade specifik målfinding efterfulgt af intracellulær medikamentafgivelse, nødvendiggør således følgende karakteristiske træk: a) en inert polymerbærer, som fortrinsvis kan påvirkes ved lysosomal hydrolyse for at lette elimineringen af polymeren fra legemet, 25 b) en nedbrydelig medikament-bærerbinding, som er modstandsdygtig over for extracellular hydrolyse, men som kan underkastes kontrolleret lysosomal hydrolyse, og c) en specifik målfindingsdel.
Et sådant molekyle kan illustreres skematisk som følger: 3
DK 164485 B
$-[—?]-<
y/\\A-(tJ) (gr'VA-X
© målfindingsdel, ^D) medikament bundet via en bionedbrydelig binding -— eventuelt bionedbrydelig tværbinding i en polymer- 5 bærer.
Selv om naturlige makromolekyler har været anvendt som bærere, har syntetiske polymerer de fordele, at deres molekylvægt lettere kan justeres til optimal celleselektivitet, og at de til forskel fra mange naturlige makromolekyler ikke er immunogene. De er også lettere 10 at producere kommercielt.
Syntetiske polymerer baseret på N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA) har været foreslået som potentielle medikamentbærere, jfr. USA-patentskrift nr. 4.062.831 og 4.097.470. Sådanne polymerer er opløselige i vandige medier og har en god biokompatibilitet. Ydermere 15 kan de ved inkorporering af p-nitrophenylestere af N-methacrylolyl-oligopeptider kombineres med mange medikamenter, som indeholder en primær aminogruppe. Polymerkæderne kan tværbindes til et niveau under geleringspunktet, så at der opnås optimal molekylvægt, og så at der ved anvendelsen af bionedbrydelige tværbindinger fås et middel til 20 nedbrydning af polymeren for at lette eliminering fra legemet.
I Biochim. Biophys. Act. Sci. 1983, s. 518-521 (se fx C.A. 98 (1983), nr. 166810η) beskrives polymerforbindelser baseret på HPMA, og som omfatter (i) en tyrosinamidrest bundet til hovedkæden ved hjælp af en Gly-Gly peptidbinding og (ii) en aminohexoserest bundet til hoved-25 kæden ved hjælp af en Gly-Gly-peptidbinding (se formlen på s. 519 i artiklen).
Eftersom lysosomale enzymer omfatter et antal proteinaser, som kan hydrolysere peptidbindinger, skulle man tro, at direkte binding af
DK 164485 B
4 det bioaktive molekyle til polymerkæden ved hjælp af en amidbinding havde potentialet til lysosomal hydrolyse. I praksis har dette ikke været tilfældet. Det har imidlertid vist sig, at peptid-"afstandsled", som er indsat mellem medikamentet og bæreren, gennemgår ned-5 brydning ved indvirkning af lysosomale enzymer inden for et bredt område af hastigheder. Den binding, der i praksis spaltes, er sædvanligvis bindingen mellem medikamentet og den nabostillede aminosyre, selv om dette ikke altid er tilfældet. Det har vist sig, at hydrolysehastigheden, dvs. medikamentafgivelseshastigheden, i høj grad 10 afhænger af antallet og arten af aminosyreresterne i peptidafstands-leddet. Afstandsled på mindre end tre aminosyrer kunne generelt ikke underkastes lysosomal hydrolyse. Peptidafstandsled, som er udformet til at passe til den kendte substratspecificitet for thiolproteinaser, som vides at være til stede i lysosomer, spaltes særlig effek-15 tivt.
Det er blevet påvist, at modifikation af glycoproteiner til dannelse af oligosaccharidsidekæder, som ender i galactose, fører til en voldsom stigning af aflejringen af glycoproteinerne i leverens paren-chymale celler. Galactosedelen virker som en specifik determinant, 20 der samvirker med receptorer, som sidder på levercellernes plasmamembran. Dette frembyder en potentiel mekanisme til målfinding for medikamenter mod hepatoma, en cancerform, som er særlig vanskelig at behandle. Ydermere giver galactosamin bundet til HPMA-copolymerer via en amidbinding et lignende resultat, hvilket indicerer, at recep-25 torerne på hepatocytmembranerne genkender galactosedelen ikke kun i glycosider, men også når de er til stede som N-acylgalactosamin. Der kendes en række andre genkendelsessystemer, fx N-acetylglucosamin/-mannose-genkendelsessystemet hos Kupffer-celler og makrophager og phosphohexose-genkendelsessystemet hos fibroblaster.
30 En anden mulig målfindingsmekanisme er at binde polymermedikamentet til et antistof, som genkendes specifikt af de celler, der har de relevante antigene receptorer. Medikamentmolekyler er blevet bundet direkte til immunoglobuliner, men dette kan føre til tab af medikamentvirkning, tab af antistofvirkning og/eller konjugatets opløselig-35 hed.
5
DK 164485 B
En anden målfindingsmekanisme er at inkorporere et protein eller et hormon, fx transferrin og melanocyt-stimulerende hormon, som binder sig specifikt til målcelletypen.
Selv om det ønskelige i at syntetisere målbundne polymermedikamenter 5 med hydrolyserbare peptidafstandsled har været nævnt i den kendte teknik (jfr. ovennævnte artikel af Kopecek), har forskerne haft vanskeligt både ved at identificere de peptidafstandsled, som har evnen til kontrolleret intracellulær medikamentafgivelse med en tilfredsstillende hastighed, og ved at identificere bindingsgruppe/-10 determinantkombinationer, som giver god målfinding mod de ønskede cellereceptorer.
Som nævnt ovenfor afhænger hastigheden af lysosomal hydrolyse af et peptidafstandsled både af antallet og af arten af aminosyreresterne.
Dette er en afspejling af både steriske og strukturelle faktorer.
15 Således afhænger hastigheden for terminal hydrolyse af et afstandsled, som indeholder 2-4 aminosyrerester, generelt af antallet af tilstedeværende rester, en virkning, som er tilskrevet sterisk interaktion mellem polymerkæden og enzymet.
For en given længde peptid afhænger hydrolysehastigheden både af 20 arten (og sekvensen) af aminosyreresterne. Denne afhængighed stammer fra den substratspecifikke karakter af de lysosomale enzymer, der er ansvarlige for spaltningen af peptidafstandsleddet. Det område i enzymet, hvor interaktion med substratet finder sted, kaldes enzymets "aktive sted". Det aktive sted har en dobbeltrolle, idet det binder 25 substratet, medens det katalyserer reaktionen, fx spaltning. Undersøgelser af strukturen af complexerne af proteolytiske enzymer med peptider indicerer, at det aktive sted på disse enzymer er forholdsvis stort og lader sig binde til flere aminosyrerester i peptidet.
Således afhænger nedbrydeligheden af en bestemt binding i en pep-30 tidkæde ikke kun af arten af den struktur, der er nær ved den spaltede binding, men også af arten af de aminosyrerester, som ligger forholdsvis fjernt fra den spaltede binding, men som spiller en vigtig rolle ved at holde enzymet i stilling under hydrolyse. Indtil nu er de detaljerede strukturer af de aktive steder på lysosomale
DK 164485 B
6 enzymer ikke blevet bestemt, og dette har vist sig at være en hindring ved fremstillingen af peptidafstandsled, som undergår lysosomal hydrolyse med en hensigtsmæssig hastighed til anvendelse i polymermedikamenter .
5 Den foreliggende opfindelse er baseret på erkendelsen af: i) peptidgrupper, som kan fungere som afstandsled, der undergår lysosomal hydrolyse med en tilfredsstillende hastighed, hvilket fører til kontrolleret intracellular medikamentafgivelse, og ii) kombinationer af bindinger og determinanter, som kan anvendes til at binde determi-10 nanten til polymerkæden uden at påvirke dens målfindingsmekanisme, idet peptidsekvenserne under i) og bindingerne ii) samtidig er modstandsdygtige over for extracellular hydrolyse. Der er blevet udviklet andre peptidbindinger til anvendelse som tværbindende peptidafstandsled, der let spaltes lysosomalt. Hydrolyse af disse bindinger 15 er særlig påvirkelig over for sterisk hindring forårsaget af polymerkæderne, mere end hydrolyse af terminaldele fra peptidsidekæder.
Den foreliggende opfindelse angår et polymermedikament, der omfatter a) et bioaktivt middel, og b) en inert syntetisk polymerbærer, som omfatter gentagende enheder afledt af N-(2-hydroxypropyl)-methacry-20 lamid (HPMA), idet polymerbæreren er kombineret med det bioaktive middel via peptidafstandsled og via andre afstandsled med en målfin-dingsdel, hvilket medikament omfatter a) 5,0-99,7 mol% enheder afledt af N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid med formlen:
25 I
CH2 oh I i CH3-C-CO-NH-CH2-CH-CH3 b) 0,2-20,0 mol% enheder afledt af et N-methacryloyleret peptid, idet peptidgrupperne er bundet til et bioaktivt molekyle og også er udsat for intracellulær lysosomal hydrolyse, og disse peptidgrupper er 30 valgt blandt Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-
DK 164485 B
7
Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe- Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe og G ly- Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, idet disse enheder har formlen: 5 ch2 CH3-C-CO-[NH-R-CO]-[B] hvor -[NH-R-CO]- er et afstandsled afledt af et af de beskrevne peptider og -[B] er det bioaktive middel og c) 0,1-94,8 mol% enheder afledt af N-methacrylamid, N-methacrylsyre, 10 en N-methacryloyleret aminosyre eller et N-methacryloyleret peptid, hvortil der er bundet en determinant, som er i stand til at samvirke med specifikke receptorer på celleoverflader, idet aminosyren eller peptidet er Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-15 Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe eller Gly- Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, idet disse enheder har formlen: ch2 CH3-C-C0-NH-[D] 20 når de er afledt af N-methacrylamid, ch2 CH3-C-C0-[D]
DK 164485 B
8 når de er afledt af N-methacrylsyre ch2 CH3-C-CO-[NH-R-CO]-[D] når de er afledt af N-methacryloyleret aminosyre eller -peptid, hvor [D] er determinanten og -[NH-R-CO]- er et afstandsled afledt af en af de beskrevne aminosyrer eller peptider.
5 Disse polymermedikamenter kan yderligere omfatte d) op til 5 mol% enheder afledt af et N-methacryloyleret peptid, idet peptidgrupperne er bundet til en bindingsgruppe, som på lignende måde er knyttet til en lignende peptidgruppe, som er knyttet til en anden polymerkæde, idet peptidet er Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, 10 Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu- Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe- Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe eller Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, idet disse enheder har formlen:
I I
ch2 ch2
I I
CH3-C-CO-[NH-R-CO]-[L]-[C0-R-NHJ-C0-C-CH3
i I
15 hvor -[NHRCO]- er et afstandsled afledt af en af de beskrevne peptider og -[L]- er bindingsgruppen ("linking group"), og kan yderligere omfatte e) op til 2 mol% enheder afledt af N-methacryloyleret tyrosinamid som 20 bioassay-mærkning, idet disse enheder har formlen:
DK 164485 B
9 NH2
I I
ch2 co
I I
CH3-C-CO-NH-CH-CH2-C6H4-OH
Ikke alle kombinationer af de ovenfor under b) nævnte peptidgrupper og bioaktive molekyler eller medikamentmolekyler kan underkastes 5 intracellular lysosomal hydrolyse; som beskrevet nedenfor kan kombinationen af Gly-Gly og daunomycin således ikke underkastes en sådan hydrolyse, og Gly-Gly bør derfor ikke anvendes som et peptidafstands -led med daunomycin. Imidlertid er Gly-Gly et acceptabelt afstandsled til andre medikamenter såsom deacetylcolchicin og -colcemid.
10 Som angivet ovenfor i forbindelse med c) kan determinanten forbindes direkte til polymerkæden enten ved en amid- eller en esterbinding, dvs. uden et afstandsled, eller den kan forbindes via et arainosyre-eller peptidafstandsled. De overvejelser, der kan påvirke valget af den anvendte binding til en given determinant, er komplicerede og 15 afhænger bl.a. af arten og antallet af de medikamentbærende enheder, af, om polymeren er enkeltkædet eller tværbundet, og selvfølgelig af arten af determinanten. Det altovervejende krav er, at determinanten bør være tilgængelig for de specifikke receptorer på målcellerne; dette er i høj grad en funktion af geometrien i polymermedikamentmo-20 lekylet.
Det bioaktive molekyle, som er til stede i det polymermedikamentet, er fortrinsvis et anticancermiddel, et antimikrobielt middel, et antiparasitisk middel, et antiinflammatorisk middel, et cardiovascu-lært medikament eller et medikament, der påvirker nervesystemet.
25 Særlig foretrukne bioaktive molekyler er fx daunomycin, puromycin, adriamycin, melphalanisopropylester (sarcolysin), bleomycin, des-ferioxamin, bestatin og tritylcystein.
DK 164485 B
10
Determinanten er fortrinsvis en monosaccharid-, disaccharid-, oligo-saccharid- eller O-methacryloyleret saccharidenhed, som fortrinsvis er bundet ved en amidbinding, et antistof såsom IgG (rotteimmunoglo-bulin) eller anti-Θ-antistof eller et protein såsom transferrin eller 5 melanocyt-stimulerende hormon (MSH). Særlig foretrukne determinanter er galactose, galactosamin, glucosamin, mannosamin og fucosylamin.
Bindingsgruppen er fortrinsvis af typen -(aminosyre)NH(CH2)XNH(aminosyre)-, hvor x betegner et helt tal fra 1-12, og den er knyttet til de nabostillede peptidafstandsled ved hjælp af amidbindinger. Særlig 10 foretrukne bindings grupper er sådanne, hvor x betegner 6, og aminosyren er Phe, Tyr, Ala, Gly eller Leu, og den gruppe, hvor x betegner 2, og aminosyren er Ala.
En særlig foretrukken udførelsesform for opfindelsen omfatter enkelte og tværbundne kæder af den givne polymer med daunomycin som det 15 bioaktive molekyle, galactose, galactosamin eller fucosylamin som determinanten, Gly-Phe-Leu-Gly som peptidafstandsleddet til både daunomycinet og determinanten og eventuelt Gly-Phe-Leu-Gly som det tværbindende peptidafstandsled og -(Phe)NH(CH2>6NH(Phe)- som bindingsgruppen.
20 Opfindelsen omfatter også syntesen af polymermedikamenter ifølge opfindelsen.
