DK158682B - Fremgangsmaade og analysekit til paavisning af antigener og antistoffer. - Google Patents
Fremgangsmaade og analysekit til paavisning af antigener og antistoffer. Download PDFInfo
- Publication number
- DK158682B DK158682B DK375782A DK375782A DK158682B DK 158682 B DK158682 B DK 158682B DK 375782 A DK375782 A DK 375782A DK 375782 A DK375782 A DK 375782A DK 158682 B DK158682 B DK 158682B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- enzyme
- antibody
- conjugate
- sample
- solid phase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 29
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims abstract description 70
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims abstract description 70
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 35
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 claims abstract description 31
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 30
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 29
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 26
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims abstract description 26
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims abstract description 15
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 32
- NEZVZINHTCNBSD-UHFFFAOYSA-N 3,4-dibromo-2-methylphenol Chemical compound CC1=C(O)C=CC(Br)=C1Br NEZVZINHTCNBSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 claims description 8
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 claims description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 7
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 claims description 4
- 239000012897 dilution medium Substances 0.000 claims 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims 2
- 101000874347 Streptococcus agalactiae IgA FC receptor Proteins 0.000 claims 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Chemical compound BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 10
- 239000012530 fluid Substances 0.000 abstract 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 28
- XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C=1SC(N)=NC=1C(F)(F)F XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 15
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 12
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 12
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 11
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 9
- 230000008859 change Effects 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 239000007793 ph indicator Substances 0.000 description 6
- 238000007423 screening assay Methods 0.000 description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 5
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 5
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N cresol red Chemical compound C1=C(O)C(C)=CC(C2(C3=CC=CC=C3S(=O)(=O)O2)C=2C=C(C)C(O)=CC=2)=C1 OBRMNDMBJQTZHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 3
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 3
- ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-hydroxyphenyl)methyl]-1,3-oxazolidin-2-one Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1CC1NC(=O)OC1 ZPLCXHWYPWVJDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000486679 Antitype Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 description 2
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 2
- 239000002574 poison Substances 0.000 description 2
- 229920000915 polyvinyl chloride Polymers 0.000 description 2
- 239000004800 polyvinyl chloride Substances 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 229920002379 silicone rubber Polymers 0.000 description 2
- 239000004945 silicone rubber Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- ISPYQTSUDJAMAB-UHFFFAOYSA-N 2-chlorophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1Cl ISPYQTSUDJAMAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000272058 Acanthophis antarcticus Species 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000011891 EIA kit Methods 0.000 description 1
- -1 For example Substances 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000272131 Pseudechis australis Species 0.000 description 1
- 241001074017 Storeria dekayi Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000002096 anti-tetanic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000729 antidote Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- WWAABJGNHFGXSJ-UHFFFAOYSA-N chlorophenol red Chemical compound C1=C(Cl)C(O)=CC=C1C1(C=2C=C(Cl)C(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 WWAABJGNHFGXSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229920001971 elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 125000005439 maleimidyl group Chemical class C1(C=CC(N1*)=O)=O 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 201000005404 rubella Diseases 0.000 description 1
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 1
- 238000012764 semi-quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 229940036116 tetanus immunoglobulin Drugs 0.000 description 1
- 229960002766 tetanus vaccines Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
- B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
- B01L3/02—Burettes; Pipettes
- B01L3/021—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids
- B01L3/0217—Pipettes, i.e. with only one conduit for withdrawing and redistributing liquids of the plunger pump type
- B01L3/022—Capillary pipettes, i.e. having very small bore
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/58—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving urea or urease
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N2035/00178—Special arrangements of analysers
- G01N2035/00237—Handling microquantities of analyte, e.g. microvalves, capillary networks
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N2035/1027—General features of the devices
- G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
- G01N2035/1055—General features of the devices using the transfer device for another function for immobilising reagents, e.g. dried reagents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N35/00—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor
- G01N35/10—Devices for transferring samples or any liquids to, in, or from, the analysis apparatus, e.g. suction devices, injection devices
- G01N2035/1027—General features of the devices
- G01N2035/1048—General features of the devices using the transfer device for another function
- G01N2035/1062—General features of the devices using the transfer device for another function for testing the liquid while it is in the transfer device
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
i
DK 158682 B
Opfindelsen angår en fremgangsmåde og et analysekit til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof eller et antigent eller haptent stof i en prøve ved ELISA-metoden, ved hvilken fremgangsmåde bindingen af et antistof/enzym- eller antigen/enzym-kon-5 jugat til en fast fase anvendes til påvisning af tilstedeværelse eller fravær af antistof eller et antigent eller haptent stof i prøven.
ELISA-analysemetoder er velkendte og er i tidens løb blevet anvendt 10 til påvisning af antistoffer og antigener i vid udstrækning. Disse analyser har imidlertid almindeligvis kun kunnet udføres under anvendelse af kompliceret laboratorieudstyr og trænet laboratorie-personale og har derfor ikke været velegnet til udførelse under ugunstige forhold, f.eks. i marken.
15
Dette er en forholdsvis stor begrænsning, når analysen skal anvendes til screening. Til f.eks. påvisning og identifikation af slangegift i Australien er det sædvanligvis nødvendigt at være i stand til at påvise mindst 2 og i de fleste tilfælde 5 primære slangegifte for at 20 muliggøre udvælgelse af den hensigtsmæssige modgift. Det betyder, at når de omtalte kendte ELISA-analysemetoder anvendes, må der udføres mindst 2 eller ofte 5 separate analyser for at identificere den ukendte slangegift i den kliniske prøve samtidig med udførelse af kontrol prøver, hvor dette er hensigtsmæssigt. Nødvendigheden af at 25 udføre flere separate prøver er naturligvis specielt en ulempe ud fra det synspunkt, at de nødvendige prøver skal udføres i marken.
Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde, der i modsætning til ovennævnte hidtil kendte ELISA-30 analysemetoder let kan anvendes til påvisning af antistoffer og antigener under ugunstige forhold.
