DK162476B - Laegemiddel, der indeholder ekstraktstoffer af planter eller plantedele af arten leptospermum scoparium, fremgangsmaader til fremstilling heraf og anvendelse af ekstraktstofferne til fremstilling af laegemidlet - Google Patents

Description

i

DK 162476 B

Ekstraktstoffer af vegetabilst materiale, såsom blade, blomster og frugter, er siden Arilds tid blevet anvendt til behandlingen af mange forskellige sygdomme. De i planterne indeholdte virksomme stoffer kan udvindes derfra ved ekstraktion af plan-5 tedelene med vand, alkohol eller andre organiske opløsningsmidler eller blandinger deraf, eller ved vanddampdestillation.

Det har nu overraskende vist sig, at planterne af arten Lepto-spermum scoparium, som hører til familien Myrtaceen, i deres 10 blomster, knopper, blade og stængler hovedsageligt indeholder virksomme stoffer i form af etheriske olier, som selv i forholdsvis ringe mængde er egnede til oral indgift til behandlingen af tumorer og leukæmi.

15 Opfindelsen angår lægemidler, som er ejendommelige ved, at de indeholder ekstraktstoffer af planter eller plantedele af arten Leptospermum scoparium.

Ekstraktstofferne eller de virksomme stoffer aktiverer øjen-20 synligt organismens naturlige modstandsdygtighed mod degenerative symptomer eller fænomener eller cancerogene symptomer eller fænomener i legemet. Denne nyerkeridte virkning er des mere overraskende, da fagverdenen på den ene side i mange århundreder har undersøgt de forskelligste planter og dele heraf for 25 forekomsten af stoffer med terapeutisk virkning, og på den anden side længe har kendt planterne af arten Leptospermum scoparium. Leptospermum scoparium vokser i Australien og New Zealand og dyrkes også i europa som prydplante på grund af smukke røde eller rosa blomster.

30 Lægemidlet indeholder fortrinsvis ekstraktstoffer af hybridsorter af arten Leptospermum scoparium. Hybridsorterne fås ved krydsning eller mutation. Kendte og i handelen værende hybridsorter er: 35

Ballerina Gaity Giri

Big Red Jubilee

DK 162476B

2

Blossom Pink Pearl

Burgundy Queen Spectrecolour

Fantasia Sunraysia

Cherry Ripe Winter Cheer 5 Coral Candy Crimson Glory

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde til fremstilling af lægemidlet, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man ekstraherer findelte blade, stængler og/eller blomster af Lep-10 tospermum Scoparium med ethanol eller vandig ethanol og efter fraseparering af plantedelene fortynder ekstrakten til den ønskede koncentration.

Opfindelsen angår desuden anvendelse af ekstraktstofferne til 15 fremstilling af et lægemiddel til behandling af tumorer og leukæmi.

Til fremstillingen af lægemidlerne ekstraheres findelte blade, stængler og/eller blomster af Leptospermum scoparium med etha-20 nol eller vandig ethanol. Efter fraseparering af plantedelene fortyndes ekstrakten til den ønskede koncentration. Det vegetabilske materiale anvendes fortrinsvis kort før blomstringen, hvorhos man findeler plantedelene uden rødderne og ekstraherer med ethanol eller vandig ethanol, især med 43% ethanol under 25 opvarmning, fortrinsvis ved opvarmning under tilbagesvaling på i og for sig kendt måde. Der kan her anvendes de friske eller forsigtigt tørrede findelte planter eller dele heraf uden rødderne.

30 En anden måde til fremstillingen af lægemidlerne består i, at man udvinder ekstraktstofferne som etheri sk olie ved hjælp af vanddampdestillation af udgangsmaterialet.

Det udvundne decoctum, dvs. den alkoholiske eller vandige 35 alkoholiske ekstrakt, kan anvendes direkte i den ønskede fortynding. På grund af den høje aktivitet af ekstraktstofferne af Leptospermum scoparium egner ekstrakten sig især til anven-

DK 162476 B

3 delse i homøopatisk fortynding svarende til homøopatiske lægebøgers forskrifter, især svarende til forskrift 19e, i en Dl-D6-fortynding (styrke), hvorhos der i almindelighed tre gange dagligt før spisning indtages 5 eller 15 - 25 dråber.

