DK158956B - Fremgangsmaade ved kinetisk eller endepunktsanalyse for uorganisk phosphat og reagens til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

i

DK 158956 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde ved kinetisk analyse for sur phosphatase og reagens til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden .

5 Fra Bergmeyer, H.U., "Methoden der enzymatischen Analyse", 3. Aufl.,

Bd. 1, s. 532-543, 826-829 og 923-927, Verlag Chemie, Weinheim/Berg-strasse, 1974, kendes metoder til aktivitetsbestemmelse af phospho-glucomutase, 6-phosphogluconatdehydrogenase, phosphoglucoseisomerase og 3-phosphoglyceratkinase. Phosphoglucomutaseaktivitet bestemmes 10 under anvendelse af glucose-6-phosphatdehydrogenase som indikatorenzym. Endvidere kan α-amylaseaktivitet bestemmes ved at måle maltose og glucose, der hidrører fra nedbrydningen af stivelse med α-amylase. Fra "J. Biol. Chem.", 199, 153-163 (1952) og M. Biol. Chem.", 236, 2186-2189 (1961) er det kendt, at α-maltose med enzymet 15 maltosephosphorylase under tilstedeværelse af phosphationer kan omdannes til glucose og Ø-D-glucose-l-phosphat ved, at /J-D-glucose-1-phosphat danner et substrat for phosphoglucomutase til dannelse af glucose-6-phosphat. I "Analytical Biochemistry", 57, 303-305 (1974) beskrives en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af maltose 20 under anvendelse af maltosephosphorylase koblet med et glucoseoxi-dasesystem. Fra "Analytical Biochemistry", 53, 108-114 (1973) kendes en fremgangsmåde til spektrofotometrisk bestemmelse af /i-glucose-1-phosphat i nærvær af a-glucose-l-phosphat og glucose-6-phosphat og under anvendelse af Ø-mutase. I "J. Gen. Appl. Microbiol.", 14, 25 359-371 (1968) beskrives oprensning af og 6-phosphogluconatdehydro- genases egenskab til oxidativ decarboxylering af 6-phosphogluconat under dannelse af ribulose-5-phosphat og C02· Endvidere beskrives der i "Årztl. Lab.", 17, 340-343, 1971, bestemmelse af a-amylaseak-tiviteten sammenkoblet med α-glucosidase, hexokinase og glucose-6-30 phosphatdehydrogenase som indikatorenzymer. I "Agr. Biol. Chem.", 37, 2813-2819, 1973, beskrives oprensning af maltosephosphorylase og undersøgelse af dette enzyms specificitet med henblik på anvendelse af samme til kvantitativ bestemmelse af maltose i nærvær af stivel-seshydrolysater. Fra "Methods of Enzymatic Analyses", vol. 1, 35 Academic Press, New York, s. 109-110 og 123-127, 1974, kendes endvidere bestemmelse af glucose ved en "hjælpereaktion" under anvendelse af et "hjælpeenzym", som omdanner glucose til glucose- 6-phosphat, der kan indgå som substrat i en NADP-afhængig indikatorreaktion. Reaktionerne er således koblede. Der kan desuden 2

DK 158956 B

udføres flere "hjælpereaktioner" efter hinanden.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde ved analyse for uorganisk phosphat, med hvilken 5 fremgangsmåde der tilvejebringes en metode til hurtig, enkel, pålidelig og reproducerbar bestemmelse af uorganisk phosphat i en forelagt prøve. Dette formål opnås med fremgangsmåden ifølge opfindelsen, som er ejendommelig ved, 10 (a) at der ved en pH-værdi på fra ca. 6 til ca. 8 udføres koblede reaktioner, som indbefatter: (I) omsætning af maltose med en uorganisk phosphatprøve i nærvær af maltosephosphorylase under dannelse af glucose og /?-D-glucose-l-phosphat, 15 (II) omsætning af Ø-D-glucose-l-phosphat i nærvær af /J-D-phosphoglucomutase under dannelse af glucose-6-phosphat, og (Ill)omsætning af glucose-6-phosphat i nærvær af glucose- 6-phosphatdehydrogenase og et co-enzym i form af 20 /J-nicotinamid-adenindinucleotid, /}-nicotinamid- adenindinucleotidphosphat eller blandinger heraf under dannelse af den reducerede form af co-enzymet og 6-phosphogluconat, og (b) at dannelsen af det reducerede co-enzym måles, idet det 25 uorganiske phosphat, som skal bestemmes, er den begrænsen de komponent, og der benyttes en ikke-phosphatpuffer til at regulere pH-værdi en.

