DK159408B - Apparat til paavisning af antigener og antistoffer - Google Patents

Description

DK 159408 B

i

Opfindelsen angår et apparat til brug ved påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antigene eller haptene stoffer eller antistoffer i en prøve.

5 I beskrivelsen til australsk patentansøgning nr. 68117/81 omtales metoder og apparater til udøvelse af ELISA-analyser beskrevet specielt i forbindelse med anvendelse ved påvisning af antistoffer mod stivkrampe i får og påvisning samt identifikation af slangegifte som eksempler på sådanne analyser.

10 I ovennævnte beskrivelse omtales et apparat til påvisning og bestemmelse af tilstedeværelse af antigene eller haptene stoffer eller antistoffer i en prøve, hvilket apparat omfatter en flerhed af beholdere, hvorhos én af beholderne er forsynet med et låg, til hvis 15 indre overflade er fæstnet antistoffer eller antigene eller haptene stoffer, hvilket låg er beregnet til at overføres fra den ene beholder til den næste, således at lågets indre overflade bringes i kontakt med opløsninger i rækken af beholdere i en forudbestemt sekvens. I én udførelsesform indbefatter lågets "indre overflade" de 20 overflader af selve låget, som, når låget påsættes en beholder, kommer i kontakt med beholderens indhold, såvel som overflader af fremspringende dele på låget, som rager ind i beholderens indre, når låget påsættes, samt overflader, som er fysisk bundet til, eller som befinder sig i låg, og som selv udsættes for kontakt med beholderens 25 indhold, når låget sættes på. I en alternativ udførelsesform omfatter lågets "indre overflade", hvortil antistoffer eller antigene eller haptene stoffer bindes, den indre overflade af et rør, som er fæstnet til låget, f.eks. rørdelen af et låg af "dråbetællertypen" med en gummibold eller lignende, som gør det muligt at trække væske 30 op i røret og uddrive den derfra.

En af de vigtigste begrænsninger ved ovennævnte apparat ligger i den kendsgerning, at kun et enkelt antistof eller antigent eller haptent stof kan fæstnes til lågets indre overflade eller til det til låget 35 fæstnede rør. Dette er en forholdsvis stor begrænsning, når appara-tet skal anvendes til screening. Til f.eks. påvisning og identifikation af slangegift i Australien er det sædvanligvis nødvendigt at være i stand til at påvise mindst 2 og i de fleste tilfælde 5 primære slangegifte for at muliggøre udvælgelse af den 2

DK 159408 B

hensigtsmæssige modgift. Det betyder, at når det omtalte kendte apparat anvendes, må der udføres mindst 2 eller ofte 5 separate analyser for at identificere den ukendte slangegift i den kliniske prøve samtidig med udførelse af kontrol prøver, hvor dette er hen-5 sigtsmæssigt. Nødvendigheden af at udføre flere separate prøver er naturligvis specielt en ulempe ud fra det synspunkt, at de nødvendige prøver skal udføres i marken.

Fra GB patentskrift nr. 2.015.158 kendes en anordning, som muliggør 10 en samtidig bestemmelse af flere stoffer ud fra en enkelt prøve. I dette skrift er der imidlertid ingen omtale af anvendelse af kapillarrør, og det er endvidere påkrævet, at rørene er forbundet indbyrdes på frigøri ig måde.

15 Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe et apparat med kapi 11 arformede elementer til brug ved påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antigene eller haptene stoffer eller antistoffer i en prøve, hvorved udførelse af en flerhed af separate analyser kan undgås. Apparatet muliggør udførelse af 20 sådanne analyser ved en enkelt procedure, som ikke kræver anvendelse af kompliceret laboratorieudstyr eller trænet laboratoriepersonale, og som derfor kan udføres under forholdsvis ugunstige betingelser, f.eks. i marken.

25 Dette opnås med apparatet ifølge opfindelsen, hvilket apparat er ejendommeligt ved, at det omfatter en flerhed af kapillarformede elementer, hvorhos der til en indre overflade af hvert kapillarelement er fæstnet antistoffer eller antigene eller haptene stoffer, samt organer, der kan bringe væsker til at passere rækken af kapil -30 larelementer samtidigt eller sekventielt.

