DK160316B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af beta-casomorphinanaloge peptider samt pharmakologisk acceptable syreadditionssalte og metalkomplekser deraf - Google Patents

Description

DK 160316 B

i

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte /3-casomorphin-analoge peptider samt pharmakologisk acceptable syreadditionssalte og metalkomplekser deraf, især sådanne med opiat-5 agtig virkning.

Der kendes pharmakologisk aktive peptider, der ved særlige biologiske prøvesystemer udviser en specifik opiatagtig virkning. Det drejer sig her især om de af Hughes m.fl. (Nature 258, 577, 1975) fra hjernen isolerede 10 pentapeptider: methionin- og leucinenkephalin samt disses langkædede analoge. Disse kendte peptider og deres syntetiske derivater har den ulempe, at de efter in vitro-behand-ling med proteaser (f.eks. Pronase E, Merck) efter en kort inkubationstid mister deres pharmakologiske virkning, i det-15 te tilfælde en opiatagtig virkning. Ved indgivelse in vivo angribes disse peptider let af kroppens egne proteaser og ødelægges.

På Int. Narcotic Research Conference's kongres i juni 1979, North Flamouth, USA, blev hidtil ukendte pepti- 20 der, β-casomorphiner, beskrevet, der frembyder en hidtil u-kendt struktur, og som på overraskende måde på grund af denne struktur har en forøget stabilitet over for proteaser (f.eks. Pronase E, Merck). Disse peptider frembyder en kraftig opiatagtig virkning inden for forskellige kendte prøvesy-25 stemer (receptorbindingsprøve og isoleret marsvinetarm)., Efter injektion af 0,35 yimol β-casomorphin-S (Tyr-Pro-Phe-Pro--Gly) i ventrikelsystemet i rottehjerne fremkommer en kraftig opiatspecifik analgetisk virkning, der i løbet af 10 minutter når den maksimale virkning og efter 60 minutter er 30 klinget fuldstændig af. Denne i forhold til raorphin korte virkningstid med samme analgetiske virkning, tyder straks på en eventuelt fuldstændig eller delvis nedbrydning af stoffet ved hjælp af hjernens enzymer.

Ved parenteral eller oral anvendelse af stoffet 35 udviser β-casomorphin-S, der i øvrigt er det hidtil kraftigste kendte opiatagtigt virkende peptid af β-casomorphinfami- 2

DK 160316 B

lien, ingen analgetisk virkning. Dosis er ved disse forsøg indtil 150 mg/kg legemsvægt for rotter. Denne ulempe ved de kendte peptider kan helt eller delvis føres tilbage til 5 stoffets inaktivering i blodet og/eller i hjernen. Inkubationsforsøg med stoffet med rottehjernehomogenat eller blodplasma viser, at allerede efter en kort inkubationstid på 15 minutter forsvinder den opiatagtige virkning.

Det er formålet med opfindelsen at tilvejebringe 10 hidtil ukendte pharmakologisk aktive peptider, /3-casomorphin-analoge, der efter inkubation (op til 120 minutter) med rottehjernehomogenat og/eller ovenstående væske af rottehjernehomogenat og/eller blodplasma (se udførelseseksemplet) bibeholder deres pharmakologiske, f.eks. opiatagtige virk-15 ning. Det er endvidere formålet med opfindelsen at tilvejebringe pharmakologisk aktive peptider, jø-casomorphin-analoge, som efter parenteral (f.eks. intravenøs eller subcutan injektion) og/eller oral indgivelse udviser en pharmakologisk virkning, især en opiatagtig virkning. Endelig er det for-20 målet med opfindelsen, ved beskrivelse af aminosyresekvensen, især positionen af D-aminosyren, at gøre en fagmand i stand til at fremstille peptidet i vilkårlige mængder ved gængse metoder.

Disse formål opfyldes ifølge opfindelsen med en ana-25 logifremgangsmåde til fremstilling af jø-casomorphinanaloge peptider med den almene formel H-Tyr-X-A-R H-Tyr-X-A-Pro-R H-Tyr-X-A-Pro-B-R 3 0 H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-R

H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-C-R H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-C-Pro-R eller H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-C-Pro-D-R, hvor Tyr er aminosyren L-tyrosin, Pro er aminosyren L-prolin, 35 A, B, C og D er aminosyrerne Pro, Ala, Thr, Val, Tyr, Phe,

Gly, Ile, Asn, Met i stereokemisk L-form, hvorhos en C-ter- 3

DK 160316 B

minal gruppe A, B, C eller D tillige kan være -Met(O)-OH med formlen CH3 5 ' S->0 ch2 ch2 i -nhchch2oh R kan være -OH, lavere alkoxy eller -NH2, og X er aminosyrerne Pro, Ala, Thr, Val, Tyr, Phe, Gly, Ile,

Asn, Met og/eller methioninderivatet Met(O)-OH i den stereo-15 kemiske D-form, deres pharmakologisk acceptable syreadditionssalte eller metalkomplekser, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at de enkelte aminosyrer og/eller tilsvarende mindre peptidfragmenter ved knytning af peptidbindingerne i den ønskede rækkefølge overføres til de ønskede 20 pharmakologisk aktive peptider under midlertidig beskyttelse af eventuelle aktive grupper, som ikke skal deltage i peptiddannelsesreaktionen, især beskyttelse af aminogrupperne med carbobenzoxychlorid og beskyttelse af syregrupper som ester, idet syntesen eventuelt kan finde sted som fastfase-25 syntese på egnede bærermaterialer, fortrinsvis polystyren.

Ifølge en anden videreudformning betyder X D-alanin, D-threonin eller D-valin.

Ifølge endnu en udformning foreligger den endestillede, C-terminale aminosyre som et amid eller en ester.

30 35

O

4

DK 160316 B

De omhandlede peptiders forøgede stabilitet over for nedbrydende enzymer beror på indførelsen af en D-amino-syre i peptidets 2-stilling. Denne indførelse var på ingen måde nærliggende, idet den kemiker, der først opdagede 5 og beskrev denne type β-casomorphinforbindelser på the International Narcotic Research Conference, juni 1979, North Falmouth, USA, berettede, at den alternerende prolinsekvens resulterer i en fuldstændig overraskende stabilitet over for peptidaser, f.eks. Pronase E, Merck. Det var således 10 på ingen måde nærliggende at gå i gang med en yderligere stabilisering over for proteasespaltning. Aminosyren i peptidets 2-stilling forhindrer nedbrydningen ved hjælp af naturlige enzymer, da de naturlige enzymer fortrinsvis spalter peptidbindinger mellem L-aminosyrer.

15 Ved en videreudformning af forbindelserne er den C-terminale aminosyre i et peptid med ulige antal grupper methionin.

Af særlig betydning er aminosyren methionin i C-terminal stilling i penta-, hepta- og nonapeptider. (Tyr er 20 altid den N-terminale aminosyre.)

Yderst gunstig er methionins derivatdannelse.

Her kan det C-terminale methionin foreligge som -Met(O)-OH: . CH-, I 3 25 S-»0 f 2 .

CII.

I 2 .

-HNCHCH2OH

30

Denne derivatdannelse medfører en forstærkning af den opiatagtige virkning, dvs. at der med mindre doser af peptiderne kan opnås stærkere virkninger.

De pharmakologisk aktive peptider syntetiseres ved hjælp af en inden for peptidkemien og/eller i naturen 35 gængs metode.

DK 160316B

5

Ved gængse metoder skal forstås indførelsen så vel som fraspaltningen af beskyttelsesgrupper, f.eks. aminogrup-pens beskyttelse ved hjælp af carbobenzoxychlorid og beskyttelsen af syregrupper som estere under syntesen. Gængse er 5 ligeledes synteser på bærermaterialer såsom f.eks. polystyren .