Fremgangsmåden kan udføres dels som en kinetisk analyse, ved hvilken 30 dannelseshastigheden for det reducerede co-enzym måles, og det uorganiske phosphat, som skal bestemmes, er hastighedsbegrænsende, og dels som en endepunktsanalyse, ved hvilken den totale produktion af det reducerede co-enzym måles, hvorhos maltose og co-enzym er til stede i molært overskud i forhold til det uorganiske phosphat, som 35 skal bestemmes. Begge måder at udføre fremgangsmåden på er foretrukne udførelsesformer for opfindelsen.

Både den kinetiske og endepunktsmetoden til analyse for uorganisk phosphat ifølge nærværende opfindelse er således baseret på følgende 3

DK 158956 B

reaktioner: ___ Mp

(I) maltose + PO^ _glucose + Ø-D-G-l-P

5 (II) jS-D-G-l-P ^~PGM ^ G-6-P

(III) G-6-P + NAD G6PDH ^ 6-P-G + NADH

Ved en foretrukken udførelsesform for den kinetiske analyse for 10 uorganisk phosphat kan følgende reaktion også benyttes: (IV) 6-P-G + NAD 6~PDH ^ ribulose-5-P + NADH + C02

Nedenstående forkortelser er anvendt i ovenstående reaktionsskemaer 15 og i det følgende:

Forkortelser: P04"" : phosphation MP : maltosephosphorylase 20 jS-D-G-l-P : /i-D-glucose-l-phosphat /i-PGM : jS-D-phosphoglucomutase G-l,6-diP : D-glucose-l,6-diphosphat G-6-P : glucose-6-phosphat 6-P-G : 6-phosphogluconat 25 G6PDH : glucose-6-phosphatdehydrogenase 6-PDH : 6-phosphogluconatdehydrogenase NAD : /J-nicotinamid-adenindinucleotid NADH : reduceret form af /1-nicotinamid-adenindinukleotid 30 Med hensyn til den første af ovennævnte reaktioner:

(I) maltose + P04’"" MP v, glucose + Ø-D-G-l-P

omsættes maltosen med phosphationer i prøven under anvendelse af 35 maltosephosphorylase som enzymatisk katalysator til dannelse af glucose og )3-D-glucose-l-phosphat.

De uorganiske phosphationer kan hidrøre fra en hvilken som helst prøve, som er forligelig med reagenssystemet.

4

DK 158956 B

Maltosephosphorylase er et enzym, som katalyserer reaktionen mellem maltose og uorganisk phosphat.

Den foretrukne kilde for maltosephosphorylase er en stamme af 5 mikroorganismen Lactobacillus brevi s (ATCC 8287), som er blevet dyrket af Beckman Instruments, Inc., Microbics Operations, Carlsbad, Californien, og enzymet er blevet ekstraheret og renset ved sædvanlige fremgangsmåder derfra. Andre kilder for dette enzym er stammer af Neisseria meninaitides. Neisseria perf1ava og andre Lactobaci1 -10 li-stammer.

Med hensyn til den anden af ovennævnte reaktioner: (II) /J-D-G-l-P ^"PGM ^ G-6-P 15 katalyserer enzymet /J'-phosphoglucomutase (/J-PGM) omdannelsen af /J-D-glucose-l-phosphat til glucose-6-phosphat. Den foretrukne kilde for /J-PGM er Lactobacillus brevis (ATCC 8287). Den dyrkes og renses ved sædvanlige enzymrensningsmetoder. Andre kilder er stammer af 20 Neisseria meninaitides. Neisseria perf1ava og Eualena gracilis.