5 Dette svarer til 1-4 mg/dag pr. 70 kg legemsvægt.

Urtinkturen kan som phytofarmakon også anvendes direkte til oral indgift eller i fortyndingen 1:10 i 30% ethanol eller i 1% kogsaltopløsning. I dette tilfælde anbefales 10 - 25 10 dråber tre gange dagligt.

Eksempel 1 200 g frisk udvundne f i ndel te blade med tynde stængler af en 15 hybridsort af Leptospermum scoparium behandles med 600 g 43% vandig ethanol. Blandingen opvarmes til kogning og holdes i 30 minutter under tilbagesvaling. Efter afkøling henstår blandingen 24 timer under låg, hvorpå ekstraktstofferne isoleres og renses ved presning og filtrering af den resulterende 20 opløsning.

Til applikationen kan den opnåede ekstrakt anvendes ufortyndet eller fortyndet i forholdet 1:10 eller 1:100 med 30% ethanol. Der indgives hensigtsmæssigt oralt 20 dråber af den for-25 tyndede ekstrakt. Dette er 3 - 4 ml/dag pr. 70 kg legemsvægt. Såfremt der ønskes fremstilling af en fortynding ifølge den homøopatiske lære behandles 3 dele af den filtrerede ekstrakt med 7 dele 30% ethanol, hvoraf derpå denne første decimalfor tynd i ng (Dl) i forholdet 1:9 endnu engang fortyndes med 15 30 - 30% ethanol.

Den således opnåede D2-fortynding kan så direkte eller efter yderligere fortynding gives oralt til behandling af patienterne.

35

DK 162476B

4

Eksempel 2 100 g tørt og formalet plantemateriale (Stængler og blade) af en hybridsort af Leptospermum scoparium ekstraheres under til-5 bagesvaling med 1 liter 43¾ ethanol, som beskrevet i eksempel 1. Efter afkøling og 24 timers henstand presses og filtreres.

Da den opnåede ekstrakt allerede svarer til en Dl-fortynding, behandles der til udvinding af en D2-fortynding med 30¾ etha-10 nol i forholdet 1:9 dele. Når det ønskes behandles 1 del af den således opnåede opløsning igen med 9 dele 15¾ ethanol til den 3. decimalfortynding. De på denne måde opnåede fortyndinger eller styrker Dl - D3 kan gives oralt til patienterne.

15 De således udvundne fortyndede ekstrakter af Leptospermum scoparium hybr. udviser allerede efter en regelmæssig indgift i 3 - 6 uger tydelige resultater ved behandling af DBA-mus, som ved topisk applikation af methylcholanthren på huden havde fået induceret murin lymfomatisk leukæmi, hvilke resultater blev 20 vurderet dels ved en fysisk bedømmelse af dyrenes tilstand og dels ved at tælle antal overlevende dyr. Midlet tåles godt.

Specielt i disse koncentrationer har det ingen uheldige indvirkninger på mave- og tarmkanalen.

25 Eksempel 3

Den af plantedelene dyrkede sorter af Leptospermum scoparium hybr. ved destillation udvundne etheriske olie fortyndes 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10.000 med ethanol eller olivenolie og kan 30 indgives som følger: 3x3-5 dråber eller 3 x 15 - 20 dråber.

De følgende eksempler illustrerer den gavnlige virkning af ekstraktstofferne af Leptospermum scoparium til behandling af 35 henholdsvis Meth-A Sarcom, 3-Lewis-lungecarcinom og L1210 lym- focytisk leukæmi.

DK 162476 B

5

Eksempel 4 ¥

Meth-A Sarcom 5 Denne tumor blev fremkaldt i 1961 på Sloan Kettering Institute, New York, N.Y. Celler fra denne tumor var en gave fra Dr. Lloyd Old. Cellerne blev holdt i flydende nitrogen. Til eksperimenterne blev cellerne optøet og injiceret intraperito-nealt (5 x 106/ml saltopløsning) i BALB/c-mus. Efter 8 dage 10 blev dyrene aflivet, og tumorcellerne blev fjernet ved skylning af peritonealhulrummet med phosphatpufret saltopløsning (PBS). 5 x 106 celler af denne suspension blev atter injiceret i.p. i normale BALB/c-mus. Efter nøjagtig 8 dage blev Meth-A sarcomcellerne igen fjernet fra peritonealhulrummet som 15 beskrevet. Denne procedure blev gentaget to gange, før tumor-cellerne blev anvendt til eksperimenterne.