Ved en videreudvikling af fremgangsmåden fremstilles de pharmakologisk aktive peptider ved knytning af peptidbindingen mellem de enkelte aminosyrer og/eller de mindre pep-10 tidfragmenter ved hjælp af gængse metoder.

Der kan af forbindelserne, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, fremstilles human- og veterinærlægemidler, der indeholder pharmakologisk aktive peptider og/eller disses syreadditionssalte og/eller disses 15 metalkomplekser.

Disse syreadditionssalte kan fortrinsvis være hydro-chlorider, lactater eller citrater. Som metalkomplekser kan anvendes zink-, magnesium- og koboltforbindelser. Lægemidlernes aktivitet kan på simpel måde konstateres ved relevante 2 0 prøver.

Lægemidlerne kan især anvendes som hostestillende midler, antidiarré-midler, analgetika, antipsychotika og beroligende midler.

De gennemførte analysemetoder, nemlig aminosyreana-25 lyse, Edman-nedbrydning og elektroforese viser, at de som eksempler i tabel I nævnte syntetiserede peptider svarer til de teoretisk forventelige analyseværdier (jvf. tabel II og III), og at peptidindholdet i den indvejede stofmængde er større end 94%.

30 35 6

DK 160316 B

Tabel I

5 Nr. Peptid 1 H-tyr-D-Ala-Phe-NH2 2 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-NH2 3 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-NH2 4 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-Pro-NH2 10 5 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-NH2 7 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Tyr-NH2 8 H-Tyr-D-Ser-Phe-NH2 9 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-NH2 10 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-Gly-NH2 15 11 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-Gly-Pro-NH2 12 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-Tyr-NH2

Normorphin

20 Tabel II

Fundne aminosyrer (i mol pr. analyseret peptid); theoretiske værdier er angivet i parentheser.

Peptid 1 2 3 4 5 η (nr. ifølge tabel I) 25 Tyr (1); 1,0 0,9 1,0 1,1 1,0 2,0 for nr. 7 (2) D-Ala (1) 0,8 0,9 1,0 1,0 1,1 1,1

Phe (1) 1,1 1,1 1,0 1,1 1,0 1,1 30 Pro (1); - 0,8 0,9 1,9 1,8 0,9 for nr. 4+5 (2)

Gly (1) - - 0,8 0,9 1,0 -

Ile (1) - - - - 0,8 ·_ 35

O

7

DK 160316 B

Tabel III

Fundne aminosyrer (i mol pr. analyseret peptid); theoretiske værdier er angivet i parentheser.

5

Peptid 8 9 10 11 12 (nr. ifølge tabel I)

Tyr (1,0) 0,9 1,0 1,1 1,0 1,9 for nr. 12: (2,0) 10 D-Ser (1,0) 0,8 0,9 1,1 1,0 0,9

Phe (1,0) 1,0 1,1 1,1 1,0 1,1

Pro (1,0) - 0,9 0,8 1,9 0,9 for nr. 11 (2,0)

Gly (1,0) - - 1,1 1,0 - 15 -

Fremgangsmåden til elektroforesen fremgår af Hoppe Seyler's Z. Physiol. Chem., bd. 361, s. 1837, December 1980.

20 25 30 35

O

8

DK 160316 B

Eksempel

Syntese af et pentapeptid med sekvensen:' Tyr-D-Ala-Phe-Pro--Gly-methylester og Tyr-D-Pxo-Phe-Pro-Gly-methylester A. Synteseplan 5 Arainokomponenten omsættes ved -15°C eller lavere i dimethylf ormamid med et 0,5 molært overskud af en Z-amino-syreisobutylcarboxylsyres blandede anhydrid (hvor Z er en N-benzoyloxycarbonylgruppe, der fungerer som beskyttelsesgruppe) i 2-4 timer.

10 Det blandede anhydrid fremstilles i DMF ved -15°C

eller lavere i 10-15 minutter ved anvendelse af et 6%'s overskud af Z-aminosyrederivat og N-methylmorpholin via chlormy-resyreisobutylesteren. Derefter ødelægges overskudet af blandet anhydrid. Ved 0°C indstilles reaktionsproduktets 15 pH til 8 ved hjælp af vandig mættet KHCO^-opløsning, og der omrøres i 30 minutter ved 0°C.

Peptiderne ekstraheres med ethylacetat. Ethylace-tat/peptidblandingen vaskes for at fjerne Z-aminosyre-kalium-saltet 3 gange med natriumchlorid/vand, 3 gange med vand og 20 inddampes. Det således fremstillede peptid, der stadig bærer beskyttelsesgruppen Z, hydratiseres i methanol. Herved tilsættes 100-500 mg Pd/aktivt carbon-katalysator pr. mmol peptid. C02~fraspaltningen kontrolleres med Ba(OH)2-opløsning. Katalysatoren filtreres fra (Schleiner & Schvill papir-25 filter nr. 595), vaskes grundigt med vand, og filtratet inddampes i en rotationsfordamper (Biichi, Rotavapor RE). Det ønskede afblokerede peptid findes i remanensen.

B. Syntese af pentapeptidet Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-methylester og Tyr-D-Pro-Phe-Pro-Gly-methylester.

30

Trin 1): a) Fremstilling af det blandede anhydrid.

(A-Phe-Pro-blandet anhydrid) 640 mg (1,6 mmol = 6%'s overskud) af dipeptidet Z-L-Phe-L-Pro (hvor Z er en N-benzyloxycarbonyl- gruppe, der fungerer som beskyttelsesgruppe) om-35

sættes i 20 ml dimethylformaraid (DMF) med 200 jil (1,5 mmol) chlormyresyreisobutylester ved -15°C

O

9

DK 160316 B

efter tilsætning af 170 jil (1,6 mmol) N-methylmor-pholin i 15 minutter, b) Forberedelse af aminokomponenten♦ 125,6 mg (1,0 mmol) glycinmethylester-hydrochlo-5 rid opløses i 20 ml DMF under tilsætning af 110 jil (1 mmol) N-methylmorpholin ved -15°C.

Trin 2): Omsætning af det blandede anhydrid fra trin 1 a med aminokomponenten fra 1 b.

Det Z-Phe-Pro-blandede anhydrid omsættes med gly-10 cinmethylester i 40 ml DMF i 4 timer ved -15°C.

-15°C

Z-Phe-Pro-bl. anhydrid + Gly-Mester 4 timer ^ A-Phe-Pro-Gly-Metester.

Før oparbejdning nedbrydes overskudet på 50% af

4 C Q

blandet anhydrid. Ved 0 C indstilles reaktionsproduktets pH til 8 med vandig mættet KHCOg-op-løsning, og der omrøres i 30 minutter ved 0°C.. Derefter ekstraheres peptidet med 50-100 ml ethyl-acetat (EtAc), og EtAc/peptidblandingen vaskes med 20 mættet vandig natriumchloridopløsning. Efter en yderligere afsluttende vask med vand inddampes EtAc-fasen.

Trin 3); Fraspaltning af beskyttelsesgruppen ved hydrogenering.

25

Peptidet opløses i 30 ml methanol, og der tilsættes 100 mg palladium på aktivt carbon (Merck).

Efter at luften er fortrængt med nitrogen, tilføres der hydrogen til reaktionsbeholderen. Hydrogeneringen sker ved 25-30°C. Hydrogeneringen er 30 afsluttet, når der ikke mere frigives CC>2, dvs. når der efter kontrol i vandig bariumhydroxidopløsning ikke mere dannes bundfald. Opløsningen filtreres, vaskes med vand og inddampes på en rotationsfordamper. Det tilbageblevne mellempro-35 dukt anvendes derefter i trin 4 som aminokomponent.

10

DK 160316B

o

Trin 4): a) Fremstilling af det blandede anhydrid Z-D-Ala- og Z-D-Pro-blandet anhydrid.

