DK161000B - Fremgangsmaade til fremstilling af l-arginin ved aerob dyrkning af brevibacterium flavum - Google Patents

Description

DK 161000 B

Opfindelsen angår en særlig fremgangsmåde til fremstilling af L-arginin ved fermentering.

L-arginin er en vigtig aminosyre, og dens anvendelse som levnedsmiddeltilsætningstof, foderstoftilsæt-5 ningsmiddel og i farmaceutiske præparater har længe været kendt.

Ligeledes kendes en række fremgangsmåder til bioteknisk fremstilling af denne aminosyre ved aerob dyrkning af mikroorganismer i et næringsmedium.

10 I tysk patentskrift 2 164 170 beskrives anven delsen af Bacillus subtilis, hvis dyrkning i nærværelse af glutaminsyre forbedrer udbyttet af L-arginin.

Fra britisk patentskrift 1 229 529 kendes mange bakteriestammer, som ved tilsætning af L-ornithin eller 15 L-citrullin producerer L-arginin i relativ små mængder, såsom f.eks. Brevibacterium flavum ATCC 14 067, 2,4 g/1 i nærværelse af L-citrullin.

Ifølge US patentskrift 3 734 829 opnås en betydelig højere koncentration med Bacillus subtilis ATCC 20 21 742, når L-glutaminsyre tilsættes næringsmediet (12,3 g/1 L-arginin).

I tysk offentliggørelsesskrift 2 108 404 beskrives ligeledes en fremgangsmåde til fremstilling af L-arginin ved hjælp af mikroorganismer.

25 Med Brevibacterium flavum ATCC 21 493 opnåedes en koncentration på 2,1 g/dl L-arginin i fermenteringsmediet.

Gentagelsen af disse forsøg under anvendelse af den deponerede stamme førte til udbytter, der kun udgør 30 en brøkdel af den angivne værdi, se f.eks. Eksempel 2 nedenfor, hvor der kun fås 4,8 g/1.

Det er ved opfindelsen tilsigtet at tilvejebringe en fremgangsmåde til fremstilling af L-arginin ved hjælp af mikroorganismer med forbedret udbytte. Det 35 viste sig overraskende, at der ved at tilsætte ovennævnte fermentering med Brevibacterium flavum N-acetyl- DK 161000 2 L-glutaminsyre kunne opnås høje udbytter.

Opfindelsen angår således en fremgangsmåde til fremstilling af L-arginin ved aerob dyrkning af Brevi-bacterium flavumstammer, i hvilke N-acetyl-L-glutamin-5 syre-5-phosphotransferasen hæmmes af L-arginin, i et næringsmedium ved sædvanlige temperaturer og pH-værdier og isolering af L-arginin, og som er ejendommelig ved, at man sætter 5 til 50 g/1 N-acetyl-L-glutaminsyre til fermenteringsblandingen. Der sættes fortrinsvis 40 g/1 10 N-acetyl-L-glutaminsyre til fermenteringsblandingen.

Tilsætningen kan ske i begyndelsen eller fortrinsvis efter en vækstperiode på 10 til 16 timer.

N-acetyl-L-glutaminsyre udgør ganske vist i sig selv et biosynteseforstadium af L-arginin. Ved den fo-15 religgende fremgangsmåde omsættes imidlertid højst 15% af den samlede mængde.

Resten kan efter afslutning af fermenteringen på sædvanlig måde skilles fra og genanvendes.

De ved fermenteringen af mikroorganismerne iføl-20 ge opfindelsen anvendte næringsmedier er af sædvanlig natur.

De indeholder assimilerbare kilder for carbon og nitrogen såvel som uorganiske salte.

Der kan tilsættes mindre mængder af organiske 25 næringsstoffer, såsom vitaminer eller aminosyrer. Eksempler på assimilerbare carbonkilder er carbonhydra-ter, såsom glucose, saccharose, stivelse- og sojahydro-lysater eller melasse.

Eksempler på assimilerbare nitrogenkilder er or-30 ganiske eller uorganiske nitrogenforbindelser, såsom nitrat, ammoniumsalte, ammoniakgas, ammoniumhydroxidop-løsninger og urinstof.

Til opnåelse af gode L-argininudbytter gennemføres fermenteringen aerobt under luftning og/eller be-35 vægelse. De bedste udbytter kræver en pH-justering i området fra 5 til 9. Den ønskede pH-værdi kan justeres

DK 161000 B

3 ved tilsætning af ammoniak på gas- eller væskeform, calciumcarbonat, alkalimetalhydroxid, urinstof eller organiske eller uorganiske syrer til mediet. En del af disse bestanddele kan desuden tjene til tilførsel af 5 assimilerbar nitrogen. Når fermenteringen gennemføres ved fra 24 til 37°C, opnås argininkoncentrationens maksimum i blandin-gen indenfor 48 til 72 timer.

Som carbonkilde tilsættes fortrinsvis saccharose i en mængde på 100 til 140 g/1, og som nitrogenkilde 10 (NH4)2S04 i en mængde på 30 til 70 g/1, afhængig af fermenteringsblandingen.

Den stamme af Brevibacterium flavum som fortrinsvis, anvendes, er den der er deponeret under nummeret ATCC 21 493.

15 En beskrivelse af biosyntesemåden til fremstil ling af L-arginin ved Coryneform bakterier er angivet i Yoshida et al., Agric. Biol. Chem. 43 (1979) 105-111.