Under brug af apparatet ifølge opfindelsen kan væsker, herunder ukendte prøver og testreagenser, trækkes ind i apparatet og dermed bringes i kontakt med den indre overflade af hvert af kapillarele-35 menterne og derefter uddrives derfra. Eksempelvis kan et sådant apparat omfatte en gummibold eller en sprøjteanordning.

Apparatet ifølge den foreliggende opfindelse kan anvendes i kombination med en flerhed af beholdere, hvorved der kan udføres en

DK 159408 B

3 analyse ved at bringe de indre overflader af kapillarelementerne i apparatet i kontakt med opløsninger indeholdt i denne flerhed af beholdere i en forudbestemt sekvens. Alternativt kan de forskellige analyseopløsninger og reagenser være anbragt i brønde i en reagens-5 bakke.

Alment kan kapillarelementerne i apparatet ifølge den foreliggende opfindelse være fremstillet af et hvilket som helst egnet materiale, såsom glas, polyvinylchlorid, polystyren eller andre egnede plast-10 materialer, men det er vigtigt, at elementerne er gennemsigtige, således at de reaktioner, der finder sted i hvert element, kan observeres udefra. Antistofferne eller de antigene eller haptene stoffer kan fæstnes til kapi11 arelementernes indre overflade ved kendte metoder, f.eks. i tilfælde med giaskapi11 arelementer ved 15 adsorption eller kovalent binding og i tilfældet med elementer af plastmateriale ved adsorption eller kovalent binding. Kapillarele-menterne kan eksempelvis have en længde på fra 1,5 cm til 2,0 cm og have en indre diameter på ca. 1 mm samt en ydre diameter på ca. 2 mm. Sådanne elementer har en kapacitet på omkring 5 til 20 mi kroli-20 ter. 1 én udførelsesform for apparatet ifølge opfindelsen er flerheden af kapillarelementerne forbundet i serie ved hjælp af slangeformede forbindelsesled. I denne udførelsesform trækkes væsker, såsom 25 ukendte prøver og testreagenser, ind i og uddrives fra elementerne i rækkefølge. De slangeformede forbindelsesled, der forbinder de individuelle rørformede elementer, kan være af et hvilket som helst egnet materiale, f.eks. har siliconegummi og polyvinylchlorid vist sig at være egnede materialer.

30

Det vil forstås, udtrykt alment, at brugen af apparatet ifølge den foreliggende opfindelse vil gøre det muligt at analysere en enkelt prøve mod en række kendte antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i en enkelt analysesekvens. Ved en sådan "screenings-ana-35 lyse" vil hvert kapillarelement være forsynet med et forskelligt, kendt antistof eller antigent eller haptent stof, og der kan også i apparatet inkluderes et kapi11 arelement, som udgør en "positiv kontrol". Ved analyse af en ukendt prøve for de antistoffer eller antigene eller haptene stoffer, der er fæstnet til de indre 4

DK 159408 B

overflader i kapi11 arelementerne, er det kun nødvendigt at udføre en enkelt analysesekvens ved at trække de forskellige testvæsker i rækkefølge ind i apparatet ifølge den foreliggende opfindelse, således at hver væske passerer gennem alle kapillarelementerne, før 5 den uddrives fra apparatet. Et specielt eksempel på brug af apparatet ifølge den foreliggende opfindelse på denne måde ved udførelse af en ELISA-analyse til påvisning af slangegifte vil blive omtalt i detaljer senere.

10 Apparatet ifølge den foreliggende opfindelse kan også anvendes til en "screeningsanalyse" af semikvantitativ type, ved hvilken en enkelt ukendt prøve analyseres sammen med én eller flere kendte positive kontroller mod et enkelt antistof eller antigent eller haptent stof i en enkelt analysesekvens. Den kendte positive kontrol 15 eller kontroller kan indeholde kendte niveauer af det stof, som skal påvises i prøven, og igen udføres den enkelte analysesekvens ved at trække de forskellige analysevæsker i rækkefølge ind i apparatet og dermed ind i kapillarelementerne, før de uddrives derfra. Anvendelse af apparatet på denne måde til udførelse af digoxin- og stivkrampe-20 screeningsanalyser omtales senere som et yderligere eksempel på brugen af apparatet.