Dette opnås med fremgangsmåden med de indledningsvis angivne karakteristika, hvilken fremgangsmåde ifølge opfindelsen er ejendommelig 35 ved, at det i konjugatet anvendte enzym er urease, at den faste fase kontaktes med urinstof som enzymsubstrat, og at tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under anvendelse af di-brom-o-cre-solsulfonphthalein til påvisning af tilstedeværelse af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven.
2
DK 158682B
I beskrivelsen til en tidligere indleveret australsk pat.ans.nr. 68117/81 omtales analyser til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer ved en forbedret "ELISA"-metode, ved hvilken metode enzymet urease 5 anvendes i antistof-enzymkonjugatet, idet urinstof er det tilsvarende enzymsubstrat, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven. Forekomst af ammoniak frembragt under indvirkning af enzymet urease på urinstofsubstratet anvendes derefter til at indicere tilstedeværelsen af 10 antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven. Denne forbedrede ELISA-metode har udbredt anvendelse, ikke alene i forbindelse med det apparatur, der omtales nedenfor, men også som en generel ELISA-metode til anvendelse i forbindelse med kendt appara-tur7~såsonfpl åder^brøndeog 1 i gnende.
15
Den yderligere forbedring, der nu tilvejebringes med opfindelsen, ligger i anvendelsen af den specielle indikator dibrom-o-cresolsul-fonphthalein eller bromcresolpurpur som indikator for forekomst af ammoniak. Fremkomsten af ammoniak kan let påvises ved et pH-skift, 20 som det har vist sig at være bedst at påvise ved det livlige farve-skift (gul til purpur) hos bromcresolpurpur, der er inkorporeret i en ikke-pufret substratopløsning. Anvendelsen af urease-urinstof som enzymsubstratsystem giver flere vigtige fordele: Substratet, der er stabilt, kan opbevares parat til brug; titreringsendepunkterne er 25 skarpe og tydeligt synlige; enzymet forgiftes ikke af natriumazid, og derfor kan testreagenser fremstilles med dette konserveringsmiddel og opbevares parat til brug (dette er ikke tilfældet med peber-rodsperoxidase (HRP; Horse Radish Peroxidase), et enzym, som tidligere er blevet anvendt i EIA-analyser). Disse faktorer gør derfor 30 enzymet egnet til EIA-kit beregnet til brug i marken. Enzymet er kommercielt tilgængeligt med en højere specifik aktivitet end andre almindeligt anvendte enzymmærker, og da urease ikke forekommer i pattedyrvæv, hvorimod andre enzymer, såsom peroxidaser, phosphataser og galaktosidaser kan forekomme i sådanne væv, er urease egnet til 35 brug ved EIA-analyser til påvisning af celleassocierede antigener og deres antistoffer. Endelig kan enzymreaktionen om ønsket stoppes øjeblikkeligt ved tilsætning af det det organiske, kviksølvholdige konserveringsmiddel Thiomersal, hvilket således muliggør opbevaring af EIA-resultater til senere undersøgelse.
DK 158682 B
3
Det er overraskende, at bromcresolpurpur med fordel kan anvendes som indikator ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, eftersom det farveskift, som bromcresolpurpur udviser, finder sted i pH-området fra 5,2 til 6,8. Urease har på den anden side en maximal aktivitet i 5 pH-området fra 7 til 8. Det er ikke desto mindre konstateret, at anvendelsen af bromcresolpurpur til påvisning af forekomst af ammoniak er effektiv ved at give et fuldstændigt og hurtigt farve-skifte.
10 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan alment tilpasses til udførelse af et stort antal analysemetoder. De efterfølgende eksempler er ikke-begrænsende, illustrative eksempler, som kan udføres: A: Antigen påvisning, f.eks. hepatitis, digoxin.
15 (a) Sandwich-antigen analyse: 1. Fast fase: Rør - antihepatitis Ab 2. Prøve: ± Hepatitis-subunit eller -virus 3. Konjugat: Antihepatitis Ab -enzym (b) Dobbelt antistof-sandwich-antigen analyse: 20 1. Fast fase: Rør - antihepatitis Ab type 1 (f.eks.
antistof fra får) 2. Prøve: ± Hepatitis-subunit eller -virus 3. Andet antistof: Antihepatitis Ab type 2 (f.eks. antistof fra kanin) 25 4. Konjugat: Anti-type 2 Ab -enzym (c) Kompetitiv antigen analyse: 1. Prøve: ± digoxin 2. Konjugat: Antidigoxin Ab -enzym 3. Fast fase: Rør - digoxin 30 (note: Ved denne analyse blandes og inkuberes prøven og konjugatet før det tilføres røret).
B: Antistofpåvisning, f.eks. stivkrampe, rubella.
35 (a) Sandwich-antistof analyse: 1. Fast fase: Rør - stivkrampe Ag 2. Prøve: ± Anti-stivkrampe Ab (humant) 3. Konjugat: Anti-human Ab - enzym
DK 158682 B
4 (b) Dobbelt antistof-sandwich-antistof analyse: 1. Fast fase: Rør - stivkrampe Ag 2. Prøve: ± Stivkrampe Ab (human) 3. Andet antistof: Anti-human Ab type 2 (f.eks. antistof 5 fra får mod humant antistof) 4. Konjugat: Anti-type 2 Ab -enzym
En første foretrukken udførelsesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af et 10 antigent eller haptent stof i en prøve er ejendommelig ved, at den i rækkefølge omfatter: 1. at prøven kontaktes med en fast fase, hvortil er fæstnet antistof, der modsvarer det antigene eller haptene stof, og at den 15 faste fase derefter kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, 2. at prøven kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, hvorhos antistoffet i konjugatet er et antistof, der modsvarer det antigene eller haptene stof, og enzymet i konjugatet er urease, og den fremkomne blanding kontaktes derefter med den faste 20 fase, hvortil det antigene eller haptene stof er fæstnet, 3. at den faste fase kontaktes med urinstof som enzymsubstrat, og 4. at tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under anvendelse af dibrom-o-cresolsulfonphthaleinindikator til påvisning af tilstedeværelse af de antigene eller haptene 25 stoffer i prøven.
