DK159123B - Fremgangsmaade ved kinetisk analyse for beta-amylase og reagens til anvendelse ved udoevelse af fremgangsmaaden - Google Patents

Description

DK 159123B

i

Opfindelsen angår en fremgangsmåde ved kinetisk analyse for Ø-amyla-se i vandig opløsning ved omsætning af et polysaccharid, som har glucoseenheder, der primært er sammenknyttet via a-l,4-bindinger, i nærvær af en Ø-amylaseholdig prøve og bestemmelse af nedbrydnings-5 produktet frembragt ved den enzymatiske reaktion.

I modsætning til a-amylase, der er et enzym, som forekommer i væsker, som blod, urin og spyt hos dyr og mennesker, forekommer enzymet /J-amylase navnlig i planter.

10

Hidtidige metoder til bestemmelse åf /?-amylase-koncentrationer har almindeligvis gjort brug af stivelse på grund af ^-amylases katalytiske virkning på hydrolysen af 1,4-bindingerne i stivelsens amylo-se- og amylopektinfraktioner. Hvis denne hydrolyse får lov til at 15 forløbe til ende, vil /3-amylasen efterhånden nedbryde stivelsen til glucose, maltose og oligosaccharider. Faldet i turbiditet eller viskositet af en vandig stivelsesopløsning efter amylosehydrolyse er ved forskellige metoder forsøgt korreleret med den forekommende j3-amyl asekoncentrati on.

20

Ved andre metoder benyttes mængden af reducerende stoffer, der dannes ved Ø-arnylase-stivelsesreaktionen, som mål for β-amyl asekoncentrati onen, eller hastigheden for farvestoffrigørelse fra en farvet stivelse ved hjælp af β-amylase benyttes som et mål for 25 β-amylasekoncentrationen.

Der er også blevet udviklet enzymatiske metoder til måling af β-amylasekoncentrationen, hvorved /J-amylase og andre enzymer benyttes til hydrolyse af stivelse til glucose, som derefter måles via 30 koblede, enzymatiske reaktioner. Denne fremgangsmåde er imidlertid ikke tilfredsstillende på grund af tilstedeværelsen af glucose i mange analysereagenser, hvilken glucose vil reagere via de koblede, enzymatiske reaktioner under dannelse af et let påviseligt produkt, ud over det, som dannes ved den enzymatiske stivelseshydrolyse.

35 Koncentrationen af denne endogene glucose er almindeligvis væsentlig i forhold til den mængde glucose, som normalt dannes ved den enzymatiske hydrolyse, og som følge heraf må den i forvejen tilstedeværende glucose udelukkes fra analyseprøven, inden analysen gennemføres.

DK 159123 B

2

En anden metode er den jodometriske, der er baseret på den velkendte reaktion mellem jod og stivelse, hvorved der dannes en blå farve. Når den blåfarvede stivelses-jodopløsning hydrolyseres med ^-amylase, aftager den blå farve, efterhånden som /J-amylasen nedbryder 5 stivelsen. Farveændringen i den blå stivelses-jodopløsning er dermed et mål på ^-amylasekoncentration. Denne teknik har imidlertid ikke været anset for pålidelig eller tilstrækkelig bestemt på grund af, at farveændringen ikke forholder sig lineært til koncentrationen af 0-amylase.