334,8 mg Z-D-Ala (tilsvarende også Z-D-Pro) opløses i 15 ml DMF under tilsætning af 170 jil (1,5 5 mmol) N-methylmorpholin og omsættes i 15 minutter ved -15°C med 180 y.1 (1,4 mmol) chlormyresyreiso-butylester.

b) omsætning af det blandede anhydrid fra trin 4 a med aminokomponenten fra trin 3.

10 Z-D-Pro- eller Z-D-Ala-anhydrid + Phe-Pro-Gly-metester (i 15 ml DMF) ^niljnér^ Z-D-Ala-Phe-Pro-Gly-methylester og Z-D-Pro-Phe-Pro-Gly-methylester (Fremstillingen af Z-D-Ala og Z-D-Pro er anført i slutningen af syntesen).

15 Nedbrydningen af overskudet af blandet anhydrid, ekstraktionstrinnene og hydrogeneringen sker som tidligere beskrevet.

Slutproduktet 4 b tjener som aminokomponent i trin 5. En kontrol af aminosyresammensætningen efter 20 hydrolyse viser det korrekte molære aminosyrefor- hold i dette peptid. En prøve med henblik på opiataktivitet (prøvemetode, se eksempel I) viser ingen som helst opiatagtig virkning.

Trin 5: a) Dannelse af det blandede anhydrid (Z-Tyr-blan- 25 det anhydrid).

629,24 mg (1,4 mmol) Ν,Ο-di-Z-L-tyrosin opløses i 15 ml DMF under tilsætning af 165 ul (1,4 mmol) N--methylmorpholin og omsættes med 175 jil (1,3 mmol) chlormyresyreisobutylester i 15 minutter ved -15°C.

30 b) Omsætning af det blandede anhydrid fra trin 5 a med slutproduktet fra trin 4b.

Slutproduktet fra trin 4 b opløses i 15 ml DMF og omsættes ved -15°C i 4 timer med det blandede anhydrid fra trin 5 a. Nedbrydningen af overskuddet 35 af blandet anhydrid, ekstraktionen og hydrogenerin gen sker som beskrevet ovenfor.

DK 160316 B

11 o

En derpå følgende adskillelse af reaktionsprodukterne sker ved hjælp af gelfiltrering på en ''Biogel P 2"-kolonne (firma Biorad) <400 mesh, diameter 20 mm, længde 1170 mm, strømningshastighed 12 ml pr. time, med ultravioletabsorp-5 tionsmåling ved 280 nm og fraktionsopsamler (hvert 20 min/frak.). Alle fraktionerne fra gelfiltreringen bliver afprøvet på et præparat af længdemusklen Plexus, myentericus ophængt i organbad med hensyn til opiatagtig virkning. Til denne prøve inddampes de enkelte fraktioner i vakuum.

10 Efter at remanenserne er taget op i vand, tilsættes dele af disse prøver organbadet og prøves for deres hæmmende virkning på de elektrisk stimulerede kontraktioner af marsvi-netarmpræparatet. Den hæmmende virkning af stofferne, der afprøves , betragtes som opiatspecifik, når den ophæves efter til-15 sætning af den specifikke opiatantagonist "Naioxon", og når der efter yderligere tilsætning af "Naxolon" ikke mere kan fremkaldes en hæmning med prøven. Præpareringen og den elektriske stimulering af marsvinetarm (frekvens 0,1 Hz, puls 60 volt, 0,5 ms) foregår som beskrevet af Kosterlitz m.fl.

20 (H.W. Kosterlitz, R.J. Lydon og A.J. Watt, Brit. J. Pharma col. 39, 398-413 (1970) og Schulz og Goldstein (R. Schulz og A. Goldstein, J. Pharmacol, exp. Ther. 183, 404-410 (1972))

De opiataktive fraktioner inddampes til tørhed.

Efter den sure hydrolyse foretages der af den o-25 piataktive fraktion en aminosyreanalyse, der viser det rigtige molært aminosyreforhold i overensstemmelse med de to 2 2 peptider D-Ala -S-casomorphin-5 og D-Pro -|3-casomorphin-5.

Der henvises til, at allerede aktiveringen af det opiatinaktive tetrapeptid (trin 4 b) ved hjælp af tyrosin-30 kobling til et opiataktivt peptid udgør beviset på en vellykket syntese.

Fremstilling af Z-D-Ala (analog- Z-D-Pro) 891 mg (10 mmol) D-Ala i 5 ml 2N NaOH behandles under isafkøling og kraftig omrøring med 3 ml 50%'s chlor-35

O

12

DK 160316 B

myresyrebenzylester i toluen og med 5,16 ml 2N NaOH.

Opløsningen syrnes med 5,33 ml 2N HC1 og ekstra-heres grundigt med ethylacetat. Den fraskilte ethylacetat-fase vaskes med fortyndet HC1 og vand og ekstraheres endelig med megen KHCO-.-opløsning. De forenede vandige ekstrak-5 ^ ter indstilles til pH 1,5 med HC1 og ekstraheres med ethylacetat. Ethylacetatfasen vaskes igen med fortyndet HC1. Efter en yderligere vaskeoperation med vand tørres over natriumsulfat. Efter afdampning af opløsningsmidlet bliver det ønskede slutprodukt tilbage.

Påvisning af den opiatagtige virknings stabilitet ved inkuba- 2 tion med rotteh]ernehomogenat af D-Ala -p-casomorphin-5 På to hanrotter (Sprague Dawley, 220 g), der er aflivet ved dekapitation, udtages hurtigt hjernen, inkl.

lillehjernen og disse anbringes i en isafkølet homogenisa-lo 2 tor (nr. S 587, volumen 35 cm , Braun, Melsungen) fyldt med 7 ml 0,05 molær Na^PO^-puffer. Homogeniseringen sker derefter ved et omdrejningstal på 850 omdr./min.. under ti gange op- og nedadgående bevægelse af homogenisatorstemplet.

20 En lille del af homogenatet udtages og lagres på is. Resten centrifugeres ved 5°C i 15 minutter ved 28.000 G.

Både homogenatet fra før centrifugeringen og den klare ovenpå liggende væske efter centrifugeringen anvendes til de efterfølgende inkubationer.

25 Alle inkubationerne med substanser med hjernehomo- genat og ovenpå flydende væske sker ved 37°C. Den pågældende inkubationstid afsluttes med 10 minutters opvarmning ved en temperatur på 95°C. Denne opvarmning til 95°G tjener til at ødelægge endnu forekommende enzymer, der på negativ måde 30 ville kunne påvirke påvisningssystemet med henblik på opiatagtig virkning.

1-2 mg af såvel β-casomorphin 5 og det ved frem-gangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede D-Ala -β-casomor-phin-5 optages i 50 jil H2O og blandes med såvel 300 jal hjer-35 13

DK 160316 B

O

nehomogenat som ovenpå liggende væske. Hver prøve opvarmes før inkubering ved 37°C straks til 95°C. Disse prøver er altså kun i meget kort tid i berøring med de aktive enzymer, og deres indhold af opiatagtig virkning tjener som referenceværdi på tidspunkt 0.

5

Efter henholdsvis 15, 30, 60 og 120 minutter udtages yderligere prøver af begge de inkuberede opiater fra in-kubatoren og opvarmes til 95°C.

Som påvisningssystem, der også omfatter opiatmæng-derne kvantitativt, anvendes den tidligere beskrevne marsvi-netarmprøve.

En prøve med henblik på indhold af opioidt materiale i de enkelte beholdere viser, at de beholdere, som kun i kort tid (0-værdi) har været udsat for enzymerne, for beg-ge de anvendte opiaters vedkommende viser samme aktivitets-

1 O

indhold. Men allerede efter 30 minutters forløb viser de beholdere, som indeholder |3-casomorphin-5, ikke mere nogen opiatagtig virkning, medens derimod det fulde opiatagtigé virkningsindhold er påviselig i D-Ala -£-casomorphin-5 både 20 efter 30 og 120 minutters inkubation. Peptidet med D-aminosyren viser derfor en forbavsende stabilitet over for peptidspaltende enzymer.