En anden foretrukken udføre!sesform for fremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof i en prøve er ejendommelig ved, at den i rækkefølge omfat-30 ter: 1. at prøven kontaktes med en fast fase, hvortil der er fæstnet antigen, som modsvarer antistoffet, 2. at den faste fase kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, 35 idet antistoffet i dette konjugat er rettet mod den dyrearts antistoffer, der undersøges for, og at enzymet i konjugatet er urease, 3. at den faste fase kontaktes med urinstof som enzymsubstrat, og 4. at tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under
DK 158682 B
5 anvendelse af dibrom-o-cresolsulfonphthaleinindikator til påvisning af tilstedeværelsen af antistof i prøven.
Opfindelsen angår også et analysekit til påvisning eller bestemmelse 5 af tilstedeværelse af antistof eller et antigent eller haptent stof i en prøve ved ELISA-metoden, hvorved bindingen af et antistof/en-zym- eller antigen/enzym-konjugat til en fast fase anvendes til påvisning af tilstedeværelse eller fravær af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven, hvilket kit er ejendomme-10 ligt ved, at det omfatter et antistof/enzym- eller antigen/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og et substrat/-indikator-system omfattende urinstof som enzymsubstratet og dibrom- o-cresolsulfonphthalein som indikator.
15 Det må forstås, at analysekit, som alment omtalt ovenfor, kan sammensættes af hensigtsmæssige komponenter for at muliggøre udførelsen af det store antal analyseprocedurer, der tidligere er omtalt, herunder de såkaldte "sandwich-analyser" og "kompetitive" analyser samt analyser af dobbelt antistoftypen.
20
En første foretrukken udførelsesform for analysekit'et ifølge opfindelsen til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af et antigent eller haptent stof i en prøve er ejendommeligt ved, at det i kombination omfatter: 25 1. en fast fase, hvortil er fæstnet antistof, der modsvarer det antigene eller haptene stof, 2. et antistof/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og 30 3. et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzym substratet og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.
En anden foretrukken udførelsesform for analysekit'et ifølge opfindelsen til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af anti-35 stof i en prøve, er ejendommelig ved, at det i kombination omfatter: 1. en fast fase, hvortil er fæstnet antigen, der modsvarer antistoffet, 6
DK 158682B
2. et antistof/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og 3. et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzymsubstratet og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.
5
Fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan udøves med et apparat, som omfatter en flerhed af rørformede eller kapillarformede elementer, hvorhos der til en indre overflade af hvert kapi11 arelement er fæstnet antistof eller antigent eller haptent stof, samt organer til 10 at bringe væsker til at passere rækken af kapi 11 arelementer samtidigt eller sekventielt.
Under brug af apparatet kan væsker, herunder ukendte prøver og testreagenser, trækkes ind i apparatet og dermed bringes i kontakt 15 med den indre overflade af hvert af kapillarelementerne og derefter uddrives derfra. Eksempelvis kan et sådant apparat omfatte en gummibold eller en sprøjteanordning.
Apparatet kan anvendes i kombination med en flerhed af beholdere, 20 hvorved der kan udføres en analyse ved at bringe de indre overflader af kapi11 arelementerne i apparatet i kontakt med opløsninger indeholdt i denne flerhed af beholdere i en forudbestemt sekvens. Alternativt kan de forskellige analyseopløsninger og reagenser være anbragt i brønde i en reagensbakke.
25
Alment kan kapi11 arelementerne i apparatet være fremstillet af et hvilket som helst egnet materiale, såsom glas, polyvinylchlorid, polystyren eller andre egnede plastmaterialer, men det er vigtigt, at elementerne er gennemsigtige, således at de reaktioner, der 30 finder sted i hvert element, kan observeres udefra. Antistofferne eller de antigene eller haptene stoffer kan fæstnes til kapillarelementernes indre overflade ved kendte metoder, f.eks. i tilfælde med giaskapi11 arelementer ved adsorption eller kovalent binding og i tilfældet med elementer af plastmateriale ved adsorption eller 35 kovalent binding. Kapi 11 arelementerne kan eksempelvis have en længde på fra 1,5 cm til 2,0 cm og have en indre diameter på ca. 1 mm samt en ydre diameter på ca. 2 mm. Sådanne elementer har en kapacitet på omkring 5 til 20 mikroliter.
DK 158682 B
7 I en udføre!sesform for apparatet er flerheden af kapillarelementerne forbundet i serie ved hjælp af slangeformede forbindelsesled. I denne udførelsesform trækkes væsker, såsom ukendte prøver og testreagenser, ind i og uddrives fra elementerne i rækkefølge. De 5 slangeformede forbindelsesled, der forbinder de individuelle rørformede elementer, kan være af et hvilket som helst egnet materiale, f.eks. har siliconegummi og polyvinylchlorid vist sig at være egnede materialer.
10 Det vil forstås, at udtrykt alment vil brugen af apparatet gøre det muligt at analysere en enkelt prøve mod en række kendte antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i en enkelt analysesekvens. I en sådan "screenings-analyse" vil hvert kapillarelement være forsynet med et forskelligt, kendt antistof eller antigent eller haptent 15 stof, og der kan også i apparatet inkluderes et kapi11 arelement, som udgør en "positiv kontrol". Ved analyse af en ukendt prøve for de antistoffer eller de antigene eller haptene stoffer, der er fæstnet til de indre overflader i kapillarelementerne, er det kun nødvendigt at udføre en enkelt analysesekvens ved at trække de forskellige 20 testvæsker i rækkefølge ind i apparatet, således at hver væske passerer gennem alle kapi11 arelementerne, før den uddrives fra apparatet. Et specielt eksempel på brug af apparatet på denne måde ved udøvelse af ELISA-analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen til påvisning af slangegifte vil blive omtalt i detaljer senere.
25
Apparatet kan også anvendes til en "screeningsprøve" af semikvantitativ type, ved hvilken analyse en enkelt ukendt prøve analyseres sammen med en eller flere kendte positive kontroller mod et enkelt antistof eller antigent eller haptent stof i en enkelt analysese-30 kvens. Den kendte positive kontrol eller kontroller kan indeholde kendte niveauer af det materiale, som skal påvises i prøven, og igen udføres den enkelte analysesekvens ved at trække de forskellige analysevæsker i sekvens ind i apparatet og dermed ind i kapillar-elementerne, før de uddrives derfra.