10

Fra Bergmeyer, H.U. "Methoden der enzymatischen Analyse, 3. Aufl., Bd. 1, s. 532-543, 826-829 og 923-927, Verlag Chemie, Weinheim/Berg-strasse, 1974, kendes metoder til aktivitetsbestemmelse af phospho-glucomutase, 6-phosphogluconatdehydrogenase, phosphoglucoseisomerase 15 og 3-phosphoglyceratkinase. Phosphoglucomutases aktivitet bestemmes under anvendelse af glucose-6-phosphatdehydrogenase som indikatorenzym. Endvidere kan o-arnylaseaktivitet bestemmes ved at måle maltose og glucose, der hidrører fra nedbrydningen af stivelse med a-amyla-se. Fra "J. Biol. Chem.", 199, 153-163 (1952) og "J. Biol. Chem.", 20 236, 2186-2189 (1961) er det kendt, at α-maltose med enzymet malto- sephosphorylase under tilstedeværelse af phosphationer, kan omdannes til glucose og j3-D-glucose-l-phosphat ved, at Ø-D-glucose-l-phosphat danner et substrat for phosphoglucomutase til dannelse af glucose-6-phosphat. I "Analytical_ Biochemistry", 57, 303-305 (1974)^,beskri-25 ves en fremgangsmåde til kvantitativ bestemmelse af maltose under anvendelse af maltosephosphorylase koblet med et glucoseoxidasesy-stem. Fra "Analytical Biochemistry", 53, 108-114 (1973) kendes en fremgangsmåde til spektrofotometrisk bestemmelse af Ø-glucose-l-phosphat i nærvær af a-glucose-l-phosphat og glucose-6-phosphat og 30 under anvendelse af /}-mutase. I "J. Gen. Appl. Microbiol.", 14, 359-371 (1968) beskrives oprensning af og 6-phosphogluconatdehydro-genases egenskab til oxidativ decarboxylering af 6-phosphogluconat under dannelse af ribulose-5-phosphat og C02> Endvidere beskrives der i "Årtzl. Lab.", 17, 340-343, 1971, bestemmelse af a-amylaseak-35 tiviteten sammenkoblet med α-glucosidase, hexokinase og glucose-6-phosphatdehydrogenase som indikatorenzymer. I "Agr. Biol. Chem.", 37, 2813-2819, 1973, beskrives oprensning af maltosephosphorylase og undersøgelse og dette enzyms specificitet med henblik på anvendelse af samme til kvantitativ bestemmelse af maltose i nærvær af 3

DK 159123 B

stivelseshydrolysater. Fra "Methods of Enzymatic Analyses", vol. 1, Academic Press, New York, s. 109-110 og 123-127, 1974, kendes endvidere bestemmelse af glucose ved en "hjælpereaktion" under anvendelse af et "hjælpeenzym", som omdanner glucose til glucose-6-5 phosphat, der kan indgå som substrat i en NADP-afhængig indikatorreaktion. Reaktionerne er således koblede. Der kan desuden udføres flere "hjælpereaktioner" efter hinanden.

Selvom alle ovennævnte metoder er tilstrækkelige til at give en 10 generel angivelse af /?-amylasekoncentrationen, er de dog ikke helt tilfredsstillende, da de enten ikke er brugbare til nøjagtige videnskabelige målinger og/eller er for tidsrøvende.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en 15 fremgangsmåde til analyse for ^-amylase, ved hvilken fremgangsmåde de problemer, som er forbundet med de hidtil kendte metoder til bestemmelse af jS-amylasekoncentrationer, overvindes, og en metode til hurtig, enkel, pålidelig og reproducerbar bestemmelse af /J-amy-lasekoncentrationer i en forelagt prøve tilvejebringes.

20

Dette formål opnås med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, hvilken, fremgangsmåde er ejendommelig ved, at der udføres samtidige reaktioner, som udføres ved et pH på fra 6 til 7,5, og som indbefatter: 25 (i) Omsætning af polysaccharidet i nærvær af Ø-amylaseprøven til dannelse af /J-maltose, (ii) omsætning af ^-maltose med mutarotase til dannelse af a-mal-30 tose, (i i i) omsætning af α-maltose med phosphationer i nærvær af maltose-phosphorylase til dannelse af glucose og /J-D-glucose-l-phosphat, 35 (iv) omsætning af /J-D-glucose-l-phosphat i nærvær af ^-D-phospho- 2*4* 2+ 2+ glucomutase og giucose-l-6-diphosphat samt Mn -, Mg -, Co -, 2+ 2+

Zn - og/eller Ni -ioner til dannelse af glucose-6-phosphat, og (v) omsætning af glucose-6-phosphat i nærvær af

DK 159123 B

4 glUCOSe-6-phOSphat-dehydrogenase og et co-enzym udvalgt fra gruppen omfattende /?-nicotinamid-adenindinucleotid, Ø-nicotinamidadenindinu-cleotidphosphat og blandinger heraf til dannelse af den reducerede form af co-enzymet og 6-phosphogluconat, og, 5 at dannelseshastigheden for det reducerede co-enzym måles, hvorhos den /J-amylase, som måles, er hastighedsbegrænsende.