2

Med D-Ala - og D-Pro-p-casomorphinerne kan der ved systemisk indgivelse (intravenøs og subcutan injektion) op-25 nås en analeptisk virkning, hvilket ikke er muligt med de tilsvarende L-forbindelser. Doseringen ligger, svarende til den ringere virkning end morphin, højere.

Analogt med det ovenfor anførte inkubationseksempel udføres prøven med henblik på den opiatagtigé virknings 30 stabilitet over for blodplasma. Her anvendes i stedet for de 3 00 jil homogenat 300 jil frisk udvundet rotteblodplasma.

Det viser sig atter, at p-casmorphin-5 uden D-aminosyren al- 2 lerede efter 30 minutter er ødelagt, medens D-Ala -(3-caso-morphin-5 beholder sin fulde virkning.

35

DK 160316 B

14

Vi i

bO Q) β i C

C M O O <1) Ή Η »Mi ΐ i 5h © a a 3.

bO w φ E ·ηγο Vi O β a g 4J © ·β f> ·Π Φ PV !h !> ρν O β w (Da) *ri

te bO β rn pli r—I bO bO

iJ in o ·η © a β β VI Q § NO OOO ΟΟ4ΦΝ00 CM a (Ud) β ·ιΗ Φ <1 a - - - - - - - - - - - - λ# a β U ρω ΡΩ to ο ot ο νο mm m Ν η νο > τ—ι · > μοι^ ^ - a

β — Λ <Ν Η Η CM vt CM PM m ι Vi S S VI

νι a a τ—ι r-ι u m ο β a ·η β) η η a — v-i 4-i Q >

PU '—v— φ β in I

8 6 «ν y - K β

Vi β β 4-ι φ o co φ

α. φ ιο > w \»M

S rH Vi U ·γ4 *1 »M

β ι-J ·η ·β α) boa α β

bO Q OO OOO ooinoo-d· I O CM V4t4 β g · C V

vi < o o ooo o o n-crti^cn vo w o a φω vqpi o Q o vo ooot oo cm m βίνινι i <υ α) ΓΤ .... .. .r4(8VlffiWKVl © a Oi-imo com |> v !> ©om i-icn o a to m on m a cm μ φ w m 4h ® Λ μ t) w λ - i bo

Vi β ·η g β g O β © Β “ β β ·Η Φ Φ

1-4 /-> » '-'g 41 H

0 _„ _ fig g P. 01 PH Vi w S β φ 5h νι φ u © h a oo o m m oo-ioom ι o i i cn ι οι^β o o g \ >

Sj ΡΩ O M OmI-00 OOr-IOMO m β β Ή S ΡΩ ·Η

*w m '— ° 00 <J-CMr-4 Ofi(UrdOcnp>bO

£ K · · Ti o O V V g β bp J3 CO 00 rH V4 ·Η « fl «H β •Η +J β Φ dP a !h Vi

Ha β Vi β cn oa Vi Φ α) Λ S 0) U V Η ιητ) Φ 01 a

Vi £ ί>, β ® U I ·Η

Ή ϊ O H Ot OO <t in CM O N ΓΟ CM O mornrl BeW'flHS'flHV

>^>Pi - - - - ------ - - - - t> β β on 5h β fB

^ 4-i s a O \m co »-i cm vo n h ri o N mmmoi η p v oi · aiPt> !L β g Λ β o β Φ 4h > β •HK Μ,ΜΡΙιΦΟΙβϋΙ© _ιΡ·ω> οπίίϋν>> υο·π •νοβ1 ιΗ·Η 54 β Η β Ή 4J © .5 Ρ-υρίιββΦβ^ •3 ΟΟ ΟΟΟ ΟΟΟΟΟΟ Ο Ο Ο Ον ι ι PV β a β Μ 0] φ »2 mg οο οοο οοοοοο οοογΗ βωβ6ββΒΌ·-

“ Μ 3 ΟΟ ΟΟΟ OOrnOMN οοη Φ ρν bO 0] a φ VI

ο £ ρω ......... ... ,η ν ν ωβ ρ η φ ιΗ ·¥ > ΟΟ <t Μ Η ο η C0 η ΟΟΗ ,Μ β Ο Φ β β β 01 β »Λ S Ο Η 00 m<f 91 dl a a φ Φ a φ β g CM rH ΡΌΙΗΦ'υ,ηωβφ 01 β S Λ Λ S β β β V4 ·ΰ >, Η, ΦΡ VHIH-Φβ Η 01 “Τ β Φ 51 Φ Ο β »—* β a β Φ I bOeaVlSOafi V4 Tt οο ΟΟΟ ΟΟΟΟΟΟ Ο Ο Ο Ο ι ι β Φ ββ Ο bOflH V β Φ >5 Ο Ο οιηο ΟΟΟΟΟΟ Ο Ο Ο σν 8 β Ο V4 4-5 β 4->0 a ,Π on- ο <ί· <t mmocnoH μ· ο ν η η ν η (9 βΗ η β ή φ

£ ·· ·· ..... ·· Φ 4-1 > φ Vi - Vi rH

ωίη Μ Ο ι—I CM rH VO on in CM CO 00 4Ha»M01C>©O4->©-a Ο Η Ρη Ο CM CM ββ β 4J φ,η^β 41 5ι φ Ο CM Vi VI ·Η VI ·Η φ Ό φ ·Η Μ Λ CM 4J SU fiUgiJ Ο ββ Ο νι a β>β«ββρ3βΦΦΦ Φ a νΐιθΒ·Η·ιΗ<;θ>4->Ρι β V4 5Η V4 U a ι β Ο,Μ Φ a ΡΩ ,Μ β Μ 01 •Η φ φ φ CM CM CM φ Ο Ο ρν ιη β Ο <*> β β a w m m a a æ a μ · u Bo©eoaobop Οι rH rH rH CM2 Ο !3 !3 a Ο PU β ΡΗβ φ β intn in Φ β Φ 5η φ φ φ a a ι « ι φ sh ι ·η a φ bo φ υβπβ ο a a cMO ozintnHJViaain γη ·νι ν ρ η a Β β β a * * rH rH Φ β ι rH β 4J »*"ν Φ β a Φ Ή 44-Η β ·Η Ο ·Η ·Η cm3 Η !b !>,ϋ ϋ a Η ·Η fbO 4Η Φ Ω Φ V Φ > Η Β β Ή w a aaaiarHrHiiiiai-Hi φ > ρ ^ > ·η β φ a 4->

β VI (Μίΐοζονοοοοοονοο ,Μ Uga bog Η bO I bD

0 Ο a Ο · ι5η0· iViShViVioiVi β ρν·-' β Vi Vi pva β 3. s 1 4Η 234ΗΟΟΡΜ4ΗΟΟΡΗΡιΡιΡΗ4ΗΟΡΜ φ ·Η φ φ 5Η Φ Φ ·Η 01 ta. ·Ρβ· iVhVhi 15-hVhi i i I ι}_ιι ββ· bO in gibd®^gPVi5l ηΟΦ-ίΡιΡιΦιηΡιΡιΦΦΦΦνοΡι« ·η aon β β ,Μ a β a β ,Μ © © <4h iiaiiia'iiaaaai'a a a 3 a s m © a φ φ· h a a β βΦΩΗβφΦΡΗβΦΦΡΜΩΗΡΜΡΜβΦΡΜ β ρι, φ β ·Η Μ Ρ - ι β a a β •Η a ·Η a .Ρΐ · ·Η a .ti I 1 ·Η a β a VI rJ H 91 V Η ϋ Vlin Vi > Φ β φ φ api eauiPi eainh β β β eaui βπ ρ,ο νον^νορ® W W PU I rH ο. ι-Η a iaarHrHairHa®SO ·Η»β»Μΐ4Η·Η β Φ4Η φ 5η φ rH rH SHO<i5HOO<!5HOO<!<i<l3<VlO<iPli,MO· > φβ>Ο^ΡΡΦ^