35
Fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse illustreres under henvisning til den tilhørende tegning, hvor figur 1 viser en afbildning af forskellige pH-indikatorers
DK 158682B
8 absorption som funktion af tiden, figur 2 er et delvis snitbillede gennem et apparat, der kan anvendes ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen, og 5 figur 3 er et delvis snitbillede gennem et andet apparat, der kan anvendes ved udøvelse af fremgangsmåden ifølge opfindelsen.
Som tidligere anført er bromcresolpurpur effektiv til påvisning af 10 ammoniak ved at give et fuldstændigt og hurtigt farveskift.
I modsætning hertil giver andre afprøvede pH-indikatorer ikke et sammenligneligt farveskift eller udviser en lignende reaktionshur-tighed ved en bestemt koncentration af antigent stof, f.eks. slange-15 gift. Figur 1 på den tilhørende tegning illustrerer følsomheden af bromcresolpurpur (BCP) som indikator for tilstedeværelse af ammoniak frembragt ved indvirkningen af urease på urinstof sammenlignet med de andre pH-indikatorer cresolrødt (CR), bromthymolblåt (BPB), chlorphenolrødt (CPR) og phenolrødt (PR), der alle, som vist i tabel 20 1 nedenfor, udviser et farveskift i pH-området fra 5 til 8.
TABEL 1
Amax Begynd- pH-område Farve- (nm) af eises- for skiftets 25 Indikator Forkortel se anion pH farveskift natur
Bromcresol- purpur BCP 590 5,0 5,2-6,8 gul -* violet 30 Cresolrødt CR 572 6,5 7,2-8,8 gul -* rød
Bromthymol- blåt BTB 648 6,0 6,0-7,6 gul - blå 35 Chlorphenol- CPR 568 5,1 5,2-6,8 gul -*· rød rødt
Phenolrødt PR 555 6,6 6,6-8,0 gul rød
DK 158682 B
9
Det fremgår af figur 1, at i et ikke-pufret system giver pH-indika-torerne BCP, BTB og PR rette linier, når absorptionen afbildes som funktion af tiden, hvorimod CR og CPR giver kurveformede reaktionsforløb. Desuden er BCP meget mere følsomme end de andre indikatorer 5 og giver et markant skift fra gult til purpur, som let kan påvises visuelt, eftersom disse farver befinder sig langt fra hinanden i det synlige lysspektrum. BCP Giver derfor en lang række fordele som indikator til anvendelse ved EIA-analyser involverende urease sammenlignet med de andre pH-indikatorer, som ville forventes at 10 give høje reaktionshastigheder og dermed være mere følsomme ved ureases pH-optimum i EIA-systemet. Bromcresolpurpur er også specielt fordelagtig sammenlignet med anvendelsen af Nessler-reaktionen til påvisning af dannelsen af ammoniak, eftersom brugen af en pH-indi-kator tilvejebringer en kontinuerlig måling af ureaseaktivitet og 15 ikke ødelægger enzymet, som det er tilfældet ved Nessler-reaktionen.
Det er følgelig specielt fordelagtigt at anvende bromcresolpurpur til udførelse af analyse under anvendelse af urease/urinstof som enzym/substrat-systemet i ELISA-metoder.
20 Ved en yderligere væsentlig forbedring af analyseproceduren ifølge opfindelsen, er det blevet konstateret, at tilstedeværelsen af ikke-specifik binding under analyseproceduren, navnlig af antistof-enzymkonjugatet til den faste fase, kan nedsættes ganske væsentlig ved inkorporeringen af ovalbumin i antistof/enzym-konjugatreagenset.
25 Dette reagens omfatter almindeligvis konjugatet i en standardfortyndingspuffer, f.eks. pufret saltvandopløsning (pH 7,2) indeholdende 0,5 vægt% overfladeaktivt middel (Tween 20), 0,25 vægt% bovin-serumalbumin og 0,lvægt% konserveringsmiddel (natriumazid). Ifølge denne yderligere forbedring sættes ovalbumin til dette reagens i en 30 mængde på 0,1 vægt% eller mere, fortrinsvis fra 0,25 til 1 vægt%.
Det på figur 2 viste apparat er specielt beregnet til brug ved påvisning af slangegift, og det vil herefter blive beskrevet under speciel henvisning til dets brug på denne måde. Apparatet omfatter 35 en glasrørenhed 10, og en sprøjte 11, som er beregnet til at trække væsker ind i og uddrive væsker fra glasrørssamlingen 10. Samlingen 10 omfatter 6 rørformede elementer 1, 2, 3, 4, 5, 6, som er forbundet i serie ved hjælp af siliconegummislanger 8. Hvert af rørene 1-5 har vedhæftet forskellig antislangegi ft på de indre overflader
DK 158682 B
10 på følgende måde: Rør 1 Tiger Snake Rør 2 Brown Snake 5 Rør 3 King Brown Snake Rør 4 Death Adder Rør 5 Taipan Rør 6 fungerer som en positiv kontrol. Røret 6's frie ende forsegles 10 ved hjælp af et forseglet plastrør 7, som i modsætning til de gennemsigtige rør 1-5 kan være farvet eller ugennemsigtigt. Det på figur 2 illustrerede apparat anvendes til påvisning og identifikation af slangegifte i kombination med en række flasker, der ^rfdehoTder- følgende opløsninger: 15
Flaske 1 indeholder vaskepuffer.
Flaske 2 indeholder antistof/enzym-konjugat, dvs. antislangegi ft koblet til urease i pufret sal in.
Flaske 3 indholder vaskevæske (ikke pufret).
20 Flaske 4 indeholder enzymsubstrat og indikator, dvs. urinstofløsning, bromcresolpurpur og EDTA (til kompleksbinding af alle metalioner, som kunne hæmme ureasen).
Følgende procedurer følges ved udførelse af analysen: 25 (1) Det kontrolleres, at forbindelsesledene mellem apparatets rør er er i orden. Umiddelbart før brug afskæres spidsen af plastrøret og væsken uddrives fra rørene.