Eftersom det samme peptidafstandsled kan anvendes både til det bioaktive molekyle og determinanten, og da fremstillingen af sådanne forbindelser er enklere end fremstillingen af forbindelser, hvori 25 sådanne afstandsled er forskellige, vil der først blive beskrevet en syntetisk fremgangsmåde til fremstilling af førstnævnte forbindelser. Syntesen består i hovedsagen af to trin.
Det første trin omfatter copolymerisation af HPMA og p-nitrophenylesteren af det N-methacryloylerede peptid (N-methacryloyleret tyrosi-30 namid kan også være inkorporeret på dette trin, så der fås en bi-oassay-mærkning) til dannelse af en "polymerprecursor", hvori de terminale p-nitrophenoxygrupper på peptidsidekæderne er hensigtsmæssige fraspaltelige grupper til efterfølgende additionsreaktioner.
DK 164485 B
π
Det andet trin omfatter sekventiel addition af det reaktive medikament, den reaktive determinant og eventuelt et diamino-tværbindings -middel. Hvis det er den enkeltkædede form af polymermedikamentbæ-reren, som ønskes, sættes medikamentet og determinanten konsekutivt 5 til polymerprecursoren i vilkårlig rækkefølge. Hvis det er det tvær-bundne produkt, som ønskes, sættes et hensigtsmæssigt tværbindings -middel, medikamentet og determinaten sekventielt til polymerprecursoren, ligeledes i vilkårlig rækkefølge.
Den ovennævnte fremgangsmåde kan illustreres som følger: HPMA 4 MA ONp
Copolymerisat i on Ψ ONp = p-nitrophenoxy L/^/V'V.oNj.· MA = methacryloyl )_/\/\Λ-0.\ρ (d) = medikament, (t) = determinant // 1) H2N HZZh- nh2
11© 2) Q
21© 3) Q
Eåft~ ^C=3A^Uværbundet produkt rtø'"-© ^VKs> (im produkt vW'ks øwf 10 I de tilfælde, hvor medikament- og determinantbindingerne ikke er ens, kan der anvendes to synteseveje.
I de tilfælde, hvor medikament- og determinantbindingerne har fælles aminosyrerester i nabostilling til bæreren, behandles polymerprecursoren indeholdende disse aminosyrer sekventielt med et aminosyre-15 eller peptidylderivat af medikamentet, et aminosyre- eller peptidyl-derivat af determinaten og eventuelt, når der ønskes et tværbundet produkt, et diamino-tværbindingsmiddel.
DK 164485 B
12
Denne fremgangsmåde kan illustreres som følger: HPMA + MA -AV- ONp
Copolymerisation ONp 1) AAj-f 1) K N -- NK, s' 2) AA2-C· 2) ^ 3) aa2-0
Enkeltkædet Tværbundet produkt produkt
^AAr D C_\Μ-[ΖΙ3-ΛΛΛ-C
y\^AA2- T yVV^AAj-® CD?-AA1-AV/-C
ylV^AAg-© (T)-AA2^< t
Determinanten kan alternativt være bundet til et N-methacryloyleret peptid, idet den nødvendige aminosyresekvens for determinantafstands-leddet og den N-methacryloylerede peptidyldeterminant så inkorporeres 5 i copolymerisationstrinnet. Polymerprecursoren behandles konsekutivt med det reaktive medikament og eventuelt, når der ønskes et tværbundet produkt, et diamino-tværbindingsmiddel.
Denne fremgangsmåde kan illustreres som følger:
DK 164485 B
13
HPMA «· MA ~ΛΑΛ_ 0.\p + HA-Støy T
ψ Copulymensaiior, S-'V/'-ONp
pftrT
/(2- 1) K,N -*-i- XH_ 2) <£ SS* W* ytV-Φ (SHV-Sbmdet
' OS'® ØflK
Det er også muligt at fremstille polymerprecursorer, som svarer til de ovenfor beskrevne, men som indeholder peptidsidekæder, som ikke ender i p-nitrophenylestergrupper, men i carboxylgrupper. I nærværelse af en hensigtsmæssig katalysator kan reaktive medikamenter og 5 determinanter knyttes til disse polymerprecursorer via de terminale carboxylgrupper; den nominelle fraspaltelige gruppe under additionen er fortrinsvis hydroxy frem for p-nitrophenoxy.
Medikamenter og determinanter med reaktive aminogrupper giver produkter, som er identiske med de produkter, der vindes ud fra polymer-10 precursorer med terminale p-nitrophenylestergrupper, dvs. at det reaktive molekyle er knyttet til sidekæden via en amidbinding. I modsætning til polymerprecursorer med terminale p-nitrophenylestergrupper reagerer polymerprecursorer med terminale carboxylgrupper imidlertid også med medikamenter og determinanter med reaktive hy-15 droxygrupper, hvilket giver produkter, hvor det reaktive molekyle er knyttet til sidekæden via en esterbinding.
Polymerprecursorer med sidekæder, der ender i carboxylgrupper, kan fremstilles a) ved basisk hydrolyse af den tilsvarende polymerprecur-sor med sidekæder, der ender i p-nitrophenylestergrupper, hvis frem-20 stilling er beskrevet ovenfor, eller b) ved copolymerisation med HPMA i overensstemmelse med en hvilken som helst af de ovenfor til fremstilling af polymerprecursoren med terminale p-nitrophenylestergrup-
DK 164485 B
14 per beskrevne syntesefremgangsmåder, idet der på copolymerisations-trinnet anvendes ikke-esterificeret N-methacryloyleret peptid i stedet for p-nitrophenylesteren deraf. Den resulterende copolymer kan derefter konsekutivt behandles med det reaktive medikament og den 5 reaktive determinant.
De fremgangsmåder, hvorved polymerprecursorer med sidekæder, som ender i carboxylgrupper, kan fremstilles, kan illustreres som følger: UV- OXp S HPKA + MA -AVL- oh pfOKp (a) Hydrolyse / (b) ΜΑ-^Τ 0H / copolymerisation
Ψ y/ V
WV^OH CVjA-OH
rV^OH c^tf) 10 Hensigtsmæssige katalysatorer til additionen af det reaktive medikament og/eller determinanten til polymerprecursorer indeholdende carboxylgrupper omfatter carbodiimider såsom dicyclohexylcarbodiimid i organiske opløsningsmidler og N-cyclohexyl-N'-(2-morpholinoethyl)-carbodiimidmetho-p-toluensulfonat i vandige opløsninger og Woodward's 15 reagens (N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat).
Den rækkefølge, i hvilken en hvilken som helst eller samtlige af det reaktive medikament, den reaktive determinant og tværbindingsmidlet sættes til polymerprecursorerne i en hvilken som helst af de ovenfor beskrevne syntesefremgangsmåder, er ikke kritisk. Mængderne af de 20 anvendte reaktanter bør selvfølgelig være de mængder, som giver det ønskede molære indhold af hver bestanddel i polymeren inden for de
DK 164485B
15 ovenfor beskrevne rammer. Den samlede molekylvægt bestemmes af polymerisationsbetingelserne, især koncentrationen af initiator, tilstedeværelsen af overgangsmidler og koncentrationen af comonomer-p-ni-trophenoxygrupper.
5 De enkeltkædede produkter ifølge opfindelsen har fortrinsvis en molekylvægt i området 5.000-60.000, mere foretrukket 30.000-60.000, og de tværbundne produkter fortrinsvis i området 10.000-500.000, mere foretrukket 30.000-400.000.
De nødvendige udgangsmaterialer til udførelse af de ovenfor beskrevne 10 synteser er enten tilgængelige i handelen eller kan fremstilles ved almindelige, for fagmænd kendte metoder.
Således kan de til copolymerisation med HPMA nødvendige peptidderivater fremstilles, og copolymerisation kan udføres som følger: i) Et kommercielt tilgængeligt dipeptid (som indeholder de første to 15 aminosyrerester til det ønskede peptidafstandsled) er N-methacrylo- yleret som beskrevet fx i Makromol. Chem. 177, 1976, s. 2833. (N-Methacryloyleret tyrosinamid til bioassay-formål kan fremstilles på samme måde.) ii) Det N-methacryloylerede dipeptid esterificeres derefter med p-ni-20 trophenol som fx beskrevet i Makromol. Chem. 178, 1977, s. 2169. (De N-methacryloylerede p-nitrophenylestere af Leu og Phe, som giver de aminosyreafstandsled, der kan anvendes til determinanten, kan fremstilles på samme måde.) iii) Peptidkæden i den N-methacryloylerede dipeptidyl-p-nitrophe-25 nylester forlænges derefter (medmindre dipeptidet er Gly-Gly, i hvilket tilfælde dipeptidet selv dannet ét af de afstandsled, som kan anvendes til determinanten) til dannelse af den ønskede peptidsekvens ved tilsætning af et peptid, der indeholder de nødvendige aminosyrerester som beskrevet fx i Makromol. Chem. 182, 1981, s. 1917.
30 iv) Det under iii) vundne N-methacryloylerede peptid kan copolyme-riseres med HPMA til dannelse af en polymerprecursor med sidekæder,
DK 164485B
16 som har terminale carboxylgrupper, eller det kan genesterificeres med p-nitrophenol. I sidstnævte tilfælde kan den N-methacryloylerede peptidyl-p-nitrophenylester copolymeriseres med HPMA som fx beskrevet i J. Polymer Sci., Polymer Symp. 66, 1979, s. 15, eller, hvis me-5 dikamentet og determinanten skal have forskellige afstandsled, kan den behandles med den reaktive determinant til dannelse af den N-methacryloylerede oligopeptidholdige determinant og derefter copolymeriseres med en N-methacryloyleret ester og HPMA som fx beskrevet i Biochim. Biophys. Acta 755, 1983, s. 518.
10 Fremstilling af HPMA er beskrevet i Angew. Makromol. Chem. 70, 1978, s. 109; de reaktive medikamenter og determinanter er alle kommercielt tilgængelige. Aminosyre- og peptidylderivater af medikamenter og determinanter kan fremstilles ved metoder beskrevet i Makromol. Chem.
184-, 1983, s. 1997, og tværbindingsmidlerne kan fremstilles som 15 beskrevet fx i Makromol. Chem. 182, 1981, s. 1899.
Den foreliggende opfindelse omfatter også farmaceutiske præparater, som er ejendommelige ved, at de indeholder mindst ét polymermedikament ifølge opfindelsen og en inert, fysiologisk acceptabel bærer. Polymermedikamenterne kan administreres oralt eller ved injektion, fx 20 ved intraperitoneal, intravenøs eller intramuscular injektion.
En hvilken som helst af de excipienser og formulerings tilsætningsstoffer, som sædvanligvis anvendes i sådanne farmaceutiske præparater, kan i princippet anvendes sammen med polymermedikamenterne ifølge opfindelsen. I tilfælde af formuleringer til injektion fore-25 trækkes det at anvende sterile vandige medier som bærer.
Opfindelsen illustreres ved nedenstående eksempler.
Eksempel 22-35 angår den biologiske afprøvning af polymermedikamenter ifølge opfindelsen og analoge dermed, og de øvrige eksempler angår syntesen af sådanne polymermedikamenter.
30 Som angivet angår en række af eksemplerne 22-35 den biologiske afprøvning af analoge med polymermedikamenter ifølge opfindelsen, idet disse analoge er forbindelser, der omfatter a) og i nogle tilfælde
DK 164485 B
17 det ene ad eller begge eventuelle de fakultative d) og e), eller af forbindelser ifølge opfindelsen, som kun indeholder det ene af b) og c) og ikke begge. Der blev anvendt analoge i disse eksempler i stedet for forbindelser ifølge opfindelsen, så at virkningen af variation 5 af b) og c) individuelt kunne påvises tydeligere.
EKSEMPEL 1
Fremstilling af en enkeltkædet polymer indeholdende daunomycin bundet til et tetrapeptidafstandsled, galactosamin bundet til et dipepti-dafstandsled og tyrosinamid bundet direkte til hovedkæden 10 HP MA ^ Tyr-NH2 MA-Tyr-NHg 11) WGly-Gly-gal MA-Glv-Gly- copolyrnerisation ^-Glv-Phe-Leu- galactosamme (2)^ --* , Giy_0Xp (il) MA-Gly-Phe-Leu- I i
Gly-ONp (3) I
s v—Tyr-NHg daunomycin C
-1—> e—G ly-Gly-Ga1
C—Glv-Phe-Leu-Gly-DNM
' * (5)
Fremstilling af MA~Tyr-NH2 (1) MA-Tyr-NH2 blev fremstillet ved omsætning af 3,4 g (0,017 mol) p-nitrophenylmethacrylat med 3,0 g (0,017 mol) Tyr-NH2 i dimethyIforma-15 mid og omrøring af reaktionsblandingen i 16 timer ved 25eC. Efter afdampning af opløsningsmidlet, blev den viskose olie blandet med tør ether og en lille mængde hydroquinon. Udbyttet var 3 g fast produkt (smeltepunkt 194-196eC, krystalliseret af ethanol). Molær ekstinktionskoefficient, c 280 nm 1,7 x 10^ (ethanol).
20 Fremstilling af MA-Gly-Gly-galactosamin (2)
DK 164485 B
18
Til en blanding af 3,5 g (1,08 x 10'2 mol) MA-Gly-Gly-ONp (methacryl-oyl-glycylglycin p-nitrophenylester) og 2,8 g (1,3 x 10"2 mol) galac- . tosaminhydrochlorid i 18 ml dimethylformamid blev langsomt sat 18,2 ml (1,3 x 10*2 mol) triethylamin, og reaktionsblandingen blev omrørt 5 i 16 timer ved 25°C. Triethylaminhydrochloridet blev derefter filtreret fra, og resten af reaktionsblandingen blev inddampet til en viskos olie. Efter tilsætning af ethanol og afkøling fik man råproduktet. Omkrystallisation gav 1,5 g produkt, smeltepunkt 112°C (ethanol) .
10 Fremstilling af MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3)
En blanding af 4,1 g (1,0 x 10‘2 mol) MA-Gly-Phe-ONp (fremstillet i overensstemmelse med J. Polym Sci. 66, 1979, s. 15) i 50 ml dioxan, 2,1 g (1,1 x 10’2 mol) H-Leu-Gly-OH i 50 ml H20 og 1,8 g (2,2 x 10'2 mol) NaHCOj blev omrørt i 48 timer ved stuetemperatur. Opløsningsmid-15 let blev afdampet under reduceret tryk for at formindske blandingens volumen til en fjerdedel af det oprindelige volumen, og efter tilsætning af en lille mængde inhibitor (hydroquinon) blev reaktions-blandingen syrnet med fortyndet saltsyre til en pH-værdi på 2. Råproduktet blev ekstraheret med ethylacetat og udfældet med diethylether.
20 Udbyttet var 74% MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH; smeltepunkt 145-150°C. TLC-Analyse viste, at produktet ikke indeholdt urenheder. (NB: Det blev foretrukket at anvende råproduktet til næste reaktionstrin, da det rene materiale let polymeriserer under oprensning).
4,6 g (1,0 x 10“2 mol) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-OH blev esterificeret med 25 p-nitrophenol (1,1 x 10"2 mol) i 55 ml THF ved hjælp af dicyclohexyl-carbodiimid (DCC) (1,1 x 10*2 mol). Efter 3 timer ved 15°G og 12 timer ved 25°C blev dicyclohexylurinstoffet filtreret fra, og den tilbageblevne opløsning blev inddampet under reduceret tryk. Remanensen blev størknet ved tilsætning af tør ethylether, og efter om-30 krystallisation af acetone/ether i forholdet 3:1 fik man MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp i et udbytte på 76%, som var analytisk rent, smeltepunkt 124-128eC. Aminosyreanalyse viste Gly/Leu/Phe i forholdet 2,0:1,0:0,-99.
DK 164485 B
19
Fremstilling af reaktiv polymerprecursor (4)
Copolymerisation af HPMA + MA-Tyr-NH2 (1) + MA-Gly-Gly-galactosamin (2) + MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3):