Φ Φ 05Η·05Η5Η·0!Η5Η··ιι0νΐι5Ηβ 5Η CM 4-5 9] Η a Ρ Ή ι 5lH

i a bphQ ε ρι Λ q bphPhQOQQ Baa o ®a β ββφνιβ4Ηα·ΗβθΗ

Β P ΟιιΟιιιΟ'·ιι·ιΟιιΒ'>Ηΐ-Η ·ΗΦ β·Ηβ 4JV44J

Φ ·Η WVlVimSHVl5HmV4VlV45HVlVlWVl5HV44-)a<! a V4 Φ a & VI

4-1 a β^ίηβ^^ΙηβΙηΜηΙη^ΙηβΙηίηΟΦΗ o®apo 4->cm i> φ φ W 5η OHHOHHHOHHHHHHOHHagP3P3 4η β ββ^νιϋ^ φ Οι ι ι ι /t©lH4J^JH ΟΦ

a h 5¾ a a a ®a©«ao<!4HSH

15

DK 160316 B

O

TABEL IV (fortsat)

Opiatagtige aktiviteter af casomorphiner på isolerede organpræparater

GPI MVD

rel.virkn. rel.virkn.

1C„ CM(5) morph. 1C» CM(J) morph. ICvMVD

„ Nr. Forbindelse nMiSEM N -l.O -l.O nM=SEM N »1.0 -1.0 1C» GPI

5 .... -....... .i .. ----- - 1 Tyr-Pro-Phc-Pro-Gly 2260=862 5 1.0 0.03 11400= 324 6 1.0 0.03 5.0 /3-Casomorphin(5). CM(5) 6500 · 1.0 0.03 40000 * 1.0 0.03 6.2 2 Tyr-Pro-Phe-Pro-NH, 693=123 3.3 0.1 667=142 17.6 0.6 1.0

Morphiccptin. Mc 1450 * 4.5 0,1 2000 * 20.0 0.55 1.4

3 D-Phc'-CMIS) 373= 83 5 6.1 0.2 421= 81 6 27.1 0.9 I.I

4 D-Pip‘-CM(5). 21= 4 9 107.6 3.4 89= 13 6 128.1 4.4 4.2 10 Depiiorphin 5 D-Pro<-CM(5). 63= 5 7 35.9 1.1 582=139 7 19.6 0.7 9.2

Dcpralorphin 6 D-PipI-CM(5) 851=220 7 2.7 0.08 473=119 7 24.1 0.8 0.56 7 D-PnAMc. 41= 6 5 55.1 1.7 523=130 7 21.8 0.8 12.8

Dcproccpiin 8 D-Pip,.D-Pro<-Mc 106= 17 5 21.3 0.7 243= 63 6 46.9 1.6 2.3 15 9 D-Alu’.D-Pro'-Mc 74= 13 7 30.5 0.96 1490=180 6 7.7 0.27 20.1 10 D-Ala*.Tyr‘-NH,-CM(5) 100 · 65.0 2.0 200 · 200.0 5.5 2.0 11 D-Ala'.Gly^NHj-CMtf) 5000 * 1.3 0.04 8500 * 4.7 0.1 1.7 12 D.AIa'.Pro4,NH,.CM(4) 400 · 16.3 0.5 1000 · 40.0 I.I 2.5 13 Tyr-Pro-Phe-Pro.CM(4) 21900 * 0.3 0.01 84300 * 0.5 0.01 3.8 14 Gly*-NH:-CM(5) 3500 * 1.9 0.06 7000 * 5.7 0.16 2.0 15 MorphlncHCI 71= 18 5 31.8 1.0 395= 96 8 28.9 1.0 5.6 20 Nurmorphine 200 * 32.5 1.0 1100 * 36.4 1.0 5.5 25 30 35

O

16

DK 160316 B

TABEL V

Analgetisk virkning af casomorphiner efter ICV og IV indgivelse (ED200)

ICV IV

5 Rel.virkn. Rel.virkn.

CM(5) morph μπιο1 morph.

Nr. Forbindelse nmol N =1.0 =1.0 kg N =1.0 1 Tyr-Pro-Phc-Pro-Gly 129.0(13.9-202.0) 17 1.0 0.04 — — — jS-casomorphin(5), CM(5) 180.0 * 1.0 0.1 — — — 2 Tyr-Pro-Phc-Pro-NH, 13.0 (6.6-18.7) 25 9.9 0.43 — — —

Morphiccptin, Mc 220.0 * 0.8 0.08 — — — 10 3 D*PheJ-CM(5) 2.0 (0.5-3.2) 15 64.5 2.0 10.6 6 — 4 D-Pip4-CM(5). 0.6 (0.04-0.9) 18 215.0 9.3 6.8 9 0.7

Dcpilorphin 5 D-Pro«-CM(5). 0.2 (0.08-2.0) 27 645.0 28.0 2.4 6 2.0

Deprolorphin 6 D-Pip5-CM(5) 4.3 (2.9-5.8) 23 30.0 1.3 — — — 7 D-Pro4-Mc. 0.7 (0.1-1.4) 27 184.0 8.0 8.6 6 0.5

Dcproccplin 15 8 D-Pip*. D-Pro4-Mc 1.1 (0.7-1.7) 29 117.0 5.1 10.0 6 9 D-AIat.D*Pro',-Mc 1.2 (0.1-2.3) 21 107.5 4.7 — _ — 10 D-AlaI,Glj^'NH.-CM(5) 7.0 * 25.7 2.6 — — — 11 D-Alai,Glys-NH.-CM(5) 15.0* 12.0 1.2 — — — 12 D-AIa’-Mc 18.8* 10.0 1.0 — — — 13 Tyr-Pro-Phe-Pro. CM(4) 650.0 * 0.3 0.03 — — — 20 14 Gly*-NH.-CM(5) 115.0* 1.6 0.16 — — — 15 Morphine-HCI 5.6 (4.2-6.4) 21 23.0 1.0 4.7 17 1.0 25 30 35

DK 160316 B

17

Tabel VI viser den relative virkning af de ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen fremstillede.peptider (enke-phalinanaloge) på marsvine-ileum i forhold til Met-enkephalin (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met), der er sat til 100.

5

TABEL VI

Virkning af enkephalinanaloge på marsvine-ileum.

Peptid Peptid- Relativ nummmer struktur_virkning 10 Tyr-Gly-Gly-Phe-Met 100

Tyr-Gly-GIy-Phe-Met-NH. 160

Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Met-NH, 140-

Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Met-ol 360

Tyr-D-Ala-Phe-Met-NH. 120

Tyr-D-Ala-Phe-Leu-NH. 120

Tyr-D-Ala-Phe-Mei-o1 50 1 Tyr-Phe-Met 0 2 Tyr-Phe-Leu — 15 3 Tyr-Phe-Met-NH. '0 4 Tyr-Phe-Leu-NH. 0 5 Tyr-AIa-Phe-NH. ' 0 6 Tyr-Pro-Phe-NHj 19 7 Tyr-Aib-Phe-NHj -2 8 Tyr-D-Ala-Phe 0' 9 Tyr-D-Phe-Met 0 10 Tyr-D-Phe-Leu 0 11 Tyr-D-Phe-Phe 0./ 12 Tyr-D-Ala-Phe-KH. 25 13 Tyr-D-Ala-Phe-ol 24 14 Tyr-D-Pro-Phe-NH- 0.1 15 Tyr-D-Phe-Met-NH. 9 16 Tyr-D-Phe-Leu-NH- 4 17 Tyr-D-Phe-Phe-NH, 23 18 Tyr-D-Phe-D-Met 0 19 Tyr-D-Phe-D-Leu 0 20 Tyr-D-AIa-D-Phe 0.1 ° 21 Tyr-D-Phe-D-Phe 0 22 Tyr-D-Phe-D-Met-NH, 1 23 Tyr-D-Phe-D-Leu-NH- 0.2 24 Tyr-D-A!a-D-Phe-NH, 2 25 Tyr-D-Phe-D-Phe-NH. 1 26 Tyr-D-Phe-NH, 0.1 27 Tyr-D-Ala-BA (bcnzylamide) 8 28 Tyr-D-Alu-PEA (phenethylamide) 6 2q 29 Tyr-D-Ala-PPA (phenylpropylamide) 77 30 Tyr-D-Ala-PBA (phenylbutyiamide) 13 35 (I tabellen betyder endelsen -ol gruppen -OH) DK 160316B j j i i