Apparatet ifølge den foreliggende opfindelse kan endvidere anvendes i forbindelse med en fremgangsmåde til påvisning eller bestemmelse 25 af tilstedeværelsen af antistoffer eller af antigene eller haptene stoffer i en prøve. I beskrivelsen til den indledningsvis omtalte australske patentansøgning nr. 68117/81 omtales analyser til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer ved en forbedret "ELISA"-metode, ved 30 hvilken metode enzymet urease anvendes i antistof-enzymkonjugatet, idet urinstof er det tilsvarende enzymsubstrat, der anvendes til at påvise tilstedeværelsen af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven. Forekomst af ammoniak frembragt under indvirkning af enzymet urease på urinstofsubstratet benyttes da som indikation 35 på tilstedeværelsen af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven. Denne forbedrede ELISA-metode finder udbredt anvendelse, ikke alene i forbindelse med det apparatur, der er omtalt ovenfor, samt i den ældre patentbeskrivelse, men også som en generel ELISA-metode til anvendelse i forbindelse med kendt

DK 159408 B

5 apparatur, såsom plader, brønde og lignende.

Ved brug af apparatet ifølge opfindelsen i forbindelse med fremgangsmåden til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af 5 antistof eller et antigent eller haptent stof i en prøve ved ELISA-metoden anvendes binding af et antistof/enzym- eller anti-gen/enzymkonjugat til en fast fase til at indicere tilstedeværelse eller fravær af antistof eller et antigent eller haptent stof i prøven, idet det i konjugatet anvendte enzym er urease, den faste 10 fase kontaktes med urinstof som enzymsubstrat, og tilstedeværelse af ammoniak påvises eller bestemmes under anvendelse af dibrom-o-cre-solsulfonphthalein til at indikere tilstedeværelse af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven. Fremgangsmåden kan alment tilpasses til udførelse af et stort antal analyser.

15

Nedenstående eksempler er illustrative eksempler herpå: A: Antigenpåvisning, f.eks. hepatitis, digoxin.

(a) Sandwich-antigenanalyse: 20 1. Fast fase: Rør - antihepatitis Ab 2. Prøve: ± Hepatitis-subunit eller -virus 3. Konjugat: Antihepatitis Ab - enzym (b) Dobbelt antistof-sandwich-antigenanalyse: 25 1. Fast fase: Rør - antihepatitis Ab type 1 (f.eks. antistof fra får) 2. Prøve: ± Hepatitis-subunit eller -virus 3. Andet antistof: Antihepatitis Ab type 2 (f.eks. antistof fra kanin) 30 4. konjugat: Anti-type 2 Ab - enzym (c) Kompetitiv antigenanalyse: 1. Prøve: + Digoxin 2. Konjugat: Antidigoxin Ab - enzym 35 3. Fast fase: Rør - digoxin (note: Ved denne analyse blandes og inkuberes prøven og konjugatet før det tilføres røret).

B: Antistofpåvisning, f.eks. stivkrampe, rubella.

6

DK 159403 B

(a) Sandwich-antistofanalyse: 1. Fast fase: Rør - stivkrampe Ag 2. Prøve: ± Anti-stivkrampe Ab (humant) 3. Konjugat: Anti-human Ab - enzym 5 (b) Dobbelt antistof-sandwich-antistofanalyse: 1. Fast fase: Rør - stivkrampe Ag 2. Prøve: ± Stivkrampe Ab (human) 3. Andet antistof: Anti-human Ab type 2 (f.eks. antistof 10 fra får mod humant antistof) 4. Konjugat: Anti-type 2 Ab - enzym

Apparatet ifølge opfindelsen kan anvendes til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af et antigent eller haptent stof i 15 en prøve, hvorved: 1. prøven kontaktes med en fast fase, hvortil er fæstnet antistof, der modsvarer det antigene eller haptene stof, hvorefter den faste fase kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, 20 2. prøven kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, hvorhos antistoffet i konjugatet er et antistof, der modsvarer det antigene eller haptene stof, og enzymet i konjugatet er urease, og den fremkomne blanding derefter kontaktes med den faste 25 fase, hvortil det antigene eller haptene stof er fæstnet, 3. den faste fase kontaktes med urinstof som enzymsubstrat, og 4. tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under 30 anvendelse af dibrom-o-cresolsulfonphthaleinindikator til påvisning af tilstedeværelse af de antigene eller haptene stoffer i prøven.