Til en opløsning af 2,5 g (1,75 x 10'^ mol) HPMA (92 mol%), 0,047 g 5 (1,90 x 10'4 mol) MA-Tyr-NH2 (1 molX) og 0,555 g (9,54 x 10'4 mol) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (5 mol%) i 25 ml acetone blev sat en opløsning af 0,138 g (3,82 x 10'4 mol) MA-Gly-Gly-gal (2 molX) i 1 ml DMSO. En opløsning af 0,153 g azo-bis-isobutyronitril i 3 ml acetone blev derefter tilsat. Blandingen blev hældt i ampuller, ampullerne blev 10 gennemboblet med nitrogen og forseglet, og blandingen blev polymeri-seret ved 50°C i 24 timer. Den udfældede polymer blev skilt fra og renset ved opløsning i methanol og genudfældning i acetone. Udbyttet var 1,9 g (60%). Produktet indeholdt 4,7 mol! -Gly-Phe- Leu-Gly-ONp-sidekæder (bestemt ud fra e 274 nu » 9,5 x 10^ i DMSO), 1,8 mol% -15 Gly-Gly-galactosamin-sidekæder (bestemt under anvendelse af GPC efter syrehydrolyse) og 1,0 mol% -Tyr-NH2*sidekæder. M„ af aminolyseret polymer - 22.000; My/Mjj - 1,4.
Fremstilling af polymer indeholdende daunomycin (5)
Binding af daunomycin til polymerprecursor (4) 20 Til en opløsning af 1,0 g copolymer (4) indeholdende 2,8 x 10"4 mol reaktive p-nitrophenoxygrupper i 4 ml dimethylsulfoxid (DMSO) blev sat en opløsning af 0,16 g (2,8 x 10-4 mol) daunomycin-hydrochlorid i 1 ml DMSO efterfulgt af 0,028 g (2,8 x 10'4 mol) triethylamin. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i mørke i 16 timer, hvorefter 25 20 μΐ aminopropanol blev tilsat for at fjerne eventuelle tilbage værende- ONp-grupper. Polymeren blev udfældet ved at hælde blandingen i 400 ml af en blanding af acetone og diethylether i forholdet 9:1; det udfældede stof blev filtreret fra, grundigt vasket med acetone og ether og tørret. Polymeren blev renset ved dobbelt gelfiltrering 30 under anvendelse af Sephadex® LH-20 (2 x 100 cm) og methanol som eluent. Methanolet blev afdampet under reduceret tryk, og ren polymer blev isoleret fra den vandige opløsning ved frysetørring. Udbyttet var 0,75 g. Polymeren indeholdt 3,5 molX sidekæder, der endte i daunomycin (10,2 vægtprocent daunomycin), 1,8 molX sidekæder, der
DK 164485 B
20 endte i galactosamin (1,8 vægtprocent galactosamin), og 1 mol% Tyr-NH2*sidekæder. Polymeren indeholdt mindre end 0,1% daunomycin i forhold til mængden af bundet daunomycin.
Bestemmelse af ubundet daunomycin: 5 Frit DNM blev bestemt ved ekstraktion med ethylacetat: 1,5 mg polymer blev opløst i 1 ml H2O og rystet med en blanding af 1 ml puffer (0,2M Na2C03/NaHC03, pH-værdi 9,8) og 2 ml ethylacetat. Den organiske fase blev skilt fra og tørret med en lille mængde tørt MgSO^, og koncentrationen af DNM blev bestemt spektrofotometrisk ved 485 nm [e - 1,0 10 x 10^ (ethylacetat)].
EKSEMPEL 2
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende daunomycin og galactosamin bundet til et te trapep tidafstands led og tyros inamid bundet direkte til polymerskelettet.
15 / t yr o s α nami d C—Gly—Phe-Leu-Glv-ONp 1) Daunomycin ** 2') Galactosamin (-tyro s inamid (-Gly-Phe-Leu-G ly- daunomycin V-Gly-Phe-Leu-Gly-galactosamin
En copolymer af HPMA, MA-tyrosinamid og MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (0,1 g, 2,85 x 10*5 mol -ONp-grupper) blev opløst i 0,4 ml dimethylsul-foxid (DMSO), og en opløsning af 8,5 mg (1,5 x 10"^ mol) daunomycin-20 hydrochlorid i 0,1 ml DMSO blev tilsat efterfulgt af 1,5 mg (1,5 x 10*5 mol) triethylamin. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 90 minutter, hvorefter en opløsning af 6,5 mg (3,0 x 10"^ mol) galac-tosamin-hydrochlorid i 0,1 ml DMSO blev tilsat efterfulgt af 3,0 mg (3,0 x 10*^ mol) triethylamin. Blandingen blev omrørt i 16 timer ved 25 stuetemperatur og derefter hældt i en blanding af acetone og diethy-lether i forholdet 9:1. Den udfældede polymer blev filtreret fra,
DK 164485 B
21 grundigt vasket med acetone og diethylether og tørret i vakuum.
Polymeren blev renset ved dialyse i Visking-rør under anvendelse af fortyndet syre og derefter vand. Den rene polymer blev isoleret ved frysetørring og indeholdt 2,17 molX sidekæder, der endte i daunomy-5 cin, dvs. 7,5 vægtprocent aktivt produkt, og 1,8 mol% sidekæder, der endte i galactosamin, dvs. 2,0 vægtprocent galactosamin.
EKSEMPEL 3
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende daunomycin bundet til et dipeptidafstandsled og tyrosinamid bundet direkte til polymer-10 skelettet.
HPMA ~1 MA-Tyr-NH2 ^ copolymerisation ) T-r~*VH2 MA-Gly-Gly-ONp (6)j Luy-Gly-ONp >~Tyr-.\H2
daunomycin i—Gly-Gly-DNM
* > (8)
Methacryloylglycylglycin-p-nitrophenylester (6) blev fremstillet ifølge Makromol. Chem. 177, 1976, s. 2833. Fremstillingen af polymer-15 precursoren ved copolymerisation blev udført som vist i eksempel 1.
My/M^ *»1,4 (aminolyseret precursor).
Fremstilling af polymer indeholdende daunomycin (8)
Til en opløsning af 0,50 g polymerprecursor (7), 5,5 mol% Gly-Gly-ONp-sidekæder (1,8 x 10"^ mol ONp-grupper) i 2 ml DMSO blev der sat 20 0,038 g (1,35 x 10*^ mol) daunomycin-hydrochlorid i 0,3 ml DMSO
efterfulgt af 0,014 g (1,35 x 10'^ mol) triethylamin. Den videre fremgangsmåde var den samme som i eksempel 1. Udbyttet var 0,38 g polymer indeholdende 3,1 molZ -Gly-Gly-daunomycin-sidekæder (10,2 vægtprocent daunomycin); e 485 nm *- 9800 (H2O).
22
DK 164485 B
EKSEMPEL 4
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende daunomycin og anti-Θ-antistoffer bundet til tetrapeptid-sidekæden og tyrosinamid bundet direkte til polymerskelettet.
5 ^ ^ S-Tvr-NH, i-Tyr-NH ( ' 2 \ rt . τη. , r-Gly-Phe-Leu- /-Gl\-Phe-Leu-Gly-ONp daunomycin ) Glv-DX>‘ j (9) ? V-Gly-Phe-Leu-Gly- ) ONp ί( 10 T>r NHg -Gly-Phe-Leu-Gly-DNM -Gly-Phe-Leu-Gly-anti Θ-(11) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (3) blev fremstillet som beskrevet i eksempel 1, og polymerprecursor (9) blev fremstillet ved copolymerisation af 10 HPMA og (3) ved den i eksempel 1 beskrevne metode. Polymerprecursor (9) indeholdt 8,0 molX -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp-sidekæder og 1 molZ Tyr-NH2- Μ„ af aminolyseret precursor (9) = 17.000; Mw/Mn = 1,3.
Fremstilling af polymer med daunomycin og frie reaktive grupper
Til en opløsning af 0,31 g polymerprecursor (9) (indeholdende 1,35 x 15 10"^ mol ONp-grupper) i 1,2 ml DMS0 blev sat 0,028 g (5,1 x 10mol) daunomycin-hydrochlorid i 0,1 ml DMSO og 0,0052 g (5 x 10"^ mol) triethylamin. Reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 60 minutter og derefter hældt i 400 ml acetone/etherblanding i forholdet 3:1 til udfældning af polymeren. Polymeren indeholdt 2,5 molZ sidekæ-20 der, der endte i daunomycin, og 4,3 mol% sidekæder, der endte i uomsatte ONp-grupper.
Binding af anti-6-antistoffer til polymer indeholdende daunomycin 77 mg af den i foregående afsnit beskrevne copolymer blev opløst ved 5°C i 0,5 ml fortyndet saltsyre (pH-værdi 3,0). 0,6 ml Sorensen's
DK 164485B
23 puffer (pH-værdi 8,0) indeholdende 0.15M NaCl blev derefter tilsat efterfulgt af dråbevis tilsætning af 0,67 ml anti-Ø-antistof-opløs-ning i den samme puffer (indeholdende 39,5 mg protein). Reaktionen fik lov til at forløbe i 30 minutter ved 5“C. I løbet af de følgende 5 30 minutter blev temperaturen gradvis forøget til 20"C. (Ved begyn delsen af reaktionen var det molære forhold mellem reaktive grupper ONp og NH2 = 1:1, og koncentrationen af makromolekyler var 6,6 vægtprocent) . Efter 1 times omsætning blev der tilsat en opløsning af 20 μΐ l-aminopropan-2-ol i 0,2 ml Sørensen's puffer (pH-værdi 8,0) inde-10 holdende 0,15M NaCl. Efter 10 minutter blev reaktionsblandingen overført til et Visking-dialyserør og dialyseret mod phosphatpuf ret saltvand (pH-værdi 7,2).
EKSEMPEL 5
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende puromycin og galac-15 tosamin bundet til tetrapeptidafstandsled ”v--Tvr-NH^ 1. Puroim'cin V-Tvr-NH,, / £ \ ' 2 ) t,, , ox- -b U-Glv-Phe-Phe- V-Gly-Phe-Phe-Leu-0.\p _ ' . ) ~ ( 2. galactosamxn f Leu-puromycm S (13) V-Gly-Phe-Phe-Leu- ' ) galactosaroin \ ilk)
Fremstilling af MA-Gly-Phe-Phe-Leu-ONp (12)
En blanding af 4,1 g (1,0 x 10'^ mol) MA-Gly-Phe-0Np (jfr. eksempel 20 1) i 50 ml dioxan, 3,06 g (1,1 x 10"^ mol, Sigma) H-Phe-Leu-OH i 50 ml dioxan og 1,85 g NaHC03 (2,2 x 10"^ mol) i 50 ml H2O blev omrørt ved stuetemperatur i 45 timer. Den videre fremgangsmåde svarede til fremstillingen af forbindelse (3) i eksempel 1. Råproduktet (udbytte 512), MA-Gly-Phe-Phe-Leu-OH blev esterificeret med p-nitrophenol ved 25 den i eksempel 1 beskrevne metode. Efter omkrystallisation af en blanding af acetone og ether i forholdet 3:9 blev det rene produkt
DK 164485 B
24 opnået i et udbytte på 50%. Aminosyreanalyse viste Gly/Phe/Leu i forholdet 1,0:1,98:1,0,
Fremstilling af polymerprecursor (13)
Copolymerisation af HPMA (95 mol%) med MA-Tyr-NH2 (1 mol%) og MA-Gly-5 Phe-Phe-Leu-ONp (12) (5,0 mol%) i overensstemmelse med den i eksempel 1 beskrevne metode gav en polymerprecursor indeholdende 3,0 mol% -Gly-Phe-Phe-Leu-ONp-sidekæder og 1,0 mol% Tyr-N^-sidekæder. M„ 23.000; 1^/Mn 1,3.
Binding af puromycin og galactosamin 10 Til en opløsning af 0,36 g polymerprecursor (13) (indeholdende 6,5 x 10“·* ONp-grupper) i 1,4 ml DMSO blev sat en opløsning af 0,026 g (4,4 x 10"^ mol) puromycin-dihydrochlorid i 0,1 ml DMSO og 0,0088 g (8,8 x 10"-* mol) triethylamin. Efter omrøring i 30 minutter ved stuetemperatur blev 0,094 g (4,4 x 10"-* mol) galactosamin og 0,044 g (4,4 x 10“^ 15 mol) triethylamin sat til blandingen. Reaktionsblandingen blev omrørt i 16 timer, hvorefter 10 pi aminopropanol blev tilsat. Polymeren blev øjeblikkeligt udfaldet i 400 ml acetone, vasket og tørret. Polymeren blev genudfældet af en methanolopløsning med acetone og renset ved dialyse af en vandig opløsning i et Visking-dialyserør. Efter iso-20 lering af produktet ved lyofilisering fik man 0,265 g af polymeren indeholdende 1,3 mol% sidekæder, der endte i puromycin (3,7 vægtprocent puromycin bestemt ud fra molær ekstinktionskoefficient e 272 nm - 2,0 x 104, ethanol), og 1,0 mol% sidekæder, der endte i galactosamin (1,0 vægtprocent galactosamin). Renheden af produktet, 25 dvs. tilstedeværelsen af lavmolekylært puromycin, blev kontrolleret ved ekstraktion af polymeren med ethylacetat som beskrevet i eksempel 1 og bekræftet ved GPC på Sephadex® G-15.
EKSEMPEL 6 25
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende deacetylcolchicin bundet til tripeptidafstandsled og en lille mængde Tyr-NH2
DK 164485 B
i-Tyr-NH^ deacetyl- V-Ala-Val-Ala-ONp colchicin (-Ala-Val-Ala- } (16) ...... ——^ ( deacetylcolchicin ' j (17)
Fremstilling af MA-Ala-Val-Ala-ONp (15) 5 15 g (0,17 mol) alanin blev opløst i 40 ml methanol, og 20 g thionyl- chlorid blev langsomt sat til opløsningen ved -15°C. Efter 1 time ved stuetemperatur og 2 timers kogning og fjernelse af methanol blev 12 g HCl.Ala-OMe isoleret under anvendelse af diethylether.
Til en opløsning af 10 g (0,086 mol) valin og 3,4 g (0,086 mol) NaDH 10 i 250 ml af en blanding af dioxan og vand i forholdet 2:1 blev langsomt sat 20,5 g (0,094 mol) di-tert.butylcarbonat ved 0eC under kraftig omrøring. Reaktionsblandingen blev derefter omrørt i endnu 1 time ved stuetemperatur, dioxan blev fjernet under reduceret tryk, og BOC-Val-OH blev vundet ved at syrne blandingen til en pH-værdi på 15 2-3. Råproduktet bestående af 18 g viskos olie blev vundet efter af dampning af opløsningsmidlet fra ethylacetatekstrakterne.
Kondensationen af BOC-Val-OH med HCl.Ala-OMe blev udført ved en blandet anhydridmetode. 12 g (0,055 mol) BOC-Val-OH blev opløst i 40 ml tørt THF, og 5,6 g (0,055 mol) triethylamin og 6,6 g (0,06 mol) 20 chlormyresyreethylester blev sat til opløsningen efter afkøling til-15eC. Efter 10 minutter ved lav temperatur blev 7,7 g (0,055 mol) HCl.Ala-OMe og 5,6 g (0,055 mol) triethylamin langsomt sat til blandingen ved -15°C. Reaktionsblandingen blev omrørt i yderligere 16 timer ved stuetemperatur, THF blev af dampet, og produktet blev eks-25 traheret med ethylacetat. Omkrystallisation af ether gav 8,1 g analytisk rent BOC-Val-Ala-OMe, smeltepunkt 138-148°C.
DK 164485 B
26
Fjernelse af BOC-gruppen blev udført ved at opløse 8,1 g BOC-Val-Ala-OMe i 60 ml methanol og tilsætte 20 ml 30%'s HCl-methanol. Efter 2 timers omrøring blev opløsningsmidlet afdampet, og det rå HCl.Val-Ala-OMe blev isoleret.
5 N-Methacryloylalanin blev fremstillet under anvendelse af Schotten-Bauman’s metode til acylering. Kobling af 5,35 g (0,034 mol) MA-Ala-OH med 8,1 g HCl.Val-Ala-OMe blev udført i dimethylformamid ved hjælp af 7,0 g dicyclohexylcarbodiimid i nærværelse af 3,4 g triethylamin.
Omkrystallisation af Cl^C^/penten gav 9,5 g MA-Ala-Val-Ala-OMe.
10 8 g MA-Ala-Val-Ala-OMe blev hydrolyseret i methanol med et lille overskud af 2N NaOH efterfulgt af syrning (efter fjernelse af metha-nolet) med citronsyre til en pH-værdi på 3. 4 g af råproduktet blev anvendt ved den følgende reaktion.
Af 3,6 g (0,012 mol) MA-Ala-Val-Ala-OH, 1,5 g (0,012 mol) p-nitro-15 phenol og 2,5 g (0,0125 mol) dicyclohexylcarbodiimid i 50 ml tetrahy-drofuran blev der fremstillet 2,0 g (40%'s udbytte) MA-Ala-Val-Ala-ONp, smeltepunkt 174-176cC. Omkrystalliseret af ethylacetat/hexan.
Molær ekstinktionskoefficient, e 274 nm - 9300 (DMSO).
Fremstilling af polymerprecursor 20 Copolymerisation af HPMA (95 mol%), MA-Tyr-NH2 (1 mol%) og MA- Ala-Val-Ala-ONp (4 mol%) gav en polymerprecursor indeholdende 2,9 mol% sidekæder med ONp-grupper. Μ„ = 27.000, Mw/Mn -1,4 (bestemt for aminolyseret precursor).
Blandingen af deacetylcolchicin og isodeacetylcolchicin blev frem-25 stillet ved at behandle trimethylcolchicinsyre med diazomethan i overensstemmelse med en kendt fremgangsmåde (Biochemistry 25, 1966, s. 2463).
DK 164485 B
27
Binding af deacetylcolchicin