(2) Den kliniske prøve indsuges, indtil rørsamlingen er fyldt.
(3) Analysen henstår ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.
30 (4) Indholdet uddrives (affald). Vaskevandet suges ind (flaske 1), indtil sprøjten er omtrent halvt fuld. Væsken uddrives (affald). Gentages 3 gange.
(5) Indsug luft, derefter konjugat (flaske 2), indtil alle rørene er fyldt.
35 (6) Analysen henstår ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.
(7) Indholdet uddrives (affald). Vaskeopløsning indsuges (flaske 3), indtil sprøjten er omtrent halvt fuld. Væsken uddrives (affald). Gentages 3 gange.
(8) Luft indtrækkes efterfulgt af substrat (flaske 4), indtil alle
DK 158682 B
η rørene er fyldte.
(9) Prøven observeres omhyggelig mod en hvid baggrund 20 minutter efter trin 8. Alle slangegifte krydsreagerer immunologisk og derfor noteres det første rør, der efter kontrol røret 6 udviser 5 farveændringssekvensen gul-grøn-blå-purpur.
Det skal bemærkes, at ved den ovenfor beskrevne analyse er den indikator, der anvendes til påvisning af frembringelse af ammoniak i urease/urinstof-systemet bromcresolpurpur. Som tidligere nævnt er 10 det blevet konstateret, at denne indikator er specielt fordelagtig i dette system, og det er konstateret, at påvisningsgrænsen for analysen udført ifølge ovenstående er ca. 10-20 ng pr. milliliter prøve i trin 2. Der kan desuden opnås større følsomhed ved at gentage prøven under anvendelse af længere inkubationstider i trin 3 og 6 15 (f.eks. af størrelsesordenen fra 20 til 30 minutter). Som tidligere omtalt er anvendelsen af denne indikator i urease/enzym-systemet imidlertid ikke begrænset til anvendelse sammen med det apparat, der er omtalt i den foreliggende beskrivelse, og en fagmand vil forstå, at indikatoren har bred anvendelighed som en almen indikator til 20 påvisning af ureaseaktivitet ved ELISA-metoder under anvendelse af andet apparatur. Det i detaljer ovenfor beskrevne apparat kan også bruges til påvisning af antistoffer mod stivkrampe, såvel som ved andre screeningsanalyser, der udnytter ELISA-analysefremgangsmåden ifølge opfindelsen.
25
Det i figur 3 afbildede apparat illustrerer en alternativ udførelsesform til anvendelse ved f.eks. en screeningsanalyse for digoxin eller stivkrampe, og apparatet vil blive beskrevet herefter under speciel henvisning til dets brug til dette formål.
30
Apparatet 20 omfatter 3 rørformede eller kapi 11 arformede glaselementer 21, 22 og 23 anbragt i et fælles legeme eller støtteorgan 24. Til den indre overflade af hvert af disse elementer er hæftet et haptent stof, som nedenfor beskrevet. Støtteorganet 24 er også 35 udstyret med 3 borehuller 25, 26 og 27, som står i forbindelse med elementerne 21, 22 henholdsvis 23. I borehullerne 25, 26 og 27 er der anbragt stempler 28, 29 henholdsvis 30, som er beregnet til at trække væske gennem de respektive kapi11 arelementer og ind i borehullerne og til at uddrive disse væsker gennem de respektive
DK 158682 B
12 elementer ved bevægelse af stemplerne inden i borehullerne. Stemplerne 28, 29 og 30 er forbundet til et enkelt håndteringsstykke 31, således at væsker samtidig trækkes ind i og uddrives fra hver af kapillarelementerne 21, 22 og 23. Bag en del af elementerne 21, 22 5 og 23 er der tilvejebragt et hvidt baggrundsområde 32, for at gøre den visuelle sammenligning af udviklet farve i disse elementer lettere.
Apparatet 20 kan anvendes ved en digoxinscreeningsanalyse baseret på 10 den i det ukendte serum frie digoxins hæmning af bindingen af urease-antidigoxinantistofkonjugat til digoxin, der er immubiliseret på giaskapi11 arelementernes indre, overflade. Denne analyse kan udformes til påvisning af digoxin i patienters serum i koncentrationer ned til 1,0 ng pr. ml, mellem 1,0 og 3,0 ng pr. ml og over 3,0 15 ng/ml. Det accepterede terapeutiske område for digoxin ligger mellem 1,0 og 3,0 ng/ml, serumkoncentrationer under dette område kan være ueffektive, serumniveauer over dette område kan være toxiske. Denne enkle screeningsanalyse gør det muligt for lægen at bestemme patientens forligelighed med foreskreven medicin og i tilfælde, hvor der 20 er mistanke om toxicitet, hurtigt at bekræfte diagnosen.
På grund af digoxins haptene natur fungerer denne analyse ved hæmningen af farveudvikling, hvilket er i kontrast til den ovenfor beskrevne slangegiftpåvisningsanalyse. Den ukendte prøve af pa-25 tientens serum og urease-antidigoxinkonjugat præinkuberes sammen i et reagensglas eller en brønd i en reagensbakke. Samtidig inkuberes kendte positive serumprøver (1 ng/ml og 3 ng/ml fri digoxin) med konjugat i tilstødende rør eller brønde. Efter en forudbestemt inkuberingsperiode ved stuetemperatur trækkes blandingerne samtidig 30 ind i de respektive kapillarelementer 21, 22 og 23, til hvis indre overflade der kovalent er fæstnet digoxin konjugeret til human serumalbumin. Efter en yderligere inkuberingsperiode uddrives blandingerne fra elementerne 21, 22 og 23, elementerne vaskes, og den tidligere omtalte urinstofindikator trækkes samtidig ind i 35 elementerne. Den ukendte prøves hæmning af farveudviklingen sammenlignes derefter med farveudviklingen i de sera, der indeholder kendte mængder af fri digoxin til tilvejebringelse af en semikvan-titativ analyse af den ukendte prøve.