Den kinetiske metode til analyse for /J-amylase ifølge opfindelsen 10 omfatter således følgende samtidige reaktioner: (I) a-l,4-bundet glucan ^~amy1as%/8-maltose + andre maltooligo- saccharider (II) /J-maltose a-maltose 15

(III) α-maltose + PO^”"" glucose + /5-D-G-l-P

(IV) /J-D-G-l-P G-6-P

20 (V) G-6-P + NAD 6-P-G + NADH

hvor koncentrationen af /J-amylase i den vandige opløsning bestemmes ved måling af dannelseshastigheden, far NADH, hvilket er et mil foiL. /J-amyl asekoncentrati onen.

25 I ovenstående reaktionsskemaer og i det følgende er nedenstående forkortelser anvendt:

Forkortelser: 30 PO^ - phosphation MP - maltosephosphorylase /J-D-G1P - /?-D-glucose-l-phosphat /3-PGM - /9-D-phosphoglucomutase 35 G-l,6-diP - D-glucose-l,6-diphosphat G-6-P - glucose-6-phosphat 6-PG - 6-phosphogluconat G6PDH - glucose-6-phosphat-dehydrogenase

DK 159123B

5 6PDH - 6-phosphogluconat-dehydrogenase NAD - /J-nicotinamid-adenindinucleotid NADH - reduceret form af /?-nicotinamid- adenindinucleotid 5

Med hensyn til den første af ovennævnte reaktioner: (I) a-l,4-bundet glucan ft~arny1asefr jS-maltose og andre mal tool i gosaccharider 10 kan den a-l,4-bundne glucan være et hvilket som helst polysaccharid, som primært består af glucose, hvori glucosemolekylerne hovedsagelig er forbundne ved a-l,4-bindinger, der kan angribes af Ø-amylasen. Eksempler på sådanne polysaccharider er stivelse, amylopectin, 15 amylose, glycogen, dextrin og nedbrydningsprodukter heraf og homologe af maltooligosaccharider, såsom maltotriose, maltotetraose og maltopentaose eller blandinger heraf.

Stivelse er den foretrukne form af glucanen som følge af, at den 20 frembyder den bedste kombination af opløselighed, lav pris, genvinding og stabilitet. "Superlose 500" er handelsbetegnelsen for en stivelse, som foretrækkes ved bestemmelse af /1-amylase. Denne stivelse har god koldtvandsopløselighed, giver bedre respons og linearitet end andre stivelser, god reproducerbarhed og er ikke 25 turbid i opløsning. "Superlose 500" er en modificeret amylose, som distribueres af Stein-Hall Company, New York City. "Superlose 500" er et hvidt granulært materiale med et fugtighedsindhold på ca. 10%, en pH-værdi på 7 og en filmtrækstyrke på over 51,4 kg/cm2. Viskositeten af "Superlose 500" i Brookfield Pa*s ved 66eC er 185·10“3 for 30 14% tørstof, 55·10~3 for 10% tørstof, og 10·10"3 for 5% tørstof. Ved 24°C er viskositeten 2000·10-3 for 14% tørstof, 275-10-3 for 10% _3 tørstof og 30·10 for 5% tørstof. "Superlose 500" opløses let i vand ved stuetemperatur i modsætning til de fleste stivelser, som kræver en vis grad af omrøring og/eller opvarmning, inden de går i 35 opløsning. "Superlose 500" er fremstillet af den modificerede amylosefraktion af kartoffelstivelse og indeholder ikke nogen væsentlig mængde stivelses-amylopectinfraktion.