18 I

i i j λ * . . ι/κ -

Ό < /// \ \ V

i-:/vV

2 II I I I " » I mm -2V o io ao ‘00. . ,*P 150

Tid efter injektion (min) 15

Ovenstående diagram viser resultaterne af en in vivo-bestemmelse af den analgetiske virkning af Tyr-D-Ala-phenyl-propylamid på rottehale-slag efter intracerebroventrikulær (ICV) injektion med Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Met-NH2 som standard.

20 Latenstiderne for haleslag bestemmes 20 min. før injektion af peptid og 10, 30, 60, 90 og 150 min. efter injektion.

For at teste reversibilitet indgives naloxon (4 mg/kg) IP på tidspunktet for ICV peptidinjektion af 6 μg Tyr-D-Ala-phenylpropylamid pr. mus (N = 6). 1: standard - 10 Mg/mus 25 (N = 6); 2: standard - 1 ^g/mus (N = 6); 3: Tyr-D-Ala-phe-nylpropylamid - 6 /ig/mus (N = 5) ? 4: Tyr-D-Ala-phenylpropyl-amid - 0,6 rø/mus (N = 5); 5: Tyr-D-Ala-phenylpropylamid -0,1 /zg/mus (N = 5) . På molær basis er 6 μg Tyr-D-Ala-phenyl-propylamid ækvivalent med 10 μg standardpeptid.

30 35 1.°^^

DK 160316 B

19 I-¢-171111. 60 120 180

Ovenstående diagram viser tidsforløbet af analgetisk 15 virkning af nogle casomorphinanaloge. Ad ordinaten er anført log analgetisk virkning, idet den maksimale effekt er 1,0.

Ad abscissen er anført tiden efter maksimal analgetisk virkning. 8: D-Pip2-D-Pro4-morphiceptin, 5 nmol ICV; 15: morphin, 7 nmol ICV; 4: D-Pip4-casomorphin(5), 5 nmol ICV; 2: mor-20 phiceptin, 20 nmol ICV.

Tabel VII viser halveringstiden for den analgetiske virkning af peptider fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen (nr. 3, 6 og 9).

25 TABEL VII

Halveringstid for analgetisk virkning (t/2) af casomorphiner efter ICV injektion.

Nr. Forbindelse nmol (1/2),. min 1 Tyr-Pro-Phc-Pro-Gly, CM(5) 600 34 30 2 Tyr-Pro-Phc-Pro N'Hj, Mc 20 22 3 D-Phc’-CM(5) 10 40 4 D-Pip4-CM(5). Dcpilorphin 5 55 5 D-Pro4-CM(5). Dcprolorphin 10 61 6 D-Pip’-CM(5) 5 72 7 D-Pro4-Mc, Deproccptin 10 115 35 8 D-Pip1, D-Pro4-Mc 5 216 9 D-Ala*. D-Pro4-Mc 5 99 15 Morphine-HCI 7 98 20

DK 160316 B

Kvantitative angivelser af Ø-casomorphinernes virkning i biologiske forsøgssystemer.

5 aa) Intracerebroventrikulær injektion, se tabel VII. bb) Analgesiforsøg (elektrisk stimuleret rottehale), se tabel VII.

cc) Sammenligning med morphin.

10 TABEL VIII

Dosis til 50%

Forbindelse smertehæmning /3-Casomorphin-5 500 mmol/rotte jØ-Casomorphin-5-amid 115 mmol/rotte 15 D-Ala2-ft-Casomorphin-5-amid 15 mmol/rotte

Morphin_18 mmol/rotte

Med D-Ala2-, D-Ser2-, D-Met2- og D-Arg2-j3-casomor-20 phinerne kan der ved systemisk indgivelse (intravenøs og subcutan injektion) opnås en analgetisk virkning og en an-tidiarrévirkning, hvilket ikke er muligt med de tilsvarende L-forbindelser.

25 Forklaring til tabel V: a) Forbindelsen D-Ala2-/3-casomorphin-5-amid udviser en med morphin sammenlignelig analgetisk virkning. I sammenligning med den analgetiske virkning og styrken af forbindelserne jØ-casomorphin-5 og jØ-casomorphin-5-amid er forbindelsen 30 D-Ala2-/J-casomorphin-5-amid ifølge opfindelsen væsentlig stærkere.

b) Forbindelsen D-Ala2-/?-casomorphin-5-amid er også længere analgetisk virksom end forbindelserne jS-casomorphin--5- og/eller jB-casomorphin-5-amid.

35 Dette kan føres tilbage til, at den enzymatiske ned brydning på grund af indbygningen af en D-aminosyre i amino-syresekvensens 2-stilling sker langsommere end ved pharmako-logiske peptider, der ikke indeholder nogen D-aminosyre i

DK 160316 B

21 aminosyresekvensens 2-stilling. D-Aminosyren i peptidets 2--stilling forhindrer nedbrydningen af naturlige enzymer, da de naturlige enzymer fortrinsvis spalter peptidbindinger mellem L-aminosyre.

5

Fordele af forbindelser fremstillet ifølge opfindelsen med en D-aminosyre i pos. 2 i sekvensen i forhold til kendte peptider med lignende struktur: a) Forbindelserne fremstillet ifølge opfindelsen er 10 stabile over for proteolytisk nedbrydning. Der henvises til den eksempelvis demonstrerede stabilitet af Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-amid i sammenligning med Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly.

Analoge inkubationsforsøg med de i tabel IX angivne peptider over for 15 H-Tyr-Pro-Phe-NH2 H-Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2 H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-NH2 H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-NH2 og H-Tyr-Pro-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-NH2 20 som kontroller viser, at de tilsvarende analoge med D-alanin i peptidets 2. position ikke ødelægges i helblod og plasma, dvs. at den fulde opiatvirkning også efter 90 minutters inkubation ved 37“C kan påvises uforandret.

b) Biologisk virkning for nogle af forbindelserne frem-25 stillet ifølge opfindelsen.

30 35 22

DK 160316 B

TABEL IX

Peptid IC50 (μΜ) H-Tyr-D-Ala-Phe-NH2 1,7 5 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-NH2 0,4

H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-NH2 5,O

H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-Pro-NH2 8,0 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Gly-Pro-Ile-NH2 7,O H-Tyr-D-Ala-Phe-Hyp-Tyr-NH2 0,02 10 H-Tyr-D-Ala-Phe-Pro-Tyr-NH2 O,1 H-Tyr-D-Ser-Phe-NH2 1,0 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-NH2 0,2 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-Gly-NH2 2,0 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-Gly-Pro-NH2 3,0 15 H-Tyr-D-Ser-Phe-Pro-Tyr-NH2 0,05 H-Tyr-D-Ser-Phe-Hyp-Tyr-NH2 0,01

Normorphin 0,2

Tabel IX viser opiatvirkningen for nogle af peptiderne ifølge opfindelsen, målt på marsvineileums isolerede længde-20 muskelpræparat (med hensyn til præparering af marsvineileum og forsøgsopstilling henvises til Schulz og Goldstein, J. Pharmakol. exp. Ther., 183. 404-410 (1972)). IG5o-værdierne er anført, dvs. koncentrationen (μΜ) af de anførte peptider i det organbad, der bevirker en 50%'s hæmning af marsvine-25 ileums elektrisk inducerede kontraktionsamplitude.

