DK159164B - Fremgangsmaade til fremstilling af humant leukocytinterferon i krystallinsk form - Google Patents

Description

i

DK 159164 B

Humane leukocytinterferoner, der betegnes a±, c*2, β±, 02 > 7ΐ» 72» 73» 74 og 75, og som er afledt af virusinducerede normale eller leu-ksmiske donorers leukocyter, er blevet renset til homogenitet, jfr.

USA patentskrift nr. 4.289.690, udstedt den 15. september 1981. 1 den 5 senere tid er der blevet anvendt rekombinant DNA-teknologi til at frembringe den mikrobielle fremstilling af flere forskellige humane leukocytinterferoner (IFN-o), hvis aminosekvens har en homolog! i størrelsesordenen 70S eller mere i forhold til hinanden som beskrevet i Nature 290, 20-26, 1981. De specifikke rekombinante humane leuko-10 cytinterferoner (rIFN-o), der er beskrevet i denne publikation, er rIFN-aA, -aB, -oC, -aD, -aE, -aF, -oG og -aH. rIFN-al og rIFN-aJ er desuden blevet beskrevet i tysk offentliggørelsesskrift nr.

31 25 706. Yderligere beskrives i tysk offentliggørelsesskrift nr.

31 44 469 den mikrobielle fremstilling via rekombinant DNA·teknologi 15 af hybride leukocytinterferoner. Eksempler på sådanne hybride leukocytinterferoner omfatter: rIFN-α A1-91 I>93_166; di_92 A92-165' Al-62 D64-166'*

Dl-63 A63-165; Al-91 B93-166' Al-91 F93-166; A1 — 91 G93-166' Al-150 I15l-165; Bl-92 A92-165'

Bl-92 D93-166' Bl-92 F93-166' Bl-92 G93-166;

Dl-92 B93-166' Dl-92 F93~166; Dl-92 G93-166'

Fl-92 A92-165* Fl-92 B93-166' Fl-92 D93-166?

Fl-92 G93-166' and Xl-151 A152-166*

De ovennævnte naturlige, rekombinante og hybride humane leukocyt-20 interferoner udgør en klasse af proteiner, der er ejendommelige ved en udtalt evne til at meddele deres målceller en virusresistent tilstand. Tillige kan disse interferoner virke for en inhibering af celleformering og en modulering af immunrespons. Disse egenskaber har foranlediget den første kliniske anvendelse af rIFN-aA og rIFN-aD som 25 terapeutiske midler til behandling af virusinfektioner og neoplas-tiske sygdomme.

Krystallisation af et stof tilfredsstiller et af de klassiske kriterier for homogenitet. Ydermere kan krystallisationsprocessen i sig selv udgøre et nyttigt rensningstrin. Tilgengeligheden af store ord-

2 DK 159164 B

nede krystaller af humane leukocytinterferoner muliggør også bestemmelsen af molekylets tertiære struktur tinder anvendelse af røntgendiffraktion.

Der er blevet udviklet adskillige teknikker til krystallisation af 5 proteiner, men der er ikke blevet opdaget nogen generel fremgangsmåde, og mange proteiner forbliver ukrystalliserede. Krystallisation af proteiner er således en uforudsigelig teknik, der benytter sig af forsøg/fej1-metoder blandt mange mulige alternative metodikker.

i

En af de mest anvendte fremgangsmåder omfatter tilsætning af et kry-10 stalliseringsmiddel til den vandige proteinopløsning, hvilket krystalliseringsmiddel sædvanligvis er et salt såsom ammoniumsulfat eller ammoniumcitrat eller et organisk opløsningsmiddel såsom ethanol eller 2-methyl-2,4-pentandiol. Sådanne fremgangsmåder tilvejebringer imidlertid ikke en hensigtsmæssig måde til fremstilling af krystal-15 linske humane leukocytinterferoner.

Et alsidigt krystalliseringsmiddel er polyethylenglycol (PEG), som kombinerer nogle af saltenes og de organiske opløsningsmidlers egenskaber, jfr. K.B. Uard et al., J. Mol. Biol. 98, 161 (1975) og A.

McPherson, Jr., J. Biol. Chem. 251, 6300 (1976). I overensstemmelse 20 med den foreliggende opfindelse har det nu vist sig, at polyethylenglycol og især polyethylenglycol 4000 med held kan anvendes til at krystallisere de ovennævnte humane leukocytinterferoner, især rlFN-aA.

Den foreliggende opfindelse angår således en fremgangsmåde til frem-25 stilling af IFN-a, hvilken fremgangsmåde omfatter behandling af en vandig opløsning, som indeholder I FN-o i en koncentration på mindst ca. 0,2 mg/ml, med polyethylenglycol.

De humane leukocytinterferoner, der anvendes som udgangsmaterialer i nærværende krystallisationsfremgangsmåde, kan isoleres ved fremgangs-30 måder , som tilvejebringer forbindelserne i en i det væsentlige homo gen tilstand. Sådanne fremgangsmåder omfatter højtryksvæskechromato-grafi (HTVC) som beskrevet i det ovennævnte USA patentskrift nr.

4.289.690, affinitetschromatografi under anvendelse af et monoklonalt

3 DK 159164 B

antistof for humant leukocytinterferon støttet på et søjlebæremateri-ale som beskrevet i fx T. Staehelin et al., J. Biol. Chem. 256, 9750-9754 (1981), eller en hvilken som helst anden fremgangsmåde, der tilvej ebringer humant interferon med tilstrækkelig renhed (>95X) og i 5 en tilstrækkelig koncentration (>0,2 mg/ml interferon).