"GR brand starch" er handelsbetegnelsen på en anden stivelse, som

DK 159123 B

6 kan benyttes i den foretrukne udførelsesform. "GR brand starch" distribueres af E. Merck Company, 500 Executive Blvd., Elmsford, New York, og forhandles af Merck European, Darmstadt, Tyskland. Denne stivelse dialyseres inden anvendelse og har følgende egenskaber: Et 5 maksimalt sulfataskeindhold på 7 vægtprocent og et tørringstab på 10 vægtprocent, 1 g "GR stivelse" har en reduceringsevne ækvivalent med 7 mg maltose, pH værdien er mellem 6,5 og 7,5, og den udviser en gunstig sensitivitetsprøve.

10 Ved bestemmelse af amylase er det nødvendigt, at /?-amylasen er hastighedsbegrænsende. Mængderne af de andre bestanddele i reagenssystemet bør dermed være til stede i sådanne mængder, at det sikres, at den observerede reaktionshastighed for det fuldstændige analysesystem er karakteristisk for og bestemt af hastigheden af den 15 /}-amylasekatalyserede reaktion (reaktion I). Til analysen foretrækkes det at benytte en koncentration på mellem ca. 1,0 og ca. 20 g af en a-l,4-bundet glucan pr. liter reagens. En glucankoncentration på ca. 5 g pr. liter reagens foretrækkes.

20 Med hensyn til den anden ovenfor nævnte reaktion: (II) ^-maltose se» a-maltose omdannes den ved den første reaktion dannede /J-maltose under kataly-25 tisk indvirkning af mutarotase til α-maltose. Mutarotasen bør foreligge i en koncentration på mindst 2.000 enheder, fortrinsvis 60.000 enheder, pr. liter reagens.

Ved den tredie af ovenanførte reaktioner: 30 ___ Mp

(III) α-maltose + P0^ !_► glucose + jS-D-G-l-P

omsættes den α-maltose, som dannes ved den anden reaktion, med phosphationer under anvendelse af maltosephosphorylase som enzyma-35 tisk katalysator til dannelse af glucose og Ø-D-glucose-l-phosphat.

Phosphationerne kan tilføres fra en hvilken som helst kilde, som er forligelig med reagenssystemet. Uorganiske phosphater er et eksempel på en sådan kilde. Det foretrukne phosphat er en blanding af I^HPO^

DK 159123 B

7 og K^PO^, som udgør en pufret opløsning med en pH-værdi på ca. 6,5, hvilket er det optimale.

Koncentrationen af phosphationer bør ligge på et niveau, som sikrer, 5 at Ø-amylase er den hastighedsbegrænsende forbindelse. Det er imidlertid ønskeligt ikke at have en for høj koncentration af phosphationer som følge af, at store koncentrationer kan inhibere aktiviteten af β-PGM-enzymet. Det foretrækkes at have en molær koncentration på fra ca. 0,01 til ca. 0,1 af uorganisk phosphat, 10 idet ca. 0,025 molær er den mest foretrukne.

Maltosephosphorylase er et enzym, som katalyserer reaktionen mellem α-maltose og uorganisk phosphat. Mindst ca. 200 internationale enheder (IU) af dette enzym pr. liter reagens er nødvendige, men ca.

15 2.000 IU pr. liter foretrækkes.

Den foretrukne kilde til maltosephosphorylase er en stamme af mikroorganismen Lactobacillus brevi s (ATCC 8287), som er blevet dyrket af Beckman Instruments, Inc., Microbics Operations, Carlsbad, 20 Californien, og enzymet er blevet ekstraheret og renset ved sædvanlige fremgangsmåder derfra. Andre kilder til dette enzym er stammer af Neisseria meninoitides. Neisseria perf1ava og andre Lactobacilli-stammer.