Til en opløsning af 0,41 g polymerprecursor (16) (indeholdende 4,0 x 10'^ mol ONp-grupper) i 1,6 ml DMSO blev sat en opløsning af 0,021 g (6,0 x 10'^ mol) deacetylcolchicin i DMSO. Blandingen blev omrørt i 5 20 timer ved stuetemperatur i mørke, og polymeren blev derefter udfaldet i acetone. Rensning blev udført ved ultrafiltrering (UM- 02-membran) i H2O med 20% methanol. Polymerproduktet, som blev isoleret ved lyofilisering, indeholdt 2,7 mol% sidekæder, der endte i deacetylcolchicin. [Beregnet ud fra molær ekstinktionskoefficient, e 350 10 nm - 1,6 x 10^ (ethanol)].
EKSEMPEL 7
Fremstilling af tværbundet polymer indeholdende daunomycin og galac-tosamin fremstillet ved konsekutiv aminolyse.
i-Tyr-NH2 1. H(Phe)-NH(CH2)6NH-(Phe)H
-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp 2· 3· galactosamin ->
/-Tyr-NH2 C
\-Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin \ >-Gly-Phe-Leu-Gly-gal ) (-Gly-Phe-Leu~Glv-Phe-NH( CH„) ^NH-Phe-Gly-Leu-Phe-Gly / j * 2 b \ (19) 1 15
Polymerprecursor (18) blev fremstillet ved copolymerisation af HPMA (90 molX), MA-Tyr-NH2 (1 mol%) og MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp (9,0 mol%). Polymerprecursor (18) indeholdt 8,0 mol% sidekæder, der endte i ONp-grupper. M„ = 17.000, My/M^ = 13 (bestemt for aminolyseret precur-20 sor).
0,2 g af polymerprecursoren (18) (8,0 mol% sidekæder indeholdende ONp-grupper) i 0,8 ml DMSO (9,8 x 10‘^ mol ONp) blev sat til en op-
DK 164485 B
28 løsning af 0,0045 g (1,1 x 10'-* mol) N,N' -bis(H-phe)hexamethylen-diamin i 0,2 ml DMSO. Blandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 5 minutter, hvorefter en opløsning af 0,036 g (6,3 x 10"^) daunomycin-hydrochlorid i 0,3 ral DMSO blev tilsat efterfulgt af 0,0064 g (6,3 x 5 10‘5 mol) triethylamin. Blandingen blev omrørt i 60 minutter, hvor efter en opløsning af 0,018 g (8,5 x 10"·* mol) galactosamin-hydro-chlorid og 0,0086 g (8,5 x 10"·* mol) triethylamin blev tilsat. Blandingen blev omrørt i yderligere 16 timer, hvorefter polymeren blev udfældet i acetone. Polymeren blev renset først ved gelfiltrering 10 under anvendelse af Sephadex® LH-20/methanol og derefter ved dialyse i et Visking-dialyserør mod vand. Den rene polymer blev isoleret ved frysetørring. Polymerproduktet indeholdt 2,8 mol% sidekæder, der endte i daunomycin (7,8 vægtprocent daunomycin) [bestemt ud fra e 485 nm - 9,8 x 10^ (DMSO)], og 3,9 molX sidekæder, der endte i 15 galactosamin. Polymerudbyttet var 0,15 g; Μ„ - 110.000, Mw/Mn = 4,0 (M„ af amino lyseret precursor var 17.000; M^Mjj = 1,3).
EKSEMPEL 8
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende bleomycin og Tyr-NH2 * tyros inamid.
20 )-Tyr-KH2 J-Tyr-NH2 j-Gly-Leu-Gly-0np ^ly-^u-Gly- bleomycin ] (20) \ <21)
Methacryloylglycylleucylglycin-p-nitrophenylester blev fremstillet ved den i eksempel 6 til fremstilling af forbindelse (15) beskrevne fremgangsmåde.
25 Polymerprecursoren blev fremstillet ved copolymerisation af HPMA (94 mol%), MA-Tyr-NH2 (1 mol%) og MA-Gly-Leu-Gly-ONp (5 mol%). Polymer-
DK 164485 B
29 precursoren (20) indeholdt 4,3 molZ sidekæder, der endte i ONp- grupper.
Til en opløsning af 0,137 g precursor (20) (3,8 x 10*^ mol ONp- grupper) i 0,55 ml dimethylsulfoxid blev sat en opløsning af 0,047 g (3,8 x 10'-* mol) bleomycinsulfat og 0,0038 g (3,8 x 10'-* mol) trieth-5 ylarain i 0,3 ml DMSO. Reaktionsblandingen blev omrørt i 12 timer, og polymeren blev derefter isoleret ved, at der blev tilsat 20 μΐ amino-propanol, hvorefter blandingen blev hældt ud i acetone. Efter 2 dages dialyse under anvendelse af Visking-rør blev polymeren lyofiliseret. Udbyttet var 0,102 g. Polymerproduktet indeholdt 3,1 mol% sidekæder, 10 der endte i bleomycin (bestemt ved kinetiske målinger for at bestemme koncentrationen af ONp-grupper).
EKSEMPEL 9
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende melanocyt-stimulerende hormon (MSH) bundet til dipeptidafstandsled.
15
v-Glv-Gly-ONp i-Glv-Glv-MSH
S M£H . \ ) (22) ^ ? (23)
Til en opløsning af 0,20 g polymerprecursor (22) (5,0 molX Gly-Gly-ONp) indeholdende 6,6 x 10'-* mol ONp-grupper i 0,8 ml DMSO blev der sat en opløsning af 0,005 g (3,0 x 10'-* mol) melanocyt-stimulerende 20 hormon i 0,3 ml DMSO. Efter 16 timers omrøring blev 10 μΐ aminopropa-nol tilsat, og polymerproduktet blev udfældet i acetone. Efter rensning under anvendelse af dialyse og lyofilisering blev produktet analyseret for at bestemme indholdet af bundet MSH. Polymerproduktet (23) indeholdt 1,3 vægtprocent MSH (bestemt spektrofotometrisk: for 25 0,347 mg/ral MSH i H20, Alc“78 ^ = 1,49).
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende desferioxamin bundet til tetrapeptidafstandsled.
EKSEMPEL 10 30
DK 164485 B
ilyr-NH j>-Tyr-NH2 f ^ desferioxamin \ /-Glv-Phe-Leu-Gly-ONp ---> \-Gly-Phe-Leu-Gly- \ \ desferioxamin ( (24) ( J ) (25) 5
En polymerprecursor (24) indeholdende 4,3 mol% sidekæder med ONp-grupper (0,20 g; 5,3 x 10"^ mol ONp-grupper) blev opløst i 0,8 ml DMS0, og 0,070 g (1,06 x 10*^ mol) desferioxamin og 0,011 g (1,06 x 10"^ mol) triethylamin i 0,2 ml DMSO blev tilsat. Efter 16 timers 10 omrøring ved stuetemperatur blev polymerproduktet udfældet i 200 ml acetone. Rensning blev udført ved dialyse i vand indeholdende 20% methanol under anvendelse af Visking-dialyserør.
Indholdet af desferioxamin blev beregnet ved kinetiske målinger for at bestemme mængden af ONp-grupper i reaktionsblandingen. Polymer-15 produktet indeholdt 3,9 mol% sidekæder med bundet desferioxamin (12,4 vægtprocent desferioxamin).
EKSEMPEL 11
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende bestatin og galac-tosamin bundet til tetrapeptidafstandsled.
20
ί-Tyr-NH 1. bestatin C-Tvr-NH
^ ) ' ' 2 -Gly-Phe-Leu-Gly-ONp 2. galactosamin /-Gly-Phe-Leu- (26) —___) Gly-bestatin r-Gly-Phe-Leu-) Gly-gal ( ( 2" -/
DK 164485 B
31 0,150 g polymerprecursor (18) (indeholdende 6,8 x 10“^ mol ONp-grupper) blev opløst i 0,6 ml DMSO, og en opløsning af 0,005 g (1,45 x 10'^ mol) bestatin og 0,0029 g (2,9 x 10'^ mol) triethylamin i 0,1 ml DMSO blev tilsat. Efter 1 times omrøring ved stuetemperatur blev 5 en opløsning af 0,030 g (1,3 x 10"^ mol) galactosamin og 0,014 g (1,3 x 10'^* mol) triethylamin i 0,2 ml DMSO tilsat, og reaktionsblandingen blev omrørt ved stuetemperatur i 16 timer. Derefter blev produktet udfældet i 200 ml acetone og renset ved 3 dages dialyse. Det lyofili-serede produkt (0,111 g) blev analyseret for indhold af galactosamin 10 (jfr. eksempel 1), Mængden af bundet bestatin blev beregnet ud fra kinetisk måling ved at følge mængden af ONp-grupper i reaktionsblandingen. Polymerproduktet (27) indeholdt 1,4 mol% sidekæder, der endte i bestatin (2,4 vægtprocent bestatin), og 5,4 mol% sidekæder, der endte i galactosamin (5,5 vægtprocent galactosamin).
15 EKSEMPEL 12
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende adriamycin og man-nosamin bundet til tetrapeptidafstandsled.
(-Tyr-NH2 1. adriamycin VTyr-NH2 \ T 2. mannosamin ) T .
/_Gly-Leu-Leu- (-Gly-Leu-Leu-Gly- J Gly-0.\p _y / adriamycin ; (-Gly-Leu-Leu-Gly- ) ( marmosamin > ( 20 ' 20 Methacryloylglycylleucylleucylglycin-p-nitrophenylester blev fremstillet på en måde svarende til den i eksempel 1 beskrevne til fremstilling af forbindelse (3).
Polymerprecursor (28) blev fremstillet ved copolymerisation af HPMA (89,5 molX), MA-Tyr-NH2 (1 molX) og MA-Gly-Leu-Leu-Gly-ONp (9,5 25 mol%). Polymeren indeholdt 8,1 mol% tetrapeptidsidekæder, der endte i ONp-grupper. M„ - 17.000; Μ^,/Μη - 1,3 (bestemt for aminolyseret precursor).
DK 164485 B
32
Polymerprodukt (29) blev fremstillet ud fra 0,4 g af polymerprecur-soren (28) indeholdende 1,8 x 10'^ mol ONp-grupper opløst i 1,6 ml DMSO, hvortil der blev sat 0,06 g (1,1 x 10"^ mol) adriamycin-hy-drochlorid og 0,011 g (1,1 x 10*^ mol) triethylamin i 0,2 ml DMSO.
5 Efter 1 times omrøring ved 25°C blev 0,030 g (1,4 x 10"^ mol) galac-tosamin og 0,014 g (1,4 x 10'^ mol) triethylamin sat til blandingen.
Den efterfølgende fremgangsmåde var den samme som beskrevet i eksempel 1. Polymerproduktet indeholdt 3,2 mol% sidekæder indeholdende adriamycin (9,6 vægtprocent adriamycin) og 4,1 molZ sidekæder inde-10 holdende mannosamin. Udbyttet var 0,31 g. Indholdet af sukkerrester blev bestemt efter syrehydrolyse under anvendelse af GPC i overensstemmelse med en kendt metode (Anal. Biochem. 73, 1976, s. 532).
EKSEMPEL 13
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende bleomycin bundet til 15 tripeptidafstandsled.
VGly-Phe-Tyr-ONp ^ r, r _ ^ r-kly-Phe-Tyr-bleomycin (3°) bleomycin S (3!)
Den reaktive monomer MA-Gly-Phe-Tyr-ONp og polymerprecursoren (30) blev fremstillet i overensstemmelse med Makromol. Chem. 182, 1981, s.
20 799. Polymerprecursoren indeholdt 8,5 mol% sidekæder med ONp-grupper.
Mrø/Mjj -1,3 (bestemt for aminolyseret precursor) .
Bindingen af bleomycin til polymerprecursoren blev udført ved den i eksempel 8 beskrevne metode. Polymerproduktet (31) indeholdt 5,7 molZ sidekæder indeholdende bleomycin.
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende puromycin og fuco- sylamin bundet til tripeptidafstandsled.
EKSEMPEL 14 33
DK 164485 B
·» / (ri nu av 1· puromycin V-Gly-Phe-Phe- \-Glv-Phe-Phe-ONp r ) ( ' _^ ( puromycin } 2. fucosylamine (-Gly-Phe-Phe-fucosy- \ (32) / laxnine (33) 5
Reaktiv monomer MA-Gly-Phe-ONp og polymerprecursor (32) blev fremstillet i overensstemmelse med Makromol. Chem. 182, 1981, s. 799. Polymerprecursoren indeholdt 12,9 molX sidekæder med ONp-grupper. M„ af amino lyseret precursor - 14.000; - 1,28.
10 Til en opløsning af 0,25 g polymerprecursor (32) (1,64 x 10"^ mol ONp-grupper) i 1 ml DMSO blev sat en opløsning af 0,029 g (4,9 x 10*^ mol) puromycin-dihydrochlorid og 0,010 g (9,8 x 10*^ mol) triethyla-min i 0,25 ml DMSO. Reaktionen fik lov til at foregå i 1 time, og derefter blev 0,015 g (9,0 x 10"^ mol) fucosylamin i 0,1 ml DMSO sat 15 til blandingen. Den efterfølgende fremgangsmåde svarede til den i eksempel 5 beskrevne. Polymerproduktet (33) indeholdt 4,1 mo!% sidekæder, der endte i puromycin, og 6,7 mol% sidekæder, der endte i fucosylamin.
EKSEMPEL 15 20 Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende transferrin bundet til dipeptidafstandsled.
1-Gly-Gly-ONp VGly-Gly-transf errin (34. transferrin ( -) (35'
DK 164485 B
34 27,4 mg polymerprecursor (34) indeholdende 11,4 molZ Gly-Gly-ONp-sidekæder blev opløst i 0,25 ml fortyndet saltsyre (pH-værdi 3,0).
1,25 ml Sørensen-puffer (pH-værdi 8) indeholdende 0,1M NaCl blev derefter tilsat efterfulgt af en opløsning af 14,2 mg transferrin i 5 0,5 ml af den samme puffer. Efter 45 minutter blev 10 μΐ l-amino-2- propanol opløst i 0,2 ml Sørensen-puffer sat til blandingen. Efter 30 minutter blev reaktionen stoppet og overført til Visking-dialyserør og dialyseret mod phosphatpufret saltvand (pH-værdi 7,2).
EKSEMPEL 16 10 Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende IgG bundet til dipeptidafstandsled.
^-Gly-Gly-OH ^ ^-Gly-Gly-IgG
En copolymer af HPMA og MA-Gly-Gly-0H (15,0 mg, 5,0 x 10'6 mol C00H-15 grupper) blev opløst i Sørensen-puffer med en pH-værdi på 5 (75 μΐ), og en opløsning af 0,002 mg N-cyclohexyl-N'-[2-morpholinoethyl]carbo-diimid i 40 μΐ af den samme puffer blev tilsat ved 1°C. Blandingen blev omrørt i 15 minutter, hvorefter en opløsning af 60,0 mg IgG i 235 μΐ af den samme puffer langsomt blev tilsat. Blandingen blev 20 omrørt i 5 timer og fik derefter lov at henstå natten over ved 4°C.
Den rå reaktionsblanding blev dialyseret mod phosphatpufret saltvand (pH-værdi 7,2).
Fremstilling af tværbundet polymer indeholdende puromycin og galac- tosamin bundet til tripeptidafstandsled 35
DK 164485 B
EKSEMPEL 17
Vdy-Phe-Tyr-ONp 1. H-Ala-Gly-HN(CH2 »^.ΝΉ-Gly-Ala-H
C (36^ 2. puromycin ) 3. galactosamin -> CGly-Phe-Tyr-puromycin (
S-Gly-Phe-Tyr-gal S
f-Gly-Phe-Tyr-Ala-Gly-HN; ( CH^) ^NH-Gly-Ala-Tyr-Phe-Glv-r 5 (37)
Polymerprecursor (36) indeholdende 4,8 molZ sidekæder med ONp- grupper blev fremstillet i overensstemmelse med Hakromol. Chem. 182, 1981, s. 1899.
2,0 g polymerprecursor (36) indeholdende 5,9 x 10'^ mol ONp-grupper 10 blev opløst i 8 ml DMSO, og en opløsning af 0,038 g (9,8 x 10*^ mol) l,2-bis(alanylglycylamino)ethan-dihydrochlorid i 0,2 ml DMSO blev tilsat efterfulgt af 0,020 g (2,0 x 10"^ mol) triethylamin. Tværbinding blev udført i 20 minutter. Derefter blev 0,120 g (2 x 10'^ mol) puromycin-dihydrochlorid i 1 ml DMSO og 0,040 g (4 x 10*^ mol) 15 triethylamin sat til blandingen. Efter omrøring af reaktionsblandingen i 1 time blev en opløsning af 0,129 g (6,0 x 10'^ mol) galactosamin- hydrochlorid og 0,060 g (6,0 x 10"^ mol) triethylamin i 1 ml DMSO tilsat. Blandingen blev omrørt i 16 timer ved stuetemperatur.
Produktet blev isoleret og renset som beskrevet i eksempel 5. Pro-20 duktet indeholdt 1,5 molZ sidekæder, der endte i puromycin (4,3 vægtprocent puromycin), og 2,8 molZ sidekæder, der endte i galactosamin.
Fremstilling af tværbundet polymer indeholdende puromycin og fuco- sylamin bundet til tripeptidafstandsled.
36
DK 164485 B
EKSEMPEL 18
C-Gly-Phe-Phe-ONp 1. H-Gly-HM CH2) ^KH-Gly-H
\ 2. puromycin ( (38) ) 3· fucosvlamin > -:-> C-Gly-Phe-Phe-puromycin ) VGly-Fhe-Phe-fucosvlamin i )-Gly-Phe-Phe-Gly-HN( CH2) 6NH-Gly-Phe-Phe-Gly-( < (36) ' 5
Polymerprecursor (38) indeholdende 4,8 mol% sidekæder med ONp- grupper blev fremstillet i overensstemmelse med Makromol. Chem. 182, 1981, s. 1899.