13
DK 158682B
En alternativ anvendelse af apparatet 20 er ved screeningsanalyse for stivkrampe, ved hvilken analyse en prøve af patientens blod eller serum screenes mod referenceserum eller blod til fastlæggelse af prøvens koncentrationsniveau af antistoffer mod stivkrampe.
5 Analysen er baseret på påvisning af binding af stivkrampeantistoffer til renset stivkrampeantigen, der er immubiliseret på glaskapillar-elementernes indre overflade, hvilken metode omfatter inkubering af serum- eller blodprøven samt høj (f.eks. mindst 1,28 internationale enheder pr. ml) og lav (f.eks. ikke over 0,01 internationale enheder 10 pr. ml) referencesera eller blod i individuelle elementer 21, 22 og 23 i apparatet 20 i et tidsrum på ca. 10 minutter, og efter passende vask at indføre anti-human Ab (IgG) - ureasekonjugat og inkubere i yderligere en periode på ca. 10 minutter. Efter yderligere vask tilføres et substrat/indikatorsystemet omfattende urinstof og 15 bromcresolpurpur som tidligere beskrevet, og farveudviklingen i prøveanalysen sammenlignes med referenceprøverne indeholdende højt og lavt koncentrationsniveau til påvisning af stivkrampeantistofti teren i prøven.
20 Under anvendelse af den ovenfor skitserede analysemetode kan prøven klassificeres i en af 3 kategorier: (a) En titer, der er lig med eller større end titeren for reference med højt koncentationsniveau.
25 - Indicerer, at patienten er meget immun og sandsynligvis ikke behøver en vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået immunitet (som muligvis kunne medføre risiko for en ugunstig reaktion).
(b) En titer mellem den høje og referencetiter.
30 - Indicerer, at patienten er immun, men at en vaccineindsprøjt ning til forstærkning af tidligere opnået immunitet sandsynlig er berettiget.
(c) En titer lig med eller mindre end den lave referencetiter.
- Indicerer, at patienten ikke er immun, og i tilfælde af kvæs-35 telse er indgivelse af stivkrampeimmunglobulin og vaccine sand synligvis berettiget.
I hvert af de ovenfor anførte eksempler fremstilles ureasekonjugatet ved standardmetoder, enten ved enkelttrinsglutaraldehydmetoden
DK 158682B
14 (Aurameas, S., Ternynck, T. og Guesdon, J.L., "Coupling of enzymes to antibodies and antigens", 1978 Scand.O.Immunol. 8 (Suppl. 7), s.7-23) eller ved M.B.S.-metoden (Monji, N., Malkus, H. og Castro, A., "Maleimide derivative of hapten for coupling to enzyme: A new 5 method in enzyme immunoassay" Biochem. Biophys. Res. Comm., 85, 671 (1978)). Konjugatreagenset fremstilles i en pufret saltvandsopløsning (pH 7,2) som beskrevet i detaljer ovenfor og indbefatter ovalbumin i en mængde på fra 0,25 til 1 vægt% for at minimere uspecifik binding af konjugatet.
10
Substratopløsningen omfatter en fortyndet urinstofopløsning, f.eks. indeholdende 1 mg/ml urinstof i giasdestilieret vand, hvortil sættes EDTA til kompleks binding af tungmetalioner, som kan forgifte ureasen.
15 20 25 30 35
Claims (10)
1. Fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof eller et antigent eller haptent stof i en prøve ved 5 ELISA-metoden, ved hvilken fremgangsmåde bindingen af et anti- stof/enzym- eller antigen/enzym-konjugat til en fast fase anvendes til påvisning af tilstedeværelse eller fravær af antistof eller et antigent eller haptent stof i prøven, kendetegnet ved, at det i konjugatet anvendte enzym er urease, at den faste fase kontak-10 tes med urinstof som enzymsubstrat, og at tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under anvendelse af di-brom-o-cre-solsulfonphthalein til påvisning af tilstedeværelse af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven.
2. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af et antigent eller haptent stof i en prøve, kendetegnet ved, at den i rækkefølge omfatter: enten (1) at prøven kontaktes med en fast fase, hvortil antistof, 20 der modsvarer det antigene eller haptene stof, er fæstnet, og hvorefter den faste fase kontaktes med et ant istof/enzym-kon j ugat, eller (2) at prøven kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, idet antistoffet i konjugatet er det antistof, der modsvarer 25 det antigene eller haptene stof, og enzymet i konjugatet er urease, og at den fremkomne blanding derefter kontaktes med en fast fase, hvortil det antigene eller haptene stof er fæstnet; (3) at den faste fase derefter kontaktes med urinstof som 30 enzymsubstrat, og (4) at tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under anvendelse af di-brom-o-cresolsulfonphthalein-indikator til påvisning af tilstedeværelse af de antigene eller haptene stoffer i prøven.
3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof i en prøve, kendetegnet ved, at den i rækkefølge omfatter: 35 DK 158682B (1) . at prøven kontaktes med en fast fase, hvortil der er fæstnet antigen som modsvarer antistoffet. (2) . at den faste fase kontaktes med et antistof/enzym-kon- jugat, idet antistoffet i dette konjugat er rettet mod den 5 dyrearts antistoffer, der undersøges for, og at enzymet i konjugatet er urease, (3) . at den faste fase kontaktes med urinstof som enzym substrat, og (4) . at tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes 10 under anvendelse af di-brom-o-cresolsulfonphthalein- indikator til påvisning af tilstedeværelse af antistof i prøven.
4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-3, 15 kendetegnet ved, at konjugatet er opløst i et pufret fortyndingsmedium, hvilket medium også indeholder ovalbumin til minimering eller forhindring af uspecifik binding af konjugatet til den faste fase.
5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at ovalbumin er til stede i fortyndingsmediet i en mængde på mindst 0,1 vægt%, fortrinsvis fra 0,25 til 1,0 vægt%.
6. Analysekit til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af 25 antistof eller et antigent eller haptent stof i en prøve ved ELISA-metoden, hvorved bindingen af et antistof/enzym- eller antigen/enzym-konjugat til en fast fase anvendes til påvisning af tilstedeværelse eller fravær af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven, kendetegnet ved, at det omfatter 30 et antistof/enzym- eller antigen/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og et substrat/indikatorsystem omfattende urinstof som enzymsubstratet og di-brom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.