Eksempel 1 20

Brevibacterium flavum ATCC 21493 podes på en næringsplade med en stamopløsning indeholdende 20 ml af et medium med følgende sammensætning: 25 Kød-pepton 7,8 g/1

Casein-pepton 7,8 g/1 Gærekstrakt 2,8 g/1

Natriumchlorid 5,6 g/1 D(+)-glukose 1,0 g/1 30 Agar-agar 12,0 g/1

Demineraliseret vand op til 1,0 1.

pH i det brugsfærdige medium: 7,5± 0,1.

Mediet kan fås færdigt fra Fa. Merck, Darmstadt, BRD.

35 Den podede plade inkuberes i 36-48 timer ved 30°C i et varmeskab. Til slut udhældes 5 ml af en 0,9%

DK 161000 B

4

NaCl-opløsning til pladen, og de dyrkede kolonier løsnes ved .hjælp af en steril podenål fra overfladen og opslæmmes. Med 1 ml af denne suspension podes 25 ml af et flydende næringsmedium, der med undtagelse af agar-5 agar er identisk med ovennævnte medium. Mediet befinder sig i en steril 500 ml Erlenmeyerkolbe med schika-ner og vatprop.

Efter podning anbringes kolben på en inkubationsrystemaskine og inkuberes 16 timer ved 30°C og 200 10 omdrejninger/minut. 2,5 ml af denne kultur udtages derpå sterilt fra kolben og sættes til 25 ml af et sterilt medium med følgende sammensætning:

Saccharose 140 g/1 15 KH2P04 1 g/1

MgS04 x 7 H20 0,4 g/1 (NH4)2S04 50 g/1

FeS04 x 7 H20 31 mg/1

MnS04 x H20 8 mg/1 20 Sojahydrolysat 10 ml/1

Thiamin x HC1 200 yg/1

Biotin 100 yg/1 N-Acetyl-L-glutaminsyre 40 g/1

CaC03 50 g/1 25 pH 7,2

Mediet er anbragt i en steril 500 ml Erlenmeyerkolbe med vægge til forøgelse af blandingseffektiviteten og vatprop. Efter tilsætning af 2,5 ml podekultur 30 anbringes kolben atter på en inkubationsrystemaskine og inkuberes 72 timer ved 30°C og 150 omdrejninger/minut. Derefter adskilles biomassen ved centrifugering, og indholdet af L-arginin i mediet bestemmes ved hjælp af en aminosyreanalysator (Fa. Biotronik, Miinchen). Medi-35 et indeholder 14,7 g/1 L-arginin. L-argininet kan dernæst udvindes fra opløsningen ved ionbytningschromato-

DK 161000 B

5 grafi og krystallisation eller andre egnede fremgangsmåder. Ved afslutningen af forsøget var det muligt at påvise ca. 180 mM,svarende til ca. 34 g/1, N-acetyl-L-glutaminsyre i mediet.

5 Bestemmelsen sker ved hjælp af højtryksvæskekro matografi.

Eksempel 2 (Sammenligningseksempel) 10

Brevibacterium flavum ATCC 21 493 behandles på samme måde som i Eksempel 1, med den forskel, at det sidstnævnte medium ikke indeholder N-acetyl-L-glutamin- 15 syre. Efter 72 timers inkubation og adskillelse af biomassen indeholder mediet ca. 4,8 g/1 L-arginin.

Eksempel 3 20 20 kolber, hver med 50 ml forkulturmedium, podes som i Eksempel 1, hver med 1 ml pladeopslæmning af Brevibacterium flavum ATCC 21 493 og inkuberes 16 timer ved 30°C og 200 omdrejninger/minut. Efter inkubationen samles indholdet i kolberne i en i forvejen sterilise- 25 ret beholder.

20 1 produktionsmedium anbringes i en fermenteringstank med et totalvolumen på 40 1 og steriliseres.

Efter steriliseringen podes mediet (sammensætning som i Eksempel 1) med forkulturen og inkuberes 64 timer ved 30 30°C, 800 omdrejninger pr. minut og ca. 0,5 vol/vol.

min. luftning. pH-værdien holdes konstant på 7,2 ved tilsætning af svovlsyre eller kaliumhydroxidopløsning (som erstatning også ammoniakopløsning eller ammoniak på gasform).

35 Efter 64 timer er ca. 16,5 g/1 L-arginin (af hængig af slutvolumenet) påviselig i mediet. N-acetyl-

DK 161000 B

6 L-glutaminsyreforbruget under fermenteringen andrager ca. 5 g/1.

Eksempel 4 5 (Sammenligningseksempel)

Brevibacterium flavum ATCC 21 493 behandles på samme måde som i Eksempel 3, med den undtagelse, at mediet ikke indeholder N-acetyl-L-glutaminsyre. Efter 10 afslutning af inkubationen andrager argininindholdet i mediet ca. 4,4 g/1.

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af L-arginin ved aerob dyrkning af Brevibacterium flavumstammer i hvilke N-acetyl-L-glutamin-syre-5-phosphotransferasen 5 hæmmes af L-arginin i et næringsmedium ved sædvanlige temperaturer og pH-værdier og isolering af L-arginin, kendetegnet ved, at man sætter 5 til 50 g/1 N-acetyl-L-glutaminsyre til fermenteringsblandingen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kende-10 tegnet ved, at man som carbonkilde anvender saccharose.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at man som nitrogenkilde tilsætter fermenteringsblandingen (NH4)2S04. 15

4. Fremgangsmåde ifølge kravene l til 3, ken detegnet ved, at man anvender Brevibacterium flavum ATCC 21 493.