2,0 g polymerprecursor (38) indeholdende 5,9 x 10"^ mol ONp-grupper 10 blev opløst i 8 ml DMSO, og en opløsning af 0,029 g (9,8 x 10"^ mol) l,2-bis(glycylamino)ethandiacetat fremstillet i overensstemmelse med Makromol. Chem. 182, 1981, s. 1899, i 0,2 ml DMSO blev tilsat efterfulgt af 0,020 g (2,0 x 10"^ mol) triethylamin. Tværbinding blev udført i'5 minutter. 0,120 g (2 x 10*^ mol) puromycin-dihydrochlorid 15 i 1 ml DMSO og 0,040 g (4 x 10*^ mol) diethylamin blev derefter sat til blandingen. Efter omrøring af reaktionsblandingen i 1 time blev en opløsning af 0,98 g (6,0 x 10*^ mol) fucosylamin i 1 ml DMSO tilsat. Blandingen blev omrørt i 16 timer ved stuetemperatur. Produktet blev isoleret og renset som beskrevet i eksempel 5. Produktet 20 indeholdt 1,4 molZ sidekæder, der endte i puromycin (4,2 vægtprocent puromycin), og 3,0 mol% sidekæder, der endte i fucosylamin.
37
DK 164485 B
EKSEMPEL 19
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende daunomycin bundet til tetrapeptidafstandsled og galactose bundet direkte til polyraerkæ-den.
5 ^Gal ^-Gal ^-Gly-Phe-Leu-Gly-OXp daunomycin J-Glv-Phe-Leu-Gly- S ., , --f S daunomvcin
' (40) C
) (4l)
Fremstilling af polymerprecursor (40) 0,71 g (5 x ΙΟ'3 mol) HPMA og 1,64 g (5 x 10"3 mol) 1,2,3,4-di-O-isopropyliden-6-0-methacryloyl-a-D-galactopyranose (fremstillet i 10 overensstemmelse med J. Chem. Soc. (London) C, 1966, s. 1913) blev opløst i 13,0 ml dimethylsulfoxid. Til denne opløsning blev sat 3 mg (1,8 x 10'^ mol) azo-bis-isobutyronitril i 1,8 ml dimethylsulfoxid efterfulgt af 291 mg (5 x 10’^ mol) MA-Gly-Phe-Leu-Gly-ONp i 1,0 ml DMS0 fremstillet i overensstemmelse med den i eksempel 1 beskrevne 15 metode. Blandingen blev gennemboblet med nitrogen og derefter polymer iseret i en forseglet ampul ved 60"C i 30 timer. Den resulterende polymer blev udfældet i ether og deacetoneret ved at blive opløst i 80%'s vandig myresyre i 20 timer ved stuetemperatur. Udbyttet af polymerprecursoren efter afdampning af myresyren var 1,2 g; indholdet 20 af ONp-grupper var 9,5 mol%, og indholdet af galactose var 52 mol%.
Binding af daunomycin til polymerprecursor (40) 374 mg (1,6 x 10'^ mol) polymerprecursor (40) blev opløst i 1,6 ral DMS0 og 50 mg (8 x 10*3 mol) daunomycin-hydrochlorid i 0,3 ml DMS0, og 0,0111 ml (8 x 10"3 mol) triethylamin blev sat til opløsningen.
25 Reaktionsblandingen blev omrørt i 30 minutter ved stuetemperatur.
Derefter blev der tilsat 20 μΐ aminopropanol, og produktet udfældede øjeblikkeligt i 200 ml acetone. Det udfældede stof blev opløst i methanol, og polymerfraktionen blev adskilt under anvendelse af en Sephadex® LH-20-søjle (100 x 2,5 cm) ækvilibreret med methanol.
DK 164485 B
38
Udbyttet var 0,28 g; indholdet af tetrapeptidsidekæder, der endte i daunomycin, var 3,5 mol%.
EKSEMPEL 20
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende melphalanisoprop-5 ylester bundet til tripeptidafstandsled og galactose bundet direkte til hovedkæden.
iAcGalactose Glycylmelphalan- VAcGalactose isopropylester \
Gly-Phe-ONp (Gly-Me-ipe) VGly-Phe-Gly-Me-ipe (42) ^ ) (43) (-Gaiacrose ^-Glv-Phe-Gl v-Me-ipe -' ( , .
) (4y i
Fremstilling af melphalanisopropylester (Me-ipe) 10 En opløsning af 5 g melphalan i HCl-isopropanol (20%) blev tilbage-svalet i 5 timer. Efter afkøling i et køleskab blev hvide krystaller af analytisk rent produkt isoleret og tørret i vakuum, smeltepunkt 200-201°C. En opløsning af Me-ipe i 50 ml diethylether blev gennem -boblet med NH3 i 3 timer; opløsningsmidlet blev derefter afdampet, og 15 det olieagtige produkt blev anvendt til det næste trin i syntesen.
Fremstilling af glycylmelphalan-isopropylester (Gly-Me-ipe)
Gly-Me-ipe blev fremstillet ved at omsætte 3,03 g BOC-Gly-OH med 6,0 g Me-ipe i 50 ml tetrahydrofuran under anvendelse af DCC-metoden. Den beskyttende BOC-gruppe blev fjernet i HCl/methanolopløsning (15%), og 20 den frie base blev fremstillet ved at boble NH3 gennem Gly-Me-ipe-hydrochloridsuspensionen i diethylether. Ammoniumchlorid blev filtreret fra, og et olieagtigt produkt blev isoleret efter afdampning af opløsningsmidlet.
39
DK 164485 B
Fremstilling af polymerprecursor (42)
Polymerprecursor (42) blev fremstillet ved radikal udfældningscopo-lymerisation af DGM (l,2,3,4-di-0-isopropyliden-6-0-methacryloyl- a-D-galactopyranose) og methacryloylglycyl-phenylalanin-p-nitrophe-5 nylester (MA-Gly-Phe-ONp) (fremstilling i overensstemmelse med Makro-mol. Chem. 178, 1977, s. 2169, som beskrevet i eksempel 1).
Polymerisationsblanding: HPMA 3,43 g (85 molZ) MA-Gly-Phe-ONp 0,926 g (8 mol%) DGM 0,65 g (7 mol%) 10 Azo-bis-isobutyronitril 0,24 g.
Polymerisation blev udført i 24 timer ved 50°C i 44 ml acetone.
Binding af Gly-Me-ipe til polymerprecursoren (42) 3 g af polymerprecursoren (42) blev opløst i 20 ml dimethylsulfoxid, og 0,816 g Gly-Me-ipe blev sat til opløsningen. Blandingen blev 15 omrert ved stuetemperatur i 3 dage, og polymeren blev derefter udfældet i acetone og genudfældet to gange af methanol i en blanding af acetone/diethylether i forholdet 1:1. Deacetonylering af beskyttet galactose bundet til polymerbæreren blev udført i 80Z's myresyre (jfr. eksempel 19), og polymermedikamentet blev isoleret ved lyofili-20 sation og udfældning af methanol i en blanding af acetone og diethy-lether i forholdet 1:1. Udbyttet af polymer var 2,9 g. Indholdet af medikament bundet til polymerbærer (melphalanisopropylester) var 106 mg/g polymer (beregnet ud fra elementaranalyse minus chlorindhold). Molekylvægt af polymerbæreren, Mj, - 35.000. Fravær af lavmolekylær 25 forbindelse (frit medikament) blev kontrolleret ved GPC under anvendelse af en søjle pakket med Sephadex® G-25.
EKSEMPEL 21
Fremstilling af enkeltkædet polymer indeholdende melphalanisoprop- ylester bundet til tetrapeptidafstandsled og galactose bundet direkte 30 til hovedkæden.
40
DK 164486 B
VAcGalactose Leucylglycylmelphalanisopropylester (-Gly-Phe-ONp (Leu-Gly-Me-ipe) ' ---^ λ-AcGalactose myresyre v-Galactose VGly-Phe-Leu-Gly-Me-ipe --^ C-Gly-Phe-Leu-Gly-Me-ipe '1^5' ) (46'>
Fremstilling af leucylglycylmelphalan-isopropylester 3,1 g BOC-Leu-Gly-OH blev omsat med 3,7 g Me-ipe i 35 ml THF under 5 anvendelse af DCC-metoden. Produktet BOC-Leu-Gly-Me-ipe blev krystalliseret af acetone, BOC-Beskyttelsesgrupperne blev fjernet i HCl/met-hanol (15%'s opløsning) i 1 time ved 25eC. Udbyttet var 3,2 g HC1.-Leu-Gly-Me-ipe. Den frie base blev fremstillet ved at boble NH3 gennem en diethylethersuspension af hydrochloridet. Et rent olie-10 agtigt produkt blev isoleret efter fjernelse af ammoniumchlorid og afdampning af opløsningsmidlet. Polymerprecursoren (42) blev fremstillet ved den i eksempel 20 beskrevne metode.
Binding af leucylglycylmelphalan-isopropylester til polymerprecursoren 15 Reaktionen blev udført ved en metode svarende til den i eksempel 18 beskrevne. 0,5 g Leu-Gly-Me-ipe blev sat til en opløsning af 1,5 g af polymerprecursoren (42) i 10 ml DMS0, og blandingen blev omrørt i 3 dage. Polymer (45) blev udfældet i en blanding af acetone og diethyl-ether i forholdet 1:1 og genudfældet to gange af methanol i den samme 20 blanding. Deacetonylering af galactose og isolering og karakterisering af polymer (46) var som beskrevet i eksempel 18. af polymerbærer: 35.000; indhold af medikament (melphalan-isopropylester bundet til polymer): 118 mg/g polymer.
Fravær af frit medikament blev kontrolleret ved GPC (Sephadex® G-25).
EKSEMPEL 22-25 41
DK 164485 B
Virkningen af forskellige peptidafstandsled til samme medikament EKSEMPEL 22 (Virkning på aktiviteten af L1210-museleukæmiceller in vitro) 5 Disse eksperimenter blev udført på tre HPMA-analoge, som ikke indeholdt determinanter. Alle tre analoge indeholdt daunomycin som den bioaktive del og peptidafstandsled til medikamentet i overensstemmelse med b). I detaljer var analogene som følger: i a) HPMA med -Gly-Gly-daunomycin-substituenter, 10 b) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin-substituenter og c) HPMA med -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin-substituenter.
Museleukæmicellerne, L1210, blev holdt i en suspensionskultur i RPMI 40-medium indeholdende 10% varmeinaktiveret hesteserum. Under disse betingelser var fordoblingstiden 15-20 timer til dannelse af celle-15 tætheder på op til ca. 1 x 10^ celler pr. ml. Celletætheden blev bedømt under anvendelse af en Coulter-tæller.
For at bedømme cytotoxiciteten af polymermedikamentet blev celler podet i glas (10 ml), og udgangscelletætheden blev målt. De forskellige polymermedikamenter blev tilsat i forskellige koncentrationer, 20 og cellerne blev holdt i et vækstskab i yderligere 72 timer, før celletætheden blev målt.
Antallet af celler fundet i glas indeholdende polymermedikamentet blev udtrykt som en procentdel af de celler, der var fundet i glas inkuberet i samme periode (72 timer) uden tilsætning af medikamentet.
25 Resultaterne er vist grafisk i fig. 1 på tegningen, hvor kurverne blev dannet ved at aftegne den procentvise cellevækst som funktion af daunomycinkoncentrationen i /xg/ml. Resultaterne indicerer, at alle tre analoge var cytotoxiske over for L1210-museleukæmiceller in vitro
DK 164485 B
42 i en vis udstrækning, men at analog b) og c) viste bedre inhibitorisk virkning end analog a).
EKSEMPEL 23 (Virkning på aktiviteten af L1210-museleukæmiceller in vitro) 5 Disse eksperimenter blev udført på tre HPMA-analoge, som ikke indeholdt determinanter. Alle tre analoge indeholdt sarcolysin (melphalan IPE) som den bioaktive del og peptidafstandsled til medikamentet i overensstemmelse med b). I detaljer var analogene som følger: a) HPMA med -Gly-Leu-Gly-sarcolysin-substituenter, 10 b) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-sarcolysin-substituenter og c) HPMA med -Gly-Phe-Gly-sarcolysin-substituenter.
Fremgangsmåden ved eksperimentet var den samme som beskrevet i eksempel 22.
Resultaterne er vist grafisk i fig. 2 på tegningen, hvor kurverne 15 blev fundet ved at aftegne den procentvise cellevækst som funktion af sarcolysinkoncentrationen i ^g/ml. Resultaterne indicerer, at alle tre analoge var cytotoxiske over for L1210-museleukæmiceller in vitro i en vis udstrækning, men at analog c) havde væsentligt bedre inhibitorisk virkning end analog a) og b), som stimulerede vækst ved 20 en lav koncentration.
EKSEMPEL 24 (Virkning på aktiviteten af L1210-museleukæmiceller in vivo)
Disse eksperimenter blev udført med to HPMA-analoge, som ikke indeholdt determinanter; begge forbindelser var af typen med åben kæde.
25 Begge analoge indeholdt daunomycin som den bioaktive del og peptidafstandsled til medikamentet i overensstemmelse med b). I detaljer var analogene som følger: DK 164485 8 43 a) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin-substituenter og b) HPMA med -Gly-Gly-daunomycin-substituenter.
Museleukæmicellerne L1210 blev inokuleret (10^ levedygtige celler) intraperitonealt i DBA2-mus på dag 0. HPMA-Copolymererne blev admini-5 streret på dag 1, 2 og 3. Overlevelse af alle dyr blev fulgt. Kontroldyr (ubehandlede) døde altid mellem dag 15 og dag 20.
De opnåede resultater er vist i tabel 1.
TABEL 1
Behandling Dosis (x 3) Gennemsnitlig Overlevelse 10 mg/kg overlevelsestid på langt sigt (dage) (>50 dage)
Analog a) 5 32 3/5
Analog a) 2 31 2/5 15 Analog b) 5 18 1/5
Analog b) 8 (x 1) 16 1/5 + 5 (x 1)
Ingen - 17 2/10 20 Det vil ses af tabel 1, at dyrenes overlevelse ikke blev forlænget ved administration af analog b). Derimod viste dyr, som var behandlet med analog a) tydeligt forlænget overlevelse, idet en signifikant del af dyrene overlevede på langt sigt.
EKSEMPEL 25 25 (Virkning på hastigheden af in vicro-afgivelse af medikament i nærværelse af enzym)
To HPMA-analoge blev fremstillet, som var af enkeltkædetypen og ikke indeholdt determinanter. Begge analoge indeholdt daunomycin som den bioaktive del med forskellige peptidafstandsled til medikamentet; begge medikamentafstandsled var i overensstemmelse med opfindelsen.
I detaljer var analogene som følger; 44
DK 164485 B
a) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin- og tyrosinamid-substituenter 5 og b) HPMA med -Gly-Phe-Phe-Leu-daunomycin- og tyrosinamid-substituenter.
Hver analog (25 mg i 1,5 ml) blev inkuberet med 1 ml enzymopløsning ved 37° C. Enzymopløsningen var et renset lysosomalt enzym, cathepsin 10 L (3,8 x 10'^ mol/1) i phosphatpuffer (pH-værdi 6,0) indeholdende 5 mM glutathion og 1 mM EDTA.
Med forskellige tidsintervaller blev medikamentafgivelsen målt ved at ekstrahere frit medikament og spektrofotometrisk måle absorberingen ved den relevante bølgelængde. Prøver af inkubationsblandingen (0,15 15 ml) blev taget og sat til 1,5 ml puffer (pH-værdi 9,8) og 1,5 ml ethylacetat. Efter 5 minutters kraftig omrystning blev en prøve (1 ml) af ethylacetatfasen taget og ekstinktionen målt ved 485 nm.
Resultaterne er vist grafisk i fig. 3 på tegningen, hvor kurverne blev fundet ved at aftegne den procentdel af det i analogen oprin-20 deligt tilstedeværende medikament, som er blevet frigivet, som funk-tion af tiden i timer. Resultaterne indicerer, at afgivelseshastigheden for daunomycin er væsentligt større, når peptidafstandsleddet til medikamentet er -Gly-Phe-Leu-Gly-, end når det er -Gly-Phe-Phe-Leu-.
25 EKSEMPEL 26-28
Virkningen af forskellige medikamenter med samme peptidafstandsled 45 EKSEMPEL 26
DK 164485 B
(Virkningen på aktiviteten af L1210-museleukæmiceller in vicro)
Disse eksperimenter blev udført med fire HPMA-analoge, som ikke indeholdt determinanter; alle forbindelser var af typen med en enkelt 5 kæde, og hver indeholdt et forskelligt medikament. Medikamentafstandsleddene i alle fire forbindelser var i overensstemmelse med opfindelsen; to havde Gly-Phe-Leu-Gly-afstandsled, og to havde- Gly-Leu-Phe-afstandsled. I detaljer var analogene som følger: a) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin- og tyrosinamid-substituen-10 ter, b) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-puromysin- og tyrosinamid-substituenter, c) HPMA med -Gly-Leu-Phe-sarcolycin-substituenter og d) HPMA med -Gly-Leu-Phe-tritylcystein-substituenter.