Der knytter sig en række vigtige fordele til det at kunne opnå humane leukocytinterferoner i krystallinsk fora. Som ovenfor anført er en udtalt fordel den yderligere rensning, som fås ved krystallisations-trinet, der kan fjerne forskellige andre urenheder, end det kan opnås 10 med HTVC eller sædvanlig søjlechromatografi. Ydermere kan krystallinske humane leukocytinterferoner lagres og forsendes ved stuetemperatur uden den risiko for proteasekontamination, som er mulig ved lagring af interferonerne i opløst tilstand. Andre teknikker til fremstilling af proteiner såsom lyofilisering vides at forårsage en vis 15 denaturering af interferon, hvilket giver sig udtryk i et tab i værdien af den specifikke aktivitet af prøver, der tages før og efter sådanne fremgangsmåder.

En egnet fremgangsmåde til krystallisation af en af de humane leukocytinterferoner, nemlig rIEN-aA, er beskrevet nedenfor i eksemplet.

20 De andre humane leukocytinterferoner, der har en høj grad af sekvens-homolog!, kan krystalliseres på analog måde.

EKSEMPEL

4 ml rIFN-otA (0,2 mg/ml) blev dialyseret natten over ved 4eC mod 0,01M vandigt HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonsyre), 25 der var indstillet til en pH-værdi på 7,1 med ammoniumhydroxid. Opløsningen blev koncentreret fem gange ved inddampning, gendialyseret mod 0,01M HEPES (pH-værdi 7,1) og yderligere koncentreret til 5 mg/ml. Den endelige koncentration blev bestemt ved ultraviolet spek-trofotometri. 1

En glasplade med ni fordybninger blev siliconiseret før anvendelsen ved at dyppe den i 5% (v/v) dimethyldichlors ilan i carbontetrachlorid og derefter brændt ved 180°C. Den blev vasket med vand og brændt

DK 159164 B

4 igen. I hver af fire fordybninger anbragtes 20 μΐ-iter af interferonopløsningen. Til hver fordybning sattes en PEG 4000-opløsning (200 mg/ml), som indeholdt ΝβΝβ (0,5 mg/ml), til slutkoncentrationer på 20, 40, 60 og 100 mg/ml. Dråberne blev omgående blandet under anven-5 delse af en mikropipette, og pladen blev anbragt over en opløsning af 100 mg/ml PEG 4000 indeholdt i et krystalliseringsfad. Fadet blev forseglet og holdt ved 4®C. Efter 1-3 dage opstod der krystaller i hver af fordybningerne. Efter yderligere nogle dage opstod der større krystaller i nogle af dråberne.

10 Krystallerne blev adskilt fra vaskefaserne ved centrifugering, vasket med 0.05H HEPES (pH-vardi 7,1), der indeholdt 10X PEG 4000, og opløst igen i 0,05M HEPES, pH-vardi 7,1. Bioassays af de opløsninger, der er fremstillet ud fra en lOX's PEG 4000-blanding, viste, at krystallerne indeholdt interferonaktivitet. Det meste af interferonaktiviteten 15 (>90X) blev udvundet i krystallerne. Det krystalliserede protein kunne ikke skelnes fra ukrystalliseret rIFN-aA ved gelelektroforese, hvilket bekræfter, at det krystallinske produkt er uspaltet og intakt.

TABEL

20

Udvinding af interferon i krystaller

Krystaller Supernatant

Krystallisa- Antiviral Udvinding Antiviral Udvinding tionsbetin- aktivitet i procent aktivitet i procent gelse (enheder/- (enheder/- ml) ml) pH-værdi 5 4,0xl08 (94) 2,5x107 (6) pH-værdi 7 6,0xl08 (99) 4,5x106 (1) pH-værdi 8 8,0xl08 (99) 4,5x106 (1)

Det er ikke nødvendigt at krystallisere interferon A fra koncentrerede opløsninger. Mikrokrystaller optræder i opløsninger af 0,2 mg/ml interferon og 10Z PEG. Denne metode kan vare nyttig til at koncen-

DK 159164 B

5 trere fortyndede opløsninger af interferon. Som det fremgår af ovenstående tabel, frembringer krystallisation under svagt basiske betingelser, dvs. ved en pH-værdi på ca. 8, krystallinsk rlFNroA i et kvantitativt udbytte og med den højeste specifikke aktivitet.

5 Humant leukocytinterferon i krystallinsk fonn kan anvendes på samme måde i farmaceutiske præparater som de tidligere anvendte og .beskrevne rensede homogene interferoner, dvs. naturlige, rekombinante og hybrid-rekombinante humane leukocytinterferoner.

Claims (6)

6 DK 159164 B FATENTKRAV

1. Fremgangsmåde til fremstilling af humant leukocytinterferon i krystallinsk form, kendetegnet ved, at en vandig opløsning, som indeholder 5 humant leukocytinterferon i en koncentration på mindst ca. 0,2 mg/ml, behandles med polyethylenglycol.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det humane leukocytinterferon er valgt blandt naturligt, rekombinant og hybrid-rekombinant humant leukocyt-10 interferon.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det humane leukocytinterferon er rekombinant humant leukocytinterferon A.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, 15 kendetegnet ved, at polyethylenglycolet (PEG) er PEG 4000, som er til stede i en slutkoncentration på ca. 20-100 mg/ml.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at pH-v*rdien tinder krystalliseringen er ca. 8,0. 1

6. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at koncentrationen af interferonet til krystallisationsfremgangsmåden er ca. 5,0 mg/ml.