7. Analysekit ifølge krav 6 til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af et antigent eller haptent stof i en prøve, kendetegnet ved, at det i kombination omfatter: (1) en fast fase, hvortil er fæstnet antistof, der modsvarer det DK 158682 B antigene eller haptene stof, (2) et antistof/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og (3) et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzym- 5 substratet og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.
8. Analysekit ifølge krav 6 til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof i en prøve, kendetegnet ved, at det i kombination omfatter: 10 (1) en fast fase, hvortil er fæstnet antigen, der modsvarer antistoffet, (2) et antistof/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og 15 (3) et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzymsubstratet og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.
9. Analysekit ifølge et hvilket som helst af kravene 6-8, kendetegnet ved, at konjugatet er opløst i et pufret 20 fortyndingsmedium, hvilket medium også indeholder ovalbumin til minimering eller forhindring af ikke-specifik binding af konjugatet til den faste fase.
10. Analysekit ifølge krav 9, kendetegnet ved, at ovalbumin 25 er til stede i fortyndingsmediet i en mængde på mindst 0,1 vægt%, fortrinsvis fra 0,25 til 1,0 vægt%. 30 35
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| AUPE704380 | 1980-12-22 | ||
| AUPE704380 | 1980-12-22 | ||
| PCT/AU1981/000191 WO1982002211A1 (en) | 1980-12-22 | 1981-12-22 | Device and method for detecting antigens and antibodies |
| AU8100191 | 1981-12-22 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK375782A DK375782A (da) | 1982-08-20 |
| DK158682B true DK158682B (da) | 1990-07-02 |
| DK158682C DK158682C (da) | 1990-12-31 |
Family
ID=3768896
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK375782A DK158682C (da) | 1980-12-22 | 1982-08-20 | Fremgangsmaade og analysekit til paavisning af antigener og antistoffer. |
| DK002590A DK159408B (da) | 1980-12-22 | 1990-01-05 | Apparat til paavisning af antigener og antistoffer |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK002590A DK159408B (da) | 1980-12-22 | 1990-01-05 | Apparat til paavisning af antigener og antistoffer |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0067182B1 (da) |
| JP (1) | JPS57502041A (da) |
| AT (1) | ATE41528T1 (da) |
| CA (1) | CA1184847A (da) |
| DE (1) | DE3176186D1 (da) |
| DK (2) | DK158682C (da) |
| NO (1) | NO822750L (da) |
| NZ (1) | NZ199286A (da) |
| WO (1) | WO1982002211A1 (da) |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1230552A (en) * | 1983-11-07 | 1987-12-22 | Howard M. Chandler | Device and method for performing qualitative enzyme immunoassays |
| US4791060A (en) * | 1983-11-07 | 1988-12-13 | Allelix Inc. | Device for performing qualitative enzyme immunoassays |
| CA1218930A (en) * | 1984-02-22 | 1987-03-10 | Allelix Biopharmaceuticals Inc. | Device for performing quantitative chemical and immunochemical assays |
| US4585623A (en) * | 1984-02-27 | 1986-04-29 | Allelix Inc. | Device for performing quantitative chemical and immunochemical assays |
| GB8406752D0 (en) * | 1984-03-15 | 1984-04-18 | Unilever Plc | Chemical and clinical tests |
| EP0194988A1 (fr) * | 1985-03-14 | 1986-09-17 | Bertrand, Alain | Support pour tests de laboratoire |
| WO1986006488A1 (en) * | 1985-04-29 | 1986-11-06 | Hichem Diagnostics, Inc., Dba Bural Technologies | Diagnostic test kit |
| WO1987007384A1 (en) * | 1986-05-30 | 1987-12-03 | Quidel | Enzyme immunoassay device |
| US4918025A (en) * | 1987-03-03 | 1990-04-17 | Pb Diagnostic Systems, Inc. | Self contained immunoassay element |
| EP0367794A4 (en) * | 1987-07-02 | 1991-03-13 | In Vitro Technologies, Inc. | Capillary device for immunoassay of multiple analytes |
| GB2213932A (en) * | 1987-12-15 | 1989-08-23 | Pall Corp | Dipstick immunodiagnostic device |
| EP0327786A1 (en) * | 1988-02-11 | 1989-08-16 | IntraCel Corporation | Method and apparatus for carrying out chemical or biochemical reactions in porous carrier phases |
| US5030555A (en) * | 1988-09-12 | 1991-07-09 | University Of Florida | Membrane-strip reagent serodiagnostic apparatus and method |
| DE69422604T2 (de) * | 1994-03-08 | 2000-06-08 | Zeptosens Ag, Witterwil | Vorrichtung und Verfahren, die Bioaffinitätsassay und elektrophoretische Auftrennung kombinieren |
| DE19620636A1 (de) * | 1995-06-01 | 1996-12-19 | Fraunhofer Ges Forschung | Vorrichtung zur Durchführung chemischer oder biochemischer Affinitätsverfahren und Verfahren zum Betreiben der Vorrichtung |
| US6559296B2 (en) | 1997-08-29 | 2003-05-06 | Olympus Optical Co., Ltd. | DNA capillary |
| JP3938982B2 (ja) * | 1997-08-29 | 2007-06-27 | オリンパス株式会社 | Ｄｎａキャピラリィ |
| WO2002089972A1 (en) * | 2001-05-03 | 2002-11-14 | Commissariat A L'energie Atomique | Microfluidic device for analyzing nucleic acids and/or proteins, methods of preparation and uses thereof |
| ATE376882T1 (de) * | 2003-07-04 | 2007-11-15 | November Ag Molekulare Medizin | Verwendung eines einwegbehälters, mikrofluidische vorrichtung und verfahren zur bearbeitung von molekülen |