Fremgangsmåden ved eksperimentet var den samme som beskrevet i ek-15 sempel 22.
Resultaterne er vist grafisk i fig. 4 på tegningen, hvor kurverne blev fundet ved at aftegne procentdelen af overlevende celler efter 72 timer som funktion af koncentrationen af polymermedikament i mg/ml. Resultaterne indicerer, at alle fire polymermedikamenter var 20 cytotoxiske over for L1210-leukæmiceller in vitro i en vis grad, men at daunomycin med den anvendte peptidbinding var betydeligt mere virksomt end puromycin, og at tritylcystein var lidt mere virksomt end sarcolysin.
EKSEMPEL 27 25 (Virkning på aktiviteten af Ll210-museleukæmiceller in vitro)
Der blev fremstillet to HPMA-analoge, som ikke indeholdt determinanter. Analogene indeholdt forskellige medikamenter, men medikamentafstandsleddet var det samme i begge tilfælde og var i overensstemmelse med opfindelsen. I detaljer var analogene som følger:
DK 164485 B
46 a) HPMA med -Gly-Gly-deacetylcolchicin-substituenter og b) HPMA med -Gly-Gly-colcemid-substituenter.
Fremgangsmåden ved eksperimentet var den samme som beskrevet i eksempel 22.
5 Resultaterne er vist grafisk i fig. 5 på tegningen, hvor kurverne blev fundet ved at aftegne den procentvise cellevækst som funktion af koncentrationen af polymermedikament i mg/ml. Resultaterne indicerer, at begge analoge var cytotoxiske over for L1210-museleukæmiceller in vitro, men at analog b) havde en større inhibitorisk virkning end 10 analog a).
EKSEMPEL 28 (Virkning på hastigheden af in vi tro-afgivelse af medikament i nærværelse af enzymer)
Der blev fremstillet to HPMA-analoge, som var af enkeltkædetypen og 15 ikke indeholdt determinanter. Analogene indeholdt forskellige medikamenter, men medikamentafstandsleddet var det samme i begge tilfælde og var i overensstemmelse med opfindelsen. I detaljer var analogene som følger: a) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-daunomycin- og tyrosinamid-substituenter 20 og b) HPMA med -Gly-Phe-Leu-Gly-puromycin- og tyrosinamid-substituenter.
Begge forbindelser blev undersøgt under anvendelse af to forskellige enzymopløsninger, nemlig (1) en blanding af isolerede lysosomale enzymer fra rottelever fremstillet i overensstemmelse med metoden be-25 skrevet af Trouet et al., 1974, i puffer (pH-værdi 5,5) indeholdende 1 mM EDTA, 5 mM reduceret glutathion og 0,2% Triton® X-100 og (2) et renset lysosomalt enzym, cathepsin L (3,8 x 10"^ mol/1), i phosphat-puffer (pH-værdi 6,0) indeholdende 5 mM glutathion og 1 mM EDTA.
DK 164485 B
47
Hver analog (25 mg i 1,5 ml) blev inkuberet med 1 ml af enzymopløsningen. Med forskellige tidsintervaller blev medikamentafgivelsen målt ved at ekstrahere frit medikament og spektrofotometrisk måle absorbansen ved den relevante bølgelængde. Prøver af inkubations -5 blandingen (0,15 ml) blev taget og sat til 1,5 ml puffer (pH-værdi 1,8) og 1,5 ml ethylacetat. Efter 5 minutters kraftig omrystning blev en prøve (1 ml) af ethylacetatfasen udtaget og ekstinktionen målt ved 485 nm i tilfælde af daunomycin, eller 272 nm i tilfælde af puromy-cin.
10 Resultaterne er grafisk vist i fig. 6 på tegningen, hvor kurverne blev fundet ved at aftegne den procentdel af det i analogen oprindeligt tilstedeværende medikament, som var blevet afgivet, som funktion af tiden i timer. De resultater, der blev fundet med blanding (1) af lysosomale enzymer er vist ved de åbne cirkler, og de resulta-15 ter, der blev fundet med det rensede enzym (2), cathepsin L, er vist ved de udfyldte cirkler.
Disse resultater viser: a) forskelle i afgivelseshastigheden for puromycin og daunomycin med samme peptidafstandsled, og 20 b) forskelle i evnen hos et renset lysosomalt enzym og en blanding af lysosomale enzymer, der er afledt fra forskellige kilder, til at nedbryde det samme peptidafstandsled med det samme terminale medikament.
[A. Trouet, 1974, Methods in Enzymology, (S. Fleisher og L. Packer,
Eds.), Vol. XXXI, s. 323-329, Academic Press, New York.
25 EDTA = ethylendiamintetraeddikesyre
Triton® X-100 = kvaternært ammonium-overfladeaktivt middel.] EKSEMPEL 29-34
Virkningen af tilstedeværelsen af determinant EKSEMPEL 29 48
DK 164485 B
(Virkningen på polymeroptagelseshastigheden for melanomaceller in vitro)
En HPMA-analog indeholdende melanocyt-stimulerende hormon (MSH) som 5 determinant blev fremstillet ud fra a-melanocyt-stimulerende hormon; peptidafstandsleddet til determinanten var -Gly-Gly-, et determinantafstandsled i overensstemmelse med opfindelsen. Analogen var af den tværbundne type (via MSH) og indeholdt ikke nogen bioaktiv del. Et 125 præparat af analogen blev I-radioaktivt mærket, og dets evne til 10 at binde sig til klon M3 591-musemelanomaceller blev sammenlignet med evnen hos en HPMA-kontrolpolymer indeholdende tyrosinamidsubstituen-ter og ingen determinantsubstituenter. Tre rækker kulturer blev podet med 2 x 10^ celler og inkuberet i 3 dage før eksperimentet. 100 μΐ af hver polymer blev sat til kulturerne og inkuberet i op til 60 minut-15 ter. Med mellemrum blev kulturerne standset, og der blev taget prøve af mediet; det samlede antal celler og celleassocieret radioaktivitet blev bestemt.
Resultaterne er vist grafisk i fig. 7 på tegningen, hvor kurverne blev fundet ved at aftegne celleproteinoptagelsen i μΐ medium/mg som 20 funktion af tiden i minutter. Resultaterne indicerer, at den MSH-holdige analog viste forøget binding til melanomacellerne sammenlignet med kontrolpolymeren.
EKSEMPEL 30 (Virkning på polymeroptagelseshastigheden hos humane fibroblaster in 25 vitro)
En HPMA-analog indeholdende apotransferrin (75 μΐ, 580 pg/ml) blev radioaktivt mærket ved iodgenmetoden; peptidafstandsleddet til determinanten var -Gly-Gly-, et determinantafstandsled i overensstemmelse med opfindelsen. Forbindelsen indeholdt ikke nogen bioaktiv del. Ved 30 chromatografi blev det indiceret, at analogen havde en molekylvægt på ca. 260.000 svarende til en polymerformel (apotransferrin)3.
DK 164485 B
49 På den fjerde dag efter subkultivering (samroenflydende celler) blev fibroblastceller (menneskehud) vasket og inkuberet i forudbestemte tidsrum i en opløsning af Hank's Balanced Salt-opløsning (3 ml) indeholdende den radioaktivt mærkede analog (200 /ti, 11 /ig/ml).
5 Prøver (1 ml) af mediet blev talt; celletællingerne blev bestemt i to adskilte grupper for at skelne mellem binding og internalisering.
Gruppe 1 blev behandlet med trypsin for at fjerne ligandbindingen til transferrinreceptoren; gruppe 2 fik ikke denne behandling. Begge grupper blev opløst i vandigt NaOH og kvantificeret med hensyn til 10 radioaktivitet og protein. Optagelseshastigheden blev sammenlignet med optagelseshastigheden hos en HPMA-kontrolpolymer indeholdende -Gly-Phe-Phe-Leu-aminopropanolsubstituenter og ingen determinantsubs-tituenter. i
Resultaterne er vist grafisk i fig. 8 på tegningen, hvor kurverne 15 blev fundet ved at aftegne optagelsen i μΐ medium/mg celleprotein som funktion af tiden i timer. Resultaterne angiver, at den apotransfer-rin-holdige polymer viste forøget internalisering og binding/interna-lisering med hensyn til humane fibroblaster sammenlignet med kontrolpolymeren.
20 EKSEMPEL 31 (Virkning på polymeroptagelsen hos humane hepatomaceller in vitro)
Der blev fremstillet en serie HPMA-analoge indeholdende galactose som determinanten, hvor galactosen var direkte bundet til polymerskelettet via en esterbinding. Analogene indeholdt stigende mængder galac- 25 tose varierende fra 0 til 99 mol%; der var ikke nogen bioaktive dele 125 til stede. Analogene blev mærket med I ved chloramin-T-metoden og testet for evne til at binde sig til humane hepatomaceller (Hep G2) in vitro. Cellerne blev dyrket som monolagskulturer i EMEM suppleret med 10% bovint føtalt serum. Tre rækker kulturer blev podet med 2 x 30 10^ celler og derefter inkuberet i 3 dage før eksperimentet. Cellerne blev inkuberet med hver analog (100 /il) i 15 sekunder, hvorefter der blev taget en prøve af mediet, og cellemonolaget blev grundigt vas
DK 164485 B
50 ket. 2,5 ml 1M NaOH blev tilsat for at opløse cellerne, og der blev taget prøver for at bestemme indholdet af radioaktivt mærkede celler og det samlede proteinindhold.
Resultaterne er vist grafisk i fig. 9 på tegningen, hvor kurverne
O
5 blev fundet ved at aftegne optagelsen i procent tællinger x 10-'/mg celleprotein som funktion af molprocent galactose i hver analog. Resultaterne indicerer, at optagelsen af HPMA-galactosecopolymerer hos humane hepatomaceller er proportional med molprocenten af tilstedeværende galactose.
10 EKSEMPEL 32 (Virkning på aktiviteten af L1210-museleukæmiceller in vitro)
Disse eksperimenter blev udført med to HPMA-copolymerer, hvoraf den ene var i overensstemmelse med opfindelsen. Begge forbindelser indeholdt daunomycin som den bioaktive del og -Gly-Phe-Leu-Gly- som 15 medikamentafstandsleddet. Forbindelsen ifølge opfindelsen indeholdt yderligere fucosylamin som determinant og -Gly-Phe-Leu-Gly- som determinantafstandsleddet.
Forsøgsproceduren var den samme som beskrevet i eksempel 22.
Resultaterne er vist grafisk i fig. 10 på tegningen, hvor kurverne 20 blev fundet ved at aftegne den procentvise cellevækst som funktion af daunomycinkoncentrationen i /ig/ml. Resultaterne angiver, at det polymerholdige medikaments cytotoxicitet over for L1210-museleukæ-miceller in vitro forøges signifikant ved tilstedeværelsen af en fucosylamindeterminant i molekylet.
EKSEMPEL 33 51
DK 164485 B
(Virkning på en polymers in vivo-målfinding)
Der blev fremstillet to HPMA-copolymerer, som havde følgende struktur og sammensætning: 5 V-TyrNH,j (1.7 mol *) WTyrNHg (1.8 mol %) C-GlyPheLeuGly- v-GlyPheLeuGly-daunomycin ( daunomycin ( (2.2 mol %) ) (3.5 mol %) ( ' V-GlyPheLeuGly-galactosamin ^ (1.9 mol N) polymer 1 polymer 2
Polymer 2 er ifølge opfindelsen, hvorimod polymer 1 ikke er.
125
Begge HPMA-polymerer blev radioktivt mærket med I under anvendelse 10 af chloramin-T-metoden til iodering. Denne radioaktive mærkning er stabil i det biologiske miljø og gør det derfor muligt at følge polymerens skæbne in vivo.
Ca. 100 /ig polymerer i 0,1 ml puffer blev injiceret i femoralvenen på en Wistar-hanrotte (250-350 g), der blev holdt anæstetiseret, og 15 efter 30 minutter blev dyret aflivet, og fordelingen i legemet af radioaktivitet blev målt.
De opnåede resultater er vist i tabel 2.
TABEL 2
Fordeling i legemet efter Polymer 1 Polymer 2 20 30 minutter Z genvunden radioaktivitet
Milt 0,51 0,19
Nyrer 4,39 4,83
Lunger 1,34 1,37 25 Lever 4,97 23,20
Blod 88,77 70,38
DK 164485 B
52
Det ses af disse resultater, at indbefatteisen af selv en lille mængde galactosamin (1,9 mol%) effektivt omdirigerer en væsentlig mængde HPMA-copolymer til rotteleveren inden for 30 minutter efter intravenøs administration.
5 EKSEMPEL 34 (Virkning på aktiviteten af L1210-museleukæmiceller in vivo)
Disse eksperimenter blev udført med to HPMA.-analoge, hvoraf den ene var i overensstemmelse med opfindelsen. Begge analoge indeholdt daunomycin som den bioaktive del, -Gly-Phe-Leu-Gly- som medikamen-10 tafstandsleddet og tyrosinamidrester. Polymeren ifølge opfindelsen indeholdt også fucose som determinant; afstandsleddet til determinanten var -Gly-Phe-Leu-Gly-. I detaljer bestod polymererne af følgende: ^-GlyPheLeuGly-daunomycin <-TyrNH2
Polymer 1 ^-GlyPheLeuG ly-daunomycin v-GlyPheLeuGly-fucose y TyrN'Hg , Polymer 2 15 Museleukæmicellerne L1210 blev inokuleret (105 levedygtige celler) intraperitonealt i DBA2*mus på dag 0. Dyrene blev derefter delt i to grupper, som blev behandlet hver for sig. Dyrene i gruppe 1 blev behandlet med polymer 1, og dyrene i gruppe 2 blev behandlet med polymer 2; i begge grupper svarede den indgivne dosis til 7,5 mg 20 daunomycin/kg. Dyrenes overlevelse i begge grupper blev fulgt.
Resultaterne viste, at overlevelsesraten for dyrene i gruppe 2 (copolymer ifølge opfindelsen) var mindst dobbelt så stor som overlevelsesraten for dyrene i gruppe 1 (ingen determinant i copolymeren); i det ene sæt eksperimenter var overlevelsesraten på langt sigt såle-25 des 57% i gruppe 2 sammenlignet med en overlevelsesrate på langt sigt på kun 25% i gruppe 1.
DK 164485B
EKSEMPEL 35 53
Virkning af forskellige peptidafstandsled til samme determinant/medi-kament på polymerens målfinding in vivo)
Disse eksperimenter blev udført med to HPMA-copolymerer, hvoraf begge 5 var ifølge opfindelsen. Copolymererne indeholdt begge daunomycin som den bioaktive del og et anti-B-antistof som determinant. Peptidafstandsleddet til medikamentet og determinanten var det samme for hver copolymer, men forskelligt i de to forbindelser. I detaljer bestod copolymererne af følgende: 10 < VGlyPheLeuGly-daunomycm 1-GlyPheLeuGly- anti-©--antistof \ Polymer 1 vGlyGly-daunomycin iGlyGly-anti-e--antistof ' * Polymer 2
Copolymerernes aktivitet blev testet mod T-lymfocyter in vivo ved at måle undertrykkelsen af responset mod røde fåreblodlegemer hos mus.
De opnåede resultater er vist i tabel 3.
15 TABEL 3
Polymer 1 Polymer 2
Samlet dosis anti-0-antistof (mg) pr. mus 3,0 3,0 20 Samlet dosis daunomycin (mg) pr. mus 0,4 0,6
Undertrykkelse af immunrespons, % 98 0
Det ses af disse resultater, at polymer 1 indeholdende -Gly-Phe-Leu-Gly-afstandsled til medikamentet og determinanten er betydeligt mere 25 effektiv til at dræbe T-lymfocyter end den tilsvarende polymer 2 indeholdende -Gly-Gly-afs tandsled.