105 Meth-A sarcomceller i 50 μΐ PBS blev injiceret intrakutant i (C57/bl6xBALB/c)F^-hunmus med en gennemsnitsvægt på 20 g.

20 Tumorimplantationsarealet blev barberet 3 dage før injektion af tumorcellerne. Generelt vokser tumoren inden for den første uge til en størrelse på 8 x 8 mm, som målt ved hjælp af en krumpasser. Tumoren blev målt en gang ugentlig i fire uger, og det omtrentlige tumorvolumen blev beregnet ved hjælp af føl-25 gende formel: V e 4 · a · b · a+b 6 2 30 hvor V b tumorvolumen på et hvilken som helst givet tidspunkt bestemt ved måling af to diametre, a og b, på tumoren.

På dag 28 blev alle musene aflivet, og deres tumorer blev udskåret og vejet. Antallet af tumorbærende dyr ud af en gruppe 35 på 10 eller 20 mus blev bestemt makroskopisk. Fra tidligere undersøgelser var det kendt, at hos dyr, som er fri for tumorer på grund af anvendelsen af antitumorale stoffer, vil tumoren ikke genopstå selv efter 6 måneder.

DK 162476B

6

Musene blev kun behandlet via den orale vej med de forskellige, beskrevne fraktioner af de planlagte ekstrakter. Doser på 100 ml/kg legemsvagt blev givet 3 gange ugentligt i dekokt-fortyndinger på 1:10, 1:100 og 1:1000. Kontrolgrupperne fik 5 doser på 0,2 ml PBS/mus.

Kontrolgruppernes tumorstørrelse fortsatte med at vokse i et tidsrum på 28 dage, mens der kun sås en stigning i tumorstørrelse efter 28 dage ved en dosis på 1:100 og 1:1000 dekokt. En 10 dosis på 1:10 dekokt viste et markant fald i tumorstørrelse begyndende efter 14 dage, idet tumoren blev progressivt mindre efter det.

Resultaterne fremgår af fig. 1, som viser tumorvækst af Meth-A 15 sarcomtumor i et tidsrum fra 7 dage til 28 dage. Som det kan ses, gav Leptospermum Scoparium-dekokt i fortyndinger på 1:10, 1:100 og 1:1000 alle reduceret tumorvækst.

Eksempel 5 20 3-Lewis-lungecarcinom

Denne tumormodel blev anvendt til at undersøge indvirkningen af ethanolekstrakten 10“1 af Leptospermum scoparium (Lept.

25 scop.) på udviklingen af metastaser i lungen.

Tumorceller til undersøgelsen blev fremstillet og opnået som følger: 30 ca. 107 tumorceller blev injiceret i venstre armhule på mus. Efter tumoren havde nået en størrelse ca. svarende til et lille kirsebær og ikke viste tegn på central nekrose, blev dyret aflivet, og tumorvævet blev fjernet ved resektion under sterile forhold. Tumoren blev udskåret i små stykker med et 35 mål på ca. 5x5 mm. Fragmenterne fik lov at sedimentere. Su-pernatanten blev bortkastet, og de resterende vævsfragmenter blev inkuberet i 30 min. ved 37eC med 20 - 30 ml 0,25% tryp-

DK 162476 B

7 sin i en vandig opløsning. Fragmenterne indeholdende opløsning blev omrørt kontinuerligt. Efter 30 min. blev trypsinbe-handlingen stoppet ved tilsætning af 10 ml føtal kalveserum.

De fordøjede fragmenter fik lov at bundfælde, og enkeltcelle-5 suspensionen i supernatanten blev frasuget. Cellerne blev centrifugeret og vasket to gange. Ved denne procedure blev sædvanligvis opnået 90% levedygtige tumorceller.

107 celler blev injiceret i højre bagbens trædepude på mus.

10 Da trædepuden havde nået en størrelse på 6-8 mm i diameter, blev foden fjernet ved resektion sammen med den primære tumor. Amputationen blev naturligvis udført under anæstesi. Det var kendt fra tidligere undersøgelser, at på dette tidspunkt havde tumorceller allerede sat sig i lungen.