Fortrinsvis er glucose-l,6-diphosphat (G-l,6-diP) til stede i enzymsystemet for at virke som cofaktor for /J-PGW. /3-PGM kræver Ø-formen af G-l,6-diP for aktivitet, men det antages, at α-formen af 25 denne cofaktor også kan virke.

+0 iO

Fortrinsvis er der også divalente kationer i form af Mn , Mg ,

Co+2, Zn+2 eller Ni+2 til stede i enzymsystemet for at virke som cofaktor for β-PGM. Kati onerne Mn+2, Mg+2 eller Co+2 foretrækkes 30 fremfor Zn+2 eller Ni+2.

Hvad angår den tredie af ovennævnte reaktioner: (III) G-6-P + NAD G6PDH ? 6-P-G + NADH 35 omsættes glucose-6-phosphat med /J-nicotinamid-adenindinucleotid og G6PDH under dannelse af 6-phosphogluconat og NADH.

Den foretrukne kilde til G6PDH er Leuconostoc mesenteroides (ATCC

5

DK 158956 B

12291), men det kan fås fra andre kilder.

Formålet med den fjerde, eventuelle reaktion er at forøge sensitiviteten og nøjagtigheden af analysen ved at forøge den dannede mængde 5 NADH: (IV) 6-P-G + NAD 6~PDH ) ribulose-5-P + NADH + C02

Den foretrukne kilde til enzymet 6-PDH er Leuconostoc mesenteroides 10 (ATCC 12291), hvorfra enzymet er blevet udvundet og renset ved sædvanlige kendte fremgangsmåder, men det kan fås fra andre kilder.

Ved endepunktsanalysen for uorganisk phosphat er det nødvendigt, at NAD (og NADP, hvis dette anvendes) er til stede i molært overskud i 15 forhold til det uorganiske phosphat, som skal bestemmes.

Ved den kinetiske analyse for uorganisk phosphat er det nødvendigt, at mængden af uorganisk phosphat er hastighedsbegrænsende.

20 Ved såvel den kinetiske analyse som endepunktsanalysen bestemmes mængden af phosphationer ved at måle dannelsen af NADH, NADPH eller blandinger heraf, som er dannet ved de koblede enzymreaktioner ifølge den foreliggende opfindelse. Specielt ved endepunktsanalysen for uorganisk phosphat bestemmes mængden af phosphationer ved at 25 måle den totale mængde NADH, NADPH eller blandinger heraf frembragt ved den koblede enzymreaktion ifølge opfindelsen, og ved den kinetiske analyse for uorganisk phosphat bestemmes mængden af phosphationer ved at måle hastigheden for dannelsen af NADH, NADPH eller blandinger heraf, som er dannet ved de samtidige, koblede enzymreak-30 tioner ifølge den foreliggende opfindelse.

NADH-Dannelseshastigheden og omregningen af denne hastighed til phosphationkoncentrationen gennemføres ved velkendte metoder. En af disse metoder benytter spektrofotometrisk udstyr til måling af 35 ændringen i lysabsorbans som følge af dannelsen af NADH ved bølgelængder beliggende mellem 300 og 370 millimicron (nm) i et temperaturområde på fra ca. 15°C til ca. 50°C. En bølgelængde på ca. 340 nm ved ca. 37°C foretrækkes.

6

DK 158956 B

Såvel den kinetiske analyse for uorganisk phosphat som endepunktsanalysen for uorganisk phosphat kan gennemføres ved en pH-værdi på fra ca. 6 til ca. 8. Den kinetiske analyse for uorganisk phosphat gennemføres fortrinsvis ved en pH-værdi på fra ca. 6,5 til 8, og 5 navnlig ved en pH-værdi på ca. 7,4. Den foretrukne pH-værdi ved endepunktsanalysen for uorganisk phosphat er ca. 7,0.