Apparatet ifølge opfindelsen kan endvidere anvendes til påvisning 35 eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistoffer i en prøve, hvorved: 1. prøven kontaktes med en fast fase, hvortil der er fæstnet antigen, som modsvarer antistoffet, i

DK 159408 B

7 2. den faste fase kontaktes med et antistof/enzym-konjugat, idet antistoffet i dette konjugat er rettet mod den dyrearts antistoffer, der undersøges for, og enzymet i konjugatet er urease, 5 3. den faste fase kontaktes med urinstof som enzymsubstrat, og 4. tilstedeværelsen af ammoniak påvises eller bestemmes under anvendelse af dibrom-o-cresolsulfonphthaleinindikator til påvisning af tilstedeværelse af antistof i prøven.

10

Apparatet ifølge opfindelsen kan desuden anvendes i forbindelse med et analysekit til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof eller et antigent eller haptent stof i en prøve ved ELISA-metoden, hvorved bindingen af et antistof/enzym- eller antigen/en-15 zym-konjugat til en fast fase anvendes til påvisning af tilstedeværelse eller fravær af antistoffer eller antigene eller haptene stoffer i prøven, hvilket kit omfatter et antistof/enzym- eller antigen/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzymsubstratet 20 og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.

Analysekittet, som omtalt ovenfor, kan sammensættes af hensigtsmæssige komponenter for at muliggøre udførelsen af det store antal analyseprocedurer, der tidligere er omtalt, herunder de såkaldte 25 "sandwich-analyser" og "kompetitive" analyser samt analyser af dobbelt antistoftypen.

Et testkit til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af et antigent eller haptent stof i en prøve kan således omfatte: 30 1. en fast fase, hvortil er fæstnet antistof, der modsvarer det antigene eller haptene stof, 2. et antistof/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er 35 urease, og 1 et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzymsubstratet og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.

DK 159408 B

8

Et testkit til påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antistof i en prøve kan omfatte: 1. en fast fase, hvortil er fæstnet antigen, der modsvarer anti- 5 stoffet, 2. et antistof/enzym-konjugat, hvorhos enzymet i konjugatet er urease, og 10 3. et substrat/indikator-system omfattende urinstof som enzym substratet og dibrom-o-cresolsulfonphthalein som indikator.

Dibrom-o-cresolsulfonphthalein eller bromcresolpurpur er en indikator for forekomst af ammoniak. Forekomsten påvises ved det pH-15 skift, som det har vist sig at være bedst at påvise ved det livlige farveskift (gul til purpur) af bromcresolpurpur, der er inkorporeret i en ikke-pufret substratopløsning.

Anvendelsen af urease-urinstof som enzymsubstratsystem giver flere 20 vigtige fordele: Substratet urinstof er stabilt og kan opbevares parat til brug; titreringsendepunkterne er skarpe og tydeligt synlige. Enzymet urease forgiftes ikke af natriumazid, og derfor kan testreagenser fremstilles med dette konserveringsmiddel og opbevares parat til brug (dette er ikke tilfældet med peberrodsperoxidase 25 (HRP; Horse Radish Peroxidase), et enzym, som tidligere er blevet anvendt i EIA-analyser). Disse faktorer gør derfor enzymet egnet til EIA-kit beregnet til brug i marken. Enzymet er kommercielt tilgængeligt med en højere specifik aktivitet end andre almindeligt anvendte enzymmærker, og da urease ikke forekommer i pattedyrvæv, 30 hvorimod andre enzymer, såsom peroxidaser, phosphataser og galakto-sidaser kan forekomme i sådanne væv, er urease egnet til brug ved EIA-analyser til påvisning af celleassocierede antigener og deres antistoffer. Endelig kan enzymreaktionen om ønsket stoppes øjeblikkeligt ved tilsætning af det organiske, kviksølvholdige konser-35 veringsmiddel Thiomersal, hvilket således muliggør opbevaring af EIA-resultater til senere undersøgelse.

At bromcresolpurpur med fordel kan anvendes som indikator ved de ovenfor beskrevne metoder kan forekomme overraskende, eftersom det

DK 159408B

9 farveskift, som bromcresolpurpur udviser, finder sted i pH-området fra 5,2 til 6,8. Urease har på den anden side en maximal aktivitet i pH-området fra 7 til 8. Det er ikke desto mindre konstateret, at anvendelsen af bromcresolpurpur til påvisning af forekomst af 5 ammoniak er effektiv ved at give et fuldstændigt og hurtigt farveskift.