15

Efter amputationen blev alle dyrene udtaget på randomiseret måde og opdelt i grupper på 10 eller nogle gange 20 dyr pr. gruppe. Dyrene blev sædvanligvis behandlet oralt med fortyndinger af Lept. scop. på 1:10, 1:100 og 1:1000 (100 mg/kg le- 20 gemsvægt) med start på dag 7 efter amputation. Indgivelsen af forbindelserne blev fortsat 3 gange/uge indtil dag 20. På dette tidspunkt begyndte de første dyr i kontrolgruppen, som var behandlet med PBS, at dø. De fleste af undersøgelserne blev afsluttet på dag 60, da alle dyr i kontrolgruppen var 25 døde af lungemetastaser. I nogle undersøgelser blev de tilsyneladende raske, behandlede dyr observeret indtil dag 120. Kun meget sjældent udviklede et dyr meget sene metastaser (mellem dag 60-120).

30 Hvis undersøgelsen blev afsluttet på dag 60, blev alle overlevende dyr aflivet, lungen blev fjernet og derefter inddryppet med sort blæk. Ved denne procedure kan meget små metastaser påvises under et stereomikroskop som hvide pletter. Lunger, hvori sådanne blev fundet, blev naturligvis regnet som værende 35 metastasepositive.

Resultaterne er vist i fig. 2, hvoraf fremgår forhindringen af metastasedannelse af Lewis-lungecarcinom. Den bedste akti-

DK 162476 B

8 vitet blev fundet ved at påbegynde indgift 8 dage efter operation. Resultatet var, at 75% af dyrene var fri for tumorer efter 60 dage.

5 Eksempel 6 L1210 Ivmfocvtisk leukæmi

Denne tumorcellelinie blev anvendt i undersøgelserne som et 10 eksempel på den mulige virkning af de beskrevne forbindelser på humane leukamier. Denne tumor er meget aggressiv. Ti leuka-miceller vil dråbe en mus inden for 10-14 dage efter intravenøs injektion.

15 Den oprindelige cellelinie blev opnået fra ATCC (American Tissue Culture Cell Collection, ATCC CCL.219). De blev opformeret in vivo ved intraperi toneal injektion af 103 celler/ml saltop-løsning/mus. Efter 8 dage blev de tumorbarende dyr aflivet, og tumorcel lesuspensionen blev vasket ud af peritonealhulrummet.

20 Tumorcellerne var sadvanligvis kontamineret med erythrocyter, som blev elimineret ved behandling af de centrifugerede celler enten med hypotonisk saltopløsning eller med ammoniumchlorid. Cellesuspensionen blev atter vasket med isotonisk saltopløsning.

25

Forskellige mangder tumorceller (103 - 101/mus) blev injiceret intravenøst. Den samme behandling som beskrevet ovenfor blev påbegyndt en dag efter injektion af tumorcellerne. Forbindelsernes effektivitet blev bestemt ved fysisk bedømmelse af det 30 tumorbarende dyr (paraplegi, vagttab, inkontinens) og ved at talle antallet af overlevende dyr.

Resultaterne fremgår af fig. 3, hvoraf ses antal overlevende mus efter indgivelse af cellelinien L1210 i mangder på 1000, 35 5000 og 10.000 tumorceller. En 0,2 ml 10~1 opløsning blev tilsat 10 gange i løbet af 20 dage efter en dyrkningsperiode på 60 dage. Ved indgivelse af 1000 tumorceller var 5 ud af 10

Claims (3)

1. Lægemiddel, kendeteflnet ved, at det indeholder ekstraktstoffer af planter eller plantedele af arten Lep-tospermum scoparium. 10

2. Lægemiddel ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det indeholder ekstraktstoffer af hybridsorter af arten Lepto-spermum scoparium.

3. Fremgangsmåde til fremstilling af lægemidlet ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man ekstraherer findelte blade, stængler og/eller blomster af Leptospermum scoparium med ethanol eller vandig ethanol og efter fraseparering af plantedelene fortynder ekstrakten til den ønskede 20 koncentration. 1 2 3 35 Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendetegnet ved, at man ekstraherer plantedelene under opvarmning og under tilbagesvaling. 25 2 Fremgangsmåde til fremstilling af lægemidlet ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at man udvinder ekstraktstoffer som etherisk olie ved hjælp af vanddampdestination af udgangsmaterialet. 30 3 Anvendelse af ekstraktstofferne ifølge krav 1 eller 2 til fremstillingen af et lægemiddel til behandlingen af tumorer og leukæmi .