Ved såvel den kinetiske analyse for uorganisk phosphat som endepunktsanalysen for uorganisk phosphat kan reagenssystemet være 10 pufret med en hvilken som helst ikke-phosphatpuffer med en pH-værdi på fra ca. 6 til ca. 8, og som er forligelig med de anvendte reagenser. Eksempler på sådanne ikke-phosphatpuffere er blandt andet: piperazin-Ν,Ν'-bi s-(2-ethansulfonsyre), N,Ν'-bi s-(2-hydroxyethyl)- 2-aminoethansulfonsyre, triethanolamin»HCl og tri s-(hydroxymethyl)-15 aminomethan. N,N'-bis-(2-Hydroxyethyl)-2-aminoethansulfonsyre er den foretrukne puffer til brug i forbindelse med det kinetiske reagenssystem for uorganisk phosphat, og piperazin-N,N'-bis-(2-ethansul-fonsyre) er den foretrukne puffer til brug i forbindelse med ende-punktsreagenssystemet for uorganisk phosphat.

20

Opfindelsen omhandler også et reagens til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket reagens er ejendommeligt ved, at det omfatter: 25 (a) maltose, (b) _ maltosephosphorylase, (c) et co-enzym udvalgt fra gruppen bestående af /J-nicotin-amid-adenindi nueleotid, /f-ni coti namid-adenindinucleotid-phosphat og blandinger heraf, 30 (d) glucose-6-phosphatdehydrogenase, (e) /J-D-phosphoglucomutase, og eventuelt (f) 6-phosphogluconatdehydrogenase, hvorhos ovenstående stoffer er til stede i sådanne mængder, at det 35 uorganiske phosphat, som skal bestemmes, er den begrænsende komponent, og (g) en ikke-phosphatpuffer med en pH-værdi på fra 6 til ca. 8.

7

DK 158956 B

Reagenssystemet kan opbevares og benyttes i form af en vandig opløsning, eller opløsningen kan frysetørres ved sædvanlige foranstaltninger og rekonstitueres med vand, når den er klar til brug. Reagenssystemet kan også fremstilles under anvendelse af dets 5 bestanddele i pulveriseret form, som opløses med vand umiddelbart inden brugen. Reagenssystemet til den kinetiske analyse og endepunktsanalysen for uorganisk phosphat er angivet i eksempel 1 henholdsvis eksempel 2.

10 EKSEMPEL 1

Bestanddele i kinetisk analyseblanding for uorganisk phosphat Nødvendig mindste 15 Bestanddel Foretrukket område mænade_

Ikke-phosphatpuffer 50 mM 10 mM

Maltose 13,9 mM 2 mM

Di valent kation 2 mM 0

Co-enzym (NAD, NADP) 2 mM 0,1 mM

20 Maltosephosphorylase 1,6 IU/ml 0,5 IU/ml Ø-Phosphoglucomutase 0,4 IU/ml 0,1 IU/ml 6-Phosphogluconat-DH 0,7 IU/ml 0,1 IU/ml

Glucose-6-phosphat-DH 5 IU/ml 1 IU/ml

Glucose-l,6-diP 0,05 mM 0 25 EKSEMPEL 2

Bestanddele i endepunktsanalysebi ånding for uorganisk phosphat 30 Nødvendig mindste

Bestanddel Foretrukket område mængde_

Ikke-phosphatpuffer 50 mM 10 mM

Maltose 13,9 mM 2 mM

Co-enzym (NAD, NADP) 1,6 mM 0,1 mM

35 Divalent kation 2 mM 0

Glucose-l,6-diP 0,05 mM 0

Maltosephosphorylase 3 IU/ml 0,05 IU/ml j8-Phosphoglucomutase 0,6 IU/ml 0,1 IU/ml

Glucose-6-phosphat-DH 5 IU/ml 1,0 IU/ml

Claims (14)