Claims (16)

1. Polymermedikament der omfatter a) et bioaktivt middel og b) en inert syntetisk polymerbærer omfattende gentagne enheder afledt af N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid (HPMA), idet polymerbæreren er 5 kombineret med det bioaktive middel via peptidafstandsled og via andre afstandsled med en målfindingsdel, kendetegnet ved, at det indeholder a) 5,0-99,7 mol% enheder afledt af N-(2-hydroxypropyl)methacrylamid med formlen: 10 ch2 oh I i CH3-C-CO-NH-CH2-CH-CH3 b) 0,2-20,0 mol% enheder afledt af et N-methacryloyleret peptid, idet peptidgrupperne er bundet til et bioaktivt molekyle og også er udsat for intracellulær lysosomal hydrolyse, og disse peptidgrupper er 15 valgt blandt Gly-Gly, Gly-Phe-Gly, Gly-Phe-Phe, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe- Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe og Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe idet disse enheder har formlen: ch2 CH3-C-C0-[NH-R-C0]-[B] 20 hvor -[NH-R-CO]- er et afstandsled afledt af et af de beskrevne peptider og -[B] er det bioaktive middel, og c) 0,1-94,8 mol% enheder afledt af N-methacrylamid, N-methacrylsyre, N-methacryloyleret aminosyre eller N-methacryloyleret peptid, hvortil DK 164485 B 55 der er bundet en determinant, som er i stand til at samvirke med specifikke receptorer på celleoverflader, idet aminosyren eller peptidet er Leu, Phe, Gly-Gly, Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-5 Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe eller Gly-Gly-Phe-Leu-Gly-Phe, idet disse enheder har formlen: ch2 CH3-C-CO-NH-[D] 10 når de er afledt af N-methacrylamid, ch2 CH3-C-CO-[D] når de er afledt af N-methacrylsyre, og ch2 CH3-C-C0-[NH-R-C0]-[D] når de er afledt af N-methacryloyleret aminosyre eller -peptid, hvor [D] er determinanten, og -[NH-R-CO]- er et afstandsled afledt af en af de beskrevne aminosyrer eller peptider.
2. Polymermedikament ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter d) op til 5 mol% enheder afledt af et N-methacryloyleret peptid, idet peptidgrupperne er bundet til en bindingsgruppe, som på lignende måde DK 164485 B 56 er knyttet til en lignende peptidgruppe, som er knyttet til en anden polymerkæde, idet peptidet er Gly-Leu-Gly, Gly-Val-Ala, Gly-Phe-Ala, Gly-Leu-Phe, Gly-Leu-Ala, Ala-Val-Ala, Gly-Phe-Leu-Gly, Gly-Phe-Phe-Leu, Gly-Leu-Leu-Gly, Gly-Phe-Tyr-Ala, Gly-Phe-Gly-Phe, Ala-Gly-Val-5 Phe, Gly-Phe-Phe-Gly, Gly-Phe-Leu-Gly-Phe eller Gly-Gly-Phé-Leu-Gly-Phe, idet disse enheder har formlen: i i CH2 CH2 i i CH3-C-CO-[NH-R-CO]-[L]-[CO-R-NH]-CO-C-CH3 i i hvor - [NHRCO] - er et afstandsled afledt af en af de beskrevne pepti-10 der og -[L]- er bindingsgruppen.
3. Polymermedikament ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter (e) op til 2 mol% enheder afledt af N-methacryloyleret tyrosinamid som bioassay-mærkning, idet disse enheder har formlen: nh2 I I ch2 co I I ch3-c-co-nh-ch-ch2-c6ha-oh
4. Polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at determinanten er et monosaccharid, disaccharid eller oligosaccharid bundet ved en amidbinding, et antistof eller et protein.
5. Polymermedikament ifølge krav 4, 20 kendetegnet ved, at sacchariddeterminanten er galactose, galactosamin, glucosamin, mannosamin eller fucosylamin. DK 164485 B 57
6. Polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, kendetegnet ved, at determinanten er IgG eller anti-Θ-antistof .
7. Polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-6, 5 kendetegnet ved, at den bioaktive del er et anticancer-middel, et antimikrobielt middel, et antiparasitmiddel, et antiin-flammatorisk middel, et cardiovasculært medikament eller et medikament, der påvirker nervesystemet,
8. Polymermedikament ifølge et hvilket som helst kravene 1-7, 10 kendetegnet ved, at den bioaktive del er daunomycin, puromycin, adriamycin, melphalanisopropylester (sarcolysin), bleomycin, desferioxamin, bestatin eller tritylcystein.
9. Polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-8, kendetegnet ved, at bindingsgruppen til d) er af typen- 15 (aminosyre)-NH(CH2)XNH-(aminosyre) -, hvor x betegner et helt tal fra i-12, og at den er knyttet til nabostillede peptidgrupper ved amidbindinger.
10. Polymermedikament ifølge krav 9, kendetegnet ved, at x betegner 6, og aminosyren er Phe,
20 Tyr, Ala, Gly eller Leu, eller x betegner 2, og aminosyren er Ala.
11. Polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-10, kendetegnet ved, at den bioaktive del er daunomycin, determinanten er galactose, galactosamin eller fucosylamin og tværbindingsafstandsleddet, når forbindelsen er tværbundet, er Gly-Phe-
25 Leu-Gly, og at bindingsgruppen er -(Phe)NH(CH2)gNH(Phe) -.
12. Fremgangsmåde til syntese af et polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, kendetegnet ved, at den omfatter copolymerisation af HPMA med enten en N-methacryloyleret aminosyre eller et N-methacryloyleret 30 peptid eller p-nitrophenylesteren deraf og omsætning af den resulterende copolymer med et reaktivt bioaktivt molekyle, en reaktiv determinant og eventuelt et diamino-tværbindingsmiddel. DK 164485 B 58
13. Fremgangsmåde til syntese af et polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11, kendetegnet ved, at den omfatter copolymerisation af HPMA, en N-methacryloyleret determinant eller N-methacryloyleret aminosyre -5 eller peptidyldeterminant og enten et N-methacryloyleret peptid eller p-nitrophenylesteren deraf og omsætning af den resulterende copolymer med et reaktivt bioaktivt molekyle og eventuelt et diamino-tværbindingsmiddel .
14. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, 10 kendetegnet ved, at N-methacryloyleret tyrosinamid også indgår i copolymerisationstrinnet som en bioassay-mærkning.
15. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det omfatter mindst ét polymermedikament ifølge et hvilket som helst af kravene 1-11 og en inert, 15 fysiologisk acceptabel bærer.
16. Farmaceutisk præparat ifølge krav 15, kendetegnet ved, at bæreren er et sterilt vandigt medium, og at præparatet er formuleret til injektion.
DK003386A 1985-01-04 1986-01-03 Polymerholdige medikamenter, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende mindst et saadant medikament DK164485C (da)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB8500209 1985-01-04
GB858500209A GB8500209D0 (en) 1985-01-04 1985-01-04 Synthetic polymeric drugs