25 Med hensyn til den fjerde af ovennævnte reaktioner:

(IV) /J-D-G-l-P 1¾ G-6-P

katalyserer enzymet Ø-phosphoglucomutase (jS-PGM) omdannelsen af 30 /3-D-glucose-l-phosphat til glucose-6-phosphat. Æ-Phosphoglucomutase er til stede i en mængde på mindst ca. 100 IU pr. liter reagens, således at j8-amylase i reaktionen I forbliver den hastighedsbegrænsende bestanddel. Fortrinsvis anvendes ca. 500 IU /J-PGM pr. liter reagens ved analyse af 0-amylase. Den foretrukne kilde til /J-PGM er 35 Lactobacillus Brevis (ATCC 8287). Den dyrkes og renses ved sædvanlige enzymrensningsmetoder. Andre kilder er stammer af Neisseria meninqitides. Neisseria perf1ava og Euolena gracilis.

Glucose-l,6-diphosphatet (G-l,6-diP) i enzymsystemet virker som

DK 159123 B

8 cofaktor for £-PGM. /J-PGM kræver ^-formen af G-l,6-diP for aktivitet, men det antages, at α-formen af denne cofaktor også kan virke.

Den foretrukne koncentration af G-l,6-diP bør være mindst ca. 0,01 g pr. liter reagens. Den optimale koncentration er ca. 0,075 g pr.

5 liter.

De di val ente kationer i form af Mn+^, Mg+^, Co+^, Zn+^ eller Ni+^ +2 +2 virker i enzymsystemet som cofaktor for jS-PGM. Kationerne Mn , Mg +2 4*2 +2 eller Co foretrækkes fremfor Zn eller Ni . Kationkoncentratio- 10 nen bør være mindst ca. 1 mi 11imol pr. liter reagens og er fortrinsvis 8,4 millimol pr. liter.

Hvad angår den femte af ovennævnte reaktioner:

15 (V) G-6-P + NAD -66¾ 6-P-G + NADH

omsættes glucose-6-phosphat med /J-nicotinamid-adenindinucleotid og G6PDH under dannelse af 6-phosphogluconat og NADH.

20 Mængden af NAD bør være tilstrækkelig stor til at holde /J-amylasen som den hastighedsbegrænsende bestanddel. Et egnet område for NAD-koncentrat ionen er fra ca. 1 til ca. 10 mill imol pr. liter reagens. Den foretrukne koncentration af NAD er ca. 2*5 millimole /J-Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat (NADP) kan erstatte NAD.

25

Glucose-6-phosphatdehydrogenase (G-6-PDH) bør også være til stede i en koncentration på mindst ca. 500 IU pr. liter reagens, således at denne reaktion ikke er den hastighedsbegrænsende reaktion. Den foretrukne koncentration af G-6-PDH-enzymet er ca. 5000 IU pr. liter 30 reagens. Den foretrukne kilde for G-6-PDH er Leuconostoc mesenteroi-des (ATCC 12291), men det kan fås fra andre kilder.

Det er ønskeligt at benytte en sjette reaktion som en del af analysen: 35 (VI) 6-P-G + NAD 6~PPlj. ribulose-5-P + NADH + C02

Formålet med denne sjette reaktion er at forøge sensitiviteten og nøjagtigheden af analysen ved at forøge den dannede mængde NADH.

9

DK 159123B

Den minimale koncentration af 6-PDH bør være mindst ca. 200 IU pr. liter reagens. Den optimale koncentration af 6-PDH er ca. 700 IU pr. liter. Den foretrukne kilde til dette enzym er Leuconostoc mesen-teroides (ATCC 12291), hvorfra enzymet er blevet udvundet og renset 5 ved sædvanlige kendte fremgangsmåder, men det kan fås fra andre kilder.

Natriumchlorid kan tilsættes reagenssystemet til forøgelse af aktiviteten af jS-amylasen.

10

Puffere omfattende dibasisk kaliumphosphat (K2HP04) og monobasisk kaliumphosphat (KHgPO^) kan benyttes til at tilvejebringe den optimale pH-værdi, hvorved reaktionssekvensen gennemføres. Ikke-phosphatpuffere kan benyttes, men phosphatpuffere foretrækkes, fordi 15 de samtidig udgør en kilde til phosphationer.