Apparatet ifølge den foreliggende opfindelse illustreres yderligere under henvisning til den tilhørende tegning, hvor: 10 figur 1 er et delvist snitbillede af en første udførelsesform for apparatet ifølge opfindelsen, figur 2 er et delvist snitbillede af en anden udførelsesform for 15 apparatet ifølge opfindelsen, og figur 3 viser en afbildning af forskellige pH-indikatorers absorption som funktion af tiden.

20 Det i figur 1 viste apparat er specielt beregnet til brug ved påvisning af slangegift, og det vil herefter blive beskrevet under speciel henvisning til dets brug på denne måde. Apparatet omfatter en glasrørenhed 10, og en sprøjte 11, som er beregnet til at trække væsker ind i og uddrive væsker fra glasrørssamlingen 10. Samlingen 25 10 omfatter 6 rørformede elementer 1, 2, 3, 4, 5, 6, som er forbun det i serie ved hjælp af siliconegummislanger 8. Hvert af rørene 1-5 har vedhæftet forskellig antislangegi ft på de indre overflader på følgende måde: 30 Rør 1 Tiger Snake Rør 2 Brown Snake Rør 3 King Brown Snake Rør 4 Death Adder Rør 5 Taipan Rør 6 fungerer som en positiv kontrol. Røret 6's frie ende forsegles ved hjælp af et forseglet plastrør 7, som i modsætning til de gennemsigtige rør 1-5 kan være farvet eller ugennemsigtigt.

35

DK 159403 B

10

Det i figur 1 illustrerede apparat anvendes til påvisning og identifikation af slangegifte i kombination med en række flasker, der indeholder følgende opløsninger: 5 Flaske 1 indeholder vaskepuffer.

Flaske 2 indeholder antistof/enzym-konjugat, dvs. antislangegi ft koblet til urease i pufret saltvandsopløsning.

Flaske 3 indholder vaskevæske (ikke pufret).

Flaske 4 indeholder enzymsubstrat og indikator, dvs. urinstof-10 opløsning, bromcresolpurpur og EDTA (til kompleksbinding af alle metalioner, som kunne hæmme ureasen).

Følgende procedurer følges ved udførelse af analysen: 15 (1) Det kontrolleres, at forbindelsesleddene mellem apparatets rør er i orden. Umiddelbart før brug afskæres spidsen af plastrøret, og væsken uddrives fra rørene.

(2) Den kliniske prøve indsuges, indtil rørsamlingen er fyldt.

20 (3) Analysen henstår ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.

(4) Indholdet uddrives (affald). Vaskevandet suges ind (flaske 1), indtil sprøjten er omtrent halvt fuld. Væsken uddrives (af- 25 fald). Gentages 3 gange.

(5) Der indsuges luft, derefter konjugat (flaske 2), indtil alle rørene er fyldt.

30 (6) Analysen henstår ved stuetemperatur i ca. 10 minutter.

(7) Indholdet uddrives (affald). Vaskeopløsning indsuges (flaske 3), indtil sprøjten er omtrent halvt fuld. Væsken uddrives (affald). Gentages 3 gange.

35 (8) Luft indtrækkes efterfulgt af substrat (flaske 4), indtil alle rørene er fyldte.

(9) Prøven observeres omhyggeligt mod en hvid baggrund 20 minutter 11

DK 15940BB

efter trin 8. Alle slangegifte krydsreagerer immunologisk, og derfor noteres det første rør, der efter kontrol røret 6 udviser farveændringssekvensen gul-grøn-blå-purpur.

5 Det skal bemærkes, at ved den ovenfor beskrevne analyse er den indikator, der anvendes til påvisning af frembringelse af ammoniak i urease/urinstof-systemet bromcresolpurpur. Som tidligere nævnt er det blevet konstateret, at denne indikator er specielt fordelagtig i dette system, og det er konstateret, at påvisningsgrænsen for ana-10 lysen udført ifølge ovenstående er ca. 10-20 ng pr. milliliter prøve i trin 2. Der kan desuden opnås større følsomhed ved at gentage prøven under anvendelse af længere inkubationstider i trin 3 og 6 (f.eks. af størrelsesordenen fra 20 til 30 minutter). Det i detaljer ovenfor beskrevne apparat kan ligeledes bruges til påvisning af 15 antistoffer mod stivkrampe, såvel som til andre screeningsanalyser, der udnytter ELISA-metoden.