Publications (4)

Publication Number Publication Date
DK3386D0 DK3386D0 (da) 1986-01-03
DK3386A DK3386A (da) 1986-07-05
DK164485B true DK164485B (da) 1992-07-06
DK164485C DK164485C (da) 1992-11-23

Family

ID=10572420

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DK003386A DK164485C (da) 1985-01-04 1986-01-03 Polymerholdige medikamenter, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende mindst et saadant medikament

Country Status (9)

Country Link
US (1) US5037883A (da)
EP (1) EP0187547B1 (da)
JP (2) JPH075474B2 (da)
AT (1) ATE60991T1 (da)
AU (1) AU589587B2 (da)
CA (1) CA1305053C (da)
DE (1) DE3581921D1 (da)
DK (1) DK164485C (da)
GB (1) GB8500209D0 (da)

Families Citing this family (81)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4738434A (en) 1986-04-07 1988-04-19 Marjoram Robert H Vibration and/or shock attenuating fluid mount or the like
JP2896580B2 (ja) * 1989-08-25 1999-05-31 チッソ株式会社 アミロース―リゾチームハイブリッドと活性化糖およびその製造法
DE69120141T2 (de) * 1990-03-28 1996-11-28 Shuji Kojima Polymerkombiniertes Arzneimittel zur Magenbehandlung und Verfahren zu dessen Herstellung
CA2046830C (en) 1990-07-19 1999-12-14 Patrick P. Deluca Drug delivery system involving inter-action between protein or polypeptide and hydrophobic biodegradable polymer
CZ279785B6 (cs) * 1991-02-01 1995-06-14 Galena, A.S. Směrované polymerní konjugáty cyklosporinu
US5332575A (en) * 1991-10-03 1994-07-26 Parfums Christian Dior Method of targeting melanocytes with a compound containing a fucose residue
US5258453A (en) * 1992-01-21 1993-11-02 University Of Utah Drug delivery system for the simultaneous delivery of drugs activatable by enzymes and light
GB9213077D0 (en) * 1992-06-19 1992-08-05 Erba Carlo Spa Polymerbound taxol derivatives
GB2270920B (en) * 1992-09-25 1997-04-02 Univ Keele Alginate-bioactive agent conjugates
US7056935B2 (en) 1995-06-07 2006-06-06 Gpi Nil Holdings, Inc. Rotamase enzyme activity inhibitors
GB9600471D0 (en) * 1996-01-10 1996-03-13 Univ London Pharmacy Drug delivery system
GB9606975D0 (en) * 1996-04-02 1996-06-05 Univ Birmingham Anti-tumor agent
EP0895784B1 (en) 1996-04-15 2005-11-23 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Drug complexes comprising taxane compounds or steroids
AU7124598A (en) * 1997-04-18 1998-11-13 Access Pharmaceuticals, Inc. Polymer-platinum compounds
US5965118A (en) * 1997-04-18 1999-10-12 Access Pharmaceuticals, Inc. Polymer-platinum compounds
US6251866B1 (en) 1997-08-05 2001-06-26 Watson Laboratories, Inc. Conjugates targeted to the interleukin-2 receptor
US6180084B1 (en) * 1998-08-25 2001-01-30 The Burnham Institute NGR receptor and methods of identifying tumor homing molecules that home to angiogenic vasculature using same
US6066673A (en) * 1998-03-12 2000-05-23 The Procter & Gamble Company Enzyme inhibitors
US7018654B2 (en) 1999-03-05 2006-03-28 New River Pharmaceuticals Inc. Pharmaceutical composition containing an active agent in an amino acid copolymer structure
US6716452B1 (en) 2000-08-22 2004-04-06 New River Pharmaceuticals Inc. Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
US7060708B2 (en) 1999-03-10 2006-06-13 New River Pharmaceuticals Inc. Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
AU1820400A (en) * 1999-11-17 2001-05-30 School Of Pharmacy, University Of London, The Conjugates of hpma copolymer and ellipticin
CA2400953A1 (en) 2000-02-24 2001-08-30 Kopran Research Laboratories Limited Orally administrable acid stable anti-ulcer benzimidazole derivatives
AU2001288829A1 (en) 2000-09-06 2002-03-22 Ap Pharma, Inc. Degradable polyacetal polymers
US8394813B2 (en) 2000-11-14 2013-03-12 Shire Llc Active agent delivery systems and methods for protecting and administering active agents
EP1401875A4 (en) * 2001-05-04 2005-01-26 Univ Utah Res Found HYALURONIC ACID-CONTAINING BIOKON JUGATES: TARGETED DELIVERY OF ANTIBODIES TO CANCER CELLS
US20060014697A1 (en) 2001-08-22 2006-01-19 Travis Mickle Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
US7375082B2 (en) 2002-02-22 2008-05-20 Shire Llc Abuse-resistant hydrocodone compounds
US7169752B2 (en) 2003-09-30 2007-01-30 New River Pharmaceuticals Inc. Compounds and compositions for prevention of overdose of oxycodone
US7375083B2 (en) 2003-09-30 2008-05-20 Shire Llc Pharmaceutical compositions for prevention of overdose or abuse
WO2003017938A2 (en) * 2001-08-22 2003-03-06 Watson Pharmaceuticals, Inc. Conjugates targeted to target receptors
US7338939B2 (en) 2003-09-30 2008-03-04 New River Pharmaceuticals Inc. Abuse-resistant hydrocodone compounds
CZ293787B6 (cs) * 2001-12-20 2004-07-14 Zentiva, A.S. pH senzitivní polymerní konjugáty antracyklinového kancerostatika pro cílenou terapii
US7105486B2 (en) 2002-02-22 2006-09-12 New River Pharmaceuticals Inc. Abuse-resistant amphetamine compounds
US7659253B2 (en) 2002-02-22 2010-02-09 Shire Llc Abuse-resistant amphetamine prodrugs
IL163667A0 (en) 2002-02-22 2005-12-18 New River Pharmaceuticals Inc Novel sustained release pharmaceutical compounds to preventabuse of controlled substances
US7700561B2 (en) 2002-02-22 2010-04-20 Shire Llc Abuse-resistant amphetamine prodrugs
AU2003226349B2 (en) * 2002-04-11 2008-01-31 Children's Medical Center Corporation Methods for inhibiting vascular hyperpermeability
CA2480666C (en) * 2002-04-11 2012-03-06 Children's Medical Center Corporation Tnp-470 polymer conjugates and use thereof
CA2483696A1 (en) * 2002-05-06 2003-11-20 University Of Utah Research Foundation Preblocking with non-ha gags increases effectiveness of ha conjugated anticancer agents
US20040116348A1 (en) * 2002-09-23 2004-06-17 Ying Chau Polymer-linker-drug conjugates for targeted drug delivery
US8133881B2 (en) 2003-01-13 2012-03-13 Shire Llc Carbohydrate conjugates to prevent abuse of controlled substances
US20060099265A1 (en) * 2003-03-20 2006-05-11 Kazuhisa Shimizu Micellar preparation containing sparingly water-soluble anticancer agent and novel block copolymer
DE602004025799D1 (de) 2003-04-15 2010-04-15 Glaxosmithkline Llc Humane il-18 substitutionsmutanten und deren konjugate
KR101159477B1 (ko) 2003-05-29 2012-07-02 샤이어 엘엘씨 남용 방지성 암페타민 화합물
BR122018071808B8 (pt) * 2003-11-06 2020-06-30 Seattle Genetics Inc conjugado
US10092662B2 (en) * 2004-03-31 2018-10-09 University Of Utah Research Foundation Macromolecular delivery systems for non-invasive imaging, evaluation and treatment of arthritis and other inflammatory diseases
EP1792927B1 (en) 2004-09-22 2013-03-06 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Novel block copolymer, micelle preparation, and anticancer agent containing the same as active ingredient
CN101106974B (zh) 2005-01-14 2012-08-08 韩国科学技术研究院 形成自聚集体的胆甾烷酸-脱乙酰壳多糖复合物及其制备方法
US20080248030A1 (en) * 2005-02-02 2008-10-09 Children's Medical Center Corporation Method of Treating Angiogenic Diseases
WO2007111211A1 (ja) 2006-03-28 2007-10-04 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha タキサン類の高分子結合体
JP5181347B2 (ja) 2006-05-18 2013-04-10 日本化薬株式会社 ポドフィロトキシン類の高分子結合体
WO2007143209A2 (en) * 2006-06-02 2007-12-13 University Of Virginia Patent Foundation Luminescent diketonate polymers
JP5548364B2 (ja) * 2006-10-03 2014-07-16 日本化薬株式会社 レゾルシノール誘導体の高分子結合体
US8334364B2 (en) 2006-11-06 2012-12-18 Nipon Kayaku Kabushiki Kaisha High-molecular weight derivative of nucleic acid antimetabolite
WO2008056654A1 (en) 2006-11-08 2008-05-15 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymeric derivative of nucleic acid metabolic antagonist
CN1973902B (zh) * 2006-12-12 2010-11-10 东北师范大学 以人参多糖为载体的抗肿瘤药物阿霉素复合物及制备方法
USRE46190E1 (en) 2007-09-28 2016-11-01 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha High-molecular weight conjugate of steroids
KR101589582B1 (ko) * 2008-03-18 2016-01-28 니폰 가야꾸 가부시끼가이샤 생리활성물질의 고분자량 결합체
US9149540B2 (en) 2008-05-08 2015-10-06 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Polymer conjugate of folic acid or folic acid derivative
BRPI0920655A2 (pt) * 2008-10-07 2019-07-09 Rexahn Pharmaceuticals Inc conjugados e hpma-docetaxel ou gencitabina e usos dos mesmos
JP5544357B2 (ja) 2009-05-15 2014-07-09 日本化薬株式会社 水酸基を有する生理活性物質の高分子結合体
EP2488207A4 (en) 2009-10-13 2015-06-10 Rexahn Pharmaceuticals Inc POLYMERIC SYSTEMS FOR ADMINISTERING ANTICANCER AGENTS
CZ302830B6 (cs) * 2009-12-15 2011-11-30 Ústav makromolekulární chemie AV CR, v.v.i. Vysokomolekulární polymerní nosice léciv odvozené od dendrimeru a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
WO2011112482A2 (en) 2010-03-08 2011-09-15 University Of Utah Research Foundation Polymeric drug delivery conjugates and methods of making and using thereof
CN107141410B (zh) 2010-05-25 2022-12-09 辛德弗雷克斯公司 聚合物缀合的MetAP2抑制剂及其应用的治疗方法
US9895449B2 (en) 2010-05-25 2018-02-20 Syndevrx, Inc. Polymer-conjugated MetAP2 inhibitors, and therapeutic methods of use thereof
WO2012067138A1 (ja) 2010-11-17 2012-05-24 日本化薬株式会社 新規なシチジン系代謝拮抗剤の高分子誘導体
DK2683393T3 (da) 2011-02-11 2018-07-23 Univ Michigan Regents Tripeptidsammensætninger og deres anvendelse til behandling af diabetes
US9346923B2 (en) 2011-09-11 2016-05-24 Nippon Kayaku Kabushiki Kaisha Method for manufacturing block copolymer
WO2014164913A1 (en) 2013-03-12 2014-10-09 University Of Utah Research Foundation Compositions and methods for inducing apoptosis
AU2014250983B2 (en) * 2013-04-10 2019-04-11 Syndevrx, Inc. MetAP2 inhibitors and methods of treating obesity
CN103965398B (zh) * 2014-04-11 2016-04-13 西北师范大学 D-半乳糖/苯甲醛氮芥/n-(2-羟丙基)甲基丙烯酰胺共聚物及其制备和应用
WO2017100553A1 (en) 2015-12-10 2017-06-15 Syndevrx, Inc. Fumagillol derivatives and polymorphs thereof
CN108697807B (zh) 2016-01-11 2021-11-26 辛德弗雷克斯公司 代谢功能障碍引起的肿瘤的治疗
EP3555280A4 (en) 2016-12-19 2020-09-09 The Regents of The University of California DUAL ENZYME-RESPONDING PEPTIDES
US11541125B2 (en) 2016-12-19 2023-01-03 The Regents Of The University Of California Noncrushable pill formulations
CA3060243A1 (en) 2017-04-17 2018-10-25 The University Of Chicago Polymer materials for delivery of short-chain fatty acids to the intestine for applications in human health and treatment of disease
US10894019B2 (en) 2017-08-15 2021-01-19 University Of South Carolina Drug delivery system and method for targeting cancer stem cells
AU2019366819A1 (en) 2018-10-26 2021-06-03 Syndevrx Inc. Biomarkers of MetAP2 inhibitors and applications thereof
US11672767B2 (en) 2019-05-13 2023-06-13 University Of South Carolina Enzymatically cleavable self-assembled nanoparticles for morphogen delivery

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL133221C (da) * 1965-11-12
US3957700A (en) * 1972-05-04 1976-05-18 British Industrial Plastics Limited Filled aminoplast moulding materials
US4007142A (en) * 1974-04-24 1977-02-08 Balm Paints Limited Amine resin and process
GB8311136D0 (en) * 1983-04-25 1983-06-02 Lepetit Spa Immobilised oligopeptides

Also Published As

Publication number Publication date
ATE60991T1 (de) 1991-03-15
DK3386D0 (da) 1986-01-03
EP0187547A3 (en) 1987-07-22
DK3386A (da) 1986-07-05
EP0187547A2 (en) 1986-07-16
DE3581921D1 (de) 1991-04-04
JPS61243026A (ja) 1986-10-29
CA1305053C (en) 1992-07-14
GB8500209D0 (en) 1985-02-13
DK164485C (da) 1992-11-23
AU589587B2 (en) 1989-10-19
EP0187547B1 (en) 1991-02-27
AU5183386A (en) 1986-07-10
JP2620517B2 (ja) 1997-06-18
JPH07300428A (ja) 1995-11-14
JPH075474B2 (ja) 1995-01-25
US5037883A (en) 1991-08-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK164485B (da) Polymerholdige medikamenter, fremgangsmaade til fremstilling heraf samt farmaceutisk praeparat indeholdende mindst et saadant medikament
Hoste et al. Polymeric prodrugs
Kopeček et al. Targetable polymeric prodrugs
Kopeček Controlled biodegradability of polymers—a key to drug delivery systems
Nuhn et al. Water-soluble polymers coupled with glycopeptide antigens and T-cell epitopes as potential antitumor vaccines.
US9289510B2 (en) Polymeric drug delivery conjugates and methods of making and using thereof
EP0955064B1 (en) Process for producing drug complexes
Ooya et al. Synthesis and characterization of biodegradable polyrotaxane as a novel supramolecular-structured drug carrier
CZ2006592A3 (cs) Polymerní lécivo a zpusob jeho výroby
Subr et al. Release of macromolecules and daunomycin from hydrophilic gels containing enzymatically degradable bonds
EP1463529B1 (en) Ph-sensitive polymeric conjugates of an anthracycline cancerostatic drug for targeted therapy
Van Heeswijk et al. The synthesis and characterization of polypeptide-adriamycin conjugates and its complexes with adriamycin. Part I
CZ2009844A3 (cs) Dendritické vysokomolekulární polymerní nosice léciv a jejich konjugáty s lécivy pro lécbu zejména pevných nádoru
Kopecek Synthesis of tailor-made soluble polymeric drug carriers
CZ278551B6 (en) Polymeric medicament, process for preparing thereof and pharmaceutical compositions based thereon
De Marre et al. Synthesis of macromolecular Mitomycin C derivatives
Chiu Interactions of macromolecules with enzymes: implications for the development of soluble polymeric drug conjugates
CZ2003605A3 (en) pH sensitive polymeric conjugates of anthracycline cancerostatic for targeted therapy
KR20030064388A (ko) 활성제 전달 시스템 및 활성제의 보호 및 투여 방법

Legal Events

Date Code Title Description
PBP Patent lapsed

Country of ref document: DK