Eksempler på andre puffere, som er blevet afprøvet og har vist sig at være tilfredsstillende, er piperazin-N,N'-bis(2-ethansulfonsyre), tri s (hydroxymethyl) ami nomethan, N-2-hydroxyethyl pi perazi n-N·' -2- 20 ethansul fonsyre og tri ethanolamin. Eksempler på andre puffere, som også kan være tilfredsstillende er N-(2-acetamido)iminodieddikesyre, N-(2-acetamido)-2-aminoethansulfonsyre og N,N'-bis(2-hydroxyethyl)-2~-amtnoethansuIfonsyFe.

25 NADH-Dannelseshastigheden og omregningen af denne hastighed til /i-amylasekoncentrationen gennemføres ved velkendte metoder. En af disse metoder benytter spektrofotometrisk udstyr til at måle ændringen i lysabsorbans som følge af dannelsen af NADH ved bølgelængder beliggende mellem 300 og 370 millimicron (nm) ved et temperaturom-30 råde på fra ca. 15”C til ca. 50”C. En bølgelængde på ca. 340 nm ved ca. 37”C foretrækkes.

Når hastigheden for absorbansændringen måles, kan koncentrationen af ^-amylase beregnes efter nedenstående ligning, hvori absorbansæn-35 dringen måles ved en bølgelængde på 340 nm og ved en temperatur på 37°C:

DK 159123 B

10 ΔΑ x Vt x 1000 IU/liter = τ

Vs x 6,22 5 ΔΑ * forandring i absorbans/minut V^. * totalt reaktionsrumfang V$ = rumfang prøve indeholdende β-amylase 6,22 = millimolært absorptivitetstal for NADH ved 340 10 nm*

Reagenssystemet til bestemmelse af /J-amylasekoncentrationen indeholder udgangsmaterialet for reaktion I, a-l,4-bundet glucan og alle bestanddelene, med undtagelse af /3-amylase, som er nødvendige for, at alle de fem reaktioner kan forløbe som angivet, d.v.s. mutarota-se, phosphationer, MP, /J-PGM og G6PDH. Dette reagenssystem kan tilvejebringes og benyttes som en blanding eller tilvejebringes i form af et sæt bestående af et antal reagenser, som hver for sig indeholder én eller flere af ingredienserne i reagenssystemet, som 2Q alle sammenblandes, når reagenserne benyttes i ^-amylase-analysen.

Alle førnævnte bestanddele i reagenssystemet har vist sig at være stabile som én blanding, og det foretrækkes derfor, at reagenssystemet tilvejebringes som én blanding, idet det er lettere at arbejde med ét reagens fremfor et antal reagenser.

25

Opfindelsen omfatter derfor også et reagens til anvendelse ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, hvilket reagens er ejendommeligt ved, at det omfatter: 2Q (a) et polysaccharid af glycoseenheder, der primært er sammenknyttet via a-l,4-bindinger, (b) phosphationer, 35 (c) maltosephosphorylase, (d) et co-enzym udvalgt fra gruppen bestående af /J-nicotin-amid-adenindi nueleotid, /}-nicotinamid-adenindi nueleotid-phosphat og blandinger heraf,

DK 159123 B

π (e) giucose-6-phosphatdehydrogenase, (f) jS-D-phosphoglucomutase, 5 (g) mutarotase, (h) glucose-l,6-diphosphat, (i) Mn2+-, Mg2+-, Co2+-, Zn2+- og/eller Ni2+-ioner, og eventu- 10 elt (j) 6-phosphogluconatdehydrogenase, hvorhos ovenstående stoffer er til stede i sådanne mængder, at den 15· /f-amyl'ase, som skaf bestemmes, er hastighedsbegrænsende.