Det i figur 2 afbildede apparat illustrerer en alternativ udførelsesform for apparatet ifølge opfindelsen, f.eks. til anvendelse 20 ved en screeningsanalyse for digoxin eller stivkrampe, og apparatet vil blive beskrevet herefter under speciel henvisning til dets brug til dette formål.

Apparatet 20 omfatter tre rørformede eller kapi11 arformede glas-25 elementer 21, 22 og 23 anbragt i et fælles legeme eller støtteorgan 24. Til den indre overflade af hvert af disse elementer er hæftet et haptent stof som nedenfor beskrevet. Støtteorganet 24 er også udstyret med tre borehuller 25, 26 og 27, som står i forbindelse med elementerne 21, 22 henholdsvis 23. I borehullerne 25, 26 og 27 er 30 der anbragt stempler 28, 29 henholdsvis 30, som er beregnet til at trække væske gennem de respektive kapillarelementer og ind i borehullerne og til at uddrive disse væsker gennem de respektive elementer ved bevægelse af stemplerne inden i borehullerne. Stemplerne 28, 29 og 30 er forbundet til et enkelt håndteringsstykke 31, 35 således at væsker samtidig trækkes ind i og uddrives fra hver af kapillarelementerne 21, 22 og 23. Bag en del af elementerne 21, 22 og 23 er der tilvejebragt et hvidt baggrundsområde 32, for at gøre den visuelle sammenligning af udviklet farve i disse elementer lettere.

DK 159408 B

12

Apparatet 20 kan anvendes ved en digoxinscreeningsanalyse baseret på det i det ukendte serum frie digoxins hæmning af bindingen af urease-antidigoxinantistofkonjugat til digoxin, der er immobiliseret på giaskapi11 arelementernes indre overflade. Denne analyse kan 5 udformes til påvisning af digoxin i patienters serum i koncentrationer ned til 1,0 ng pr. ml, mellem 1,0 og 3,0 ng pr. ml og over 3,0 ng/ml. Det accepterede terapeutiske område for digoxin ligger mellem 1,0 og 3,0 ng/ml, idet serumniveauer under dette område kan være ineffektive, og serumniveauer over dette område kan være toxiske.

10 Denne enkle screeningsanalyse gør det muligt for lægen at bestemme patientens forligelighed med foreskreven medicin og i tilfælde, hvor der er mistanke om toxicitet, hurtigt at bekræfte diagnosen.

På grund af digoxins haptene natur fungerer denne analyse ved 15 hæmningen af farveudvikling, hvilket er i kontrast til den ovenfor beskrevne slangegiftpåvisningsanalyse. Den ukendte prøve af patientens serum og urease-antidigoxinkonjugat præinkuberes sammen i et reagensglas eller en brønd i en reagensbakke. Samtidig inkuberes kendte positive serumprøver (1 ng/ml og 3 ng/ml frit digoxin) med 20 konjugat i tilstødende rør eller brønde. Efter en forudbestemt inkuberingsperiode ved stuetemperatur trækkes blandingerne samtidig ind i de respektive kapi 11 arelementer 21, 22 og 23, til hvis indre overflade der kovalent er fæstnet digoxin konjugeret til humant serumalbumin. Efter en yderligere inkuberingsperiode uddrives 25 blandingerne fra elementerne 21, 22 og 23, elementerne vaskes, og den tidligere omtalte urinstofindikator trækkes samtidig ind i elementerne. Den ukendte prøves hæmning af farveudviklingen sammenlignes derefter med farveudviklingen i de sera, der indeholder kendte mængder frit digoxin til tilvejebringelse af en semikvan-30 titativ analyse af den ukendte prøve.