Normorphin er anført til sammenligning. Den hæmmende virkning af de enkelte peptider kan ophæves og blokeres af den specifikke opiatantagonisk Naloxon® og må således anses for opiatspecifik.

30 Peptiderne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen udviser også over for forbindelser, der ikke som peptiderne ifølge opfindelsen har en aminosyre med D-konfiguration i 2-stillingen, en særlig udpræget høj enzymatisk stabilitet. Den stærkere virkning af de pharmako-35 logisk aktive peptider ifølge opfindelsen i forhold til kendte pharmakologisk aktive peptider fremgår af Peptides, bd. 3, s. 793-797, hvori værdier for jø-casomorphinernes

DK 160316 B

23 opiatvirkning er angivet. Alle forbindelser ifølge opfindelsen kan betegnes som kun lidt toksiske.

Således udviser f.eks.

H-Tyr - D-Ala - Phe - Pro - NH2 5 a) efter oral indgivelse af 300 mg pr. kg (p.o) ingen toksiske fænomener, b) efter intraperitoneal (i.p.) indgivelse af 200 mg pr. kg ligeledes ingen toksiske fænomener.

Heraf fås værdier for 10 LD50 større end 300 mg pr. kg p.o., LD50 større end 200 mg pr. kg i.p.

I Tabel IX er der anført fysiske egenskaber af peptider fremstillet iføgle opfindelsen (enkephalinanaloge).

15 20 25 30 35 24

DK 160316 B

TABEL IX

Fysiske egenskaber af enkephalin-analoge

Peptide · :k(CCD)*- ' HVEt- TLC+.

5 pH 2.8 " pH 5.0 , . 834 5513

Tyr-Phe-Met 2.33 0.71 0.19 0.63 0.72

Tyr-Phe-Leu 3.17 ins§ ins .. . åns ins

Tyr-Phe-Mct-NH, , 1.22 0.41 . 0.55 . 0.64 0.85

Tyr-Phe-Leu-NH, 1.78 0.45 . 0.53 : 0.65 0.85

Tyr-Ala-Phe-NH; 0.61 · 0.49 0.58 0.51 0.83

Tyr-Pro-.Phe-NH, 1.00 ·· 0.49 .-· 0.57 0.50 -· 0.82 ηη Tyr-Aib-Phe-NH, Ί.17 . 0.47 . .0.55. 0.57 0.91 ±U Tyr-D-Ala-Phe 1.44 -:.-0.37 0.10 . · 0.-57.-0.64

TynD-Phe-Met -.-. . -2.-70 ' 0.71 0.18 0.58 ·. 0.71

Tyr*.D-Phe-Leu · ^3.76 ·· - -ins . ··', ins ins ins

TyrO-Phe-Phe- 4.00' · 0.67 ..- 0.13 0.60 . 0.71 -Tyr-D-Ate-Phe-NH2. 0.82 0.49 ,0.56 - .0.57'' .0.68-

Tyr^D-AIa.-Phe-o! K86 · . 0.50 . 0.57 0.64-. 0.81

Tyr-D-Pro-Phe-NH. - · 1.22 - il 0.45 0.54- ,.0.55- : -0.85

Tyr-D-Phe-Met-NHj 1.63 ; ‘ 0.36 :: 0.52 ' '0.62 0.82 - 15 Tyr-D-Phe-Leu-NH.. ·.. 1.94 0.46 .. 0,52 0:64 <· 0.83

Tyr-D-Phe-Phe-NH. ·. ·· 2.85 - 0.38 -0.49 - 0.62 i.:. 0.78

Tyr-D-Phe-D-Met · 2.33 · 0.31 0.14 -0.60 0.69

Tyr-D-Phe-D-Leu j 3.76 ' 0.39 . ,Q'.08 ·.· 0.64 - :0.75

Tyr-D-AIa-D-Phe · ·· 1.38 0.35 - 0.I1: 0,63 - i.· 0.64.

Tyr-D-Phe-D-Phe :,· 3.55 ' 0.29 - .0.00 0,65- - -f0.70'<:

Tyr-D-Phe-D-Met-NHj 1.33 “ 0.46 .:0.-56:. -.0.66 ::.0.78 .

Tyr-D-Phe-D-Leu-NHj .2.03 0.45 . 0:58 --. 0.67:.- 0^4 '

Tyr-D-Ala-D-Phe-NHS . 0.89 · 0.48 0.56 -. 0.57. -· '0.67' 20 - Tyr-D-Phc-D-Phe-NH; 2.45 0.43 0.47 - '0:64 . - --0.84

Tyr-D-Aia-BA 1.56 · 0.54 . 0.62. : i - .0.67. ' 0;81

Tyr-D-Ala-PEA - 1.70 . 0.54 . -.0.60-1 · ... 0:62 : 0.81:

Tyr-D-Ala-PPA 3.00 0.49 . '0.54-·. . .-0.65 . 0.87

Tyr-D-Ala-PBA . ' 4.26 - 0.41 0.53 0.67 0.90

Tyr-D-Phe-NH. . -1.13 - 0.54 0.65 0.56 0.72 (I tabellen betyder endelsen -ol gruppen -OH).

25 * Den eksperimentelt bestemte fordelingskoefficient ved modstrømsfordeling i systemet n-BuOH:AcOH:H2O (4:1:5). Mobilitet i forhold til Lys = 1,00 ved højspændingselek-troforese i IN AcOH (pH 2,8) og pyridinacetatpuffer (pH 5,0).

30 t Rf-værdier ved tyndtlagschromatografi på Merck silicagel-overtrukne glasplader i systemet n-BuOH:AcOH:H2O (8:3:4) og EtOAc:pyridin:AcOH:H2O.

§ Peptidet er uopløseligt i opløsningsmidlerne anvendt til opløsning af prøver ved TLC og HVE.

35 Forkortelser: BA = benzylamid; PEA phenethylamid; PPA = phenylpropylamid; PBA = phenylbutylamid.

25

DK 160316 B

0 Human- og veterinærlægemidlerne er pharmaceuti- ske præparater, der foruden ikke-toksiske, inaktive, pharma- ceutisk egnede bærestoffer indeholder et eller flere af de aktive stoffer, der fremstilles ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, eller som består af et eller flere af de her 5 omhandlede aktive stoffer.

Af de pågældende aktive stoffer kan der fremstilles pharmaceutiske præparater i enhedsdoseringsformer. Dette vil sige, at præparaterne foreligger som f.eks. tabletter, dragées, kapsler, piller, suppositorier og ampuller, hvis 10 indhold af aktivt stof varer til en brøkdel eller et multiplum af en enkeltdosis. Doseringsenhederne kan f.eks. indeholde 1, 2, 3 eller 4 enkeltdoser eller det halve, en tredjedel eller en fjerdedel af en enkeltdosis. En enkeltdosis indeholder fortrinsvis den mængde aktivt stof, der indgives 15 ved en indgivelse, og som almindeligvis svarer til en hel, en halv, en tredjedel eller en fjerdedel af en dagsdosis.

Ved ikke-toksiske, inaktive pharmaceutisk egnede bærestoffer skal forstås faste, halvfaste eller flydende 20 fortyndingsmidler, fuldstoffer og præparathjælpestoffer af enhver art.

Foretrukne pharmaceutiske præparater er tabletter, dragéer, kapsler, piller, granulater, suppositorier, opløsninger, suspensioner og emulsioner, pastaer, salver, geler, 25 cremer, lotioner, pudere og sprays.