1. Fremgangsmåde ved kinetisk eller endepunktsanalyse for uorganisk phosphat, kendetegnet ved, 5 (a) at der ved en pH-værdi på fra ca. 6 til ca. 8 udføres koblede reaktioner, som indbefatter: (I) omsætning af maltose med en uorganisk phosphatprøve i nærvær af maltosephosphorylase under dannelse af glucose og jS-D-glucose-l-phosphat, 10 (II) omsætning af /5-D-glucose-l-phosphat i nærvær af jS-D-phosphogl ucomutase under dannelse af glucose-6-phosphat, og (Ill)omsætning af glucose-6-phosphat i nærvær af glucose- 6-phosphatdehydrogenase og et co-enzym i form af 15 Ø-nicotinamid-adenindinucleotid, Ø-nicotinamid- adenindi nueleotidphosphat eller blandinger heraf under dannelse af den reducerede form af co-enzymet og 6-phosphogluconat, og (b) at dannelsen af det reducerede co-enzym måles, idet det 20 uorganiske phosphat, som skal bestemmes, er den begrænsen de komponent, og der benyttes en ikke-phosphatpuffer til at regulere pH-værdien.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, k e n d e t e g n e t ved, at den 25 yderligere omfatter omsætning af 6-phosphogluconat i nærvær af co-enzymet og 6-phosphogluconatdehydrogenase under dannelse af den reducerede form af co-enzymet, ribulose-5-phosphat og C02.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 30 ved, at Ø-D-glucose-l-phosphatet omsættes i nærvær af /1-D-phos- phoglucomutase og giucose-l,6-diphosphat under dannelse af glucose- 6-phosphat.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående 35 krav, kendetegnet ved, at /?-D-glucose-l-phosphatet omsættes i nærvær af £-D-phosphoglucomutase, glucose-l,6-diphosphat og en kation udvalgt fra gruppen bestående af Mn+2, Mg+2, Co+2, Zn+2 +2 eller Ni og blandinger heraf under dannelse af glucose-6-phosphat. DK 158956 B

5. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at den totale produktion af det reducerede co-enzym måles, og at maltose og co-enzymet er til stede i molært overskud i forhold til det uorganiske phosphat, som skal 5 bestemmes.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at dannelseshastigheden for det reducerede co-enzym måles, og at det uorganiske phosphat, som skal 10 bestemmes, er hastighedsbegrænsende.

7. Reagens til anvendelse ved kinetisk eller endepunktsanalyse for uorganisk phosphat, kendetegnet ved, at det omfatter: 15 (a) maltose, (b) maltosephosphorylase, (c) et co-enzym udvalgt fra gruppen bestående af /J-nicotin-amid-adenindinucleotid, /f-nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat'dg1 blandinger heraf, 20 (d) glucose-6-phosphatdehydrogenase, (e) Ø-D-phosphoglucomutase, og eventuelt (f) 6-phosphogluconatdehydrogenase, hvorhos ovenstående stoffer er til stede i sådanne mængder, at det 25 uorganiske phosphat, som skal bestemmes, er den begrænsende komponent, og (g) en ikke-phosphatpuffer med en pH-værdi på fra 6 til ca. 8.

8. Reagens ifølge, krav 7, kendetegnet ved, at pufferen er piperazin-N,N'-bis-(2-ethansulfonsyre), N,N'-bis-(2-hydroxy-ethyl)-2-aminoethansulfonsyre, triethanolamin*HCl eller tris-(hy-droxymethyl)ami nomethan.

9. Reagens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at reagen serne er til stede i sådanne mængder, at det uorganiske phosphat, som skal bestemmes, er hastighedsbegrænsende, således at reagenssystemet er et kinetisk reagenssystem. DK 158956 B

10. Reagens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at maltose og co-enzymet er til stede i molært overskud i forhold til det uorganiske phosphat, som skal bestemmes, således at reagenssystemet er et endepunktsreagenssystem. 5

11. Reagens ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det yderligere omfatter glucose-l,6-diphosphat.

12. Reagens ifølge krav 7 eller 11, kendetegnet ved, at i Q i O i O 10 det yderligere omfatter en kation udvalgt blandt Mn , Mg , Co , +2 +2 Zn , Ni og blandinger heraf.

13. Reagens ifølge krav 12, kendetegnet ved, at kationen er Mg+2, Mn+2, Co+2 eller blandinger heraf. 15

14. Reagens ifølge krav 11, kendetegnet ved, at glucose-1,6-diphosphatet i det væsentlige består af /J-formen af dette. 20 25 30 35