En alternativ anvendelse af apparatet 20 er ved screeningsanalyse for stivkrampe, ved hvilken analyse en prøve af patientens blod eller serum screenes mod referenceserum eller blod til fastlæggelse 35 af prøvens koncentrationsniveau af antistoffer mod stivkrampe. Analysen er baseret på påvisning af binding af stivkrampeantistoffer til renset stivkrampeantigen, der er immobiliseret på glaskapillar-elementernes indre overflade, hvilken metode omfatter inkubering af serum- eller blodprøven samt høj- (f.eks. mindst 1,28 internationale

DK 159408B

13 enheder pr. ml) og lav- (f.eks. ikke over 0,01 internationale enheder pr. ml) reference-sera eller blod i individuelle elementer 21, 22 og 23 i apparatet 20 i et tidsrum på ca. 10 minutter og efter passende vask indføring af anti-human Ab (IgG) - ureasekonjugat og 5 inkubering i yderligere en periode på ca. 10 minutter. Efter yderligere vask tilføres et substrat/indikatorsystem omfattende urinstof og bromcresolpurpur som tidligere beskrevet, og farveudviklingen i prøveanalysen sammenlignes med referenceprøverne indeholdende højt og lavt koncentrationsniveau til påvisning af stivkrampeantistoftit-10 eren i prøven.

Under anvendelse af den ovenfor skitserede analysemetode kan prøven klassificeres i én af 3 kategorier: 15 (a) En titer, der er lig med eller større end referencetiteren med højt koncentrationsniveau, - indicerer, at patienten er meget immun og sandsynligvis ikke behøver en vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået immunitet (hvilket muligvis kunne medføre risiko for en 20 ugunstig reaktion).

(b) En titer mellem den høje og den lave referencetiter - indicerer, at patienten er immun, men at en vaccineindsprøjtning til forstærkning af tidligere opnået immunitet 25 sandsynligvis er berettiget.

(c) En titer lig med eller mindre end den lave referencetiter - indicerer, at patienten ikke er immun, og at indgivelse af stivkrampeimmunoglobulin og vaccine i tilfælde af kvæstelse 30 sandsynligvis er berettiget. 1 hvert af de ovenfor anførte eksempler fremstilles ureasekonjugatet ved standardmetoder, enten ved enkelttrinsgiutaraldehydmetoden (Aurameas, S., Ternynck, T. og Guesdon, J.L., "Coupling of enzymes 35 to antibodies and antigens", 1978 Scand.J.Immunol. 8 (Suppl. 7), s.7-23) eller ved M.B.S.-metoden (Monji, N., Malkus, H. og Castro, A., "Maleimide derivative of hapten for coupling to enzyme: A new method in enzyme immunoassay" Biochem. Biophys. Res. Comm., 85, 671 (1978)). Konjugatreagenset fremstilles i en pufret

DK 159408B

14 saltvandsopløsning (pH 7,2) som beskrevet i detaljer ovenfor og indbefatter ovalbumin i en mængde på fra 0,25 til 1 vægt% for at minimere uspecifik binding af konjugatet.

5 Substratopløsningen omfatter en fortyndet urinstofopløsning, f.eks. indeholdende 1 mg/ml urinstof i glasdestilleret vand, hvortil der sættes EDTA til kompleksbinding af tungmetalioner, som kan forgifte ureasen.

10 Figur 3 viser følsomheden af bromcresolpurpur (BCP) som indikator for tilstedeværelse af ammoniak frembragt ved indvirkningen af urease på urinstof sammenlignet med andre pH-indikatorer, såsom cresolrødt (CR), bromthymolblåt (BPB), chlorphenolrødt (CPR) og phenolrødt (PR), der alle, som vist i tabel 1 nedenfor, udviser et 15 farveskift i pH-området fra 5 til 8.

TABEL 1

Amax Begyn- pH-område Farve-20 (nm) af delses- for skiftets

Indikator Forkortelse anion_pH farveskift natur_

Bromcresol- purpur BCP 590 5,0 5,2-6,8 gul -+ violet 25

Cresolrødt CR 572 6,5 7,2-8,8 gul + rød

Bromthymol- blåt BTB 648 6,0 6,0-7,6 gul - blå 30

Chlorphenolrødt CPR 568 5,1 5,2-6,8 gul ·* rød

Phenol rødt PR 555 6,6 6,6-8,0 gul -* rød 35

Det fremgår af figur 3, at i et ikke-pufret system giver pH-indika-torerne BCP, BTB og PR rette linier, når absorptionen afbildes som funktion af tiden, hvorimod CR og CPR giver kurveformede reaktionsforløb. Desuden er BCP meget mere følsom end de andre indikatorer og 15