Tabletterne, dragéerne, kapslerne, pillerne og granulaterne kan indeholde det eller de aktive stof(fer) foruden gængse bærestoffer, såsom fyld- og strækmidler (f.eks. stivelser, mælkesukker, rørsukker, glukose, mannit og kie-30 selsyre), bindemidler (f.eks. carboxymethylcellulose, algi-nater, gelatine, polyvinylpyrrolidon), fugtighedsbevarende midler (f.eks. glycerol), disintegreringsmidler (f.eks. agaragar, calciumcarbonat og natriumbicarbonat), opløsningsforhalende midler (f.eks. paraffin) og resorptionsfremmende mid- 35

DK 160316B

26 0 ler (f.eks. kvaternære ammoniumforbindelser), 'adsorptionsmidler (f.eks. kaolin og bentonit) og glidemidler (f.eks. talkum, calcium- og magnesiumstearat og faste polyethylenglykoler) eller blandinger af de anførte stoffer. ί

Tabletterne, dragéerne, kapslerne, pillerne og gra- c nulaterne kan være forsynet med gængse overtræk, der eventuelt indeholder opacificeringsmidler, og også være således sammensat, at de afgiver det eller de aktive stof(fer) udelukkende eller fortrinsvis i en bestemt del af mave-tarmka- ! nalen, eventuelt protraheret, idet der som indlejringsmidler | 10 f.eks. kan anvendes polymerstoffer og voksarter. j

Det eller de aktive stof(fer) kan eventuelt sammen j med et eller flere af de ovenfor anførte bærestoffer også i foreligge i mikroindkapslet form til opnåelse af en forsinket virkning.

15

Suppositorier kan foruden det eller de aktive stof-(fer) indeholde gængse vandopløselige eller vanduopløselige bærestoffer, f.eks. polyethylenglykoler, fedtstoffer, f.eks. kakaosmør og højere estere (f.eks. C^-alkohol med g-fedt syre) eller blandinger af disse stoffer.

20

Salver, pastaer, cremer og geler kan foruden det eller de aktive stof(fer) indeholde de gængse bærestoffer (f.eks. animalsk eller vegetabilsk fedtstof, voksarter, paraffiner, stivelser, tragant) eller blandinger af disse stoffer.

25

Opløsninger og emulsioner kan foruden det eller de aktive stof(fer) indeholde de gængse bærestoffer såsom opløsningsmidler, opløseliggørende midler og emulgatorer, f.eks. vand, ethylalkohol, isopropylalkohol, ethylcarbonat, ethylacetat, benzylalkohol, feenzylberizdat, propylenglykol, 30 olier, især bomuldsfrøolie, jordnøddeolie, majskimolie, o- livenolie og sesamolie, glycerol, polyethylenglykoler eller blandinger af disse stoffer.

Til parenteral indgivelse kan opløsningerne og e- mulsionerne også foreligge i steril og blodisotonisk form.

35

DK 160316 B

27 O Suspensioner kan foruden det eller de aktive stof- (fer) indeholde gængse bærestoffer såsom flydende fortyndingsmidler (f.eks. vand, ethylalkohol, propylenglykol), suspensionsmidler (f.eks. ethoxylerede isostearylakoholer, po-lyoxyethylensorbit- og sorbitanestere, mikrokrystallinsk 5 cellulose) eller blandinger af disse stoffer.

De nævnte præparatformer kan også indeholde farvestoffer konserveringsmidler samt lugt- og smagsforbedrende tilsætningsstoffer, f.eks. pebermynteolie og eukalyptusolie samt sødemidler, f.eks. saccharin.

10 De terapeutisk aktive forbindelser forekommer i de ovenfor anført pharmaceutiske præparater fortrinsvis i en koncentration på ca. 0,1-99,5, især på ca. 0,5-95% beregnet på vægten af den samlede blanding.

De ovenfor anførte pharmaceutiske præparater kan 15 foruden de her omhandelde aktive stoffer også indeholde andre pharmaceutisk aktive stoffer.

Fremstillingen af de ovenanførte pharmaceutiske præparater sker på gængs måde efter kendte metoder, f.eks. ved at blande det eller de aktive stof(fer) med bærestof(fer).

20 De aktive stoffer eller de pharmaceutiske præpara ter kan anvendes lokalt, oralt, parenteralt, peritonealt og/ eller rectalt, fortrinsvis parenteralt.

I reglen betragtes det inden for humanmedicin som fordelagtigt at indgive det eller de foreliggende aktive 25 stoffer i en samlet mængde på ca. 5-500, fortrinsvis 50-250 mg hver 24 timer, eventuelt i form af flere enkelte indgivelser, til opnåelse af det ønskede resultat. En enkeltindgivelse indeholdet det eller de aktive stof(fer) i mængder på ca. 10 til ca. 300, fortrinsvis 50-200 mg/dosis. Det 30 kan dog være nødvendigt at afvige fra den nævnte dosering afhængigt af patienten og dennes legemsvægt, af sygdommens art og sværhedsgrad, præparatets art og lægemidlets indgi- 35 28

DK 160316 B

O

velsesvej samt det tidsrum eller interval, hvormed indgivelsen finder sted. Det kan således i enkelte tilfælde være tilstrækkeligt at anvende mindre end den ovennævnte mængde aktivt stof, medens man i.'andre tilfælde må overskride den anførte mængde aktivt stof.

5

Bestemmelse af den til enhver tid nødvendige optimale dosering og indgivelsesmåde af det aktive stof kan dog let foretages af enhver fagmand ud fra hans fagkundskab.

10 15 20 25 30 35

Claims (6)

1. Analogifremgangsmåde til fremstilling af Ø-casomor-phinanaloge peptider med den almene formel H-Tyr-X-A-R 5 H-Tyr-X-A-Pro-R H-Tyr-X-A-Pro-B-R H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-R H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-C-R H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-C-Pro-R eller 10 H-Tyr-X-A-Pro-B-Pro-C-Pro-D-R hvor Tyr er aminosyren L-tyrosin, Pro er aminosyren L-prolin, A, B, C og D er aminosyrerne Pro, Ala, Thr, Val, Tyr, Phe, Gly, Ile, Asn, Met i stereokemisk L-form, hvorhos en C-ter-minal gruppe A, B, C eller D tillige kan være -Met(0)-0H 15 med formlen CH3 i S—> 0 i ch2 i

20 CH2 i -nhchch2oh. R kan være -OH, lavere alkoxy eller -NH2, og X er aminosyrerne Pro, Ala, Thr, Val, Tyr, Phe, Gly, Ile, Asn, Met i 25 den stereokemiske D-form, deres pharmakologisk acceptable syreadditionssalte eller metalkomplekser, kendetegnet ved, at de enkelte aminosyrer og/eller tilsvarende mindre peptidfragmenter ved knytning af peptidbindingerne i den ønskede rækkefølge overføres til de ønskede pharmakolo-30 gisk aktive peptider under midlertidig beskyttelse af eventuelle aktive grupper, som ikke skal deltage i peptiddannelsesreaktionen, især beskyttelse af aminogrupperne med car-bobenzoxychlorid og beskyttelse af syregrupper som ester, idet syntesen eventuelt kan finde sted som fastfasesyntese 35 på egnede bærermaterialer, fortrinsvis polystyren.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg- DK 160316 B n e ved, at der fremstilles en /3-casomorphinanalog, hvori X er D-alanin, D-threonin eller D-valin.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den endestillede, C-terminale aminosyre fore- 5 kommer som amid eller ester.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at i et peptid med ulige antal grupper er den C-terminale aminosyre me'thionin.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg-10 net ved, at peptiderne er penta-, hepta- eller nonapep- tider.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det endestillede methionin foreligger som -Met(O)-OH med formlen 15 CH3 i S—>0 i ch2 i 20 -nhchch2oh. 25