Eksempel

Bestanddele i analvseblånding til g-amvlasebestemmelse 20

Nedenstående angiver sammensætningen af det foretrukne reagens fremstillet som. en. 1--1 i ters opløsning i deioniseret vand: "Superlose 500" 5,00 gram 25 di basisk kaliumphosphat 2,65 gram monobasisk kaliumphosphat 1,33 gram

maltosephosphorylase 2000 IU

/J-phosphoglucomutase 500 IU

NAD · 41^0 1,8 gram

30 glucose-6-phosphatdehydrogenase 5000 IU

6-phosphogluconatdehydrogenase 700 IU

MgCl2*6H20 1,7 gram natriumchlorid 0,5 gram G-l,6-diP 0,075 gram

35 Mutarotase 60.000 IU

pH-Værdien indstilles til fra ca. 6,0 til ca. 7,5, idet en pH-værdi på 6,5 foretrækkes.

DK 159123 B

12

Reagenssystemet kan opbevares og benyttes i form af en vandig opløsning, eller opløsningen kan frysetørres ved sædvanlige foranstaltninger og rekonstitueres med vand, når den er klar til brug. Reagenssysternet kan også fremstilles under anvendelse af dets 5 bestanddele i pulveriseret form, som opløses med vand umiddelbart inden brugen.

10 15 20 25 30 35

Claims (3)

1. Fremgangsmåde ved kinetisk analyse for jS-amylase i vandig opløsning ved omsætning af et polysaccharid, som har glucoseenheder, 5 der primært er sammenknyttet via <*-l,4-bindinger, i nærvær af en i8-amylaseholdig prøve og bestemmelse af nedbrydningsproduktet frembragt ved den enzymatiske reaktion, kendetegnet ved, at der udføres samtidige reaktioner, som udføres ved et pH pf^fra 6 til 7,5, og som indbefatter: 10 (i) Omsætning af polysaccharidet i nærvær af /J-amylaseprøven til dannelse af ^-maltose, (ii) omsætning af /J-maltose med mutarotase til dannelse af a-mal-15 tose, (i i i) omsætning af α-maltose med phosphationer i nærvær af maltose-phosphorylase til dannelse af glucose og /8-D-glucose-l-phosphat, 20 (iv) omsætning af /l-D-glucose-l-phosphat i nærvær af /3-D-phospho- 2+ 2+ 2+ 2+ glucomutase og glucose-l-6-diphosphat samt Mn , Mg , Co , Zn 2+ og/eller Ni ioner til dannelse af glucose-6-phosphat, og (v) omsætning af glucose-6-phosphat i nærvær af glucose-6-phos-25 phat-dehydrogenase og et co-enzym udvalgt fra gruppen omfattende j8-nicotinamid-adenindinucleotid, ^-nicotinamid-adenindinucleotid-phosphat og blandinger heraf til dannelse af den reducerede form®af co-enzymet og 6-phosphogluconat, og 30 at dannelseshastigheden for det reducerede co-enzym måles, hvorhos den /J-amylase, som måles, er hastighedsbegrænsende.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at i trin (v) omsættes 6-phosphogluconat i nærvær af co-enzymer og 35 6-phosphogluconat-dehydrogenase til dannelse af den reducerede form af co-enzymerne og ribulose-5-phosphat.

3. Reagens til anvendelse ved fremgangsmåden ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det omfatter DK 159123 B 14 (a) et polysaccharid af glycoseenheder, der primært er sammenknyttet via a-l,4-bindinger, (b) phosphationer, 5 (c) maltosephosphorylase, (d) et co-enzym udvalgt fra gruppen bestående af jS-nicotin- amid-adenindinucleotid, Ø-nicotinamid-adenindi nueleotid- 10 phosphat og blandinger heraf, (e) glycose-6-phosphatdehydrogenase, (f) /J-D-phosphoglucomutase, 15 (g) mutarotase, (h) glucose-l,6-diphosphat, 20 (i) Mn2+-, Mg2+-, Co2+-, Zn2+- og/eller Ni2+-ioner, og eventu elt (j) 6-phosphogluconatdehydrogenase, 25 hvorhos ovenstående stoffer er til stede i sådanne mængder, at den Ø-amylase, der skal bestemmes, er hastighedsbegrænsende. 30 35