DK 159408 B

giver et markant skift fra gult til purpur, som let kan påvises visuelt, eftersom disse farver befinder sig langt fra hinanden i det synlige lysspektrum. BCP giver derfor en lang række fordele som indikator til anvendelse ved EIA-analyser involverende urease 5 sammenlignet med de andre pH-i ndi katorer, som ville forventes at give høje reaktionshastigheder og dermed være mere følsomme ved ureases pH-optimum i EIA-systemet. Bromcresolpurpur er også specielt fordelagtig sammenlignet med anvendelsen af Nessler-reaktionen til påvisning af dannelsen af ammoniak, eftersom brugen af en pH-i ndi -10 kator tilvejebringer en kontinuerlig måling af ureaseaktivitet og ikke ødelægger enzymet, som det er tilfældet ved Nessler-reaktionen. '

Det er følgelig specielt fordelagtigt at anvende bromcresolpurpur til udførelse af analyse under anvendelse af urease/urinstof som enzym/substrat-systemet i ELISA-metoder.

15

Forekomsten af ikke-specifik binding under analyseproceduren, navnlig af antistof-enzymkonjugatet til den faste fase, kan nedsættes ganske væsentligt ved inkorporering af ovalbumin i antistof/-enzym-konjugatreagenset. Dette reagens omfatter almindeligvis 20 konjugatet i en standardfortyndingspuffer, f.eks. pufret salt vandsopløsning (pH 7,2) indeholdende 0,5 vægt% overfladeaktivt middel (Tween 20), 0,25 vægt% bovint serumalbumin og 0,1 vægt% konserveringsmiddel (natriumazid). Ovalbumin sættes til dette reagens i en mængde på 0,1 vægt% eller mere, fortrinsvis fra 0,25 25 til 1 vægt%.

30 35

Claims (6)

1. Apparat til brug ved påvisning eller bestemmelse af tilstedeværelse af antigene eller haptene stoffer eller antistoffer i en 5 prøve, kendetegnet ved, at det omfatter en flerhed af kapi 11 arf ormede elementer (1, 2, 3, 4, 5, 6), hvorhos der til en indre overflade af hvert kapi11 arelement er fæstnet antistoffer eller antigene eller haptene stoffer, samt organer (11), der kan bringe væsker til at passere rækken af kapi11 arelementer samtidigt 10 eller sekventielt.

2. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kapillar-elementerne er forbundet i serie ved hjælp af slangeformede forbindelsesled (8), og at denne serie af elementer (10) er forbundet til 15 et enkelt organ (11), der kan bringe væsker til at passere gennem elementerne.

3. Apparat ifølge krav 2, kendetegnet ved, at det enkelte organ (11), der kan bringe væsker til at passere gennem 20 serierne af kapi 11 arelementer (1, 2, 3, 4, 5, 6), omfatter en sprøjte med et borehul, som er i væskeforbindelse med en ende af serien af kapillarelementer, samt et stempel, der kan bevæges inde i dette borehul.

4. Apparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at kapil larelementerne (21, 22, 23) er anbragt side om side i et støtteorgan (24) og i væskeforbindelse til individuelle borehuller (25, 26, 27) inde i støtteorganet, og at organet, der kan bringe væsker til at passere gennem kapillarelementerne, omfatter organer til samtidig 30 indtrækning af væsker ind i og uddrivning af væsker ud fra borehullerne gennem de respektive kapi11 arelementer.

5. Apparat (20) ifølge krav 4, kendetegnet ved, at der inden i borehullerne (25, 26, 27) er anbragt individuelle stempler 35 (28, 29, 30), som kan bevæges og herved relativt i forhold hertil trække væsker ind i og uddrive væsker fra borehullerne, og at de individuelle stempler er forbundet således, at de bevæges samtidig i forhold til de respektive borehuller. 17 DK 159408 B

6. Apparat ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at kapillarelementerne er fremstillet af glaseller plastmaterialer, og at antistofferne eller de haptene eller antigene stoffer er fæstnet til elementernes indre overflade ved ad-5 sorption eller kovalent binding. 10 15 20 25 30 35