| FR2860006B1 (fr) * | 2003-09-24 | 2006-12-22 | Commissariat Energie Atomique | Dispositif pour separer et/ou analyser plusieurs cibles moleculaires en solution dans un melange complexe |
| EP1888780A4 (en) * | 2005-05-06 | 2009-11-11 | Applera Corp | MULTIPLE CAPILLARY DEVICE AND METHOD FOR SYNTHESIS AND DELIVERY |
| EP2450691A1 (en) * | 2010-11-05 | 2012-05-09 | Aqsens Oy | Device and method for holding and analysing a sample |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE1598224A1 (de) * | 1964-10-12 | 1970-07-30 | Heinrich Dipl Chem Gerhard Her | Verfahren und Roehrchen zur Durchfuehrung klinisch-chemischer Analysen |
| NL154600B (nl) * | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| ZA733611B (en) * | 1972-10-11 | 1974-04-24 | Merck Patent Gmbh | Indicator for the determination of urea |
| US3917453A (en) * | 1974-08-16 | 1975-11-04 | Polaroid Corp | Method and device for determining the concentration of a substance in a fluid |
| US3950226A (en) * | 1974-10-31 | 1976-04-13 | Moon Ki Chang | Novel reagent and method for the determination of urea in biological fluids |
| NL7501215A (nl) * | 1975-02-01 | 1976-08-03 | Akzo Nv | Methode voor het aantonen en bepalen van een antigeen of antilichaam. |
| US3983745A (en) * | 1975-08-08 | 1976-10-05 | Mts Systems Corporation | Test specimen crack correlator |
| JPS52112379A (en) * | 1976-03-17 | 1977-09-20 | Toyo Boseki | Method and instrument for effecting chemical analysis |
| US4210418A (en) * | 1976-08-30 | 1980-07-01 | Mallinckrodt, Inc. | Container for immunochemical and enzymatical determinations or procedures |
| IT1105734B (it) * | 1977-07-14 | 1985-11-04 | Syva Co | Prova di legame di competizione di antienzima omogeneo |
| JPS54111892A (en) * | 1978-02-17 | 1979-09-01 | Ii Mairusu Rooton | Method and device for inspecting numerous data |
| US4302536A (en) * | 1978-08-15 | 1981-11-24 | Longenecker Robert W | Colorimetric immunoassay process |
| AU540523B2 (en) * | 1980-03-06 | 1984-11-22 | Commonwealth Serum Laboratories | Apparatus for detecting antigens or antibodies |
-
1981
- 1981-12-15 NZ NZ199286A patent/NZ199286A/en unknown
- 1981-12-21 CA CA000392770A patent/CA1184847A/en not_active Expired
- 1981-12-22 DE DE8282900081T patent/DE3176186D1/de not_active Expired
- 1981-12-22 EP EP82900081A patent/EP0067182B1/en not_active Expired
- 1981-12-22 JP JP57500157A patent/JPS57502041A/ja active Pending
- 1981-12-22 WO PCT/AU1981/000191 patent/WO1982002211A1/en not_active Ceased
- 1981-12-22 AT AT84201067T patent/ATE41528T1/de not_active IP Right Cessation
-
1982
- 1982-08-12 NO NO822750A patent/NO822750L/no unknown
- 1982-08-20 DK DK375782A patent/DK158682C/da active
-
1990
- 1990-01-05 DK DK002590A patent/DK159408B/da not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0067182A1 (en) | 1982-12-22 |
| NZ199286A (en) | 1986-05-09 |
| DE3176186D1 (en) | 1987-06-19 |
| DK158682C (da) | 1990-12-31 |
| DK2590A (da) | 1990-01-05 |
| EP0067182A4 (en) | 1983-04-29 |
| DK2590D0 (da) | 1990-01-05 |
| JPS57502041A (da) | 1982-11-18 |
| EP0067182B1 (en) | 1987-05-13 |
| CA1184847A (en) | 1985-04-02 |
| NO822750L (no) | 1982-08-12 |
| DK159408B (da) | 1990-10-08 |
| ATE41528T1 (de) | 1989-04-15 |
| WO1982002211A1 (en) | 1982-07-08 |
| DK375782A (da) | 1982-08-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK158682B (da) | Fremgangsmaade og analysekit til paavisning af antigener og antistoffer. | |
| RU2503009C2 (ru) | Устройство и способ для разделения и анализа крови | |
| US4769216A (en) | Device for detecting antigens and antibodies | |
| US4590157A (en) | Method for detecting antigens and antibodies | |
| US4770853A (en) | Device for self contained solid phase immunodiffusion assay | |
| JP3358737B2 (ja) | 改良された投与量応答曲線を有するアッセイ | |
| EP2874545B1 (en) | Disposable test device | |
| CN112485436A (zh) | 检测新冠疫苗注射后体内中和抗体的胶体金免疫层析试纸条及其制备方法 | |
| JPH04290961A (ja) | 迅速で簡単なマニュアルアッセイを行うためのデバイス | |
| LEWIS et al. | Hemagglutination in the diagnosis of toxoplasmosis and amebiasis | |
| US20040133128A1 (en) | Assay device with attachable seal for use with specimen collection and assay containers | |
| DK174032B1 (da) | Sæt samt fremgangsmåde til immunometrisk dosering, der kan anvendes på hele celler | |
| CN112379089A (zh) | 一种基于量子点微球免疫层析试纸条的新冠病毒检测方法 | |
| EP0134605B1 (en) | Device for detecting antigens and antibodies | |
| JPH09507577A (ja) | 多対象同時測定用反応カラムと方法 | |
| McArthur et al. | A rapid micro-method for screening eel sera for antibodies against the digenean Telogaster opisthorchis Macfarlane, 1945. | |
| CA1191786A (en) | Device and method for detecting antigens and antibodies | |
| CN113009144B (zh) | 一种基于微流控技术的抗体检测试剂盒及检测方法 | |
| EP0451687A2 (en) | Chlamydia half-sandwich immunoassay | |
| JPH02120665A (ja) | 分析読取装置 | |
| JPH01221665A (ja) | 単一エピトープ分折物検出のための競合固体相イムノアッセイ法、及びそのためのキット | |
| NZ212930A (en) | Device utilisable in a method for detecting antigens and antibodies | |
| CN105326511B (zh) | 一种用于免疫检测的真空采血装置 | |
| CN105223349A (zh) | 一种检测样本的装置 | |
| JPH01274066A (ja) | 酵素免疫測定法 |